ES2670874T3 - Anticuerpos contra CD70 - Google Patents

Anticuerpos contra CD70 Download PDF

Info

Publication number
ES2670874T3
ES2670874T3 ES12710486.7T ES12710486T ES2670874T3 ES 2670874 T3 ES2670874 T3 ES 2670874T3 ES 12710486 T ES12710486 T ES 12710486T ES 2670874 T3 ES2670874 T3 ES 2670874T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
seq
antibody
human
amino acid
domain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES12710486.7T
Other languages
English (en)
Inventor
Karen Silence
Peter Ulrichts
Johannes Joseph Wilhelmus De Haard
Torsten Dreier
Michael John Scott Saunders
Harald Wajant
Sofie Maria Elvire GABRIELS
Mahan Moshir
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ArgenX BVBA
Original Assignee
ArgenX BVBA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ArgenX BVBA filed Critical ArgenX BVBA
Application granted granted Critical
Publication of ES2670874T3 publication Critical patent/ES2670874T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen a CD70 humana, comprendiendo dichos anticuerpo o fragmento de unión a antígeno al menos un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR3 de cadena pesada variable, una CDR2 de cadena pesada variable y una CDR1 de cadena pesada variable y al menos un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR3 de cadena ligera variable, una CDR2 de cadena ligera variable y una CDR1 de cadena ligera variable en donde la CDR3 de cadena pesada variable comprende o consiste en SEQ ID NO: 50 (DAGYSNHVPIFDS); la CDR2 de cadena pesada variable comprende o consiste en la SEQ ID NO: 27 (DINNEGGTTYYADSVKG); la CDR1 de cadena pesada variable comprende o consiste en SEQ ID NO: 11 (VYYMN); la CDR3 de cadena ligera variable comprende o consiste en SEQ ID NO: 160 (ALFISNPSVE); la CDR2 de cadena ligera variable comprende o consiste en la SEQ ID NO: 119 (NTNTRHS); y la CDR1 de cadena ligera variable comprende o consiste en SEQ ID NO: 250 (GLKSGSVTSDNFPT).

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
DESCRIPCION
Anticuerpos contra CD70 Campo técnico
La presente invención se refiere a anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a la proteína CD70 humana con alta afinidad y muestran una potente inhibición del crecimiento de células tumorales.
Antecedentes
El receptor de citocinas CD27 es un miembro de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TFNR), que desempeña un papel en el crecimiento y la diferenciación celular, así como en la apoptosis. El ligando para CD27 es cD70, que pertenece a la familia de ligandos del factor de necrosis tumoral. CD70 es un polipéptido de 193 aminoácidos que tiene un dominio N-terminal hidrófilo de 20 aminoácidos y un dominio C-terminal que contiene 2 sitios potenciales de glicosilación ligados a N (Goodwin, R.G. et al. (1993) Cell 73: 447-56; Bowman et al. (1994) Immunol 152: 1756-61) Basándose en estas características, se determinó que CD70 es una proteína transmembrana de tipo II que tiene una porción C-terminal extracelular.
CD70 se encuentra transitoriamente en linfocitos T y B activados y células dendríticas (Hintzen et al. (1994) J. Immunol. 152:1762-1773; Oshima et al. (1998) Int. Immunol. 10: 517-26; Tesselaar et al. (2003) J. Immunol. 170:33- 40). Además de la expresión en células normales, se ha informado sobre la expresión de CD70 en diferentes tipos de cáncer, incluidos carcinomas de células renales, cánceres de mama metastásicos, tumores cerebrales, leucemias, linfomas y carcinomas nasofaríngeos (Junker et al. (2005) J Urol. 173:2150-3; Sloan et al. (2004) Am J Pathol. 164:315-23; Held-Feindt y Mentlein (2002) Int J Cancer 98:352-6; Hishima et al. (2000) Am J Surg Pathol. 24:742-6; Lens et al. (1999) Br J Haematol. 106:491-503). También se ha propuesto que la interacción de CD70 con CD27 desempeña un papel en la enfermedad autoinmunitaria mediada por células y la inhibición de la producción de TNF-alfa (Nakajima et al. (2000) J. Neuroimmunol. 109:188-96).
En consecuencia, CD70 representa una diana para el tratamiento de cáncer, trastornos autoinmunitarios y una variedad de otras enfermedades caracterizadas por la expresión de CD70.
El documento WO 2006/0044643 describe anticuerpos contra CD70 que contienen un dominio efector de anticuerpo que puede mediar una o más de ADCC, ADCP, CDC o ADC y ejerce un efecto citostático o citotóxico sobre un cáncer que expresa CD70 o ejerce un efecto inmunosupresor sobre un trastorno inmunológico que expresa CD70 en el ausencia de conjugación con un agente citostático o citotóxico. Los anticuerpos ilustrados en la presente memoria están basados en las regiones de unión a antígeno de dos anticuerpos monoclonales, denominados 1F6 y 2F2. El documento WO 2006/113909 describe anticuerpos anti-CD70 humanizados, específicamente 1F6 humanizado y 2F2 humanizado.
El documento WO 2007/038637 describe anticuerpos monoclonales completamente humanos que se unen a CD70. Estos anticuerpos se caracterizan por unirse a CD70 humana con una Kd de 1x10-7M o menos. Los anticuerpos también se unen y se internalizan mediante líneas celulares tumorales de carcinoma de células renales que expresan CD70, tales como 786-O.
Compendio de la invención
De acuerdo con la invención, se proporciona un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a CD70 humana, comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno al menos un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR3 de cadena pesada variable, una CDR2 de cadena pesada variable y una CDR1 de cadena pesada variable y al menos un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR3 de cadena ligera variable, una CDR2 de cadena ligera variable y una CDR1 de cadena ligera variable
en donde la CDR3 de cadena pesada variable comprende o consiste en SEQ ID NO: 50 (DAGYSNHVPIFDS);
la CDR2 de cadena pesada variable comprende o consiste en SEQ ID NO: 27 (DINNEgGtTYY ADSVKG);
la CDR1 de cadena pesada variable comprende o consiste en SEQ ID NO: 11 (VYYMN);
la CDR3 de cadena ligera variable comprende o consiste en SEQ ID NO: 160 (ALFISNPSVE);
la CDR2 de cadena ligera variable comprende o consiste en SEQ ID NO: 119 (NTNTRHS); y
la CDR1 de cadena ligera variable comprende o consiste en SEQ ID NO: 250 (gLKSGSVtSdNFPT).
En la presente memoria se proporcionan anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos (denominados en la presente memoria anticuerpos contra CD70) que se unen a la proteína CD70 humana y exhiben propiedades que son diferentes, y generalmente superiores, a los anticuerpos contra CD70 descritos en la técnica anterior. Las propiedades superiores de estos anticuerpos son ventajosas con respecto al uso en terapia humana,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
particularmente el tratamiento de cánceres que expresan CD70 y también trastornos inmunológicos.
Los anticuerpos CD70 descritos en la presente memoria se caracterizan por una afinidad de unión extremadamente alta para CD70 humana. Todas las realizaciones preferidas descritas en la presente memoria exhiben una afinidad de unión para CD70 humana recombinante (medida mediante resonancia de plasmón superficial Biacore™ como se describe en la presente memoria) que es significativamente más alta que los anticuerpos CD70 más potentes de la técnica anterior propuestos para terapia humana, incluyendo anticuerpos contra cD70 de la técnica anterior de "origen humano". Además, todas las realizaciones preferidas de los anticuerpos CD70 descritos en la presente memoria exhiben una unión superior (es decir, mayor afinidad) a CD70 expresada en la superficie de líneas celulares humanas, específicamente líneas celulares humanas de cáncer, cuando se comparan con los anticuerpos contra CD70 de la técnica anterior propuestos para terapia humana. Esta unión superior a CD70 de la superficie celular es particularmente marcada con respecto a las líneas celulares de cáncer humano que expresan CD70 con "bajo número de copias" y tiene relevancia directa para el uso de los anticuerpos en la terapia humana. Además, las realizaciones preferidas de los anticuerpos contra CD70 descritos en la presente memoria muestran una unión sustancialmente mejorada a células cancerosas aisladas de pacientes humanos, particularmente células cancerosas aisladas de pacientes con leucemia linfocítica crónica (LLC), en comparación con los anticuerpos contra CD70 de la técnica anterior propuestos para uso terapéutico humano.
En la presente memoria se describe un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a CD70 humana, comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno al menos un dominio variable de cadena pesada (VH) y al menos un dominio variable de cadena ligera (VL), en donde dichos dominios VH y VL exhiben una velocidad de disociación (koff medida mediante Biacore™) para CD70 humana de menos de 7 x 10-4 s-1, cuando se somete a ensayo como un fragmento Fab utilizando el protocolo normalizado Biacore™ descrito en la presente memoria.
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender al menos un dominio variable de cadena pesada (VH) y al menos un dominio variable de cadena ligera (VL), donde dicho dominio VH y VL muestra una velocidad de disociación para CD70 humana de 5 x 10-4 s-1 o menos, o 2 x 10-4s-1 o menos, o 1 x 10-4s-1 o menos. Lo más preferiblemente el anticuerpo contra CD70 exhibirá una velocidad de disociación para CD70 en el intervalo de 0,4 x 10-4 s-1 a 4,8 x 10-4 s-1, cuando se someta a ensayo como un fragmento Fab.
También se describe un anticuerpo que se une a CD70 humana, dicho anticuerpo comprende dos regiones Fab, en donde cada una de las regiones Fab se une a CD70 humana y exhibe una velocidad de disociación para CD70
-4 -1 -4 -1 -4 -1
humana de 5 x 10 s' o menos, o 2 x 10 s' o menos, o 1 x 10 s' o menos y preferiblemente en el intervalo de 0,4 x 10-4 s-1 a 4,8 x 10-4 s-1, cuando se somete a ensayo como un fragmento Fab. Las dos regiones Fab pueden ser idénticas o pueden diferir en términos de propiedades de unión, p.ej. afinidad por CD70 humana. Las dos regiones Fab pueden unirse al mismo epítopo o epítopos solapantes en CD70 humana o pueden unirse a epítopos distintos que no se solapan en CD70 humana. Las dos regiones Fab pueden diferir entre sí en términos de secuencia de aminoácidos dentro de uno o ambos dominios VH y VL.
Las realizaciones preferidas de los anticuerpos contra CD70 proporcionados en la presente memoria pueden, además de la afinidad de unión extremadamente alta por CD70, exhibir un potente bloqueo o inhibición de la interacción entre CD70 y su ligando CD27. Los anticuerpos contra CD70 preferidos que exhiben tanto unión de alta afinidad a CD70 como el bloqueo potente de la interacción CD70/CD27 son particularmente ventajosos como agentes terapéuticos para el tratamiento de indicaciones de enfermedad donde el bloqueo de la señalización CD70/CD27 aumenta la eficacia terapéutica (p.ej., además de la destrucción celular mediada por las funciones efectoras del anticuerpo contra CD70), por ejemplo enfermedades autoinmunitarias y cánceres que expresan conjuntamente CD70y CD27.
No todos los anticuerpos contra CD70 proporcionados en la presente memoria muestran un potente bloqueo de la interacción CD70/CD27 además de la unión de alta afinidad a CD70. También se describen en la presente memoria varios anticuerpos contra CD70 que exhiben una afinidad muy alta por la unión a CD70 pero que no muestran un bloqueo significativo de la interacción CD70/CD27. Las propiedades de estos anticuerpos se describen en otra parte de la presente memoria. La disponibilidad de anticuerpos contra CD70 no bloqueantes de alta afinidad puede mejorar/ampliar la gama de posibilidades terapéuticas.
Las realizaciones preferidas de los anticuerpos contra CD70 descritos en la presente memoria, que exhiben una afinidad de unión muy alta por CD70 humana, también se caracterizan por una combinación de propiedades de unión que no es exhibida por los anticuerpos contra CD70 de la técnica anterior propuestos para uso terapéutico humano. Por consiguiente, los anticuerpos contra CD70 preferidos descritos en la presente memoria se caracterizan por:
(a) unión dentro de la secuencia de aminoácidos HIQVTLAICSS (SEQ ID NO: 342) en CD70 humana;
(b) reactividad cruzada con homólogos de CD70 de macaco rhesus (Macaca mulatta) y mono cinomolgo
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
(Macaca cynomolgus);
(c) unión a CD70 humana nativa y CD70 humana recombinante desnaturalizada por calor.
Esta combinación de propiedades de unión, que no es exhibida por los anticuerpos de la técnica anterior propuestos para uso terapéutico humano, indica la unión a un nuevo epítopo en CD70 que es diferente de los epítopos a los que se han unido los anticuerpos contra CD70 de la técnica anterior.
La combinación de propiedades de unión mostrada por los anticuerpos contra CD70 preferidos es ventajosa en el contexto del desarrollo de fármacos humanos. En particular, la reactividad cruzada con homólogos de CD70 de simios permite que los estudios de toxicidad sobre anticuerpos contra CD70 propuestos para el uso terapéutico humano se lleven a cabo en modelos de primates.
Los anticuerpos contra CD70 preferidos descritos en la presente memoria aún exhiben adicionalmente propiedades favorables que son relevantes para la fabricación comercial como un producto de anticuerpo terapéutico. Como se comenta en otra parte de la presente memoria, los anticuerpos contra CD70 preferidos proporcionados en la presente memoria muestran una expresión de nivel extremadamente alto en los sistemas de expresión recombinante utilizados para la fabricación comercial de productos de anticuerpos terapéuticos de grado clínico. Los niveles de expresión alcanzables con los anticuerpos contra CD70 preferidos exceden con creces los niveles típicamente alcanzados incluso para productos de anticuerpos terapéuticos "completamente humanos". Además, los productos de anticuerpo contra CD70 preferidos (producidos por expresión recombinante en un formato adecuado para uso terapéutico humano) exhiben estabilidad térmica sobresaliente, que es superior a la de los productos de anticuerpos terapéuticos típicos.
Los anticuerpos contra CD70 proporcionados en la presente invención con una afinidad de unión superior por CD70 humana y las otras propiedades ventajosas enumeradas anteriormente son derivados de camélidos (por ejemplo derivados de llama). Los anticuerpos contra CD70 derivados de camélidos pueden aislarse o expresarse de manera recombinante con anticuerpos monoclonales. Las realizaciones preferidas pueden ser un anticuerpo monoclonal humanizado (o que ha experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal "germlined") (p.ej., una variante humanizada de un anticuerpo derivado de camélido), un anticuerpo quimérico (p.ej., un anticuerpo quimérico de camélido-humano) o un anticuerpo quimérico humanizado (p.ej., un anticuerpo quimérico que comprende variantes humanizadas de dominios VH y VL de camélido y dominios constantes de un anticuerpo humano).
Los anticuerpos contra CD70 derivados de camélido pueden comprender un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL), en donde los dominios VH y VL son derivados de camélido. En realizaciones concretas, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender dominios VH y VL de llama, o variantes que han experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal humana de dominios VH y VL de llama. Este anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, pueden exhibir "alta homología humana", como se define en la presente memoria.
Los anticuerpos contra CD70 derivados de camélidos descritos en la presente memoria muestran típicamente secuencias de aminoácidos VH y/o región VL que tienen al menos 90% (p.ej., 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%) de identidad de secuencia con la secuencia de la línea germinal de anticuerpos humanos que coincide más estrechamente.
Otras realizaciones preferidas de la invención incluyen variantes humanizadas (o que han experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal humana) de los anticuerpos contra cD70 derivados de camélidos. En particular, la invención proporciona variantes que han experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal humanizadas o humanas de los anticuerpos contra CD70 derivados de llama descritos en la presente memoria.
En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un anticuerpo quimérico camélido humano que se une a CD70 humana, en donde las porciones de unión a antígeno del anticuerpo (p.ej., dominios VH y/o VL o CDR de las mismas) son derivados de camélidos y las regiones constantes del anticuerpo derivan de un anticuerpo humano. En particular, la invención proporciona un anticuerpo quimérico de llama-humano que se une a CD70 humana.
En un aspecto adicional de la invención, se proporciona una variante humanizada de un anticuerpo de camélido- humano quimérico que se une a CD70 humana, en donde las porciones de unión a antígeno del anticuerpo (p.ej., dominios VH y/o VL o CDR de las mismas) son variantes humanizadas de secuencias derivadas de camélido y las regiones constantes del anticuerpo derivan de un anticuerpo humano. En particular, la invención proporciona una variante humanizada de un anticuerpo de llama-humano quimérico que se une a CD70 humana.
En la presente memoria se describen anticuerpos contra CD70, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, definidos a continuación mediante la referencia a características estructurales específicas, es decir, secuencias de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
aminoácidos especificadas de las CDR (una o más de SEQ ID NO: 49-59, 262 o 263 (CDR3 de cadena pesada)) o SEQ ID NO: 26-37, 249, 258 o 259 (CDR2 de cadena pesada) o SEQ ID NO: 10-20, 248, 256 o 257 (CDR1 de cadena pesada) o una de las secuencias de CDR mostradas como SEQ ID NO: 148-168, 271 o 273 (cadena ligera CDR3), o SEC ID NO: 109-128 o 270 (CDR2 de cadena ligera) o SEC ID NO: 77-95, o 250-253, 267 o 268 (CDR1 de cadena ligera), o dominios variables completos (uno o más de SEQ ID NO: 177-188, 212-223, 274 o 275 (VH) o SEQ ID NO: 189-211, 230-245, 276 o 277 (VL)) Todos estos anticuerpos se unen a CD70 humana con alta afinidad, exhibiendo una velocidad de disociación para CD70 humana de 5 x 10-4 s-1 o menos, y típicamente en el intervalo de 0,4 x 10-4 s-1 a 4,8 x 10-4 s-1, cuando se somete a ensayo como un fragmento Fab.
Se proporcionan específicamente anticuerpos quiméricos que contienen dominios VH y VL que son derivados de camélidos, o variantes que han experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal humana de los mismos, fusionados a dominios constantes de anticuerpos humanos, en particular IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humanas. Los dominios variables de la cadena pesada definidos anteriormente pueden utilizarse como anticuerpos de dominio único, o se pueden incluir dentro de un anticuerpo de cuatro cadenas convencional u otras proteínas de unión a antígeno, tales como, por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fab biespecíficos y fragmentos Fv, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo de cadena sencilla, un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) y anticuerpos multiespecíficos.
Cualquier anticuerpo contra CD70 dado o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende un dominio VH emparejado con un dominio VL para formar un sitio de unión a antígeno CD70 comprenderá una combinación de 6 CDR: CDR3 de cadena pesada variable (HCDR3), CDR2 de cadena pesada variable (HCDR2), CDR1 de cadena pesada variable (HCDR1), CDR3 de cadena ligera variable (LCDR3), CDR2 de cadena ligera variable (LCDR2) y CDR1 de cadena ligera variable (LCDR1).
Las combinaciones preferidas de 6 CDR incluyen:
(i) HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 50, HCDR2 que comprende SEQ ID NO: 27, HCDR1 que comprende SEQ ID NO: 11, LCDR3 que comprende SEQ ID NO: 160, LCDR2 que comprende SEQ ID NO: 119, y LCDR1 que comprende SEQ ID NO: 250;
También se describen en la presente memoria combinaciones de CDR3 de cadena pesada variable (HCDR3), CDR2 de cadena pesada variable (HCDR2), CDR1 de cadena pesada variable (HCDR1), CDR3 de cadena ligera variable (LCDR3), CDR2 de cadena ligera variable (LCDR2) y CDR1 de cadena ligera variable (LCDR1) seleccionadas del grupo que consiste en:
(ii) HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 49, HCDR2 que comprende SEQ ID NO: 26, HCDR1 que comprende sEq ID NO: 10, LcDr3 que comprende SEQ ID NO: 148, LCDR2 que comprende SEQ ID NO: 109, y LcDR1 que comprende SEQ ID NO: 77;
(iii) HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 50, HCDR2 que comprende SEQ ID NO: 27, HCDR1 que comprende SEQ ID NO: 11, LCDR3 que comprende SEQ ID NO: 149, LCDR2 que comprende SEQ ID NO: 110, y LCDR1 que comprende SEQ ID NO: 78;
(iv) HcDr3 que comprende SEQ ID NO: 50, HCDR2 que comprende SEQ ID NO: 28, HCDR1 que comprende SEQ ID nO: 11, LCDR3 que comprende SEQ iD NO: 150, LCDR2 que comprende SEQ ID NO:
111, y LCDR1 que comprende SEQ ID NO: 79;
(v) HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 50, HCDR2 que comprende SEQ ID NO: 28, HCDR1 que comprende SEQ ID NO: 11, LCDR3 que comprende SEQ ID NO: 151, LCDR2 que comprende SEQ ID NO: 110, y LCDR1 que comprende SEQ ID NO: 80;
(vi) HcDr3 que comprende SEQ ID NO: 51, HCDR2 que comprende SEQ ID NO: 29, HCDR1 que comprende SEQ ID nO: 12, LCDR3 que comprende SEQ iD NO: 152, LCDR2 que comprende SEQ ID NO: 110, y LCDR1 que comprende SEQ ID NO: 80;
(vii) HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 52, HCDR2 que comprende SEQ ID NO: 30, HCDR1 que comprende SEQ ID NO: 13, LCDR3 que comprende SEQ iD NO: 153, LCDR2 que comprende SEQ ID NO:
112, y LCDR1 que comprende SEQ ID NO: 81;
(viii) HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 53, HCDR2 que comprende SEQ ID NO: 31, HCDR1 que comprende SEQ ID NO: 14, LCDR3 que comprende SEQ iD NO: 154, LCDR2 que comprende SEQ ID NO:
113, y LCDR1 que comprende SEQ ID NO: 82;
(ix) HcDR3 que comprende SEQ ID NO: 54, HCDR2 que comprende SEQ ID NO: 32, HCDR1 que comprende SEQ ID nO: 15, LCDR3 que comprende SEQ iD NO: 155, LCDR2 que comprende SEQ ID NO:
114, y LCDR1 que comprende SEQ ID NO: 83;
(x) hCdR3 que comprende SEQ ID NO: 55, HCDR2 que comprende SEQ ID NO: 33, HCDR1 que comprende sEq ID NO: 16, LcDr3 que comprende SEQ ID NO: 156, LCDR2 que comprende SEQ ID NO: 115, y LcDR1 que comprende SEQ ID NO: 84;
(xi) HcDr3 que comprende SEQ ID NO: 56, HCDR2 que comprende SEQ ID NO: 34, HCDR1 que comprende SEQ ID nO: 17, LCDR3 que comprende SEQ iD NO: 157, LCDR2 que comprende SEQ ID NO:
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
116, y LCDR1 que comprende SEQ ID NO: 85;
(xii) HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 57, HCDR2 que comprende SEQ ID NO: 35, HCDR1 que comprende SEQ ID NO: 18, LCDR3 que comprende SEQ iD NO: 158, LCDR2 que comprende SEQ ID NO:
117, y LCDR1 que comprende SEQ ID NO: 84;
(xiii) HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 58, HCDR2 que comprende SEQ ID NO: 36, HCDR1 que comprende SEQ ID NO: 19, LCDR3 que comprende SEQ iD NO: 159, LCDR2 que comprende SEQ ID NO: 118 y LCDR1 que comprende SEQ ID NO: 86;
(xiv) HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 50, HCDR2 que comprende SEQ ID NO: 27, HCDR1 que comprende SeQ ID NO: 11, LCDR3 que comprende SEQ iD NO: 161, LCDR2 que comprende SEQ ID NO:
120, y LCDR1 que comprende SEQ ID NO: 88;
(xv) HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 50, HCDR2 que comprende SEQ ID NO: 27, HCDR1 que comprende SEQ ID NO: 11, LCDR3 que comprende SEQ iD NO: 162, LCDR2 que comprende SEQ ID NO:
121, y LCDR1 que comprende SEQ ID NO: 89;
(xvi) HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 50, HCDR2 que comprende SEQ ID NO: 27, HCDR1 que comprende SeQ ID NO: 11, LCDR3 que comprende SEQ iD NO: 163, LCDR2 que comprende SEQ ID NO:
122, y LCDR1 que comprende SEQ ID NO: 90;
(xvii) HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 51, HCDR2 que comprende SEQ ID NO: 29, HCDR1 que comprende SeQ ID NO: 12, LCDR3 que comprende SEQ ID NO: 164, LCDR2 que comprende SEQ ID NO: 123 y LCDR1 que comprende SEQ ID NO: 91;
(xviii) HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 51, HCDR2 que comprende SEQ ID NO: 29, HCDR1 que comprende SEQ ID NO: 12, LCDR3 que comprende SEQ ID NO: 164, LCDR2 que comprende SEQ ID NO:
124, y LCDR1 que comprende SEQ ID NO: 91;
(xix) HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 59, HCDR2 que comprende SEQ ID NO: 37, HCDR1 que comprende SeQ ID NO: 12, LCDR3 que comprende SEQ iD NO: 165, LCDR2 que comprende SEQ ID NO:
125, y LCDR1 que comprende SEQ ID NO: 92;
(xx) HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 59, HCDR2 que comprende SEQ ID NO: 37, HCDR1 que comprende SEQ ID NO: 20, LCDR3 que comprende SEQ iD NO: 165, LCDR2 que comprende SEQ ID NO:
126, y LCDR1 que comprende SEQ ID NO: 93;
(xxi) HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 59, HCDR2 que comprende SEQ ID NO: 37, HCDR1 que comprende SeQ ID NO: 20, LCDR3 que comprende SEQ iD NO: 166, LCDR2 que comprende SEQ ID NO: 127 y LCDR1 que comprende SEQ ID NO: 92;
(xxii) HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 59, HCDR2 que comprende SEQ ID NO: 37, HCDR1 que comprende SeQ ID NO: 20, LCDR3 que comprende SEQ ID NO: 167, LCDR2 que comprende SEQ ID NO: 128, y LCDR1 que comprende SEQ ID NO: 94;
(xxiii) HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 59, HCDR2 que comprende SEQ ID NO: 37, HCDR1 que comprende SEQ ID NO: 20, LCDR3 que comprende SEQ ID NO: 168, LCDR2 que comprende SEQ ID NO: 110, y LCDR1 que comprende SEQ ID NO: 95;
(xxiv) HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 262, HCDR2 que comprende SEQ ID NO: 258, HCDR1 que comprende SEQ ID NO: 256, LCDR3 que comprende SEQ iD NO: 271, LCDR2 que comprende SEQ ID NO: 110, y LCDR1 que comprende SEQ ID NO: 267;
(xxv) HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 263, HCDR2 que comprende SEQ ID NO: 259, HCDR1 que comprende SeQ ID NO: 257, LCDR3 que comprende SEQ iD NO: 273, LCDR2 que comprende SEQ ID NO: 270, y LCDR1 que comprende SEQ ID NO: 268.
También se describen en la presente memoria anticuerpos contra CD70, que exhiben unión de alta afinidad a CD70 humana, incluyendo anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden un dominio variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO : 225, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 274 y SEQ ID NO: 275 y secuencias de aminoácidos que presentan al menos 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con una de las secuencias enumeradas, y que comprende opcionalmente un dominio variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 223, SEC ID NO: 230, SEC ID NO: 231, SEC ID NO: 232, SEC ID NO: 233, SEC ID NO: 234, SEC ID NO: 234, SEC ID NO: 236, SEC ID NO: 237, SEC ID NO: 238, SEC ID NO: 239, SEC ID NO: 240, SEC ID NO: 241, SEC ID NO: 242, SEC ID NO: 243, SEC ID NO: 244, SEC ID NO: 245, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 276 y SEQ ID NO: 277 y secuencias de aminoácidos que presentan al menos 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con una de las secuencias citadas.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Aunque son permisibles todos los emparejamientos posibles de dominios VH y dominios VL seleccionados de los grupos de secuencia de dominio VH y VL enumerados anteriormente, ciertas combinaciones de VH y VL son particularmente preferidas; estas son las combinaciones "nativas" dentro de un solo Fab que exhibe unión de alta afinidad a CD70 humana.
Por consiguiente, los anticuerpos contra CD70 preferidos, o fragmentos de unión a antígeno del mismo, que exhiben unión de alta afinidad a CD70 son aquellos que comprenden una combinación de un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL), en donde la combinación es:
(i) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 223 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 241;
También se describen en la presente memoria anticuerpos contra CD70, o fragmentos de unión a antígeno del mismo, que exhiben unión de alta afinidad a CD70 son aquellos que comprenden una combinación de un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL), en donde la combinación se selecciona del grupo que consiste en:
(ii) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 177 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 189;
(iii) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 178 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 190;
(iv) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 179 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 191;
(v) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 179 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 192;
(vi) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 180 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 193;
(vii) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 181 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 194;
(viii) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 182 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 195;
(ix) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 183 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 196;
(x) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 184 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 197;
(xi) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 185 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 198;
(xii) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 186 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 199;
(xiii) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 187 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 200;
(xiv) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 178 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 201;
(xv) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 178 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 202;
(xvi) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 178 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 203;
(xvii) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 178 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 204;
(xviii) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 180 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 205;
(xix) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 180 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 206;
(xx) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 188 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 207;
(xxi) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 188 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 208;
(xxii) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 188 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 209;
(xxiii) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 188 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 210;
(xxiv) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 188 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 211;
(xxv) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 274 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 276;
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
(xxvi) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 275 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 277.
Para cada una de las combinaciones específicas VH/VL enumeradas anteriormente, también se permite combinar un dominio VH que tenga una secuencia de aminoácidos de al menos un 90%, 92%, 95%, 97% o 99% idéntica a la secuencia de dominio VH indicada con un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos 90%, 92%, 95%, 97% o 99% a la secuencia de dominio VL enumerada.
En el párrafo anterior, y en cualquier parte de la presente memoria, la estructura de los anticuerpos/fragmentos de unión a antígeno se define sobre la base del % de identidad de secuencia con una secuencia de referencia enumerada (con SEQ ID NO dado). En este contexto, el % de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar comparando estas dos secuencias alineadas de manera óptima y en las que la secuencia de aminoácidos que se va a comparar puede comprender adiciones o deleciones con respecto a la secuencia de referencia para una alineación óptima entre estas dos secuencias. El porcentaje de identidad se calcula determinando el número de posiciones idénticas para las cuales el residuo de aminoácido es idéntico entre las dos secuencias, dividiendo este número de posiciones idénticas por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado obtenido por 100 para obtener el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias. Típicamente, la ventana de comparación que corresponde a la longitud completa de la secuencia que se compara. Por ejemplo, es posible utilizar el programa BLAST, "secuencias BLAST 2" (Tatusova et al., "Blast 2 sequences: a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250) disponible en el sitio
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/bl2.html, los parámetros utilizados son los que se proporcionan por defecto (en particular para los parámetros "penalización por apertura de hueco": 5 y "penalización por extensión de hueco": 2; siendo la matriz elegida, por ejemplo, la matriz "BLOSUM 62" propuesta por el programa), el porcentaje de identidad entre las dos secuencias que se deben comparar es calculado directamente por el programa.
Los anticuerpos contra CD70 más preferidos proporcionados en la presente memoria, que exhiben una combinación particularmente ventajosa de propiedades, que incluyen una afinidad extremadamente alta por CD70 humana, son aquellos basados en la porción de unión a antígeno del Fab derivado de llama denominado 27B3 en los ejemplos adjuntos, más variantes que han experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal humana de 27B3, que incluyen las variantes que han experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal identificadas en los ejemplos adjuntos. 27B3 y sus variantes que han experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal, particularmente las variantes basadas en las CDR o los dominios variables completos de la variante 41D12, exhiben una combinación extremadamente ventajosa de propiedades, resumidas de la siguiente manera: unión de alta afinidad a CD70 humana recombinante, unión fuerte a CD70 de la superficie celular, específicamente unión a CD70 expresada en líneas celulares cancerosas, particularmente líneas celulares que expresan CD70 con "bajo número de copias" y fuerte unión a células cancerosas aisladas de muestras de pacientes (LLC), bloqueo potente de la interacción CD70/CD27, potente función efectora, particularmente cuando se expresa como una quimera con regiones constantes de IgG1 humana, y especialmente cuando se expresa como IgG1 no fucosilada, reactividad cruzada con homólogos de CD70 de macaco rhesus y mono cinomolgo permitiendo estudios toxicológicos en especies de primates, uniéndose a CD70 tanto nativo (es decir, de la superficie celular) como desnaturalizado por calor, niveles de internalización parcial o baja en ciertas líneas celulares de cáncer. Todas estas características combinadas hacen que 41D12, y de hecho otras variantes de 27B3 y los otros anticuerpos contra CD70 descritos en la presente invención exhiban propiedades similares, un candidato sobresaliente para uso terapéutico en el tratamiento de enfermedades asociadas a CD70, específicamente cánceres y trastornos inmunológicos que expresan CD70.
27B3 y sus variantes se caracterizan por la presencia de la secuencia de CDR3 variable de cadena pesada que se muestra como SEQ ID NO: 50 (DAGYSNHVPIFDS).
En la presente memoria se describen anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que incluyen la misma combinación de CDR de cadena pesada que 27B3, o variantes que han experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal humana de 27B3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede comprender un dominio variable de cadena pesada en donde
la CDR3 de cadena pesada variable comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 o una variante de secuencia de la misma;
la CDR2 de cadena pesada variable comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 249 y variantes de secuencia de las mismas; y la CDR1 de cadena pesada variable comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 248 y variantes de secuencia de las mismas, en donde las variantes de secuencia comprenden una, dos o tres sustituciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones conservativas, sustituciones humanizantes o variantes de afinidad) en la secuencia indicada.
El antígeno o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender un dominio variable de cadena pesada
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
en donde la combinación de HCDR3, HCDR2 y HCDR1 se selecciona de entre las siguientes:
(a) la CDR3 de cadena pesada variable comprende o consiste en SEQ ID NO: 50 (DAGYSNHVPIFDS) o una variante de secuencia de la misma;
la CDR2 de cadena pesada variable comprende o consiste en SEQ ID NO: 27 (DINNEGGTTYYADSVKG) o una variante de secuencia de la misma; y la CDR1 de cadena pesada variable comprende o consiste en SEQ ID NO: 11 (VYYMN) o una variante de secuencia de la misma,
donde las variantes de secuencia comprenden una, dos o tres sustituciones de aminoácidos (p.ej., sustituciones conservativas, sustituciones humanizantes o variantes de afinidad) en la secuencia indicada;
(b) la CDR3 de cadena pesada variable comprende o consiste en SEQ ID NO: 50 (RDAGYSNHVPIFDS) o una variante de secuencia de la misma;
la CDR2 de cadena pesada variable comprende o consiste en SEQ ID NO: 249 (DINNEGGATYYADSVKG) o una variante de secuencia de la misma; y la CDR1 de cadena pesada variable comprende o consiste en SEQ ID NO: 11 (VYYMN) o una variante de secuencia de la misma,
en donde las variantes de secuencia comprenden una, dos o tres sustituciones de aminoácidos (p.ej., sustituciones conservativas, sustituciones humanizantes o variantes de afinidad) en la secuencia indicada.
(c) la CDR3 de cadena pesada variable comprende o consiste en SEQ ID NO: 50 (DAGYSNHVPIFDS) o una variante de secuencia de la misma;
la CDR2 de cadena pesada variable comprende o consiste en SEQ ID NO: 27 (DINNEGGTTYYADSVKG) o una variante de secuencia de la misma; y
la CDR1 de cadena pesada variable comprende o consiste en SEQ ID NO: 248 (GYYMN) o una variante de secuencia de la misma,
en donde las variantes de secuencia comprenden una, dos o tres sustituciones de aminoácidos (p.ej., sustituciones conservativas, sustituciones humanizantes o variantes de afinidad) en la secuencia indicada.
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo también incluye un dominio variable de cadena ligera (VL), emparejado con el dominio variable de cadena pesada. En los dominios variables de cadena ligera preferidos, la CDR3 de cadena ligera variable comprende o consiste en SEQ ID NO: 160 o a su variante de secuencia; la CDR2 de cadena ligera variable comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 110 y variantes de secuencia de las secuencias citadas; y la CDR1 de cadena ligera variable comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 253 y variantes de secuencia de las secuencias citadas, y
en donde las variantes de secuencia comprenden una, dos o tres sustituciones de aminoácidos (p.ej., sustituciones conservativas, sustituciones humanizantes o variantes de afinidad) en las secuencias citadas.
El antígeno o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender un dominio variable de cadena ligera en donde la combinación de LCDR3, LCDR2 y LCDR1 se selecciona entre los siguientes:
(a) la CDR3 de cadena ligera variable comprende o consiste en SEQ ID NO: 160 (ALFISNPSVE) o una variante de secuencia de la misma;
la CDR2 de cadena ligera variable comprende o consiste en SEQ ID NO: 119 (NTNTRHS) o una variante de secuencia de la misma; y
la CDR1 de cadena ligera variable comprende o consiste en SEQ ID NO: 250 (GLKSGSVTSDNFPT) o una variante de secuencia de la misma,
donde las variantes de secuencia comprenden una, dos o tres sustituciones de aminoácidos (p.ej., sustituciones conservativas, sustituciones humanizantes o variantes de afinidad) en la secuencia indicada;
(b) la CDR3 de cadena ligera variable comprende o consiste en SEQ ID NO: 160 (ALFISNPSVE) o una variante de secuencia de la misma;
la CDR2 de cadena ligera variable comprende o consiste en SEQ ID NO: 119 (NTNTRHS) o una variante de secuencia de la misma; y
la CDR1 de cadena ligera variable comprende o consiste en SEQ ID NO: 87 (GLKSGSVTSTNFPT) o una variante de secuencia de la misma,
en donde las variantes de secuencia comprenden una, dos o tres sustituciones de aminoácidos (p.ej., sustituciones conservativas, sustituciones humanizantes o variantes de afinidad) en la secuencia indicada.
En la Tabla 15A se proporcionan otras combinaciones de CDR de cadena ligera para variantes "que han experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal" humana de 27B3.
La realización más preferida del anticuerpo contra CD70 o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL) donde la combinación de 6 CDR que forma el sitio de unión para CD70 humana es la siguiente:
la CDR3 de cadena pesada variable comprende o consiste en SEQ ID NO: 50 (DAGYSNHVPIFDS); la CDR2 de cadena pesada variable comprende o consiste en SEQ ID NO: 27 (DINNEGGTTYYADSVKG);
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
la CDR1 de cadena pesada variable comprende o consiste en SEQ ID NO: 11 (VYYMN);
la CDR3 de cadena ligera variable comprende o consiste en SEQ ID NO: 160 (ALFISNPSVE);
la CDR2 de cadena ligera variable comprende o consiste en SEQ ID NO: 119 (NTNTRHS); y
la CDR1 de cadena ligera variable comprende o consiste en SEQ ID NO: 250 (gLKSGSVtSdNFPT).
Otras combinaciones descritas de 6 CDR son aquellas combinaciones "nativas" que se producen en las variantes que han experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal humana de 27B3 enumeradas en las Tablas 14A (cadenas pesadas) y 15A (cadenas ligeras).
En las realizaciones preferidas anteriores basadas en 27B3 y sus variantes que han experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal, el anticuerpo incluye preferiblemente el dominio CH1, la región bisagra, el dominio CH2 y el dominio CH3 de un anticuerpo humano, en particular IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humanas. La realización más preferida es una IgG1 humana. Todavía se prefiere adicionalmente que la IgG1 humana desarrolle la maximización de la función efectora en una o más de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP). Es particularmente preferida una IgG1 humana no fucosilada, p.ej. una IgG1 no fucosilada producida utilizando la tecnología Potelligent™ de BioWa Inc.
Otros anticuerpos contra CD70 descritos, que exhiben una unión de alta afinidad a CD70 humana, basados en el Fab denotado 27B3 y variantes genéticamente humanas de 27B3, incluyen anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden un dominio variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 274 y SEQ ID NO: 275 y secuencias de aminoácidos que presentan al menos 90%, 95%, 97%, 98 % o 99% de identidad de secuencia con una de las secuencias citadas, y que comprenden opcionalmente un dominio variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 231, SEQ ID N O: 232, SEC ID NO: 233, SEC ID NO: 234, SEC ID NO: 234, SEC ID NO: 236, SEC ID NO: 237, SEC ID NO: 238, SEC ID NO: 239, SEC ID NO: 240, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 276 y SEQ ID NO: 277 y secuencias de aminoácidos que exhiben al menos 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con una de las secuencias enumeradas.
Aunque son permisibles todos los emparejamientos posibles de dominios VH y dominios VL seleccionados de los grupos de secuencia de dominio VH y VL enumerados anteriormente, ciertas combinaciones de VH y VL son particularmente preferidas; estas son las combinaciones "nativas" dentro de un solo Fab que exhiben unión de alta afinidad a CD70 humana. En el caso de las variantes que han experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal de 27B3 enumeradas en las Tablas 14B y 15B, puede preferirse conservar el emparejamiento original VH/VL.
Por consiguiente, los anticuerpos contra CD70 preferidos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que exhiben unión a CD70 de alta afinidad son aquellos que comprenden una combinación de un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera, en donde la combinación es:
(i) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 223 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 241;
También se describen anticuerpos contra CD70, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que exhiben unión de alta afinidad a CD70 que comprende una combinación de un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera, en donde la combinación se selecciona del grupo que consiste en:
(ii) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 178 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 190;
(iii) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 212 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 230
(iv) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 213 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 231;
(v) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 214 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 232;
(vi) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 215 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 235;
(vii) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 216 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 234;
(viii) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 217
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 235;
(ix) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 218 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 236;
(x) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 219 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 237;
(xi) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 220 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 238;
(xii) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 221 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 239;
(xiii) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 222 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 240;
(xiv) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 224 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 242;
(xv) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 225 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 243;
(xvi) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 226 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 244;
(xvii) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 227 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 245;
(xviii) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 228 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 246;
(xix) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 229 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 247;
(xx) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 223 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 244;
(xxi) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 223 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 245.
Para cada una de las combinaciones específicas de VH/VL enumeradas anteriormente, también es permisible, y dentro del alcance de la invención, combinar un dominio VH que tenga una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos 90%, 92%, 95%, 97% o 99 % a la secuencia recitada del dominio VH con un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos 90%, 92%, 95%, 97% o 99% a la secuencia enumerada del dominio VL.
La realización más preferida es un anticuerpo contra CD70 o un fragmento de unión a antígeno del mismo basados en la combinación VH/VL nativa de la variante que ha experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal indicada como 41D12. Por consiguiente, también se proporciona en la presente memoria un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 223, variantes que han experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal y variantes de afinidad de las mismas y secuencias de aminoácidos idénticas en al menos 90%, 92%, 95%, 97% o 99% a la misma, y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 241, variantes que ha experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal y variantes de afinidad de las mismas y secuencias de aminoácidos idénticas en al menos 90%, 92%, 95%, 97% o 99% a la misma.
Las realizaciones en las que la secuencia de aminoácidos del dominio VH muestra menos de 100% de identidad de secuencia con la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 223 pueden comprender CDR de cadena pesada que son idénticas a HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID NO: 223 (sEq ID NO: 11, 27 y 50, respectivamente) mientras que muestran la variación de la secuencia de aminoácidos dentro de las regiones marco. Asimismo, las realizaciones en las que la secuencia de aminoácidos del dominio VL exhibe menos del 100% de identidad de secuencia con la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 241 pueden comprender CDR de cadena pesada que son idénticas a LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 241 (SEQ ID NO: 250, 116 y 160, respectivamente) mientras que muestran la variación de la secuencia de aminoácidos dentro de las regiones marco.
En las realizaciones preferidas anteriores basadas en los dominios VH y VL de 41D12, o variantes de los mismos, el anticuerpo incluye preferiblemente el dominio CH1, la región bisagra, el dominio CH2 y el dominio CH3 de un anticuerpo humano, en particular IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humanas. La realización más preferida es una IgG1 humana. Se prefiere todavía adicionalmente que la IgG1 humana esté diseñada para maximizar la función efectora en una o más de ADCC, CDC o ADCP. Particularmente preferido es una IgG1 humana desfucosilada, preferiblemente preparada utilizando el sistema de expresión Potelligent™.
También se describe un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
consiste en: la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 225, variantes que han experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal y variantes de afinidad de la misma y secuencias de aminoácidos idénticas en al menos 90%, 95%, 97%, 98% o 99%, y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 243, variantes que han experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal y variantes de afinidad de las mismas y secuencias de aminoácidos idénticas en al menos 90%, 92%, 95%, 97% o 99% a la misma; o
También se describe un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 226, variantes que han experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal y variantes de afinidad de la misma y secuencias de aminoácidos idénticas en al menos 90%, 95%, 97%, 98% o 99%, y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 244, variantes que han experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal y variantes de afinidad de las mismas y secuencias de aminoácidos idénticas en al menos 90%, 92%, 95%, 97% o 99% a la misma.
Características/propiedades de los anticuerpos contra CD70
En los aspectos y realizaciones mencionados anteriormente, los anticuerpos contra CD70, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, pueden exhibir cada uno una o más, o cualquier combinación, de las siguientes propiedades o características:
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se puede unir a CD70 humana con alta afinidad, exhibiendo una velocidad de disociación para CD70 humana de 7 x 10-4 s-1 o menos, preferiblemente 5 x 10-4 s-1 o menos, y típicamente en el intervalo de 0,4 x 10-4 s-1 a 4,8 x 10-4 s-1, cuando se somete a ensayo como un fragmento Fab.
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD70 humana con alta afinidad e inhibir la interacción entre CD70 y CD27. Alternativamente, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD70 humana pero no inhibir la interacción entre CD70 y CD27.
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se puede unir con alta afinidad a CD70 humana en la superficie de células que expresan CD70.
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se puede unir a CD70 humana en la superficie de células que expresan CD70 y se internalizan lenta o solo parcialmente. Un aspecto clave de la invención es la observación de que los anticuerpos contra CD70 de hecho están muy poco internalizados en un gran número de líneas celulares que expresan cD70, incluyendo muchas líneas celulares de cáncer que expresan CD70. Esta observación contrasta directamente con informes publicados anteriormente de que los anticuerpos contra CD70 se internalizan rápidamente después de unirse a líneas celulares de carcinoma de células renales (véanse Adam et al., British Journal of Cancer (2006) 95:298-306; y documento WO 2007/038637) y tiene implicaciones directas para el uso terapéutico de los anticuerpos. La observación de que los anticuerpos contra CD70 están muy poco internalizados después de unirse a células cancerosas apoya firmemente la conclusión de que las estrategias terapéuticas para el tratamiento de muchos cánceres que expresan CD70 y de enfermedades inmunológicas asociadas con CD70 deberían basarse en una unión extremadamente alta a CD70, acoplada a la función efectora de anticuerpos, en particular una o más de ADCC, CDC o ADCP, y no en el uso de productos inmunoconjugados en los que el anticuerpo contra CD70 está unido a un agente terapéutico, por ejemplo un radical de fármaco citotóxico o citostático.
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se puede unir dentro de la secuencia de aminoácidos HIQVTLAICSS (SEQ ID NO: 342) en CD70 humana;
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede exhibir reactividad cruzada con CD70 con origen de simio, específicamente los homólogos de CD70 de macaco rhesus (Macaca mulatta) y de mono cinomolgo (Macaca cynomolgus).
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se puede unir a CD70 humana nativa (p.ej., CD70 expresada en la superficie de una célula, tal como una línea celular o una célula que expresa CD70 aislada de un paciente humano) y CD70 humana recombinante desnaturalizada por calor.
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno pueden proporcionar rendimientos de producción muy altos (>4 g/l) en sistemas de expresión de anticuerpos recombinantes, tales como por ejemplo la línea celular CHK1SV (propiedad de BioWa/Lonza), en comparación con una media histórica de 1-2 g/L para los productos de anticuerpos
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
terapéuticos, lo que da como resultado una reducción sustancial en los costes de producción.
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede ser altamente estable en condiciones de almacenamiento a 37°C y en ciclos de congelación-descongelación, que también es un factor de reducción de costes importante.
El anticuerpo puede exhibir una o más funciones efectoras seleccionadas entre citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC), citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) y fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCP) contra células que expresan proteína CD70 humana en la superficie celular.
El anticuerpo puede exhibir ADCC contra células que expresan CD70, v.g. células cancerosas u otras células malignas, o células inmunes.
El anticuerpo puede mostrar una función de ADCC potenciada en comparación con un anticuerpo de referencia que es un anticuerpo equivalente que comprende un dominio de Fc humano nativo. En una realización no limitante, la función de ADCC puede estar potenciada al menos 10 veces en comparación con el anticuerpo de referencia que comprende un dominio de Fc humano nativo. En este contexto, puede entenderse que "equivalente" significa que el anticuerpo con función ADCC potenciada muestra una especificidad de unión a antígeno sustancialmente idéntica y/o comparte una secuencia de aminoácidos idéntica con el anticuerpo de referencia, excepto por cualquier modificación realizada (en relación con Fc humano nativo) con el propósito de mejorar la ADCC.
El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno puede inhibir el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto tumoral in vivo, en ausencia de conjugación con un agente citotóxico o citostático. En una realización no limitante, la inhibición de la función de crecimiento tumoral puede ser potenciada al menos 10 veces en comparación con el anticuerpo de referencia SGN70.
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede inducir apoptosis de células que expresan CD70.
El anticuerpo puede contener la región bisagra, el dominio CH2 y el dominio CH3 de una IgG humana, lo más preferiblemente IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humanas.
El anticuerpo puede incluir modificaciones en la región Fc, tales como modificaciones que mejoran la función efectora del anticuerpo como se explica en otra parte en la presente memoria. En particular, el anticuerpo puede ser una IgG no fucosilada.
En aspectos adicionales, la invención también proporciona moléculas de polinucleótidos que codifican los anticuerpos contra CD70 enumerados anteriormente y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, además de vectores de expresión que comprenden los polinucleótidos, células anfitrionas que contienen los vectores y métodos de expresión/producción recombinante de los anticuerpos contra CD70.
En otro aspecto adicional, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende uno cualquiera de los anticuerpos contra CD70 descritos anteriormente y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptables.
Otro aspecto más de la invención se refiere a los métodos de tratamiento médico que utilizan los anticuerpos contra CD70 enumerados anteriormente, particularmente en el tratamiento del cáncer.
Breve descripción de los dibujos
La invención se comprenderá mejor con referencia a los siguientes ejemplos experimentales y a las figuras adjuntas en las que:
Figura 1: Muestra la respuesta inmunitaria sometida a ensayo en ELISA en CD70 recombinante para llamas inmunizadas con células 786-O (parte superior) y con células Raji (parte inferior).
Figura 2: ilustra la inhibición de la unión de cD27 a CD70 por Fab contra CD70 derivados de llama y Fab contra CD70 de referencia, medidos mediante ELISA.
Figura 3: es una representación gráfica de la señal para Fab derivados de llama sometidos a ensayo en un Elisa de unión (color negro) o en un Elisa de inhibición (color blanco).
Figura 4: ilustra la inhibición de la unión de CD27 a CD70 humana (A y B) o CD70 de rhesus (C) por los mAb de llama-humanos contra CD70 y los mAb contra CD70 de referencia medida mediante ELISA.
Figura 5: muestra la unión de los mAb contra CD70 de llama-humanos quiméricos a células 786-O (A) o células MHH-PREB-1 (B) como se demuestra mediante análisis FACS.
Figura 6: muestra la inhibición por los mAb de llama-humanos quiméricos específicos de CD70 en un ensayo de potencia de co-cultivo basado en células Raji.
Figura 7: muestra los resultados de un ensayo de liberación de Cr51 en ADCC sobre células 786-O.
Figura 8: muestra los resultados del ensayo de CDC sobre células U266 en presencia de suero humano al
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Figura 9: demuestra la eficacia de los mAb contra CD70 llama-humanos quiméricos en un ensayo de ADCP en células 786-O
Figura 10: ilustra la intemalización del anticuerpo, evaluada como IMF OUT para diferentes mAb de llama- humanos contra CD70 quiméricos en función del tiempo sobre células 786-O en dos experimentos independientes.
Figura 11: demuestra la supervivencia de ratones en un modelo de xenoinjerto Raji después del tratamiento con mAb quimérico de llama-humano contra CD70 41D12, control de isotipo y Fc-control de muerte.
Figura 12: representa alineamientos de las secuencias de aminoácidos de VH y VL del clon 27B3 con las secuencias de aminoácidos de los segmentos del gen de la línea germinal humana VH3-38 y VL8-61, respectivamente.
La Figura 13 muestra el análisis de filtración en gel de muestras de variantes de mAb de 27B3 que han experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal tomadas después de 5 semanas de incubación a 37°C.
Figura 14: muestra la potencia en la unión de CD70, medida utilizando Biacore, de muestras de mAb contra CD70 que han experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal tomados en diversos momentos después de la incubación a diversas temperaturas.
La Figura 15 muestra la afinidad de unión de los mAb contra CD70 por líneas celulares de cáncer que expresan CD70.
La Figura 16 muestra la afinidad de los mAb contra CD70 por células de pacientes de LLC que expresan CD70.
La Figura 17 muestra la lisis de células SU-DHL-6 a las que se unen los mAb contra CD70.
La Figura 18 muestra la inhibición de la unión de CD27 a CD70 por los mAb contra CD70, medida mediante ELISA.
Figura 19: muestra un alineamiento de las secuencias de CD70 de diferentes especies.
Figura 20: muestra la afinidad de unión de los mAb contra CD70 por células U266 humanas, células LCL8864 de mono rhesus y células HSC-F de mono cinomolgo.
Figura 21: muestra la inhibición de la unión de CD27 a CD70 humana, de mono rhesus y de mono cinomolgo por los mAb contra CD70 según se determina mediante ELISA.
Figura 22: muestra la unión de los mAb contra CD70 a CD70 recombinante desnaturalizada, evaluada mediante ELISA.
Figura 23: muestra secuencias quiméricas de CD70 utilizadas para el mapeo de epítopos.
Figura 24: ilustra la internalización del anticuerpo para los mAb contra CD70 en función del tiempo en células 786-O.
Definiciones
"Anticuerpo" o "Inmunoglobulina" - Según se utiliza en la presente memoria, el término "inmunoglobulina" incluye un polipéptido que tiene una combinación de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, independientemente de que posea o no inmunorreactividad específica relevante. "Anticuerpos" se refiere a tales conjuntos que tienen actividad inmunorreactiva específica conocida significativa para un antígeno de interés (p.ej., CD70 humana). El término "anticuerpos contra CD70" se utiliza en la presente memoria para referirse a anticuerpos que exhiben especificidad inmunológica para la proteína CD70 humana. Como se explica en otra parte en la presente memoria, la "especificidad" para CD70 humana no excluye la reacción cruzada con homólogos de especies de CD70. Los anticuerpos e inmunoglobulinas comprenden cadenas ligeras y pesadas, con o sin un enlace covalente intercatenario entre ellas. Las estructuras básicas de inmunoglobulinas en los sistemas de vertebrados son relativamente bien entendidas.
El término genérico "inmunoglobulina" comprende cinco clases distintas de anticuerpos que se pueden distinguir bioquímicamente. Las cinco clases de anticuerpos están dentro del alcance de la presente invención, la siguiente discusión generalmente se dirigirá a la clase IgG de moléculas de inmunoglobulina. Con respecto a IgG, las inmunoglobulinas comprenden dos cadenas polipeptídicas ligeras idénticas de peso molecular de aproximadamente 23.000 Daltons, y dos cadenas pesadas idénticas de peso molecular 53.000-70.000. Las cuatro cadenas están unidas mediante enlaces disulfuro en una configuración en "Y" en la que las cadenas ligeras se acoplan a las cadenas pesadas comenzando en la boca de la "Y" y continuando a través de la región variable.
Las cadenas ligeras de un anticuerpo se clasifican como kappa o lambda (k, A). Cada clase de cadena pesada puede estar unida a una cadena ligera kappa o lambda. En general, las cadenas ligera y pesada se unen covalentemente entre sí, y las porciones de "cola" de las dos cadenas pesadas se unen entre sí mediante enlaces disulfuro covalentes o enlaces no covalentes cuando las inmunoglobulinas se generan por hibridomas, células B o células anfitrionas modificadas. En la cadena pesada, las secuencias de aminoácidos se ejecutan desde un extremo N en los extremos bifurcados de la configuración Y hasta el extremo C en la parte inferior de cada cadena. Los expertos en la técnica apreciarán que las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, (y, |j, a, 8, £) con algunas subclases entre ellas (p.ej., y1 - Y4). Es la naturaleza de esta cadena la que determina la
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
"clase" del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD o IgE, respectivamente. Las subclases de inmunoglobulinas (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, etc. están bien caracterizadas y se sabe que confieren especialización funcional. Las versiones modificadas de cada una de estas clases e isotipos son fácilmente discernibles para el experto en la técnica a la vista de la presente descripción y, en consecuencia, están dentro del alcance de la presente invención.
Como se indicó anteriormente, la región variable de un anticuerpo permite que el anticuerpo reconozca selectivamente y se una específicamente a epítopos sobre los antígenos. Es decir, el dominio VL y el dominio VH de un anticuerpo se combinan para formar la región variable que define un sitio de unión a antígeno tridimensional. Esta estructura de anticuerpo cuaternario forma el sitio de unión al antígeno presente al final de cada brazo de la Y. Más específicamente, el sitio de unión al antígeno se define por tres regiones determinantes complementarias (CDR) en cada una de las cadenas VH y VL.
"Proteína CD70" o "antígeno CD70" — Según se utiliza en la presente memoria, los términos "proteína CD70" o "antígeno CD70" o "CD70" se utilizan indistintamente y se refieren a un miembro de la familia del ligando TNF que es un ligando para TNFRSF27/CD27. Los términos "proteína CD70 humana" o "antígeno CD70 humano" o "CD70 humana" se utilizan indistintamente para referirse específicamente al homólogo humano, incluyendo la proteína CD70 humana nativa expresada naturalmente en el cuerpo humano y/o en la superficie de líneas celulares humanas cultivadas, así como formas recombinantes y fragmentos de las mismas. Los ejemplos específicos de CD70 humana incluyen el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en el Número de Acceso a Secuencias de Referencia del nCbI NP_001243, o su dominio extracelular.
"Sitio de unión" — Según se utiliza en la presente memoria, el término "sitio de unión" comprende una región de un polipéptido que es responsable de unirse selectivamente a un antígeno diana de interés (p.ej., CD70 humana). Los dominios de unión comprenden al menos un sitio de unión. Los dominios de unión ilustrativos incluyen un dominio variable de anticuerpo. Las moléculas de anticuerpo de la invención pueden comprender un único sitio de unión o múltiples (p.ej., dos, tres o cuatro) sitios de unión.
"Derivado de" — Según se utiliza en la presente memoria, el término "derivado de" una proteína designada (p.ej., un anticuerpo contra CD70 o un fragmento de unión a antígeno del mismo) se refiere al origen del polipéptido. En una realización, el polipéptido o la secuencia de aminoácidos que deriva de un polipéptido de partida concreto es una secuencia de CDR o una secuencia relacionada con la misma. En una realización, la secuencia de aminoácidos que deriva de un polipéptido de partida particular no es contigua. Por ejemplo, en una realización, una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR derivan de un anticuerpo de partida. En una realización, el polipéptido o la secuencia de aminoácidos que deriva de un polipéptido de partida o secuencia de aminoácidos concreta tiene una secuencia de aminoácidos que es esencialmente idéntica a la de la secuencia de partida, o una porción de la misma en la que la porción consiste en al menos 3-5 aminoácidos, al menos 5-10 aminoácidos, al menos 10-20 aminoácidos, al menos 20-30 aminoácidos, o al menos 30-50 aminoácidos, o que de otro modo es identificable para un experto en la técnica tiene su origen en la secuencia de partida. En una realización, las una o más secuencias de CDR derivadas del anticuerpo de partida se alteran para producir secuencias de CDR variantes, p.ej. variantes de afinidad, en donde las secuencias variantes de CDR mantienen la actividad de unión a CD70.
"Derivado de Camélido" — En ciertas realizaciones preferidas, las moléculas de anticuerpo contra CD70 de la invención comprenden secuencias de aminoácidos marco y/o secuencias de aminoácidos de CDR derivadas de un anticuerpo convencional de camélido originadas por la inmunización activa de un camélido con antígeno CD70. Sin embargo, los anticuerpos contra CD70 que comprenden secuencias de aminoácidos derivadas de camélidos se pueden diseñar para comprender secuencias marco y/o de región constante derivadas de una secuencia de aminoácidos humana (es decir, un anticuerpo humano) u otras especies de mamíferos no camélidos. Por ejemplo, se pueden incluir una región marco humana o de primate no humano, una porción de cadena pesada, y/o una porción bisagra en los anticuerpos contra CD70 en cuestión. En una realización, pueden estar presentes uno o más aminoácidos que no son de camélido en la región marco de un anticuerpo contra CD70 "derivado de camélido", por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de la estructura del camélido puede comprender una o más mutaciones de aminoácidos en las que está presente el residuo de aminoácido humano o de primate no humano. Además, los dominios VH y VL derivados de camélido, o variantes humanizadas de los mismos, se pueden unir a los dominios constantes de anticuerpos humanos para producir una molécula quimérica, como se describe extensamente en otra parte de la presente memoria.
"Sustitución de aminoácidos conservativa" - Una "sustitución de aminoácidos conservativa" es una en la que el residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica, incluyendo cadenas laterales alcalinas (p.ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (p.ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (p.ej., glicina, asparragina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
(p.ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por lo tanto, un residuo de aminoácido no esencial en un polipéptido de inmunoglobulina puede reemplazarse por otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadena lateral. En otra realización, una cadena de aminoácidos puede reemplazarse por una cadena estructuralmente similar que difiere en el orden y/o composición de los miembros de la familia de la cadena lateral.
"Porción de cadena pesada" — Según se utiliza en la presente memoria, el término "porción de cadena pesada" incluye secuencias de aminoácidos derivadas de los dominios constantes de una cadena pesada de inmunoglobulina. Un polipéptido que comprende una porción de cadena pesada comprende al menos uno de: un dominio CH1, un dominio bisagra (p.ej., región bisagra superior, media y/o inferior), un dominio CH2, un dominio CH3 o una de sus variantes o fragmentos. En una realización, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención puede comprender la porción Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina (p.ej., una porción bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3). En otra realización, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención puede carecer al menos de una porción de un dominio constante (p.ej., todo o parte de un dominio CH2). En ciertas realizaciones, al menos uno, y preferiblemente todos, los dominios constantes derivan de una cadena pesada de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, en una realización preferida, la porción de cadena pesada comprende un dominio bisagra completamente humano. En otras realizaciones preferidas, la porción de cadena pesada comprende una porción de Fc completamente humana (p.ej., bisagra, secuencias de dominio CH2 y CH3 de una inmunoglobulina humana).
En ciertas realizaciones, los dominios constantes constitutivos de la porción de cadena pesada son de diferentes moléculas de inmunoglobulina. Por ejemplo, una porción de cadena pesada de un polipéptido puede comprender un dominio CH2 derivado de una molécula IgG1 y una región bisagra derivada de una molécula IgG3 o IgG4. En otras realizaciones, los dominios constantes son dominios quiméricos que comprenden porciones de diferentes moléculas de inmunoglobulina. Por ejemplo, una bisagra puede comprender una primera porción de una molécula de IgG1 y una segunda porción de una molécula de IgG3 o IgG4. Tal como se establece anteriormente, un experto en la técnica entenderá que los dominios constantes de la porción de cadena pesada pueden modificarse de manera que difieran en la secuencia de aminoácidos de la molécula de inmunoglobulina natural (de tipo salvaje). Es decir, los polipéptidos de la invención descritos en la presente memoria pueden comprender alteraciones o modificaciones en uno o más de los dominios constantes de la cadena pesada (CH1, bisagra, CH2 o CH3) y/o en el dominio de la región constante de la cadena ligera (CL). Las modificaciones ilustrativas incluyen adiciones, deleciones o sustituciones de uno o más aminoácidos en uno o más dominios.
"Quimérica" — Una proteína "quimérica" comprende una primera secuencia de aminoácidos unida a una segunda secuencia de aminoácidos con la que no está naturalmente unida en la naturaleza. Las secuencias de aminoácidos pueden existir normalmente en proteínas separadas que se ponen en contacto en el polipéptido de fusión o pueden existir normalmente en la misma proteína pero se colocan en una nueva disposición en el polipéptido de fusión. Se puede crear una proteína quimérica, por ejemplo, mediante síntesis química, o creando y traduciendo un polinucleótido en el que las regiones peptídicas están codificadas en la relación deseada. Los anticuerpos quiméricos contra CD70 ilustrativos incluyen proteínas de fusión que comprenden dominios VH y VL derivados de camélidos, o variantes humanizadas de los mismos, fusionados a los dominios constantes de un anticuerpo humano, p.ej. IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humano.
"Región variable" o "dominio variable" — Los términos "región variable" y "dominio variable" se utilizan indistintamente en la presente memoria y se pretende que tengan un significado equivalente. El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables VH y VL difieren ampliamente en secuencia entre anticuerpos y se utilizan en la unión y especificidad de cada anticuerpo concreto para su antígeno diana. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida uniformemente en todos los dominios variables de anticuerpos. Se concentra en tres segmentos llamados "bucles hipervariables" en cada uno del dominio VL y el dominio VH que forman parte del sitio de unión al antígeno. Los bucles hipervariables primero, segundo y tercero del dominio de la cadena ligera VLambda se denominan en la presente memoria L1(A), L2(A) y L3(A) y se pueden definir por comprender los residuos 24-33 (L1(A), que consiste en los residuos de aminoácidos 9, 10 u 11), 49-53 (L2(A), que consiste en 3 residuos) y 90-96 (L3(A), que consiste en 5 residuos) en el dominio VL (Morea et al., Methods 20:267- 279 (2000)). Los bucles hipervariables primero, segundo y tercero del dominio de la cadena ligera VKappa se denominan en la presente memoria L1(k), L2(k) y L3(k) y se pueden definir por comprender los residuos 25-33 (L1(K), que consiste en los residuos 6, 7, 8, 11, 12 o l3), 49-53 (L2(K), que consiste en 3 residuos) y 90-97 (L3(K), que consiste en 6 residuos) en el dominio VL (Morea et al., Methods 20:267-279 (2000)). El primer, segundo y tercer bucles hipervariables del dominio VH se denominan en la presente memoria HI, H2 y H3 y se pueden definir por comprender los residuos 25-33 (H1, que consiste en 7, 8 o 9 residuos), 52-56 (H2, que consiste en 3 o 4 residuos) y 91-105 (H3, altamente variable en longitud) en el dominio VH (Morea et al., Methods 20:267-279 (2000)).
A menos que se indique lo contrario, los términos L1, L2 y L3 se refieren respectivamente al primer, segundo y tercer bucles hipervariables de un dominio VL, y abarcan bucles hipervariables obtenidos de ambos isotipos Vkappa y Vlambda. Los términos HI, H2 y H3 respectivamente se refieren al primer, segundo y tercer bucles hipervariables del dominio VH, y abarcan bucles hipervariables obtenidos de cualquiera de los isotipos de cadena pesada conocidos,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
que incluyen y, £, 5, a o p.
Los bucles hipervariables L1, L2, L3, H1, H2 y H3 pueden comprender cada uno parte de una "región determinante de complementariedad" o "CDR", como se define a continuación. Los términos "bucle hipervariable" y "región determinante de complementariedad" no son estrictamente sinónimos, ya que los bucles hipervariables (HV) se definen sobre la base de la estructura, mientras que las regiones determinantes de complementariedad (CDR) se definen en función de la variabilidad de secuencia (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD., 1983) y los límites de los HV y las CDR pueden ser diferentes en algunos dominios VH y VL.
Las CDR de los dominios VL y VH pueden definirse típicamente por que comprender los siguientes aminoácidos: residuos 24-34 (CDRL1), 50-56 (CdRl2) y 89-97 (CDrL3) en el dominio variable de la cadena ligera, y residuos 3135 o 31-35b (CDRH1), 50-65 (CDRH2) y 95-102 (CDRH3) en el dominio variable de la cadena pesada; (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD. (1991)). Por tanto, los HV pueden estar comprendidos dentro de las CDR correspondientes y debe interpretarse que las referencias en la presente memoria a los "bucles hipervariables" de los dominios VH y VL también abarcan las CDR correspondientes, y viceversa, a menos que se indique lo contrario.
Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan región marco (FR), como se define a continuación. Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro FR (FR1, FR2, FR3 y FR4, respectivamente), que adoptan en gran parte una configuración de hoja p, conectada por los tres bucles hipervariables. Los bucles hipervariables en cada cadena son mantenidos en estrecha proximidad por las FR y, con los bucles hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos. El análisis estructural de anticuerpos reveló la relación entre la secuencia y la forma del sitio de unión formado por las regiones determinantes de complementariedad (Chothia et al., J. Mol. Biol. 227:799-817 (1992); Tramontano et al., J. Mol. Biol, 215:175-182 (1990)). A pesar de su alta variabilidad de secuencia, cinco de los seis bucles adoptan solo un pequeño repertorio de conformaciones de cadena principal, llamadas "estructuras canónicas". Estas conformaciones están determinadas, en primer lugar, por la longitud de los bucles y, en segundo lugar, por la presencia de residuos clave en ciertas posiciones en los bucles y en las regiones marco que determinan la conformación a través de su empaquetamiento, formación de enlaces de hidrógeno o la capacidad de adoptar conformaciones de cadena principal inusuales.
"CDR" — Según se utiliza en la presente memoria, el término "CDR" o "región determinante de la complementariedad" significa los sitios de combinación de antígenos no contiguos encontrados dentro de la región variable de ambos polipéptidos de cadena pesada y ligera. Estas regiones concretas han sido descritas por Kabat et al., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977) y Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. (1991), y por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) y por MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996) donde las definiciones incluyen solapamiento o subconjuntos de residuos de aminoácidos cuando se comparan entre sí. Los residuos de aminoácidos que abarcan las CDR como se define mediante cada una de las referencias citadas anteriormente se exponen para comparación. Preferiblemente, el término "CDR" es una CDR tal como define Kabat basándose en comparaciones de secuencias.
Tabla 1: Definiciones de CDR
Definiciones de CDR
Kabat1
Chothia2 MacCallum3
CDR1 Vh
31-35 26-32 30-35
CDR2 Vh
50-65 53-55 47-58
CDR3 Vh
95-102 96-101 93-101
VlCDR1
24-34 26-32 30-36
VlCDR2
50-56 50-52 46-55
VlCDR3
89-97 91-96 89-96
Ya numeración de residuos sigue la nomenclatura de Kabat et al., Supra 2La numeración de residuos sigue la nomenclatura de Chothia et al., Supra 3La numeración de residuos sigue la nomenclatura de MacCallum et al., Supra
"Región marco" — El término "región marco" o "región FR" según se utiliza en la presente memoria, incluye los residuos de aminoácidos que son parte de la región variable, pero que no son parte de las CDR (p.ej., utilizando la definición de CDR de Kabat). Por lo tanto, un marco de región variable tiene entre aproximadamente 100-120
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
aminoácidos de longitud, pero incluye solo aquellos aminoácidos fuera de las CDR. Para el ejemplo específico de un dominio variable de cadena pesada y para las CDR definidas por Kabat et al., La región marco 1 corresponde al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 1-30; la región marco 2 corresponde al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 36-49; la región marco 3 corresponde al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 66-94, y la región marco 4 corresponde al dominio de la región variable desde el aminoácido 103 hasta el final de la región variable. Las regiones marco de la cadena ligera están separadas de forma similar por cada una de las CDR de región variable de la cadena ligera. Del mismo modo, utilizando la definición de CDR de Chothia et al. o McCallum et al. los límites de la región marco están separados por los respectivos extermos de las CDR como se describió anteriormente. En realizaciones preferidas, las CDR son las definidas por Kabat.
En los anticuerpos de origen natural, las seis CDR presentes en cada anticuerpo monomérico son secuencias cortas, no contiguas de aminoácidos que están colocadas específicamente para formar el sitio de unión al antígeno cuando el anticuerpo adopta su configuración tridimensional en un entorno acuoso. El resto de los dominios variables pesados y ligeros muestran una menor variabilidad intermolecular en la secuencia de aminoácidos y se denominan regiones marco. Las regiones marco adoptan en gran parte una conformación de hoja p y las CDR forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina p. Por lo tanto, estas regiones marco actúan formando un andamio que proporciona el posicionamiento de las seis CDR en la orientación correcta mediante interacciones entre cadenas, no covalentes. El sitio de unión al antígeno formado por las CDR posicionadas define una superficie complementaria al epítopo en el antígeno inmunorreactivo. Esta superficie complementaria promueve la unión no covalente del anticuerpo al epítopo del antígeno inmunorreactivo. La posición de las CDR puede ser identificada fácilmente por un experto en la técnica.
"Región bisagra" — Según se utiliza en la presente memoria, el término "región bisagra" incluye la porción de una molécula de cadena pesada que une el dominio CH1 al dominio CH2. Esta región bisagra comprende aproximadamente 25 residuos y es flexible, permitiendo así que las dos regiones de unión al antígeno N-terminales se muevan de forma independiente. Las regiones bisagra se pueden subdividir en tres dominios distintos: dominio bisagra superior, medio e inferior (Roux et al. J. Immunol. 1998 161:4083) Los anticuerpos contra CD70 que comprenden una región bisagra "completamente humana" pueden contener una de las secuencias de la región bisagra mostradas en la Tabla 2 a continuación.
Tabla 2: Secuencias bisagra humanas
IgG
Bisagra superior Bisagra media Bisagra inferior
igG1
EPKSCDKTHT (SEQ ID NO: 320) CPPCP (SEQ ID NO: 321) APELLGGP (SEQ ID NO: 322)
IgG3
ELKTPLGDTTHT (SEQ ID NO: 323) CPRCP (EPKSCDTPPPCPRCP)a (SEQ ID NO: 324) APELLGGP (SEQ ID NO: 325)
IgG4
ESKYGPP (SEQ ID NO: 326) CPSCP (SEQ ID NO: 327) APEFLGGP (SEQ ID NO: 328)
IgG42
ERK (SEQ ID NO: 329) CCVECPPPCP (SEQ ID NO: 330) APPVAGP (SEQ ID NO: 331)
"Dominio CH2" — Según se utiliza en la presente memoria, el término "dominio CH2" incluye la porción de una molécula de cadena pesada que se extiende, por ejemplo, desde aproximadamente el residuo 244 al residuo 360 de un anticuerpo utilizando esquemas de numeración convencionales (residuos 244 a 360, sistema de numeración de Kabat; residuos 231-340, sistema de numeración UE, Kabat EA y col. Sequences of Proteins of Immunological Interest. Bethesda, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., NIH. 1991) El dominio CH2 es único en el sentido de que no está estrechamente emparejado con otro dominio. Por el contrario, dos cadenas de carbohidratos ramificadas ligadas a N se interponen entre los dos dominios CH2 de una molécula de IgG nativa intacta. También está bien documentado que el dominio CH3 se extiende desde el dominio CH2 hasta el extremo C de la molécula IgG y comprende aproximadamente 108 residuos.
"Fragmento" — El término "fragmento" se refiere a una parte o porción de un anticuerpo o cadena de anticuerpo que comprende menos residuos de aminoácidos que un anticuerpo o cadena de anticuerpo intactos o completos. El término "fragmento de unión a antígeno" se refiere a un fragmento polipeptídico de una inmunoglobulina o anticuerpo que se une al antígeno o compite con el anticuerpo intacto (es decir, con el anticuerpo intacto del que derivaron) para la unión al antígeno (es decir, unión específica a CD70 humana). Según se utiliza en la presente memoria, el término "fragmento" de una molécula de anticuerpo incluye fragmentos de anticuerpos que se unen a antígenos, por ejemplo, un dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo, un dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo, un anticuerpo de cadena sencilla (scFv), un fragmento F(ab')2, un fragmento Fab, un fragmento Fd, un fragmento Fv y un fragmento de anticuerpo de dominio único (DAb). Se pueden obtener fragmentos, por ejemplo,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
mediante tratamiento químico o enzimático de un anticuerpo o cadena de anticuerpo intactos o completos o mediante medios recombinantes.
"Valencia" Según se utiliza en la presente memoria, el término "valencia" se refiere al número de sitios potenciales de unión a la diana en un polipéptido. Cada sitio de unión a la diana se une específicamente a una molécula diana o sitio específico en una molécula diana. Cuando un polipéptido comprende más de un sitio de unión a la diana, cada sitio de unión a la diana puede unirse específicamente a moléculas iguales o diferentes (p.ej., se puede unir a diferentes ligandos o diferentes antígenos, o diferentes epítopos en el mismo antígeno). Las moléculas de unión sujeto tienen al menos un sitio de unión específico para una molécula de CD70 humana.
"Especificidad" - El término "especificidad" se refiere a la capacidad de unirse (p.ej., inmunoreaccionar con) una diana dada, p.ej., CD70. Un polipéptido puede ser monoespecífico y contener uno o más sitios de unión que se unen específicamente a una diana o un polipéptido puede ser multiespecífico y contener dos o más sitios de unión que se unen específicamente a las mismas o diferentes dianas. En una realización, un anticuerpo de la invención es específico para más de una diana. Por ejemplo, en una realización, una molécula de unión multiespecífica de la invención se une a CD70 y a una segunda molécula expresada en una célula tumoral. En la técnica se conocen anticuerpos ilustrativos que comprenden sitios de unión a antígeno que se unen a antígenos expresados en células tumorales y se pueden incluir una o más CDR de tales anticuerpos en un anticuerpo de la invención.
"Sintético" — Según se utiliza en la presente memoria, el término "sintético" con respecto a los polipéptidos incluye polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que no se produce de forma natural. Por ejemplo, polipéptidos no naturales que son formas modificadas de polipéptidos naturales (p.ej., que comprenden una mutación tal como una adición, sustitución o deleción) o que comprenden una primera secuencia de aminoácidos (que puede ser de origen natural o no) que se une en una secuencia lineal de aminoácidos a una segunda secuencia de aminoácidos (que puede ser de origen natural o no) a la que no está naturalmente unida en la naturaleza.
"Modificado" — Según se utiliza en la presente memoria, el término "modificado" incluye la manipulación de moléculas de ácido nucleico o polipéptido por medios sintéticos (p.ej., por técnicas recombinantes, síntesis de péptidos in vitro, mediante acoplamiento enzimático o químico de péptidos o alguna combinación de estas técnicas). Preferiblemente, los anticuerpos de la invención se modifican, incluyendo, por ejemplo, anticuerpos humanizados y/o quiméricos, y anticuerpos que se han modificado para mejorar una o más propiedades, tales como la unión a antígeno, la estabilidad/vida media o la función efectora.
"Anticuerpo modificado" — Según se utiliza en la presente memoria, el término "anticuerpo modificado" incluye formas sintéticas de anticuerpos que están alterados de tal forma que no son naturales, p.ej., anticuerpos que comprenden al menos dos porciones de cadena pesada pero no dos cadenas pesadas completas (tales como anticuerpos o minicuerpos de dominio suprimido); formas multiespecíficas de anticuerpos (p.ej., biespecíficas, triespecíficas, etc.) alteradas para unirse a dos o más antígenos diferentes o a diferentes epítopos en un único antígeno); moléculas de cadena pesada unidas a moléculas scFv y similares. Las moléculas de ScFv son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Núm. 5.892.019. Además, el término "anticuerpo modificado" incluye formas multivalentes de anticuerpos (p.ej., anticuerpos trivalentes, tetravalentes, etc., que se unen a tres o más copias del mismo antígeno). En otra realización, un anticuerpo modificado de la invención es una proteína de fusión que comprende al menos una porción de cadena pesada que carece de un dominio CH2 y que comprende un dominio de unión de un polipéptido que comprende la porción de unión de un miembro de un par receptor-ligando.
El término "anticuerpo modificado" también se puede utilizar en la presente memoria para referirse a las variantes de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo contra CD70. Un experto en la técnica entenderá que un anticuerpo contra CD70 puede modificarse para producir un anticuerpo contra CD70 variante que varía en la secuencia de aminoácidos en comparación con el anticuerpo contra CD70 a partir del que se obtiene. Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones de nucleótidos o aminoácidos que conducen a sustituciones conservativas o cambios en residuos de aminoácidos "no esenciales" (p.ej., en residuos de CDR y/o marco). Las sustituciones de aminoácidos pueden incluir el reemplazo de uno o más aminoácidos por un aminoácido natural o no natural.
"Sustituciones humanizantes" — Según se utiliza en la presente memoria, el término "sustituciones humanizantes" se refiere a sustituciones de aminoácidos en las que el residuo de aminoácido presente en una posición concreta en el dominio VH o VL de un anticuerpo contra CD70 (p.ej., un anticuerpo contra CD70 derivado de camélido) es reemplazado por un residuo de aminoácido que se produce en una posición equivalente en un dominio VH o VL humano de referencia. El dominio VH o VL humano de referencia puede ser un dominio VH o VL codificado por la línea germinal humana. Las sustituciones humanizantes pueden realizarse en las regiones marco y/o las CDR de un anticuerpo contra CD70, definidas en la presente memoria.
'Variantes humanizadas" — Según se utiliza en la presente memoria, el término "variante humanizada" se refiere a
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
un anticuerpo variante que contiene una o más "sustituciones humanizantes" en comparación con un anticuerpo contra CD70 de referencia, en donde una porción del anticuerpo de referencia (p.ej., el dominio VH y/o el dominio Vl o partes de los mismos que contienen al menos una CDR) tiene un amino derivado de una especie no humana, y las "sustituciones humanizantes" se producen dentro de la secuencia de aminoácidos derivada de una especie no humana.
"Variantes que han experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal" — El término "variante que ha experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal" se utiliza en la presente memoria para referirse específicamente a "variantes humanizadas" en las que las "sustituciones humanizantes" dan como resultado el reemplazo de uno o más residuos de aminoácidos presentes en una o varias posiciones concretas en el dominio VH o VL de un anticuerpo contra CD70 (por ejemplo un anticuerpo contra CD70 derivado de camélido) con un residuo de aminoácido que se produce en una posición equivalente en un dominio VH o VL humano de referencia codificado por la línea germinal humana. Es típico que para cualquier "variante que ha experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal" dada, los residuos de aminoácidos del remplazo sustituidos en la variante que ha experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal se tomen exclusivamente, o predominantemente, de un único dominio VH o VL codificado por la línea germinal humana. Los términos "variante humanizada" y "variante que ha experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal" se utilizan a menudo indistintamente en la presente memoria. La introducción de una o más "sustituciones humanizantes" en un dominio VH o VL derivado de un camélido (p.ej., derivado de llama) da como resultado la producción de una "variante humanizada" del dominio VH o VL derivado de camélido (llama). Si los residuos de aminoácidos sustituidos derivan predominantemente o exclusivamente de una única secuencia de dominio VH o VL codificada por línea germinal humana, el resultado puede ser una "variante que ha experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal humana" del dominio VH o VL derivado de camélido (llama).
"Variantes de afinidad" — Según se utiliza en la presente memoria, el término "variante de afinidad" se refiere a un anticuerpo variante que exhibe uno o más cambios en la secuencia de aminoácidos en comparación con un anticuerpo contra CD70 de referencia, en donde la variante de afinidad exhibe una alteración de la afinidad por la proteína CD70 humana en comparación al anticuerpo de referencia. Típicamente, las variantes de afinidad exhibirán una modificación de la afinidad por la CD70 humana, en comparación con el anticuerpo contra CD70 de referencia. Preferiblemente, la variante de afinidad exhibirá mejora de la afinidad por CD70 humana, en comparación con el anticuerpo contra CD70 de referencia. La mejora puede ser evidente en forma de una Kd más baja, para CD70 humana, o una velocidad de liberación más lenta para CD70 humana o una alteración en el patrón de reactividad cruzada con homólogos de CD70 no humanos. Las variantes de afinidad muestran típicamente uno o más cambios en la secuencia de aminoácidos en las CDR, en comparación con el anticuerpo contra CD70 de referencia. Dichas sustituciones pueden dar como resultado la sustitución del aminoácido original presente en una posición dada en las CDR con un residuo de aminoácido diferente, que puede ser un residuo de aminoácido de origen natural o un residuo de aminoácido no natural. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser conservativas o no conservativas.
"Alta homología humana" — Se considerará que un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL) tiene una alta homología humana si los dominios VH y VL, en conjunto, presentan al menos 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias de VH y Vl de la línea germinal humana que coinciden más estrechamente. Los anticuerpos que tienen una alta homología humana pueden incluir anticuerpos que comprenden dominios VH y VL de anticuerpos no humanos nativos que exhiben un porcentaje de identidad suficientemente alto con secuencias de la línea germinal humana, incluyendo por ejemplo anticuerpos que comprenden dominios VH y VL de anticuerpos convencionales de camélido, así como modificados, especialmente humanizados o que han experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal, variantes de tales anticuerpos y también anticuerpos "completamente humanos".
En una realización, el dominio VH del anticuerpo con alta homología humana puede exhibir una identidad de secuencia de aminoácidos o una homología de secuencia de 80% o más con uno o más dominios VH humanos a través de las regiones marco FR1, FR2, FR3 y FR4. En otras realizaciones, la identidad de secuencia de aminoácidos o la homología de secuencia entre el dominio VH del polipéptido de la invención y la secuencia del dominio VH de la línea germinal que coincide más estrechamente puede ser 85% o más, 90% o más, 95% o más, 97% o mayor, o hasta 99% o incluso 100%.
En una realización, el dominio VH del anticuerpo con alta homología humana puede contener una o más (p.ej. 1 a 10) emparejamientos erróneos de la secuencia de aminoácidos a través de las regiones marco FR1, FR2, FR3 y FR4, en comparación con la secuencia de VH humano que coincide más estrechamente.
En otra realización, el dominio VL del anticuerpo con alta homología humana puede mostrar una identidad de secuencia u homología de secuencia de 80% o más con uno o más dominios VL humanos a través de las regiones marco FR1, FR2, FR3 y FR4. En otras realizaciones, la identidad de secuencia de aminoácidos o la homología de secuencia entre el dominio VL del polipéptido de la invención y la secuencia del dominio VL de la línea germinal humana que coincide más estrechamente puede ser 85% o mayor 90% o mayor, 95% o mayor, 97% o mayor, o
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
hasta 99% o incluso 100%.
En una realización, el dominio VL del anticuerpo con alta homología humana puede contener uno o más (p.ej. 1 a 10) emparejamientos erróneos de la secuencia de aminoácidos en las regiones marco FR1, FR2, FR3 y FR4, en comparación con la secuencia de VL humano que coincide más estrechamente.
Antes de analizar el porcentaje de identidad de secuencia entre el anticuerpo con alta homología humana y VH y VL de la línea germinal humana, se pueden determinar los pliegues canónicos, lo que permite la identificación de la familia de segmentos de la línea germinal humana con la combinación idéntica de pliegues canónicos para H1 y H2 o L1 y L2 (y L3). Posteriormente, se elige el miembro de la familia de la línea germinal humana que tiene el más alto grado de homología de secuencia con la región variable del anticuerpo de interés para calificar la homología de secuencia. La determinación de las clases canónicas de Chothia de los bucles hipervariables L1, L2, L3, H1 y H2 se puede realizar con las herramientas bioinformáticas públicamente disponibles en la página web
www.bioinf.org.uk/abs/chothia.html.page. La salida del programa muestra los requisitos clave de los residuos en un archivo de datos. En estos archivos de datos, las posiciones clave de los residuos se muestran con los aminoácidos permitidos en cada posición. La secuencia de la región variable del anticuerpo de interés se proporciona como entrada y se alinea primero con una secuencia de anticuerpo consenso para asignar el esquema de numeración de Kabat. El análisis de los pliegues canónicos utiliza un conjunto de moldes de residuos clave obtenidos mediante un método automatizado desarrollado por Martin y Thornton (Martin et al., J. Mol. Biol. 263:800-815 (1996).
Conocido el segmento V de la línea germinal humana concreto, que utiliza la misma combinación de pliegues canónicos para H1 y H2 o L1 y L2 (y L3), se puede determinar el miembro de la familia con mejor emparejamiento en términos de homología de secuencia. Con herramientas bioinformáticas, se puede determinar el porcentaje de identidad de secuencia entre las secuencias de aminoácidos marco del dominio VH y VL del anticuerpo de interés y las secuencias correspondientes codificadas por la línea germinal humana, pero en realidad también se puede aplicar el alineamiento manual de las secuencias. Las secuencias de inmunoglobulinas humanas pueden identificarse a partir de varias bases de datos de proteínas, tales como VBase (
http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) o la base de datos Pluckthun/Honegger (http: //
www.bioc.unizh.ch/antibody/Sequences/Germlínes. Para comparar las secuencias humanas con las regiones V de los dominios VH o VL en un anticuerpo de interés, se puede utilizar un algoritmo de alineamiento de secuencias, tal como el disponible en sitios web como
www.expasy.ch/tools/#align., pero también se puede realizar el alineamiento manual con el conjunto limitado de secuencias. Las secuencias de cadena ligera y pesada de la línea germinal humana de las familias con las mismas combinaciones de pliegues canónicos y con el más alto grado de homología con las regiones marco 1, 2 y 3 de cada cadena se selecciona y se compara con la región variable de interés, también se comprueba la FR4 frente a las regiones JH y JK o JL de la línea germinal humana.
Obsérvese que en el cálculo del porcentaje total de homología de secuencia, los residuos de FR1, FR2 y FR3 se evalúan utilizando la secuencia que coincide más estrechamente de la familia de la línea germinal humana con la combinación idéntica de pliegues canónicos. Solo se puntúan los residuos diferentes de la coincidencia más estrecha u otros miembros de la misma familia con la misma combinación de pliegues canónicos (Nota: excluyendo cualquier diferencia codificada por el cebador). Sin embargo, para fines de humanización, los residuos en regiones marco idénticas a los miembros de otras familias de la línea germinal humana, que no tienen la misma combinación de pliegues canónicos, pueden considerarse "humanos", a pesar de que se califican como "negativos" de acuerdo con las estrictas condiciones descritas anteriormente. Esta suposición se basa en el enfoque de "mezcla y emparejamiento" para la humanización, en la que FR1, FR2, FR3 y FR4 se comparan por separado con su secuencia de la línea germinal humana más cercana y la molécula humanizada contiene una combinación de diferentes FR como hicieron Qu y colaboradores (Qu et la., Clin. Cancer Res. 5:3095-3100 (1999)) y Ono y colaboradores (Ono et al., Mol. Immunol. 36:387-395 (1999)). Los límites de las regiones marco individuales se pueden asignar utilizando el esquema de numeración IMGT, que es una adaptación del esquema de numeración de Chothia (Lefranc et al., NAR 27:209-212 (1999)); imgt.cines.fr).
Los anticuerpos con alta homología humana pueden comprender bucles hipervariables o CDR que tienen pliegues canónicos humanos o similares a los humanos, como se analiza en detalle a continuación. En una realización, se puede obtener o derivar al menos un bucle hipervariable o CDR en el dominio VH o el dominio VL del anticuerpo con alta homología humana de un dominio VH o VL de un anticuerpo no humano, por ejemplo un anticuerpo convencional de una especie de Camelidae, que exhiba todavía una estructura de pliegues canónicos predicha o real que es sustancialmente idéntica a una estructura de pliegues canónicos que se produce en anticuerpos humanos.
Está bien establecido en la técnica que aunque las secuencias de aminoácidos primarios de los bucles hipervariables presentes en ambos dominios VH y VL codificados por la línea germinal humana son, por definición, altamente variables, todos los bucles hipervariables, excepto CDR H3 del dominio VH, adoptan solo unas pocas conformaciones estructurales distintas, denominadas pliegues canónicos (Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Tramontano et al. Proteins 6:382-94 (1989)), que dependen tanto de la longitud del bucle hipervariable como
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
de la presencia de los llamados residuos de aminoácidos canónicos (Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Las estructuras canónicas reales de los bucles hipervariables en dominios VH o VL intactos se pueden determinar mediante análisis estructural (p.ej., cristalografía de rayos X), pero también es posible pronosticar la estructura canónica sobre la base de residuos de aminoácidos clave que son característicos de una estructura concreta (discutido más abajo). En esencia, el patrón específico de residuos que determina cada estructura canónica forma una "firma" que permite reconocer la estructura canónica en bucles hipervariables de un dominio VH o VL de estructura desconocida; por lo tanto, las estructuras canónicas pueden pronosticarse basándose en la secuencia de aminoácidos primaria sola.
Las estructuras de pliegue canónico pronosticadas para los bucles hipervariables de cualquier secuencia de VH o VL dada en un anticuerpo con alta homología humana pueden analizarse utilizando algoritmos que están disponibles públicamente en
www.bioinf.org.uk/abs/chothia.html,www.biochem.ucl.ac.uk/~martin/antibodies.html y

www.bioc.unizh.ch/antibody/Sequences/Germlines/Vbase_hVk.html. Estas herramientas permiten que las secuencias VH o VL de consulta se alineen contra secuencias del dominio VH o VL humanos de estructura canónica conocida, y se realice una predicción de la estructura canónica para los bucles hipervariables de la secuencia de consulta.
En el caso del dominio VH, los bucles H1 y H2 pueden calificarse por tener una estructura de pliegues canónicos "sustancialmente idéntica" a una estructura de pliegues canónicos que se sabe que aparece en anticuerpos humanos si se cumplen al menos el primero, y preferiblemente ambos, de los siguientes criterios:
1. Una longitud idéntica, determinada por el número de residuos, a la clase estructural canónica humana que
coincide más estrechamente.
2. Al menos 33% de identidad, preferiblemente al menos un 50% de identidad con los residuos de
aminoácidos clave descritos para las correspondientes clases estructurales canónicas H1 y H2 humanas.
(obsérvese que a los efectos del análisis anterior, los bucles H1 y H2 se tratan por separado y cada uno se compara con su clase estructural canónica humana que coincide más estrechamente)
El análisis anterior se basa en la predicción de la estructura canónica de los bucles H1 y H2 del anticuerpo de interés. Si se conocen las estructuras reales de los bucles H1 y H2 en el anticuerpo de interés, por ejemplo basándose en cristalografía de rayos X, los bucles H1 y H2 en el anticuerpo de interés también pueden calificarse por tener una estructura de pliegues canónicos sustancialmente idéntica "a una estructura de pliegues canónicos que se sabe que se produce en anticuerpos humanos si la longitud del bucle difiere de la de la clase estructural canónica humana que coincide más estrechamente (típicamente en ± 1 o ± 2 aminoácidos) pero la estructura real de los bucles H1 y H2 en el anticuerpo de interés coincide con la estructura de un pliegue canónico humano.
Los residuos de aminoácidos clave encontrados en las clases estructurales canónicas humanas para el primer y segundo bucles hipervariables de los dominios VH humanos (HI y H2) son descritos por Chothia et al., J. Mol. Biol. 227:799-817 (1992). En particular, la Tabla 3 en la página 802 de Chothia et al., que se incorpora a la presente memoria como referencia, enumera los residuos de aminoácidos preferidos en los sitios clave para estructuras canónicas H1 encontradas en la línea germinal humana, mientras que la Tabla 4 en la página 803, también incorporada específicamente como referencia, enumera residuos de aminoácidos preferidos en sitios clave para estructuras canónicas de CDR H2 encontradas en la línea germinal humana.
En una realización, tanto H1 como H2 en el dominio VH del anticuerpo con alta homología humana exhiben una estructura de pliegues canónicos pronosticada o real que es sustancialmente idéntica a una estructura de pliegues canónicos que se produce en los anticuerpos humanos.
Los anticuerpos con alta homología humana pueden comprender un dominio VH en el que los bucles hipervariables H1 y H2 forman una combinación de estructuras de pliegue canónico que es idéntica a una combinación de estructuras canónicas que se sabe que ocurren en al menos un dominio VH de la línea germinal humana. Se ha observado que solo ciertas combinaciones de estructuras de pliegue canónico en H1 y H2 en realidad ocurren en dominios VH codificados por la línea germinal humana. En una realización, H1 y H2 en el dominio VH del anticuerpo con alta homología humana se pueden obtener a partir de un dominio VH de una especie no humana, p.ej. una especie de Camelidae, aunque forma una combinación de estructuras de pliegue canónico pronosticadas o reales que es idéntica a una combinación de estructuras de pliegue canónico que se sabe que se producen en una línea germinal humana o un dominio VH mutado somáticamente. En realizaciones no limitantes, H1 y H2 en el dominio VH del anticuerpo con alta homología humana se pueden obtener a partir de un dominio VH de una especie no humana, p.ej. una especie de Camelidas, y forman una de las siguientes combinaciones de pliegues canónicos: 1-1, 1-2, 1-3, 1-6, 1-4, 2-1, 3-1 y 3-5.
Un anticuerpo con alta homología humana puede contener un dominio VH que exhibe una alta homología de secuencia/identidad de secuencia con VH humano, y que contiene bucles hipervariables que exhiben homología
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
estructural con VH humano.
Puede ser ventajoso que los pliegues canónicos presentes en H1 y H2 en el dominio VH del anticuerpo con alta homología humana, y la combinación de los mismos, sean "correctos" para la secuencia de la línea germinal de VH humano que representa la coincidencia más estrecha con el dominio VH del anticuerpo con alta homología humana en términos de identidad de secuencia de aminoácidos primaria global. A modo de ejemplo, si la coincidencia de secuencia más estrecha es con un dominio VH3 de la línea germinal humana, puede ser ventajoso que H1 y H2 formen una combinación de pliegues canónicos que también se produce naturalmente en un dominio VH3 humano. Esto puede ser particularmente importante en el caso de anticuerpos con alta homología humana que derivan de especies no humanas, p.ej. anticuerpos que contienen dominios VH y VL que derivan de anticuerpos convencionales de camélido, especialmente anticuerpos que contienen dominios de Vh y Vl de camélido humanizados.
Así, en una realización, el dominio VH del anticuerpo contra CD70 con alta homología humana puede exhibir una identidad de secuencia o homología de secuencia de 80% o más, 85% o más, 90% o más, 95% o más, 97% o más, o hasta 99% o incluso 100% con un dominio VH humano en las regiones marco FR1, FR2, FR3 y FR4, y además H1 y H2 en el mismo anticuerpo se obtienen a partir de un dominio VH no humano (p.ej., derivado de especies de Camelidae), pero forman una combinación de estructuras de pliegues canónicos pronosticadas o reales que es lo mismo que una combinación de pliegues canónicos que se sabe que se producen naturalmente en el mismo dominio VH humano.
En otras realizaciones, L1 y L2 en el dominio VL del anticuerpo con alta homología humana se obtienen cada uno de un dominio VL de una especie no humana (p.ej., un dominio VL derivado de camélido), y cada uno exhibe una estructura pliegue canónico pronosticada o real que es sustancialmente idéntica a una estructura de pliegues canónicos que se produce en anticuerpos humanos.
Como con los dominios VH, los bucles hipervariables de los dominios VL de ambos tipos VLambda y VKappa pueden adoptar un número limitado de conformaciones o estructuras canónicas, determinadas en parte por la longitud y también por la presencia de residuos de aminoácidos clave en ciertas posiciones canónicas.
Dentro de un anticuerpo de interés que tiene alta homología humana, los bucles L1, L2 y L3 obtenidos a partir de un dominio VL de una especie no humana, p.ej. una especie de Camelidae, se pueden calificar por tener una estructura de pliegues canónicos "sustancialmente idéntica" a una estructura de pliegues canónicos que se sabe que se produce en anticuerpos humanos si se cumplen al menos el primero, y preferiblemente ambos, de los siguientes criterios:
1. Una longitud idéntica, determinada por el número de residuos, a la clase estructural humana que coincide más estrechamente.
2. Al menos 33% de identidad, preferiblemente al menos 50% de identidad con los residuos de aminoácidos clave descritos para las correspondientes clases estructurales canónicas L1 o L2 humanas, ya sea del repertorio VLambda o de VKappa.
(obsérvese que a los efectos del análisis anterior los bucles L1 y L2 se tratan por separado y cada uno se compara con su clase estructural canónica humana que coincide más estrechamente)
El análisis anterior se basa en la predicción de la estructura canónica de los bucles L1, L2 y L3 en el dominio VL del anticuerpo de interés. Si se conoce la estructura real de los bucles L1, L2 y L3, por ejemplo basándose en cristalografía de rayos X, los bucles L1, L2 o L3 derivados del anticuerpo de interés también se pueden calificar por tener una estructura de pliegues canónicos "sustancialmente idéntica" a una estructura de pliegues canónicos que se sabe que se produce en anticuerpos humanos si la longitud del bucle difiere de la de la clase estructural canónica humana que coincide más estrechamente (típicamente en ± 1 o ± 2 aminoácidos) pero la estructura real de los bucles de Camelidae coincide con un pliegue canónico humano.
Los residuos de aminoácidos clave encontrados en las clases estructurales canónicas humanas para las CDR de los dominios humanos VLambda y VKappa son descritos por Morea et al. Methods, 20:267-279 (2000) y Martin et al., J. Mol. Biol., 263:800-815 (1996). El repertorio estructural del dominio VKappa humano también es descrito por Tomlinson et al. EMBO J. 14:4628-4638 (1995), y la del dominio VLambda por Williams et al. J. Mol. Biol., 264:220- 232 (1996). L1 y L2 en el dominio VL de un anticuerpo con alta homología humana pueden formar una combinación de estructuras de pliegue canónico pronosticadas o reales que es idéntica a una combinación de estructuras de pliegue canónico que se sabe que se producen en un dominio VL de la línea germinal humana. En realizaciones no limitantes, L1 y L2 en el dominio VLambda de un anticuerpo con alta homología humana (p.ej., un anticuerpo que contiene un dominio VL derivado de camélido o una variante humanizada del mismo) pueden formar una de las siguientes combinaciones de pliegues canónicos: 11-7, 13-7 (A,B,C), 14-7 (A,B), 12-11, 14-11 y 12-12 (como definen Williams et al. J. Mol. Biol. 264:220-32 (1996) y como se muestra en

http://www.bioc.uzh.ch/antibody/Sequences/Germlines/VBase_hVL.html). En realizaciones no limitantes, L1 y L2 en
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
el dominio Vkappa pueden formar una de las siguientes combinaciones de pliegues canónicos: 2-1, 3-1, 4-1 y 6-1 (como define Tomlinson et al. EMBO J. 14:4628-38 (1995)) y como se muestra en

http://www.bioc.uzh.ch/antibody/Sequences/Germlines/VBase_hVK.html).
En una realización adicional, los tres L1, L2 y L3 en el dominio VL de un anticuerpo con alta homología humana pueden exhibir una estructura sustancialmente humana. Se prefiere que el dominio VL del anticuerpo con alta homología humana muestre alta identidad de secuencia/homología de secuencia con VL humano, y también que los bucles hipervariables en el dominio VL exhiban homología estructural con VL humano.
En una realización, el dominio VL de un anticuerpo contra CD70 con alta homología humana puede exhibir una identidad de secuencia de 80% o más, 85% o más, 90% o más, 95% o más, 97% o más, o hasta 99 % o incluso 100% con un dominio VL humano en las regiones marco FR1, FR2, FR3 y FR4, y además el bucle hipervariable L1 y el bucle hipervariable L2 pueden formar una combinación de estructuras de pliegues canónicos pronosticadas o reales que es la misma que una combinación de pliegues canónicos que se sabe que se produce naturalmente en el mismo dominio VL humano.
Por supuesto, se prevé que los dominios VH que exhiban alta identidad de secuencia/homología de secuencia con VH humano, y también homología estructural con bucles hipervariables de VH humano se combinarán con dominios VL que exhiban alta identidad de secuencia/homología de secuencia con VL humano, y también homología estructural con bucles hipervariables de VL humano para proporcionar anticuerpos con alta homología humana que contiene emparejamientos VH/VL (p.ej., emparejamientos VH/Vl derivados de camélidos) con máxima homología de secuencia y estructural con emparejamientos vH/VL codificados en seres humanos.
Como se ha resumido anteriormente, la invención se refiere, al menos en parte, a anticuerpos, y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen a CD70 humana con alta afinidad. Las propiedades y características de los anticuerpos contra CD70 y los fragmentos de anticuerpos de acuerdo con la invención se describirán ahora con más detalle.
Unión a, y afinidad por, CD70
En ciertos aspectos, los anticuerpos, y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos, proporcionados en la presente memoria se unen a CD70 humana con alta afinidad. Los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen a CD70 humana con alta afinidad pueden exhibir una afinidad de unión (Kd) para CD70 humana, y más concretamente para el dominio extracelular de CD70 humana, de aproximadamente 10 nM o menos, o 1 nM o menos, o 0,1 nM o menos, o 10 pM o menos.
El anticuerpo contra CD70 (o fragmento de unión a antígeno) puede comprender dominios VH y VL que, cuando los dominios VH y VL se expresan en forma de un Fab, presentan una velocidad de disociación para la unión a CD70 humana de menos de 7 x 10'4s'1, preferiblemente menos de 5 x 10'4s'1, o menos de 2 x 10'4s'1, menos de 1 x 10'4s'1. Por lo general, la velocidad de disociación se encontrará en el intervalo de 0,4 x 10'4s'1 a 4,8 x 10'4s'1. La afinidad de unión (Kd) y velocidad de disociación (Koff) puede medirse utilizando mecanismos convencionales bien conocidos por los expertos en la técnica, tales como, por ejemplo, resonancia de plasmón superficial (BIAcore), como se describe en los ejemplos adjuntos. En resumen, se añaden 50 pl de muestra que se vaya a analizar a 200 pl de PBS + Tween al 0,02% y se diluyen 1/400 de la siguiente manera: 5 pl de muestra (1 mg/ml) + 195 pl de HBS-EP+ (tampón Biacore), se diluyen adicionalmente 10 pl + 90 pl de HVS-EP+ = 2,5 pg/ml. El análisis Biacore se realiza a temperatura ambiente utilizando un chip CM5 altamente recubierto con CD70 (4000 UR) utilizando el protocolo suministrado por el fabricante.
A este respecto, se debe tener en cuenta que aunque la velocidad de disociación se mide para las combinaciones de VH y VL en forma de Fab, esto no significa que los dominios VH y VL contribuyan por igual a la unión a CD70. Para muchas combinaciones de VH/VL, es el dominio VH el que contribuye principalmente a la unión a CD70, y el dominio VL contribuye a la solubilidad y/o estabilidad del emparejamiento VH/Vl.
La unión de los anticuerpos contra CD70 descritos en la presente memoria, o fragmentos Fab de los mismos, a CD70 humana recombinante también se puede evaluar mediante ELISA.
Los anticuerpos contra CD70 descritos en la presente memoria pueden mostrar además la unión a CD70 expresada en la superficie de células intactas, p.ej. células de carcinoma renal 786-O y otras líneas celulares de cáncer. La unión de anticuerpos contra CD70 a células que expresan CD70 puede evaluarse mediante citometría de flujo. Los resultados presentados en los ejemplos adjuntos demuestran que los anticuerpos contra CD70 preferidos, que incluyen la variante 41D12 (cuando se expresan como IgG1 ARGX-110 no fucosilada), muestran una unión muy fuerte a CD70 de la superficie celular. De hecho, para muchas líneas celulares, ARGX-110 exhibe una unión más fuerte que el anticuerpo SGN70 de la técnica anterior de comparación.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Es particularmente notable que ARGX-110 exhiba una fuerte unión a líneas celulares que expresan CD70 con un bajo número de copias, incluyendo entre otras las líneas celulares Raji, SU-DHL-6, MHHPREB1, Mino, Mec1, JVM- 2, HH y EBC-1, y también a células cancerosas aisladas de pacientes (p.ej., pacientes con LLC), en ambos casos la unión de ARGX-110 es marcadamente más fuerte que SGN70. La unión "mejorada" a líneas celulares de número de copias bajo y materiales de pacientes con LLC puede reflejar en gran parte la afinidad extremadamente alta de ARGX-110 por CD70 recombinante. Estas características de unión apoyan una utilidad concreta de ARGX-110 (basándose en 41D12) y otros anticuerpos contra CD70 descritos en la presente memoria con propiedades similares en el tratamiento del cáncer, particularmente cuando se utilizan como una IgG que exhibe una potente función efectora (p.ej., IgG1 no fucosilada) en lugar de como un producto inmunoconjugado unido a un radical citotóxico o citostático. La importancia de la unión de alta afinidad (es decir, mayor afinidad que la que puede lograrse con los anticuerpos contra CD70 de la técnica anterior) a CD70 recombinante y CD70 de la superficie celular con respecto a la utilidad clínica de los anticuerpos se demuestra en los ejemplos adjuntos mediante experimentos en los que las muestras de PBMC son "enriquecidas" con líneas celulares de cáncer y a continuación tratadas con anticuerpos contra CD70. En este sistema, el tratamiento con ARGX-110 produjo significativamente más lisis de las células cancerosas diana que los anticuerpos contra CD70 de comparación MDX1411 y SGN70.
Los anticuerpos contra CD70 descritos en la presente memoria exhiben unión de alta afinidad a CD70 humana, y más específicamente al dominio extracelular de CD70 humana, pero no se excluye la reactividad cruzada con homólogos no humanos de CD70. De hecho, es una característica ventajosa de muchos de los anticuerpos contra CD70 descritos en la presente memoria, que incluyen 27B3 y sus variantes que han experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal, particularmente 41D12, que además de la unión de alta afinidad a CD70 humana también reaccionan de forma cruzada con homólogos de CD70 de simio, específicamente los homólogos de CD70 de macaco rhesus y mono cinomolgo.
A este respecto, se puede considerar que un anticuerpo contra CD70 exhibe reactividad cruzada con un homólogo de CD70 de simio, por ejemplo, los homólogos de CD70 de macaco rhesus y mono cinomolgo, si la diferencia en la CI50 para CD70 humana frente a la de simio (mono rhesus o cynomolgus) en un ELISA de inhibición de CD70- CD27, tal como el descrito en el ejemplo adjunto 20.2, es de menos de 5 veces, preferiblemente de menos de 3 veces o de menos de 2 veces. La afinidad de unión, y por lo tanto la potencia de bloqueo, para CD70 humana y de simio debe ser ampliamente comparable.
Interacción entre CD70 y CD27
En ciertos aspectos, los anticuerpos contra CD70, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, proporcionados en la presente memoria, pueden unirse a CD70 humana con alta afinidad y bloquear la interacción entre CD70 y CD27.
La capacidad de los anticuerpos contra CD70, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, para bloquear la unión de CD70 a CD27 puede evaluarse mediante Elisa utilizando CD70 recombinante capturada (Flag-TNC-CD70) o CD70 recubierta dirigida y CD27-Fc recombinante. Los anticuerpos contra CD70 descritos en la presente memoria pueden inhibir la interacción entre CD70 y CD27 con una CI50 de 300 ng/ml o menos, o 200 ng/ml o menos, o 110 ng/ml o menos, o 70 ng/ml o menos, o 50 ng/ml o menos.
La capacidad de los anticuerpos contra CD70, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, para bloquear la unión de CD70 a CD27 también puede evaluarse en un ensayo basado en el co-cultivo de células Raji (linfoma de células B humano) y células HT1080-CD27 (línea celular epitelial humana transfectada con CD27), como se describe en los ejemplos adjuntos. Los anticuerpos contra CD70 descritos que inhiben la interacción entre CD70 y CD27 pueden exhibir una CI50 en este ensayo de co-cultivo de 500 ng/ml o menos, o 300 ng/ml o menos, o 100 ng/ml o menos, o 50 ng/ml o menos, o 30 ng/ml o menos.
Los anticuerpos contra CD70 preferidos basados en 27B3 y sus variantes que han experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal, que incluyen 41D12 (ARGX-110), exhiben un bloqueo potente de la interacción CD70/CD27 en el sistema Elisa. De hecho, ARGX-110 es significativamente más potente en el bloqueo de las interacciones CD70/CD27 que los anticuerpos de comparación SGN70 y MDX1411. La interacción entre CD70 y CD27 puede contribuir a la supervivencia, proliferación y/o supresión inmunitaria de las células tumorales dentro del microentorno tumoral. Por consiguiente, la potente inhibición de la interacción CD70/CD27, además de la unión de alta afinidad a CD70, puede contribuir a una mejora del resultado clínico en el tratamiento de ciertos cánceres o trastornos inmunológicos que expresan CD70, por ejemplo, enfermedades autoinmunitarias y cánceres que expresan conjuntamente CD70 y CD27.
En otras realizaciones, los anticuerpos contra CD70, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, pueden unirse a CD70 humana pero no inhibir la interacción entre CD70 y CD27. Los anticuerpos contra CD70 que se unen a CD70 pero no inhiben la interacción entre CD70 y CD27 se pueden evaluar basándose en Elisa utilizando CD70 recombinante capturada (Flag-TNC-CD70) o CD70 recubierta dirigida y CD27-Fc recombinante. Como se demuestra
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
en los ejemplos adjuntos, se han identificado varios Fab que se unen a CD70 pero que no inhiben la interacción CD70/CD27 en gran medida. En particular, el clon Fab identificado aquí como 59D10 exhibe una fuerte unión a la CD70 recombinante medida mediante Biacore pero no bloquea la interacción CD70/CD27 en un grado significativo, cuando se evalúa mediante ELISA. Los anticuerpos contra CD70 descritos en la presente memoria que se unen a CD70 pero no inhiben la interacción entre CD70 y CD27 pueden poseer funciones efectoras de anticuerpo intactas, es decir, una o más de ADCC, CDC, ADCP o ADC e inhibir el crecimiento de células tumorales in vivo. Los anticuerpos contra CD70 que se unen a CD70 con alta afinidad pero no son bloqueantes se pueden utilizar ventajosamente como anticuerpos de "un solo brazo" o productos Fab PEGilados o en cualquier otro formato de anticuerpo que proporcione una interacción monovalente estricta con una célula diana que exprese CD70.
Epítopos de CD70
En ciertos aspectos, los anticuerpos contra CD70 descritos en la presente memoria se unen a epítopos dentro del dominio extracelular de CD70 humana.
El término "epítopo" se refiere a la porción o porciones de un antígeno (p.ej., CD70 humana) que se ponen en contacto con un anticuerpo. Los epítopos pueden ser lineales, es decir, que implica la unión a una sola secuencia de aminoácidos, o conformacionales, es decir, que implica la unión a dos o más secuencias de aminoácidos en diversas regiones del antígeno que pueden no ser necesariamente contiguas.
Los anticuerpos contra CD70 descritos en la presente memoria pueden unirse a diferentes epítopos (solapantes o no solapantes) dentro del dominio extracelular de la proteína CD70 humana. Por ejemplo, los Fab denominados 1C2 y 9E1 en los ejemplos adjuntos se unen claramente a diferentes epítopos que no se solapan en CD70 humana.
Como se observa en otra parte de la presente memoria, el anticuerpo contra CD70 preferido 41D12 (ARGX-110) exhibe una combinación particularmente útil de características de unión que no exhibe ningún anticuerpo contra CD70 de la técnica anterior conocido, a saber:
(a) unión dentro de la secuencia de aminoácidos HIQVTLAICSS (SEQ ID NO: 342) en CD70 humana;
(b) reactividad cruzada con homólogos de CD70 de macaco rhesus (Macaca mulatta) y mono cinomolgo (Macaca cynomolgus);
(c) unión a CD70 humana nativa y CD70 humana recombinante desnaturalizada por calor.
Para cualquier anticuerpo contra CD70 dado, la capacidad de unirse a CD70 humana dentro de la secuencia de aminoácidos HIQVTLAICSS (SEQ ID NO: 342) puede ser determinada fácilmente por un experto en la técnica, por ejemplo, utilizando el análisis de unión de CD70 quimérica de ratón-humano descrito en el ejemplo adjunto 20,4.
La reactividad cruzada con homólogos de CD70 de simio también puede ser determinada fácilmente por un experto en la técnica, por ejemplo mediante análisis de FAC, resonancia de plasmón superficial (Biacore™) o utilizando un ELISA de inhibición de CD70-CD27. A este respecto, se puede considerar que un anticuerpo contra CD70 exhibe reactividad cruzada con un homólogo de CD70 de simio, por ejemplo, los homólogos de CD70 de macaco rhesus y mono cinomolgo, si la diferencia en CI50 para CD70 humana frente a simio (mono rhesus o cinomolgo) en un ELISA de inhibición de CD70-CD27, tal como el descrito en el ejemplo adjunto 20.2, es de menos de 5 veces, preferiblemente menos de 3 veces o menos de 2 veces.
Los anticuerpos contra CD70 descritos en la presente memoria también pueden demostrar la capacidad para unir CD70 humana nativa y CD70 humana recombinante desnaturalizada por calor. A este respecto, la unión a CD70 humana "nativa" se indica mediante unión a CD70 expresada en la superficie de una célula que expresa CD70, tal como cualquiera de las líneas celulares CD70+ descritas en los ejemplos adjuntos, o incluso células que expresan CD70 naturales aisladas a partir de material del paciente (p.ej., células aisladas de pacientes con LLC como en los ejemplos adjuntos), células T activadas, etc. La unión a Cd70 humana "nativa" puede así ser sometida a ensayo fácilmente por un experto en la técnica.
La unión a CD70 humana recombinante desnaturalizada por calor se puede someter a ensayo como se describe en el ejemplo 20.3 adjunto. Se prefiere que el anticuerpo contra CD70 muestre una DO a 620 nm de 0,6 o mayor en este ensayo, para demostrar la unión significativa a CD70 humana recombinante desnaturalizado por calor.
Intemalización parcial o lenta
Los anticuerpos contra CD70 descritos en la presente memoria, que incluyen el anticuerpo contra CD70 preferido 41D12 (ARGX-110), exhiben una internalización parcial en líneas celulares de carcinoma renal, lo que significa que cuando la internalización del anticuerpo se somete a ensayo en células de carcinoma renal 786-O una proporción sustancial del anticuerpo unido, es decir al menos 30-40%, permanece externo después de incubación durante 6 horas, e incluso después de 24 horas, a 37°C. Además, los anticuerpos contra CD70 también pueden exhibir una
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
tasa lenta de intemalización. A este respecto, se considera que un anticuerpo contra CD70 muestra lenta intemalización si se internaliza a una velocidad más lenta que un anticuerpo contra CD70 de referencia 9D1 (VH SEQ ID NO: 178; VL SEQ ID NO: 190).
Como se demuestra en los ejemplos adjuntos, las diferentes líneas de células cancerosas exhiben diferencias significativas en el grado de internalización de los anticuerpos contra CD70. Es particularmente significativo que la mayoría de las líneas celulares cancerosas exhiban menos de 30%, e incluso menos de 10%, de intemalización del anticuerpo contra CD70 unido, incluso después de 6 horas de incubación con ARGX-110. Estos resultados apoyan claramente la utilidad de los anticuerpos contra CD70 con potente función efectora (incluidas las variantes diseñadas para mejorar la función efectora) en el tratamiento de cánceres que expresan CD70. Se ha informado previamente en la literatura científica que CD70 es una diana "de intemalización"; por lo tanto, se ha propuesto desarrollar productos inmunoconjugados de anticuerpo contra CD70-fármaco para el tratamiento de cánceres que expresan CD70 y enfermedades inmunológicas. Por lo tanto, los resultados presentados en la presente memoria, que demuestran de forma concluyente que la internalización de los anticuerpos contra CD70 unidos a la superficie celular es una rara y que la mayoría de las líneas celulares que expresan CD70 no internalizan el anticuerpo contra CD70 unido en gran medida, son extremadamente sorprendentes.
Anticuerpos contra CD70 derivados de camélido
En otros aspectos más, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno del mismo descritos en la presente memoria pueden comprender al menos un bucle hipervariable o región determinante de complementariedad obtenida a partir de un dominio VH o un dominio VL de una especie en la familia Camelidae. En particular, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender dominios VH y/o VL, o sus CDR, obtenidos por inmunización activa de camélidos exogámicos, p.ej. llamas, con un antígeno contra CD70 humana.
Por "bucle hipervariable o región determinante de complementariedad obtenida de un dominio VH o un dominio VL de una especie en la familia Camelidae" se entiende que ese bucle hipervariable (HV) o CDR tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica, o sustancialmente idéntica, a la secuencia de aminoácidos de un bucle hipervariable o CDR que está codificada por un gen de inmunoglobulina de Camelidae. En este contexto, el "gen de inmunoglobulina" incluye genes de la línea germinal, genes de inmunoglobulina que han experimentado reordenamiento, y también genes somáticamente mutados. Por lo tanto, la secuencia de aminoácidos del HV o CDR obtenida de un dominio VH o VL de una especie de Camelidae puede ser idéntica a la secuencia de aminoácidos de un HV o CDR presente en un anticuerpo convencional de Camelidae maduro. El término "obtenido a partir de" en este contexto implica una relación estructural, en el sentido de que los HV o CDR del anticuerpo contra CD70 incorporan una secuencia de aminoácidos (o variantes mínimas de la misma) que originalmente estaba codificada por un gen de inmunoglobulina de Camelidae. Sin embargo, esto no implica necesariamente una relación concreta en términos del procedimiento de producción utilizado para preparar el anticuerpo contra CD70.
Los anticuerpos contra CD70 derivados de camélido pueden obtenerse de cualquier especie de camélido, incluyendo entre otros, llama, dromedario, alpaca, vicuña, guanaco o camello.
Los anticuerpos contra CD70 que comprenden los dominios VH y VL derivados de camélido, o CDR de los mismos, son típicamente polipéptidos expresados recombinantemente, y pueden ser polipéptidos quiméricos. El término "polipéptido quimérico" se refiere a un polipéptido artificial (de origen no natural) que se crea por yuxtaposición de dos o más fragmentos peptídicos que de otro modo no se producen contiguamente. Se incluyen dentro de esta definición los polipéptidos quiméricos de "especies" creados por yuxtaposición de fragmentos peptídicos codificados por dos o más especies, p.ej. camélido y humana.
Las CDR derivadas de camélido descritas en la presente memoria pueden comprender una de las secuencias de CDR mostradas como SEQ ID NO: 49-59, 262 o 263 (CDR3 de cadena pesada) o SEQ ID NO: 26-37, 249, 258 o 259 (CDR2 de cadena pesada ) o SEQ ID NO: 10-20, 248, 256 o 257 (CDR1 de cadena pesada) o una de las secuencias de CDR mostradas como SEQ ID NO: 148-168, 271 o 273 (CDR3 de cadena ligera) o SEQ ID NO: 109128 o 270 (CDR2 de cadena ligera) o SEC ID NO: 77-95, o 250-253, 267 y 268 (CDR1 de cadena ligera).
En una realización, el dominio VH completo y/o el dominio VL completo se pueden obtener a partir de una especie de la familia Camelidae. En realizaciones específicas, el dominio VH derivado de camélido puede comprender la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 177-188, 212-223, 274 o 275, mientras que el dominio VL derivado de camélido puede comprender la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 189-211, 230245, 276 o 277 (VL). El dominio VH derivado de camélido y/o el dominio VL derivado de camélido pueden someterse a continuación a modificación de proteínas, en la que se introducen una o más sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de camélido. Estos cambios modificados incluyen preferiblemente sustituciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de camélidos. Dichos cambios incluyen "humanización" o "mutación inversa a secuencias de la línea germinal" en donde uno o más residuos de aminoácidos en un dominio VH o VL codificado por los camélidos se reemplazan por residuos equivalentes de un
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
dominio VH o VL homólogo humano codificado.
Los dominios VH y VL de camélido aislados obtenidos por inmunización activa de un camélido (p.ej., llama) con un antígeno contra CD70 humana se pueden utilizar como base para diseñar polipéptidos de unión a antígeno de acuerdo con la invención. Partiendo de dominios VH y VL de camélido intactos, es posible diseñar una o más sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos que se aparten de la secuencia de inicio de camélido. En ciertas realizaciones, tales sustituciones, inserciones o deleciones pueden estar presentes en las regiones marco del dominio VH y/o el dominio VL. El propósito de tales cambios en la secuencia primaria de aminoácidos puede ser reducir propiedades presumiblemente desfavorables (p.ej., inmunogenicidad en un anfitrión humano (denominada humanización), sitios de posible heterogeneidad y/o inestabilidad del producto (glucosilación, desamidación, isomerización, etc.) o para mejorar algunas otras propiedades favorables de la molécula (p.ej., solubilidad, estabilidad, biodisponibilidad, etc.). En otras realizaciones, los cambios en la secuencia primaria de aminoácidos se pueden diseñar en uno o más de los bucles hipervariables (o CDR) de un dominio VH y/o VL de Camelidae obtenido por medio de inmunización activa. Tales cambios pueden introducirse para mejorar la afinidad y/o especificidad de unión a antígeno, o para reducir propiedades presumiblemente desfavorables, por ejemplo, inmunogenicidad en un anfitrión humano (denominada humanización), sitios de potencial heterogeneidad y/o inestabilidad del producto, glicosilación, desamidación, isomerización, etc., o para mejorar alguna otra propiedad favorable de la molécula, por ejemplo, solubilidad, estabilidad, biodisponibilidad, etc.
Por tanto, en una realización, la invención proporciona una variante de anticuerpo contra CD70 que contiene al menos una sustitución de aminoácido en al menos una región marco o CDR del dominio VH o el dominio VL en comparación con un dominio VH o VL derivado de camélido, ejemplos de los cuales incluyen, pero sin limitación, los dominios VH de camélido que comprenden las secuencias de aminoácidos mostradas como SEC ID NO: 177-188, 212-223, 274 o 275, y los dominios VL de camélido que comprenden las secuencias de aminoácidos mostradas como SEQ ID NO: 189-211, 230-245, 276 o 277.
En otras realizaciones, se proporcionan moléculas de anticuerpo "quimérico" que comprenden dominios VH y VL derivados de camélidos (o variantes modificadas de los mismos) y uno o más dominios constantes de un anticuerpo que no es de camélido, por ejemplo dominios constantes codificados por el ser humano (o variantes modificadas de los mismos). En dichas realizaciones, se prefiere que tanto el dominio VH como el dominio VL se obtengan de la misma especie de camélido, por ejemplo, tanto VH como VL pueden ser de Lama glama o tanto VH como VL pueden ser de Lama pacos (antes de la introducción de la variación de la secuencia de aminoácidos modificada). En dichas realizaciones, tanto el dominio VH como el dominio VL pueden obtenerse de un solo animal, particularmente un único animal que se ha inmunizado activamente con un antígeno contra CD70 humana.
Como una alternativa a los cambios de modificación en la secuencia de aminoácidos primaria de los dominios VH y/o VL de Camelidae, los bucles hipervariables derivados de camélidos individuales o CDR, o combinaciones de los mismos, pueden aislarse de los dominios VH/VL de camélido y transferirse a un marco alternativo (es decir que no sea de Camelidae), por ejemplo un marco VH/VL humano, mediante injerto de CDR.
Los anticuerpos contra CD70 que comprenden dominios VH y VL derivados de camélidos, o CDR de los mismos, pueden adoptar diversas realizaciones diferentes en las que están presentes tanto un dominio VH como un dominio VL. El término "anticuerpo" se utiliza en la presente memoria en el sentido más amplio y abarca, pero no se limita a, anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales completos), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (p.ej., anticuerpos biespecíficos), siempre que exhiban la especificidad inmunológica apropiada para una proteína CD70 humana. El término "anticuerpo monoclonal" tal según se utiliza en la presente memoria se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades mínimas. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos y se dirigen contra un solo sitio antigénico. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos (policlonales) convencionales que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos) sobre el antígeno, cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante o epítopo en el antígeno.
Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden una porción de un anticuerpo completo, generalmente la unión a antígeno o dominio variable del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fab biespecíficos y Fv, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo monocatenario, un fragmento variable monocatenario (scFv) y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos (véase Holliger y Hudson, Nature Biotechnol. 23:1126-36 (2005)), cuyo contenido se incorpora a la presente memoria como referencia).
En realizaciones no limitantes, los anticuerpos contra CD70 que comprenden dominios VH y VL derivados de camélidos, o CDR de los mismos, pueden comprender dominios CH1 y/o dominios CL, cuya secuencia de aminoácidos es total o sustancialmente humana. Cuando el polipéptido de unión a antígeno de la invención es un anticuerpo destinado a uso terapéutico humano, es típico que la región constante completa del anticuerpo, o al
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
menos una parte del mismo, tenga una secuencia de aminoácidos completa o sustancialmente humana. Por lo tanto, una o más o cualquier combinación del dominio CH1, la región bisagra, el dominio CH2, el dominio CH3 y el dominio CL (y el dominio CH4 si está presente) pueden ser total o sustancialmente humanos con respecto a su secuencia de aminoácidos.
Ventajosamente, el dominio CH1, la región bisagra, el dominio CH2, el dominio CH3 y el dominio CL (y el dominio CH4 si está presente) pueden tener todos una secuencia de aminoácidos completamente o sustancialmente humana. En el contexto de la región constante de un anticuerpo humanizado o quimérico, o un fragmento de anticuerpo, el término "sustancialmente humano" se refiere a una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 90%, o al menos 92%, o al menos 95%, o al menos 97%, o al menos 99% con una región constante humana. El término "secuencia de aminoácidos humana" en este contexto se refiere a una secuencia de aminoácidos que está codificada por un gen de inmunoglobulina humana, que incluye genes de la línea germinal, reordenados y somáticamente mutados. La invención también contempla polipéptidos que comprenden dominios constantes de secuencia "humana" que han sido alterados, mediante una o más adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos con respecto a la secuencia humana, exceptuando aquellas realizaciones en las que se requiere expresamente la presencia de una región bisagra "completamente humana".
La presencia de una región bisagra "completamente humana" en los anticuerpos contra CD70 de la invención puede ser beneficiosa tanto para minimizar la inmunogenicidad como para optimizar la estabilidad del anticuerpo.
Como se comenta en otra parte de la presente memoria, se contempla que se pueden realizar una o más sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos dentro de la región constante de la cadena pesada y/o ligera, particularmente dentro de la región Fc. Las sustituciones de aminoácidos pueden dar como resultado la sustitución del aminoácido sustituido por un aminoácido natural diferente, o por un aminoácido no natural o modificado. También se permiten otras modificaciones estructurales, tales como, por ejemplo, cambios en el patrón de glicosilación (p.ej., mediante la adición o eliminación de sitios de glicosilación unidos a N u O). Dependiendo del uso pretendido del anticuerpo, puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a sus propiedades de unión a receptores de Fc, por ejemplo para modular la función efectora. Por ejemplo, se pueden introducir uno o varios residuos de cisteína en la región Fc, permitiendo de este modo la formación de enlaces disulfuro entre las cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o una mayor destrucción de células mediada por el complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Véanse Caron et al., J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Alternativamente, se puede diseñar un anticuerpo contra CD70 que tenga regiones Fc duales y de ese modo pueda tener una mejora de la lisis de complemento y de las capacidades de ADCC. Véase Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). La invención también contempla productos inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo como se describe en la presente memoria conjugado a un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, toxina (p.ej., una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radioactivo (es decir, un producto radioconjugado). Las regiones Fc también pueden diseñarse para la prolongación de vida media, como describen Chan y Carter, en Nature Reviews: Immunology, Vol.10, pág. 301-316, 2010.
En otra realización más, la región Fc se modifica para aumentar la capacidad del anticuerpo para mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o para aumentar la afinidad del anticuerpo por un receptor Fcy modificando uno o más aminoácidos.
En otra realización más, se modifica la glicosilación de un anticuerpo. Por ejemplo, se puede preparar un anticuerpo aglicosilado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilación). La glicosilación puede alterarse para, por ejemplo, aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno diana CD70. Tales modificaciones de hidratos de carbono pueden realizarse; por ejemplo, alterando uno o más sitios de glicosilación dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden realizar una o más sustituciones de aminoácidos que dan como resultado la eliminación de uno o más sitios de glicosilación de la región de la región variable para eliminar de ese modo la glicosilación en ese sitio. Tal aglicosilación puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno.
También se contemplan variantes de anticuerpos contra CD70 que tienen un tipo alterado de glicosilación, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tiene cantidades reducidas de residuos de fucosilo o un anticuerpo no fucosilado (como describen Natsume et al., en Drug Design Development and Therapy, Vol. 3, pág. 7-16, 2009) o un anticuerpo que tiene aumento de estructuras de GlcNac bisecantes. Se ha demostrado que tales alteraciones de los patrones de glicosilación aumentan la actividad de ADCC de los anticuerpos, produciendo típicamente un aumento de ADCC de 10 veces con respecto a un anticuerpo equivalente que comprende un dominio Fc humano "nativo". Tales modificaciones de carbohidratos se pueden lograr, por ejemplo, expresando el anticuerpo en una célula anfitriona que tiene una alteración de la maquinaria enzimática de glucosilación (como describen Yamane-Ohnuki y Satoh, en mAbs 1: 3, 230-236, 2009). Los ejemplos de anticuerpos no fucosilados con mejora de la función de ADCC son los producidos que utilizan la tecnología Potelligent™ de BioWa Inc.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
La invención puede abarcar, en ciertas realizaciones, anticuerpos de Camelidae/humanos quiméricos, y en particular anticuerpos quiméricos en los que los dominios VH y VL tienen secuencia completamente de camélido (p.ej., Llama o alpaca) y el resto del anticuerpo tiene secuencia completamente humana. Los anticuerpos contra CD70 pueden incluir anticuerpos que comprenden variantes "humanizadas" o "que han experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal" de dominios VH y VL derivados de camélidos, o CDR de los mismos, y anticuerpos quiméricos de camélido/humano, en los que los dominios VH y VL contienen una o más sustituciones de aminoácidos en el regiones marco en comparación con los dominios VH y VL de camélido obtenidos por medio de inmunización activa de un camélido con un antígeno contra CD70 humana. Tal "humanización" aumenta el % de identidad de secuencia con los dominios VH o VL de la línea germinal humana mediante la sustitución de residuos de aminoácidos emparejados erróneamente en un dominio VH o VL de Camelidae de partida con el residuo equivalente encontrado en un dominio VH o VL codificado en la línea germinal humana.
Los anticuerpos contra CD70 también pueden ser anticuerpos injertados con CDR en los que las CDR (o bucles hipervariables) derivadas de un anticuerpo camélido, por ejemplo, un anticuerpo contra CD70 de camélido generado mediante inmunización activa con proteína CD70 humana, o codificado por un gen camélido, se injertan en un marco humano de VH y VL, siendo el resto del anticuerpo también de origen completamente humano.
Los anticuerpos contra CD70 humanizados, quiméricos e injertados con CDR como se describió anteriormente, particularmente anticuerpos que comprenden bucles hipervariables o CDR derivadas de la inmunización activa de camélidos con un antígeno contra cD70 humana, pueden producirse fácilmente utilizando técnicas convencionales de manipulación y expresión del ADN recombinante, haciendo uso de células anfitrionas procarióticas y eucarióticas modificadas para producir el polipéptido de interés e incluyendo, pero sin limitación, células bacterianas, células de levadura, células de mamífero, células de insecto, células vegetales, algunas de las cuales se describen en la presente memoria y se ilustran en los ejemplos adjuntos.
Los anticuerpos contra CD70 derivados de camélido incluyen variantes en las que el bucle o los bucles hipervariables o CDR del dominio VH y/o el dominio VL se obtienen a partir de un anticuerpo camélido convencional producido contra CD70 humana, pero en el que al menos uno de dichos bucles hipervariables o CDR (derivados camélido) se han diseñado para incluir una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos con respecto a la secuencia codificada por camélidos. Dichos cambios incluyen la "humanización" de los bucles hipervariables/CDR. Los HV/CDR derivados de camello que se han modificado por ingeniería genética de esta manera todavía pueden exhibir una secuencia de aminoácidos que es "sustancialmente idéntica" a la secuencia de aminoácidos de un HV/CDR codificado por un camélido. En este contexto, la "identidad sustancial" puede permitir que no más de una, o no más de dos secuencias de aminoácidos presenten emparejamientos erróneos con el HV/CDR codificado por el camélido.
Los anticuerpos contra CD70 derivados de camélidos proporcionados en la presente memoria pueden ser de cualquier isotipo. Los anticuerpos destinados al uso terapéutico humano serán típicamente del tipo IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, con frecuencia del tipo IgG, en cuyo caso pueden pertenecer a cualquiera de las cuatro subclases IgG1, IgG2a y b, IgG3 o IgG4. Dentro de cada una de estas subclases, se permite realizar una o más sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos dentro de la porción Fc, o realizar otras modificaciones estructurales, por ejemplo para potenciar o reducir las funcionalidades dependientes de Fc.
Humanización de dominios VH y VL derivados de camélido
Los anticuerpos convencionales de camélido proporcionan un punto de partida ventajoso para la preparación de anticuerpos con utilidad como agentes terapéuticos para seres humanos debido a los siguientes factores, comentados en el documento US 12/497.239:
1) Alto % de homología de secuencia entre dominios VH y VL de camélido y sus contrapartes humanos;
2) Alto grado de homología estructural entre las CDR de los dominios VH y VL de camélido y sus contrapartes
humanas (es decir, estructuras de pliegues canónicos similares a las humanas y combinaciones de pliegues
canónicos similares a las humanas).
La plataforma de camélido (p.ej., llama) también proporciona una ventaja significativa en términos de la diversidad funcional de los anticuerpos contra CD70 que se pueden obtener.
La utilidad de los anticuerpos contra CD70 que comprenden los dominios VH de camélido y/o VL de camélido para la terapia humana puede mejorarse aún más mediante la "humanización" de los dominios VH y VL de camélido naturales, por ejemplo para hacerlos menos inmunogénicos en un anfitrión humano. El objetivo general de la humanización es producir una molécula en la que los dominios VH y VL exhiban inmunogenicidad mínima cuando se introduzcan en un sujeto humano, a la vez que conserven la especificidad y afinidad del sitio de unión al antígeno formado por los dominios VH y VL parentales.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Un enfoque para la humanización, denominado "mutación inversa a secuencias de la línea germinal (germlining)", implica cambios de modificación en la secuencia de aminoácidos de un VH o dominio VL de camélido para acercarlo a la secuencia de la línea germinal de un dominio VH o VL humano.
La determinación de homología entre un dominio VH (o VL) de camélido y dominios VH (o VL) humanos es un paso crítico en el procedimiento de humanización, tanto para la selección de residuos de aminoácidos de camélido que se deben cambiar (en un dominio VH o VL dado) y para la selección de uno o varios residuos de aminoácidos de reemplazo apropiados.
Se ha desarrollado un enfoque para la humanización de anticuerpos convencionales de camélido basado en el alineamiento de un gran número de secuencias de dominios VH (y VL) de camélido novedosas, típicamente dominios VH (o VL) mutados somáticamente que se sabe que se unen a un antígeno diana, con secuencias VH (o VL) de la línea germinal humana, secuencias consenso VH (y VL) humanas, así como información de secuencia de la línea germinal disponible para llama pacos. Los siguientes pasajes esbozan los principios que se pueden aplicar a (i) la selección de residuos de aminoácidos de "camélido" para su remplazo en un dominio VH o VL derivado de camélido o una CDR de los mismos, y (ii) la selección de residuos de aminoácidos "humanos" de reemplazo para la sustitución, cuando se humaniza cualquier dominio VH (o VL) de camélido dado. Este enfoque puede utilizarse para preparar variantes humanizadas de CDR derivadas de camélido que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas como SEQ ID NO: 49-59, 262 o 263 (CDR3 de cadena pesada) o SEQ ID NO: 26-37, 249, 258. o 259 (CDR2 de cadena pesada) o SEQ ID NO: 10-20, 248, 256 o 257 (CDR1 de cadena pesada) o una de las secuencias de CDR mostradas como SEQ ID NO: 148-168, 271 o 273 (CDR3 de cadena ligera), o SEQ ID NO: 109-128 o 270 (CDR2 de cadena ligera) o SEQ ID NO: 77-95, o 250-253, 267 o 268 (CDR1 de cadena ligera), y también para la humanización de dominios VH derivados de camélido que tienen las secuencias mostradas como SEQ ID NO: 177188, 212-223, 274 o 275 y de dominios VL derivados de camélidos que tienen las secuencias mostradas como SEQ ID NO: 189-211, 230-245, 276 o 277.
Etapa 1. Seleccionar la familia humana (línea germinal) y el miembro de esta familia que muestren la homología/identidad más altas con la secuencia de camélido madura que se vaya a humanizar. A continuación se describe un procedimiento general para identificar la línea germinal humana que coincide más estrechamente para cualquier dominio de VH (o VL) de camélido.
Etapa 2. Seleccionar un miembro específico de la familia de la línea germinal humana utilizado como modelo para la mutación inversa a secuencias de la línea germinal. Preferiblemente esta es la línea germinal con la homología más alta u otro miembro de la familia de la línea germinal de la misma familia.
Etapa 3. Identificar las posiciones preferidas consideradas para experimentar mutación inversa a secuencias de la línea germinal en base a la tabla de utilización de aminoácidos para la línea germinal de camélido que está más próxima a la línea germinal humana seleccionada.
Etapa 4. Tratar de cambiar los aminoácidos en la línea germinal de camélido que se desvían de la línea germinal humana más próxima; la mutación inversa a secuencias de la línea germinal de residuos de FR es preferible a la de residuos de CDR.
a. Se prefieren las posiciones que se desvían de la línea germinal humana seleccionada utilizada como modelo para la mutación inversa a secuencias de la línea germinal, para lo cual el aminoácido encontrado en la secuencia del camélido no coincide con la línea germinal seleccionada y no se encuentra en otras líneas germinales de la misma subclase (para aminoácidos de FR codificados tanto por V como por J).
b. Las posiciones que se desvían del miembro de la familia de la línea germinal humana seleccionado pero que se utilizan en otras líneas germinales de la misma familia también se pueden abordar en el procedimiento de mutación inversa a secuencias de la línea germinal.
c. También pueden abordarse emparejamientos erróneos adicionales (p.ej., debidos a mutaciones somáticas adicionales) hacia la línea germinal humana seleccionada.
El siguiente enfoque se puede utilizar para determinar la línea germinal humana que coincide más estrechamente con un dominio VH (o VL) de camélido dado:
Antes de analizar el porcentaje de identidad de secuencia entre VH y VL de Camelidae y de la línea germinal humana, se pueden determinar en primer lugar los pliegues canónicos, lo que permite la identificación de la familia de segmentos de la línea germinal humana con la combinación idéntica de pliegues canónicos para H1 y H2 o L1 y L2 ( y L3). Posteriormente, el miembro de la familia de la línea germinal humana que tiene el mayor grado de homología de secuencia con la región variable de Camelidae de interés se puede elegir para calificar la homología de secuencia. La determinación de las clases canónicas de Chothia de los bucles hipervariables L1, L2, L3, H1 y H2 se puede realizar con las herramientas bioinformáticas públicamente disponibles en la página web
www.bioinf.org.uk/abs/chothia.html.page. La salida del programa muestra los requisitos clave de los residuos en un archivo de datos. En estos archivos de datos, las posiciones clave de los residuos se muestran con los aminoácidos permitidos en cada posición. La secuencia de la región variable del anticuerpo se proporciona como entrada y se alinea en primer lugar con una secuencia de anticuerpo consenso para asignar el esquema de numeración de Kabat. El análisis de los pliegues canónicos utiliza un conjunto de moldes de residuos clave obtenidos por medio de un método automatizado desarrollado por
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Martin y Thornton (Martin et al., J. Mol. Biol. 263:800-815 (1996). Los límites de las regiones marco individuales se pueden asignar utilizando el esquema de numeración IMGT, que es una adaptación del esquema de numeración de Chothia (Lefranc et al., NAR 27:209-212 (1999);
http://imgt.cines.fr).
Conocido el segmento V de la línea germinal humana concreto, que utiliza la misma combinación de pliegues canónicos para H1 y H2 o L1 y L2 (y L3), se puede determinar el mejor miembro de la familia que se empareja en términos de homología de secuencia. El porcentaje de identidad de secuencia entre las secuencias de aminoácidos del marco del dominio VH y VL de Camelidae y las secuencias correspondientes codificadas por la línea germinal humana se puede determinar utilizando herramientas bioinformáticas, pero también se podría utilizar el alineamiento manual de las secuencias. Las secuencias de inmunoglobulinas humanas pueden identificarse a partir de varias bases de datos de proteínas, tales como VBase (
http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) o la base de datos Pluckthun/Honegger (
http://www.bioc.unizh.ch/antibody/Sequences/Germlines. Para comparar las secuencias humanas con las regiones V de los dominios VH o VL de Camelidae, se puede utilizar un algoritmo de alineación de secuencias, como el que se encuentra en sitios web como
www.expasy.ch/tools/#align, pero también se puede realizar el alineamiento manual con un conjunto limitado de secuencias. Las secuencias de cadena ligera y pesada de la línea germinal humana de las familias con las mismas combinaciones de pliegues canónicos y con el mayor grado de homología con las regiones marco 1, 2 y 3 de cada cadena se pueden seleccionar y comparar con la región variable de Camelidae de interés, también fR4 se compara con las regiones JH y JK o JL de la línea germinal humana.
Obsérvese que en el cálculo del porcentaje total de homología de secuencia, los residuos de FR1, FR2 y FR3 se evalúan utilizando la secuencia que coincide más estrechamente de la familia de la línea germinal humana con la combinación idéntica de pliegues canónicos. Solo se puntúan los residuos diferentes del emparejamiento más estrecho u otros miembros de la misma familia con la misma combinación de pliegues canónicos (Nota: excluyendo cualquier diferencia codificada por cebadores). Sin embargo, para fines de humanización, los residuos en regiones marco idénticos a los miembros de otras familias de líneas germinales humanas, que no tienen la misma combinación de pliegues canónicos, pueden considerarse para la humanización, a pesar de que se califican como "negativos" de acuerdo con las rigurosas condiciones descritas anteriormente. Esta suposición se basa en el enfoque de "mezcla y emparejamiento" para la humanización, en el que FR1, FR2, FR3 y FR4 se comparan por separado con su secuencia de la línea germinal humana que coincide más estrechamente y la molécula humanizada contiene una combinación de diferentes FR como realizaron Qu y colaboradores (Qu et la., Clin. Cancer Res. 5:3095-3100 (1999)) y Ono y colaboradores (Ono et al., Mol. Immunol. 36:387-395 (1999)).
Anticuerpos que compiten de manera cruzada
Los anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que "compiten de manera cruzada" con las moléculas descritas en la presente memoria son aquellos que se unen a CD70 humana en el sitio o los sitios que son idénticos o se solapan con el sitio o los sitios en los que se unen los presentes anticuerpos contra CD70. Se pueden identificar anticuerpos monoclonales competitivos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, por ejemplo, a través de un ensayo de competición de anticuerpos. Por ejemplo, se puede unir una muestra de cD70 humana purificada o parcialmente purificada a un soporte sólido. A continuación, se añaden un compuesto de anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención y un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo que se sospecha que es capaz de competir con dicho compuesto de anticuerpo de la invención. Una de las dos moléculas se marca. Si el compuesto marcado y el compuesto no marcado se unen a sitios separados y discretos en CD70, el compuesto marcado se unirá al mismo nivel independientemente de si el compuesto competidor sospechoso está presente o no. Sin embargo, si los sitios de interacción son idénticos o se solapan, el compuesto no marcado competirá y la cantidad de compuesto marcado unido al antígeno disminuirá. Si el compuesto no marcado está presente en exceso, compuesto marcado se unirá muy poco, si lo hiciera. Para los fines de la presente invención, los anticuerpos monoclonales competidores o fragmentos de unión a antígeno de los mismos son aquellos que disminuyen la unión de los presentes compuestos de anticuerpos a CD70 en aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%. aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, o aproximadamente 99%. Los detalles de los procedimientos para llevar a cabo tales ensayos de competición son bien conocidos en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en Harlow y Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, páginas 567-569, ISBN 0-87969314-2. Tales ensayos pueden hacerse cuantitativos utilizando anticuerpos purificados. Se establece una curva patrón titulando un anticuerpo contra sí mismo, es decir, el mismo anticuerpo se utiliza tanto para la marca como para el competidor. Se valora la capacidad de un anticuerpo monoclonal competidor no marcado o fragmento de unión a antígeno del mismo para inhibir la unión de la molécula marcada a la placa. Los resultados se representan gráficamente y se comparan las concentraciones necesarias para alcanzar el grado deseado de inhibición de la unión.
Las realizaciones preferidas son anticuerpos que compiten de manera cruzada por la unión a CD70 humana con anticuerpos que comprenden el Fab 27B3 derivado de llama, y sus variantes que han experimentado mutación
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
inversa a secuencias de la línea germinal, que incluyen en particular 41D12 (ARGX-110) y que exhiben la misma combinación de características de unión, a saber:
(a) unión dentro de la secuencia de aminoácidos HIQVTLAICSS (SEQ ID NO: 342) en CD70 humana;
(b) reactividad cruzada con homólogos de CD70 de macaco rhesus (Macaca mulatta) y mono cinomolgo
(Macaca cynomolgus);
(c) unión a CD70 humana recombinante nativa y desnaturalizada por calor.
Polinucleótidos que codifican anticuerpos contra CD70
La invención también proporciona moléculas de polinucleótidos que codifican los anticuerpos contra CD70 de la invención, también vectores de expresión que contienen secuencias de nucleótidos que codifican los anticuerpos contra CD70 de la invención conectados operativamente a secuencias reguladoras que permiten la expresión del polipéptido de unión a antígeno en una célula anfitriona o sistema de expresión libre de células, y una célula anfitriona o sistema de expresión libre de células que contiene este vector de expresión.
Las moléculas de polinucleótidos que codifican los anticuerpos contra CD70 de la invención incluyen, por ejemplo, moléculas de ADN recombinante. Los términos "ácido nucleico", "polinucleótido" o "molécula de polinucleótido" se utilizan en la presente memoria indistintamente y se refieren a cualquier molécula de ADN o ARN, monocatenaria o bicatenaria y, si es monocatenaria, a la molécula de su secuencia complementaria. Al comentar las moléculas de ácido nucleico, se puede describir en la presente memoria una secuencia o estructura de una molécula de ácido nucleico concreta de acuerdo con la convención normal de proporcionar la secuencia en la dirección 5' a 3'. En algunas realizaciones de la invención, los ácidos nucleicos o polinucleótidos están "aislados". Este término, cuando se aplica a una molécula de ácido nucleico, se refiere a una molécula de ácido nucleico que está separada de las secuencias a las que es inmediatamente contigua en el genoma natural del organismo en el que se originó. Por ejemplo, un "ácido nucleico aislado" puede comprender una molécula de ADN insertada en un vector, tal como un vector plasmídico o virus, o integrada en el ADN genómico de una célula procariótica o eucariótica o un organismo anfitrión no humano. Cuando se aplica al ARN, el término "polinucleótido aislado" se refiere principalmente a una molécula de ARN codificada por una molécula de ADN aislada como se definió anteriormente. Alternativamente, el término puede referirse a una molécula de ARN que se ha purificado/separado de otros ácidos nucleicos con los que se asociaría en su estado natural (es decir, en células o tejidos). Un polinucleótido aislado (ya sea ADN o ARN) puede representar adicionalmente una molécula producida directamente por medios biológicos o sintéticos y separada de otros componentes presentes durante su producción.
En una realización, la invención proporciona secuencias de nucleótidos que codifican el dominio VH y el dominio VL del Fab derivado de llama que ha experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal indicado en la presente memoria como 41D12, en donde el dominio VH tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 223 y el dominio VH tiene el secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 241. En una realización preferida, la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio VH que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 223 comprende la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID NO: 344, y la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio VL que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada La SEQ ID NO: 241 comprende la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID NO: 345.
También se describen secuencias de nucleótidos que codifican el dominio VH y el dominio VL del Fab derivado de llama que ha experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal indicado en la presente 57B6, en donde el dominio VH tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 274 y el dominio VH tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 276. En una realización preferida, la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio VH que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 274 comprende la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID NO: 346, y la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio VL que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada La SEQ ID NO: 276 comprende la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID NO: 347.
También se describen secuencias de nucleótidos que codifican el dominio VH y el dominio VL del Fab derivado de llama que ha experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal indicado en la presente memoria como 59D10, en donde el dominio VH tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 275 y el dominio VH tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 277. En una realización preferida, la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio VH que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 275 comprende la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID NO: 348, y la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio VL que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 277 comprende la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID NO: 349.
Para la producción recombinante de un anticuerpo contra CD70 de acuerdo con la invención, se puede preparar un polinucleótido recombinante que lo codifica (utilizando técnicas de biología molecular convencionales) y e insertar en un vector replicable para su expresión en una célula anfitriona elegida, o un sistema de expresión libre de células.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Las células anfitrionas adecuadas pueden ser procariotas, levaduras o células eucarióticas superiores, específicamente células de mamífero. Los ejemplos de líneas de células anfitrionas de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster Chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de mieloma de ratón SP2/0-AG14 (ATCC CRL 1581; ATCC CRL 8287) o NS0 (colecciones de cultivo HPA Núm. 85110503); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA, ATCC CCL 2); células renales caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); Células MRC 5; Células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2), así como la línea celular PERC-6 de DSM. Los vectores de expresión adecuados para su uso en cada una de estas células anfitrionas también son conocidos en general en la técnica.
Debe observarse que el término "célula anfitriona" generalmente se refiere a una línea celular cultivada. Los seres humanos completos en los que se ha introducido un vector de expresión que codifica un polipéptido de unión a antígeno de acuerdo con la invención se excluyen explícitamente de la definición de "célula anfitriona".
Producción de anticuerpos
En un aspecto importante, la invención también proporciona un método para producir un anticuerpo contra CD70 de la invención que comprende cultivar una célula anfitriona (o sistema de expresión libre de células) que contiene un polinucleótido (p.ej. un vector de expresión) que codifica el anticuerpo contra CD70 en condiciones que permiten la expresión del anticuerpo contra CD70 y la recuperación del anticuerpo contra CD70 expresado. Este procedimiento de expresión recombinante se puede utilizar para la producción a gran escala de anticuerpos contra CD70 de acuerdo con la invención, incluyendo anticuerpos monoclonales destinados a uso terapéutico en seres humanos. Los vectores, las líneas celulares y los procedimientos de producción adecuados para la fabricación a gran escala de anticuerpos recombinantes adecuados para el uso terapéutico in vivo generalmente están disponibles en la técnica y serán bien conocidos por el experto en la técnica.
Como se señala en otra parte, los anticuerpos contra CD70 proporcionados en la presente memoria, que incluyen en particular anticuerpos basados en el Fab 27B3 y sus variantes que han experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal tales como 41D12 (ARGX-110) exhiben características que son particularmente beneficiosas para la fabricación comercial a gran escala. Específicamente, el rendimiento de producción extremadamente alto (> 4 g/l) alcanzable en un sistema de expresión recombinante a escala comercial reducirá drásticamente los costes de producción.
Las realizaciones preferidas también exhiben estabilidad térmica cuando se someten a ensayo a 37°C y también durante varios ciclos de congelación-descongelación, lo que de nuevo es extremadamente beneficioso para la fabricación comercial y el almacenamiento de un producto clínico. Sorprendentemente, algunas de las variantes que han experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal de Fab 27B3, incluyendo 41D12 y 40F1, exhiben estabilidad térmica mejorada en comparación con el propio 27B3.
También se describe en la presente memoria un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen a CD70 humana, comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento un dominio variable de cadena pesada correspondiente a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 178, con la condición de que al menos un aminoácido en una posición de Kabat seleccionada del grupo que consiste en H6, H18, H24, H31, H56, H74, H77, H79, H83, H84, H89, H93, H94, H108, H110, y H112 se sustituye por otro aminoácido .
Este anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, pueden exhibir una mayor estabilidad térmica que un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprenden un dominio variable de cadena pesada con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 178.
También se describe en la presente memoria un anticuerpo contra CD70 o fragmento de unión a antígeno que comprende un dominio variable de cadena ligera correspondiente a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 201, con la condición de que al menos un aminoácido en una posición Kabat seleccionado del grupo que consiste en L2, L11, L12, L25, L26, L30, L46, L53, L60, L61, L67, L68, L76, L80, L81, L85 y L87 este sustituido por otro aminoácido.
Este anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede exhibir una mayor estabilidad térmica que un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprenden un dominio variable de cadena pesada con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 201.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
El anticuerpo contra CD70, o fragmento de unión a antígeno del mismo pueden comprender:
a) un dominio variable de cadena pesada con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 178 que comprende una o más sustituciones de aminoácidos en posiciones Kabat seleccionadas del grupo que consiste en H6, H18, H24, H31, H56, H74, H74, H77, H79, H83, H84, H89, H93, H94, H108, H110 y H112; y
b) un dominio variable de cadena ligera con la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 201 que comprende una o más sustituciones de aminoácidos en posiciones Kabat seleccionadas del grupo que consiste en L2, L11, L12, L25, L26, L30, L46, L53, L60, L61, L67, L68, L76, L80, L81, L85 y L87.
Este anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo puede exhibir mayor estabilidad térmica que un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende un dominio variable de cadena pesada con la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 178 y un dominio variable de cadena ligera con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 201.
Utilidad terapéutica de los anticuerpos contra CD70
Los anticuerpos contra CD70, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, proporcionados en la presente memoria pueden utilizarse para inhibir el crecimiento de células tumorales cancerosas. in vivo y, por lo tanto, son útiles en el tratamiento de cánceres que expresan CD70.
Por consiguiente, otros aspectos de la invención se refieren a métodos para inhibir el crecimiento de células tumorales en un paciente humano, y también a métodos para tratar o prevenir el cáncer, que comprenden administrar a un paciente que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo contra CD70 o fragmento de unión a antígeno como se describe en la presente memoria.
Otro aspecto de la invención proporciona un anticuerpo contra CD70 o un fragmento de unión a antígeno como se describe en la presente memoria para su uso en la inhibición del crecimiento de células tumorales que expresan CD70 en un paciente humano.
Otro aspecto adicional de la invención proporciona un anticuerpo contra CD70 o un fragmento de unión a antígeno como se describe en la presente memoria para si uso en el tratamiento o la prevención del cáncer en un paciente humano.
Los cánceres preferidos cuyo crecimiento puede inhibirse utilizando los anticuerpos contra CD70 descritos en la presente memoria incluyen cáncer renal (p.ej., carcinoma de células renales), cáncer de mama, tumores cerebrales, leucemias crónicas o agudas incluyendo leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, linfomas (p. ej., linfoma de Hodgkin y no Hodgkin, linfoma linfocítico, linfoma primario del SNC, linfoma de células T), carcinomas nasofaríngeos, melanoma (p. ej., melanoma maligno metastásico), cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de huesos, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma maligno cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer de recto, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de útero, carcinoma de trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, el carcinoma del cuello del útero, el carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de la uretra, cáncer del pene, tumores sólidos de la infancia, cáncer de la vejiga, cáncer del riñón o uréter, carcinoma de la pelvis renal, neoplasia del sistema nervioso central (SNC), angiogénesis tumoral, tumor del eje espinal, glioma del tronco encefálico, adenoma hipofisario, sarcoma de Kaposi, cáncer epidermoide, cáncer de células escamosas, mesotelioma.
Los anticuerpos contra CD70 descritos en la presente memoria también pueden utilizarse para tratar un sujeto con un trastorno tumorigénico caracterizado por la presencia de células tumorales que expresan CD70 incluyendo, por ejemplo, carcinomas de células renales (CCR), tales como CCR de células claras, glioblastoma, cáncer de mama, tumores cerebrales, carcinomas nasofaríngeos, linfoma no Hodgkin (LNH), leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC), linfoma de Burkitt, linfomas anaplásicos de células grandes (LACG), mieloma múltiple, linfomas cutáneos de células T, linfomas nodulares de células pequeñas divididas, linfomas linfocíticos, linfomas de células T periféricas, linfomas de Lennert, linfomas inmunoblásticos, leucemia/linfoma de células T (LLCT), leucemia de células T en adultos (LCTA), linfomas folículares centroblásticos/centrocíticos (cb/cc), linfomas difusos de células grandes de linaje B, linfoma de células T de tipo linfadenopatía angioinmunoblástica (LAIB), linfomas asociados a la cavidad corporal asociados al VIH, carcinomas embrionarios, carcinomas indiferenciados de la rinofaringe (p.ej., tumor de Schmincke), enfermedad de Castleman, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma de células del manto y otros linfomas de células B.
Las realizaciones específicas se refieren al tratamiento de uno cualquiera de los cánceres enumerados anteriormente con un anticuerpo que comprende el Fab 27B3 derivado de llama, o una de sus variantes que han
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal, incluyendo concretamente 41D12 (ARGX-110). En particular, cualquiera de los cánceres enumerados anteriormente se puede tratar utilizando un anticuerpo que comprende las regiones Fab de 41D12 (variante que ha experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal de 27B3) fusionadas a las regiones constantes de IgG1 humana. En la última realización, se puede modificar adicionalmente la región constante de IgG1 humana para maximizar las funciones efectoras de anticuerpo (p.ej., mediante la adición de mutaciones puntuales), o el anticuerpo 41D12-IgG1 puede no fucosilarse, nuevamente para mejorar la función efectora de anticuerpo.
Como se observa en otra parte, los anticuerpos contra CD70 descritos en la presente memoria, particularmente 27B3 y sus variantes que han experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal, muestran una unión particularmente fuerte a líneas celulares de cáncer humano que expresan CD70 de la superficie celular a bajo número de copias, tal como por ejemplo la línea celular de linfoma de células B grandes SU-DHL-6, la línea celular de leucemia linfocítica crónica jVM-2, la línea celular de linfoma de células T cutáneas HH, la línea celular de carcinoma gástrico MKN-45, las líneas celulares de carcinoma de pulmón A549 y EBC-1, las líneas celulares de melanoma WM852 y WM793, la línea celular de glioblastoma GaMG y las líneas celulares de carcinoma de ovario OAW-42, SKOv3 y OVCAR3. De hecho, la afinidad de 41D12 (ARGX-110) por estas líneas celulares de cáncer de bajo número de copias es significativamente mayor que la de los anticuerpos de la técnica anterior de comparación, tales como SGN70 y MDX1411.
La afinidad "mejorada" por líneas celulares de cáncer de bajo número de copias tiene relevancia directa para el tratamiento clínico de los cánceres correspondientes, como se demuestra mediante los experimentos de enriquecimiento celular en los ejemplos adjuntos. Cuando las células de una línea celular de bajo número de copias (p.ej., la línea celular de linfoma de células B grandes difuso SU-DHL-6) se adicionan a PBMC recién aisladas de donantes sanos, las células de la línea celular cancerosa se empobrecen preferentemente en el anticuerpo contra CD70 ARGX-110 ilustrativo.
Por consiguiente, un aspecto adicional de la invención se refiere a un método para tratar o prevenir el cáncer, que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo contra CD70 o fragmento de unión a antígeno como se describe en la presente memoria, en donde el cáncer es un cáncer que exhibe una baja expresión del número de copias de CD70.
La invención también proporciona un anticuerpo contra CD70 o fragmento de unión a antígeno como se describe en la presente memoria para uso en el tratamiento o prevención del cáncer en un paciente humano, en el que el cáncer es un cáncer que exhibe una baja expresión del número de copias de CD70.
En cada uno de estos aspectos, el cáncer de bajo número de copias se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en: linfoma de células B grandes, leucemia linfocítica crónica, linfoma de células T cutáneo, cáncer gástrico, cáncer de pulmón, melanoma, glioblastoma y cáncer de ovario.
Las realizaciones específicas se refieren al tratamiento de cánceres de bajo número de copias con un anticuerpo que comprende el Fab 27B3 derivado de llama, o una de sus variantes que han experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal, incluyendo concretamente 41D12 (ARGX-110). En particular, cualquiera de los cánceres de bajo número de copias enumerados anteriormente puede tratarse utilizando un anticuerpo que comprende las regiones Fab de 41D12 (variante germinal de 27B3) fusionadas a las regiones constantes de IgG1 humana.
Los anticuerpos contra CD70 descritos en la presente memoria también son útiles para el tratamiento de trastornos inmunológicos caracterizados por la expresión de CD70. Los ejemplos específicos de tales trastornos inmunológicos incluyen los siguientes: artritis reumatoide, enfermedades desmielinizantes autoinmunitarias (p.ej., esclerosis múltiple, encefalomielitis alérgica), oftalmopatía endocrina, uveoretinitis, lupus eritematoso sistémico, miastenia gravis, enfermedad de Graves, glomerulonefritis, trastorno hepatológico autoinmunitario, enfermedad inflamatoria intestinal (p.ej., enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad celíaca), anafilaxia, reacción alérgica, síndrome de Sjogren, diabetes mellitus tipo I, cirrosis biliar primaria, granulomatosis de Wegener, fibromialgia, polimiositis, dermatomiositis, insuficiencia endocrina múltiple, síndrome de Schmidt, uveítis autoinmunitaria, enfermedad de Addison, adrenalitis, tiroiditis, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad tiroidea autoinmunitaria, anemia perniciosa, atrofia gástrica, hepatitis crónica, hepatitis lupoide, aterosclerosis, lupus eritematoso cutáneo subagudo, hipoparatiroidismo, síndrome de Dressier, trombocitopenia autoinmunitaria, púrpura trombocitopénica idiopática, anemia hemolítica, pénfigo vulgar, pénfigo, dermatitis herpetiforme, alopecia areata, penfigoide, esclerodermia, esclerosis sistémica progresiva, síndrome CREST (calcinosis, fenómeno de Raynaud, dismotilidad esofágica, esclerodactilia y telangiectasia), infertilidad autoinmunitaria masculina y femenina, espondilitis anquilosante, colitis ulcerosa, enfermedad mixta del tejido conectivo, poliarteritis nedosa, vasculitis necrosante sistémica, dermatitis atópica, rinitis atópica, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Chagas, sarcoidosis, fiebre reumática, asma, aborto recurrente, síndrome antifosfolípido, pulmón de granjero, eritema multiforme, síndrome post-cardiotomía, síndrome de Gushing, hepatitis crónica activa autoinmunitaria, pulmón del cuidador de aves, necrólisis epidérmica tóxica, síndrome de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Alport, alveolitis, alveolitis alérgica, alveolitis fibrosante, enfermedad pulmonar intersticial, eritema nodoso, pioderma gangrenoso, reacción a la transfusión, arteritis de Takayasu, polimialgia reumática, arteritis temporal, esquistosomiasis, arteritis de células gigantes, ascariasis, aspergilosis, síndrome de Sampter, eczema, granulomatosis linfomatoide, enfermedad de Behcet, síndrome de Caplan, enfermedad de Kawasaki, dengue, encefalomielitis, endocarditis, fibrosis endomiocárdica, endoftalmitis, eritema elevatum y diutinum, psoriasis, eritroblastosis fetal, faciitis eosinofílica, síndrome de Shulman, síndrome de Felty, filariasis, ciclitis, ciclitis crónica, ciclitis heterocrónica, ciclitis de Fuch, nefropatía IgA, púrpura de Henoch-Schonlein, enfermedad de injerto contra anfitrión, rechazo de trasplante, cardiomiopatía, síndrome de Eaton-Lambert, policondritis recidivante, crioglobulinemia, síndrome de Evans, e insuficiencia gonadal autoinmunitaria, trastornos de linfocitos B (p.ej., lupus eritematoso sistémico, síndrome de Goodpasture, artritis reumatoide y diabetes tipo I), linfocitos Th1 (p.ej., artritis reumatoide, esclerosis múltiple, psoriasis, síndrome de Sjorgren, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Graves, cirrosis biliar primaria, granulomatosis de Wegener, tuberculosis o enfermedad de injerto contra anfitrión) o linfocitos Th2 (p.ej., dermatitis atópica, lupus eritematoso sistémico, asma atópica, rinoconjuntivitis, rinitis alérgica, síndrome de Omenn, esclerosis sistémica o enfermedad de injerto contra anfitrión crónica), Síndrome de Churg Strauss, poliangitis microscópica y arteritis de Takayasu.
Las realizaciones específicas se refieren al tratamiento de cualquiera de los trastornos inmunológicos enumerados anteriormente con un anticuerpo que comprende el Fab 27B3 derivado de llama, o una de sus variantes que han experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal, incluyendo concretamente 41D12 (ARGX-110). En particular, cualquiera de los cánceres enumerados anteriormente se puede tratar utilizando un anticuerpo que comprende las regiones Fab de 41D12 (variante germinal de 27B3) fusionadas a las regiones constantes de IgG1 humana. En la última realización, la región constante de IgG1 humana puede modificarse adicionalmente para maximizar las funciones efectoras de anticuerpo (p.ej., mediante la adición de mutaciones puntuales), o el anticuerpo 41D12-IgG1 puede no fucosilarse, nuevamente para mejorar la función efectora de anticuerpo.
Según se utiliza en la presente memoria, el término "tratar" o "tratamiento" significa ralentizar, interrumpir, obstaculizar, controlar, mejorar, detener, reducir la gravedad de un síntoma, trastorno, afección o enfermedad, pero no implica necesariamente una eliminación total de todos los síntomas, afecciones o trastornos relacionados con la enfermedad.
Para el uso terapéutico en seres humanos, los anticuerpos contra CD70 descritos en la presente memoria pueden administrarse a un sujeto humano que necesite tratamiento en una "cantidad eficaz". El término "cantidad efectiva" se refiere a la cantidad o dosis de un anticuerpo contra CD70 que, tras la administración de una dosis única o múltiple a un paciente humano, proporciona eficacia terapéutica en el tratamiento de la enfermedad. Las cantidades terapéuticamente eficaces del anticuerpo contra CD70 pueden comprender una cantidad en el intervalo de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg por dosis única. El profesional sanitario puede determinar una cantidad terapéuticamente eficaz para cada paciente individual controlando el efecto del anticuerpo contra CD70 sobre un biomarcador, tal como CD70 de la superficie celular en tejidos tumorales, o un síntoma como regresión tumoral, etc. La cantidad de anticuerpos administrados en cualquier punto temporal dado pueden variarse de manera que se administren cantidades óptimas de anticuerpo contra CD70, ya sea se empleen solos o combinados con cualquier otro agente terapéutico, durante el transcurso del tratamiento.
También se contempla administrar los anticuerpos contra CD70 descritos en la presente memoria, o composiciones farmacéuticas que comprenden dichos anticuerpos, combinados con cualquier otro tratamiento contra el cáncer, como una terapia combinada.
Uso de anticuerpos que son escasamente internalizados para agotar las células que expresan CD70
Un hallazgo sorprendente descrito en la presente memoria es que los anticuerpos contra CD70 unidos a CD70 expresados en la superficie de líneas celulares cancerosas están poco internalizados. Este es un resultado sorprendente, ya que la técnica anterior ha descrito previamente a CD70 como una "diana de internalización". Aunque existe una variación entre diferentes tipos de células cancerosas en el grado preciso de internalización de los anticuerpos de CD70 unidos, no se observa ningún tipo de célula cancerosa que "internalice completamente" el anticuerpo de CD70 unido. Por ejemplo, se ha demostrado que las líneas celulares de cáncer renal previamente descritas como de internalización rápida de hecho internalizan un máximo de aproximadamente 70% del anticuerpo unido ARGX-110. Muchas otras líneas de células cancerosas internalizan menos de 30%, menos de 20% o incluso menos de 10% de ARGX-110 unido.
La variación del grado de internalización entre las diferentes líneas de células cancerosas depende en gran medida de la enfermedad, observándose resultados similares utilizando diferentes anticuerpos contra CD70. Sin embargo, la escasa internalización en ciertas líneas celulares es particularmente evidente cuando se utiliza el anticuerpo ARGX- 110. El bajo grado de internalización observado en muchas células cancerosas proporciona una justificación para el uso de anticuerpos contra CD70 con una fuerte función efectora para agotar (p.ej., destruir o inhibir el crecimiento de) las células cancerosas in vivo. Dado que los anticuerpos ligados a CD70 son relativamente mal internalizados en
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
muchas células cancerosas, el anticuerpo permanecerá unido a la superficie celular y por lo tanto podrá desencadenar funciones efectoras (ADCC, cDc, ADCP) mediante interacciones con el sistema inmunitario de un paciente humano.
Por consiguiente, en la presente memoria se describe un método para agotar las células que expresan CD70 en un paciente humano, que comprende administrar a dicho paciente una cantidad eficaz de un anticuerpo que se une a CD70 humana, en donde dichas células que expresan CD70 exhiben 30% o menos, 25% o menos, 20% o menos, 15% o menos, 10% o menos o 5% o menos de internalización de dicho anticuerpo después de un período de 6 horas, y en donde dicho anticuerpo muestra al menos una función efectora seleccionada del grupo que consiste en ADCC, CDC y ADCP.
En este método, el anticuerpo contra CD70 (con funciones efectoras activas) se utiliza para agotar células que expresan CD70. Este agotamiento de las células que expresan CD70 puede formar la base del tratamiento terapéutico o profiláctico, p.ej. para el tratamiento de la prevención de cánceres que expresan CD70, o para el tratamiento de la prevención de trastornos inmunológicos asociados con CD70. El mecanismo preciso por el que se agotan los anticuerpos que expresan CD70 puede depender del tipo de funciones efectoras exhibidas por el anticuerpo contra CD70, pero dependerá de la fuerte unión (alta afinidad) del anticuerpo contra CD70 a CD70 de la superficie celular, junto con una escasa internalización del anticuerpo unido
En ciertas realizaciones, las células que expresan CD70 son células cancerosas que expresan CD70. En particular, las células cancerosas que expresan CD70 pueden ser de un tipo de cáncer seleccionado del grupo que consiste en: linfoma de Burkitt, linfoma de células B grandes, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma de células del manto, leucemia linfocítica crónica, carcinoma pancreático, carcinoma gástrico, glioblastoma y carcinoma de pulmón. Se ha demostrado que las líneas celulares derivadas de cada uno de estos cánceres internalizan 30% o menos de anticuerpo contra CD70 unido a lo largo de un período de 6 horas. En una realización adicional, las células cancerosas que expresan CD70 pueden ser de un tipo de cáncer seleccionado del grupo que consiste en: linfoma de Burkitt, linfoma de células B grandes, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma de células de manto, leucemia linfocítica crónica, carcinoma gástrico, glioblastoma y carcinoma de pulmón. Se ha demostrado que las líneas celulares derivadas de cada uno de estos cánceres internalizan 20% o menos de anticuerpo contra CD70 unido a lo largo de un período de 6 horas. En una realización adicional, las células cancerosas que expresan CD70 pueden ser de un tipo de cáncer seleccionado del grupo que consiste en: linfoma de Burkitt, linfoma de células B grandes, linfoma de células de manto, leucemia linfocítica crónica, carcinoma gástrico y carcinoma de pulmón. Se ha demostrado que las líneas celulares derivadas de cada uno de estos cánceres internalizan 10% o menos de anticuerpo contra CD70 unido a lo largo de un período de 6 horas.
En otras realizaciones, las células que expresan CD70 pueden ser células T activadas que expresan CD70, que no muestran ninguna internalización detectable de los anticuerpos de CD70 unidos (específicamente no se observa internalización de ARGX-110 a lo largo de un período de 6 horas. Esta observación de que los anticuerpos contra CD70 unidos no son internalizado por las células T activadas CD70+ apoya firmemente el uso de anticuerpos contra CD70 con una fuerte función efectora (ADCC, CDC o ADCP), que incluye pero no se limita a ARGX-110, en el tratamiento de enfermedades inmunológicas mediadas por células T activadas por CD70+, incluyendo trastornos autoinmunitarios tales como, por ejemplo, artritis reumatoide, psoriasis, LES, etc.
Las realizaciones enumeradas anteriormente pueden utilizar esencialmente cualquier anticuerpo contra CD70. En realizaciones específicas, el anticuerpo puede ser cualquier anticuerpo contra CD70 que se haya demostrado experimentalmente que exhibe 30% o menos, 25% o menos, 20% o menos, 15% o menos, 10% o menos o 5% o menos de internalización después de un período de 6 horas en una línea celular de cáncer que expresa CD70 seleccionada del grupo que consiste en Raji, SU-DHL-6, MHHPREB1, Mino, Mec1, JVM-2, MKN-45, A549, U87MG, PANC-1, PANC-89, L428, Granta 519, Rec-1 y EBC-1. En efecto, el ensayo de internalización de la línea celular descrito en los ejemplos adjuntos puede utilizarse como un filtro para determinar qué indicaciones de enfermedad concretas deben ser elegidas como diana por anticuerpos contra CD70 que tienen una fuerte función efectora, o por productos conjugados de anticuerpo contra CD-fármaco (discutidos más adelante), y también para identificar anticuerpos contra CD70 adecuados para uso en el tratamiento de indicaciones de enfermedades concretas.
Por consiguiente, también se describe en la presente memoria un método para agotar las células cancerosas que expresan CD70 en un paciente humano, que comprende administrar a dicho paciente una cantidad eficaz de un anticuerpo que se une a CD70 humana, en donde dicho anticuerpo exhibe 30% o menos de internalización después de un período de 6 horas en una línea celular de cáncer que expresa CD70 seleccionada del grupo que consiste en Raji, SU-DHL-6, MHHPREB1, Mino, Mec1, JVM-2, MKN-45, A549, U87MG, PANC-1, PANC-89, L428, Granta 519, Rec-1 y EBC-1, y en donde dicho anticuerpo muestra al menos una función efectora seleccionada del grupo que consiste en ADCC, CDC y ADCP. En una realización, el anticuerpo que se utilizará para reducir las células cancerosas que expresan CD70 en un paciente humano puede ser un anticuerpo que exhibe una internalización de 10% o menos durante un período de 6 horas en una línea celular de cáncer que expresa CD70 seleccionada del grupo que consiste en Raji, SU-DHL-6, Granta 519, Rec-1, Mec1, JVM-2, MkN-45, A549 y EBC-1, y también
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
presenta al menos una función efectora seleccionada del grupo que consiste en ADCC, CDC y ADCP .
Las realizaciones específicas pueden utilizar cualquiera de los anticuerpos contra CD70 descritos en la presente memoria, que se unen a CD70 humana con una afinidad extremadamente alta. Las realizaciones preferidas pueden utilizar un anticuerpo que comprende el Fab 27B3 derivado de llama, o una de sus variantes que han experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal, incluyendo en particular 41D12 (ARGX-110). Las realizaciones particularmente preferidas utilizan un anticuerpo que comprende las regiones Fab de 41D12 (variante que ha experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal de 27B3) fusionadas a las regiones constantes de IgG1 humana. En la última realización, la región constante de IgG1 humana puede diseñarse adicionalmente para maximizar las funciones efectoras de anticuerpo (p.ej., mediante la adición de mutaciones puntuales), o el anticuerpo 41D12-IgG1 puede no fucosilarse, nuevamente para mejorar la función efectora de anticuerpo.
Dado que la justificación detrás del uso de anticuerpos contra CD70 escasamente internalizados para agotar las células que expresan CD70 se basa en las funciones efectoras del anticuerpo, se prefiere que los anticuerpos utilizados en este método sean productos no inmunoconjugados en los que el anticuerpo contra CD70 está unido a un agente farmacéutico, agente citotóxico, agente citostático, radical de fármaco, etc. De hecho, una ventaja particular de este método es evitar la necesidad de utilizar productos conjugados de anticuerpo-fármaco, lo que es deseable tanto desde perspectiva de seguridad del paciente (evita la administración de agentes potencialmente tóxicos) como desde una perspectiva económica (evita la costosa síntesis de productos conjugados de anticuerpo- fármaco).
Uso de productos conjugados de anticuerpo-fármaco para destruir células con anticuerpos contra CD70 de intemalización significativa
En los presentes ejemplos se demuestra que hay diferencias significativas célula a célula en el grado de internalización de los anticuerpos contra CD70, y que estas diferencias dependen en gran medida del tipo de célula, más que de la naturaleza del anticuerpo contra CD70 (aunque las diferencias son particularmente marcadas cuando se utiliza el anticuerpo ARGX-110). Para aquellos tipos de células que exhiben una significativo grado de internalización del anticuerpo contra CD70 unido, es decir, 30% o más, preferiblemente 40% o más, más preferiblemente 50% o más, o incluso 60% o más de internalización después de 6 horas, una estrategia terapéutica altenativa puede basarse en el uso de productos conjugados anticuerpo contra CD70-fármaco.
Por consiguiente, se describe un método para agotar las células que expresan CD70 en un paciente humano, que comprende administrar a dicho paciente una cantidad eficaz de un producto conjugado de anticuerpo-fármaco que comprende un anticuerpo que se une a CD70 humana y un radical de fármaco citotóxico o citostático, en donde las células que expresan CD70 exhiben 30% o más, 40% o más, 50% o más, o 60% o más de internalización de dicho anticuerpo que se une a CD70 humana después de un período de 6 horas.
En realizaciones específicas, las células que expresan CD70 pueden internalizar entre 40% y 70%, preferiblemente entre 50% y 70% del anticuerpo contra CD70 que forma la base del producto conjugado de anticuerpo-fármaco en un período de 6 horas.
En este método, el producto conjugado de anticuerpo contra CD70-fármaco se utiliza para agotar células que expresan CD70. Este agotamiento de las células que expresan CD70 puede formar la base del tratamiento terapéutico o profiláctico, p.ej. para el tratamiento de prevención de cánceres que expresan CD70, o para el tratamiento de prevención de trastornos inmunológicos asociados con CD70. El mecanismo preciso por el que se agotan los anticuerpos que expresan CD70 puede depender de la naturaleza del producto conjugado de anticuerpo- fármaco, es decir, si el radical de "fármaco" es citotóxico o citostático, pero dependerá de la unión fuerte (alta afinidad) del anticuerpo contra CD70 a la superficie de la célula CD70, junto con la internalización significativa del anticuerpo unido.
En ciertas realizaciones, las células que expresan CD70 son células cancerosas que expresan CD70. En particular, las células cancerosas que expresan CD70 pueden ser de un tipo de cáncer seleccionado del grupo que consiste en: linfoma cutáneo de células T, mieloma múltiple, carcinoma de células renales, astrocitoma, melanoma y carcinoma ovárico. Se ha demostrado que las líneas celulares derivadas de cada uno de estos cánceres internalizan más del 30% del anticuerpo contra cD70 unido durante un período de 6 horas. En una realización adicional, las células cancerosas que expresan CD70 pueden ser de un tipo de cáncer seleccionado del grupo que consiste en: carcinoma de células renales, astrocitoma, melanoma y carcinoma de ovario. Se ha demostrado que las líneas celulares derivadas de cada uno de estos cánceres internalizan más de 50% del anticuerpo contra CD70 unido a lo largo de un período de 6 horas.
En realizaciones específicas de este aspecto de la invención, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco puede basarse en cualquiera de los anticuerpos contra CD70 descritos en la presente memoria, que se unen a CD70 humana con una afinidad extremadamente alta. En realizaciones preferidas, el producto conjugado de anticuerpo-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
fármaco puede basarse en un anticuerpo que comprende el Fab 27B3 derivado de llama, o una de sus variantes que ha experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal, incluyendo en particular 41D12. Las características de los producto conjugados de anticuerpo-fármaco destinados al uso terapéutico en seres humanos son generalmente conocidas en la técnica, particularmente con respecto a la naturaleza del radical de "fármaco", p.ej. un agente citotóxico o citostático, y medios de conjugación del radical de fármaco al radical de anticuerpo contra CD70. Se proporcionan ejemplos de conjugados de anticuerpo contra CD70-fármaco, por ejemplo, en el documento WO 2004/073656.
Composiciones farmacéuticas
El alcance de la invención incluye composiciones farmacéuticas que contienen uno o una combinación de anticuerpos contra CD70 de la invención, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, formulados con uno o más portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables. Dichas composiciones pueden incluir uno o una combinación de (p.ej., dos o más diferentes) anticuerpos contra CD70.
Los mecanismos para formular anticuerpos para uso terapéutico humano son bien conocidos en la técnica y son revisados, por ejemplo, por Wang et al., en Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 96, pág. 1-26, 2007.
Ejemplos
La invención se entenderá mejor con referencia a los siguientes ejemplos experimentales no limitantes.
Ejemplo 1: Inmunización de llamas
Las inmunizaciones de llamas y la recolección de linfocitos de sangre periférica (PBL), así como la posterior extracción de ARN y la amplificación de fragmentos de anticuerpos se realizaron según lo descrito por De Haard y colaboradores (De Haard H, et al., J. Bact. 187: 4531-4541, 2005). Se inmunizaron dos llamas con células 786-0 que expresaban cD70 (ATCC-CRL-1932) y dos llamas con células Raji que expresaban CD70 (ATCC-CCL-86). Las células se prepararon recientemente para cada inmunización y se verificó la expresión de CD70 mediante análisis FACS. Las llamas se inmunizaron con aproximadamente 107 células vivas inyectadas por vía intramuscular en el cuello, una vez por semana durante seis semanas. Se inyectó coadyuvante incompleto de Freund en los músculos del cuello a unos pocos centímetros del sitio de inmunización celular.
Se tomaron muestras de sangre de 10 ml antes y después de la inmunización para investigar la respuesta inmunitaria. Los sueros de las llamas se analizaron para determinar la presencia de anticuerpos contra CD70 recombinante (Flag-TNC-CD70) mediante ELISA antes de (día 0) y después (día 55 o 69) la inmunización. Debe observarse que como anticuerpo de detección se utilizó anti-IgG1/2 de llama de cabra (Bethyl, A160-100P) que no discrimina entre anticuerpos convencionales y de cadena pesada, lo que significa que la respuesta de CD70 medida es de la IgG total. Los resultados se muestran en la Figura 1.
Tres a cuatro días después de la última inmunización, se recogieron 400 ml de sangre para la extracción del ARN total de los LSP utilizando un gradiente de Ficoll-Paque para aislar los LSP y el método descrito por Chomczynski P, et al., Anal. Biochem. 162: 156-159, 1987 para preparar el ARN. De promedio, se obtuvieron rendimientos de ARN de 450 |jg, de los cuales se utilizó una alícuota de 80 |jg para la síntesis al azar de ADNc y la posterior amplificación de los segmentos génicos VHCH1, VACA y VKCK.
Ejemplo 2: Construcción de la biblioteca
Se construyeron bibliotecas VACA y VKCK independientes utilizando una PCR de dos etapas, en la que se realizaron 25 ciclos con cebadores no etiquetados seguidos de 10 ciclos utilizando una versión marcada de estos cebadores (De Haard H, et al., Biol. Chem. 274, 1999). Las bibliotecas VHCH1 se construyeron en paralelo utilizando el mismo enfoque. Los tamaños de las bibliotecas individuales estaban entre 107 y 1010 ufc. A continuación, la cadena ligera de las bibliotecas VACA y VKCK se volvió a clonar por separado en el vector que expresaba VHCH1 para crear la biblioteca de Fab "Lambda" y "Kappa" de llama, respectivamente. Alternativamente, los amplicones VHCH1 digeridos se clonaron directamente en las bibliotecas VKCK y VACA evitando la construcción de una biblioteca VHCH1 separada. Puesto que el barajado de cadenas ligeras generalmente ofrece mejores variantes de afinidad que el barajado de cadenas pesadas, optamos por generar bibliotecas de cadenas ligeras preclonadas y clonar directamente los amplicones de cadenas pesadas en estos repertorios primarios.
Las últimas bibliotecas de presentación de fagos estaban entre 5x108 y 2x109 ufc. El control de calidad de las bibliotecas mediante el análisis del porcentaje de clones que contienen Fab completo se realizó rutinariamente utilizando PCR.
Ejemplo 3: Selecciones y escrutinio
5
10
15
20
25
30
35
Se realizaron dos o tres rondas de selecciones de fagos en CD70 recombinante capturado (Flag-TNC-CD70) o en CD70 aplicada directamente como recubrimiento utilizando protocolos convencionales. La elución del fago unido se realizó con tripsina.
A partir del fago seleccionado transfectado a TG1, las colonias individuales se recogieron aleatoriamente para determinar su crecimiento en placas de 96 pocillos. Después de la inducción con IPTG de acuerdo con protocolos convencionales, se prepararon fracciones periplásmicas (peris) que contenían Fab. En todas las selecciones y para las cuatro llamas, se encontraron varios clones que pudieron expresar Fab capaces de inhibir la interacción entre CD27 y CD70 de acuerdo con lo determinado por el ELISA de inhibición (figuras 2 y 3). En este ensayo, Flag-TNC- CD70 es capturada por un mAb anti-Flag y se detecta la unión de CD27-Fc a través de un mAb anti-CD27 biotinilado y estrep-HRP en ausencia o presencia de Fab CD70 (figura 2 y 3) o mAb contra CD70 (figura 4). En la Figura 2B se puede observar que 27B3, que tiene un VH idéntico a 9D1, pero contiene una cadena ligera algo diferente, parece bloquear la unión de CD27 a CD70 de manera más eficaz, lo que estaba en consonancia con la mejor velocidad de disociación de este Fab medida en Biacore (datos no mostrados). La Tabla 3 indica la potencia de bloqueo (expresada como CI50) para los diversos mAb quiméricos de llama-humano sometidos a ensayo en el ELISA de inhibición de CD70. El Fab 27B3 tiene una CI50 de aproximadamente 0,4 nM, que incluso parece mejorar al darle formato de una IgG1 de llama-humana quimérica produciendo una CI50 de 0,25 nM, mientras que el mAb 9D1 con la otra cadena ligera es 3 veces menos potente (0,73 nM). La Figura 3 es un material compuesto de un experimento que somete a ensayo los Fab contra CD70 de llama para determinar la actividad de bloqueo (en el ELISA de inhibición, véanse las barras de color blanco) y para determinar la unión de CD70 (ELISA de unión, barras de color negras). Para el ELISA de unión, Flag-TNC-CD70 se captura mediante un mAb anti-Flag y se detecta la unión de Fab utilizando un mAb anti-myc-HRP, que reconoce la etiqueta MYC fusionada al extremo C del fragmento Fd. Con fines comparativos, se sometieron a ensayo en paralelo anticuerpos monoclonales contra CD70 (SGN70 descritos en el documento US 2010/0129362 A1, clon 1F6; y MDX69A7 descrito en el documento WO2008/074004 figura 5A y 5B). Se identificaron muchos clones de Fab derivados de llama que muestran unión pura en ELISA y no son bloqueantes (véase la figura 3, por ejemplo, clones de Fab 45H8, 45C4, 46A2, 46G7, 46E4, 46F12 y 46G12). Tiene interés el clon 59D10, que como Fab no tiene actividad bloqueadora, pero cuando se convirtió en una IgG quimérica tuvo efectos antagónicos (véase la Tabla 3). Las secuencias de aminoácidos de los dominios VH y VL de los clones Fab derivados de llama de unión y bloqueo se muestran en otro lugar en la presente memoria (Tablas 6 - 9).
Tabla 3: Potencia de bloqueo expresada como CI50 (ng/ml) para anticuerpos individuales SIMPLE (mAb) y SGN70 y MDX69A7 de referencia medidos en el eLiSA de inhibición de CD70 utilizando CD70 humana recombinante.
mAb
CI50 (ng/ml)
SGN70
330
MDX69A7
4038
9D1
109
5F4
296
9E1
1400
9G2
40
5B2
92
9B2
126
4D2
254
24D4
84
24B6
420
27B3
38
19G10
75
57B6
154
59D10
107
Los mAb 27B3 y 57B6 también se sometieron a ensayo para determinar su capacidad para inhibir la interacción entre CD70 recombinante de rhesus (CD70 FLAG-TNC-rhesus) y CD27. El valor de CI50 determinado mediante el ELISA de inhibición descrito anteriormente fue de 150 y 135 ng/ml, respectivamente.
5
10
15
20
25
30
35
Ejemplo 4: Afinidad por CD70 humana y rhesus
Se determinaron las velocidades de disociación de los Fab bloqueadores anti-CD70 derivados de llama purificados utilizando Biacore. La CD70 humana recombinante se inmovilizó en un chip CM5 Biacore. La inmovilización se realizó de acuerdo con un método proporcionado por Biacore y utilizando el kit NHS/EDC (Biacore AB): después de la activación del chip, se preparó una solución de 5o pg/ml de CD70 recombinante en tampón de acetato 10 mM con pH de 5 y se inyectó 1 pl de esta solución (50 ng) dando como resultado una densidad superficial de aproximadamente 1000 UR.
Los Fab para los mAb contra CD70 ARGX-110, MDX2H5 y SGN70 se prepararon mediante digestión con tripsina (SGN70 y MDX69A7 se describen en otra parte en la presente memoria, MDX2H5, también denominado MDX1411, se describe en el documento W02008/074004 figura 1a y 1B). Los Fab, a una concentración de aproximadamente 100-400 pg/ml, se diluyeron 6 veces en solución salina tamponada con Hepes (Hepes 0,1 M, NaCl 1,5 M, EDTA 30 mM, tensioactivo P20 al 0,5% v/v). Se inyectaron (30 pl) y se pasaron a través de las celdas de flujo a un caudal de 30 pl/min. Después de la unión del Fab a CD70, la velocidad de disociación se controló durante un período de 10 minutos. Después de la disociación, las superficies de las celdas de flujo se regeneraron inyectando 5 pl de NaOH 10 mM. Aveces, se necesitaban múltiples inyecciones de NaOH para regenerar las superficies, dependiendo de la afinidad de los Fab. El análisis de la velocidad de disociación se realizó aplicando el soporte lógico BIAevaluation. En primer lugar, el sensograma de las rondas del blanco se sustrajo de los obtenidos con la celda de flujo revestida. A continuación se determinó la velocidad de disociación para un intervalo de tiempo de 10 minutos utilizando la aplicación cinética Fit y se calculó el valor de Kd. Por otra parte, también se determinó la velocidad de disociación CD27 para CD70. Las velocidades de disociación se resumen en la Tabla 4.
Todos los Fab derivados de llama sometidos a ensayo se unen con velocidades de disociación aparentes muy bajas (es decir, alta afinidad) a CD70 recombinante humana y a CD70 recombinante de rhesus basándose en las velocidades de disociación de Biacore en el intervalo de 0,4-4,8 x 10"4 s-1. Las velocidades de disociación de los Fab derivados de llama para CD70 humana son mucho mejores que para los Fab derivados del mAb de referencia (7-30 x 10"4 s"1). Se ha demostrado que los Fab derivados de llama con las mejores velocidades de disociación tienen velocidades de disociación comparables a las de CD27 por su interacción con CD70 (0,8 x 10)."4 s"1). Se debe señalar que el límite inferior para la medición de las velocidades de disociación utilizando Biacore es de aproximadamente 0,4 x 10"4 s"1. Por lo tanto, los Fab derivados de llama con velocidades de disociación que caen cerca de este límite evaluados por Biacore pueden de hecho exhibir incluso una mayor afinidad por CD70.
Tabla 4: Velocidades de disociación de Fab derivados de Ilama y Fab de referencia para CD70 humana o de rhesus
Fab probado
koff (s)-1) x E-4 CD70 humana koff (s)-1) x E-4 CD70 de rhesus
SGN70-Fab
7,0
MDX2H5-Fab
17 Sin unión
MDX69A7-Fab
O co
CD27
0,8
1C2
0,4 3,2
9D1
4,8 2,0
9G2
1,8 1,8
5F4
0,8 5,0
9E1
1,9 2,0
9B2
2,8 6,1
4D2
3,3 2,9
27B3
0,8
24E3
0,8
33D8
4,5
24F2
1,6
24B6
1,0
19G10
0,8
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Fab probado
koff (s)-1) x E-4 CD70 humana koff (s)-1) x E-4 CD70 de rhesus
8B12
3,6
45B12
2,1
45D9
2,1
45F8
2,0
57B6
1,0 0,4
59D10
13,9 Sin unión
Ejemplo 5: Unión de mAb contra CD70 de llama-humano quiméricos a células positivas para CD70
Los VH y VL de clones Fab derivados de llama interesantes se fusionaron a regiones constantes de IgG1 humana y CA humana (todas las regiones de cadena ligera variable son de origen lambda) y se produjeron como anticuerpos monoclonales quiméricos bivalentes en el sistema descrito en la solicitud de patente WO 2009/145606. Los mAb de llama-humano quiméricos se purificaron sobre Proteína A seguido de filtración en gel.
Se incubaron 786-0 células con una serie de diluciones 1/5 de mAb inhibidores de CD70 de llama-humano quiméricos (20 pg/ml - 0,25 ng/ml) y se detectó la unión de los mAb a las células utilizando un anticuerpo anti-Fc humano-FITC (producto conjugado AF006 diluido 1/500 del proveedor Binding Site). Se midió la fluorescencia de 10000 células/estado utilizando un citómetro de flujo y se representó gráficamente la fluorescencia media. Los resultados se muestran en la figura 5. La mayoría de los mAb se unen con alta afinidad a las células 786-0. El anticuerpo SIMPLE 1C2, que como Fab mostró tener la mejor velocidad de disociación y potencia de bloqueo, no fue capaz de reconocer CD70 expresada en la superficie celular (datos no mostrados) y por lo tanto no se estudió adicionalmente. El anticuerpo SIMPLE 27B3 tiene la mejor afinidad por el receptor unido a la célula con una CE50 de 0,24 nM.
En un experimento adicional, se incubaron células MHH-PREB-1 derivadas de NHL (105 células) con un gradiente de concentración de mAb inhibidores de CD70 de llama-humano quiméricos (20 pg/ml-0,25 ng/ml) y se detectó la unión de los mAb a las células utilizando anticuerpo anti-IgG humana-FITC. Los resultados se muestran en la Figura 5B. Los valores de CE50 para 57B6 y 59D10 fueron de 83 y 74 ng/ml, respectivamente.
Ejemplo 6: Inhibición en experimentos de co-cultivo mediante mAb contra CD70 quiméricos de llama- humano
Con el fin de determinar la potencia de bloqueo en un ensayo basado en células, se utilizó el sistema descrito por Wyzgol y colaboradores (J Immunol (2009) 183: 1851 - 1861). La línea celular de fibrosarcoma HT1080 transfectada con CD27 humano secreta IL-8 tras la ligación con CD70 recombinante trimérica y el bloqueo de esta interacción con un mAb neutralizador se puede medir por la reducción de los niveles de citocina. Se aplicó una versión modificada del ensayo en el que la línea celular Raji del linfoma de células B sirvió como fuente de CD70, aunque la molécula se expresa en la superficie celular y, por lo tanto, es más relevante que CD70 soluble.
Las células Raji se cultivaron y se comprobaron para determinar la expresión de CD70 mediante análisis FACS. Después, las células se mezclaron en una placa de cultivo tisular de 96 pocillos (50.000 células/pocillo) con los mAb anti-CD70 y se incubaron a RT durante 1 hora. Se añadieron células HT1080-CD27 (10.000 células/pocillo) y se mezclaron completamente. Los co-cultivos se transfirieron a la incubadora y se cultivaron durante la noche a 37°C. Los sobrenadantes se recogieron y analizaron para determinar su contenido de IL-8 mediante ELISA. Los resultados para los anticuerpos SIMPLE se muestran en la figura 6 y se comparan con los mAb contra CD70 de referencia. Los valores de CI50 para los mAb contra CD70 de llama-humanos quiméricos están entre 3 y 517 ng/ml en comparación con 42 ng/ml para SGN70 y 143 ng/ml para MDX69A7 (véase la tabla 5). Los anticuerpos SIMPLE 27B3 (CI50 de 33 pM) y 9G2 (CI50 de 20 pM) son de 10 a 20 veces más potentes que sGn70 de referencia (CI50 de 370 pM) que de nuevo es 3 veces más potente que MDX69A7 de referencia (1 nM). Por lo tanto, puede concluirse que los mAb de llama-humano quiméricos son extremadamente potentes en el bloqueo de la interacción entre CD27 y CD70 y superan a los anticuerpos de referencia en este bioensayo altamente relevante.
Tabla 5: Potencia de neutralización expresada como valor de CI50 (ng/ml) de mAb quiméricos de Ilama humano y mAb de referencia sometidos a ensayo en ensayo de co-cultivo basado en Raji
mAb
CI50 (ng/ml)
9D1
29
5F4
32
5
10
15
20
25
30
35
40
45
mAb
CI50 (ng/ml)
9B2
213
4D2
54
9E1
517
5B2
19
SGN70
55
MDX69A7
143
27B3
5
19G10
16
9G2
3
57B6
5
59D10
10
Ejemplo 7: Actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo
La citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) se midió utilizando el ensayo normalizado de liberación de Cr51, que fue descrito por McEarchern et al. (Blood (2007) 109: 1185 - 1192). Se purificaron células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) a partir de sangre completa heparinizada mediante separación con Ficoll convencional y se utilizaron como fuente de células NK (es decir, células efectoras). Se utilizó sangre de varios donantes independientes. Las células se suspendieron a 2x106/ml en medio que contenía 200 U/ml de IL-2 humana (para la estimulación de células NK) y se incubaron durante la noche a 37°C. Al día siguiente, las células adherentes y no adherentes se recogieron y lavaron una vez en medio de cultivo. Las células diana fueron células 786-0 (RCC) y se marcaron con Cr51. La proporción de células diana a efectorfue de 1:20 y la incubación se realizó durante 2 horas con el anticuerpo presente a diferentes concentraciones en el medio de cultivo. Los mAb de llama- humano quiméricos, así como los anticuerpos de referencia, se analizaron para determinar la actividad ADCC en células 786-0 a diferentes concentraciones.
El porcentaje de lisis se determinó mediante la ecuación:
% Lisis = (CPM muestra - CPM liberación espontánea)/(CPM liberación máxima- CPM liberación espontánea) x 100.
Los resultados demuestran que todos los mAb de llama-humano quiméricos inducen la lisis de las células diana mediante la actividad ADCC (figura 7). El mAb SIMB 27B3 tiene una potencia de alrededor de 1 pg/ml y por lo tanto es 10 veces más potente que la variante de afinidad 9D1 que tiene una CI50 comparable como SGN70 de referencia, que de nuevo es 2,5 veces más potente en ADCC que MDX69A7 de referencia. El anticuerpo SIMPLE 27B3 combina la mejor potencia de bloqueo del ligando del receptor en su clase con una potencia de ADCc superior y, por lo tanto, tiene un perfil terapéutico favorable.
Ejemplo 8: Potencia de citoxicidad dependiente del complemento de mAb específicos de CD70
Las propiedades de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) de los anticuerpos se determinaron en el ensayo convencional descrito por McEarchern et al. (Blood (2007) 109: 1185 - 1192). En un primer experimento de control, las células U266 (MM) y MHH-PREB1 (NHL) se analizaron para determinar la presencia del antígeno CD70 mediante análisis FACS. En un siguiente experimento, se ensayó un mAb contra cD70 quimérico llama-humano para determinar la actividad CDC en ambas líneas celulares a 3 concentraciones diferentes y en presencia de suero humano al 3, 6 o 9% (como fuente de complemento humano). Se concluyó que las células U266 proporcionan la mejor razón señal/ruido en presencia de suero al 9%.
En un siguiente experimento, las células U266 se mezclaron con mAb de llama-humano quiméricos (figura 8, panel superior) o los mAb de referencia CD70 (figura 8, panel inferior) a 0,001-20 pg/ml en ausencia o presencia de suero humano al 9% y se incubaron durante 2 horas a 37°C. Las células se centrifugaron y se añadió yoduro de propidio para determinar el número de células muertas. La lisis celular se midió mediante FACS. Se demostró la actividad CDC para todos los mAb de llama-humano quiméricos en células U266 en presencia de suero humano al 9%. El anticuerpo SIMPLE 27B3 tiene una CI50 similar a la de SGN70 de referencia, mientras que MDX69A7 es 10 veces menos potente.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Ejemplo 9: Potencia de la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos
Para analizar las propiedades de Fagocitosis Celular Dependiente de Anticuerpos (ADCP) de los mAb SIMPLE, se implementó el ensayo descrito por McEarchern et al. (Blood (2007) 109: 1185 - 1192). En este ensayo, se purificaron células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) a partir de sangre completa heparinizada mediante separación con Ficoll convencional. Se utilizó sangre de diferentes donantes. Las células se incubaron en RPMI que contenía FCS al 10% en un matraz de cultivo tisular durante la noche a 37°C. Las células no adherentes se eliminaron y las células adherentes se cultivaron durante 15 días en 75 ml de medio X-VIVO 15 que contenía 500 U/ml de rhGM-CSF (7,5 pg/75 ml). Después de 15 días, se recogieron las células adherentes (macrófagos derivados de monocitos (MDM).
Se incubaron 8,0 x 104 células diana (células 786-0) cargadas con el colorante rojo PKH26 con mAb durante 30 minutos en hielo en una placa de 96 pocillos con fondo en V. A continuación, se añadieron 2,0 x104 células MDM (razón de diana a efector (786-0 a MDM) de 4:1) y después de 1 hora de incubación a 37°C, las células se centrifugaron, se resuspendieron en 100 pl de BSA con PBS al 1% y se transfirieron a una placa de 96 pocillos de fondo en V. Se añadió anticuerpo monoclonal anti-CD11b (conjugado con FITC) para la tinción de los macrófagos durante 30 minutos mientras se mantenían las placas en hielo, a continuación las células se lavaron dos veces con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 1% (en PBS). Las muestras se analizaron mediante FACS, donde se calificó la fagocitosis en células teñidas doblemente. Los resultados se muestran en la Figura 9 y estos demuestran que todos los mAb de llama-humano quiméricos sometidos a ensayo son potentes para inducir ADCP. El anticuerpo SIMPLE 27B3 induce la fagocitosis de macrófagos de hasta el 50% de las células tumorales marcadas a concentraciones de 1 pg/ml con una CI50 de aproximadamente 100 ng/ml (0,4 nM).
Ejemplo 10: internalización de los mAb anti-CD70 en la línea celular tumoral 786-O
Se ha demostrado que la unión de anticuerpos contra CD70 a la línea celular derivada de carcinoma renal 786-0 da como resultado la internalización rápida (en 1 hora) del complejo de anticuerpo-receptor (Adam et al., Br J Cancer (2006) 95:298 - 306). Con el fin de someter a ensayo la internalización de anticuerpos SIMPLE y mAb de referencia dirigidos contra CD70, se cultivaron células 786-O en una placa de microtitulación de 96 pocillos y se incubaron durante la noche a 37°C. Se añadieron 2,5 pg/ml de mAb y se incubaron con las células durante 0-24 horas a 37°C. Las placas se lavaron 3 veces 5' con tampón para retirar anticuerpos unidos a membranas "stripping buffer" (NaCl 150 mM, glicina 100 mM, pH = 2,5; codificado "IN" representando la cantidad de mAb internalizado a través de CD70) o PBS (codificado "OUT" representando la cantidad de mAb unido al receptor en el exterior de la célula). Posteriormente, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 30' a temperatura ambiente, se lavaron con PBS, y se incubaron 5' con Triton-X-100 ("IN") o PBS ("OUT") al 0,2%. A continuación, las células se lavaron dos veces y se incubaron a RT durante 10 minutos con glicina 100 mM seguido de una incubación de 30 minutos con PBS + BSA al 1%. Finalmente, las células se tiñeron con anti-Fc humano de cabra (Jackson immunoresearch 109005-098) e anti-IRDYE800 de cabra (Li-cor 926-32214) antes del análisis en el escáner de infrarrojos Li-Cor Odyssey. El anticuerpo que queda en el exterior de la célula, es decir, no internalizado, se califica como IMF media en la figura 10. Los resultados demuestran que varios mAb permanecen más tiempo en la superficie de las células que los otros mAbs (señal más alta). Sin embargo, ninguno de los mAb se internaliza por completo: inicialmente (entre 0 y 2 horas), la internalización del mAb es muy rápida, pero parece que se alcanza un estado estable donde 30-40% del mAb permanece en el exterior de la célula, incluso después de 24 horas de incubación a 37°C. El anticuerpo SIMPLE 27B3 se internaliza tan rápidamente como los anticuerpos de referencia SGN70 y MDX69A7. Es interesante observar que los anticuerpos SIME 9E1 y 19G10, pero también otros, permanecen a niveles elevados en el exterior de las células, incluso después de 24 horas de incubación (panel inferior de la figura 10). Para inducir eficazmente los efectos de ADCC, CDC y ADCP, es importante que permanezcan altos niveles de anticuerpos específicos de CD70 en el exterior de las células cancerosas elegidas como diana para reclutar las células inmunitarias efectoras responsables de la destrucción celular. Por otro lado, los anticuerpos de internalización rápida tienen potencial como productos Conjugados de Fármacos con Anticuerpos (ADC).
Ejemplo 11: Eficacia in vivo de los mAb de Ilama-humano quiméricos en un modelo de xenoinjerto tumoral
Para establecer la enfermedad diseminada, se inyectaron 106 células Raji en 0,2 ml de PBS en la vena lateral de la cola de ratones con inmunodeficiencia combinada severa C.B.-17 (SCID) (Harlan, Indianápolis, IN). Después de la inyección, todos los ratones se combinaron y a continuación se colocaron aleatoriamente en los diversos grupos de tratamiento, con 9 ratones por grupo. Los anticuerpos se administraron en 0,5 ml el día 1, 4, 8, 11, 15 después de la implantación celular por medio de inyección intraperitoneal. Los ratones se controlaron al menos dos veces por semana y se sacrificaron cuando exhibieron signos de enfermedad, incluida la pérdida de peso de 15% a 20%, postura encorvada, letargo, hinchazón craneal o deshidratación. Los ratones recibieron tratamiento con mAb 41D12 en una respuesta a la dosis. Además, se probó una versión Fc-dead de 41D12 a 10 mg/kg. Esta versión Fc-dead ha sido descrita anteriormente en la bibliografía y no tiene actividad ADCC ni CDC y tiene una actividad ADCP mucho más baja (McEarchern et al., Clin Cancer Res (2008) 14(23):7763-72) Los resultados se muestran como curvas de supervivencia en la figura 11. Estos datos muestran que el tiempo medio de supervivencia para los ratones de control es de 27 días. La mediana del tiempo de supervivencia se prolongó hasta al menos 67 días cuando se
administraron dosis iguales o superiores a 0.1 mg/kg de 41D12. La dosis de 0,01 mg/kg es aún eficaz. La versión Fc-dead de 41D12 no tiene potencia in vivo, ilustrando la importancia de ADCC, CDC y ADCP en este modelo.
Ejemplo 12: expresión de mAbs no fucosilados
5
Se ha demostrado que los anticuerpos con cantidades reducidas de residuos de fucosilo aumentan ADCC 10-1000 veces (Iida et al., Clin Cancer Res. (2006) 12(9):2879 - 2887) La línea celular CHO Ms704-PF y MS705, que carecen del gen de fucosiltransferasa (FUT8, BioWa, Inc.) se sometió a electroporación con un vector de expresión eucariótico que codifica la cadena pesada y ligera de los mAb contra CD70 de llama-humano quiméricos. Los clones 10 resistentes a los fármacos se seleccionaron mediante crecimiento en medio CHO Excell 325-PF. Los clones se escrutaron para determinar la producción de IgG mediante un ELISA de unión a CD70 convencional.
Tabla 6: Secuencia de VH derivado de Ilama específico de CDH
Fab
Marco 1 SEQ ID CDR1 SEQ ID
1C2
ELQVVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLS 1 NYWMH 10
9D1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS 2 VYYMN 11
8B12
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS 2 VYYMN 11
8C12
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS 2 VYYMN 11
9E1
EVQLQESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFD 3 DYAMS 12
5F4
EVQVQESGGGLVHPGGSLKLSCAASGFTFD 4 TYAMS 13
5B2
QVQLVESGGDLVQPGGSLRLSCAASGFTVS 5 NPAMS 14
6D5
EVQLVQPGAELRKPGASVKVSCKASGYTFT 6 SYYID 15
4D2
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLACTVSGGSIT 7 TSYYYWS 16
9A1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS 2 SYAMS 17
9G2
QVQLVESGGGLMQPGGSLRLSCAASGFTFS 8 SSAMS 18
9B2
QLQVVESGGGLMQPGGSLRLSCAASGFTFS 9 GSAMS 19
27B3
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS 2 VYYMN 11
24E3
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS 2 VYYMN 11
33D8
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS 2 VYYMN 11
24F2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS 2 VYYMN 11
24B6
EVQLQESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFD 3 DYAMS 12
19G10
EVQLQESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFD 3 DYAMS 12
45B12
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS 2 AYYMN 20
45D9
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS 2 AYYMN 20
45F8
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS 2 AYYMN 20
45A12
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS 2 AYYMN 20
45B6
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS 2 AYYMN 20
57B6
QLQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFS 254 HYAMS 256
59D10
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASELSFS 255 ISEMT 257
Fab
Marco 2 SEQ ID CDR2 SEQ ID
1C2
WVRQAPRKGLEWVS 21 TISTDNSRTYYADSVKG 26
9D1
WVRQAPGKGLEWVS 22 DINNEGGTTYYADSVKG 27
8B12
WVRQAPGKGLEWVS 22 DINNEGDTTYYADSVKG 28
8C12
WVRQAPGKGLEWVS 22 DINNEGDTTYYADSVKG 28
9E1
WVRQAPGKGLEWVS 22 SIYMYDSSTYYADSVKG 29
5F4
WVRQAPGKGLEWVS 22 AISWSGGETFYAESMKG 30
5B2
WVRQAPGKGLEWVS 22 EITNYGYNRYYADSVKG 31
6D5
WVRQAPGQGLEWMG 23 RIDPEDGGTKYAQKFQG 32
4D2
WIRQPPGKGLEWMG 24 AIGSRGSTYYSPSLKT 33
9A1
WVRQAPGKGLEWVS 22 DINSGGGSTKYNDSVKG 34
9G2
WVRQAPGKGLEWVS 22 SIYSDSSYTYYADSVKS 35
9B2
WVRQAPGKGLEWVS 22 SIYSHSMYTYYADSVKS 36
27B3
WVRQAPGKGLEWVS 22 DINNEGGTTYYADSVKG 27
24E3
WVRQAPGKGLEWVS 22 DINNEGGTTYYADSVKG 27
33D8
WVRQAPGKGLEWVS 22 DINNEGGTTYYADSVKG 27
24F2
WVRQAPGKGLEWVS 22 DINNEGGTTYYADSVKG 27
24B6
WVRQAPGKGLEWVS 22 SIYMYDSSTYYADSVKG 29
19G10
WVRQAPGKGLEWVS 22 SIYMYDSSTYYADSVKG 29
45B12
WVRQAPGKGLEWIS 25 DINNEGYETYYADSVKG 37
45D9
WVRQAPGKGLEWIS 25 DINNEGYETYYADSVKG 37
45F8
WVRQAPGKGLEWIS 25 DINNEGYETYYADSVKG 37
45A12
WVRQAPGKGLEWIS 25 DINNEGYETYYADSVKG 37
45B6
WVRQAPGKGLEWIS 25 DINNEGYETYYADSVKG 37
57B6
WVRQAPGKGLEWVS 22 GDNTYDGGTRYQDSVKG 258
59D10
WVRQAPGKGLEWVS 22 GISGVTGGSSTSYADSVKG 259
Fab
Marco 3 SEQ ID CDR3 SEQ ID
1C2
RFTISRDHAKNTLILÜMNS LKSEDTAVYYCIR 38 GSDYEH 49
9D1
RFTISRDNAKNTLTLQMN SLKPEDTALYYCVR 39 DAGYSNHVPIFDS 50
8B12
RFTISRDNAKNTLTLQMD SLKPEDTALYYCVR 40 DAGYSNHVPIFDS 50
8C12
RFTISRDNAKNTLTLQMD SLKPEDTALYYCVR 40 DAGYSNHVPIFDS 50
9E1
RFTISTDNAKNTVYLQMN SLKSEDTAVYYCAK 41 DINRSYGSSWSHFGPIFSS 51
5F4
RFTISRNNAKNTLYLQMN SLKSEDTAVYYCAR 42 GMGLAEGLTD 52
5B2
RFTISTDNAKNTLYLQMNS LRSEDSAVYYCTA 43 SLGLEYGYGD 53
6D5
RVTFTADASTSTAYVELSS LRSEDTAVYYCAS 44 RRRDFDY 54
4D2
RTSISRDTSKNQFTLQLSS VTPEDTAVYYCAR 45 VTGEITYNSGSYYYTLNLFD Y 55
9A1
RFAISRDNAKNTLYLQMN SLKPEDTAVYYCAK 46 EGGSGRYWTNEYDY 56
9G2
RFTISTDNAKNTLYLQMNS LKPDDTAVYYCAG 47 SSDYEGSFAS 57
9B2
RFTISTDNAKNTLYLQMNS LKPDDTAVYYCAA 342 SSDYEGLFVS 58
27B3
RFTISRDNAKNTLTLQMN SLKPEDTALYYCVR 39 DAGYSNHVPIFDS 50
24E3
RFTISRDNAKNTLTLQMN SLKPEDTALYYCVR 39 DAGYSNHVPIFDS 50
33D8
RFTISRDNAKNTLTLQMN SLKPEDTALYYCVR 39 DAGYSNHVPIFDS 50
24F2
RFTISRDNAKNTLTLQMN SLKPEDTALYYCVR 39 DAGYSNHVPIFDS 50
24B6
RFTISTDNAKNTVYLQMN SLKSEDTAVYYCAK 41 DINRSYGSSWSHFGPIFSS 51
19G10
RFTISTDNAKNTVYLQMN SLKSEDTAVYYCAK 41 DINRSYGSSWSHFGPIFSS 51
45B12
RFTISRDNAKNTLTLQMD SLKPEDTARYYCVR 48 DAGYSNHVQIFDS 59
45D9
RFTISRDNAKNTLTLQMD SLKPEDTARYYCVR 48 DAGYSNHVQIFDS 59
45F8
RFTISRDNAKNTLTLQMD SLKPEDTARYYCVR 48 DAGYSNHVQIFDS 59
45A12
RFTISRDNAKNTLTLQMD SLKPEDTARYYCVR 48 DAGYSNHVQIFDS 59
45B6
RFTISRDNAKNTLTLQMD SLKPEDTARYYCVR 48 DAGYSNHVQIFDS 59
57B6
RFTISRDNGKNTLYLQMN SLKPEDTAVYYCAK 260 DTGRGIMGEYGMDY 262
59D10
RFTISRDNDKNTLYLQMN SLIPEDTAVYYCAT 261 TSGTYYFIPEYEY 263
Fab
MARCO 4 SEQ ID
1C2
WGQGTQVTVSS 60
9D1
WGQGTQVIVAS 61
8B12
WGQGTQVIVAS 61
8C12
WGQGTQVIVAS 61
9E1
WGQGTQVTVSS 60
5F4
WGQGTQVTVSS 60
5B2
WGQGTQVTVSS 60
6D5
WGQGTQVTVSS 60
4D2
WGQGTQVTVSS 60
9A1
WGQGTQVTVSS 60
9G2
WGQGTQVTVSS 60
9B2
WGQGTQVTVSS 60
27B3
WGQGTQVIVAS 61
24E3
WGQGTQVIVAS 61
33D8
WGQGTQVIVAS 61
24F2
WGQGTQVIVAS 61
24B6
WGQGTQVTVSS 60
19G10
WGQGTQVTVSS 60
45B12
WGQGTQVIVAS 61
45D9
WGQGTQVIVAS 61
45F8
WGQGTQVIVAS 61
45A12
WGQGTQVIVAS 61
45B6
WGQGTQVIVAS 61
57B6
WGKGTLVTVSS 264
59D10
WGQGTQVTVSS 60
Tabla 7: Secuencia de VL derivado de llama específico de CD70 (Q en negrita codificado por el codón de PARADA ámbar)
Fab
Marco 1 SEQ ID CDR1 SEQ ID
1C2
QTVVTQEPSLSVSPGGTVTLTC 62 GLSSGSVTTTNYPG 77
9D1
QAVVTQEPSLSVSPGGTVTLTC 63 GLSSGSVTSSHYPG 78
8B12
QTVVTQEPSLSVSPGGTVTLTC 62 GLSSGSVTSSNYPG 79
8C12
QAVVTQEPSLSVSPGGTVTLTC 63 GLTSGSVTSSNYPD 80
9E1
QAVVTQEPSLSVSPGGTVTLTC 63 GLTSGSVTSSNYPD 80
5F4
QAVVTHPPSLSASPGSSVRLTC 64 TLISGDNIGGYDIS 81
5B2
QSALTQPPSVSGTLGKTLTISC 65 AGTSSDVGYGNYVS 82
6D5
QSALTQPSAVSVSLGQTARITC 66 QGGNARFSSFA 83
4D2
QSVLTQPPSLSASPGSSVRLTC 67 TLSSGNSVGNYDIS 84
9A1
QSALTQPSALSVTLGQTAKITC 68 QGGRLGSSYAH 85
9G2
QSVVTQPPSLSASPGSSVRLTC 69 TLSSGNSVGNYDIS 84
9B2
QAVLTQPPSLSASPGSSVRLTC 70 TLNSANSVGSYDIS 86
27B3
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTC 71 GLKSGSVTSTNFPT 87
24E3
QAVVTQEPSLSVSPGGTVTLTC 63 GLTSGSVTSDNFPV 88
33D8
QSALTQPSTVSVSLGQTARITC 72 RGDSLERYGTN 89
24F2
QSALTQPSAVSVSLGQTARITC 66 RGDTLRNYHAN 90
24B6
QPVLTQPSAVSVSLGQTARITC 73 QGGYYTH 91
19G10
NFMLTQPSAVSVSLGQTARITC 74 QGGYYTH 91
45B12
QAVLTQPSSVSVSLGQTAKITC 75 QGGNLGLYGAN 92
45D9
QAVLTQPSSVSVSLGQTAKITC 75 QGGNLWLYGAN 93
45F8
QAVLTQPSSVSVSLGQTANITC 76 QGGNLGLYGAN 92
45A12
QAVVTQEPSLSVSPGGTVTLTC 63 GLSSGSATSGNYPE 94
45B6
QAVVTQEPSLSVSPGGTVTLTC 63 GLSSGSVTSSNYPD 95
57B6
QTVVTQEPSLSVSPGGTVTLTC 265 GLKSGSVTSSNYPA 267
59D10
QSVLTQPPSVSGSPGKTVTISC 266 AGTSSDVGYGYYVS 268
Fab
Marco 2 SEQ ID CDR2 SEQ ID
1C2
WFQQTPGQAPRTLIY 96 STSSRHS 109
9D1
WYQQTPGQAPRLLIF 97 NTNSRHS 110
8B12
WYQQTPGQAPRVLIY 98 NTNNRHS 111
8C12
WYQQTPGQAPRLLIY 99 NTNSRHS 110
9E1
WYQQTPGQAPRLLIY 99 NTNSRHS 110
5F4
WYQQKTGSPPRYLLY 100 YYSDSYKHQSS 112
5B2
WYQQLPGTAPKLLIY 101 RVSTRAS 113
6D5
WYQQKPGQAPVQVIY 102 YNTNRPS 114
4D2
WYQQKAGSPPRYLLY 103 YYSDSYKNQGS 115
9A1
WYQQKPGQAPVLVIY 104 GNNYRPS 116
9G2
WYQQKAGSPPRYLLY 103 YYSDSVKHQGS 117
9B2
WYQQKAGSPPRYLLY 103 YYSDSLSHQGS 118
27B3
WYQQTPGQAPRLLIY 99 NTNTRHS 119
24E3
WYQQTPGQAPRLLIY 99 TINSRHS 120
33D8
WYQQKPGQAPVLVIY 104 DDDSRPS 121
24F2
WYRQKPGQAPVLVIY 105 GDDIRPS 122
24B6
WYQQKPGQAPVLVIY 104 INNNRPS 123
19G10
WYQQKPGQAPVLVIY 104 VNNNRPS 124
45B12
WYQQNPGRAPILLIY 106 GDNYRPL 125
45D9
WYQQNPGRAPILLIY 106 GDNQRPL 126
45F8
WYQQNPGRAPILLFY 107 GDNYMPL 127
45A12
WYQQTPGQAPRLIIY 108 NTASRHS 128
45B6
WYQQTPGQAPRLLIY 99 NTNSRHS 110
57B6
WYQQTPGQAPRLLIY 99 NTNSRHS 110
59D10
WYQQFPGMAPKLLIY 269 DVNKRAS 270
Fab
Marco 3 SEQ ID CDR3 SEQ ID
1C2
GVPSRFSGSISGNKAALTITGAQP EDEADYYC 129 ALEEIGSYTYM 148
9D1
129 ALLNIDDGSTM 149
Fab
Marco 3 SEQ ID CDR3 SEQ ID
GVPSRFSGSISGNKAALTITGAQP EDEADYYC
8B12
GVPSRYSGSISGNKAALTITGAEP EDEADYYC 130 NLHLGSYTPM 150
8C12
GVPSRFSGSISGNKAALTITGAQP EDEADYYC 131 ALYWGYGTNVDV 151
9E1
GVPSRFSGSISGNKAALTITGAQP EDEADYYC 129 NLYMGSGGSKV 152
5F4
GVPSRFSGSKDASANAGLLLISGL QSEDEADYYC 132 SAYKSGSYKAPV 153
5B2
GMPDRFSGSKSGNTASLTISGLQ SEDEADYYC 133 ASYTTNNKPV 154
6D5
GIPARFSGSSSGGAATLTISGAQA EDEADYYC 134 QSYESGNYV 155
4D2
GVPSRFSGSKDPSANAGLLLISGL QAEDEADYYC 135 SVSNSGTYKPV 156
9A1
GIPERFSGSSSGDTATLTISGAQA EDEAVYYC 136 QSGSSNTNVM 157
9G2
GVPSRFSGSSDASANAGLLLISGL QPEDEADYYC 137 SAYKSGSHV 158
9B2
138 SAYNRGSHV 159
Fab
Marco 3 SEQ ID CDR3 SEQ ID
GVPSRFSGSTDASANAGLLLISGL QPEDEADYYC
27B3
GVPSRFSGSISENKAALTITGAQP EDEAEYFC 139 ALFISNPSVE 160
24E3
GVPSRFSGSITGNKAILTITGAQPE DEADYYC 140 ALYLENFANE 161
33D8
GIPERFSGSSSGATAALTISGAQA EDEGDYYC 141 QSADSSGNAV 162
24F2
GIPERFSGSRLGGTATLTVSGAQA EDEADYYC 142 QSSDSSGYRVV 163
24B6
GIPERFSGSISGNTATLTISGAQVE DEADYYC 143 QSGSSSTIPV 164
19G10
GIPERFSGSSSGNTATLTISGAQA EDEAAYYC 144 QSGSSSTIPV 164
45B12
GIPERFTISKSGGTATLTIDGAQAE DESDYYC 145 QSADYSGNSV 165
45D9
GIPERFTISKSGGTATLTIDGAQAE DESDYYC 145 QSADYSGNSV 165
45F8
GIPERFTISKSGGTATLTIDGAQAE NESDYYC 146 QSSDYPGNSV 166
45A12
GVPGRFSGSISGNKAALTITGAQP 147 LLYMGGSDFNFV 167
Fab
Marco 3 SEQ ID CDR3 SEQ ID
EDEADYYC
45B6
GVPSRFSGSISGNKAALTITGAQP EDEADYYC 129 ALYMGSGSNNVV 168
57B6
GVPSRFSGSISGNKAALTITGAQP EDEADYYC 129 ALYMGSGSANAM 271
59D10
GIADRFSGSKAGNTASLTISGLQS EDEADYYC 272 ASYRSSANAV 273
Fab
Marco 4 SEQ ID
1C2
FGGGTHLTVLG 169
9D1
FGGGTHLTVLG 169
8B12
FGGGTKLTVLG 170
8C12
FGGGTKLTVLG 170
9E1
FGGGTKLTVLG 170
5F4
FGGGTHLTVLG 169
5B2
FGGGTHLTVLG 169
6D5
FGGGTTLTVLG 171
4D2
FGGGSKLTVLG 172
9A1
FGGGTHLTVLS 173
9G2
FGGGTKLTVLG 170
9B2
FGGGTKLTVLG 170
27B3
FGGGTQLTVLS 174
24E3
FGGGTRLTVLG 175
33D8
FGGGTHLTVLG 169
24F2
FGGGTKLTVLG 170
24B6
FGGGTKLTVLG 170
19G10
FGGGTKLTVLG 170
45B12
FGGGTKLTVLG 170
Fab
Marco 3 SEQ ID CDR3 SEQ ID
45D9
FGGGTKLTVLG 170
45F8
FGGGTKLTVLG 170
45A12
FGGGTKLTVLG 170
45B6
FGGGTELTVLG 176
57B6
FGGGTHLTVLG 169
59D10
FGGGTHLTVLG 169
Tabla 8: VH derivado de llama completo
Fab
Secuencia completa del dominio VH SEQ ID
1C2
ELQVVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSNYWMHWVRQAPRKG LEWVSTISTDNSRTYYADSVKGRFTISRDHAKNTLILQMNSLKSEDT AVYYCIRGSDYEHWGQGTQVTVSS 177
9D1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMNWVRQAPGKG LEWVSDINNEGGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLTLQMNSLKPED TALYYCVRDAGYSNHVPIFDSWGQGTQVIVAS 178
8B12
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMNWVRQAPGKG LEWVSDINNEGDTTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLTLQMDSLKPED TALYYCVRDAGYSNHVPIFDSWGQGTQVIVAS 179
8C12
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMNWVRQAPGKG LEWVSDINNEGDTTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLTLQMDSLKPED TALYYCVRDAGYSNHVPIFDSWGQGTQVIVAS 179
9E1
EVQLQESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMSWVRQAPGKG LEWVSSIYMYDSSTYYADSVKGRFTISTDNAKNTVYLQMNSLKSED TAVYYCAKD1N RSYGSSWSH FG Pl FSSWGQGTQVTVSS 180
5F4
EVQVQESGGGLVHPGGSLKLSCAASGFTFDTYAMSWVRQAPGKG LEWVSAISWSGGETFYAESMKGRFTISRNNAKNTLYLQMNSLKSED TAVYYCARGMGLAEGLTDWGQGTQVTVSS 181
5B2
QVQLVESGG DLVQPGGSLRLSCAASG FTVSN PAMSW VRQAPG KG LEWVSEITNYGYNRYYADSVKGRFTISTDNAKNTLYLQMNSLRSED SAVYYCTASLGLEYGYGDWGQGTQVTVSS 182
6D5
EVQLVQPGAELRKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIDWVRQAPGQGL EWMGRIDPEDGGTKYAQKFQGRVTFTADASTSTAYVELSSLRSED TAVYYCASRRRDFDYWGQGTQVTVSS 183
4D2
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLACTVSGGSITTSYYYWSWIRQPPGK GLEWMGAIGSRGSTYYSPSLKTRTSISRDTSKNQFTLQLSSVTPED TAVYYCARVTGEITYNSGSYYYTLNLFDYWGQGTQVTVSS 184
Fab
Secuencia completa del dominio VH SEQ ID
9A1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKG LEWVSDINSGGGSTKYNDSVKGRFAISRDNAKNTLYLQMNSLKPED TAVYYCAKEGGSGRYWTNEYDYWGQGTQVTVSS 185
9G2
QVQLVESGGGLMQPGGSLRLSCAASGFTFSSSAMSWVRQAPGKG LEWVSSIYSDSSYTYYADSVKSRFTISTDNAKNTLYLQMNSLKPDDT AV YYC AG SSDYEGSFASWG QGTQVTVSS 186
9B2
QLQVVESGGGLMQPGGSLRLSCAASGFTFSGSAMSWVRQAPGK GLEWVSSIYSHSMYTYYADSVKSRFTISTDNAKNTLYLQMNSLKPD DTAVYYCAASSDYEGLFVSWGQGTQVTVSS 187
27B3
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMNWVRQAPGKG LEWVSDINNEGGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLTLQMNSLKPED TALYYCVRDAGYSNHVPIFDSWGQGTQVIVAS 178
24E3
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMNWVRQAPGKG LEWVSDINNEGGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLTLQMNSLKPED TALYYCVRDAGYSNHVPIFDSWGQGTQVIVAS 178
33D8
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMNWVRQAPGKG LEWVSDINNEGGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLTLQMNSLKPED TALYYCVRDAGYSNHVPIFDSWGQGTQVIVAS 178
24F2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMNWVRQAPGKG LEWVSDINNEGGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLTLQMNSLKPED TALYYCVRDAGYSNHVPIFDSWGQGTQVIVAS 178
24B6
EVQLQESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMSWVRQAPGKG LEWVSSIYMYDSSTYYADSVKGRFTISTDNAKNTVYLQMNSLKSED TAVYYCAKD1N RSYGSSWSH FG Pl FSSWGQGTQVTVSS 180
19G10
EVQLQESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMSWVRQAPGKG LEWVSSIYMYDSSTYYADSVKGRFTISTDNAKNTVYLQMNSLKSED TAVYYCAKD 1N RSYGSSWSH FG Pl FSSWGQGTQVTVSS 180
45B12
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYYMNWVRQAPGKG LEWISDINNEGYETYYADSVKGRFTISRDNAKNTLTLQMDSLKPEDT ARYYCVRDAGYSNHVQIFDSWGQGTQVIVAS 188
45D9
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYYMNWVRQAPGKG LEWISDINNEGYETYYADSVKGRFTISRDNAKNTLTLQMDSLKPEDT ARYYCVRDAGYSNHVQIFDSWGQGTQVIVAS 188
45F8
188
Fab
Secuencia completa del dominio VH SEQ ID
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYYMNWVRQAPGKG LEWISDINNEGYETYYADSVKGRFTISRDNAKNTLTLQMDSLKPEDT ARYYCVRDAGYSNHVQIFDSWGQGTQVIVAS
45A12
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYYMNWVRQAPGKG LEWISDINNEGYETYYADSVKGRFTISRDNAKNTLTLQMDSLKPEDT 188
ARYYCVRDAGYSNHVQIFDSWGQGTQVIVAS
45B6
188
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYYMNWVRQAPGKG LEWISDINNEGYETYYADSVKGRFTISRDNAKNTLTLQMDSLKPEDT ARYYCVRDAGYSNHVQIFDSWGQGTQVIVAS
57B6
274
QLQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSHYAMSWVRQAPGKG LEWVSGDNTYDGGTRYQDSVKGRFTISRDNGKNTLYLQMNSLKPE DTAVYYC AKDTG RG1MG E YG M D YWG KGTLVTVSS
59D10
275
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASELSFSISEMTWVRQAPGKGL EWVSGISGVTGGSSTSYADSVKGRFTISRDNDKNTLYLQMNSLIPE DTAVYYCATTSGTYYFIPEYEYWGQGTQVTVSS
Tabla 9: VL derivado de llama completo (Q en negrita codificada por el codón de PARADA ámbar)
Fab
Secuencia completa SEQ ID
1C2
QTVVTQEPSLSVSPGGTVTLTCGLSSGSVTTTNYPGWFQQTPGQA PRTLIYSTSSRHSGVPSRFSGSISGNKAALTITGAQPEDEADYYCAL EEIGSYTYMFGGGTHLTVLG 189
9D1
QAVVTQEPSLSVSPGGTVTLTCGLSSGSVTSSHYPGWYQQTPGQ APRLLIFNTNSRHSGVPSRFSGSISGNKAALTITGAQPEDEADYYCA LLNIDDGSTMFGGGTHLTVLG 190
8B12
QTVVTQEPSLSVSPGGTVTLTCGLSSGSVTSSNYPGWYQQTPGQA PRVLIYNTNNRHSGVPSRYSGSISGNKAALTITGAEPEDEADYYCNL HLGSYTPMFGGGTKLTVLG 191
8C12
QAVVTQEPSLSVSPGGTVTLTCGLTSGSVTSSNYPDWYQQTPGQA PRLLIYNTNSRHSGVPSRFSGSISGNKAALTITGAQPEDEADYYCAL YWGYGTNVDVFGGGTKLTVLG 192
9E1
QAVVTQEPSLSVSPGGTVTLTCGLTSGSVTSSNYPDWYQQTPGQA PRLLIYNTNSRHSGVPSRFSGSISGNKAALTITGAQPEDEADYYCNL YMGSGGSKVFGGGTKLTVLG 193
5F4
QAVVTHPPSLSASPGSSVRLTCTLISGDNIGGYDISWYQQKTGSPP RYLLYYYSDSYKHQSSGVPSRFSGSKDASANAGLLLISGLQSEDEA DYYCSAYKSGSYKAPVFGGGTHLTVLG 194
Fab
Secuencia completa SEQ ID
5B2
QSALTQPPSVSGTLGKTLTISCAGTSSDVGYGNYVSWYQQLPGTA PKLLIYRVSTRASGMPDRFSGSKSGNTASLTISGLQSEDEADYYCA SYTTNNKPVFGGGTHLTVLG 195
6D5
QSALTQPSAVSVSLGQTARITCQGGNARFSSFAWYQQKPGQAPV QVIYYNTNRPSGIPARFSGSSSGGAATLTISGAQAEDEADYYCQSY ESGNYVFGGGTTLTVLG 196
4D2
QSVLTQPPSLSASPGSSVRLTCTLSSGNSVGNYDISWYQQKAGSP PRYLLYYYSDSYKNQGSGVPSRFSGSKDPSANAGLLLISGLQAEDE ADYYCSVSNSGTYKPVFGGGSKLTVLG 197
9A1
QSALTQPSALSVTLGQTAKITCQGGRLGSSYAHWYQQKPGQAPVL VIYGNNYRPSGIPERFSGSSSGDTATLTISGAQAEDEAVYYCQSGS SNTNVMFGGGTHLTVLS 198
9G2
QSVVTQPPSLSASPGSSVRLTCTLSSGNSVGNYDISWYQQKAGSP PRYLLYYYSDSVKHQGSGVPSRFSGSSDASANAGLLLISGLQPEDE ADYYCSAYKSGSHVFGGGTKLTVLG 199
9B2
QAVLTQPPSLSASPGSSVRLTCTLNSANSVGSYDISWYQQKAGSP PRYLLYYYSDSLSHQGSGVPSRFSGSTDASANAGLLLISGLQPEDE ADYYCSAYNRGSHVFGGGTKLTVLG 200
27B3
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGLKSGSVTSTNFPTWYQQTPGQA PRLLIYNTNTRHSGVPSRFSGSISENKAALTITGAQPEDEAEYFCAL FISNPSVEFGGGTQLTVLS 201
24E3
QAVVTQEPSLSVSPGGTVTLTCGLTSGSVTSDNFPVWYQQTPGQA PRLLIYTINSRHSGVPSRFSGSITGNKAILTITGAQPEDEADYYCALY LENFANEFGGGTRLTVLG 202
33D8
QSALTQPSTVSVSLGQTARITCRGDSLERYGTNWYQQKPGQAPVL VIYDDDSRPSGIPERFSGSSSGATAALTISGAQAEDEGDYYCQSAD SSGNAVFGGGTHLTVLG 203
24F2
QSALTQPSAVSVSLGQTARITCRGDTLRNYHANWYRQKPGQAPVL VIYGDDIRPSGIPERFSGSRLGGTATLTVSGAQAEDEADYYCQSSD SSGYRVVFGGGTKLTVLG 204
24B6
QPVLTQPSAVSVSLGQTARITCQGGYYTHWYQQKPGQAPVLVIYIN NNRPSGIPERFSGSISGNTATLTISGAQVEDEADYYCQSGSSSTIPV FGGGTKLTVLG 205
19G10
206
Fab
Secuencia completa SEQ ID
NFMLTQPSAVSVSLGQTARITCQGGYYTHWYQQKPGQAPVLVIYV NNNRPSGIPERFSGSSSGNTATLTISGAQAEDEAAYYCQSGSSSTI PVFGGGTKLTVLG
45B12
QAVLTQPSSVSVSLGQTAKITCQGGNLGLYGANWYQQNPGRAPIL LIYGDNYRPLGIPERFTISKSGGTATLTIDGAQAEDESDYYCQSADY SGNSVFGGGTKLTVLG 207
45D9
QAVLTQPSSVSVSLGQTAKITCQGGNLWLYGANWYQQNPGRAPIL LIYGDNQRPLGIPERFTISKSGGTATLTIDGAQAEDESDYYCQSADY SGNSVFGGGTKLTVLG 208
45F8
QAVLTQPSSVSVSLGQTANITCQGGNLGLYGANWYQQNPGRAPIL LFYGDNYMPLGIPERFTISKSGGTATLTIDGAQAENESDYYCQSSDY PGNSVFGGGTKLTVLG 209
45A12
QAVVTQEPSLSVSPGGTVTLTCGLSSGSATSGNYPEWYQQTPGQ APRLIIYNTASRHSGVPGRFSGSISGNKAALTITGAQPEDEADYYCL LYMGGSDFNFVFGGGTKLTVLG 210
45B6
211
QAVVTQEPSLSVSPGGTVTLTCGLSSGSVTSSNYPDWYQQTPGQA PRLLIYNTNSRHSGVPSRFSGSISGNKAALTITGAQPEDEADYYCAL YMGSGSNNVVFGGGTELTVLG
57B6
276
QTVVTQEPSLSVSPGGTVTLTCGLKSGSVTSSNYPAWYQQTPGQA PRLLIYNTNSRHSGVPSRFSGSISGNKAALTITGAQPEDEADYYCAL YMGSGSANAMFGGGTHLTVLG
59D10
277
QSVLTQPPSVSGSPGKTVTISCAGTSSDVGYGYYVSWYQQFPGMA PKLLIYDVNKRASGIADRFSGSKAGNTASLTISGLQSEDEADYYCAS YRSSANAVFGGGTHLTVLG
Ejemplo 13: Mutación inversa a secuencias de la línea germinal de mAb 27B3 anti-CD70
Los segmentos de genes de la línea germinal humana con la misma estructura de pliegues canónicos y la identidad 5 de secuencia de aminoácidos más alta con las regiones VH y VL de mAb 27B3 se identificaron mediante comparación con secuencias de genes de la línea germinal humana conocidas. Las regiones VH y VL humanas que coinciden más estrechamente con mAb 27B3 fueron VH3-48 humano (89,7% identidad FR) y VL8-61 humano (86,1% identidad FR), respectivamente. Las secuencias del segmento genético de la línea germinal humana JH y JL de la línea germinal humana que coinciden más estrechamente fueron JH5 y JL7, respectivamente. El alineamiento 10 de secuencias de las regiones VH y VL de mAb 27B3 con las secuencias vH y VL de la línea germinal humana que coinciden más estrechamente se muestran en la Figura 12. La comparación de las regiones V del anticuerpo SIMPLE 27B3 y las secuencias de la línea germinal humana identificaron 12 mutaciones candidatas humanizadoras en la región VH y 13 en la región VL (2 en CDR1 y 1 en CDR2). Una visión general de las mutaciones humanizantes en las secuencias VH y VL de 27B3, junto con los tamaños de biblioteca necesarios para cubrir la diversidad 15 introducida, se expone en las Tablas 10 y 11.
Tabla 10: Mutaciones dirigidas en la secuencia de aminoácidos VH 27B3. denota el tamaño de biblioteca necesario
para cubrir todos los mutantes potenciales.
Mutaciones incluidas en la biblioteca
Posición de Kabat
aa de Camélido Opción 1 de aa en la línea germinal humana Opción 2 de aa en la línea germinal humana Opción 3 de aa en la línea germinal humana Probabilidad
46
E V 0,50
74
A S 0,50
77
T S 0,50
79
T Y 0,50
83/84
KP KT RA 0,33
89
L V 0,50
93/94
AR AK VR 0,33
108
Q L T M 0,25
110
I T 0,50
112
A S 0,50
4608
Tabla 11: Mutaciones dirigidas en la secuencia de aminoácidos VL 27B3. denota el tamaño de biblioteca necesario para cubrir todos los mutantes potenciales. * denota mutaciones en las regiones CDR1 o CDR2.
Posición de Kabat
aa de Camélido Opción 1 de aa en la línea germinal humana Opción 2 de aa en la línea germinal humana Opción 3 de aa en la línea germinal humana Probabilidad
2
A T 0,50
11-12
LT FS 0,50
26*
K T 0,50
30*
T D 0,50
46
L T 0,50
53*
T S 0,50
60
S C 0,50
61
R D 0,50
67/68
SE LG 0,50
80/81/84/85
PEDEAE PEDESD ADDESD ADDEAE 0,25
87
F Y 0,50
4096
Se crearon bibliotecas que habían experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal de VH_27B3 5 y VL_27B3 que abarcaban todas las combinaciones de mutaciones humanizantes mediante un ensamblaje basado en PCR (véase, por ejemplo, Stemmer et al., Gene (1995) 164:49-53). Los oligonucleótidos solapantes con mutaciones específicas en ciertas posiciones se ensamblaron mediante PCR. La biblioteca contenía aminoácidos tanto humanos como de llama en cada posición mutada para evitar la pérdida completa de unión en el caso de que el residuo de llama de tipo salvaje fuera crítico para la unión de alta afinidad (véanse, p.ej. Baca et al., J. Biol. Chem. 10 (1997) 272:10678 - 10684; Tsurushita et al., J. Immunol. Methods (2004) 295: 9 - 19). La biblioteca de VH contenía
aproximadamente 1 x 1010 clones y la biblioteca de VL aproximadamente de 8 x 109 clones. Las bibliotecas de VH y VL se combinaron y editaron a una sola biblioteca de Fab con un tamaño de 1 x 1010 clones (91% con inserto de Fab completo) adecuados para el escrutinio de presentación en fagos. Se excedió la diversidad requerida para cubrir todas las mutaciones posibles como se menciona en las tablas 10 y 11 en las bibliotecas de cadena pesada y 15 cadena ligera primaria, pero también la biblioteca de Fab combinada fue lo suficientemente grande como para cubrir todas las permutaciones posibles (1,89 x 107).
Ejemplo 14: Selección de Fab 27B3 de la línea germinal con alta identidad con FR humana
La visualización de fagos se utilizó para seleccionar los Fab 27B3 de la línea germinal con una alta afinidad por CD70 y una alta identidad con FR humana. Específicamente, se biotiniló Flag-TNC-CD70 y se incubó a diversas 5 concentraciones con diferentes cantidades de fago que expresaba Fab. Los complejos de fago y Flag-TNC-CD70 se capturaron a continuación en una placa de microtitulación recubierta con estreptavidina y se lavaron con Flag-TNC- cD70 no biotinilado a 37°C. Los fagos se eluyeron con tripsina y se utilizaron para la infección de células TG1. Se realizaron cinco rondas de selección, aumentando la restricción de lavado en cada ronda. Los detalles de las condiciones utilizadas para cada ronda de selección se establecen en la Tabla 12.
10 Tabla 12: Condiciones para la selección de Fab 27B3 de la línea germinal
Ronda
Entrada de fagos (jl) Antígeno [pM] Tiempo de lavado Temperatura de lavado Antígeno de lavado
1
10 24000-2400-240 1 hora RT PBS
2
1 2400-240-24 ON 37°C CD70 24 nM
3
0,1 240-24-2,4 ON 37°C CD70 2,4 nM
4
0,01 24-2,4-0,24 3 días 37°C CD70 240 pM
5
0,1 2,4-0,24-0,024 6 días 37°C CD70 24 pM
Los fagos eluidos de las rondas 3, 4 y 5 de selección se transfectaron a TG1 y se sembraron en placa clonalmente; los clones individuales se seleccionaron aleatoriamente para un análisis adicional. Se prepararon fracciones periplásmicas que contenían los Fab a partir de cultivos de pequeña escala inducidos por IPTG. Se determinó la 15 tasa de descomposición de cada Fab utilizando un chip CM5 recubierto con CD70 en un ensayo de unión de Biacore. Se secuenciaron clones con Fab con velocidades de disociación similares a 27B3. Las velocidades de disociación para los clones con una identidad de secuencia con FR humana total superior a 94% se muestran en la Tabla 13, junto con el porcentaje de identidad con FR humana del clon individual (VH, VL y total).
20 Las secuencias de aminoácidos completas de los clones de Fab secuenciados se muestran en las tablas 14 y 15 y las variantes de las secuencias de aminoácidos de CDR de 27B3 se muestran en la tabla 16. La inspección de estas secuencias revela que el marco 1 de la cadena ligera a menudo tiene mutaciones extra (no humanas) en la región del cebador en el aminoácido 2 (A en lugar de T). Se prepararon variantes de los clones 35G3, 40F1 y 39C3 (clones 53C1, 53B1 y 53E1, respectivamente) que tenían el aminoácido humano correspondiente en la posición 2. Por otra 25 parte, el clon 41D12 se germinó adicionalmente combinando la cadena pesada de 41D12 con la cadena ligera de 40F1 (53A2) o con la cadena ligera de 53B1 (53H1).
Tabla 13: Velocidad de disociación de clones de Fab 27B3 que han experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal con más de 94% de identidad con FR humana total.
Clon Fab
% Identidad con FR para VL % Identidad con FR para VH % Identidad con FR Total Frecuencia de aislamiento Velocidad de disociación [10-4s-1]
27B3
86,0 89,5 87,9 1,4
36A9
97,5 92,0 94,5 1 1,3
53F1
97,5 92,0 94,5 1 2,3
36D6
94,9 94,3 94,6 2 1,4
53G1
96,2 94,0 95,0 1 2,0
35G3
94,9 95,4 95,2 1 1,7
35F6
94,9 95,4 95,2 1 ND
36G2
93,6 96,6 95,2 7 1,1
39D5
93,7 96,6 95,2 2 1,2
42D12
93,7 96,6 95,2 2 1,6
35G1
97,5 94,3 95,7 1 2,3
41D12
92,4 98,9 95,9 4 2,3
41H8
94,9 97,0 96,0 1 2,2
Clon Fab
% Identidad con FR para VL % Identidad con FR para VH % Identidad con FR Total Frecuencia de aislamiento Velocidad de disociación [10-4s-1]
35G2
96,2 96,6 96,4 1 1,7
40F1
94,9 98,0 96,6 1 1,6
39C3
97,5 97,7 97,6 6 2,5
Tabla 14A: Secuencias de aminoácidos de VH de clones 27B3 que han experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal con más de 94% de identidad humana total, con identificadores de secuencia desagregados en FR y CDR. Las mutaciones humanizadoras están sombreadas y las mutaciones introducidas por cebadores están en negrita.
CLASE DE CADENA PESADA
MARCO 1 CDR1 MARCO 2
27B3
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SEQ ID NO:2 VYYMN NO:11 SEQ ID WVRQAPGKGLEWVS SEQ ID NO:22
36A9
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SEQ ID NO:2 VYYMN NO:11 SEQ ID WVRQAPGKGLEWVS SEQ ID NO:22
53F1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SEQ ID NO:2 VYYMN NO:11 SEQ ID WVRQAPGKGLEWVS SEQ ID NO:22
36D6
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SEQ ID NO:2 VYYMN NO:11 SEQ ID WVRQAPGKGLEWVS SEQ ID NO:22
53G1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SEQ ID NO:2 VYYMN NO:11 SEQ ID WVRQAPGKGLEWVS SEQ ID NO:22
35G3
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SEQ ID NO:2 VYYMN NO:11 SEQ ID WVRQAPGKGLEWVS SEQ ID NO:22
53C1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SEQ ID NO:2 VYYMN NO:11 SEQ ID WVRQAPGKGLEWVS SEQ ID NO:22
35F6
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCASSGFTFS SEQ ID NO:274 VYYMN NO:11 SEQ ID WVRQAPGKGLEWVS SEQ ID NO:22
36G2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SEQ ID NO:2 VYYMN NO:11 SEQ ID WVRQAPGKGLEWVS SEQ ID NO:22
39D5
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SEQ ID NO:2 GYYMN NO:248 SEQ ID WVRQAPGKGLEWVS SEQ ID NO:22
42D12
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SEQ ID NO:2 VYYMN NO:11 SEQ ID WVRQAPGKGLEWVS SEQ ID NO:22
35G1
EVQLVESGGGLVQPGGSVRLSCAASGFTFS SEQ ID NO:2 VYYMN NO:11 SEQ ID WVRQAPGKGLEWVS SEQ ID NO:22
41D12
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SEQ ID NO:2 VYYMN NO:11 SEQ ID WVRQAPGKGLEWVS SEQ ID NO:22
41H8
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SEQ ID NO:2 VYYMN NO:11 SEQ ID WVRQAPGKGLEWVS SEQ ID NO:22
35G2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SEQ ID NO:2 VYYMN NO:11 SEQ ID WVRQAPGKGLEWVS SEQ ID NO:22
40F1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SEQ ID NO:2 VYYMN NO:11 SEQ ID WVRQAPGKGLEWVS SEQ ID NO:22
53B1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SEQ ID NO:2 VYYMN NO:11 SEQ ID WVRQAPGKGLEWVS SEQ ID NO:22
39C3
EVQLVUNSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SEQ ID NO:275 VYYMN NO:11 SEQ ID WVRQAPGKGLEWVS SEQ ID NO:22
CLASE DE CADENA PESADA
MARCO 1 CDR1 MARCO 2
53E1
EVQLVUNSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SEQ ID NO:275 VYYMN NO:11 SEQ ID WVRQAPGKGLEWVS SEQ ID NO:22
53H1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SEQ ID NO:2 VYYMN NO:11 SEQ ID WVRQAPGKGLEWVS SEQ ID NO:22
53A2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SEQ ID NO:2 VYYMN NO:11 SEQ ID WVRQAPGKGLEWVS SEQ ID NO:22
CLASE DE CADENA PESADA
CDR2 MARCO 3 CDR3 MARCO 4
27B3
DINNEGGTTYYADSVKG SEQ ID NO:27 RFTISRDNAKNTLTLQMNSLKPEDTALYYCVR SEQ ID NO:39 DAGYSNHVPIFDS SEQ ID NO:50 WGQGTQVIVAS SEQ ID NO:61
36A9
DINNEGGTTYYADSVKG SEQ ID NO:27 RFTISRDNSKNTLTLQMNSLKPEDTAfYYCVR SEQ ID NO:350 DAGYSNHVPIFDS SEQ ID NO:50 WGQGTQVIVSS SEQ ID 110:28 7
53F1
DINNEGGTTYYADSVKG SEQ ID NO:27 RFTI3RD1IAK1ITLTLQM1I3LKPEDTAVYYCVR SEQ ID NO:351 DAGYSNHVPIFDS SEQ ID NO:50 WGQGTQVIVAS SEQ ID 110:28 8
36D6
DINNEGGTTYYADSVKG SEQ ID NO:27 RFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTALYYCVR SEQ ID 110:278 DAGYSNHVPIFDS SEQ ID NO:50 WGQGTTVTVSS SEQ ID 110:289
53G1
DINNEGGTTYYADSVKG SEQ ID NO:27 RFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDT AV Y Y CVR SEQ ID 110:27 9 DAGYSNHVPIFDS SEQ ID NO:50 WGQGTTVIVS3 SEQ ID 110:290
35G3
DINNEGGTTYYADSVKG SEQ ID NO:27 RFTTSRDIISKIISLTLQMIISLKPEDTAVYYCAR SEQ ID 110:280 DAGYSNHVPIFDS SEQ ID NO:50 WGQGTpVfVlS SEQ ID 110:2 93
53C1
DINNEGGTTYYADSVKG SEQ ID NO:27 RFTISRD1ISK1ISLTLQM1ISLKPEDTAVYYCAR SEQ ID 110:280 DAGYSNHVPIFDS SEQ ID NO:50 WGQGTLVTV33 SEQ ID 110:293
35F6
DINNEGGTTYYADSVKG SEQ ID NO:27 RFTISRD1ISK1ITLYLQM1ISLRAEDTAVYYCVR SEQ ID 110:281 DAGYSNHVPIFDS SEQ ID NO:50 WGQGTTVTVA3 SEQ ID 110:291
36G2
DINNEGGTTYYADSVKG SEQ ID NO:27 RFTIS RDNAKNSÍLTLQMNS LRAEDTAVY YCVR SEQ ID 110:282 DAGYSNHVPIFDS SEQ ID NO:50 WGQGTQVTVSS SEQ ID 110:2 92
39D5
DINNEGGTTYYADSVKG SEQ ID NO:27 RFT 13 RD1JAK1JTLYLQ14113 LRAEDTAVY YCVR SEQ ID 110:28 3 DAGYSNHVPIFDS SEQ ID NO:50 WGQGTTVTVAS SEQ ID 110:291
42D12
DINNEGGTTYYADSVKG SEQ ID NO:27 RFTISRDNSKUTLYLQMUSLjRAEDTAVYYCVR SEQ ID 110:281 DAGYSNHVPIFDS SEQ ID NO:50 WGQGTQVTVSS SEQ ID 110:2 92
35G1
DINNEGGTTYYADSVKG SEQ ID NO:27 RFTI3RD1JAK1JTLYLQM1J3LKPEDTAVYYCAR SEQ ID 110:284 DAGYSNHVPIFDS SEQ ID NO:50 WGQGTLVTVA3 SEQ ID 110:294
CLASE DE CADENA PESADA
MARCO 1 CDR1 MARCO 2
41D12
DINNEGGTTYYADSVKG SEQ ID NO:27 RFTISRDNSKNÍLÍLQMNSLgftEDTAWYYCAR SEQ ID NO:285 DAGYSNHVPIFDS SEQ ID NO:50 WGQGTLVTVGG SEQ ID 110:293
41H8
DINNEGGTTYYADSVKG SEQ ID NO:27 RFTISRDMSKMTLYLQI'IMSLRAEDTAVYYCAR SEQ ID 110:286 DAGYSNHVPIFDS SEQ ID NO:50 WGQGTQVTiVAG SEQ ID 110:28 8
35G2
DINNEGGTTYYADSVKG SEQ ID NO:27 RFTISRDMAKMTLYLQI'IMSLKPEDTAVYYCAR SEQ ID 110:284 DAGYSNHVPIFDS SEQ ID NO:50 WGQGTLVTVGG SEQ ID 110:293
40F1
DINNEGG UNTYYADSVKG SEQ ID NO:249 RFTIGRD1JSKUGLYLQ1IUGLRAEDTAVYYCAR SEQ ID 110:285 DAGYSNHVPIFDS SEQ ID NO:50 WGQGTQVTVSG SEQ ID 110:2 92
53B1
DINNEGG UNTYYADSVKG SEQ ID NO:249 RFTISRDNCKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR SEQ ID 110:285 DAGYSNHVPIFDS SEQ ID NO:50 WGQGTQVTVSS SEQ ID 110:2 92
39C3
DINNEGGTTYYADSVKG SEQ ID NO:27 RFTIGRD1JGKUTLYLQ1IUGLRAEDTAVYYCAR SEQ ID 110:286 DAGYSNHVPIFDS SEQ ID NO:50 WGQGTTVTVGG SEQ ID 110:289
53E1
DINNEGGTTYYADSVKG SEQ ID NO:27 RF TIS RDNS KNT LíLQMNS LRAE DTAV YY CAR. SEQ ID NO:286 DAGYSNHVPIFDS SEQ ID NO:50 WGQGTTVTVGG SEQ ID 110:289
53H1
DINNEGGTTYYADSVKG SEQ ID NO:27 RFTISRDNSKlISLYLQÍ'llIS LRA.E DT AV Y Y CAR SEQ ID 110:286 DAGYSNHVPIFDS SEQ ID NO:50 WGQGTLYTVGG SEQ ID 110:293
53A2
DINNEGGTTYYADSVKG SEQ ID NO:27 RFTIS RD1IS K1IS LYLQMIIS LRAEDTAVY YCAR SEQ ID 110:285 DAGYSNHVPIFDS SEQ ID NO:50 WGQGTLYTVGG SEQ ID 110:293
Tabla 14B: Secuencias de aminoácidos de VH de clones de 27B3 de la línea germinal con más del 94% de identidad humana total, con identificadores de secuencia para la secuencia de aminoácidos de VH completa.
SEQ ID NO:
CLASE DE CADENA PESADA SECUENCIA COMPLETA DE VH
178
27B3 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMNWVRQAPGKGLEWVSDINNEGGTTYYADSVKG RFTISRDNAKNTLTLQMNSLKPEDTALYYCVRDAGYSNHVPIFDSWGQGTQVIVAS
212
36A9 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMNWVRQAPGKGLEWVSDINNEGGTTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLTLQMNSLKPEDTAVYYCVRDAGYSNHVPIFDSWGQGTQVIVSS
213
53F1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMNWVRQAPGKGLEWVSDINNEGGTTYYADSVKG RFTISRDNAKNTLTLQMNSLKPEDTAYYYCVRDAGYSNHVPIFDSWGQGTQVIVAS
SEQ ID NO:
CLASE DE CADENA PESADA SECUENCIA COMPLETA DE VH
214
36D6 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMNWVRQAPGKGLEWVSDINNEGGTTYYADSVKG RFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTALYYCVRDAGYSNHVPIFDSWGQGTTVTVS.S
215
53G1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMNWVRQAPGKGLEWVSDINNEGGTTYYADSVKG RFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAfYYCVRDAGYSNHVPIFDSWGQGTIVIVSS
216
35G3 EVQLVEGGGGLVQPGGGLRLGCAAGGFTFGVYYM1IWVRQAPGKGLEWVGDI1I1IEGGTTYYADGVKG RFTIGRD1IGK1IGLTLQM1IGLKPEDTAVYYCARDAGYG1IHVPIFDGWGQGTLVTVGG
217
53C1 EVQLVEGGGGLVQPGGGLRLGCAAGGFTFGVYYMIIVJVRQAPGKGLEVJVGDIIIIIEGGTTY YADGVKG RFTIGRD1IGK1IGLTLQM1IGLKPEDTAVYYCARDAGYG1IHVPIFDGKGQGTLVTVSG
218
35F6 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCASSGFTFSVYYMNWRQAPGKGLEWVSDINNEGGTTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRaÍEDTAVYYCVRDAGYSNHVPIFDSWGQGTTVfVAS
219
36G2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMNWVRQAPGKGLEWSDINNEGGTTYYADSVKG RFTISRDNAKNSLTLQMNSLRSEDTAVYYCVRDAGYSNHVPIFDSWGQGTQV|yé:s
220
39D5 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYYMNWRQAPGKGLEWVSDINNEGGTTYYADSVKG RFTISRDNAKNTLfLQMNSLRAEDTAVYYCVRDAGYSNHVPIFDSWGQGTfvfVAS
221
42D12 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMNWVRQAPGKGLEWVSDINNEGGTTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA^YYCVRDAGYSNHVPIFDSWGQGTQVYVgS
222
35G1 EVQLVESGGGLVQPGGSVRLSCAASGFTFSVYYMNWRQAPGKGLEWVSDINNEGGTTYYADSVKG RFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCARDAGYSNHVPIFDSWGQGTEVfVAS
223
41D12 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMNWVRQAPGKGLEWVSDINNEGGTTYYADSVKG RFTISRDNSKNfLYLQMNSLRAEDTASYYCARDAGYSNHVPIFDSWGQGTiiVYVGS
224
41H8 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMNWVRQAPGKGLEWVSDINNEGGTTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAYfYYCARDAGYSNHVPIFDSWGQGTQVlVAS
225
35G2 EVQLVEGGGGLVQPGGGLRLGCAAGGFTFGVYYM1IWVRQAPGKGLEWVGDI1I1IEGGTTYYADGVKG RFTIGRDIIAKMTLYLQMIJGLKPEDTAVYYCARDAGYGMHVPIFDGWGQGTLVTVGG
226
40F1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMNWVRQAPGKGLEWVSDINNEGGATYYADSVKG RFTISRDNSKNSLYLQMNSLRftEDTAYYYCARDAGYSNHVPIFDSWGQGTQVTVSS
227
53B1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMNWRQAPGKGLEWVSDINNEGGATYYADSVKG RFTISRDNSKN|LYLQMNSLRAEDTA¥YYClRDAGYSNHVPIFDSWGQGTQVÍVSS
SEQ ID NO:
CLASE DE CADENA PESADA SECUENCIA COMPLETA DE VH
228
39C3 EVQLVASGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMNWVRQAPGKGLEWVSDINNEGGTTYYADSVKG RF TIS RDNSKNTLYLQMNS LRAE DTA¥YYCARDAGYSNHVPIFDS WGQGTTVTVS S
229
53E1 EVQLVAGGGGLVQPGGGLRLGCAAGGFTFGVYYMIIVíVRQAPGKGLEWVGDIIIIIEGGTTY YADGVKG RFTIGRD1IGK1ITLYLQM1IGLRAEDTAVYYCARDAGYG1IHVPIFDGWGQGTTVTVGG
223
53H1 EVQLVEGGGGLVQPGGGLRLGCAAGGFTFGVYYMIF.'JY'RQAPGKGLESVGDIIIIIEGGTTY YADGVKG RFTIGRD1IGK1IGLYLQM1IGLRAEDTAVYYCARDAGYG1IHVPIFDGKGQGTLVTVGG
223
53A2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVYYMNWVRQAPGKGLEWVSDINNEGGTTYYADSVKG RFTISRDNSKNSLYLQMNSLRÁEDTAMYYCARDAGYSNHVPIFDSWGQGTLVIVaS
Tabla 15A: Secuencias de aminoácidos de VL de clones 27B3 que han experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal con más de 94% de identidad humana total, con identificadores de secuencia desagregados en FR y CDR. Las mutaciones humanizantes están sombreadas y las mutaciones introducidas por cebadores están en negrita.
CLON DE CADENA LIGERA
MARCO 1 CDR1 MARCO 2
27B3
QAWTQEPSLTVSPGGTVTLTC SEO ID NO:71 GLKSGSVTSTNFPT SEO ID NO:87 WYQQTPGQAPRLLIY SEO ID NO:99
36A9
QTWTQEPSFSVSPGGTVTLTC SEQ ID NO:294 GLKSGSVTSDNFPT SEQ ID NO:250 WYQQTPGQAPRLLIY SEO ID NO:99
53F1
QAWTQEPSFSVSPGGTVTLTC SEQ ID NO:295 GLKSGSVTSDNFPT SEQ ID NO:250 WYQQTPGQAPRLLIY SEO ID NO:99
36D 6
QTWTQEPSLTVSPGGTVTLTC SEQ ID NO:296 GLKSGSVTSTNFPT SEO ID NO:87 WYQQTPGQAPRLLIY SEO ID NO:99
53G1
QTWTQEPSFSVSPGGTVTLTC SEQ ID NO:294 GLTSGSVTSTNFPT SEQ ID NO:251 WYQQTPGQAPRLLIY SEO ID NO:99
35G3
QAWTQEPSFSVSPGGTVTLTC SEQ ID NO:295 GLKSGSVTSDNFPT SEQ ID NO:250 WYQQTPGQAPRLLIY SEO ID NO:99
53C1
QTWTQEPSFSVSPGGTVTLTC SEQ ID NO:294 GLKSGSVTSDNFPT SEQ ID NO:250 WYQQTPGQAPRLLIY SEO ID NO:99
35F6
QTWTQEPSFSVSPGGTVTLTC SEQ ID NO:294 GLTSGSVTSDHFPT SEQ ID NO:252 WYQQTPGQAPRLLIY SEO ID NO:99
36G2
QAWTQEPSLTVSPGGTVTLTC SEO ID NO:71 GLKSGSVTSDNFPT SEQ ID NO:250 WYQQTPGQAPRLLIY SEO ID NO:99
39D5
QTWTQEPSLTVSPGGTVTLTC SEQ ID NO:296 GVTSGSVTSDMFPT SEQ ID NO:253 WYQQTPGQAPRLLIY SEO ID NO:99
42D12
QAWTQEPSFSVSPGGTVTLTC SEQ ID NO:295 GLTSGSVTSTNFPT SEQ ID NO:251 WYQQTPGQAPRLLIY SEO ID NO:99
35G1
QTWTQEPSFSVSPGGTVTLTC SEQ ID NO:294 GLKSGSVTSDNFPT SEQ ID NO:250 WYQQTPGQAPRLLIY SEO ID NO:99
41D12
QAWTQEPSLTVSPGGTVTLTC SEO ID NO:71 GLKSGSVTSDNFPT SEQ ID NO:250 WYQQTPGQAPRLLIY SEO ID NO:99
41H8
QAWTQEPSFSVSPGGTVTLTC SEQ ID NO:295 GLTSGSVTSTNFPT SEQ ID NO:251 WYQQTPGQAPRLLIY SEO ID NO:99
35G2
QTWTQEPSFSVSPGGTVTLTC SEQ ID NO:294 GLKSGSVTSTNFPT SEO ID NO:87 WYQQTPGQAPRLLIY SEO ID NO:99
40F1
QAWTQEPSFSVSPGGTVTLTC SEQ ID NO:295 GLKSGSVTSDNFPT SEQ ID NO:250 WYQQTPGQAPRLLIY SEO ID NO:99
53B1
QTWTQEPSFSVSPGGTVTLTC SEQ ID NO:294 GLKSGSVTSDNFPT SEQ ID NO:250 WYQQTPGQAPRLLIY SEO ID NO:99
39C3
QAWTQEPSFSVSPGGTVTLTC SEQ ID NO:295 GLKSGSVTSDNFPT SEQ ID NO:250 WYQQTPGQAPRLLIY SEO ID NO:99
53E1
QTWTQEPSFSVSPGGTVTLTC SEQ ID NO:294 GLKSGSVTSDNFPT SEO ID NO:250 WYQQTPGQAPRLLIY SEO ID NO:99
53H1
QTWTQEPSFSVSPGGTVTLTC SEQ ID NO:294 GLKSGSVTSDNFPT SEQ ID NO:250 WYQQTPGQAPRLLIY SEO ID NO:99
53A2
QAWTQEPSFSVSPGGTVTLTC SEQ ID NO:295 GLKSGSVTSDNFPT SEQ ID NO:250 WYQQTPGQAPRLLIY SEO ID NO:99
CLON DE CADENA LIGERA
CDR2 MARCO 3 CDR3 MARCO 4
27B3
NTNTRHS SEO ID NO:119 GVP SRFSGSISENKAALTITGAOPEDEAEYFC SEO ID 110:139 ALFISNPSVE SEO ID NO:160 FGGGTOLTVLS SEO ID NO:174
36A9
NTNTRHS SEO ID NO:119 GVPDRFGGGILGIIKAAITITGAQADDESDYFC GEQ ID 1IC : 2 ALFISNPSVE SEO ID NO:160 FGGGTQLTVLG SEQ ID 110:30 9
53F1
NTNTRHS SEO ID NO:119 GVPCRFGGGILGIIKAAITITGAQADDEGDYFC GEO ID 1IC : 2 ALFISNPSVE SEO ID NO:160 FGGGTQLTVLG SEQ ID 110:30 9
36D6
NTN3RH3 GVPDRFGGGILGIIKAAITITGAQADDEGDYFC ALFISNPSVE FGGGTQLTVLG
SEQ ID NO:110 SEQ ID 110:2 97 SEQ ID 110:160 SEQ ID 110:30 9
53G1
NTNSRHS SEQ ID 110:110 GVP S RF S G SI LGN KAAL TIT G AQfiD'D E Sü Y F C SEQ ID 110:2 98 ALFISNPSVE SEQ ID 110:160 FGGGTQLTVLG SEQ ID 110:30 9
35G3
NTNSRHS SEQ ID NO:110 GVP DRF S G SILGNKAALTIRGAQADDEAEYYC SEQ ID 110:2 99 ALFISNPSVE SEQ ID NO:160 FGGGTQLTVLG SEQ ID 110:30 9
53C1
NTNSRHS SEQ ID 110:110 GVPDRFSGSILGNKAALTIRGAQADDEAEYYC SEQ ID 110:2 99 ALFISNPSVE SEQ ID NO:160 FGGGTQLTVLG SEQ ID 110:30 9
35F6
NTNSRHS SEQ ID 110:110 GVPDRFSGSILGNKAALTITGAQPEDESDYFC SEQ ID 110:300 ALFISNPSVE SEQ ID 110:160 FGGGTQLTVLG SEQ ID 110:30 9
36G2
NTNTRHS SEQ ID 110:119 GVP Í3RF S G SILGN KAAL TITGAQPEDESDYYC SEQ ID 110:301 ALFISNPSVE SEQ ID 110:160 FGGGTQLTVLG SEQ ID 110:30 9
39D5
NTNTRHS SEQ ID 110:119 GVPBRFSGSIBGNKAALTITGAQPEDE5BYYC SEQ ID 110:301 ALFISNPSVE SEQ ID 110:160 FGGGTQLTVLG SEQ ID 110:30 9
42D12
NTNTRHS SEO ID NO:119 GVP SRF S GSILGNKAALTITGAQADDEAEYFC SEQ ID 110:302 ALFISNPSVE SEO ID NO:160 FGGGTQLTVLG SEQ ID 110:30 9
35G1
NTNSRHS SEQ ID 110:110 GVPDRFSGSILGHKAALTITGAQADDESDYFC SEQ ID 110:2 97 ALFISNPSVE SEO ID NO:160 FGGGTQLTVLG SEQ ID 110:30 9
41D12
NTNTRHS SEQ ID 110:119 GVP Í)RF S G SI LGN KAAL TIT G AQ A,DD E AE Y F C SEQ ID 110:303 ALFISNPSVE SEQ ID 110:160 FGGGTQLTVLG SEQ ID 110:30 9
41H8
ntnsrhs SEQ ID NO:110 GVPDRFSGSILGHKAALTITGAQPEDESDYFC SEQ ID 110:300 ALFISNPSVE SEQ ID NO:160 FGGGTQLTVLG SEQ ID 110:30 9
35G2
ntn|rhs SEO ID NO:110 GVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDEADYFC SEQ ID 110:304 ALFISNPSVE SEO ID NO:160 FGGGTQLTVLG SEQ ID 110:30 9
40F1
NTNTRHS SEO ID NO:119 GVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDEAEYFC SEQ ID 110:303 ALFISNPSVE SEO ID NO:160 FGGGTQLTVLG SEQ ID 110:30 9
53B1
NTNTRHS SEQ ID 110:119 gvpdrfsgsilgnkaaltitgaqaqdeaeyfc SEQ ID 110:303 ALFISNPSVE SEQ ID 110:160 FGGGTQLTVLG SEQ ID 110:30 9
39C3
NTNTRHS SEQ ID 110:119 GVP SRFS GSILGllKAALTITGAQAÜDE SÜYYC SEQ ID 110:305 ALFISNPSVE SEQ ID 110:160 FGGGTQLTVLG SEQ ID 110:30 9
53E1
NTNTRHS SEO ID NO:119 GVPSRFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYC SEQ ID 110:305 ALFISNPSVE SEO ID NO:160 FGGGTQLTVLG SEQ ID 110:30 9
53H1
NTNTRHS SEO ID NO:119 GVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDEAEYFC SEQ ID 110:303 ALFISNPSVE SEO ID NO:160 FGGGTQLTVLG SEQ ID 110:30 9
53A2
NTNTRHS SEO ID NO:119 GVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDEAEYFC SEQ ID 110:303 ALFISNPSVE SEO ID NO:160 FGGGTQLTVLG SEQ ID 110:30 9
Tabla 15B: Secuencias de aminoácidos de VL de clones 27B3 que han experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal con más de 94% de identidad humana total, con identificadores de secuencia para la 5 secuencia de VL completa. Las mutaciones humanizantes están sombreadas y las mutaciones introducidas por cebadores están en negrita.
SEQ ID NO:
LIGHT CHAIN CLONE FULL VL SEQUENCE
201
2 7B3 QAWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGLKSGSVTSTNFPTWYQQTPGQAPRLLIYNTNTRHS GVPGRFGGGIGE1IKAALTITGAQPEDEAEYFCALFIGUPGVEFGGGTQLTVLG
230
36A9 QTVVTQEPGFGVGPGGTVTLTCGLKGGGVTGDHFPTivYQQTPGQAPRLLIYlITUTRHG GVP DRF G GGILG11KAALTITGAQADDE GDYFCALFIGIJP GVEFGGGT QLTVLG
231
53F1 QAVVTQEPGFGVGPGGTVTLTCGLKGGGVTGDHFPTLJYQQTPGQAPRLLIYUTUTRHG GVPDRFGGGILGUKAALTITGAQADDEGDYFCALFIGIJPGVEFGGGTQLTVLG
232
36D 6 QTVVTQEPGLTVGPGGTVTLTCGLKGGGVTGTI JFPTWYQQTPGQAPRLLIYUTMGRHG GVPDRFGGGILGHKAALTITGAQADDESDYFCALFIGIIPGVEFGGGTQLTVLG
233
53G1 QTVVTQEPGFGVGPGGTVTLTCGLTGGGVTGT1IFPTWYQQTPGQAPRLLIYIITIISRHG GVP GRFGGGILG1IKAALTITGAQADDEGDYFCALFIG1IP GVEFGGGTQLTVLG
234
35G3 QAWTQEPGFSVGPGGTVTLTCGLKGGGVTGDTJEPTIvYQQTPGQAPRLLIYUTUGRHG GVPDRFGGGILG1IKAALTIRGAQADDEAEYYCALFIGUPGVEFGGGTQLTVLG
235
53C1 QTVVTQEPGFSVGPGGTVTLTCGLKGGGVTGD1JFPTWYQQTPGQAPRLLIYUTMGRHG GVPDRFGGG ILGIIKAALTIRGAQADDEAEYYCALFISIIP GVEFGGGTQLTVLG
236
35F6 QTVVTQEPGFSVGPGGTVTLTCGLTGGSVTGD1IFPTWYQQTPGQAPRLLIYUTMGRHG
GVPDRFGGGILGIIKAALTITGAQPEDESDYFCALF131IPGVEFGGGTQLTVLG
237
36G2 QAVVTQEPGLTVGPGGTVTLTCGLKGGGVTGD1IFPTV; YQQTPGQAPRLLI YIITIITRHG GVPDRFGGG ILGIIKAALTI TGAQPEDESD YYCALFIGIIP GVEFGGGTQLTVLG
238
39D5 QTVVTQEPGLTVGPGGTVTLTCGVTGGGVTGD1IFPTV; YQQTPGQAPRLLI YIITIITRHG GVPDRFGGG ILGIIKAALTI TGAQPEDESD YYCALFIGIIP GVEFGGGTQLTVLG
239
42D12 QAWTQEPGFGVGPGGTVTLTCGLTGGGVTG TI JFPTVJYQQTPGQAPRLLI YIITIITRHG GVPGRFGGG ILGIIKAALTI TGAQADDEAE YFCALF IGIIP GVEFGGGTQLTVLG
240
35G1 QTVVTQEPGFSVGPGGTVTLTCGLKGGGVTGD1IFPTV; YQQTPGQAPRLLI YIITIIGRHG GVPDRFGGG ILGIIKAALTI TGAQADDEGD YFCALF IGIIP GVEFGGGTQLTVLG
241
41D12 QAVVTQEPGLTVGPGGTVTLTCGLKGGGVTGD1IFPTV; YQQTPGQAPRLLI YIITIITRHG GVPDRFGGG ILGIIKAALTI TGAQADDEAE YFCALF IGIIP GVEFGGGTQLTVLG
242
41H8 QAVVTQEPGFGVGPGGTVTLTCGLTGGGVTGT1IFPTV; YQQTPGQAPRLLI YIITIIGRHG GVPDRFGGG ILGIIKAALTI TGAQPEDESD YFCALF IGIIP GVEFGGGTQLTVLG
243
35G2 QTVVTQEPGFGVGPGGTVTLTCGLKGGGVTGT1IFPTV; YQQTPGQAPRLLI YIITIIGRHG GVPDRFGGG ILGIIKAALTI TGAQADDEAD YFCALF IGIIP GVEFGGGTQLTVLG
244
40F1 QAVVTQEPGFGVGPGGTVTLTCGLKGGGVTGD1IFPTV; YQQTPGQAPRLLI YIITIITRHG GVPDRFGGG ILGIIKAALTI TGAQADDEAE YFCALF IGIIP GVEFGGGTQLTVLG
245
53B1 QTVVTQEPGFGVGPGGTVTLTCGLKGGGVTGD1IFPTV; YQQTPGQAPRLLI YIITIITRHG GVPDRFGGG ILGIIKAALTI TGAQADDEAE YFCALF IGIIP GVEFGGGTQLTVLG
246
39C3 QAVVTQEPGFSVGPGGTVTLTCGLKGGGVTGD1IFPTV; YQQTPGQAPRLLI YIITIITRHG GVPGRFGGG ILGIIKAALTI TGAQADDEGD YYCALFIGIIP GVEFGGGTQLTVLG
247
53E1 QTVVTQEPGFGVG PGGTVTLTCGLKGGGVTGD1IFP TV; YQQTPGQAPRLLI YIITIITRHG GVPGRFGGG ILGIIKAALTI TGAQADDEGD YYCALFIGIIP GVEFGGGTQLTVLG
244
53H1 QTVVTQEPGFGVGPGGTVTLTCGLKGGGVTGDIJFPTVJYQQTPGQAPRLLI YIITIITRHG GVPDRFGGG ILGIIKAALTI TGAQADDEAE YFCALF IGIIP GVEFGGGTQLTVLG
245
5 3A2 QAVVTQEPGFGVGPGGTVTLTCGLKGGGVTGD1IFPTV; YQQTPGQAPRLLI YIITIITRHG GVPDRFGGG ILGIIKAALTI TGAQADDEAE YFCALF IGIIP GVEFGGGTQLTVLG
Ejemplo 15: Estabilidad frente a la temperatura de los mAb 27B3 que han experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal
5
Algunas variantes de mAb de 27B3 que habían experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal se expresaron en células HEK293 como moléculas de IgG1 humana completas. Después de la purificación de la proteína A, se evaluó la estabilidad frente a la temperatura de los clones de mAb 27B3 que habían experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal. Específicamente, cada mAb se incubó a diversas temperaturas 10 (intervalos de 2 o 5°C) durante 1 hora a una concentración de 100 |jg/ml en tampón PBS. La temperatura de los mAb se disminuyó a continuación de una manera controlada (reducción a 25°C durante 2 horas, seguido de una incubación durante la noche a 4°C) y se utilizó la centrifugación para eliminar los agregados. La cantidad de mAb activo (como porcentaje de la concentración total de mAb) en el sobrenadante se midió con Biacore.
15 Los resultados (expuestos en la Tabla 17) demuestran que la mayoría de los clones tienen una temperatura de fusión similar (Tm) a la que tiene el tipo salvaje 27B3. Sorprendentemente, los clones 41D12 y 35G2 muestran tener un aumento de termoestabilidad en comparación con 27B3.
Tabla 17: Estabilidad a la temperatura de mAbs 27B3 de la línea germinal
Clon de mAb
O o E 1-
27B3 (WT)
64,7 64,6
35G1
63,7
35G3
61,7
53A2
62,2 62,2
41D12
65,9 65,9
35G2
65,6 66,0
40F1
63,5
53H1
64,1
20
La estabilidad frente a la temperatura de los mAb 27B3 que habían experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal: 41D12, 35G2 y 40F1 se estudiaron adicionalmente utilizando una variedad de técnicas. Se prepararon alícuotas (1 ml) de los mAb de ensayo a una concentración de 100 jg/ml en PBS de Dulbecco que
-69-
contenía Tween al 0,02%. También se preparó una alícuota de control negativo que consistía solamente en tampón (PBS de Dulbecco que contenía Tween al 0,02%) y una alícuota de control positivo que consistía en mAb en PBS de Dulbecco que contenía Tween al 0,02%. Para cada preparación de mAb, se almacenaron alícuotas a 4°C, a RT y a 37°C durante un período de 0-8 semanas. Se retiraron muestras de 50 jl de las alícuotas los días 1, 7, 14, 21, 28, 5 35, 56 y 92 para su análisis. Una muestra se almacenó a -20°C y se utilizó como referencia.
15.1 Análisis de filtración en gel de las muestras
Las muestras tomadas en cada punto temporal también se analizaron por filtración en gel utilizando una columna 10 Superdex200 10/300 GL. La muestra de ensayo de 50 jl se añadió a 200 jl de PBS + Tween-20 al 0,02%. Se tomó una muestra (125 jl) para el análisis de filtración en gel. Las muestras se centrifugaron antes del análisis para eliminar los agregados más grandes. Se midieron el % de pico monomérico y el área del pico monomérico, así como el volumen de retención. Los resultados se muestran en las tablas 19, 20 y 21.
15 Tabla 19: Resultados del estudio de estabilidad de PBS - % pico monomérico
d1 d7 d14 d21 d28 d35 d56 d92
35G2
Referencia 99,82 99,84 99,81 99,81 99,80 99,87
40F1
99,85 99,83 99,83 99,83 99,87 99,86
41D12
99,84 99,81 99,84 99,75 99,73 99,23 99,82 99,84
35G2
99,85 99,75 99,74 99,83 99,66 99,84
40F1
4°C 99,65 99,29 99,73 99,77 99,72
41D12
99,88 99,76 99,83 99,8 99,84 99,81 99,49
35G2
99,78 99,83 99,81 99,87 99,83
40F1
RT 99,87 99,83 99,84 99,77 99,77
41D12
99,88 99,86 99,87 99,78 99,73 99,80 99,71
35G2
99,86 99,80 99,72 99,68 99,48 99,32
40F1
37°C 99,83 99,78 99,78 99,77 99,40 99,27
41D12
99,89 99,77 99,61 99,71 99,45 99,02 98,66 97,46
Tabla 20: Resultados del estudio de estabilidad de PBS - área bajo la curva del pico monomérico (mAU * ml)
d1 d7 d14 d21 d28 d35 d56 d92
35G2
Referencia 67,34 68,46 64,92 66,70 66,69 66,37
40F1
67,04 67,96 70,36 69,62 69,53 67,23
41D12
66,41 67,64 61,17 68,53 68,60 66,08 67,48 67,06
35G2
68,41 67,58 62,55 68,64 68,12 68,42
40F1
4°C 69,86 67,31 65,55 66,76 68,99
41D12
68,38 69,87 65,61 68,98 69,99 68,85 67,33
35G2
66,76 67,23 71,40 68,55 68,45
40F1
RT 68,42 69,53 69,17 68,02 70,32
41D12
66,47 69,01 64,32 69,72 71,56 69,36 67,16
35G2
67,52 67,14 64,49 61,89 66,51 65,64
40F1
37°C 66,48 67,69 67,35 68,02 68,61 67,23
41D12
67,09 68,13 61,51 68,97 68,37 68,25 67,78 66,51
Tabla 21: Resultados del estudio de estabilidad en PBS - volumen de retención (ml)
d1 d7 d14 d21 d28 d35 d56 d92
35G2
Referencia 12,17 12,13 12,13 12,15 12,17 12,20
5
10
15
20
25
30
35
d1 d7 d14 d21 d28 d35 d56 d92
40F1
12,14 12,09 12,11 12,12 12,14 12,16
41D12
12,12 12,08 12,10 12,10 12,12 12,14 12,10 12,13
35G2
4°C 12,16 12,12 12,14 12,16 12,17 12,20
40F1
12,13 12,09 12,11 12,12 12,14
41D12
12,12 12,08 12,10 12,10 12,13 12,10 12,13
35G2
RT 12,16 12,12 12,14 12,16 12,17
40F1
12,14 12,09 12,10 12,12 12,13
41D12
12,12 12,07 12,10 12,10 12,28 12,09 12,13
35G2
37°C 12,16 12,12 12,13 12,14 12,16 12,17
40F1
12,13 12,09 12,09 12,12 12,12 12,14
41D12
12,12 12,08 12,08 12,09 12,10 12,12 12,06 12,08
Los resultados del análisis de filtración en gel de las muestras de 35G2, 40F1 y 41D12 tomadas después de 5 semanas de incubación a 37°C se muestran en la Figura 13. Se observan dos picos menores a un tiempo de retención más alto (indicando la presencia de algunos agregados) y menor tiempo de retención (indicando la presencia de algún producto de degradación). Los resultados demuestran que la mayoría de la proteína está intacta y no se agrega.
Análisis de muestras mediante BIACORE
Las muestras tomadas en determinados puntos temporales se analizaron para determinar su potencia en la unión a CD70 utilizando Biacore. La muestra de 5o pl se añadió a 200 pl de PBS + Tween al 0,02%, y se diluyó 1/400 de la siguiente manera: 5 pl de muestra (1 mg/ml) + 195 pl de HBS-EP + (tampón Biacore), se diluyó adicionalmente 10 pl + 90 pl HVS-EP + = 2,5 pg/ml. El análisis de Biacore se realizó utilizando un chip CM5 altamente recubierto con CD70 (4000 RU). Los resultados para los mAb 40F1, 35G2 y 41D12 se muestran en la Figura 16. La muestra de referencia es la muestra al 100%.
Los resultados demuestran que los mAbs pierden algo de potencia (afinidad por el antígeno CD70) con el tiempo cuando se incuban a 37°C. Para 41D12, se trazan tanto la pendiente como la señal máxima (R0) (véanse las Figuras 16C y D).
A continuación, se estudió la estabilidad frente a la congelación-descongelación de los mAb 27B3 de la línea germinal: 41D12, 35G2 y 40F1. Por lo tanto, una alícuota de 0,7 ml de los mAb (a 5 mg/ml) se congeló durante al menos 6 horas a -20°C y se descongeló durante 1 hora a RT. Este ciclo se repitió 9x (completando 10 ciclos de congelación-descongelación en total) y las muestras se analizaron mediante filtración en gel como anteriormente. Los resultados demuestran que los mAb son estables después de la congelación y descongelación durante 10 ciclos: no se observaron productos de degradación o agregados en la filtración en gel.
Tabla 22: Resultados del estudio de estabilidad de filtración en gel en PBS (izquierda = valor después de 10 ciclos C/D, a la derecha está valor para la muestra de referencia)
Filtración de gel
35G2 40F1 41D12
10/ref.
10/ref.
10/ref.
% pico monomérico
99,9/99,8 99,8/99,7 99,8/99,8
Pico monomérico del área
67,5/64,7 65,9/67,2 68,2/67,8
Tiempo de retención
12,20/12,21 12,15/12,15 12,12/12,12
Las muestras también se sometieron a ensayo para determinar la potencia en Biacore como se describió anteriormente. Los resultados demuestran que, después de 10 ciclos de congelación-descongelación, el mAb todavía tiene 97% de su potencia (para los tres mAb sometidos a ensayo).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Tabla 23: Potencia en Biacore después de 10 ciclos de congelación-descongelación (%)
35G2 40F1 41D12
Referencia
100 100 100
10xFT
97,35 96,96 97,02
Ejemplo 16: Potencia de ADCC de los mAb 27B3 de la línea germinal
Algunas variantes que habían experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal de 27B3 se expresaron en células HEK293 como moléculas de IgG1 humana completa. Después de la purificación de la proteína A, se evaluó la potencia de ADCC de los mAb 27B3 que habían experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal. La ADCC se midió utilizando como se describió anteriormente en el ejemplo 7.
Las CI50 relativas para los mAb 27B3 que habían experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal en comparación con el 27B3 parental se proporcionan en la tabla 18 tanto para la potencia de ADCC como para la potencia de bloqueo de CD70/CD27 en el ensayo de co-cultivo de Raji (como se describe en el ejemplo 6). Una cifra de <1,0 denota mejora de CI50 para la variante que había experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal en respecto a 27B3 parental. A partir de estos datos, se puede concluir que la variante 41D12 que había experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal mantuvo la potencia de ADCC así como la potencia de bloqueo de CD70/CD27 combinada con la mejor Tm.
Tabla 18: CI50 relativas de variantes que han experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal de 27B3 en el ensayo de ADCC basado en 786-0 y neutralización en el bioensayo basado en Raji en comparación con el clon de mAb parental
Clon de mAb
CI50 en el ensayo de co-cultivo de Raji con respecto a 27B3 CI50 en ADCC de mAb que ha experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal con respecto a 27B3
27B3
1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
53A2
0,8 1,5 1,9 1,5 4,6 0,7
41D12
1,2 1,7 1,1 2,2 1,4 2,0 2,0
35G2
1,4 1,7 2,1 4,4 1,4 1,9 2,3
40F1
1,8 1,0 1,5 1,3 1,5 2,1 1,6
53H1
1,6 0,9 1,8 3,4 2,1 1,9 1,7
Ejemplo 17 Construcción y selección de líneas celulares que expresan el mAb CD70 no fucosilado, ARGX- 110
Se produjo un vector de gen doble que codificaba las secuencias de aminoácidos VH y VL del clon 41D12 27B3 que había experimentado mutación inversa a secuencias de la línea germinal (alotipo za). Las secuencias de nucleótidos que codifican la cadena pesada (SEQ ID NO: 344) y la cadena ligera (SEQ iD NO: 345) de 41D12 se proporcionan en la Tabla 30 a continuación.
Se transfectaron de forma estable células Potelligent® CHOK1SV con el vector de doble gen mediante electroporación. Se realizaron seis rondas de transfección. En cada ronda, las células de cada electroporación se añadieron a 200 ml de medio libre de componente animal definido químicamente (CDACF) CM63 y se sembraron en placas sobre 40 placas de 96 pocillos a 50 pL por pocillo. El día después de la transfección, se añadieron 150 pl del medio CM63 que contenía el agente selectivo L-metionina sulfoximina (MSX) a cada pocillo para proporcionar una concentración final de MSX 50 pM. Al cabo de aproximadamente 3, 4 y 5 semanas de incubación, las placas se escrutaron para detectar la presencia de colonias utilizando un espejo de clonación. Todas las colonias identificadas se examinaron con un microscopio para evaluar si la colonia había surgido de una o varias células.
Se identificaron doscientas cuarenta y cinco colonias y se escrutaron para determinar la producción de anticuerpos utilizando un método basado en Octetos. Las concentraciones de anticuerpos oscilaron entre 0 y 172 pg/ml. De las 245 líneas celulares exploradas, 214 fueron positivas para la producción de anticuerpos. Las líneas celulares se clasificaron de acuerdo con la productividad y se seleccionaron las 70 líneas celulares principales. Los cultivos de estas 70 líneas celulares se expandieron inicialmente en cultivo estático y posteriormente en cultivo en suspensión. Treinta líneas celulares que exhibieron un crecimiento aceptable se seleccionaron y evaluaron adicionalmente en un escrutinio de productividad de cultivo discontinuo en matraces oscilantes. Los cultivos se gasearon los días 4, 6, 8 y 10 y se recogieron el día 12. La concentración de anticuerpo en las muestras de sobrenadante de recolección se determinó en HPLC utilizando una columna que contenía Proteína A. Las concentraciones de anticuerpos en las muestras de las 30 líneas celulares oscilaron entre 109 y 877 mg/L. Los resultados de la evaluación del matraz
oscilante discontinuo se utilizaron para clasificar las líneas celulares, en función de la productividad. Las 20 líneas celulares principales se seleccionaron para una evaluación adicional.
Los datos de crecimiento y productividad para estas 20 líneas celulares seleccionadas que expresan el anticuerpo 5 ARGX-110 se estudiaron en cultivos de matraces oscilantes alimentados por lotes utilizando medio CDACF y los resultados se muestran en la Tabla 24. Las concentraciones de anticuerpos en la recolección variaron de 857 a 3922 mg/L, como se determina en una columna de HPLC con Proteína A. La línea celular F13 se seleccionó para inocular un biorreactor de bolsa de células de 10 L desechable. Se alcanzó una concentración de anticuerpo de recolección de 4327 mg/L. Esta línea celular alcanzó una concentración de anticuerpo en la recolección de 2711 mg/L en un 10 cultivo de matraz oscilante alimentado por lotes y tuvo la segunda tasa de producción específica más alta (2,22 pg/célula/h) de las 6 líneas celulares evaluadas (B1, D4, D5, F1, F13 y F18). Esta línea celular también exhibió características de crecimiento aceptables.
Tabla 24: Resumen de datos de crecimiento y productividad para 20 líneas celulares seleccionadas, que expresan 15 el anticuerpo ARGX-110, desarrolladas en cultivos de matraces oscilantes alimentados por lotes con CDACF.
Línea celular
Concentración máxima de células viables (106/ mL) IVC en la recolección(1) (109 cel.h/L) Viabilidad en la recolección (%) Concentración de anticuerpos en la recolección(2) (mg/L) Tasa de producción específica (9p)(3) (pg/célula/h)
A1
8,55 1276 47,1 1536 1,204
A9
4,01 1039 71,5 1033 0,994
B1
8,60 1777 69,9 3922 2,206
B2
5,22 1277 59,7 2938 2,301
D4
9,10 1957 79,5 3346 1,709
D5
7,84 1791 78,5 3258 1,819
D12
7,76 1635 91,2 1424 0,871
D20
7,66 1525 60,6 3130 2,052
D24
4,25 973 28,3 1133 1,164
D30
7,58 1492 93,4 2095 1,405
F1
8,55 1717 41,0 3704 2,157
F13
6,14 1224 46,0 2711 2,215
F18
7,80 1641 50,0 3301 2,011
F20
7,76 1812 68,2 2095 1,156
F21
7,95 1693 39,7 2008 1,186
F22
8,13 1953 87,9 1572 0,805
F29
9,16 1944 88,3 1435 0,738
F31
7,27 1453 73,9 1540 1,060
F33
5,67 1409 7,2 857 0,608
F34
10,04 2049 93,4 1328 0,648
(1) Integral tiempo de la concentración de células viables en la recolección.
(2) Determinado mediante HPLC con Proteína A.
(3) Calculado por análisis de regresión lineal de la concentración de anticuerpo contra la integral tiempo de la concentración de células viables.
Ejemplo 18 Afinidad de los mAb contra CD70
18.1 Afinidad por líneas celulares cancerosas que expresan CD70
Se analizaron varias líneas de células cancerosas mediante análisis FACS para determinar la unión de ARGX-110 y SGN70 (descrito en el documento US2010/0129362) a concentraciones saturantes de mAb (al menos 2 |jg/ml). Esto
se realizó a 4°C (1 hora de incubación de las células con los mAb) o a 37°C (15 minutos de incubación de las células con los mAb). La unión se detectó utilizando anticuerpo anti-hIgG1-Fc-FITC (AF006, Sitio de Unión) o anti-hIgG1-Fc- PE (eBioscience, 12-4998). La fluorescencia se midió utilizando un citómetro de flujo. Los resultados se resumen en la Tabla 25. La tercera columna de la tabla muestra si ARGX-110 se une con baja (+), media (++) o alta (+++) 5 afinidad a las diversas líneas celulares sometidas a ensayo.
En la columna de la derecha, la señal de FACS (IMF) para ARGX-110 se divide por la señal de FACS (IMF) para SGN70 para el experimento llevado a cabo a 37°C. Estos resultados demuestran que ARGX-110 se une con mayor afinidad a las células que SGN70, particularmente para líneas celulares con número de copias inferior en las que se 10 puede esperar que la unión de un anticuerpo de alta afinidad pueda recogerse más fácilmente.
Tabla 25: Unión de los mAb CD70 ARGX-110 y SGN70 a líneas celulares cancerosas
Tipo
Línea celular ARGX-110 Señal en FACS de ARGX-110/señal en FACS de SGN70
Linterna de Burkitt
Raji + + + 1,2
Linfoma de Células B Grandes
SU-DHL-6 + 2,4
Linfoma de Hodgkin
L428 + + + 1,4
Linfoma No Hodgkin
MHHPREB1 + + + 1,2
Mino + + + 1,0
Linfoma de células del manto
Jeko + + +
Granta 519
+ + 0,9
Rec-1 +
Mec1 + + + 1,2
Leucemia linfocítica crónica
JVM-3 + +
JVM-2 + 2,4
Linfoma cutáneo de células T
HUT78 + + + 1,0
HH
+ 1,7
U266 + + + 0,8
JNN-3 + + +
LP1 + +
Mieloma múltiple
AMO-1 + + +
RPMI8226
+ + +
MM1.S + +
KMS11 + + +
KMS12MB + + +
786-O + + + 2,1
Carcinoma de células renales
Caki-1 + + 1,9
A498 + + 1,0
Astrocitoma
U251 + + +
Carcinoma gástrico
MKN-45 + 10,6
Carcinoma de pulmón
A549 + 3,8
EBC-1
+ 8,9
WM1205-Lu + + +
Melanoma
WM852 +
WM3248 + + +
5
10
15
20
25
30
35
40
Tipo
Línea celular ARGX-110 Señal en FACS de ARGX-110/señal en FACS de SGN70
WM793
+
WM1552C
+ +
WM115
+ + +
Glioblastoma
GaMG +
U87MG
+ + 2,0
U343
+ +
Carcinoma de ovario
OAW-42 +
SKOV3
+
OVCAR3
+
Carcinoma pancreático
PANC-1 + + 2,9
PANC-89
+
En un experimento adicional, se determinó la afinidad de unión aparente de los mAb contra CD70, ARGX-110, SGN70 y MDX1411 [véase más arriba], a lo largo de un intervalo de concentraciones para diferentes líneas celulares. Las células se incubaron durante 1 hora a 4°C con una serie de diluciones de los mAb de unión a CD70 y se detectó la unión utilizando anticuerpo anti-hIgG1-Fc-FITC o anti-hIgG-Fc-PE. La fluorescencia se midió utilizando un citómetro de flujo y se representó la fluorescencia media. Los resultados se muestran en la Figura 15.
Los resultados demuestran que la afinidad de los tres mAbs diferentes por CD70 en las células es comparable, pero para algunas líneas celulares, SU-DHL-6, A549 y MKN45, la unión de ARGX-110 es superior en comparación con MDX1411 y SGN70. La CE50 para la unión a SU-DHL-6, A549 y MKN45 es mucho más alto para todos los mAb en comparación con CE50 en las otras líneas celulares como U266 y muchos otros, lo que probablemente indica que el mAb se une solo con un brazo (Fab), ya no permite la avidez y, por lo tanto, da como resultado afinidades menores. De hecho, cuando se prueba en Biacore, la afinidad del Fab de ARGX-110 frente a SGN70 y MDX1411 es mucho mayor (véase más abajo).
18.2 Afinidad por células de pacientes que expresan CD70
Las células primarias tomadas de pacientes con leucemia linfocítica crónica (LLC) (2 pacientes de alto riesgo, 1 paciente de bajo riesgo) se sembraron a 250.000 células/pocillo en placas de 96 pocillos de fondo redondo en RPMI 1640 + FBS al 10% y se añadieron los mAb a una concentración de 5 pg/ml en RPMI + FBS al 10%. Después de una incubación de hasta 5 horas a 37°C, las células se lavaron dos veces con PBS enfriado con hielo. Se diluyó anti- IgG humana de cabra Alexa Fluor 647 (Núm. Cat. 21445 de Invitrogen) 1/500 en PBS/BSA al 1% y se incubó durante 20 minutos a 4°C. La placa se lavó dos veces con PBS enfriado con hielo y se añadió paraformaldehído al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente para fijar las células. Las señales se midieron mediante FACS. Los resultados se muestran en la Figura 16. Los resultados demuestran que ARGX-110 se une bien a las células de los pacientes con LLC, mientras que SGN70 casi no dio señales de unión.
18.3 Afinidad de los Fab contra CD70 por CD70 recombinante en Biacore
La CD70 humana recombinante se inmovilizó en un chip CM5 Biacore. La inmovilización se realizó de acuerdo con un método proporcionado por Biacore y utilizando el kit NHS/EDC (Biacore AB): después de la activación del chip, se preparó una solución de 50 pg/ml de CD70 recombinante en tampón de acetato 10 mM con pH de 5 y se inyectó 1 pl de esta solución (50 ng) dando como resultado una densidad superficial de aproximadamente 1000 UR.
Los Fab se prepararon para los mAb contra CD70 ARGX-110, MDX1411 y SGN70 mediante digestión con papaína. Estos Fab, a una concentración de aproximadamente 100-400 pg/ml, se diluyeron 6 veces en solución salina tamponada con HEPES (HEPES 0,1 M, NaCl 1,5 M, EDTA 30 mM, tensoactivo p20 al 0,5% v/v). Se inyectaron (30 pl) y se pasaron a través de las celdas de flujo a un caudal de 30 pl/min. Después de la unión del Fab a CD70, la velocidad de disociación se controló durante un período de 10 minutos. Después de la disociación, las superficies de las celdas de flujo se regeneraron inyectando 5 pl de NaOH 10 mM. A veces, se necesitaban múltiples inyecciones de NaOH para regenerar las superficies, dependiendo de la afinidad de los Fab. El análisis de la velocidad de disociación se realizó aplicando el soporte lógico BIAevaluation. En primer lugar, el sensograma de las rondas en blanco se sustrajo de los obtenidos con la celda de flujo revestida. A continuación, se determinó la velocidad de disociación para un intervalo de tiempo de 10 minutos utilizando la aplicación cinética Fit y se calculó el valor de Kd.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Las velocidades de disociación se resumen en la Tabla 26.
Tabla 26: "Velocidad de disociación" de los Fab para la unión CD70 humana
Velocidad de disociación [10-4 s-1]
ARGX-110
1,4
SGN70
7
MDX1411
17
18.4 Experimentos de enriquecimiento para evaluar la lisis de células SU-DHL-6 a las que se unen mAb CD70
Se pipetearon células SU-DHL-6 (una línea celular de linfoma difuso de célula B grandes) a pocillos a 50.000 células/pocillo que a continuación se adicionaron a 300.000 PBMC recién aisladas/pocillo de donantes sanos y se añadieron los mAb a diferentes concentraciones. Las muestras se incubaron durante 2 días y se analizaron mediante FACS para determinar el agotamiento de la línea celular (tal como se midió con anti-CD19 humano con APC (eBioscience 17-0199-42)). La mejor potencia en la destrucción celular se obtuvo con ARGX-110, que también proporciona el mayor % de lisis. Los resultados se muestran en la Figura 17.
Ejemplo 19: Actividad de bloqueo de CD27-CD70 de los mAb contra CD70
La interacción entre CD70 y CD27 puede contribuir a la supervivencia, proliferación y/o supresión inmunológica de las células tumorales dentro del microentorno tumoral. La capacidad de los mAb contra CD70 para bloquear la interacción entre CD70 y CD27 se evaluó mediante ELISA.
En este ensayo, se recubrió primero una placa de microtitulación (Nunc Maxisorb) con 100 pl de anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2 (Sigma Aldrich, F3165) a una dilución de 1250 veces en PBS (para alcanzar una concentración final de aproximadamente 3,5 pg/ml) durante la noche a 4°C. La placa se lavó una vez con PBS- Tween y se incubó a RT durante 2 horas con 300 pl de PBS-caseína al 1%. La placa se lavó tres veces más con PBS-Tween. Se añadieron 100 pl de Flag-TNC-CD70 de 5 ng/ml (80 pM) (The Journal of Immunology, 2009, 183: 1851-1861) diluido en PBS, se añadió caseína al 0,1% a la placa y se incubó a RT durante 1 hora mientras se agitaba. La placa se lavó cinco veces con PBS-Tween. El mAb contra CD70 que se debía someter a ensayo se añadió a la placa; se lograron diversas concentraciones diluyendo la solución de partida de anticuerpo en PBS- caseína al 0,1%. Inmediatamente después, se añadieron 50 pl de quimera de Fc para CD27 humano recombinante de 1 pg/ml (concentración final 6,5 nM) (R&D Systems 382-CD, PM = 46,5 kDa), y se incubaron a RT durante 1 hora mientras se agitaba. La placa se lavó cinco veces con PBS Tween. Se añadieron 100 pl de anti-CD27 biotinilado (eBioscience 13-0271), diluido 500 veces en PBS-caseína al 0,1, y la placa se incubó a RT durante una hora más, mientras se agitaba. La placa se lavó cinco veces con PBS Tween. Se añadieron 100 pl de Strep-HRP (Jackson Immunoresearch 016-030-084) diluido 5000 veces en PBS-caseína al 0,1%, y la placa se incubó a RT durante una hora más, mientras se agitaba. La placa se lavó cinco veces con PBS-Tween. Se añadieron 100 pl de TMB a la placa y se midió la DO a 620 nm.
Utilizando este ensayo, la potencia de bloqueo de ARGX-110 se comparó con la potencia de SGN70 y MDX1411. Como se muestra en la Figura 18, ARGX-110 es mucho más potente (aproximadamente 100 veces) en el bloqueo de la interacción entre CD70 y CD27 que los dos mAb de referencia (CI50 ARGX-110 = 67 ng/ml, mDx1411 = 5500 ng/ml y SGN70 = 4972 ng/ml).
Ejemplo 20: Propiedades de unión de los mAb contra CD70
20.1 Reactividad cruzada con CD70 de especies no humanas
La determinación de la reactividad cruzada de los mAb contra CD70 es útil para evaluar qué modelos animales se pueden utilizar para prueba in vivo de estudios conceptuales, y qué especies son las más adecuadas para estudios de toxicología. CD70 de Rhesus es idéntica en 94% a CD70 humana y CD70 de mono Cynomolgus es idéntica en 95% a CD70 humana. En la Figura 19 se muestra un alineamiento de las secuencias de las diferentes especies. Las secuencias de CD70 de ratón y de rata también se incluyen para resaltar las diferencias en comparación con la secuencia humana.
Los mAb contra CD70 ARGX-110, SGN70 y MDX1411 se sometieron a ensayo para determinar su unión a U266 (una línea celular de mieloma múltiple humano), células LCL8664 (línea celular de linfoma de células B de rhesus, ATCC-CRL-1805) y a células HSC-F (línea de células T de mono cinomolgo, linfocitos derivados del bazo fetal, Fundación japonesa de ciencias de la salud) en una serie de diluciones que comienza a una concentración de 10-20 pg/ml.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
La detección se realizó utilizando anti-IgG1 humana de cabra con FITC. Las muestras se analizaron mediante FACS. Los resultados se muestran en la Figura 20. El número de copias de CD70 en ambas líneas de células de mono es muy bajo (señales bajas en FACS). Sin embargo, ARGX-110 tiene una alta afinidad por CD70 de cynomolgus y rhesus en comparación con la afinidad de SGN70 y MDX1411 por CD70 de estas especies.
20.2 Potencia de bloqueo de los mAb contra CD70
La capacidad de los mAb contra CD70 (ARGX-110, SGN70 y MDX1411) para bloquear la interacción entre CD70 y CD27 se sometió a ensayo utilizando el ELISA de bloqueo descrito en el Ejemplo 19 anterior. El ensayo se adaptó para medir la potencia de bloqueo de cada anticuerpo para Flag-TNC-CD70 humano, de mono rhesus y cinomolgo (Wyzgol, et al., J. Immunol., 2009, 183: 1851-1861).
En el ELISA, se utilizaron exactamente las mismas condiciones para CD70 de las diferentes especies, de modo que los valores de CI50 entre las diferentes especies se pudieron comparar directamente. Los resultados se muestran en la Figura 21 y respaldan los resultados observados utilizando células de seres humanos, monos rhesus y monos cinomolgos. ARGX-110 tiene una potencia inalterada y, por lo tanto, una afinidad inalterada por CD70 de monos en comparación con seres humanos, mientras que SGN70 y especialmente MDX1411 tienen una afinidad menor por CD70 de mono que de ser humano. Los valores de CI50 se resumen en la Tabla 27.
Tabla 27: CI50 para bloquear la interacción CD27-CD70 en ELISA para CD70 de diferentes especies
Células
CI50 [ng/ml] en ELISA de inhibición
Humano
Mono rhesus Mono cinomolgo
ARGX-110
39 75 48
SGN70
54 178 112
MDX1411
44 >10000 >10000
20.3 Unión a CD70 desnaturalizada
La unión de los mAb contra CD70 a CD70 recombinante desnaturalizada se evaluó mediante ELISA. La CD70 recombinante se desnaturalizó por calentamiento durante 5 minutos a 95°C, seguido de enfriamiento inmediato en hielo durante 5 minutos. Una placa de microtitulación se recubrió con 5 pg/ml de CD70 con o sin desnaturalización. La placa se bloqueó y los mAb contra CD70 para el ensayo se aplicaron a 10 pg/ml. Después del lavado, se detectó la unión de los mAb utilizando anti-IgG humana-HRP. Como control positivo para el recubrimiento, en lugar de utilizar los mAb contra CD70, se aplicó un mAb derivado de ratón anti-Flag y la detección fue con HRP anti-ratón. Se usó TMB como sustrato y se midió la DO a 620 nm. Los resultados de este ELISA se muestran en la Figura 22. Los resultados demuestran que ARGX-110 se une a un epítopo diferente que SGN70, MDX1411 (MDX2H5) y MDX69A7 ya que ARGX-110 aún se une a CD70 desnaturalizada mientras que los otros mAb no lo hacen. Entre los otros mAb, algunos también se unen a CD70 desnaturalizada (fe 5F4, 9G2, 57B6).
20.4 Mapeo de epítopos utilizando quimeras de ratón-humano
Se construyeron proteínas de fusión de ECD de CD70 humano-ratón intercambiando dominios de CD70 humana y de ratón con el fin de mapear el reconocimiento de dominio de los mAb. La construcción se realizó utilizando ADN recombinante convencional y metodologías de PCR. Las quimeras de ratón y humanas se clonaron en un vector de expresión eucariótico con una etiqueta Flag para capturar en ELISA y una TNC para la trimerización de la proteína (Flag-TNC-CD70). Las proteínas se expresaron como proteínas solubles en células HEK293. La secuencia de las diferentes quimeras se muestra en la Figura 23.
Se recubrió una placa de microtitulación Maxisorb (Nunc) con mAb anti-Flag M2 de ratón de 3,5 pg/ml (Sigma Aldrich, F3165) y se capturaron las diferentes quimeras. Se aplicó una serie de diluciones de los mAb contra CD70 que se debían someter a ensayo comenzando a una concentración de 10 pg/ml y realizando diluciones 1:3. Después de 2 horas, se detectó la unión utilizando anti-Fc-humano-HRP a una dilución de 16000 veces. La tinción se realizó con ABTS y se midió la DO a 405 nm. Como control positivo, se aplicó CD27-Fc que es capaz de unirse a CD70 humana y de ratón con buena afinidad, así como a las variantes quiméricas humanas de CD70 de ratón. Los valores de CE50 para la unión se resumen en la Tabla 28.
Tabla 28: Unión de ARGX-110 a quimeras CD70 humana-murino mostradas en la Figura 23.
CE50 [ng/ml]
ARGX-110 CD27
humano
22 79
5
10
15
20
25
30
35
40
45
CE50 [ng/ml]
ARGX-110 CD27
quim-1
27 159
quim-2.1
15 51
quim-2.2
16 56
quim-2.3
15
quim-2.4
14 76
quim-2
NB 99
quim-3
NB 94
quim-4
NB 51
ratón
NB 41
NB = sin unión
Los resultados demuestran que ARGX-110 se puede unir a Flag-TNC-CD70 humana y a las quimeras 1, 2.1, 2.2, 2.3 y 2.4 pero no se une a las quimeras 2, 3 y 4 y a Flag-TNC-CD70 de ratón. Esto indica que el epítopo para ARGX- 110 está dentro de la siguiente secuencia de aminoácidos: HIQVTLAICSS (SEQ ID NO: 342).
Ejemplo 21: intemalización de CD70 de diferentes líneas celulares tumorales y células de tumor primario
Se ha demostrado que la unión de anticuerpos contra CD70 a las líneas celulares derivadas de carcinoma renal 7860 y A498 da como resultado la internalización rápida (en 1 hora) del complejo anticuerpo-receptor (Adam et al., Br. J. Cancer (2006) 95: 298 - 306). Con el fin de someter a ensayo la internalización de los mAb ARGX-110, SGN70 y MDX1411, las células 786-0 se cultivaron en una placa de microtitulación de 96 pocillos y se incubaron durante la noche a 37°C. Se añadieron 2,5 pg/ml de mAb y se incubaron con las células durante 0-24 horas a 37°C. Las placas se lavaron 3 veces 5' con tampón para retirar anticuerpos unidos a membranas (NaCl 150 mM, glicina 100 mM, pH = 2,5; codificado "IN" que representa la cantidad de mAb internalizado a través de CD70) o PBS (codificado "OUT" y que representa la cantidad de mAb unido al receptor en el exterior de la célula). Posteriormente, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 30' a temperatura ambiente, se lavaron con PBS, y se incubaron 5' con Triton- X-100 al 0,2% ("IN") o PBS ("OUT"). A continuación, las células se lavaron dos veces y se incubaron a RT durante 10 minutos con glicina 100 mM seguido de 30 minutos de incubación con PBS + BSA al 1%. Finalmente, las células se tiñeron con anti-Fc humano de cabra (Jackson immunoresearch 109-005-098) y anti-IRDYE800 de cabra (Li-cor 926-32214) antes del análisis en el escáner de infrarrojos Li-Cor Odyssey. El % de mAb OUT en función del tiempo se muestra en la Figura 24.
Los resultados demuestran que la internalización para todos los mAb es comparable y que ninguno de los mAb se internaliza por completo. Inicialmente, entre 0 y 2 horas, la internalización del mAb es muy rápida, pero parece que se alcanza un estado estacionario en el que aproximadamente 30% del mAb permanece en el exterior de la célula, incluso después de 24 horas de incubación a 37°C .
La internalización de los mAb unidos a CD70 también se evaluó utilizando otras líneas celulares. En estos experimentos, solo se midió la señal del mAb fuera de la célula como una función del tiempo utilizando análisis FACS de acuerdo con el protocolo descrito a continuación. Se determinó que este protocolo alternativo es una lectura fiable en comparación con el método descrito anteriormente (véase la Figura 24, panel derecho).
Para las células en suspensión, las células se centrifugaron, se contaron y el sedimento se resuspendió en un medio hasta una densidad de 5 x 105 células/ml, y se añadieron 100 pl de esta suspensión por pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo en V. Para las células adherentes, las células se sembraron en una placa de 96 pocillos y se dejaron crecer a 37°C, 5% de CO2 hasta que las células estuvieron completamente unidas. Las células se sembraron en placa a una densidad que permitió el crecimiento celular lineal durante un período adicional de 48 h.
Los mAb para el ensayo se diluyeron y se incubaron con las células a 37°C, 5% de CO2 durante períodos de tiempo variables: 24 h, 8 h, 6 h, 4 h, 2 h, 1 h, 30 min, 15 min, 5 min, 0 min (= sin mAb). Después de la incubación, las placas se lavaron en hielo con tampón FACS frío para detener la reacción de internalización. En esta etapa, las células adherentes se separaron de la placa utilizando una solución de disociación celular (Sigma) y se transfirieron a una placa de 96 pocillos con fondo en V. A continuación, las células se centrifugaron a 4°C. El sobrenadante se eliminó invirtiendo suavemente la placa. Las células se lavaron dos veces volviendo a suspender suavemente el sedimento celular en 100 pl de tampón FACS frío. Después del lavado, el sedimento celular se resuspendió en 100 pl de anti- IgG hu-FITC, diluido 1/500 en tampón FACS. La placa se incubó durante 30 minutos a 4°C, mientras se agitaba, y
las células se lavaron tres veces más con tampón FACS frío. Las células se resuspendieron en 100 |jl de tampón FACS y se midió la fluorescencia inmediatamente. La mediana de la intensidad de fluorescencia media (IMF) se trazó en función del tiempo.
5 Varios de los experimentos se repitieron dos o más veces. Los resultados de dos experimentos fueron muy comparables. En algunos experimentos, utilizando células U266, SU-DHL-6 y Raji, se utilizó un intervalo de concentración (20 ng/ml - 5 jg/ml) para ver si había un efecto de la concentración de mAb sobre la velocidad de internalización. No se observó tal efecto (datos no mostrados).
10 Los resultados para diferentes líneas celulares sometidas a ensayo se muestran en la Tabla 29 y demuestran que la internalización no es un fenómeno común, en realidad es un evento bastante raro. La Tabla 29 resume el porcentaje de internalización después de 6 horas para las diferentes líneas celulares. Estos resultados muestran que la mayoría de ARGX-110 permanece unido al exterior de las células, haciendo que las células sean más susceptibles a ADCC, CDC y ADCP.
15
Tabla 29: % de internalización de los mAb contra CD70 en diferentes líneas celulares después de 6 horas.
Tipo
Línea celular % de internalización después de 6 horas % Promedio por indicación
Linfoma de Burkitt
Raji 2 2
Linfoma de células B grandes
SU-DHL-6 3 3
Linfoma de Hodgkin
L428 15 15
Linfoma no Hodgkin
MHHPREB1 19 19
Linfoma de células del manto
Mino 12 7
Granta 519
7
Rec-1
2
Leucemia linfocítica crónica
Mec1 3 7
JVM-2
8
JVM-3
11
Paciente HR
5
Paciente HR
7
Paciente LR
8
Linfoma cutáneo de células T
HUT78 35 33
HH
31
Mieloma múltiple
U266 38 34
AMO-1
36
RPMI8226
38
MM1.S
35
KMS12MB
49
Carcinoma de células renales
786-O 58 54
Caki-1
37
A498
66
Astrocitoma
U251 52 52
Carcinoma gástrico
MKN-45 0 0
Carcinoma de pulmón
A549 0 3
EBC-1
6
Melanoma
WM1205-Lu 45 44
Tipo
Línea celular % de internalización después de 6 horas % Promedio por indicación
WM3248 34
WM115 52
Glioblastoma
U87MG 10 21
U343 32
Carcinoma de ovario
SKOV3 51 51
Carcinoma pancreático
PANC-1 29 25
PANC-89 20
Tabla 30: secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos contra CD70 seleccionados
mAb
41D12
Cadena pesada SEQ ID NO: 344 accaccaccAT GGGCTGGTCCTG C ATC ATCCTGTTTCTG GTG GCC AC CGCCACAGGCGTCCACTCTGAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGG GGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTG CAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGTCTACTACATGAACTGGGTC CGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTCGAGTGGGTCTCAGATATTA ATAATGAAGGTGGTACTACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGC CGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCTAAGAACAGCCTGTATCT GCAAATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGACACGGCCGTGTACTAC TGCGCGAGAGATGCCGGATATAGCAACCATGTACCCATCTTTGA TTCTTGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACTGTCTCCTCAGCCAGTA CAAAAG GT CC AAGTGT GTTCCCT CTTGCT CCCT C AT CC AAG AGT A CCAGTGGAGGCACCGCCG CTCTTGG CTG CTTG GTTAAG G ATTAT TT CCCAG AGCCT GT CACTGTTT CATGG AACT CCGGCGCCTT G ACA TCTGGTGTGCATACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGTCAAGTGGCCTC TAC AG CCTCAGTAG CGTG GTCACTGTG CCCAG CAGCTCTCTCG G CAC AC AAACTT AT ATCTGT AAT GT G AAT C AT AAG CCTT C AA AT ACC AAG GT G G AT AAG AAAGTG G AACC AAAAT C AT GT G AC AAG AC AC AC ACCTGCCCTCCTTGTCCAGCCCCCGAACTGCTGGGTGGGCCCAG CGTGTT CCT GTTT CCTCCT AAACCC AAAG AC ACT CTG ATG ATT AGT AGGACCCCAGAAGTCACTTGCGTGGTGGTTGACGTGTCACATGA AGATCCCGAGGTCAAGTTCAATTGGTATGTTGACGGGGTCGAAGT T CACAACGCT AAAACT AAACC AAG AG AGG AACAGT AT AACT CT AC CTACCGGGTGGTGAGTGTTCTGACTGTCCTCCATCAAGACTGGCT G AATGGCAAAG AAT ACAAGTGT AAGGTG AGCAACAAAGCCCTGC CCGCT CCT AT AG AG AAAAC AAT AT CCAAAGCCAAAGGTCAACCT C GCGAGCCACAGGTGTACACCCTCCCACCAAGCCGCGATGAACTT ACT AAG AACCAAGTCT CT CTT ACTTGCCT GGTT AAGGGGTT CT AT CCATCCGACATTGCAGTCGAGTGGGAGTCTAATGGACAGCCTGA G AAC AACT AC AAAACC ACCCCT CCTGTT CT G G ATT CTG ACGG ATC TTT CTT CCTTT ATT CT AA ACT C AC CG TG G AT AA AAG CAGGTGGCAG CAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTTATGCATGAGGCCCTGCA T AACC ATT AT ACCC AG AAGTCTTT GTCCCT C AGT CC AGG AAAGT G A
kozak
LÍDER
REGIÓN VARIABLE
REGIÓN CONSTANTE LAMBDA
Cadena ligera SEQ ID NO: 345
mAb
accaccacc AT GGGCTGGTCCTG C ATC ATCCTGTTTCTG GTG GCC AC CGCCACAGGCGTCCACTCTCAGGCAGTGGTGACCCAGGAGCCT
TCCCTGACAGTGTCTCCAGGAGGGACGGTCACGCTCACCTGCG GCCTCAAATCTGGGTCTGTCACTTCCGATAACTTCCCCACTTGGT ACCAGCAGACACCAGGCCAGGCTCCCCGATTGCTTATCTACAA CACAAACACCCGTCACTCTGGCGTCCCCGACCGCTTCTCCGGAT CCATCCTGGGCAACAAAGCCGCCCTCACCATCACGGGGGCCCA GGCCGACGACGAGGCCGAATATTTCTGTGCTCTGTTCATAAGTA ATCCTAGTGTTGAGTTCGGCGGAGGGACCCAACTGACCGTCCTA GGTCAACCT AAAGC AG C ACCTT C AGTT ACT CT GTTT CC ACCT AGT T CAG AGG AACTGCAGGCCAAT AAAGCC AC ACT CGTCTGCCT CAT CAGTGACTTCTACCCAGGAGCCGTGACCGTGGCCTGGAAAGCCG ACAGTAGCCCCGTGAAGGCCGGGGTGGAGACAACAACTCCTAGT AAAC AG AGT AAT AAC AAAT ATGCCG CT AGT AGTT AT CT CTCCCT C A CT CCCG AGCAGTGG AAGT CT CACAG AAGTT ACT CTT GT CAGGTT A
CT CACG AGGGTT CCACAGTGG AAAAG ACTGTGGCCCCT ACT G AA TGTAGTTGA
kozak
LÍDER
REGIÓN VARIABLE
REGIÓN CONSTANTE LAMBDA
57B6
Cadena pesada SEQ ID NO: 346 CAGTTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTG GGGGGTCTCTGAGACTC T CTT GTGCAGCCT CTGG ATT C AGCTT CAGTCACT ATGCCAT G AGC TGGGTCCGCCAGGCT CCAGGAAAGGGGCTAGAGTGGGTCTCAGGTGATAATACCTACGA TGGTG GTACAAG GTAT CAAG ACT CCGTG AAGGGCCG ATT CACCAT CT CCAG AG ACAATGG CAAGAACACG CTGTAT CTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTGTATTA CTGTGCAAAAGATACT GGTAGAGGCATTATGGGGGAGTACGGCATGGACTACTGGGGCAA AGGGACCCTGGTCACC GTCTCCTCA
Cadena ligera SEQ ID NO: 347 CAGACTGTGGTGACCCAGGAGCCGTCCCTGTCAGTGTCTCCAGG AGGGACGGTCACACTC ACCTGCGGCCT CAAGTCT G GGTCT GT CACTT CCAGT AACT ACCCT GCTTGGTACCAGCAG ACACCAGGCC AGGCT CCCCG ATTGCTT AT CT AC AAC ACA AAC AGC CGTCACTCTGGGGTC CCCAGTCGCTTCTCCGGATCCATCTCTGGGAACAAAGCCGCCCT CACCATCACGGGGGCC CAGCCCGAGGACGAGGCCGACTATTACTGTGCTCTGTACATGGG TAGTGGTAGTGCCAAT GCTATGTTCGGCGGAGGGACCCATCTGACCGTCCTGGGTCA
59D10
Cadena pesada SEQ ID NO: 348
mAb
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTG GGGGGTCTCTGAGACTC T CCT GTGC AGCGT CCG AATT GT CCTT C AGT ATTT CT G AG ATG ACC TGGGTCCGCCAGGCT CCAGGAAAGGGGCTCGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTGGTGTAAC TGGTGGTAGTAGTACA AGTT ATGCAG ACT CCGT G AAGGGCCG ATT CACCAT CT CCAG AG A CAACGACAAGAACACG TTGTAT CT AC AAAT G AAC AG CCT G AT ACCCG AG G AC ACGG CCGT A TATTACTGTGCAACA ACTAGTGGTACTTACTACTTCATCCCCGAGTATGAGTACTGGGGC CAGGGGACCCAGGTC ACCGT CT CCT CA
Cadena ligera SEQ ID NO: 349 CAGTCTGTGCTGACCCAGCCTCCCTCCGTGTCTGGGTCTCCAGG AAAGACG GTCACCATC TCCTGTGCAGGAACCAGCAGTGATGTTGGGTATGGATACTATGTC TCCTGGTATCAACAG TT CCC AG G AAT G GCCCCC AAACT CCTG AT AT ATG ACGTC AAT AAA CGGGCCTCAGGGATC GCT G AT CGCTT CT CTGGCT CCAAGGCCGGCAACACTGCCT CCCT G ACC ATCTCTG GG CTC CAGTCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGTGCCTCATATAGAAGT AGCGCCAATGCTGTG TTCGGCGGAGGGACCCATCTGACCGTCCTGGGT

Claims (13)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    1. Un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen a CD70 humana, comprendiendo dichos anticuerpo o fragmento de unión a antígeno al menos un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una CDR3 de cadena pesada variable, una CDR2 de cadena pesada variable y una CDR1 de cadena pesada variable y al menos un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR3 de cadena ligera variable, una CDR2 de cadena ligera variable y una CDR1 de cadena ligera variable
    en donde la CDR3 de cadena pesada variable comprende o consiste en SEQ ID NO: 50 (DAGYSNHVPIFDS); la CDR2 de cadena pesada variable comprende o consiste en la SEQ ID NO: 27 (DINNEGGTTYYADSVKG); la CDR1 de cadena pesada variable comprende o consiste en SEQ ID NO: 11 (vYyMN);
    la CDR3 de cadena ligera variable comprende o consiste en SEQ ID NO: 160 (ALFIsNpSVE); la CDR2 de cadena ligera variable comprende o consiste en la SEQ ID NO: 119 (NTNTRHS); y
    la CDR1 de cadena ligera variable comprende o consiste en SEQ ID NO: 250 (GLKSGSVTSDNFPT).
  2. 2. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1, que comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 223, o una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos 90%, 95%, 97 %, 98% o 99% a la misma, y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 241, o una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos 90%, 95%, 97% , 98% o 99% a la misma.
  3. 3. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 2, que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 223, y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende o que consiste en secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO:241
  4. 4. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que es un anticuerpo quimérico de llama-humano, en donde los dominios VH y VL derivan de llama y uno o más de los dominios constantes derivan de una inmunoglobulina humana, y que comprende opcionalmente la región bisagra, el dominio CH2 y el dominio CH3 de una IgG humana, preferiblemente una IgG1 humana.
  5. 5. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que muestra una o más funciones efectoras seleccionadas entre citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno exhibe opcionalmente una potenciación de la función de ADCC en comparación con un anticuerpo equivalente que comprende un dominio Fc humano nativo, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCP) contra células que expresan CD70 humana en la superficie celular, tales como células cancerosas que expresan CD70.
  6. 6. Un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores que es una IgG no fucosilada, preferiblemente una IgG1 humana no fucosilada.
  7. 7. Un polinucleótido aislado que codifica el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
  8. 8. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de la reivindicación 7 conectado operativamente a secuencias reguladoras que permiten la expresión del polipéptido de unión a antígeno en una célula anfitriona o sistema de expresión libre de células.
  9. 9. Una célula anfitriona o sistema de expresión libre de células que contiene el vector de expresión de la reivindicación 8.
  10. 10. Un método para producir un anticuerpo recombinante o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende cultivar la célula anfitriona o sistema de expresión libre de células de la reivindicación 9 en condiciones que permiten la expresión del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno y recuperar el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno expresados.
  11. 11. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y al menos un portador o excipiente farmacéuticamente aceptables.
  12. 12. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en
    (a) la inhibición del crecimiento de células tumorales que expresan CD70 en un paciente humano; o
    (b) el tratamiento o la prevención del cáncer en un paciente humano, en donde dicho cáncer es opcionalmente un cáncer que exhibe una baja expresión del número de copias de CD70.
  13. 13. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en el tratamiento o la prevención del cáncer en un paciente humano que se selecciona del grupo que consiste en: linfoma de células B grandes, leucemia linfocítica crónica, linfoma de Burkitt, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma de células del manto, carcinoma pancreático, linfoma cutáneo de células T, cáncer 5 gástrico, cáncer de pulmón, melanoma, glioblastoma y cáncer de ovario.
ES12710486.7T 2011-03-16 2012-03-16 Anticuerpos contra CD70 Active ES2670874T3 (es)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161453390P 2011-03-16 2011-03-16
US201161453390P 2011-03-16
US201161503871P 2011-07-01 2011-07-01
US201161503871P 2011-07-01
PCT/EP2012/054733 WO2012123586A1 (en) 2011-03-16 2012-03-16 Antibodies to cd70

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2670874T3 true ES2670874T3 (es) 2018-06-01

Family

ID=45878935

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES12710486.7T Active ES2670874T3 (es) 2011-03-16 2012-03-16 Anticuerpos contra CD70

Country Status (18)

Country Link
US (6) US9765148B2 (es)
EP (1) EP2686347B1 (es)
JP (2) JP5982409B2 (es)
CN (1) CN103596979B (es)
AU (1) AU2012228194B2 (es)
BR (1) BR112013021562B1 (es)
CA (1) CA2828753C (es)
CY (1) CY1120471T1 (es)
DK (1) DK2686347T3 (es)
ES (1) ES2670874T3 (es)
HU (1) HUE039849T2 (es)
IL (1) IL228001B (es)
PL (1) PL2686347T3 (es)
PT (1) PT2686347T (es)
RU (1) RU2604196C2 (es)
SI (1) SI2686347T1 (es)
TR (1) TR201807202T4 (es)
WO (1) WO2012123586A1 (es)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2282773B1 (en) 2008-05-02 2014-01-15 Seattle Genetics, Inc. Methods and compositions for making antibodies and antibody derivatives with reduced core fucosylation
PT2686347T (pt) 2011-03-16 2018-07-05 Argenx Bvba Anticorpos dirigidos contra cd70
EP3508215A3 (en) * 2012-12-03 2019-10-02 Bristol-Myers Squibb Company Enhancing anti-cancer activity of immunomodulatory fc fusion proteins
EP3457138A3 (en) * 2013-04-30 2019-06-19 Université de Montréal Novel biomarkers for acute myeloid leukemia
EP3041868A2 (en) * 2013-09-05 2016-07-13 Aduro Biotech Holdings, Europe B.V. Cd70-binding peptides and method, process and use relating thereto
US10391168B1 (en) 2014-08-22 2019-08-27 University Of Bern Anti-CD70 combination therapy
KR102390359B1 (ko) * 2014-09-29 2022-04-22 삼성전자주식회사 폴리펩타이드, 이를 포함하는 항 VEGF 항체 및 항 c-Met/항 VEGF 이중 특이 항체
US20180244792A1 (en) * 2015-09-10 2018-08-30 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Anti-fibrotic effect of cd70
EP3621981A2 (en) 2017-05-12 2020-03-18 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for engineering cells and uses thereof in immuno-oncology
US11166985B2 (en) 2017-05-12 2021-11-09 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for engineering cells and uses thereof in immuno-oncology
GB2567613A (en) 2017-06-16 2019-04-24 Argenx Bvba Treatment for acute myeloid leukaemia
CA3080103A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Staten Biotechnology B.V. Anti-apoc3 antibodies and methods of use thereof
GB201800649D0 (en) 2018-01-16 2018-02-28 Argenx Bvba CD70 Combination Therapy
EP3694546A1 (en) 2018-01-30 2020-08-19 Cellectis Combination comprising allogeneic immune cells deficient for an antigen present on both t-cells and pathological cells and therapeutic antibody against said antigen
TW201936633A (zh) 2018-02-01 2019-09-16 美商輝瑞大藥廠 標靶至cd70的嵌合抗原受體
BR112020015641A2 (pt) * 2018-02-01 2021-01-05 Pfizer Inc. Anticorpos específicos para cd70 e seus usos
EP3790629A1 (en) 2018-05-11 2021-03-17 CRISPR Therapeutics AG Methods and compositions for treating cancer
US20220047634A1 (en) * 2018-11-30 2022-02-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Chimeric antigen receptor factories and methods of use thereof
TW202038958A (zh) 2018-12-18 2020-11-01 比利時商阿根思公司 Ｃｄ７０組合治療
US20220249558A1 (en) 2019-04-30 2022-08-11 Crispr Therapeutics Ag Allogeneic cell therapy of b cell malignancies using genetically engineered t cells targeting cd19
RU2738802C1 (ru) * 2019-08-21 2020-12-17 Общество с ограниченной ответственностью "Международный Биотехнологический Центр "Генериум" Определяющие комплементарность участки для связывания cd3 и содержащая их биспецифическая антигенсвязывающая молекула
CN111909966B (zh) * 2020-04-01 2021-09-21 苏州克睿基因生物科技有限公司 一种制备经修饰的免疫细胞的方法
KR20230030632A (ko) 2020-06-30 2023-03-06 지앙수 헨그루이 파마슈티컬스 컴퍼니 리미티드 항-cd70 항체 및 이의 적용
US20230266332A1 (en) 2020-07-28 2023-08-24 Inserm (Institut National De La Santè Et De La Recherch Médicale) Methods and compositions for preventing and treating a cancer
WO2022104109A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Catamaran Bio, Inc. Genetically modified natural killer cells and methods of use thereof
US20240024475A1 (en) 2020-12-01 2024-01-25 Cure Genetics Co., Ltd Antigen-Binding Protein Targeting CD70 and Use Thereof
CN114685657A (zh) * 2020-12-31 2022-07-01 康诺亚生物医药科技（成都）有限公司 一种功能增强型抗体阻断剂的开发及其应用
CN113292653B (zh) * 2021-06-17 2022-11-11 南京蓝盾生物科技有限公司 具有增强的adcp效应的抗cd70抗体及其应用
CN113754769B (zh) * 2021-10-13 2023-06-06 宜明昂科生物医药技术（上海）股份有限公司 靶向cd70的抗体及其制备和用途
WO2024040194A1 (en) 2022-08-17 2024-02-22 Capstan Therapeutics, Inc. Conditioning for in vivo immune cell engineering

Family Cites Families (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
US5859205A (en) * 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5573924A (en) 1992-09-08 1996-11-12 Immunex Corporation CD27 ligand
DE19747418C1 (de) 1997-10-27 1999-07-15 Deutsches Krebsforsch Inhibitor-Protein des wnt-Signalwegs
US6500633B1 (en) 2000-04-26 2002-12-31 Atairgin Technologies, Inc. Method of detecting carcinomas
US20030148321A1 (en) 2001-08-24 2003-08-07 Iris Pecker Methods and kits for diagnosing and monitoring hematopoietic cancers
US20070072178A1 (en) 2001-11-05 2007-03-29 Torsten Haferlach Novel genetic markers for leukemias
US7261892B2 (en) 2001-11-27 2007-08-28 Celltech R&D Limited Methods for diagnosis and treatment of epithelial-derived cancers
ES2394018T3 (es) 2001-11-27 2013-01-15 Ucb Pharma S.A. Procedimientos para el diagnóstico y el tratamiento de cánceres derivados de células epiteliales
US8404716B2 (en) 2002-10-15 2013-03-26 Celgene Corporation Methods of treating myelodysplastic syndromes with a combination therapy using lenalidomide and azacitidine
US8039218B2 (en) 2002-11-14 2011-10-18 John Wayne Cancer Institute Detection of cancer cells in body fluids
US20080025989A1 (en) 2003-02-20 2008-01-31 Seattle Genetics, Inc. Anti-cd70 antibody-drug conjugates and their use for the treatment of cancer and immune disorders
US7662387B2 (en) 2003-02-20 2010-02-16 Seattle Genetics Anti-cd70 antibody-drug conjugates and their use for the treatment of cancer and immune disorders
EA009026B1 (ru) 2003-03-24 2007-10-26 Займоджинетикс, Инк. Антитела против il-22ra, их партнеры по связыванию и способы их применения при воспалениях
BRPI0511782B8 (pt) * 2004-06-03 2021-05-25 Novimmune Sa anticorpos anti-cd3, uso e método de produção dos mesmos, composição farmacêutica, molécula de ácido nucleico isolada e vetor
US8337838B2 (en) 2004-10-15 2012-12-25 Seattle Genetics, Inc. Anti-CD70 antibody and its use for the treatment and prevention of cancer and immune disorders
US7641903B2 (en) 2004-10-15 2010-01-05 Seattle Genetics, Inc. Anti-CD70 antibody and its use for the treatment and prevention of cancer and immune disorders
EP1799262A4 (en) 2004-10-15 2009-10-21 Seattle Genetics Inc ANTI-CD70 ANTIBODIES AND ITS USE FOR THE TREATMENT AND PREVENTION OF CANCER DISORDERS AND IMMUNE DISORDERS
MX2007004770A (es) 2004-10-22 2007-11-22 Zymogenetics Inc Anticuerpos anti-il-22ra y moleculas y metodos para usarlos en inflamacion.
US20060275844A1 (en) 2005-04-19 2006-12-07 Linke Steven P Diagnostic markers of breast cancer treatment and progression and methods of use thereof
AU2006236225C1 (en) * 2005-04-19 2013-05-02 Seagen Inc. Humanized anti-CD70 binding agents and uses thereof
WO2007011856A2 (en) 2005-07-15 2007-01-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Compositions and methods for differential diagnosis of chronic lymphocytic leukemia
CN101370830A (zh) * 2005-09-26 2009-02-18 米德列斯公司 抗cd70的人单克隆抗体
ES2527961T3 (es) 2005-09-26 2015-02-02 Medarex, L.L.C. Anticuerpos monoclonales humanos para CD70
US7723477B2 (en) 2005-10-31 2010-05-25 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting Wnt-dependent solid tumor cell growth
WO2007064919A2 (en) * 2005-12-02 2007-06-07 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
MX363905B (es) 2006-06-12 2019-04-08 Aptevo Res & Development Llc Proteinas de union multivalentes monocatenarias con funcion efectora.
PL2099823T5 (pl) * 2006-12-01 2023-02-20 Seagen Inc. Wariant środków wiążących cel i jego zastosowania
MX2009006277A (es) * 2006-12-14 2009-07-24 Medarex Inc Anticuerpos humanos que se enlazan a cd70 y usos de los mismos.
AR062123A1 (es) * 2007-07-27 2008-10-15 Inst Nac De Tecnologia Agropec Dominio vhh monomerico derivado de anticuerpos de camelidos anti-vp6 dominio dimerico, metodo de inmunodeteccion de rotavirus, composiciones, metodos de prevencion y tratamiento de infecciones con rotavirus
KR100807069B1 (ko) 2007-09-21 2008-02-25 고려대학교 산학협력단 암 치료용 의약 조성물
EA201000673A1 (ru) 2007-11-05 2011-04-29 Новартис Аг СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ АКТИВАЦИИ Wnt И ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ Wnt-ОПОСРЕДОВАННЫХ РАКОВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
EP2276509B1 (en) * 2008-04-11 2016-06-15 Seattle Genetics, Inc. Detection and tratment of pancreatic, ovarian and other cancers
US20110165620A1 (en) 2008-05-28 2011-07-07 Roland Romijn Method for the production of proteins or protein fragments
GB2461546B (en) * 2008-07-02 2010-07-07 Argen X Bv Antigen binding polypeptides
WO2010014948A1 (en) 2008-08-01 2010-02-04 The University Of Utah Research Foundation Methods of treatment using wnt inhibitors
US20110190157A1 (en) 2008-08-15 2011-08-04 The Regents Of The University Of California Biomarkers for Diagnosis and Treatment of Chronic Lymphocytic Leukemia
SG190568A1 (en) 2008-09-26 2013-06-28 Oncomed Pharm Inc Frizzled-binding agents and uses thereof
US9260508B2 (en) * 2008-12-19 2016-02-16 Ablynx N.V. Method for generation of immunoglobulin sequences
ES2571235T3 (es) 2009-04-10 2016-05-24 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Procedimiento para el tratamiento de un tumor sanguíneo que utiliza el anticuerpo anti-TIM-3
BR112012002854B1 (pt) 2009-08-10 2020-02-18 Samumed, Llc Composto ou sal farmaceuticamente aceitável, composição farmacêutica e uso dos mesmos
US20120178111A1 (en) 2009-09-23 2012-07-12 Diamandis Eleftherios P Methods and compositions for the detection of lung cancers
CA2778864C (en) 2009-11-19 2017-06-27 Merck Serono S.A. Humanized antibodies against human il-22ra
RU2012132442A (ru) 2009-12-29 2014-02-10 Киова Хакко Кирин Ко., Лтд. Антитело к cd27
GB2476681B (en) 2010-01-04 2012-04-04 Argen X Bv Humanized camelid VH, VK and VL immunoglobulin domains
KR101846590B1 (ko) 2010-06-11 2018-04-09 교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤 항 ｔｉｍ-3 항체
US9403906B2 (en) 2011-01-19 2016-08-02 Cantargia Ab Method of treatment of a solid tumor with interleukin-1 accessory protein antibody
PT2686347T (pt) * 2011-03-16 2018-07-05 Argenx Bvba Anticorpos dirigidos contra cd70
WO2013006490A2 (en) 2011-07-01 2013-01-10 Cellerant Therapeutics, Inc. Antibodies that specifically bind to tim3
KR102007055B1 (ko) 2011-09-22 2019-08-02 암젠 인크 Cd27l 항원 결합 단백질
GB2504139B (en) * 2012-07-20 2014-12-31 Argen X Bv Antibodies to highly conserved targets produced by the immunisation of Camelidae species
WO2013093508A2 (en) 2011-12-22 2013-06-27 Oslo University Hospital Hf Wnt pathway inhibitors
EP2825200A4 (en) 2012-03-15 2015-08-26 Janssen Biotech Inc HUMAN ANTI-CD27 ANTIBODIES, METHODS AND USES THEREOF
KR20140145148A (ko) 2012-03-21 2014-12-22 에리테끄 파르마 급성 골수성 백혈병 치료를 위한 약제
US9801851B2 (en) 2012-05-23 2017-10-31 St. Jude Children's Research Hospital Methods and compositions for the treatment of BCR-ABL positive lymphoblastic leukemias
ES2649673T3 (es) 2012-06-15 2018-01-15 Curegenix Inc. Compuesto como inhibidor de la señalización WNT, composición, y uso del mismo
IN2015DN00140A (es) 2012-08-31 2015-06-12 Argen X Bv
WO2014045101A1 (en) 2012-09-21 2014-03-27 Cellzome Gmbh Tetrazolo quinoxaline derivatives as tankyrase inhibitors
WO2014100772A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Cellerant Therapeutics, Inc. Antibodies that bind membrane-bound il1rap
WO2014126836A1 (en) 2013-02-14 2014-08-21 Bristol-Myers Squibb Company Tubulysin compounds, methods of making and use
JOP20200096A1 (ar) 2014-01-31 2017-06-16 Children’S Medical Center Corp جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها
SG11201607143UA (en) 2014-03-11 2016-09-29 Univ Leland Stanford Junior Anti sirp-alpha antibodies and bi-specific macrophage enhancing antibodies
WO2016111947A2 (en) 2015-01-05 2016-07-14 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies that inhibit tim-3:lilrb2 interactions and uses thereof
EP3125645A1 (en) 2015-07-31 2017-02-01 Bleckmann GmbH & Co. KG Flange assembly for securing a heating device to a fluid container
TWI717375B (zh) 2015-07-31 2021-02-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｃｄ７０及ｃｄ３抗體構築體
US20180244792A1 (en) 2015-09-10 2018-08-30 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Anti-fibrotic effect of cd70
BR112018008891A8 (pt) 2015-11-03 2019-02-26 Janssen Biotech Inc anticorpos que se ligam especificamente a pd-1 e tim-3 e seus usos
EA039859B1 (ru) 2016-02-03 2022-03-21 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3
US11027021B2 (en) 2016-03-15 2021-06-08 Seagen Inc. Combinations of PBD-based antibody drug conjugates with Bcl-2 inhibitors
GB2567613A (en) 2017-06-16 2019-04-24 Argenx Bvba Treatment for acute myeloid leukaemia
GB201800649D0 (en) 2018-01-16 2018-02-28 Argenx Bvba CD70 Combination Therapy

Also Published As

Publication number Publication date
US9765148B2 (en) 2017-09-19
BR112013021562A2 (pt) 2016-11-08
US20190270823A1 (en) 2019-09-05
US20150266963A1 (en) 2015-09-24
EP2686347A1 (en) 2014-01-22
HUE039849T2 (hu) 2019-02-28
DK2686347T3 (en) 2018-06-25
CN103596979B (zh) 2018-01-26
RU2604196C2 (ru) 2016-12-10
PT2686347T (pt) 2018-07-05
AU2012228194B2 (en) 2017-06-01
US20140147450A1 (en) 2014-05-29
IL228001B (en) 2018-06-28
WO2012123586A1 (en) 2012-09-20
PL2686347T3 (pl) 2018-10-31
US20140141016A1 (en) 2014-05-22
JP2016196471A (ja) 2016-11-24
JP6261651B2 (ja) 2018-01-17
EP2686347B1 (en) 2018-05-02
CY1120471T1 (el) 2019-07-10
RU2013146106A (ru) 2015-04-27
CN103596979A (zh) 2014-02-19
US11072665B2 (en) 2021-07-27
JP5982409B2 (ja) 2016-09-07
CA2828753C (en) 2022-07-26
US8834882B2 (en) 2014-09-16
US9765149B2 (en) 2017-09-19
US20230265201A1 (en) 2023-08-24
SI2686347T1 (en) 2018-08-31
CA2828753A1 (en) 2012-09-20
US20140235843A1 (en) 2014-08-21
AU2012228194A1 (en) 2013-09-12
TR201807202T4 (tr) 2018-06-21
BR112013021562B1 (pt) 2023-01-10
IL228001A0 (en) 2013-09-30
US20170369581A9 (en) 2017-12-28
US11434298B2 (en) 2022-09-06
JP2014509861A (ja) 2014-04-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2670874T3 (es) Anticuerpos contra CD70
US11407839B2 (en) Antibodies that bind to OX40 and their uses
US20200079863A1 (en) Antibodies that bind to tl1a and their uses
AU2016293119A1 (en) Antibody molecules which bind CD79
US10696741B2 (en) Anti-IL-22R antibodies
GB2543729A (en) Antibodies to IL-24
NZ619849B2 (en) Antibodies that bind to ox40 and their uses