CN101370830A - 抗cd70的人单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本发明提供以高亲和力特异性结合CD70的分离的单克隆抗体，特别是人单克隆抗体。还提供了编码本发明的抗体的核酸分子，用于表达本发明的抗体的表达载体、宿主细胞和方法。还提供了包含本发明的抗体的免疫偶联物、双特异性分子和药物组合物。本申请还提供了治疗癌症、自身免疫病、炎症和病毒感染的方法。

Description

抗CD70的人单克隆抗体

相关申请的交叉参考

本申请要求2005年9月26日提交的美国临时专利申请系列号60/720,600、2005年10月13日提交的美国临时专利申请系列号60/726,695和2005年12月8日提交的美国临时专利申请系列号60/748,827的优先权，根据35 U.S.C.§119(e)要求在先申请日的权利，上述申请的全部内容引入本文作为参考。

发明背景

细胞因子受体CD27是肿瘤坏死因子受体(TFNR)超家族的一个成员，它在细胞生长和分化以及细胞凋亡或程序性细胞死亡中起作用。CD27的配体是CD70，CD70属于肿瘤坏死因子配体家族。CD70是193个氨基酸的多肽，具有20个氨基酸的亲水性N-末端结构域和含有2个潜在N-连接糖基化位点的C-末端结构域(Goodwin，R.G.等.(1993)Cell 73：447-56；Bowman等.(1994)Immunol 152：1756-61)。基于这些特征，确定CD70是具有胞外C-末端部分的II型跨膜蛋白。

CD70在活化而非静息的T和B淋巴细胞和树突细胞上短时存在(Hintzen等.(1994)J.Immunol.152：1762-1773；Oshima等.(1998)Int.Immunol.10：517-26；Tesselaar等.(2003)J.Immunol.170：33-40)。除了在正常细胞上表达以外，还报道了CD70在不同类型的癌症包括肾细胞癌、转移乳腺癌、脑瘤、白血病、淋巴瘤和鼻咽癌中的表达(Junker等.(2005)J Urol.173：2150-3；Sloan等.(2004)Am J Pathol.164：315-23；Held-Feindt和Mentlein(2002)Int J Cancer 98：352-6；Hishima等.(2000)Am J Surg Pathol.24：742-6；Lens等.(1999)Br J Haematol.106：491-503)。另外，已经发现CD70在用DNA甲基转移酶抑制剂或ERK途径抑制剂处理的T细胞上过量表达，可能导致药物诱导的和特发性的狼疮(Oelke等.(2004)Arthritis Rheum.50：1850-60)。已经提出CD70与CD27的相互作用在细胞介导的自身免疫病和TNF-α产生的抑制中起作用(Nakajima等.(2000)J.Neuroimmunol.109：188-96)。

因此，CD70是一种有价值的治疗癌症、自身免疫病和多种以CD70表达为特征的其他疾病的靶标。

发明概述

本发明公开内容提供与CD70结合并且表现出许多所需特性的分离的单克隆抗体，特别是人单克隆抗体。这些特性包括与人CD70高亲和力结合。也提供了应用本发明的抗体和组合物治疗多种CD70介导的疾病的方法。

在一个方面，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体(a)以1×10^-7M或更低的K_D与人CD70结合；和(b)与肾细胞癌肿瘤细胞系结合。

优选地，该抗体与选自786-O(ATCC登录号CRL-1932)、A-498(ATCC登录号HTB-44)、ACHN(ATCC登录号CRL-1611)、Caki-1(ATCC登录号HTB-46)和Caki-2(ATCC登录号HTB-47)的肾细胞癌肿瘤细胞系结合。

优选地，该抗体为人抗体，但是在替代实施方案中，该抗体也可以是，例如，鼠抗体、嵌合抗体或人源化抗体。

在更优选的实施方案中，该抗体以5.5×10^-9M或更低的K_D与人CD70结合，或者以3×10^-9M或更低的K_D与人CD70结合，或者以2×10^-9M或更低的K_D与人CD70结合，或者以1.5×10^-9M或更低的K_D与人CD70结合。

在另一实施方案中，该抗体在与786-O肾细胞癌肿瘤细胞上表达的CD70结合后被这些细胞内化。

在另一实施方案中，该抗体与B细胞肿瘤细胞系结合。优选地，该B细胞肿瘤细胞系选自Daudi(ATCC登录号CCL-213)、HuT 78(ATCC登录号TIB-161)、Raji(ATCC登录号CCL-86)和Granta-519(DSMZ登录号342)。

在另一实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体与参比抗体交叉竞争结合CD70，其中所述参比抗体:(a)以1×10^-7M或更低的K_D与人CD70结合；和(b)与肾细胞癌肿瘤细胞系结合。

在各种实施方案中，所述参比抗体包括:

(a)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链可变区。

或者所述参比抗体包括:

(a)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链可变区；

或者所述参比抗体包括:

(a)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链可变区；

或者所述参比抗体包括:

(a)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链可变区；

或者所述参比抗体包括:

(a)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链可变区。

在另一方面，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人V_H3-30.3基因的重链可变区，其中该抗体与CD70特异性结合。本发明也提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人V_H3-33基因的重链可变区，其中该抗体与CD70特异性结合。本发明也提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人V_H4-61基因的重链可变区，其中该抗体与CD70特异性结合。本发明进一步提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人V_K L6基因的轻链可变区，其中该抗体与CD70特异性结合。本发明进一步提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人V_K L18基因的轻链可变区，其中该抗体与CD70特异性结合。本发明进一步提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人V_KL15基因的轻链可变区，其中该抗体与CD70特异性结合。

一种优选的组合包括:

(a)包含SEQ ID NO:11的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO:16的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO:21的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO:26的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO:31的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO:36的轻链可变区CDR3。

另一种优选的组合包括:

(a)包含SEQ ID NO:12的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO:17的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO:22的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO:27的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO:32的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO:37的轻链可变区CDR3。

另一种优选的组合包括:

(a)包含SEQ ID NO:13的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO:18的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO:23的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO:28的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO:33的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO:38的轻链可变区CDR3。

另一种优选的组合包括:

(a)包含SEQ ID NO:14的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO:19的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO:24的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO:29的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO:34的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO:39的轻链可变区CDR3。

另一种优选的组合包括:

(a)包含SEQ ID NO:15的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO:20的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO:25的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO:30的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO:35的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO:40的轻链可变区CDR3。

其他本发明优选的抗体或其抗原结合部分包括:

(a)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链可变区。

另一种优选的组合包括:

(a)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链可变区。

另一种优选的组合包括:

(a)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链可变区。

另一种优选的组合包括:

(a)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链可变区。

另一种优选的组合包括:

(a)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链可变区。

本发明的抗体可以是，例如，如IgG1或IgG4同种型的全长抗体。或者，这些抗体可以是抗体片段，如Fab或Fab’₂片段，或单链抗体。

本发明也提供一种免疫偶联物，其包含与诸如细胞毒素或放射性同位素等治疗剂连接的本发明的抗体或其抗原结合部分。本发明也提供一种双特异性分子，其包含与第二功能部分连接的本发明的抗体或其抗原结合部分，该第二功能部分具有与该抗体或其抗原结合部分不同的结合特异性。

还提供包含本发明的抗体或其抗原结合部分或免疫偶联物或双特异性分子和药学上可接受的载体的组合物。

本发明也包括编码本发明的抗体或其抗原结合部分的核酸分子，以及包含这些核酸的表达载体，包含这些表达载体的宿主细胞，和应用这些宿主细胞制备抗CD70抗体的方法。而且，本发明提供一种含有人免疫球蛋白重链和轻链转基因的转基因小鼠，其中该小鼠表达本发明的抗体，以及由这种小鼠制备的杂交瘤，其中该杂交瘤产生本发明的抗体。

在另一方面，本发明提供一种治疗或预防以表达CD70的肿瘤细胞生长为特征的方法，包括给受试者施用有效治疗或预防该疾病的量的本发明的抗CD70人抗体。所述疾病可以是癌症，例如肾细胞癌或淋巴瘤。

在另一方面，本发明提供一种治疗自身免疫病的方法，包括给受试者施用有效治疗自身免疫病的量的本发明的抗CD70人抗体。

本发明的其他特征和优点通过下面的详述和实施例将是显而易见的，该详述和实施例不应理解为限制性的。贯穿本申请中引用的所有参考文献、Genbank项、专利和公布的专利申请的内容均在此处特别引入作为参考。

附图说明

图1A显示2H5人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO:41)和氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO:11)、CDR2(SEQ ID NO:16)和CDR3(SEQ ID NO:21)区，并指出了V和J的种系来源。

图1B显示2H5人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO:46)和氨基酸序列(SEQ ID NO:6)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO:26)、CDR2(SEQ ID NO:31)和CDR3(SEQ ID NO:36)区，并指出了V和J的种系来源。

图2A显示10B4人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO:42)和氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO:12)、CDR2(SEQ ID NO:17)和CDR3(SEQ ID NO:22)区，并指出了V、D和J的种系来源。

图2B显示10B4人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO:47)和氨基酸序列(SEQ ID NO:7)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO:27)、CDR2(SEQ ID NO:32)和CDR3(SEQ ID NO:37)区，并指出了V和J的种系来源。

图3A显示8B5人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO:43)和氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO:13)、CDR2(SEQ ID NO:18)和CDR3(SEQ ID NO:23)区，并指出了V、D和J的种系来源。

图3B显示8B5人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO:48)和氨基酸序列(SEQ ID NO:8)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO:28)、CDR2(SEQ ID NO:33)和CDR3(SEQ ID NO:38)区，并指出了V和J的种系来源。

图4A显示18E7人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO:44)和氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO:14)、CDR2(SEQ ID NO:19)和CDR3(SEQ ID NO:24)区，并指出了V、D和J的种系来源。

图4B显示18E7人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO:49)和氨基酸序列(SEQ ID NO:9)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO:29)、CDR2(SEQ ID NO:34)和CDR3(SEQ ID NO:39)区，并指出了V和J的种系来源。

图5A显示69A7人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO:45)和氨基酸序列(SEQ ID NO:5)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO:15)、CDR2(SEQ ID NO:20)和CDR3(SEQ ID NO:25)区，并指出了V、D和J的种系来源。

图5B显示69A7人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO:50)和氨基酸序列(SEQ ID NO:10)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO:30)、CDR2(SEQ ID NO:35)和CDR3(SEQ ID NO:40)区，并指出了V和J的种系来源。

图6显示2H5和10B4的重链可变区氨基酸序列与人种系V_H3-30.3氨基酸序列(SEQ ID NO:51)的比对。

图7显示8B5和18E7的重链可变区氨基酸序列与人种系V_H 3-33氨基酸序列(SEQ ID NO:52)的比对。

图8显示69A7的重链可变区氨基酸序列与人种系V_H 4-61氨基酸序列(SEQ ID NO:53)的比对。

图9显示2H5的轻链可变区氨基酸序列与人种系V_K L6氨基酸序列(SEQ ID NO:54)的比对。

图10显示10B4的轻链可变区氨基酸序列与人种系V_K L18氨基酸序列(SEQ ID NO:55)的比对。

图11显示8B5和18E7的轻链可变区氨基酸序列与人种系V_KL15氨基酸序列(SEQ ID NO:56)的比对。

图12显示69A7的轻链可变区氨基酸序列与人种系V_K L6氨基酸序列(SEQ ID NO:54)的比对。

图13显示ELISA实验结果，该结果证明抗人CD70的人单克隆抗体与CD70特异性结合。

图14显示流式细胞实验结果，该结果证明抗CD70人单克隆抗体2H5与肾癌细胞系结合。

图15A和B显示流式细胞实验结果，该结果证明抗人CD70的人单克隆抗体以浓度依赖性的方式与肾细胞癌(RCC)细胞系结合。(A)786-O RCC细胞系，(B)A498 RCC细胞系。

图15C显示流式细胞实验的结果，该结果证明抗人CD70的人单克隆抗体与肾癌细胞系786-O结合。

图15D显示流式细胞实验的结果，该结果证明抗人CD70的HuMAb 69A7抗体以浓度依赖性的方式与肾细胞癌(RCC)细胞系结合。

图16显示流式细胞实验的结果，该结果证明抗CD70人单克隆抗体2H5与人淋巴瘤细胞系结合。

图17A和B显示流式细胞实验结果，该结果证明抗CD70人单克隆抗体2H5以浓度依赖性的方式与人淋巴瘤细胞系结合。(A)Raji淋巴瘤细胞系，(B)Granta-519淋巴瘤细胞系。

图17C显示流式细胞实验的结果，该结果证明抗人CD70的人单克隆抗体与Raji淋巴瘤细胞系结合。

图17D显示竞争性流式细胞测定的结果，该结果证明HuMAb2H5和69A7抗体共有类似的结合表位。

图17E显示流式细胞实验的结果，该结果证明抗人CD70的人单克隆抗体与Daudi淋巴瘤细胞系和786-O肾癌细胞系结合。

图18显示Hum-Zap内化实验的结果，该结果证明抗人CD70的人单克隆抗体与可以被内化到CD70+细胞内。

图19A-C显示细胞增殖测定的结果，该结果证明毒素-偶联的人单克隆抗CD70抗体杀死肾细胞癌细胞(RCC)系。(A)Caki-2 RCC，(B)786-O RCC，(C)ACHN RCC。

图20A-D显示抗体依赖的细胞毒性(ADCC)测定的结果，该结果证明人单克隆抗CD70抗体以ADCC依赖性的方式杀死人白血病和淋巴瘤细胞系。(A)ARH-77白血病细胞系，(B)HuT 78淋巴瘤细胞系，(C)Raji淋巴瘤细胞系，和(D)不表达CD70的L-540细胞系。

图21显示细胞增殖测定的结果，该结果证明毒素-偶联的人单克隆抗人CD70抗体杀死人淋巴瘤细胞系。

图22A-B显示细胞增殖测定的结果，该结果证明(A)采用3小时洗涤和(B)采用连续洗涤，毒素-偶联的人单克隆抗人CD70抗体显示对Raji细胞的细胞毒性。

图23A-B显示体内小鼠肿瘤模型研究的结果，证明用毒素偶联的抗CD70抗体2H5进行处理对体内肾细胞癌(RCC)肿瘤具有直接抑制作用。(A)A-498 RCC肿瘤，(B)ACHN RCC肿瘤。

图24A-F显示抗体依赖的细胞毒性(ADCC)测定的结果，证明脱岩藻糖基化的人单克隆抗CD70抗体以ADCC依赖的方式对人白血病细胞具有增强的细胞毒性。(A)ARH-77细胞；(B)MEC-1细胞；(C)用抗CD16抗体处理的MEC-1细胞；(D)SU-DHL-6细胞；(E)IM-9细胞；(D)HuT 78细胞。

图25显示抗体依赖的细胞毒性(ADCC)测定的结果，证明人单克隆抗CD70抗体以ADCC浓度依赖的方式杀死人白血病细胞。

图26显示抗体依赖的细胞毒性(ADCC)测定的结果，证明人单克隆抗CD70抗体以ADCC依赖的方式杀死人白血病细胞，但是细胞毒性依赖于CD16。

图27显示抗体依赖的细胞毒性(ADCC)测定的结果，证明人单克隆抗CD70抗体杀死活化的人T细胞，并且添加抗CD-16抗体逆转该效应。

图28显示阻断测定的结果，证明某些人单克隆抗CD70抗体阻断CD70与CD27的结合，而其他人单克隆抗CD70抗体不阻断CD70与CD27的结合。

图29A-B显示体内小鼠肿瘤模型研究的结果，证明用毒素偶联的抗CD70抗体2H5进行处理对体内淋巴瘤肿瘤具有直接抑制作用。(A)Raji肿瘤，(B)ARH-77肿瘤。

图30A-C显示体内小鼠肿瘤模型研究的结果，证明用毒素偶联的抗CD70抗体2H5进行处理对体内淋巴瘤肿瘤具有直接抑制作用。(A)ARH-77肿瘤；(B)Granta 519肿瘤；(C)Raji肿瘤。

图31显示的研究结果显示抗CD70抗体69A7与恒河猴CD70+B淋巴细胞系上表达的CD70交叉反应。

图32显示阻断测定的结果，证明人抗CD70抗体阻断已知小鼠抗人CD70抗体的结合。

图33A和B显示用抗CD70抗体或非岩藻糖基化形式的抗体处理的结果。(A)抗CD70抗体以剂量依赖的方式抑制CD70共刺激的细胞增殖。(B)抗CD70抗体以剂量依赖的方式抑制CD70共刺激的IFN-γ分泌。

图34A-C显示用抗CD70抗体或非岩藻糖基化形式的抗体处理对肽刺激的细胞的结果。(A)抗CD70抗体抑制肽特异性CD8+T细胞增殖。(B)未观察到总细胞存活率的显著降低。(C)未观察到总CD8+细胞数显著减少。

图35显示加入抗CD16抗体阻断了抗CD70抗体对肽特异性CD8+T细胞增殖的效果。

图36A-B显示体内小鼠肿瘤模型研究的结果，证明用毒素偶联的抗CD70抗体2H5进行处理对体内肾癌肿瘤具有直接抑制作用。(A)786-O肿瘤，(B)Caki-1肿瘤。

发明详述

本发明涉及以高亲和力特异性结合CD70的分离的单克隆抗体，特别是人单克隆抗体。在某些实施方案中，本发明的抗体源自特定重链和轻链种系序列，和/或包含特定结构特征，如包含特定氨基酸序列的CDR区。本发明提供分离的抗体、制备该抗体的方法、含有该抗体的免疫偶联物和双特异性分子、和含有本发明的抗体、免疫偶联物或双特异性分子的药物组合物。本发明也涉及利用该抗体(例如)治疗诸如癌症的疾病的方法。

为了使本发明更容易理解，首先定义了一些术语。其他的定义在发明详述内容中说明。

“信号转导途径”是指在信号从一个细胞的一部分向一个细胞的另一部分传送中起作用的多种信号转导分子之间的生化关系。本文使用的短语“细胞表面受体”包括，例如，能够接收信号和跨过细胞质膜传播这种信号的分子和分子复合物。本发明的“细胞表面受体”的一个例子是CD70受体。

本文提到的术语“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。“抗体”是指包含通过二硫键互相连接在一起的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(在此缩写为V_H)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域C_H1、C_H2和C_H3组成。每条轻链由轻链可变区(在此缩写为V_L)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域C_L组成。V_H和V_L区可进一步再分为高变区，称为互补决定区(CDR)，CDR散布在被称为构架区(FR)的更加保守的区域中。每个V_H和V_L均由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基端向羧基端以如下顺序排列:FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有可与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，该宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一成分(C1q)。

本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”(或“抗体部分”)是指保留与抗原(例如CD70)特异性结合的能力的抗体的一个或多个片段。已证明抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段来行使。术语抗体的“抗原结合部分”中所包括的结合片段的例子包括:(i)Fab片段，即由V_L、V_H、C_L和C_H1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)₂片段，即包含在铰链区处通过二硫键连接的两个Fab片段的双价片段；(iii)Fab′片段，其基本上是具有铰链区部分的Fab(见FundamentalImmunology(Paul ed.，3rd ed.1993)；(iv)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(v)由抗体单臂的V_L和V_H结构域组成的Fv片段；(vi)由V_H结构域组成的dAb片段(Ward等(1989)Nature 341：544-546)；和(vii)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域V_L和V_H由单独的基因编码，但是它们可以利用重组方法通过合成连接体连接在一起，该连接体使它们能够制成一条蛋白质链，其中V_L和V_H区配对构成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见，例如Bird等(1988)Science 242：423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883)。这种单链抗体也包括在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段用本领域技术人员公知的常规技术获得，并用与完整抗体相同的方法对这些片段的实用性进行筛选。

本文使用的“分离的抗体”是指基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，与CD70特异性结合的分离的抗体基本不含与除CD70以外的抗原特异性结合的抗体)。但是，与CD70特异性结合的分离的抗体与诸如来自其他物种的CD70分子等其他抗原可能具有交叉反应性。在某些实施方案中，分离的抗体特异性结合人CD70并且不与其他非人CD70抗原交叉反应。而且，分离的抗体可基本不含其他细胞材料和/或化学物质。

本文使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单一分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和性。

本文使用的术语“人抗体”包括具有如下可变区的抗体，在该可变区中，构架区和CDR区都源自人种系免疫球蛋白序列。而且，如果该抗体含有恒定区，则该恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。人抗体可以包含后来的修饰，包括天然或合成修饰。本发明的人抗体可包含并非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。但是，本文使用的术语“人抗体”不包括其中源自另一哺乳动物种如小鼠的种系的CDR序列已被移植到人构架序列上的抗体。

术语“人单克隆抗体”是指表现单一结合特异性的抗体，其具有其中构架区和CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列的可变区。在一个实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，该杂交瘤包括与无限增殖化细胞融合的B细胞，该B细胞从具有含人重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因非人动物(例如转基因小鼠)中获得。

本文使用的术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如:(a)从对于人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤(下文进一步描述)中分离的抗体，(b)从经转化表达人抗体的宿主细胞如转染瘤中分离的抗体，(c)从重组组合人抗体文库中分离的抗体，和(d)通过包括将人免疫球蛋白基因序列剪接为其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。这些重组人抗体具有其中构架区和CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列的可变区。但是在某些实施方案中，这些重组人抗体可以经历体外诱变(或者，当使用人Ig序列的转基因动物时，经历体内体细胞诱变)，因此重组抗体的V_H和V_L区的氨基酸序列尽管是源自人种系V_H和V_L序列并与之相关的序列，但可能不是在体内天然存在于人抗体种系的所有组成成分(repertoire)中。

本文使用的术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM或IgG1)。

短语“识别抗原的抗体”和“抗原特异性抗体”在此与术语“与抗原特异性结合的抗体”可互换使用。

术语“人抗体衍生物”是指人抗体的任何修饰形式，例如抗体和其它试剂或抗体的偶联物。

术语“人源化抗体”是指其中来源于另外一种哺乳动物种如小鼠的种系的CDR序列已经被移植到人构架序列上的抗体。在人构架序列内也可以进行其它的构架区修饰。

术语“嵌合抗体”是指其中可变区序列来源于一个物种而恒定区序列来源于另一个物种的抗体，例如其中可变区序列来源于小鼠抗体而恒定区序列来源于人抗体的抗体。

本文使用的术语“与人CD70特异性结合”的抗体是指以5×10^-8M或更低、更优选1×10^-8M或更低、更优选6×10^-9M或更低、更优选3×10^-9M或更低、甚至更优选2×10^-10M或更低的K_D与人CD70结合的抗体。

本文使用的术语“K_assoc”或“K_a”是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而本文使用的术语“K_dis”或“K_d”是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。本文使用的术语“K_D”是指解离常数，它是由K_d与K_a的比值获得的(即K_d/K_a)，并且表示为摩尔浓度(M)。抗体的K_D值可能用本领域建立的方法测定。测定抗体K_D的一种优选方法是使用表面等离振子共振法，优选使用生物传感器系统，如

系统。

本文使用的术语IgG抗体的“高亲和力”是指抗体对于靶抗原的K_D为10^-7M或更低、更优选10^-8M或更低、更优选10^-9M或更低、甚至更优选10^-10M或更低。但是对于其他抗体同种型来说，“高亲和力”结合可能不同。例如，对于IgM同种型来说，“高亲和力”结合是指抗体具有10^-7M或更低、更优选10^-8M或更低、甚至更优选10^-9M或更低的K_D。

本文使用的术语“受试者”包括任何人或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖类动物、鱼、爬行类动物等。

本申请的各个方面在下面的章节中进一步详细描述。

抗CD70抗体

本发明的抗体的特征在于抗体的特定功能特征或特性。例如，这些抗体与人CD70特异性结合。优选地，本发明的抗体以高亲和力与CD70结合，例如K_D为5×10^-7M或更低，更优选5.5×10^-9M或更低，更优选3×10^-9M或更低，更优选2×10^-9M或更低，或者更优选1.5×10^-9M或更低。评价抗体对CD70的结合能力的标准试验在本领域中是公知的，包括，例如ELISA、Western印迹分析和RIA。合适的试验在实施例中详细描述。抗体的结合动力学(例如结合亲和力)也可以通过本领域公知的标准试验(如ELISA、Scatchard和Biacore分析)来评价。作为另外一个例子，本发明的抗体可以与肾癌肿瘤细胞系例如786-O、A-498、ACHN、Caki-1或Caki-2细胞系结合。作为另外一个例子，本发明的抗体可以与B细胞肿瘤细胞系例如Daudi、HuT 78、Raji或Granta-519细胞系结合。

单克隆抗体2H5、10B4、8B5、18E7和69A7

本发明示例性的抗体包括如实施例1和2所述分离并进行结构表征的人单克隆抗体2H5、10B4、8B5、18E7和69A7。2H5、10B4、8B5、18E7和69A7的V_H氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO:1、2、3、4和5中。2H5、10B4、8B5、18E7和69A7的V_L氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO:6、7、8、9和10中。

假定这些抗体中的每一个都能够与CD70结合，则V_H和V_L序列可以“混合并匹配”，从而产生本发明的其他的抗CD70结合分子。CD70与这些“混合并匹配的”抗体的结合可以用上文及实施例中所述的结合试验(例如FACS或ELISA)检测。优选地，当V_H和V_L链混合并匹配时，来自特定V_H/V_L配对的V_H序列被替换为结构上相似的V_H序列。同样，优选地，来自特定V_H/V_L配对的V_L序列被替换为结构上相似的V_L序列。

因此，在一个方面，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括:

(a)包含选自SEQ ID NO:1、2、3、4和5的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含选自SEQ ID NO:6、7、8、9和10的氨基酸序列的轻链可变区；

其中该抗体与CD70特异性结合。

优选的重链和轻链组合包括:

(a)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链可变区；或

(a)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链可变区；或

(a)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链可变区；或

(a)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链可变区；或

(a)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链可变区。

在另一方面，本发明提供包含2H5、10B4、8B5、18E7和69A7的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3或其组合的抗体。2H5、10B4、8B5、18E7和69A7的V_H CDR1的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:11、12、13、14和15中。2H5、10B4、8B5、18E7和69A7的V_H CDR2的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:16、17、18、19和20中。2H5、10B4、8B5、18E7和69A7的V_H CDR3的氨基酸序列分别示于SEQID NO:21、22、23、24和25中。2H5、10B4、8B5、18E7和69A7的V_K CDR1的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:26、27、28、29和30中。2H5、10B4、8B5、18E7和69A7的V_K CDR2的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:31、32、33、34和35中。2H5、10B4、8B5、18E7和69A7的V_K CDR3的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:36、37、38、39和40中。CDR区用Kabat系统(Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Departmentof Health and Human Services，NIH出版号91-3242)勾画出。

假如这些抗体均能与CD70结合，并且抗原结合特异性主要是由CDR1、2和3区提供的，则V_H CDR1、CDR 2和CDR 3序列与V_KCDR1、CDR 2和CDR 3序列可以“混合并匹配”(即来自不同抗体的CDR可以混合并匹配，但是每个抗体必须含有V_H CDR1、CDR 2和CDR 3和V_K CDR1、CDR 2和CDR 3)，从而产生本发明的其他的抗CD70结合分子。CD70与这些“混合并匹配的”抗体的结合可以用上文及实施例中所述的结合试验(例如FACS、ELISA、Biacore分析)检测。优选地，当V_H CDR序列混合并匹配时，来自特定V_H序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列被替换为结构上相似的CDR序列。同样，当V_K CDR序列混合并匹配时，来自特定V_K序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列优选地被替换为结构上相似的CDR序列。对于本领域技术人员而言显而易见的是，通过将一个或多个V_H和/或V_L CDR区序列替换为来自此处公开的单克隆抗体2H5、10B4、8B5、18E7和69A7的CDR序列的结构上相似的序列，可以产生新的V_H和V_L序列。

因此，在另一个方面，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括:

(a)包含选自SEQ ID NO:11、12、13、14和15的氨基酸序列的重链可变区CDR1；

(b)包含选自SEQ ID NO:16、17、18、19和20的氨基酸序列的重链可变区CDR2；

(c)包含选自SEQ ID NO:21、22、23、24和25的氨基酸序列的重链可变区CDR3；

(d)包含选自SEQ ID NO:26、27、28、29和30的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；

(e)包含选自SEQ ID NO:31、32、33、34和35的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和

(f)包含选自SEQ ID NO:36、37、38、39和40的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；

其中该抗体与CD70、优选与人CD70特异性结合。

在一个优选实施方案中，该抗体包括:

(a)包含SEQ ID NO:11的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO:16的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO:21的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO:26的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO:31的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO:36的轻链可变区CDR3。

在另一优选实施方案中，该抗体包括:

(a)包含SEQ ID NO:12的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO:17的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO:22的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO:27的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO:32的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO:37的轻链可变区CDR3。

在另一优选实施方案中，该抗体包括:

(a)包含SEQ ID NO:13的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO:18的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO:23的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO:28的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO:33的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO:38的轻链可变区CDR3。

在另一优选实施方案中，该抗体包括:

(a)包含SEQ ID NO:14的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO:19的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO:24的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO:29的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO:34的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO:39的轻链可变区CDR3。

在另一优选实施方案中，该抗体包括:

(a)包含SEQ ID NO:15的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO:20的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO:25的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO:30的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO:35的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO:40的轻链可变区CDR3。

本领域公知，不依赖于CDR1和/或CDR2域，单独的CDR3域即可以决定抗体对于同源抗原的结合特异性，并且基于共同的CDR3序列可以预测性地产生具有相同结合特异性的多种抗体。参见，例如，Klimka等，BritishJ.of Cancer 83(2)：252-260(2000)(描述了仅使用鼠抗-CD30抗体Ki-4的重链可变域CDR3产生人源化抗-CD30抗体)；Beiboer等，J.Mol Biol.296：833-849(2000)(描述了仅使用亲本鼠MOC-31抗-EGP-2抗体的重链CDR3序列产生重组上皮糖蛋白-2(EGP-2)抗体)；Rader等，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.95：8910-8915(1998)(描述了使用鼠抗整联蛋白α_vβ₃抗体LM609的重链和轻链可变CDR3域的一组人源化抗整联蛋白α_vβ₃抗体，其中每个成员抗体在CDR3域之外含有不同的序列，并且能够与亲本鼠抗体结合相同的表位，其亲和力与亲本鼠抗体一样高或更高)；Barbas等，J.Am.Chem.Soc.116：2161-2162(1994)(公开了CDR3域对抗原结合提供了最重要的贡献)；Barbas等，Proc，Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：2529-2533(1995)(描述了三种抗人胎盘DNA的Fab(SI-1，SI-40和SI-32)的重链CDR3序列向抗破伤风类毒素Fab的重链上的移植，由此替换了存在的重链CDR3，并且证明单独的CDR3提供结合特异性)；和Ditzel等，J.Immunol.157：739-749(1996)(描述了移植研究，其中仅向单特异性IgG破伤风类毒素结合Fab p313抗体转移亲本多特异性FabLNA3的重链CDR3足以保留亲本Fab的结合特异性)。上述每一参考文献都全文引入作为参考。

因此，本发明提供包含一个或多个来自人或非人动物的抗体的重链和/或轻链CDR3结构域的单克隆抗体，其中该单克隆抗体能够特异性结合CD70。在某些方面，本发明提供包含一个或多个来自非人抗体如小鼠或大鼠抗体的重链和/或轻链CDR3域的单克隆抗体，其中该单克隆抗体能够特异性结合CD70。在某些实施方案中，这些本发明的包含一个或多个来自非人抗体的重链和/或轻链CDR3域的抗体与相应的亲本非人抗体(a)能够竞争结合；(b)保留功能特性；(c)结合相同的表位；和/或(d)具有类似的结合亲和力。

在其他方面，本发明提供包含一个或多个来自人抗体(例如从非人动物获得的人抗体)的重链和/或轻链CDR3结构域的单克隆抗体，其中该单克隆抗体能够特异性结合CD70。在其他方面，本发明提供包含一个或多个来自第一人抗体(如从非人动物获得的人抗体)的重链和/或轻链CDR3域的单克隆抗体，其中该第一人抗体能够特异性结合CD70，并且其中来自该第一人抗体的CD3域代替了缺乏对CD70的结合特异性的人抗体中的CDR3域，从而产生能够特异性结合CD70的第二人抗体。在某些实施方案中，本发明的包含一个或多个来自第一人抗体的重链和/或轻链CDR3域的抗体与相应的亲本第一人抗体(a)能够竞争结合；(b)保留功能特性；(c)结合相同的表位；和/或(d)具有类似的结合亲和力。

具有特定种系序列的抗体

在某些实施方案中，本发明的抗体包含来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。

例如，在一个优选实施方案中，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人V_H 3-30.3基因的重链可变区，其中该抗体与CD70特异性结合。在另一优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人V_H 3-33基因的重链可变区，其中该抗体与CD70特异性结合。在另一优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分或片段，其包含产自或源自人V_H 4-61基因的重链可变区，其中该抗体与CD70特异性结合。在另一优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人V_K L6基因的轻链可变区，其中该抗体与CD70特异性结合。在另一优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分或片段，其包含产自或源自人V_K L18基因的轻链可变区，其中该抗体与CD70特异性结合。在另一优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分或片段，其包含产自或源自人V_K L15基因的轻链可变区，其中该抗体与CD70特异性结合。

在另一优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体:

(a)包含产自或源自人V_H 3-30.3、3-33或4-61基因(该基因分别编码SEQ ID NO:51、52和53所示的氨基酸序列)的重链可变区；

(b)包含产自或源自人V_K L6、L18或L15基因(该基因分别编码SEQ ID NO:54、55和56所示的氨基酸序列)的轻链可变区；且

(c)该抗体与CD70特异性结合。

分别具有V_H 3-30.3和V_k L6的V_H和V_K的抗体的一个例子是2H5。分别具有V_H 3-30.3和V_k L18的V_H和V_K的抗体的一个例子是10B4。分别具有V_H 3-33和V_k L15的V_H和V_K的抗体的例子是8B5和18E7。分别具有V_H 4-61和V_k L6的V_H和V_K的抗体的一个例子是69A7。

在本文中，如果一种人抗体的可变区是从使用人种系免疫球蛋白基因的系统中获得的，则该人抗体包含“产自”或“源自”特定种系序列的重链或轻链可变区。这样的系统包括用目标抗原免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠，或者用目标抗原筛查展示在噬菌体上的人免疫球蛋白基因文库。“产自”或“源自”人种系免疫球蛋白序列的人抗体可以这样鉴定:将该人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较，选择在序列上最接近于该人抗体序列(即有最高％同一性)的人种系免疫球蛋白序列。“产自”或“源自”特定人种系免疫球蛋白序列的人抗体与该种系序列相比可能包含氨基酸差异，例如由于天然发生的体细胞突变或定点突变的有意引入而导致的氨基酸差异。但是，选择的人抗体在氨基酸序列上与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列通常至少90％相同，并且含有当与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如鼠种系序列)相比较时确认该人抗体属于人类抗体的氨基酸残基。在某些情况下，人抗体在氨基酸序列上与该种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列可以至少95％、或者甚至至少96％、97％、98％或99％相同。典型地，源自特定人种系序列的人抗体表现与该人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列有不超过10个氨基酸的差异。在某些情况中，该人抗体可能表现与该种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列有不超过5个、或者甚至不超过4、3、2或1个氨基酸的差异。

同源抗体

在另一实施方案中，本发明的抗体包含的重链和轻链可变区含有与此处所述优选抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且其中该抗体保留了本发明抗CD70抗体的所需功能特性。

例如，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链可变区，其中:

(a)重链可变区包含与选自SEQ ID NO:1、2、3、4和5的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；

(b)轻链可变区包含与选自SEQ ID NO:6、7、8、9和10的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；

(c)该抗体与人CD70特异性结合。

在另外一些实施方案中，V_H和/或V_L氨基酸序列可以与上述序列85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。具有与上述序列的V_H和V_L区高度(即80％或更高)同源的V_H和V_L区的抗体可以如下获得:诱变(例如定点诱变或PCR介导的诱变)编码SEQ IDNO:41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的核酸分子，然后用此处所述的功能试验检测编码的被改变抗体的保留的功能(即以5×10^-8M或更低的K_D与人CD70结合)。

如本文使用的，两个氨基酸序列之间的百分同源性等同于两个序列之间的百分同一性。考虑为了两个序列之间进行最佳比对所需要引入的空位的数目和每个空位的长度后，两个序列之间的百分同一性是这两个序列共有的相同位点的数目的函数(即％同源性＝相同位点的数目/位点的总数×100)。两个序列之间的序列比较和百分同一性的确定可以如下面的非限制性实施例中所述用数学算法实现。

两个氨基酸序列之间的百分同一性可以用已经整合入ALIGN程序(2.0版本)中的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17(1988))的算法来确定，其使用PAM120权重残基表，12的空位长度罚分，4的空位罚分。另外，两个氨基酸序列之间的百分同一性也可以用已经整合入GCG软件包(可从http://www.gcg.com获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：444-453(1970))的算法来确定，其使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，16、14、12、10、8、6或4的空位权重，和1、2、3、4、5或6的长度权重。

另外或者可替代地，本发明的蛋白质序列可以进一步作为“查询序列”用于进行公共数据库的检索，例如鉴定相关序列。这种检索可以用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的XBLAST程序(2.0版本)进行。BLAST蛋白质检索可以用XBLAST程序进行，得分＝50，字长＝3，以获得与本发明的抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以采用如Altschul等(1997)Nucleic AcidsRes.25(17)：3389-3402所述的空位BLAST。当采用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。

具有保守修饰的抗体

在某些实施方案中，本发明的抗体包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中这些CDR序列中的一个或多个包含基于本文所述优选抗体(例如2H5、10B4、8B5、18E7或69A7)的特定氨基酸序列或其保守修饰，并且其中该抗体保留本发明抗CD70抗体的所需功能特性。因此，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中:

(a)重链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NO:21、22、23、24和25的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列，

(b)轻链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NO:36、37、38、39和40的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列，

(c)该抗体与CD70特异性结合。

在一个优选实施方案中，重链可变区CDR2序列包含选自SEQ IDNO:16、17、18、19和20的氨基酸序列和其保守修饰的氨基酸序列；且轻链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID NO:31、32、33、34和35的氨基酸序列和其保守修饰的氨基酸序列。在另一优选实施方案中，重链可变区CDR1序列包含选自SEQ ID NO:11、12、13、14和15的氨基酸序列和其保守修饰的氨基酸序列；且轻链可变区CDR1序列包含选自SEQ ID NO:26、27、28、29和30的氨基酸序列和其保守修饰的氨基酸序列。

本文使用的术语“保守序列修饰”是指不会显著影响或改变含该氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。可以通过本领域公知的标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变，向本发明抗体中引入修饰。保守氨基酸置换是将氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸残基。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已经定义。这些家族包括:具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本发明抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以被置换为来自相同侧链家族的其他氨基酸残基，并且可以用此处所述的功能试验检测改变的抗体保留的功能(即(c)所述的功能)。

与本发明的抗CD70抗体结合相同表位的抗体

在另一实施方案中，本发明提供与本发明的任意CD70单克隆抗体结合相同表位的抗体(即能够与本发明的任意单克隆抗体交叉竞争结合CD70的抗体)。在优选实施方案中，用于交叉竞争研究的参比抗体可以是单克隆抗体2H5(具有分别如SEQ ID NO:1和6所示的V_H和V_L序列)，或单克隆抗体10B4(具有分别如SEQ ID NO:2和7所示的V_H和V_L序列)，或单克隆抗体8B5(具有分别如SEQID NO:3和8所示的V_H和V_L序列)，或单克隆抗体18E7(具有分别如SEQ ID NO:4和9所示的V_H和V_L序列)，或单克隆抗体69A7(具有分别如SEQ ID NO:5和10所示的V_H和V_L序列)。这些交叉竞争抗体可以根据它们在标准CD70结合测定中与2H5、10B4、8B5、18E7或69A7交叉竞争的能力来鉴定。例如，可以利用BIAcore分析、ELISA测定或流式细胞分析来证明与本发明抗体的交叉竞争。被测试抗体抑制例如2H5、10B4、8B5、18E7或69A7与人CD70结合的能力证明，该测试抗体可以与2H5、10B4、8B5、18E7或69A7竞争结合人CD70，因此所结合的人CD70上的表位与2H5、10B4、8B5、18E7或69A7相同。在一个优选实施方案中，所结合的人CD70上的表位与2H5、10B4、8B5、18E7或69A7相同的抗体是人单克隆抗体。这些人单克隆抗体可以如实施例所述制备和分离。

工程化抗体和修饰的抗体

本发明的抗体进一步可以利用具有此处所公开的一种或多种V_H和/或V_L序列的抗体作为起始材料来制备，以构建一种修饰的抗体，该修饰的抗体相对于与起始抗体相比可以具有改变的特性。可以通过修饰一个或两个可变区(即V_H和/或V_L)例如一个或多个CDR区内和/或一个或多个构架区内的一个或多个残基来构建抗体。另外，或者，可以通过修饰恒定区内的残基来构建抗体，例如改变该抗体的效应功能。

可以进行的一种类型的可变区工程化是CDR移植。抗体主要是通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。由于这个原因，CDR内的氨基酸序列比CDR外的序列在各个抗体之间更加多样化。由于CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，因此通过构建如下的表达载体能够表达模拟特定天然存在抗体的特性的重组抗体:该表达载体包含来自特定天然存在抗体的CDR序列，该CDR序列被移植到来自具有不同特性的不同抗体的构架序列上(参见，例如，Riechmann，L等(1998)Nature 332：323-327；Jones，P.等(1986)Nature 321：522-525；Queen，C.等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：10029-10033；Winter的美国专利5,225,539，和Queen等的美国专利5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

因此，本发明的另一个实施方案涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区，该CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含选自SEQ ID NO:11、12、13、14和15，SEQ ID NO:16、17、18、19和20，和SEQ ID NO:21、22、23、24和25的氨基酸序列，并且包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，该CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含选自SEQ ID NO:26、27、28、29和30，SEQ ID NO:31、32、33、34和35，和SEQ ID NO:36、37、38、39和40的氨基酸序列。因此，这些抗体含有单克隆抗体2H5、10B4、8B5、18E7或69A7的V_H和V_LCDR序列，但是可能含有与这些抗体不同的构架序列。

这些构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或发表的参考文献中获得。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在以下资源中发现:“VBase”人种系序列数据库(可从因特网上www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase获得)，以及Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版号94-61242；Tomlinson，I.M.等(1992)“The Repertoire of Human Germline V_HSequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with DifferentHypervariable Loops”J.Mol.Biol.227：776-798；和Cox，J.P.L.等(1994)“A Directory of Human Germ-line V_H Segments Reveals a Strong Bias intheir Usage”Eur.J.Immunol.24：827-836；其内容均引入本文作为参考。作为另一个例子，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Genbank数据库中发现。例如，在HCo7 HuMAb小鼠中发现的下列重链种系序列可以根据如下Genbank登录号获得:1-69(NG_0010109，NT_024637和BC070333)、3-33(NG_0010109和NT_024637)和3-7(NG_0010109和NT_024637)。作为另一个例子，在VK HCo12HuMAb小鼠中发现的以下重链种系序列可以根据如下Genbank登录号获得:1-69(NG_0010109、NT_024637和BC070333)、5-51(NG_0010109和NT_024637)、4-34(NG_0010109和NT_024637)、3-30.3(CAJ556644)和3-23(AJ406678)。

用于本发明抗体的优选构架序列在结构上类似于所选择的本发明抗体使用的构架序列，例如，类似于本发明优选的单克隆抗体使用的V_H 3-30.3构架序列(SEQ ID NO:51)和/或V_H 3-33构架序列(SEQID NO:52)和/或V_H 4-61构架序列(SEQ ID NO:53)和/或V_K L6构架序列(SEQ ID NO:54)和/或V_K L18构架序列(SEQ ID NO:55)和/或V_K L15构架序列(SEQ ID NO:56)。V_H CDR1、CDR 2和CDR 3序列和V_K CDR1、CDR 2和CDR 3序列可以被移植到与该构架序列的来源种系免疫球蛋白基因具有相同序列的构架区上，或者CDR序列可以被移植到与该种系序列相比含有一个或多个突变的构架区上。例如，已经发现，在某些情况中，将构架区内的残基进行突变对于保持或增强抗体的抗原结合能力是有利的(参见，例如，Queen等的美国专利5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

另一种类型的可变区修饰是突变V_H和/或V_K CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基，从而改善目标抗体的一种或多种结合特性(例如亲和力)。可以进行定点诱变或PCR介导的诱变，以引入突变，对抗体结合的影响，或者其他目标功能特性，可以用此处所述和实施例中提供的体外或体内试验来评价。优选引入(如上文所述的)保守修饰。这些突变可以是氨基酸置换、添加或缺失，但是优选置换。而且，一般改变CDR区内的不超过1、2、3、4或5个残基。

因此，在另一个实施方案中，本发明提供分离的抗CD70单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含的重链可变区含有:(a)V_H CDR1区，其包含选自SEQ ID NO:11、12、13、14和15的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:11、12、13、14和15相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(b)V_H CDR2区，其包含选自SEQ ID NO:16、17、18、19和20的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:16、17、18、19和20相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(c)V_H CDR3区，其包含选自SEQ ID NO:21、22、23、24和25的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:21、22、23、24和25相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(d)V_K CDR1区，其包含选自SEQ ID NO:26、27、28、29和30的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:26、27、28、29和30相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(e)V_K CDR2区，其包含选自SEQ ID NO:31、32、33、34和35的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:31、32、33、34和35相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)V_K CDR3区，其包含选自SEQ ID NO:36、37、38、39和40的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:36、37、38、39和40相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列。

本发明的工程化抗体包括例如为了改善抗体特性而对其V_H和/或V_K内的构架残基进行了修饰的抗体。进行这样的构架修饰一般是为了降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个构架残基“回复突变”为相应的种系序列。更特别地，经历体细胞突变的抗体可含有与衍生该抗体的种系序列不同的构架残基。通过比较抗体构架序列与衍生该抗体的种系序列，可以鉴定这些残基。这些“回复突变”的抗体也包括在本发明中。例如，对于10B4，V_H的氨基酸残基#2(FR1内)是异亮氨酸，而在相应的V_H 3-30.3种系序列中该残基为缬氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，可以通过(例如)定点诱变或PCR介导的诱变，将该体细胞突变“回复突变”为种系序列(例如，10B4的V_H的FR1的残基2可以从异亮氨酸“回复突变”为缬氨酸)。

另一个例子是，对于10B4，V_H的氨基酸残基#30(FR1内)是甘氨酸，而在相应的V_H 3-30.3种系序列中该残基为丝氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将10B4的V_H的FR1的残基30从甘氨酸“回复突变”为丝氨酸。

另一个例子是，对于8B5，V_H的氨基酸残基#24(FR1内)是苏氨酸，而在相应的V_H 3-33种系序列中该残基为丙氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将8B5的V_H的FR1的残基24从苏氨酸“回复突变”为丙氨酸。

另一个例子是，对于8B5，V_H的氨基酸残基#77(FR3内)是赖氨酸，而在相应的V_H 3-33种系序列中该残基为天冬酰胺。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将8B5的V_H的FR3的残基11从赖氨酸“回复突变”为天冬酰胺。

另一个例子是，对于8B5，V_H的氨基酸残基#80(FR3内)是丝氨酸，而在相应的V_H 3-33种系序列中该残基为酪氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将8B5的V_H的FR3的残基14从丝氨酸“回复突变”为酪氨酸。

另一个例子是，对于69A7，V_H的氨基酸残基#50(FR2内)是亮氨酸，而在相应的V_H 4-61种系序列中该残基为异亮氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将69A7的V_H的FR2的残基13从亮氨酸“回复突变”为异亮氨酸。

另一个例子是，对于69A7，V_H的氨基酸残基#85(FR3内)是精氨酸，而在相应的V_H 4-61种系序列中该残基为丝氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将69A7的V_H的FR3的残基18从精氨酸“回复突变”为丝氨酸。

另一个例子是，对于69A7，V_H的氨基酸残基#89(FR3内)是苏氨酸，而在相应的V_H 4-61种系序列中该残基为丙氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将69A7的V_H的FR3的残基22从苏氨酸“回复突变”为丙氨酸。

另一个例子是，对于10B4，V_L的氨基酸残基#46(FR2内)是苯丙氨酸，而在相应的V_L L18种系序列中该残基为亮氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将10B4的V_L的FR2的残基12从苯丙氨酸“回复突变”为亮氨酸。

另一个例子是，对于69A7，V_L的氨基酸残基#49(FR2内)是苯丙氨酸，而在相应的V_L L6种系序列中该残基为酪氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将69A7的V_L的FR2的残基15从苯丙氨酸“回复突变”为酪氨酸。

另一种类型的构架修饰涉及对构架区内、乃至一个或多个CDR区内的一个或多个残基进行突变，以除去T细胞表位，从而降低该抗体的潜在的免疫原性。该方法也被称为“脱免疫”，在Carr等的公布号为20030153043的美国专利中详细记载。

本发明的工程化抗体也包括其中已经通过改变抗体上T细胞表位相互作用的氨基酸修饰对氨基酸残基进行修饰从而提高或降低免疫原性应答的那些抗体(参见，例如美国专利No.6,835,550；6,897,049和6,936249)。

除了在构架区或CDR区内进行的修饰以外，或者作为它的替代方案，也可以将本发明的抗体改造为在Fc区内包括修饰，一般是为了改变该抗体的一种或多种功能特性，如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，也可以将本发明的抗体化学修饰(例如一个或多个化学部分可以连接到该抗体上)，或者修饰改变其糖基化，以改变该抗体的一种或多种功能特性。这些实施方案均在下文详细描述。Fc区中残基的编号是Kabat的EU指数的编号。

在一个实施方案中，修饰CH1的铰链区，使该铰链区中半胱氨酸残基的数目改变，例如增加或减少。该方法在Bodmer等的美国专利No.5,677,425号中详细记载。改变CH1铰链区中半胱氨酸的数目是为了(例如)促进轻链和重链的装配，或提高或降低抗体的稳定性。

在另一实施方案中，对抗体的Fc铰链区进行突变，以降低该抗体的生物半衰期。更具体地，向Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区引入一个或多个氨基酸突变，使得该抗体与葡萄球菌蛋白A(SpA)的结合比天然Fc-铰链结构域与SpA的结合减弱。该方法在Ward等的美国专利No.6,165,745号中详细记载。

在另一实施方案中，修饰抗体以提高其生物半衰期。可以使用各种方法。例如，如Ward的美国专利No.6,277,375所述，可以引入一个或多个如下突变:T252L、T254S、T256F。或者，如Presta等的美国专利No.5,869,046和6,121,022所述，为了提高生物半衰期，该抗体可以在CH1或CL区内进行改变，使之含有来自IgG Fc区CH2结构域的两个环的补救受体结合表位。

在其他一些实施方案中，通过将至少一个氨基酸残基置换为不同的氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体的效应功能。例如，可以将选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320、322的一个或多个氨基酸置换为不同的氨基酸残基，使得该抗体对效应配体的亲和力改变，但是保留亲本抗体的抗原结合能力。其亲和力被改变的效应配体可以是，例如，Fc受体或补体的C1成分。该方法在Winter等的美国专利No.5,624,821和5,648,260中更详细地描述。

在另外一个实施例中，可以将选自氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸置换为不同的氨基酸残基，使得该抗体的C1q结合改变和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)降低或消除。该方法在Idusogie等的美国专利No.6,194,551中更详细地描述。

在另外一个实施例中，改变氨基酸位点231和239中的一个或多个氨基酸残基，从而改变该抗体固定补体的能力。该方法在Bodmer等的PCT公布WO 94/29351中进一步描述。

在另外一个实施例中，为了提高抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或提高抗体对Fcγ受体的亲和力，通过在下列位点处修饰一个或多个氨基酸来修饰Fc区:238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。该方法在Presta的PCT公布WO 00/42072中进一步描述。而且，人IgG1上对于FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点已经作图，并且已经描述了具有改善的结合的变体(参见，Shields，R.L.等(2001)J.Biol.Chem.276:6591-6604)。位点256、290、298、333、334和339处的特定突变显示改善了与FcγRIII的结合。另外，下列组合突变体显示改善了与FcγRIII的结合:T256A/S298A，S298A/E333A，S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。

在另一实施方案中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备无糖基化的抗体(即该抗体缺乏糖基化)。例如，为了提高抗体对抗原的亲和力，可以改变糖基化。这样的碳水化合物修饰可以通过(例如)改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可以进行一个或多个氨基酸置换，使一个或多个可变区构架糖基化位点消失，从而消除该位点处的糖基化。这种无糖基化可以提高抗体对抗原的亲和力。这种方法在Co等的美国专利No.5,714,350和6,350,861中更详细地描述。

另外或者可替代地，可以制备糖基化类型改变的抗体，如岩藻糖基残基数目减少的低岩藻糖基化抗体，或等分GlcNac结构增多的抗体。已经证明这种改变的糖基化模式提高了抗体的ADCC能力。这种碳水化合物修饰可以通过(例如)在糖基化机制改变的宿主细胞中表达抗体来实现。糖基化机制改变的细胞在本领域中已有描述，能够用作宿主细胞，在其中表达本发明的重组抗体，从而产生糖基化改变的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因，FUT8(α(1，6)岩藻糖基转移酶基因)，因此在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在它们的碳水化合物中缺乏岩藻糖。通过使用两种替代载体定向破坏CHO/DG44细胞中的FUT8基因，产生Ms704、Ms705和Ms709FUT8^-/-细胞系(参见Yamane等的美国专利申请No.20040110704和Yamane-Ohnuki等.(2004)Biotechnol Bioeng 87：614-22)。另一个例子是，Hanai等的EP 1,176,195描述了具有功能破坏的FUT8基因的细胞系，该基因编码岩藻糖转移酶，由于减少或消除了α(1，6)键相关的酶，在这种细胞系中表达的抗体表现为低岩藻糖基化。Hanai等也描述了用于向结合抗体Fc区的N-乙酰葡萄糖胺上添加岩藻糖的酶活性低或不具有酶活性的细胞系，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。Presta的PCT公布WO 03/035835记载了一种变异CHO细胞系，Lec13细胞，其将岩藻糖连接到Asn(297)-连接的碳水化合物上的能力降低，也导致在该宿主细胞中表达的抗体为低岩藻糖基化(参见，Shields，R.L.等(2001)J.Biol.Chem.277：26733-26740)。Umana等的PCT公布WO 99/54342记载了表达糖蛋白修饰的糖基转移酶(例如β(1，4)-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTIII))的工程化细胞系，因此该工程化细胞系中表达的抗体表现为等分GlcNac结构增加，导致抗体的ADCC活性提高(参见，Umana等(1999)Nat.Biotech.17：176-180)。此外，抗体的岩藻糖残基可以用岩藻糖苷酶切下。例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶从抗体上除去岩藻糖残基(Tarentino，A.L等.(1975)Biochem.14：5516-23)。

本发明涉及的对此处所述抗体的另一种修饰是PEG化。例如，为了提高抗体的生物(例如血清)半衰期，可以将该抗体PEG化。为了PEG化一种抗体，一般在一个或多个PEG基团与抗体或抗体片段连接的条件下，将该抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)如PEG的反应性酯或醛衍生物反应。优选地，通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行PEG化。本文使用的术语“聚乙二醇”包括用来衍生化其他蛋白质的任何PEG形式，如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，将要PEG化的抗体是一种无糖基化的抗体。将蛋白质PEG化的方法在本领域中公知，并且可以用于本发明的抗体。参见，例如，Nishimura等的EP 0 154316和Ishikawa等的EP 0 401 384。

抗体的物理性质

本发明的抗体可以进一步通过抗CD70抗体的各种物理性质进行表征。可以利用各种试验基于这些物理性质检测和/或区分不同类别的抗体。

在某些实施方案中，本发明的抗体可以在轻链或重链可变区中含有一个或多个糖基化位点。可变区中一个或多个糖基化位点的存在可能由于抗原结合改变而导致抗体的免疫原性提高或者抗体的pK改变(Marshall等(1972)Annu Rev Biochem 41：673-702；Gala FA和MorrisonSL(2004)J Immunol 172：5489-94；Wallick等(1988)J Exp Med168：1099-109；Spiro RG(2002)Glycobiology 12：43R-56R；Parekh等(1985)Nature 316：452-7；Mimura等(2000)Mol Immunol 37：697-706)。已知糖基化在含有N-X-S/T序列的基序处发生。可变区糖基化可以用Glycoblot试验进行检测，该试验切割抗体，产生Fab，然后利用测定高碘酸盐氧化和席夫碱形成的试验检测糖基化。或者，可变区糖基化也可以用Dionex光层析法(Dionex-LC)检测，该方法从Fab上切下糖成为单糖，并且分析各种糖的含量。在某些情况中，优选不含可变区糖基化的抗CD70抗体。这可以通过选择在可变区中不含糖基化基序的抗体或者利用本领域公知的标准技术突变糖基化基序内的残基来实现。

在一个优选实施方案中，本发明的抗体不含天冬酰胺异构化位点。脱酰胺或异天冬氨酸作用可以分别在N-G或D-G序列上发生。脱酰胺或异天冬氨酸作用导致产生异天冬氨酸，这通过在侧链羧基末端而不是在主链上产生扭结的结构而降低了抗体的稳定性。异天冬氨酸的产生可以用iso-quant试验来测定，该试验利用反相HPLC检测异天冬氨酸。

每种抗体具有独特的等电点(pI)，但是通常抗体落入6至9.5的pH范围内。IgG1抗体的pI一般落入7-9.5的pH范围内，IgG4抗体的pI一般落入6-8的pH范围内。抗体可以具有该范围之外的pI。尽管这种作用通常未知，但是推测pI落于正常范围之外的抗体在体内条件下可能具有一定的解折叠和不稳定性。等电点可以用毛细管等电聚焦试验来测定，该试验产生pH梯度，并且可以利用激光聚焦来提高精确性(Janini等(2002)Electrophoresis 23：1605-11；Ma等(2001)Chromatographia 53：S75-89；Hunt等(1998)J Chromatogr A 800：355-67)。在某些情况中，优选pI值落入正常范围内的抗CD70抗体。这可以通过选择pI位于正常范围内的抗体或者通过利用本领域公知的标准技术突变带电荷的表面残基来实现。

每种抗体的熔解温度指示热稳定性(Krishnamurthy R和ManningMC(2002)Curr Pharm Biotechnol 3：361-71)。较高的热稳定性表示在体内有较高的总体抗体稳定性。抗体的熔点可以用诸如差示扫描量热法(Chen等(2003)Pharm Res 20：1952-60；Ghirlando等(1999)Immunol Lett68：47-52)等技术来测量。T_M1表示抗体最初解折叠的温度。T_M2表示抗体完全解折叠的温度。通常，优选地本发明的抗体的T_M1大于60℃，优选大于65℃，甚至更优选大于70℃。此外，抗体的热稳定性也可以利用圆二色性来测量(Murray等(2002)J.Chromatogr Sci 40：343-9)。

在一个优选实施方案中，选择不快速降解的抗体。抗CD70抗体的破裂可以用本领域公知的毛细管电泳(CE)和MALDI-MS来测定(Alexander AJ和Hughes DE(1995)Anal Chem 67：3626-32)。

在另一个优选实施方案中，选择具有最小的聚集作用的抗体。聚集可以导致触发不希望的免疫应答和/或改变的或不利的药代动力学性质。通常，抗体具有25％或更少的聚集是可以接受的，优选20％或更少，甚至更优选15％或更少，甚至更优选10％或更少，甚至更优选5％或更少。聚集可以用本领域公知的几种技术来测定，包括大小排阻柱(SEC)高效液相层析(HPLC)和光散射法，用来鉴定单体、二聚体、三聚体或多聚体。

抗体工程化方法

如上所述，能够利用具有此处公开的V_H和V_K序列的抗CD70抗体，通过修饰V_H和/或V_K序列或与之连接的恒定区，产生新的抗CD70抗体。因此，在本发明的另一方面，利用本发明的抗CD70抗体(例如2H5、10B4、8B5、18E7或69A7)的结构特征，产生结构上相关的抗CD70抗体，该结构上相关的抗体保留本发明抗体的至少一种功能特性，如与人CD70结合。如上所述，例如，2H5、10B4、8B5、18E7或69A7的一个或多个CDR区或其突变可以与已知的构架区和/或其他CDR重组组合，从而产生另外的重组工程化的本发明的抗CD70抗体。其他类型的修饰包括以上部分所述的修饰。用于工程化方法的起始材料是此处提供的一种或多种V_H和/或V_K序列，或其一个或多个CDR区。为了产生工程化抗体，不一定必须实际制备(即表达为蛋白质)具有此处提供的一种或多种V_H和/或V_K序列，或其一个或多个CDR区的抗体。而是用该序列中所含的信息作为起始材料，产生由原始序列衍生的“第二代”序列，然后制备该“第二代”序列，并将其表达为蛋白质。

因此，在另一实施方案中，本发明提供一种制备抗CD70抗体的方法，包括:

(a)提供:(i)重链可变区抗体序列，其包含选自SEQ ID NO:11、12、13、14和15的CDR1序列、选自SEQ ID NO:16、17、18、19和20的CDR2序列、和/或选自SEQ ID NO:21、22、23、24和25的CDR3序列；和/或(ii)轻链可变区抗体序列，其包含选自SEQ IDNO:26、27、28、29和30的CDR1序列、选自SEQ ID NO:31、32、33、34和35的CDR2序列、和/或选自SEQ ID NO:36、37、38、39和40的CDR3序列；

(b)改变重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列内的至少一个氨基酸残基，从而产生至少一个改变的抗体序列；和

(c)将该改变的抗体序列表达为蛋白质。

可以利用标准分子生物学技术制备和表达所述改变的抗体序列。

优选地，由改变的抗体序列编码的抗体保留此处所述抗CD70抗体的一种、一些或全部功能特性，该功能特性包括但不限于与CD70特异性结合。

改变的抗体的功能特性可以用本领域中使用的和/或此处所述的(如实施例中所述的)标准试验(例如流式细胞术、结合测定)来评价。

在本发明抗体的工程化方法的某些实施方案中，可以沿全部或部分抗CD70抗体编码序列随机或选择性引入突变，并可以针对结合活性和/或如此处所述的其他功能特性，筛选获得的修饰的抗CD70抗体。突变方法在本领域中已经描述。例如，Short的PCT公布WO 02/092780记载了利用饱和诱变、合成连接装配或它们的组合产生和筛选抗体突变的方法。另外，Lazar等的PCT公布WO 03/074679也记载了利用计算筛选方法优化抗体的生理化学性质的方法。

编码本发明的抗体的核酸分子

本发明的另一方面涉及编码本发明的抗体的核酸分子。该核酸可以存在于完整细胞、细胞裂解物中，或以部分纯化或基本上纯的形式存在。当通过包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳在内的标准技术和本领域公知的其他方法与其他细胞成分或其他污染物(例如其他细胞核酸或蛋白质)分离纯化时，核酸是“分离的”或“基本上纯的”。参见，F.Ausubel等ed.(1987)Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以含有或者可以不含内含子序列。在一个优选实施方案中，该核酸是cDNA分子。

本发明的核酸可以利用标准分子生物学技术获得。对于杂交瘤(例如，由如下文进一步描述的携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，编码由杂交瘤制备的抗体轻链和重链的cDNA可以用标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于从免疫球蛋白基因文库中获得的抗体(例如使用噬菌体展示技术)，可以从文库中回收编码该抗体的一种或多种核酸。

本发明优选的核酸分子是编码2H5、10B4、8B5、18E7或69A7单克隆抗体的V_H和V_L序列的核酸分子。编码2H5、10B4、8B5、18E7和69A7的V_H序列的DNA序列分别在SEQ ID NO:41、42、43、44和45中示出。编码2H5、10B4、8B5、18E7和69A7的V_L序列的DNA序列分别在SEQ ID NO:46、47、48、49和50中示出。

一旦获得编码V_H和V_L片段的DNA片段，即可通过标准重组DNA技术进一步操作这些DNA片段，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码V_L或V_H的DNA片段与编码另外一种蛋白质如抗体恒定区或柔性连接体的另一个DNA片段有效连接。如本文使用的术语“有效连接”意思是两个DNA片段连接在一起，使得这两个DNA片段编码的氨基酸序列保持符合阅读框。

通过将编码V_H的DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另外一种DNA分子有效连接，可以将分离的编码V_H区的DNA转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在本领域中公知(参见，例如，Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunologicl Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版号94-61242)，包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是最优选的是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，编码V_H的DNA可以与只编码重链CH1恒定区的另外一种DNA分子有效连接。

通过将编码V_L的DNA与编码轻链恒定区CL的另外一种DNA分子有效连接，可以将分离的编码V_L区的DNA转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列在本领域中公知(参见，例如，Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunologicl Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版号94-61242)，包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。在优选的实施方案中，轻链恒定区可以是K或λ恒定区，但最优选地是K恒定区。

为了产生scFv基因，将编码V_H和V_L的DNA片段与编码柔性连接体例如编码氨基酸序列(Gly₄-Ser)₃的另外一个片段有效连接，使得V_H和V_L序列可以表达为连续的单链蛋白质，其V_L和V_H区通过该柔性连接体连接(参见，例如Bird等(1988)Science 242：423-426；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty等(1990)Nature348：552-554)。

本发明的单克隆抗体的产生

本发明的单克隆抗体(mAb)能够通过多种技术制备，包括常规的单克隆抗体方法，例如，Kohler和Milstein(1975)Nature 256：495所述的标准体细胞杂交技术。虽然优选体细胞杂交技术，但是原则上，能使用制备单克隆抗体的其他技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌转化。

用于制备杂交瘤的优选的动物系统是鼠系统。用小鼠产生杂交瘤是一种完善建立的程序。免疫程序和分离用于融合的被免疫脾细胞的技术是本领域公知的。融合配偶体(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是公知的。

本发明的嵌合或人源化抗体可以基于如上所述获得的鼠单克隆抗体的序列来制备。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以从目标鼠杂交瘤中获得，并且使用标准分子生物学技术将其改造为含有非鼠(例如人类)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可以利用本领域公知的方法将鼠可变区连接到人恒定区上(参见，例如，Cabilly等的美国专利No.4,816,567)。为了产生人源化抗体，可以利用本领域公知的方法将鼠CDR区插入人构架内(参见，例如，Winter的美国专利No.5,225,539，和Queen等的美国专利No.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

在一个优选实施方案中，本发明的抗体是人单克隆抗体。这种抗CD70人单克隆抗体能用携带部分人免疫系统而不是小鼠系统的转基因或转染色体小鼠产生。这些转基因和转染色体小鼠包括在此分别被称作HuMab

和KM

的小鼠，并且在此通称为“人Ig小鼠”。

HuMab

(Medarex，Inc.)包含编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座，和使内源μ和K链基因座失活的定向突变(参见，例如，Lonberg等(1994)Nature 368(6474)：856-859)。因此，该小鼠表现为小鼠IgM或κ表达降低，并且响应于免疫，导入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变，从而产生高亲和力人IgGκ单克隆抗体(Lonberg，N.等(1994)，同上；综述Lonberg，N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113：49-101；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.13：65-93，和Harding，F.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci 764：536-546)。HuMab小鼠的制备和使用，以及该小鼠携带的基因组修饰，在下面的文献中详细描述:Taylor，L.等(1992)Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen，J.等(1993)International Immunology 5：647-656；Tuaillon等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 90：3720-3724；Choi等(1993)Nature Genetics 4：117-123；Chen，J.等(1993)EMBO J.12：821-830；Tuaillon等(1994)J.Immunol.152：2912-2920；Taylor，L.等(1994)International Immunology6：579-591；和Fishwild，D.等(1996)Nature Biotechnology 14：845-851，这些文献的内容全文引入本文作为参考。进一步参见，Lonberg和Kay的美国专利No.5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；和5,770,429；和Surani等的美国专利No.5,545,807；Lonberg和Kay的PCT公布号WO 92/03918，WO 93/12227，WO 94/25585，WO 97/13852，WO 98/24884和WO99/45962；和Korman等的PCT公布号WO 01/14424。

在另一实施方案中，可以用转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠，例如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠，产生本发明的人抗体。这种小鼠在此被称为“KM

，在Ishida等的PCT公布WO 02/43478中详细描述。

再者，表达人免疫球蛋白基因的替代转基因动物系统在本领域中可以获得，能够用来产生本发明的抗CD70抗体。例如，可以使用一种被称作Xenomouse(Abgenix，Inc.)的替代转基因系统，这种小鼠在例如Kucherlapati等的美国专利No.5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963中描述。

而且，表达人免疫球蛋白基因的替代转染色体动物系统在本领域中可以获得，能够用来产生本发明的抗CD70抗体。例如，可以使用携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠，其被称作“TC小鼠”；这种小鼠在Tomizuka等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727中描述。作为另外一个例子，本领域中已经描述了携带人重链和轻链转染色体的牛(Kuroiwa等(2002)Nature Biotechnology 20：889-894)，其能够用来产生本发明的抗CD70抗体。

本发明的人单克隆抗体也可以使用用于筛查人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法制备。这种用于分离人抗体的噬菌体展示方法在本领域中已经建立。参见，例如，Ladner等的美国专利No.5,223,409；5,403,484；和5,571,698；Dower等的美国专利No.5,427,908和5,580,717；McCafferty等的美国专利No.5,969,108和6,172,197；和Griffiths等的美国专利No.5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,9130,31,32,33,34,35和36,593,081。

本发明的人单克隆抗体也可以用SCID小鼠制备，该SCID小鼠中重构了人免疫细胞，因此在免疫时能够产生人抗体应答。这种小鼠在例如Wilson等的美国专利No.5,476,996和5,698,767中描述。

人Ig小鼠的免疫

当使用人Ig小鼠产生本发明的人抗体时，根据Lonberg，N.等(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild，D.等(1996)Nature Biotechnology14：845-851；和PCT公布WO 98/24884和WO 01/14424所述，用表达CD70的细胞系、纯化的或富集的CD70抗原和/或重组CD70或CD70融合蛋白的制品免疫该小鼠。优选地，第一次免疫时小鼠为6-16周龄。例如，可以使用纯化的或重组的CD70抗原的制剂(5-50μg)腹膜内免疫人Ig小鼠。

产生抗CD70完全人单克隆抗体的详细程序在下面的实施例1中描述。应用各种抗原积累的经验证明，当最初使用弗氏完全佐剂中的抗原腹膜内(IP)免疫，接着隔周用弗氏不完全佐剂中的抗原腹膜内免疫(最多共六次)时，转基因小鼠产生应答。但是，发现弗氏佐剂之外的佐剂也是有效的。另外，发现在没有佐剂时，全细胞具有高度免疫原性。在免疫方案进程中用例如眼眶后取血获得的血浆样品监测免疫应答。通过ELISA筛选血浆，用具有足够抗CD70人免疫球蛋白效价的小鼠进行融合(如实施例1所述)。用抗原对小鼠进行静脉内加强免疫，3天后处死并且取出脾脏。预期每次免疫可能需要2-3次融合。每一种抗原一般免疫6-24只小鼠。通常HCo7和HCo12系都使用。HCo7和HCo12小鼠系的产生分别在美国专利No.5,770,429和PCT公开WO 01/09187的实施例2中描述。另外，HCo7和HCo12转基因可以杂交，产生具有两种不同人重链转基因(HCo7/HCo12)的一种小鼠。可替代地或者另外，如PCT公开WO 02/43478所述，可以使用KM

系。

产生本发明的人单克隆抗体的杂交瘤的制备

为了制备产生本发明的人单克隆抗体的杂交瘤，从被免疫的小鼠中分离脾细胞和/或淋巴结细胞，并且与合适的无限增殖化细胞系(例如小鼠骨髓瘤细胞系)融合。根据抗原特异性抗体的产生筛选得到的杂交瘤。例如，可以使用50％ PEG，将来自被免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬液与六分之一数量的P3X63-Ag8.653非分泌小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1580)融合。或者，可以应用基于电场的电融合法，应用Cyto Pulse大腔室细胞融合电穿孔仪(Cyto Pulse Sciences，Inc.，GlenBurnie，MD)，融合免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液。将细胞以大约2×10⁵的密度接种于平底微量滴定板中，接着在含有L-谷氨酰胺和丙酮酸钠(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)并且进一步含有20％胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)、18％ P388DI条件基质、5％ Origen杂交瘤克隆因子(BioVeris，Gaithersburg，VA)、4mM L-谷氨酰胺、5mM HEPES，0.055mMβ-巯基乙醇、50单位/毫升青霉素、50mg/ml链霉素和1×次黄嘌呤-氨基喋呤-胸苷(HAT)培养基(Sigma；融合后24小时加入HAT)的DMEM高葡萄糖培养基中孵育一周。一周之后，在用HT替换了HAT的培养基中培养细胞。然后通过ELISA根据人单克隆IgM和IgG抗体筛选各孔。通常在10-14天之后可以观察到杂交瘤生长。将分泌抗体的杂交瘤再次平板接种，再次筛选，如果对于人IgG仍然是阳性，则可以通过有限稀释将单克隆抗体至少亚克隆两次。然后体外培养稳定的亚克隆，以在组织培养基中产生少量抗体用于表征。

为了纯化人单克隆抗体，选择的杂交瘤可以在用于单克隆抗体纯化的两升旋转摇瓶中生长。过滤上清液，浓缩，之后用蛋白A-sepharose(Pharmacia，Piscataway，N.J.)进行亲和层析。洗脱下来的IgG通过凝胶电泳和高效液相色谱法检查以确保纯度。将缓冲溶液换成PBS，用1.43的消光系数根据OD280确定浓度。可将单克隆抗体分成等份并且在-80℃下保存。

产生本发明的单克隆抗体的转染瘤的制备

利用(例如)本领域公知的重组DNA技术和基因转染方法的组合(例如，Morrison，S.(1985)science 229：1202)，也能在宿主细胞转染瘤中产生本发明的抗体。

例如，为了表达抗体或其抗体片段，可通过标准分子生物学技术(例如，使用表达目标抗体的杂交瘤进行PCR扩增或cDNA克隆)，获得编码部分或全长轻链和重链的DNA，并将该DNA插入到表达载体中，使得基因与转录和翻译控制序列有效连接。在上下文中，术语“有效连接”意思是抗体基因连接到载体中，使得载体中的转录和翻译控制序列发挥它们调节该抗体基因的转录和翻译的预期功能。选择与所用的表达宿主细胞相匹配的表达载体和表达控制序列。抗体轻链基因和抗体重链基因可被插入到分开的载体中，或者，更通常地，将两个基因插入到同一表达载体中。通过标准方法将抗体基因插入到表达载体中(例如，抗体基因片段上的互补限制性位点与载体连接，或者如果不存在限制性位点的活，则平端连接)。通过插入到已经编码期望的同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，使得V_H区段与载体中的C_H区段有效连接，而V_K区段与载体中的C_L区段有效连接，可以利用本文描述的抗体的轻链和重链可变区产生任意抗体同种型的全长抗体基因。另外，或者可替代地，重组表达载体能编码有利于宿主细胞分泌抗体链的信号肽。可将抗体链基因克隆到载体中，使得信号肽与该抗体链基因的氨基末端符合阅读框地连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的蛋白质的信号肽)。

除了抗体链基因，本发明的重组表达载体还带有控制该抗体链基因在宿主细胞中表达的调节序列。术语“调节序列”包括启动子、增强子和控制抗体链基因转录或翻译的其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。这样的调节序列例如在Goeddel(Gene Expression Technology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990))中描述。本领域技术人员应当理解，表达载体的设计，包括调节序列的选择，取决于诸如要转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白质表达水平等因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括指导蛋白质在哺乳动物细胞中高水平表达的病毒元件，例如来源于巨细胞病毒(CMV)、猿病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。可替代地可以使用非病毒调节序列，例如泛蛋白启动子或β-珠蛋白启动子。另外，调节元件也可由来自诸如SRα启动子系统等不同来源的序列组成，SRα启动子系统含有来自SV40早期启动子的序列和人1型T细胞白血病病毒的长末端重复序列(Takebe，Y.等(1988)Mol.Cell.Biol.8：466-472)。

除了抗体链基因和调节序列以外，本发明的重组表达载体还可以携带另外的序列，例如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如，复制起点)和选择性标记基因。选择性标记基因有利于筛选载体已经导入其中的宿主细胞(参见，例如，Axel等的美国专利No.4,399,216，4,634,665和5,179,017)。例如，选择性标记基因一般给已经导入载体的宿主细胞带来抗药性，例如G418、潮霉素或氨甲喋呤抗性。优选的选择性标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(在dhfr-宿主细胞中用于氨甲喋呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。

为了表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中。术语“转染”的各种形式包括常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞中的各种技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等等。虽然在理论上可以在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但是优选在真核细胞中，最优选在哺乳动物宿主细胞中表达该抗体，因为这样的真核细胞，特别是哺乳动物细胞，比原核细胞更可能组装和分泌正确折叠并且具有免疫活性的抗体。据报道，原核表达抗体基因无法高产率地产生活性抗体(Boss，M.A.和Wood，C.R.(1985)Immunology Today 6：12-13)。

用于表达本发明的重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中描述的dhfr-CHO细胞，和DHFR选择性标记一起使用，例如，如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621所述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别地，用于NSO骨髓瘤细胞的另一种优选表达系统是WO 87/04462、WO89/01036和EP 338,841公开的GS基因表达系统。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养足以使抗体在宿主细胞中表达的时间，或更优选地，培养足以使抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中的时间，而产生抗体。可应用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。

抗体与抗原结合的表征

通过(例如)流式细胞术，可以检测本发明的抗体与CD70的结合。简要地说，从组织培养瓶中新鲜收获表达CD70的细胞，制备单细胞悬浮液。表达CD70的细胞悬浮液直接用第一抗体染色或者在用1％低聚甲醛的PBS溶液固定后用第一抗体染色。约1百万个细胞重悬浮在含0.5％ BSA和50-200μg/ml第一抗体的PBS中，在冰上孵育30分钟。细胞用含有0.1％ BSA、0.01％ NaN₃的PBS洗涤两次，重悬浮在100μl 1:100稀释的FITC-偶联的山羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)中，在冰上再孵育30分钟。细胞再次洗涤两次，重悬浮在0.5ml洗涤缓冲液中，在FACSCalibur细胞计数仪(Becton-Dickinson，San Jose，CA)上分析荧光染色。

或者，可以通过标准ELISA检测本发明抗体与CD70的结合。简要地说，用0.25μg/ml的纯化CD70在PBS中的溶液包被微量滴定板，然后用PBS中的5％牛血清白蛋白封闭。向各个孔中加入抗体的稀释液(例如，来自CD70免疫小鼠的血浆的稀释液)，并且在37℃下孵育1-2小时。用PBS/Tween洗涤培养板，之后和与碱性磷酸酶偶联的第二试剂(例如，对于人抗体，为山羊抗人IgG Fc特异性多克隆试剂)一起在37℃下孵育1小时。洗涤后，培养板用pNPP底物(1mg/ml)显色，并且在OD405-650下分析。优选地，用表现出最高效价的小鼠进行融合。

如上所述的ELISA分析也可以用来筛选表现出与CD70免疫原有阳性反应性的杂交瘤。将与CD70高亲合力结合的杂交瘤进行亚克隆，并且进一步表征。从每个杂交瘤中选择保留母细胞反应性的一个克隆(通过ELISA)，制备5-10小瓶细胞库，保存在-140℃下，用于抗体纯化。

为了纯化抗CD70抗体，选择的杂交瘤在用于单克隆抗体纯化的两升旋转摇瓶中生长。过滤上清液并且浓缩，然后用蛋白A-sepharose(Pharmacia，Piscataway，NJ)进行亲和层析。通过凝胶电泳和高效液相色谱检查洗脱的IgG以确保纯度。将缓冲溶液换成PBS，并且使用1.43的消光系数根据OD₂₈₀确定浓度。将单克隆抗体分成等份并且在-80℃下保存。

为了确定选择的抗CD70单克隆抗体是否与独特表位结合，可以使用商售试剂(Pierce，Rockford，IL)将每种抗体生物素化。可以使用如上所述的CD70包被的ELISA板，应用未标记的单克隆抗体和生物素化单克隆抗体进行竞争研究。可以使用链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶探针检测生物素化mAb的结合。或者，如下面的实施例进一步所述，可以使用放射性标记的抗体进行竞争性研究，并且可以用Scatchard分析检测未标记的竞争抗体。

为了确定被纯化的抗体的同种型，可以用对特定同种型抗体具有特异性的试剂进行同种型ELISA。例如，为了确定人单克隆抗体的同种型，在4℃下用1μg/ml抗人免疫球蛋白包被微量滴定板的孔过夜。用1％BSA封闭之后，平板与1μg/ml或更少的测试单克隆抗体或纯化的同种型对照物在室温下反应1-2小时。这些孔然后与人IgG1或人IgM特异性碱性磷酸酶偶联的探针反应。如上所述使平板显色并且分析。

可以通过Western印迹法进一步检测抗CD70人IgG与CD70抗原的反应性。简要地说，制备CD70并进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离的抗原转移到硝酸纤维素膜上，用10％胎牛血清封闭，并用待检测的单克隆抗体探查。人IgG的结合可以用抗人IgG碱性磷酸酶检测，并用BCIP/NBT底物片(Sigma Chem.Co.，St.Louis，Mo.)显色。

免疫偶联物

另一方面，本发明涉及与诸如细胞毒素、药物(例如免疫抑制剂)或放射性毒素等治疗性部分偶联的抗CD70抗体或其片段。这些偶联物在此被称为“免疫偶联物”。包括一个或多个细胞毒素的免疫偶联物被称作“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒剂包括对细胞有害(例如杀伤细胞)的任何试剂。实例包括:紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、吐根碱、丝裂霉素、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩糖苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素和它们的类似物或同系物。治疗剂还包括，例如:抗代谢物(例如，氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺(decarbazine))，烷化剂(例如，氮芥、苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露糖醇、链唑霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺合铂(II)(DDP)顺铂)，氨茴霉素类(例如，柔红菌素(以前称为道诺霉素)和阿霉素)，抗生素(例如，放线菌素D(以前称为放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC))，和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。

能与本发明抗体偶联的治疗性细胞毒素的其他优选例子包括倍癌霉素、刺孢霉素、美坦生、auristatin、和它们的衍生物。刺孢霉素抗体偶联物的一个例子是可作为商品购得的(Mylotarg^TM；Wyeth-Ayerst)。

可以利用本领域使用的连接体技术将细胞毒素与本发明的抗体偶联。已经用于将细胞毒素与抗体偶联的连接体类型的实例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽的连接体。可以选择，例如，在溶酶体区室内易被低pH切割或易被蛋白酶切割的连接体，该蛋白酶例如是在肿瘤组织中优先表达的蛋白酶，如组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B、C、D)。

关于细胞毒素的类型、用于偶联治疗剂与抗体的连接体和方法的进一步讨论，参见Saito，G.等(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55：199-215；Trail，P.A.等(2003)Cancer.Immunol.Immunother.52：328-337；Payne，G.(2003)Cancer Cell 3：207-212；Allen，T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer 2：750-763；Pastan，I.和Kreitman，R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3：1089-1091；Senter，P.D.和Springer，C.J.(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.53：247-264。

本发明的抗体也可以与放射性同位素偶联，产生细胞毒性放射性药物，也被称作放射性免疫偶联物。能够与诊断或治疗性使用的抗体偶联的放射性同位素的例子包括但不限于碘¹³¹、碘¹²⁵、铟¹¹¹、钇⁹⁰和镥¹⁷¹。制备放射性免疫偶联物的方法在本领域中已经建立。放射性免疫偶联物的例子可以作为商品获得，包括Zevalin^TM(IDEC Pharmaceuticals)和Bexxar^TM(Corixa Pharmaceuticals)，并且能够利用类似的方法使用本发明的抗体制备放射性免疫偶联物。

本发明的抗体偶联物可用于修饰特定的生物学反应，且药物部分不应理解为局限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有需要的生物活性的蛋白质或多肽。这样的蛋白质包括，例如:具有酶活性的毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质，如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或生物学反应调节物，如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生长因子。

将这种治疗性部分与抗体偶联的技术是众所周知的，参见，例如，Arnon等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs InCancer Therapy”，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等(ed.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，“Antibodies ForDrug Delivery”，in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson等(ed.)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“Antibody Carriers OfCytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review”，in MonoclonalAntibodies’84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等(ed.)，pp.475-506(1985)；“Analysis，Results，And Future Prospective Of TheTherapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，inMonoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等(ed.)，pp.303-16(Academic Press 1985)，和Thorpe等，＂The Preparation AndCytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates，＂Immunol.Rev.，62：119-58(1982)。

双特异性分子

另一方面，本发明涉及包含本发明的抗CD70抗体或其片段的双特异性分子。本发明的抗体或其抗原结合部分可以被衍生化或连接到另一个功能性分子上，如另一个肽或蛋白质(例如另一个抗体或受体的配体)上，从而生成可与至少两个不同结合位点或靶分子结合的双特异性分子。本发明的抗体实际上可以被衍生化或连接到一个以上的其他功能性分子上，从而生成可与两个以上不同结合位点和/或靶分子结合的多特异性分子；这样的多特异性分子也包括在本文使用的术语“双特异性分子”内。为了产生本发明的双特异性分子，本发明的抗体可与一个或多个其他结合分子如其他抗体、抗体片段、肽或结合模拟物功能性连接(如通过化学偶联、基因融合、非共价结合等)，从而得到双特异性分子。

因此，本发明包括双特异性分子，其具有至少一种对于CD70的第一结合特异性和对于第二种目标表位的第二结合特异性。在本发明一个特定实施方案中，第二种目标表位是Fc受体，如人FcγRI(CD64)或人Fcα受体(CD89)。因此，本发明包括既能与表达FcγR或FcαR的效应细胞(如单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN))结合，又能与表达CD70的靶细胞结合的双特异性分子。这些双特异性分子将表达CD70的细胞导向于效应细胞，并且触发Fc受体介导的效应细胞活性，如表达CD70的细胞的吞噬作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、细胞因子释放、或超氧阴离子的产生。

在其中双特异性分子是多特异性分子的本发明的一个实施方案中，除抗-Fc结合特异性和抗CD70结合特异性之外，该分子还可包括第三结合特异性。在一个实施方案中，该第三结合特异性是抗增强因子(EF)部分，例如与参与细胞毒性活性的表面蛋白质结合因而增强针对靶细胞的免疫应答的分子。“抗增强因子部分”可以是与诸如抗原或受体等特定分子结合，从而导致结合决定簇对Fc受体或靶细胞抗原的作用增强的抗体、功能性抗体片段或配体。“抗增强因子部分”可与Fc受体或靶细胞抗原结合。可替代地，抗增强因子部分可以与一种实体结合，该实体不同于第一和第二结合特异性所结合的实体。例如，抗增强因子部分可与细胞毒性T细胞结合(如经由CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1或其他免疫细胞，该细胞导致针对靶细胞的免疫应答增强)。

在一个实施方案中，本发明的双特异性分子包含至少一个抗体或其抗体片段作为结合特异性，包括(例如)Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv或单链Fv。该抗体也可以是轻链或重链二聚体，或任何其最小片段，如Fv或单链构建体，如Ladner等的美国专利No.4,946,778所述，该专利的内容引入本文作为参考。

在一个实施方案中，对于Fcγ受体的结合特异性由单克隆抗体提供，该单克隆抗体的结合不被人免疫球蛋白G(IgG)阻断。本文使用的术语“IgG受体”是指位于染色体1上的8个γ-链基因的任意一个。这些基因编码总共12个跨膜或可溶性受体同种型，这些同种型分组为3个Fcγ受体类别:FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。在一个优选实施方案中，Fcγ受体是人高亲和力FcγRI。人FcγRI是72kDa的分子，对单体IgG表现出高亲和力(10⁸-10⁹M^-1)。

某些优选抗-Fcγ单克隆抗体的制备和表征由Fanger等在PCT申请WO88/00052和美国专利号4,954,617中描述，在此处将其内容整体引入作为参考。这些抗体在与受体的Fcγ结合位点不同的位点处与FcγRI、FcγRII或FcγRIII的表位结合，因而，其结合基本不被生理学水平的IgG阻断。可用于本发明中的特定抗-FcγRI抗体为mAb 22、mAb 32、mAb 44、mAb 62和mAb 197。产生mAb 32的杂交瘤可从美国典型培养物保藏中心获得，ATCC保藏号为HB9469。在另外一些实施方案中，抗-Fcγ受体抗体是单克隆抗体22的人源化形式(H22)。H22抗体的产生和表征在Graziano，R.F.等(1995)J.Immunol155(10)：4996-5002和Tempest等的PCT公布WO 94/10332中描述。产生H22抗体的细胞系以HA022CL1的名称保藏在美国典型培养物保藏中心，保藏号为CRL 11177。

在另外一些优选实施方案中，对Fc受体的结合特异性由可与人IgA受体如Fc-α受体(FcαRI(CD89))结合的抗体提供，该抗体的结合优选地不被人免疫球蛋白A(IgA)阻断。术语“IgA受体”包括位于染色体19上的一个α-基因的基因产物(FcαRI)。已知该基因编码几个55-110kDa的可变剪接跨膜同种型。FcαRI(CD89)在单核细胞/巨噬细胞、嗜酸性和嗜中性粒细胞上组成型表达，但不在非效应细胞群体上组成型表达。FcαRI对IgA1和IgA2两者均具有中等亲和力(约5×10⁷M^-1)，在暴露于诸如G-CSF或GM-CSF的细胞因子后该亲和力增加(Morton，H.C.等(1996)Critical Reviews in Immunology 16：423-440)。已描述了4种FcαRI-特异性单克隆抗体，它们被确定为A3、A59、A62和A77，它们在IgA配体结合域之外与FcαRI结合(Monteiro，R.C.等(1992)J.Immunol.148：1764)。

FcαRI和FcγRI是用于本发明的双特异性分子的优选触发受体，因为它们(1)主要表达于诸如单核细胞、PMN、巨噬细胞和树突细胞的免疫效应细胞上；(2)高水平表达(如每个细胞表达5,000-100,000个)；(3)是细胞毒性(如ADCC、吞噬作用)的介质；(4)介导导向于它们的抗原(包括自身抗原)的增强的抗原呈递。

优选人单克隆抗体，但是可以在本发明的双特异性分子中使用的其他抗体包括，例如，鼠、嵌合和人源化单克隆抗体。

可通过应用本领域中公知的方法偶联组成的结合特异性，如抗-FcR和抗CD70结合特异性，制备本发明的双特异性分子。例如，双特异性分子的每一种结合特异性可单独生成，然后彼此偶联。当结合特异性是蛋白质或肽时，可以使用多种偶联剂或交联剂进行共价偶联。交联剂的例子包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚氨基-S-乙酰-硫代乙酸盐(SATA)、5，5’-二硫代二(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻亚苯基双马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸盐(SPDP)和磺基琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己基-1-羧酸盐(sulfo-SMCC)(参见，例如，Karpovsky等(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu，MA等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其他方法包括Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.No.78，118-132)；Brennan等(1985)Science 229：81-83和Glennie等(1987)J.Immunol.139：2367-2375所描述的方法。优选的偶联剂为SATA和sulfo-SMCC，两者均可从Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)获得。

当结合特异性是抗体时，它们可通过两个重链的C-末端铰链区的巯基键合而偶联。在一个特别优选的实施方案中，对铰链区进行修饰以使其在偶联前含有奇数个，优选1个巯基残基。

可替代地，两种结合特异性可在同一载体中编码，并在相同的宿主细胞中表达和装配。当双特异性分子是mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab’)₂或配体x Fab融合蛋白时，该方法是特别有用的。本发明的双特异性分子可以是包含一个单链抗体和一个结合决定簇的单链分子，或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可以包含至少两个单链分子。制备双特异性分子的方法例如在美国专利5,260,203、美国专利5,455,030、美国专利4,881,175、美国专利5,132,405、美国专利5,091,513、美国专利5,476,786、美国专利5,013,653、美国专利5,258,498和美国专利5,482,858中描述。

双特异性分子与其特异性靶标的结合可通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(如生长抑制)或Western印迹分析来证实。这些试验中的每一个通常通过应用对目标复合物具有特异性的标记试剂(如抗体)来检测特定目标蛋白质-抗体复合物的存在。例如，可以利用识别和特异性结合抗体-FcR复合物的酶联抗体或抗体片段来检测FcR-抗体复合物。或者，这些复合物可利用多种其他免疫分析中的任一种来检测。例如，可对抗体进行放射性标记并且在放射免疫测定(RIA)中使用(参见，例如，Weintraub，B.，Principles ofRadioimmunoassays，Seventh Training Course on Radioligand AssayTechniques，The Endocrine Society，1986年3月，引入本文作为参考)。可以通过诸如使用γ计数器或闪烁计数器的手段或者通过放射自显影方法检测放射性同位素。

药物组合物

另一方面，本发明提供一种组合物，例如药物组合物，其含有与药学上可接受的载体配制在一起的一种或组合的本发明的单克隆抗体或其抗原结合部分。这样的组合物可以包含一种或组合的(例如两种或多种不同的)本发明的抗体或免疫偶联物或双特异性分子。例如，本发明的药物组合物可以含有结合靶抗原上的不同表位或具有互补活性的抗体组合(或免疫偶联物或双特异性分子)。

本发明的药物组合物也可以在联合治疗中施用，即与其他药剂联用。例如，联合治疗可包括本发明的抗CD70抗体联合至少一种其他的抗炎剂或免疫抑制剂。可在联合治疗中使用的治疗剂的例子在下面本发明抗体的应用一节中更详细地描述。

本文使用的“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，该载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(如通过注射或输注)。根据施用途径，可将活性化合物即抗体、免疫偶联物或双特异性分子包裹于一种材料中，以保护该化合物免受可使该化合物失活的酸和其他天然条件的作用。

本发明的药物组合物可包含一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保持了亲代化合物的所需生物活性而不引起任何不期望的毒理学作用的盐(参见如Berge，S.M.等(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。这样的盐的例子包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括那些由诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等无毒性无机酸衍生的盐，以及由诸如脂族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等无毒性有机酸衍生的盐。碱加成盐包括那些由诸如钠、钾、镁、钙等碱土金属衍生的盐，以及由诸如N，N’-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等无毒性有机胺衍生的盐。

本发明的药物组合物也可含有药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的例子包括:(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠，亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如棕榈酸抗坏血酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。

可用于本发明药物组合物中的适当的水性或非水性载体的例子包括水，乙醇，多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，及其适当的混合物，植物油如橄榄油，和注射用有机酯如油酸乙酯。例如通过应用包被材料如卵磷脂，在分散液的情况下通过维持所需的颗粒大小，以及通过应用表面活性剂，能够维持适当的流动性。

这些组合物还可含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过上述的灭菌程序或通过包含诸如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等各种抗细菌剂和抗真菌剂确保防止存在微生物。也可能需要在组合物中包含等渗剂，例如，糖、氯化钠等。另外，通过包含延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可实现注射型药物延长的吸收。

药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射液或分散液的粉末剂。这些用于药学活性物质的介质和试剂的使用是本领域公知的。除了任何与活性化合物不相容的常规介质或试剂范围外，包括其在本发明的药物组合物中的应用。还可以向组合物中掺入补充的活性化合物。

治疗性组合物一般必须是无菌的并且在制备和贮存条件下稳定的。可以将组合物配制成溶液、微乳状液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散剂。例如，通过使用包衣，例如卵磷脂，在分散液的情况下通过保持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。在很多情况下，组合物中优选包含等渗剂，例如，糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氧化钠。通过在组合物中加入延迟吸收剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可实现注射型药物延长的吸收。

通过将活性化合物以需要的量混入合适的溶剂中，并且根据需要加入以上列举的成分中的一种或其组合，接着无菌微过滤，可制备无菌注射液。通常，通过将活性化合物掺入到含有基本分散介质和上面所列其他所需成分的无菌载体中制备分散剂。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末剂，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，由其预先无菌过滤的溶液得到活性成分加任何额外所需成分的粉末。

可以与载体材料组合制备单一剂量形式的活性成分的量根据所治疗的受试者和特定给药方式而不同。可以与载体材料组合制备单一剂量形式的活性成分的量一般是产生治疗效果的组合物的量。通常，以100％计，这个量的范围是大约0.01％至大约99％的活性成分，优选大约0.1％至大约70％，最优选大约1％至大约30％的活性成分，与药学上可接受的载体相组合。

调节剂量方案，以提供最佳的期望的反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单一大丸剂，可以随时间施用几次分开的剂量，或者根据治疗状况的紧急情况所需，可以按比例减小或增加剂量。特别有利的是将肠胃外组合物配制成容易给药并且剂量均匀的剂量单位形式。此处使用的剂量单位形式是指适合作为单位剂量用于所治疗的受试者的物理不连续单位；每个单位含有预定量的活性化合物，经计算该预定量的活性化合物与需要的药物载体组合产生所需的治疗效果。对本发明剂量单位形式的具体说明限定于且直接依赖于(a)活性化合物的独特特性和要达到的特定治疗效果，和(b)本领域中固有的对于配制这种用于治疗个体敏感性的活性化合物的限制。

对于抗体的给药而言，剂量范围为约0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至25mg/kg受者体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重，或在1-10mg/kg范围内。需要时可以使用较高的剂量，例如15mg/kg体重、20mg/kg体重或25mg/kg体重。一个治疗方案的例子需要每周给药一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3月一次、或每3-6月一次。本发明的抗CD70抗体的优选剂量方案包括经静脉内给予1mg/kg体重或3mg/kg体重，该抗体使用如下剂量方案之一给药:(i)每4周一次，共6次，然后每3个月一次；(ii)每3周一次；(iii)3mg/kg体重一次，然后每3周1mg/kg体重。

在一些方法中，同时施用具有不同结合特异性的两种或多种本发明的抗CD70单克隆抗体，在该情况中，每种抗体的给药剂量落在所述范围内。抗体通常在有必要时多次给药。单次给药之间的间隔可以是，例如，每周、每月、每三个月或每年。间隔也可以是不定期的，例如通过测定患者中抗靶抗原的抗体的血液水平来确定。在一些方法中，调节剂量以达到约1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，在一些方法中为约25-300μg/ml。

可替代地，抗体也可以作为持续释放制剂来给药，在此情况中需要频率较低的给药。剂量和频率根据抗体在患者中的半衰期而不同。通常，人抗体表现出最长的半衰期，之后是人源化抗体、嵌合抗体和非人类抗体。给药剂量和频率根据处理是预防性的还是治疗性的而不同。在预防性应用中，在长时间内以较不频繁的间隔给予相对较低的剂量。有些患者在余生中持续接受处理。在治疗性应用中，有时需要以较短的间隔给予较高的剂量，直到疾病的进展减轻或停止，优选直到患者表现为疾病症状部分或完全改善。之后，可以以预防性方案给患者给药。

本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可能改变，以获得可有效实现对特定患者、组合物和给药方式的所需治疗反应，而对患者无毒性的活性成分的量。选择的剂量水平取决于多种药物代谢动力学因素，包括应用的本发明特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性，给药途径，给药时间，应用的特定化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与应用的特定组合物联合应用的其他药物、化合物和/或材料，接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康情况和病史，以及医学领域中公知的类似因素。

本发明的抗CD70抗体的“治疗有效剂量”优选地导致疾病症状的严重性降低，疾病无症状期的频率和持续时间增加，或者防止因疾病痛苦而引起的损伤或失能。例如，对于CD70+肿瘤的治疗，相对于未接受治疗的受试者，“治疗有效剂量”优选地将细胞生长或肿瘤生长抑制至少约20％，更优选至少约40％，更优选至少约60％，更优选至少约80％。化合物抑制肿瘤生长的能力可以在预测对人类肿瘤的疗效的动物模型系统中评价。或者，也可以通过检查化合物抑制细胞生长的能力来评价该组合物的这种性能，这种抑制可以通过本领域技术人员公知的试验在体外测定。治疗有效量的治疗性化合物能够减小肿瘤大小，或者以其他方式缓解受试者的症状。本领域技术人员可以根据如下因素确定这种量，如受试者的大小、受试者症状的严重性和选择的特定组合物或给药途径。

本发明的组合物可以利用本领域公知的一种或多种方法通过一种或多种给药途径给药。本领域技术人员应当理解，给药途径和/或方式根据期望的结果而不同。本发明抗体的优选给药途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外给药途径，例如注射或输注。本文使用的短语“肠胃外给药”是指除肠和局部给药以外的给药模式，通常是注射，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。

可替代地，本发明的抗体也可以通过非肠胃外途径给药，如局部、表皮或粘膜途径给药，例如，鼻内、经口、阴道、直肠、舌下或局部。

活性化合物可以与保护化合物不被快速释放的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这样的制剂的很多方法受专利保护或者通常为本领域技术人员所公知。参见，例如，Sustainedand controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。

治疗性组合物可应用本领域公知的医疗装置给药。例如，在一个优选实施方案中，本发明的治疗组合物可用无针皮下注射装置给药，如在美国专利No.5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中公开的装置。可用于本发明的公知的植入物和模块的例子包括:美国专利No.4,487,603，该专利公开了用于以受控速率分散药物的可植入微量输注泵；美国专利No.4,486,194，该专利公开了用于通过皮肤给药的治疗装置；美国专利No.4,447,233，该专利公开了用于以精确的输注速率递送药物的医用输注泵；美国专利No.4,447,224，该专利公开了用于连续递送药物的变流可植入输注装置；美国专利No.4,439,196，该专利公开了具有多腔区室的渗透药物递送系统:和美国专利No.4,475,196，该专利公开了一种渗透药物递送系统。这些专利引入本文作为参考。本领域技术人员公知许多其他这样的植入物、递送系统和模块。

在某些实施方案中，本发明的人单克隆抗体可配制为确保在体内的正确分布。例如，血-脑屏障(BBB)阻止了许多高度亲水性的化合物。为了确保本发明的治疗性化合物能够跨过BBB(如果需要时)，可将它们配制在如脂质体中。至于制备脂质体的方法，参见，例如，美国专利4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂质体包含可被选择性地转运入特定细胞或器官内的一个或多个部分，从而增强定向药物递送(参见，例如，V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。定向部分的例子包括叶酸或生物素(参见，例如，Low等的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman等(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais等(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等(1995)Am.J.Physiol.1233：134)；p120(Schreier等(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；也参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。

本发明的应用和方法

本发明的抗体，特别是人抗体，抗体组合物和方法，具有与(例如)CD70介导的疾病的诊断和治疗有关的许多体外和体内诊断和治疗应用。例如，这些分子可以施用于在体外或离体培养的细胞，或者(例如)在体内施用于人类受试者，从而治疗、预防以及诊断多种疾病。本文使用的术语“受试者”包括人和非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖类动物和爬行类动物。优选的受试者包括患有由CD70活性介导的疾病的人类患者。这些方法特别适合治疗患有与异常CD70表达有关的疾病的人类患者。当抗CD70抗体与另外一种药物一起给药时，这两种药物可以相继或同时给药。

鉴于本发明的抗体与CD70特异性结合，本发明的抗体可以用来特异性检测细胞表面上CD70的表达，而且可以用来通过免疫亲和纯化方法纯化CD70。

CD70在多种人类癌症中表达，所述癌症包括肾细胞癌、转移性乳腺癌、脑瘤、白血病、淋巴瘤和鼻咽癌(Junker等.(2005)JUrol.173：2150-3；Sloan等.(2004)Am JP athol.164：315-23；Held-Feindt和Mentlein(2002)Int J Cancer 98：352-6；Hishima等(2000)Am J SurgPathol.24：742-6；Lens等.(1999)Br J Haematol.106：491-503)。抗CD70抗体可以单独使用，用来抑制癌性肿瘤的生长。或者，如下文所述，抗CD70抗体也可以与其他免疫原性剂、标准癌症治疗或其他抗体一起使用。

其生长可以用本发明的抗体抑制的优选癌症包括一般对免疫治疗有应答的癌症。可治疗的优选癌症的非限制性的例子包括肾癌(例如肾细胞癌)、乳腺癌、脑瘤、慢性或急性白血病，包括急性髓性白血病、慢性髓性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、淋巴瘤(例如何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤、淋巴细胞淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、T细胞淋巴瘤)和鼻咽癌。可以用本发明的方法治疗的其他癌症的例子包括黑色素瘤(例如转移性恶性黑色素瘤)、前列腺癌、结肠癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、阴户癌、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、肿瘤血管发生、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮状癌、鳞状细胞癌、环境诱发的癌症，包括石棉诱发的癌症，例如间皮瘤，和所述癌症的组合。

此外，鉴于CD70在各种肿瘤细胞上表达，本发明的人抗体、抗体组合物和方法能够用来治疗患有致肿瘤疾病的受试者，所述疾病例如是以存在表达CD70的肿瘤细胞为特征的疾病，包括，例如，肾细胞癌(RCC)，如透明细胞RCC、胶质母细胞瘤、乳腺癌、脑瘤、鼻咽癌、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、多发性骨髓瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、结节性小卵裂细胞淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、伦纳特淋巴瘤、免疫母细胞性淋巴瘤、T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T细胞白血病(T-ALL)、中心母细胞/中心细胞性(cb/cc)滤泡性淋巴瘤、B系弥漫性大细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性淋巴结病(AILD)-样T细胞淋巴瘤、HIV相关体腔淋巴瘤、胚胎性癌、未分化鼻咽癌(例如施明克瘤)、卡斯尔曼病、卡波西肉瘤、多发性骨髓瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症和其他B细胞淋巴瘤。

因此，在一个实施方案中，本发明提供一种抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，包括给受试者施用治疗有效量的抗CD70抗体或其抗原结合部分。优选地，该抗体是人抗CD70抗体(如本文所述的任何人抗CD70抗体)。另外或者可替代地，该抗体可以是嵌合或人源化抗CD70抗体。

另外，也已经提出CD70与CD27的相互作用在细胞介导的自身免疫病如实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)中起作用(Nakajima等(2000)J.Neuroimmunol.109：188-96)。这种作用被认为部分是由TNF-α产生的抑制介导的。而且，CD70信号的阻断抑制了CD40介导的CD8+T-细胞的克隆扩增，并且减少了CD8+记忆T细胞的产生(Taraban等.(2004)J.Immunol.173：6542-6)。这样，本发明的人抗体、抗体组合物和方法可以用来治疗患有自身免疫病的患者，所述自身免疫病例如是以存在表达CD70的B细胞为特征的疾病，包括，例如实验性自身免疫脑脊髓炎。可以使用本发明的抗体的其他自身免疫病包括但不限于系统性红斑狼疮(SLE)、胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、炎性肠病(IBD)(包括克罗恩病、溃疡性结肠炎和乳糜泻)、多发性硬化症(MS)、牛皮癣、自身免疫性甲状腺炎、类风湿性关节炎(RA)和肾小球肾炎。此外，本发明的抗体组合物能够用于抑制或预防移植排斥或用于治疗移植物抗宿主疾病(GVHD)。

另外，也已经提出CD70与CD27的相互作用在CD4+T细胞信号传导中起作用。已经证实某些病毒向CD27途径发出信号，导致中和抗体应答的破坏(Matter等.(2006)J Exp Med 203：2145-55)。这样，本发明的人抗体、抗体组合物和方法可以用来治疗患有病毒感染的患者，所述病毒包括，例如，人类免疫缺陷病毒(HIV)、肝炎(甲、乙、丙)、疱疹病毒(例如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II和CMV、EB病毒)、腺病毒、流感病毒、虫媒病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、痘苗病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒和虫媒病毒脑炎病毒和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)，或者用于治疗HIV感染/AIDS。另外，本发明的人抗体、抗体组合物和方法可以用来抑制TNF-α产生。

在一个实施方案中，本发明的抗体(例如人单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)可以用于检测CD70的水平或在其膜表面上含有CD70的细胞的水平，然后可将该水平与特定疾病症状相关联。此外，也可以利用这些抗体抑制或阻断CD70的功能，然后可以将其与特定疾病症状的预防或缓解相关联，由此提示CD70是该疾病的介质。这可以如下实现，例如，在允许抗体与CD70之间形成复合物的条件下，使实验样品和对照样品接触抗CD70抗体。检测并比较实验样品和对照中抗体与CD70之间形成的任何复合物。

在另一实施方案中，可以在开始时检测本发明的抗体(例如人抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)与体外治疗或诊断应用相关的结合活性。例如，能够用以下实施例中所述的流式细胞分析来检测本发明的组合物。

本发明的抗体(例如人抗体、多特异性和双特异性分子、免疫偶联物和组合物)在CD70相关疾病的治疗和诊断中具有额外的应用。例如，人单克隆抗体、多特异性或双特异性分子和免疫偶联物可以用来在体内或体外引发一种或多种下列生物活性:抑制表达CD70的细胞的生长和/或将其杀死；介导表达CD70的细胞在人效应细胞存在下的吞噬作用或ADCC，或者阻断CD70配体与CD70的结合。

在一个特定实施方案中，本发明的抗体(例如人抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)在体内用于治疗、预防或诊断多种CD70相关疾病。CD70相关疾病的例子尤其包括自身免疫病、实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)、癌症、肾细胞癌(RCC)，如透明细胞RCC，胶质母细胞瘤、乳腺癌、脑瘤、鼻咽癌、非何杰金氏淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、多发性骨髓瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、结节性小卵裂细胞淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、伦纳特淋巴瘤、免疫母细胞性淋巴结瘤、T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T细胞白血病(T-ALL)、中心母细胞/中心细胞性(cb/cc)滤泡性淋巴瘤、B系弥漫性大细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性淋巴结病(AILD)-样T细胞淋巴瘤、HIV相关体腔淋巴瘤、胚胎性癌、未分化鼻咽癌(例如施明克瘤)、卡斯尔曼病、卡波西肉瘤、多发性骨髓瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症和其他B细胞淋巴瘤。

在体内和体外施用本发明的抗体组合物(例如人单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和免疫偶联物)的适当途径在本领域中公知，可以由本领域技术人员选择。例如，抗体组合物可以通过注射(例如静脉内或皮下)给药。使用的分子的适宜剂量将取决于受试者的年龄和体重以及抗体组合物的浓度和/或配方。

如前所述，本发明的人抗CD70抗体可以与诸如细胞毒剂、放射性毒剂或免疫抑制剂等一种或多种治疗剂共同给药。抗体可以与该治疗剂连接(作为免疫复合物)，或者可以与该治疗剂分开给药。对于后者(分开给药)，抗体可以在该治疗剂之前、之后或同时给药，或者可以与其他已知治疗如抗癌治疗例如放射治疗共同应用。这些治疗剂包括，抗肿瘤剂，如多柔比星(阿霉素)、顺铂、硫酸博来霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、羟基脲，它们本身仅在对患者具有毒性或亚毒性的水平时才有效。顺铂以100mg/剂的剂量静脉内给药，每4周1次，阿霉素以60-75mg/ml的剂量静脉内给药，每21天1次。本发明的人抗CD70抗体或其抗原结合片段与化疗剂的共同给药提供了两种抗癌剂，它们通过对人肿瘤细胞产生细胞毒性作用的不同的机制起作用。这种共同给药能够解决由于发展耐药性或肿瘤细胞抗原性改变(这将使它们对抗体没有反应性)引起的问题。

靶特异性效应细胞，例如与本发明的组合物(例如人抗体、多特异性和双特异性分子)有关的效应细胞，也可以用作治疗剂。靶向的效应细胞可以是人白细胞，如巨噬细胞、嗜中性粒细胞或单核细胞。其他细胞包括嗜酸性细胞、自然杀伤细胞和其他带有IgG或IgA受体的细胞。需要时，效应细胞可以从所治疗的受试者中获得。靶特异性效应细胞可以作为在生理学可接受的溶液中的细胞悬浮液施用。施用的细胞数可以是10⁸-10⁹个的数量级，但是根据治疗目的而不同。通常，该量足以获得在靶细胞处如表达CD70的肿瘤细胞处的集中，以及通过例如吞噬作用实现对细胞的杀伤。施用途径也可以不同。

应用靶特异性效应细胞的治疗可以与其他清除靶细胞的技术一起进行。例如，使用本发明的组合物(例如人抗体、多特异性和双特异性分子)和/或具有这些组合物的效应细胞的抗肿瘤治疗可以与化学治疗一起使用。另外，可以应用联合免疫治疗将两种不同的细胞毒性效应群体导向至肿瘤细胞排斥。例如，与抗-Fc-γRI或抗-CD3连接的抗CD70抗体可以与IgG-或IgA-受体特异性结合剂一起使用。

本发明的双特异性和多特异性分子也可以用来调节效应细胞上的FcγR或FcγR水平，例如通过对细胞表面上的受体加帽以及将其清除。抗-Fc受体的混合物也可以用于该目的。

具有补体结合位点(如来自IgG1、-2或-3或IgM的补体结合部分)的本发明的组合物(例如人抗体、多特异性和双特异性分子和免疫偶联物)，也可以在补体的存在下使用。在一个实施方案中，用本发明的结合剂和适宜的效应细胞离体处理含有靶细胞的细胞群体能够通过加入补体或含有补体的血清来实现。补体蛋白的结合能够改善用本发明的结合剂包被的靶细胞的吞噬作用。在另一实施方案中，用本发明的组合物(例如人抗体、多特异性和双特异性分子)包被的靶细胞也能够被补体裂解。在另一实施方案中，本发明的组合物不激活补体。

本发明的组合物(例如人抗体、多特异性和双特异性分子和免疫偶联物)也可以与补体一起施用。因此，含有人抗体、多特异性或双特异性分子和血清或补体的组合物也在本发明的范围内。这些组合物是有利的，因为补体与人抗体、多特异性或双特异性分子紧密接近。或者，本发明的人抗体、多特异性或双特异性分子和补体或血清也可以分开施用。

本发明的范围内还包括药盒，该药盒包括本发明的抗体组合物(例如人抗体、多特异性或双特异性分子，或免疫偶联物)和使用说明。该药盒可以进一步包括一种或多种另外的试剂，如免疫抑制剂、细胞毒剂或放射性毒剂，或一种或多种另外的本发明的人抗体(例如，具有补充活性的人抗体，它所结合的CD70抗原上的表位与第一人抗体不同)。

因此，可以给用本发明的抗体组合物治疗的患者(在本发明的人抗体给药之前、同时或之后)另外施用另一种治疗剂，如细胞毒剂或放射性毒剂，该治疗剂可以增强或增加人抗体的治疗效果。

在另外一些实施方案中，可以另外用调节(例如增强或抑制)Fcγ或Fcγ受体的表达或活性的药物治疗受试者，例如用细胞因子治疗受试者。在用多特异性分子治疗过程中施用的优选细胞因子包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)。

本发明的组合物(例如人抗体、多特异性和双特异性分子)也可以用来靶向表达FcγR或CD70的细胞，例如标记这些细胞。对于这种应用，可以将结合剂与能够被检测到的分子连接。因此，本发明提供离体或在体外定位表达Fc受体如FcγR或CD70的细胞的方法。可检测标记物可以是，例如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。

在一个特定实施方案中，本发明提供检测样品中CD70抗原的存在或测定CD70抗原量的方法，包括在允许抗体或其部分与CD70之间形成复合物的条件下使样品和对照样品接触可与CD70特异性结合的人单克隆抗体或其抗原结合部分。然后检测复合物的形成，其中样品与对照样品相比复合物形成的差异指示样品中CD70抗原的存在。

在另一实施方案中，通过将化合物与抗体连接，可以利用本发明的免疫偶联物将该化合物(例如治疗剂、标记物、细胞毒素、放射毒素、免疫抑制剂等)靶向至具有CD70细胞表面受体的细胞。例如，抗CD70抗体可以与美国专利No.6,81,354和6,548,530、美国专利公开Nos.20030050331、20030064984、20030073852和20040087497所述或WO 03/022806(全部引入本文作为参考)公开的任一种毒素化合物偶联。因此，本发明也提供用于离体或在体内定位表达CD70的细胞(例如应用可检测标记物，如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)的方法。可替代地，免疫偶联物通过将细胞毒素或放射毒素靶向至CD70，也可以杀伤具有CD70细胞表面受体的细胞。

本发明进一步通过下面的实施例进行阐述，不应将这些实施例理解为进一步的限制。全部附图和在本申请中引用的全部参考文献、专利和公开专利申请的内容均引入本文作为参考。

实施例

实施例1:抗CD70人单克隆抗体的制备

抗原

免疫方案使用与双myc-His标签融合的重组人CD70作为抗原。或者，在某些免疫中使用肾癌细胞系786-O(ATCC保藏号CRL-1932)进行全细胞免疫，并且用肾癌细胞系A-498(ATCC保藏号HTB-44)进行加强免疫。

转基因HuMAb

和KM

用表达人抗体基因的HuMAb转基因小鼠的HCo7、HCo12和HCo17系和转基因转染色体小鼠KM系制备抗CD70的完全人类单克隆抗体。在这些小鼠系中，已经如Chen等(1993)EMBO J.12:811-820所述将内源小鼠κ轻链基因纯合地破坏，并且已经如PCT公布WO 01/09187的实施例1所述将内源小鼠重链基因纯合地破坏。而且，该小鼠系携带如Fishwild等(1996)Nature Biotechnology14：845-851所述的人K轻链转基因KCo5，和如PCT公布WO 01/09187实施例2中所述的人重链转基因HCo7、HCo12或HCo17。KM小鼠含有如PCT公布WO 02/43478所述的SC20转染色体。

HuMAb和KM的免疫:

为了产生抗CD70的完全人类单克隆抗体，用重组人CD70作为抗原或在细胞表面上表达CD70的全细胞免疫HuMAb

和KM

用于HuMab小鼠的一般性免疫方案在Lonberg，N.等(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild，D.等(1996)Nature Biotechnology14：845-851和PCT公开WO 98/24884中描述。在第一次输注抗原时小鼠为6-16周龄。利用5-10×10⁶个细胞腹膜内(IP)、皮下(Sc)或通过足垫注射免疫HuMAb小鼠。

转基因小鼠用在完全弗氏佐剂或Ribi佐剂中的抗原腹膜内免疫两次，然后用在不完全弗氏佐剂或Ribi佐剂中的抗原腹膜内免疫3-21天(最多可达总共11次免疫)。通过眼眶后采血监测免疫应答。通过ELISA和FACS对血浆进行筛选(如下文所述)，用具有足够的抗CD70人免疫球蛋白效价的小鼠进行融合。用抗原经静脉内对小鼠进行加强免疫，3天后处死并取出脾脏。每种抗原一般进行10-35次融合。每种抗原免疫几十只小鼠。

产生抗CD700抗体的HuMAb

或KM

的选择

为了选择产生可与CD70结合的抗体的HuMAb

或KM小

通过流式细胞分析，根据与表达重组人CD70的细胞系结合，而不与不表达CD70的对照细胞系结合，筛选来自免疫小鼠的血清。另外，通过流式细胞分析根据与786-O或A-498细胞的结合对血清进行筛选。简要地说，通过将表达CD70的CHO细胞、786-O细胞或A498细胞与1:20稀释的抗CD70抗体一起孵育，来评价抗CD70抗体的结合。洗涤细胞，用FITC标记的抗人IgG Ab检测其结合。使用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行流式细胞分析。进一步如Fishwild，D.等(1996)所述，通过ELISA，针对与CD70的结合，检测与表达CD70的CHO细胞结合但是不与不表达CD70的亲本CHO细胞结合的抗体。简要地说，用在PBS中浓度为1-2μg/ml的来自被转染CHO细胞的纯化重组CD70融合蛋白以100μl/孔的量包被微量滴定板，4℃下孵育过夜，然后用PBS/Tween(0.05％)中的5％鸡血清以200μl/孔封闭。将来自CD70免疫的小鼠的血清稀释液加入各孔中，在室温下孵育1-2小时。用PBS/Tween洗涤板，然后与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗人IgG多克隆抗体在室温下孵育1小时。洗涤后，培养板用ABTS底物(Sigma，A-1888，0.22mg/ml)显色，并用分光光度计在OD415-495处分析。用显示最高抗CD70抗体效价的小鼠进行融合。如下文所述进行融合，通过ELISA检测杂交瘤上清液的抗CD70活性。

产生抗CD70人单克隆抗体的杂交瘤的产生

根据标准程序使用PEG或者使用Cyto Pulse大腔室细胞融合电穿孔仪(Cyto Pulse Sciences，Inc.，Glen Burnie，MD)采用基于电场的电融合法将从HuMAb 和/或KM

中分离的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系融合。然后根据抗原特异性抗体的产生筛选获得的杂交瘤。使用50％ PEG(Sigma)将来自被免疫小鼠的脾细胞单细胞悬液与1/4数量的SP2/0非分泌型小鼠骨髓瘤细胞(ATCC CRL 1581)融合。将细胞以约1×10⁵/孔的密度接种于平底微量滴定板上，然后在含有L-谷氨酰胺和丙酮酸钠(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)并且进一步含有20％胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)，18％ P388DI条件培养基，5％ Origen杂交瘤克隆因子(BioVeris，Gaithersburg，VA)，4mM L-谷氨酰胺，5mM HEPES，0.055mMβ-巯基乙醇，50单位/毫升青霉素，50mg/ml链霉素和1×次黄嘌呤-氨基喋呤-胸苷(HAT)培养基(Sigma；融合后24小时加入HAT)的DMEM高葡萄糖培养基中孵育一周。一周之后，在用HT替换了HAT的培养基中培养细胞。然后通过FACS或ELISA(如上所述)针对人抗CD70单克隆IgG抗体筛选各个孔。一旦发生广泛的杂交瘤生长，则通常在10-14天后监测培养基。将分泌抗体的杂交瘤再次平板接种，再次筛选，并且如果对于人IgG仍然是阳性，则通过有限稀释将抗CD70单克隆抗体亚克隆至少两次。然后在体外培养稳定的亚克隆，以在组织培养基中产生少量的抗体用于进一步表征。

选择杂交瘤克隆2H5、10B4、8B5、18E7和69A7进一步分析。

实施例2:人单克隆抗体2H5、10B4、8B5、18E7和69A7的结构表征

利用标准PCR技术分别从2H5、10B4、8B5、18E7和69A7杂交瘤中获得编码2H5、10B4、8B5、18E7和69A7单克隆抗体的重链和轻链可变区的cDNA序列，并利用标准DNA测序技术进行测序。

2H5的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图1A和SEQ ID NO:41和1中。

2H5的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图1B和SEQ ID NO:46和6中。

2H5重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列的比较证明，2H5重链应用了来自人种系VH 3-30.3的VH区段、未确定的D区段和来自人种系JH4b的JH区段。2H5 VH序列与种系VH3-30.3序列的比对显示在图6中。利用Kabat CDR区测定系统对2H5VH序列的进一步分析勾画出了重链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图1A和6以及SEQ ID NO:11、16和21所示。

2H5轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明，2H5轻链应用了来自人种系VK L6的VL区段和来自人种系JK4的JK区段。2H5 VL序列与种系VK L6序列的比对显示于图9中。利用Kabat CDR区测定系统对2H5 VL序列的进一步分析勾画出了轻链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图1B和9以及SEQID NO:26、31和36所示。

10B4的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图2A和SEQ ID NO:42和2中。

10B4的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图2B和SEQ ID NO:47和7中。

10B4重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列的比较证明，10B4重链应用了来自人种系VH 3-30.3的VH区段、来自人种系4-11的D区段和来自人种系JH 4b的JH区段。10B4 VH序列与种系VH 3-30.3序列的比对显示于图6中。利用Kabat CDR区测定系统对10B4 VH序列的进一步分析勾画出了重链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图2A和6以及SEQ ID NO:12、17和22所示。

10B4轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明，10B4轻链应用了来自人种系VK L18的VL区段和来自人种系JK 3的JK区段。10B4 VL序列与种系VK L18序列的比对显示于图10中。利用Kabat CDR区测定系统对10B4 VL序列的进一步分析勾画出了轻链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图2B和10以及SEQ ID NO:27、32和37所示。

8B5的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图3A和SEQ ID NO:43和3中。

8B5的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图3B和SEQ ID NO:48和8中。

8B5重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列的比较证明，8B5重链应用了来自人种系VH 3-33的VH区段、来自人种系3-10的D区段和来自人种系JH 4b的JH区段。8B5 VH序列与种系VH 3-33序列的比对显示于图7中。利用Kabat CDR区测定系统对8B5 VH序列的进一步分析勾画出了重链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图3A和7以及SEQ ID NO:13、18和23所示。

8B5轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明，8B5轻链应用了来自人种系VK L15的VL区段和来自人种系JK 4的JK区段。8B5 VL序列与种系VK L15序列的比对显示于图11中。利用Kabat CDR区测定系统对8B5 VL序列的进一步分析勾画出了轻链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图3B和11以及SEQ ID NO:28、33和38所示。

18E7的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图4A和SEQ ID NO:44和4中。

18E7的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图4B和SEQ ID NO:49和9中。

18E7重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列的比较证明，18E7重链应用了来自人种系VH 3-33的VH区段、来自人种系3-10的D区段和来自人种系JH 4b的JH区段。18E7 VH序列与种系VH 3-33序列的比对显示于图7中。利用Kabat CDR区测定系统对18E7 VH序列的进一步分析勾画出了重链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图4A和7以及SEQ ID NO:14、19和24所示。

18E7轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明，18E7轻链应用了来自人种系VK L15的VL区段和来自人种系JK4的JK区段。18E7 VL序列与种系VK L15序列的比对显示于图11中。利用Kabat CDR区测定系统对18E7 VL序列的进一步分析勾画出了轻链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图4B和11以及SEQ ID NO:29、34和39所示。

69A7的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图5A和SEQ ID NO:45和5中。

69A7的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图5B和SEQ ID NO:50和10中。

69A7重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列的比较证明，69A7重链应用了来自人种系VH 4-61的VH区段、来自人种系4-23的D区段和来自人种系JH 4b的JH区段。69A7 VH序列与种系VH 4-61序列的比对显示于图8中。利用Kabat CDR区测定系统对69A7 VH序列的进一步分析勾画出了重链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图5A和9以及SEQ ID NO:15、20和25所示。

69A7轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明，69A7轻链应用了来自人种系VK L6的VL区段和来自人种系JK4的JK区段。69A7 VL序列与种系VK L6序列的比对显示于图12中。利用Kabat CDR区测定系统对69A7 VL序列的进一步分析勾画出了轻链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图5B和12以及SEQ ID NO:30、35和40所示。

实施例3:抗CD70人单克隆抗体的结合特异性的表征

为了检测对于CD70结合的特异性，通过标准ELISA进行抗CD70抗体与免疫纯化的CD70的结合的比较。

重组myc-标记的CD70包被平板过夜，然后检测与抗CD70人单克隆抗体2H5、10B4、8B5、18E7和69A7的结合。进行标准ELISA程序。抗CD70人单克隆抗体以1μg/ml的浓度加入，并且以1:2的连续稀释度向下滴定。与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗人IgG(Fc或κ链特异性)多克隆抗体用作第二抗体。结果显示在图13中。抗CD70人单克隆抗体2H5、10B4、8B5、18E7和69A7与CD70高特异性结合。

实施例4:抗CD70抗体与肾癌细胞系表面上表达的CD70结合的表征

通过流式细胞术检测抗CD70抗体与在其细胞表面上表达CD70的肾细胞癌细胞的结合。

检测肾细胞癌细胞系A-498(ATCC保藏号HTB-44)、786-O(ATCC保藏号CRL-1932)、ACHN(ATCC保藏号CRL-1611)、Caki-1(ATCC保藏号HTB-46)和Caki-2(ATCC保藏号HTB-47)的抗体结合。HuMAb 2H5抗CD70人单克隆抗体的结合如下评价:将1×10⁵个细胞与浓度为1μg/ml的2H5一起孵育。洗涤细胞，用FITC标记的抗人IgG Ab检测其结合。使用FACSCalibur流式细胞仪(BectonDickinson，San Jose，CA)进行流式细胞分析。结果显示在图14中。抗CD70人单克隆抗体2H5与肾癌细胞系A-498、786-O、ACHN、Caki-1和Caki-2结合。

检测肾细胞癌细胞系786-O和A-498的HuMAb抗CD70人单克隆抗体2H5、8B5、10B4和18E7在不同浓度下的结合。抗CD70人单克隆抗体的结合如下评价:将5×10⁵个细胞与初始浓度为50μg/ml并且以1:3稀释度连续稀释的抗体孵育。洗涤细胞，用PE标记的抗人IgG抗体检测结合。使用FACSCalibur流式细胞仪(BectonDickinson，San Jose，CA)进行流式细胞分析。结果显示在图15A(786-O)和图15B(A-498)中。通过染色的平均荧光强度(MFI)测定，抗CD70单克隆抗体2H5、8B5、10B4和18E7以浓度依赖的方式与肾癌细胞系786-O和A-498结合。抗CD70单克隆抗体的EC50值的范围对于786-O细胞系为从1.844nM到6.669nM，对于A-498细胞系为3.984nM到11.84nM。

HuMAb 2H5和69A7抗CD70人单克隆抗体与肾细胞癌细胞系786-O的结合如下评价:将2×10⁵个细胞与浓度为10μg/ml的2H5或69A7一起孵育。用同种型对照抗体作为阴性对照。洗涤细胞，用FITC标记的抗人IgG抗体检测结合。使用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行流式细胞分析。结果显示在图15C中。两种抗CD70人单克隆抗体都与肾癌细胞系786-O结合。

检测肾细胞癌细胞系786-O与不同浓度的HuMAb抗CD70人单克隆抗体69A7的结合。抗CD70人单克隆抗体的结合如下评价:将5×10⁵个细胞与初始浓度为10μg/ml并且以1:3稀释度连续稀释的抗体一起孵育。洗涤细胞，用PE标记的抗人IgG抗体检测结合。使用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行流式细胞分析。结果显示在图15D中。通过染色的平均荧光强度(MFI)测定发现，抗CD70单克隆抗体69A7与肾癌细胞系786-O以浓度依赖的方式结合。抗CD70单克隆抗体69A7与786-O细胞结合的EC₅₀值为6.927nM。

这些数据证明抗CD70 HuMAb与肾细胞癌细胞系结合。

实施例5:抗CD70抗体与淋巴瘤细胞系表面上表达的CD70结合的表征

通过流式细胞术检测抗CD70抗体与在其细胞表面上表达CD70的淋巴细胞的结合。

检测淋巴瘤细胞系Daudi(ATCC保藏号CCL-213)、HuT 78(ATCC保藏号TIB-161)和Raji(ATCC保藏号CCL-86)的抗体结合。HuMAb 2H5抗CD70人单克隆抗体的结合如下评价:将1×10⁵个细胞与浓度为1μg/ml的2H5一起孵育。洗涤细胞，用FITC标记的抗人IgG Ab检测其结合。使用在细胞表面上不表达CD70的Jurkat细胞系作为阴性对照。使用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行流式细胞分析。结果显示在图16中。通过染色的平均荧光强度(MFI)测定发现，抗CD70单克隆抗体2H5与淋巴瘤细胞系Daudi、HuT78和Raji结合。

检测淋巴瘤细胞系Raji和Granta 519(ATCC保藏号342)与不同浓度的HuMAb抗CD70人单克隆抗体2H5的结合。抗CD70人单克隆抗体的结合如下评价:将5×10⁵个细胞与初始浓度为50μg/ml并且以1:3稀释度连续稀释的抗体一起孵育。使用同种型对照抗体作为阴性对照。洗涤细胞，用PE标记的抗人IgG抗体检测结合。使用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行流式细胞分析。结果显示在图17A(Raji)和17B(Granta 519)中。通过染色的平均荧光强度(MFI)测定发现，抗CD70单克隆抗体2H5与淋巴瘤细胞系Raji和Granta 519以浓度依赖的方式结合。抗CD70抗体对于Raji细胞的EC₅₀值为1.332nM，对Granta 519细胞为1.330nM。

HuMAb 2H5和69A7抗CD70人单克隆抗体与Raji淋巴瘤细胞系的结合如下评价:将2×10⁵个细胞与浓度为10μg/ml的HuMAb一起孵育。洗涤细胞，用FITC标记的抗人IgG Ab检测其结合。使用单独的同种型对照抗体和第二抗体作为阴性对照。使用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行流式细胞分析。结果显示在图17C中。通过染色的平均荧光强度(MFI)测定发现，两种抗CD70单克隆抗体都与Raji淋巴瘤细胞系结合。

进行竞争FACS测定来阐明69A7相对于2H5的结合特异性。Raji细胞与浓度为10μg/ml的裸69A7、2H5和同种型对照抗体一起孵育，或者不与抗体孵育。洗涤后，细胞与浓度为10μg/ml的FITC偶联的69A7一起孵育。洗涤细胞，用FITC标记的抗人IgG抗体检测结合。使用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行流式细胞分析。结果显示在图17D中。抗CD70抗体69A7和2H5阻断FITC标记的69A7的结合，表明2H5和69A7共有类似的结合表位。

进一步检测Daudi淋巴瘤细胞系和786-O肾癌细胞的抗体结合。HuMAb 69A7抗CD70人单克隆抗体的结合如下评价:将2×10⁵个细胞与浓度为1μg/ml的69A7一起孵育。洗涤细胞，用FITC标记的抗人IgG Ab检测其结合。使用在细胞表面上不表达CD70的Jurkat细胞系作为阴性对照。使用FACSCalibur流式细胞仪(BectonDickinson，San Jose，CA)进行流式细胞分析。结果显示在图17E中。通过染色的平均荧光强度(MFI)测定发现，抗CD70人单克隆抗体69A7与Daudi淋巴瘤细胞系和786-O肾癌细胞系结合。

这些数据证明抗CD70 HuMAb与淋巴瘤细胞系结合。

实施例6:抗CD70单克隆抗体的结合亲和力的Scatchard分析

采用Scatchard分析检测了2H5、8B5、10B4和18E7单克隆抗体对CD70转染的CHO细胞系的结合亲和力。

使用标准技术用全长CD70转染CHO细胞，在含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI培养基中生长。用胰蛋白酶消化该细胞，用基于Tris的结合缓冲液(24mM Tris pH7.2、137mM NaCl、2.7mM KCl、2mM葡萄糖、1mM CaCl₂、1mM MgCl₂、0.1％ BSA)洗一次，用结合缓冲液将细胞调节至2×106细胞/ml。Millipore板(MAFB NOB)用1％脱脂奶粉水溶液包被，并在4℃下贮存过夜。用0.2ml结合缓冲液洗板三次。向最大结合孔中加入单独50微升缓冲液(总结合)。向对照孔中加入单独25微升缓冲液(非特异性结合)。向所有孔中加入体积为25μl的不同浓度的¹²⁵I-抗-CD70抗体。向对照孔中加入体积为25μl的100倍过量的不同浓度的未标记的抗体，并向所有孔中加入在结合缓冲液中的25μl CD70转染的CHO细胞(2×10⁶细胞/ml)。将板在4℃摇床上以200RPM孵育2小时。在孵育结束时，用0.2ml冷洗涤缓冲液(24mM Tris pH7.2、500mM NaCl、2.7mM KCl、2mM葡萄糖、1mMCaCl₂、1mM MgCl₂、0.1％BSA)洗Millipore板三次。取出滤膜，用γ计数器计数。使用Prism软件(San Diego，CA)用单位点结合参数进行平衡结合的评价。

应用上述Scatchard结合测定，抗体对CD70转染的CHO细胞的K_D如下:2H5为接近2.1nM，8B5为5.1nM，10B4为1.6nM，18E7为1.5nM。

实施例7:抗CD70单克隆抗体的内化

使用Hum-Zap内化试验检测了抗CD70 HuMAb向表达CD70的肾癌细胞中内化的能力。Hum-Zap试验通过第二抗体的结合检测第一人抗体的内化，该第二抗体具有对偶联到毒素肥皂草毒蛋白(saporin)上的人IgG的亲和性。

表达CD70的肾癌细胞系786-O以1.25×10⁴细胞/孔接种到100μl孔中过夜。向孔中加入初始浓度为30nM的抗CD70 HuMAb抗体2H5、8B5、10B4或18E7，并以1:3连续稀释向下滴定。使用对CD70非特异性的同种型对照抗体作为阴性对照。以11nM的浓度加入Hum-Zap(Advanced Targeting Systems，San Diego，CA，IT-22-25)，将板孵育72小时。然后用1.0Ci ³H-胸苷对板进行脉冲24小时，收获，用Top Count闪烁计数仪(Packard Instruments，Meriden，CT)读数。结果显示在图18中。抗CD70抗体2H5、8B5、10B4和18E7显示在表达CD70的786-O肾癌细胞中³H-胸苷掺入依赖于抗体浓度的降低。该数据证明抗CD70抗体2H5、8B5、10B4和18E7内化到肾癌细胞系中。

实施例8:毒素偶联的抗CD70抗体对肾细胞癌细胞系的细胞杀伤的评价

在该实施例中，利用细胞增殖试验检测了与毒素偶联的抗CD70单克隆抗体杀伤CD70+肾细胞癌细胞系的能力。

抗CD70 HuMAb抗体2H5、8B5、10B4和18E7与毒素通过诸如肽、腙或二硫化物连接体等连接体偶联。将表达CD70的肾癌细胞系ACHN和Caki-2以2.5×10⁴细胞/孔接种在100μl孔中3小时，表达CD70的肾癌细胞系786-O以1.25×10⁴细胞/孔接种在100μl孔中3小时。向孔中加入初始浓度为30nM的抗CD70抗体-毒素偶联物，并以1:3连续稀释度向下滴定。用对于CD70非特异性的同种型对照抗体作为阴性对照。使板孵育69小时。然后用1.0Ci 3H-胸苷对板进行脉冲24小时，收获，并用Top Count闪烁计数器(Packard Instruments，Meriden，CT)读数。结果显示在图19A(Caki-2)、19B(786-O)和19C(ACHN)中。在表达CD70的Caki-2、786-O和ACHN肾癌细胞中，抗CD70抗体2H5、8B5、10B4和18E7显示抗体-毒素浓度依赖性的3H-胸苷掺入减少。抗CD70抗体的EC₅₀值为:对于Caki-2细胞为6.728nM至76.05nM，对于786-O细胞为1.635nM至3.940nM，对于ACHN细胞为9.406nM至108.5nM。该数据证明抗CD70抗体2H5、8B5、10B4和18E7当与毒素偶联时对于肾癌细胞系具有细胞毒性。

实施例9:抗CD70抗体的ADCC活性的评价

在该实施例中，利用荧光细胞毒性试验检测抗CD70单克隆抗体在效应细胞存在下通过抗体依赖的细胞毒性(ADCC)杀伤CD70+细胞系的能力。

人效应细胞如下用全血制备。通过标准Ficoll-paque分离法从肝素化的全血中纯化人外周血单核细胞。将该细胞重悬浮在含有10％FBS和200U/ml人IL-2的RPMI1640培养基中，并在37℃下孵育过夜。次日，收集细胞，用培养基洗四次，并以2×10⁷细胞/ml的浓度重悬浮。CD70+靶细胞与BATDA试剂(Perkin Elmer，Wellesley，MA)以每1×10⁶个靶细胞/mL2.5μl BATDA的比例在37℃下孵育20分钟。将靶细胞洗四次，离心，并使终浓度为1×105细胞/ml。

如下所述使用Delfia荧光发射分析检测CD70+细胞系ARH-77(人B淋巴母细胞白血病；ATCC保藏号CRL-1621)、HuT 78(人皮肤淋巴细胞淋巴瘤；ATCC保藏号TIB-161)、Raji(人B淋巴细胞伯基特淋巴瘤；ATCC保藏号CCL-86)和阴性对照细胞系L540(人何杰金氏淋巴瘤；DSMZ保藏号ACC 72)对人抗CD70单克隆抗体的抗体特异性ADCC。每种靶细胞系(100μl标记的靶细胞)与50μl效应细胞和50μl抗体一起孵育。在整个实验过程中使用1:50的靶:效比。在所有研究中，用人IgG1同种型对照作为阴性对照。在2000rpm脉冲离心和37℃孵育一小时后，收集上清液，再次快速离心，并将20μl上清液转移到平底板中，向其中加入180μl Eu溶液(Perkin Elmer，Wellesley，MA)，用RubyStar读板器(BMG Labtech)读数。裂解％如下计算:(样品释放-自发释放*100)/(最大释放-自发释放)，其中自发释放是来自只含靶细胞的孔的荧光，最大释放是来自含有靶细胞并且用2％ Triton-X处理的孔的荧光。ARH-77、HuT 78、Raji和L-540细胞系的细胞毒性％裂解分别显示在图20A-D中。应用HuMAb抗CD70抗体2H5和18E7，表达CD70+的细胞系ARH-77、HuT 78和Raji均显示抗体介导的细胞毒性，而阴性对照细胞系L-540在抗CD70抗体存在下没有可检测到的细胞毒性。该数据证明HuMAb抗CD70抗体对CD70+表达细胞显示特异性细胞毒性。

实施例10:毒素偶联的抗CD70抗体对人淋巴瘤细胞系的细胞杀伤的评价

在该实施例中，利用细胞增殖试验检测了与毒素偶联的抗CD70单克隆抗体杀伤CD70+人淋巴瘤细胞系的能力。

抗CD70 HuMAb抗体2H5与毒素通过诸如肽、腙或二硫化物连接体等连接体偶联。可以与本发明的抗体偶联的毒素化合物的例子在2005年9月26日提交的案卷号为04280/100M629US3的同时提交的申请中有描述。将表达CD70的人淋巴瘤细胞系Daudi、HuT 78、Granta519和Raji以10⁵细胞/孔接种在100μl孔中3小时。向孔中加入初始浓度为30nM的抗CD70抗体-毒素偶联物，并以1:2的连续稀释度向下滴定。也用Jurkat细胞检测HuMAb抗体2H5-毒素偶联物，Jurkat细胞是在细胞表面上不表达CD70的阴性对照细胞系。使板孵育72小时。然后用0.5μCi ³H-胸苷对板进行脉冲8小时，然后终止培养，收获，并用Top Count闪烁计数器(Packard Instruments)读数。图21显示2H5-偶联物对Daudi、HuT 78、Granta 519和Jurkat细胞的效果。在表达CD70的Daudi、HuT 78和Granta 519 B细胞淋巴瘤癌细胞中，抗CD70抗体2H5显示抗体-毒素浓度依赖性的³H-胸苷掺入减少，但在Jurkat细胞中则没有。

在单独的试验中，表达CD70的人淋巴瘤癌细胞系Raji以104细胞/孔接种在100μl孔中3小时。向孔中加入初始浓度为30nM的抗CD70抗体-毒素偶联物，并以1:3的连续稀释度向下滴定。使用毒素偶联的同种型对照抗体作为对照。使板在洗涤3小时或连续洗涤情况下孵育72小时。然后用0.5μCi ³H-胸苷对板进行脉冲8小时，然后终止培养，收获，并用Top Count闪烁计数器(Packard Instruments)读数。图22A和22B显示分别在3小时洗涤或连续洗涤时对于Raji细胞有抗体-毒素浓度依赖性的³H-胸苷掺入减少。

该数据证明与毒素偶联的抗CD70抗体显示对人淋巴瘤癌细胞的特异性细胞毒性。

实施例11:使用裸抗CD70抗体和细胞毒素偶联的抗CD70抗体治疗体内肿瘤异种移植模型

为了检测抗体对肿瘤生长的体内效果，用毒素偶联的抗CD70抗体体内治疗植入肾细胞癌肿瘤的小鼠。

A-498(ATCC保藏号HTB-44)和ACHN(ATCC保藏号CRL-1611)细胞用标准实验程序在体外扩增。6-8周龄的雄性Ncr无胸腺裸鼠(Taconic，Hudson，NY)每只小鼠在右胁皮下植入在0.2mlPBS/Matrigel(1:1)中的7.5×10⁶ACHN或A-498细胞。在植入后对小鼠称重，使用电子卡尺测量肿瘤三维，每周两次。肿瘤体积计算为高度×宽度×长度。荷有平均270mm³的ACHN肿瘤或平均110mm³的A498肿瘤的小鼠随机分入治疗组。在第0天，小鼠腹膜内给予PBS载体、毒素偶联的同种型对照抗体或毒素偶联的抗CD70HuMAb 2H5。可以与本发明的抗体偶联的毒素化合物的例子在编号为MEDX-0034US4的同时提交的申请中描述。A-498样品组中的小鼠用三种不同的毒素化合物检测。在给药后的60天里，监测小鼠的肿瘤生长。当肿瘤达到肿瘤终点(2000mm³)时对小鼠行安乐死。结果显示在图23A(A-498肿瘤)和23B(ACHN肿瘤)中。与毒素偶联的抗CD70抗体2H5延长了达到肿瘤终点体积(2000mm³)的平均时间，并且延缓了肿瘤生长的进展。因此，用抗CD70抗体-毒素偶联物治疗对肿瘤生长具有直接的体内抑制效果。

实施例12:使用2H5的免疫组织化学

使用来自透明细胞肾细胞癌(ccRCC)、淋巴瘤和胶质母细胞瘤患者的临床活检标本，通过免疫组织化学检测抗CD70 HuMAb 2H5识别CD70的能力。

对于免疫组织化学，使用5μm冷冻的切片(Ardais Inc，USA)。干燥30分钟后，切片用丙酮固定(在室温下10分钟)并且风干5分钟。用PBS漂洗玻片，然后与PBS中的10％正常山羊血清预孵育20分钟，随后与在含10％正常山羊血清的PBS中的10μg/ml fitc化的2H5在室温下孵育30分钟。然后，用PBS洗涤玻片三次，与小鼠抗FITC(10μg/ml，DAKO)在室温下孵育30分钟。玻片再用PBS洗涤，与山羊抗小鼠HRP偶联物(DAKO)在室温下孵育30分钟。玻片用PBS洗涤三次。用二氨基联苯胺(Sigma)作为底物，产生棕色染色。用蒸馏水洗涤后，玻片用苏木精复染1分钟。然后玻片在流动的蒸馏水中洗涤10秒种，在glycergel(DAKO)中固定。临床活检标本的免疫组织化学染色显示在非何杰金氏淋巴瘤、浆细胞瘤、ccRcc和胶质母细胞瘤切片中为阳性染色。只有恶性细胞在每种情况中都为阳性，相邻的正常组织未被染色。

实施例13:脱岩藻糖基化HuMAb的产生

已经证明岩藻糖基残基数目减少的抗体提高抗体的ADCC能力。在本实施例中，产生缺乏了岩藻糖基残基的2H5 HuMAb。

缺乏岩藻糖基转移酶基因FUT8的CHO细胞系Ms704-PF(Biowa，Inc.，Princeton，NJ)用表达抗体2H5重链和轻链的载体电穿孔。通过在含有6mM L-谷氨酰胺和500μg/ml G418(Invitrogen，Carlsbad，CA)的Ex-Cell 325-PF CHO培养基(JRH Biosciences，Lenexa，KS)中生长筛选耐药性克隆。通过标准ELISA测定根据IgG表达筛选克隆。产生了两个单独的克隆，B8A6和B8C11，其产率范围为每天每细胞1.0到3.8皮克。

实施例14:脱岩藻糖基化抗CD70抗体的ADCC活性的评价

在该实施例中，利用荧光细胞毒性试验检测了脱岩藻糖基化的和非脱岩藻糖基化的抗CD70单克隆抗体在效应细胞存在下通过抗体依赖的细胞毒性(ADCC)杀伤CD70+细胞的能力。

人抗CD70单克隆抗体2H5如上所述脱岩藻糖基化。人效应细胞如下所述用全血制备。通过标准Ficoll-paque分离法从肝素化的全血中纯化人外周血单核细胞。将该细胞重悬浮在含有10％FBS和200U/ml人IL-2的RPMI1640培养基(培养基)中，并在37℃下孵育过夜。次日，收集细胞，用培养基洗一次，并以2×10⁷细胞/ml的浓度重悬浮。CD70+靶细胞与BATDA试剂(Perkin Elmer，Wellesley，MA)以每1×10⁶靶细胞/mL培养基2.5μl BATDA的比例在37℃孵育20分钟。将靶细胞用含有20mM HEPES和2.5mM丙磺舒的PBS洗四次，离心，并使测定基质中的终浓度为1×105细胞/ml。

如下所述使用Delfia荧光发射分析检测CD70+细胞系ARH-77(人B淋巴母细胞白血病；ATCC保藏号CRL-1621)、MEC-1(人慢性B细胞白血病；DSMZ保藏号ACC 497)、SU-DHL-6(人B细胞淋巴瘤；DSMZ保藏号Acc572)、IM-9(人B淋巴母细胞；ATCC保藏号CCL-159)和HuT 78(人皮肤淋巴细胞淋巴瘤；ATCC保藏号TIB-161)对脱岩藻糖基化和非脱岩藻糖基化的人抗CD70单克隆抗体2H5的抗体特异性ADCC。靶细胞系ARH-77(100μl标记的靶细胞)与50μl效应细胞和50μl 2H5或脱岩藻糖基化的2H5抗体一起孵育。在整个实验过程中使用1:50的靶:效比。用人IgG1同种型对照作为阴性对照。在2100rpm脉冲离心和37℃孵育一小时后，收集上清液，再次快速离心，并将20μl上清液转移到平底板中，向其中加入180μl Eu溶液(Perkin Elmer，Wellesley，MA)，用Fusion Alpha TRF读板器(Perkin Elmer)读数。裂解％如下计算:(样品释放-自发释放*100)/(最大释放-自发释放)，其中自发释放是来自只含靶细胞的孔的荧光，最大释放是来自含有靶细胞并且用3％ Lysol处理的孔的荧光。ARH-77细胞系的细胞毒性％裂解显示在图24中。表达CD70+的细胞系ARH-77、MEC-1、SU-DHL-6、IM-9和HuT 78应用HuMAb抗CD70抗体2H5显示抗体介导的细胞毒性，并且显示与抗CD70抗体2H5脱岩藻糖基化形式有关的增加的特异性裂解百分比。另外，在MEC-1细胞系中，抗CD16抗体显示阻断ADCC效应。该数据证明脱岩藻糖基化的HuMAb抗CD70抗体对CD70+表达细胞显示增强的特异性细胞毒性。

实施例15:使用⁵¹Cr-释放试验评价抗CD70抗体的ADCC活性

在该实施例中，利用⁵¹Cr-释放试验检测了抗CD70单克隆抗体在效应细胞存在下通过抗体依赖的细胞毒性(ADCC)杀伤CD70+RajiB淋巴细胞的能力。

人外周血单核细胞(效应细胞)通过标准Ficoll-paque分离法从肝素化的全血中纯化。将该细胞以2×10⁶/mL重悬浮在含有10％ FBS和200U/ml人IL-2的RPMI1640培养基中，并在37℃下孵育过夜。次日，收集细胞，用培养基洗一次，并以2×10⁷细胞/ml的浓度重悬浮。两百万个Raji靶细胞(人B淋巴细胞伯基特淋巴瘤；ATCC保藏号CCL-86)与200μCi ⁵¹Cr在1ml总体积中37℃孵育1小时。将靶细胞洗涤一次，重悬浮在1ml培养基中，于37℃再孵育30分钟。最后孵育后，将靶细胞洗涤一次，使终浓度为1×10⁵细胞/ml。对于最后的ADCC测定，100μl标记的Raji细胞与50μl效应细胞和50μl抗体一起孵育。在整个实验过程中使用1:100的靶:效比。在所有研究中，用人IgG1同种型对照作为阴性对照。在某些研究中，在向测定板中加入PBMC之前，将PBMC培养物分别等分到含有20μg/mL抗人CD16抗体、无关的小鼠IgG1抗体或者不含抗体的试管中。在27℃孵育15分钟后，如上所述不加洗涤地使用血细胞。37℃孵育4小时后，收集上清液，用Cobra IIγ射线自动计数器(PackardInstruments)以240-400keV的阅读窗计数。每分钟的计数作为抗体浓度的函数作图，使用Prism软件(San Diego，CA)，通过非线性回归、S形剂量应答(可变斜率)分析数据。裂解百分比用以下方程式计算:％裂解＝(样品CPM-无抗体CPM)/(TritonX CPM-无抗体CPM)×100。对于Raji细胞系的细胞毒性％特异性裂解的抗体滴定曲线显示在图25中。该数据证明抗CD70抗体对Raji细胞系具有ADCC作用。抗CD70抗体对Raji细胞的EC₅₀值为36.61nM。在抗CD16抗体存在下对Raji细胞的细胞毒性的图显示在图26中。该数据证明抗CD70抗体对Raji细胞的ADCC作用依赖于CD16。

实施例16:抗CD70抗体对活化T细胞的ADCC活性的评价

在该实施例中，利用荧光细胞毒素试验检测了脱岩藻糖基化和非脱岩藻糖基化的抗CD70单克隆抗体在效应细胞存在下通过抗体依赖的细胞毒性(ADCC)杀伤活化T细胞的能力。

人抗CD70单克隆抗体2H5如上所述脱岩藻糖基化。人效应细胞如上所述制备。人脾T细胞用抗CD3包被的磁珠(纯度>90％)正选择。细胞用抗CD3和抗CD28包被的珠子和25ng/mlIL-2在Iscove′s培养基+10％热灭活的FCS中刺激6天。收集细胞，通过碘化丙锭掺入法测定存活力(60％存活)，针对CD70表达门控并分析活细胞(活细胞中约65％ CD70+)，之后加入ADCC测定。

如下所述采用Delfia荧光发射分析检测活化T细胞对于脱岩藻糖基化和非脱岩藻糖基化的人抗CD70单克隆抗体2H5的抗体特异性ADCC。活化的靶T细胞(100μl标记的靶细胞)与50μl效应细胞和50μl 2H5或脱岩藻糖基化的2H5抗体一起孵育。在整个实验过程中使用1:50的靶:效比。用人IgG1同种型对照作为阴性对照。在2100rpm脉冲离心和37℃孵育一小时后，收集上清液，再次快速离心，并将20μl上清液转移到平底板中，向其中加入180μl Eu溶液(Perkin Elmer，Wellesley，MA)，用Fusion Alpha TRF读板器(PerkinElmer)读数。裂解％如下计算:(样品释放-自发释放*100)/(最大释放-自发释放)，其中自发释放是来自只含靶细胞的孔的荧光，最大释放是来自含有靶细胞并且用3％ Lysol处理的孔的荧光。活化T细胞的细胞毒性％特异性裂解显示在图27中。活化T细胞显示对于HuMAb抗CD70抗体2H5的抗体介导的细胞毒性，以及与抗CD70抗体2H5脱岩藻糖基化形式有关的增加的特异性裂解百分比。在脱岩藻糖基化和非脱岩藻糖基化形式的抗CD70抗体中加入抗CD16抗体阻断了抗体介导的细胞毒性。对照IgG对于细胞毒性没有影响。该数据证明脱岩藻糖基化的HuMAb抗CD70抗体对活化T细胞显示增加的特异性细胞毒性。

实施例17:受体-配体CD70-CD27结合的阻断试验

在该实施例中，利用阻断试验检测了抗CD70单克隆抗体阻断CD70与配体CD27相互作用的能力。

孔用100μl/孔的2μg/ml的抗IgG抗体(Fc-sp.)于4℃包被过夜。孔用200μl/孔1％ BSA/PBS在室温下封闭1小时。向每孔中加入100μl/孔的0.16μg/ml的CD27-Fc-his，在37℃下振摇1小时。每孔用200μl/孔PBS/Tween 20(0.05％(v:v))洗涤5次。抗CD70抗体在10％NHS+1％ BSA/PBS中稀释，与0.05μg/ml的CD70-myc-his混合，在室温下孵育1小时，并用200μl/孔PBS/Tween 20(0.05％(v:v))洗涤5次。用阻断CD70/CD27相互作用的已知抗体作为阳性对照，用同种型对照抗体作为阴性对照。CD70和抗CD70抗体的混合物用抗Fc抗体阻断，向含有CD27-Fc-his的孔中加入100μl/孔的CD70-myc-his+抗体。该混合物在37℃下摇动孵育1小时。向混合物中加入100μl/孔的抗myc-HRP(在10％ NHS+1％ BSA/PBS中1:1000稀释)，并且在37℃摇动下孵育1小时。加入100μl TMB底物，室温下孵育5-10分钟，然后加入75μl 0.25M H₂SO₄，由此检测信号，在A450nm处读取结果。结果显示在图28中。该数据证实某些抗CD70抗体，包括2H5、8B5和18E7，阻断CD70与CD27的结合，而另外一些抗体不影响CD70和CD27之间的相互作用。

实施例18:使用裸抗CD70抗体治疗体内肿瘤异种移植模型

为了检测抗体对肿瘤生长的体内效果，用裸抗CD70抗体体内治疗植入淋巴瘤的小鼠。

ARH-77(人B淋巴母细胞白血病；ATCC保藏号CRL-1621)和Raji(人B淋巴细胞伯基特淋巴瘤；ATCC保藏号CCL-86)细胞用标准实验程序在体外扩增。6-8周龄的雄性Ncr无胸腺裸鼠(Taconic，Hudson，NY)每只小鼠在右胁皮下植入在0.2ml PBS/Matrigel(1:1)中的5×10⁶ ARH-77或Raji细胞。在植入后对小鼠称重，使用电子卡尺测量肿瘤三维，每周两次。肿瘤体积计算为高度×宽度×长度/2。荷有平均80mm³的ARH-77肿瘤或平均170mm³的Raji肿瘤的小鼠随机分入治疗组。在第0天，小鼠腹膜内给予PBS载体、同种型对照抗体或裸抗CD70 HuMAb 2H5。当肿瘤达到肿瘤终点(2000mm³)时对小鼠行安乐死。结果显示在图29A(Raji肿瘤)和29B(ARH-77肿瘤)中。裸抗CD70抗体2H5延长了达到肿瘤终点体积(2000mm³)的平均时间，并且延缓了肿瘤生长的进展。因此，用单独的抗CD70抗体治疗对肿瘤生长具有直接的体内抑制效果。

实施例19:使用毒素偶联的抗CD70抗体治疗体内淋巴瘤肿瘤异种移植模型

为了检测抗体对肿瘤生长的体内效果，用毒素偶联的抗CD70抗体体内治疗植入淋巴瘤的小鼠。

ARH-77(人B淋巴母细胞白血病；ATCC保藏号CRL-1621)、Granta 519(DSMZ保藏号342)和Raji(人B淋巴细胞伯基特淋巴瘤；ATCC保藏号CCL-86)细胞用标准实验程序在体外扩增。6-8周龄的雄性Ncr无胸腺裸鼠(Taconic，Hudson，NY)每只小鼠在右胁皮下植入在0.2ml PBS/Matrigel(1:1)中的5×10⁶ ARH-77、10×10⁶ Granta 519或5×10⁶ Raji细胞。在植入后对小鼠称重，使用电子卡尺测量肿瘤三维，每周两次。肿瘤体积计算为高度×宽度×长度/2。荷有平均80mm³(ARH-77)、220mm³(Granta 519)或170mm³(Raji)肿瘤的小鼠随机分入治疗组。在第0天，小鼠腹膜内给予PBS载体、毒素偶联的同种型对照抗体或毒素偶联的抗CD70 HuMAb 2H5。可以与本发明的抗体偶联的毒素化合物的例子在2005年9月26日提交的美国临时申请序号60/720,499中描述。当肿瘤达到肿瘤终点(2000mm³)时对小鼠行安乐死。结果显示在图30A(ARH-77)、30B(Granta 519)和30C(Raji肿瘤)中。与毒素偶联的抗CD70抗体2H5延长了达到肿瘤终点体积(2000mm³)的平均时间，并且延缓了肿瘤生长的进展。因此，用抗CD70抗体-毒素偶联物治疗对淋巴瘤肿瘤生长具有直接的体内抑制效果。

实施例20:抗CD70抗体与恒河猴B淋巴瘤细胞的交叉反应性

也进行了FACS分析来评价抗CD70抗体69A7与恒河猴CD70+B淋巴瘤细胞系LCL8664(ATCC#:CRL-1805)交叉反应的能力。HuMAb 69A7抗CD70人单克隆抗体的结合如下评价:1×10⁵细胞与浓度为1μg/ml的69A7一起孵育。洗涤细胞，用FITC-标记的抗人IgG Ab检测结合。用同种型对照作为阴性对照。使用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行流式细胞分析。结果显示在图31中。结果证实抗CD70抗体69A7与猴CD70+B淋巴瘤细胞交叉反应。

实施例21:抗CD70抗体在与786-O肾癌细胞结合后的内化

利用免疫荧光染色，用786-O人肾癌细胞系检测HuMab抗CD70抗体69A7和2H5在与细胞结合后的内化。通过用0.25％胰蛋白酶/EDTA处理从组织培养瓶中收获786-O细胞(1×10⁴细胞每100μl每孔，在96-孔板中)，然后与在FACS缓冲液(PBS+5％ FBS，培养基)中的各5μg/ml的HuMab抗CD70抗体在冰上孵育30分钟。用人IgG1同种型对照作为阴性对照。用培养基洗涤2次后，将细胞重悬浮在培养基中(每孔100μl)，然后与1:100稀释的PE偶联的山羊抗人第二抗体(Jackson ImmunoResearch Lab)一起在冰上孵育30分钟。细胞在0分钟时立即在荧光显微镜(Nikon)下进行形态学和免疫荧光强度成像，或者在37℃下孵育不同的时间。在HuMab抗CD70抗体染色的细胞中观察到荧光，但是在对照抗体中未观察到。在试验中使用FITC-直接偶联的HuMab抗CD70抗体也获得类似的结果。结果显示应用两种抗CD70 HuMab在0分钟时在细胞表面膜上出现荧光。孵育30分钟后，膜荧光强度显著降低，而内部荧光增强。在120分钟时间点时，膜荧光不明显，但是在细胞内区室中出现荧光。该数据证明HuMab抗CD70抗体在与表达CD70的内源肿瘤细胞结合后能够特异性内化。

实施例22:HuMAb抗CD70阻断已知小鼠抗CD70抗体的结合

在该实验中，检测HuMAb抗CD70抗体69A7阻断已知小鼠抗CD70抗体与CD70+肾癌786-O细胞结合的能力。786-O细胞与1μg/ml的小鼠抗CD70抗体BU-69(Ancell，Bayport，MN)和1、5或10μg/ml的HuMAb 69A7在冰上孵育20分钟。用IgG1和IgG2同种型对照抗体作为阴性对照。洗涤细胞两次，用FITC-标记的抗人IgG Ab检测结合。用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行流式细胞分析。结果显示在图32中。抗CD70 HuMAb 69A7以浓度依赖的方式阻断小鼠抗CD70抗体的结合。

实施例23:HuMAb抗CD70抑制炎症应答

在该实验中，检测了HuMAb抗CD70抗体2H5对炎症应答的抑制。小鼠CD32稳定转染的CHO-S细胞(CHO-S/mCD32细胞)用全长人CD70构建体瞬时转染(CHO-S/mCD32/CD70细胞)。使用2A5和PE偶联的抗人IgG第二抗体通过流式细胞分析证实表面表达(数据未显示)。

人T细胞富集试剂盒(目录号15061；StemCellTechnologies Inc)纯化的人外周血CD3+T细胞在体外以1×10⁶/孔用1×10⁵ CHO-S/mCD32或CHO-S/mCD32/CD70细胞/孔、1μg/ml抗hCD3(克隆OKT3；BD Bioscience)和连续稀释的HuMAb 2H5或非岩藻糖基化2H5(2H5NF)刺激，在96孔板中各重复三个孔。3天后，收集上清液等份，用定量ELISA试剂盒(BD Biosciences)测定干扰素-γ(INF-γ)分泌。培养板用1μCi/ml of ³H-胸苷脉冲，孵育8小时，收获细胞，用

 1450 Microbeta计数器(Wallac，Inc.)读取³H-胸苷掺入，用IgG1同种型对照抗体作为阴性对照。结果显示在图33中。2H5和2H5 NF都以剂量依赖的方式完全抑制CD70共刺激的增殖(图33A)。数据还显示2H5抑制对于CD70共刺激是特异性的，因为2H5对于抗CD3+CHO-S/mCD32介导的增殖没有影响。2H5和2H5 NF也以剂量依赖的方式完全抑制CD70共刺激的INF-γ分泌(图33B)。数据还显示2H5抑制对于CD70共刺激是特异性的，因为2H5对于抗CD3+CHO-S/mCD32介导的INF-γ分泌没有影响。数据综合起来显示2H5和2H5NF在功能上阻断CD70人T细胞共刺激。

针对巨细胞病毒(CMV)特异性T细胞应答(Astarte，Inc)预筛选的人MHC I类单倍体B^*3501+外周血单核细胞(PBMC)在25ng/mlB^*3501结合CMV肽IPSINVHHY(ProImmune，Oxford，UK)和连续稀释的HuMAb 2H5存在下培养11天。通过流式细胞术用PE偶联的抗CD8染色(克隆RPA-T8，BD Biosciences)分析培养物的CD8+T细胞，用APC标记的肽-MHC I类五聚寡聚体染色(F114-4B；ProImmune)分析肽特异性CD8+T细胞，根据碘化丙锭染色的缺乏分析存活率。用同种型对照抗体作为阴性对照。结果显示在图34中。2H5部分抑制肽特异性CD8+T细胞扩增，2H5NF和阳性对照抗MHC I类抗体(克隆W6/32；BD Bioscience)完全抑制肽特异性CD8+T细胞扩增(图34A)。未观察到总细胞存活率显著降低(图34B)。未观察到总CD8+细胞数显著减少(图34C)。总之，数据显示2H5和2H5NF作用对于肽刺激的CD8+T细胞是特异性的。数据代表用同一供体进行的另外一个实验。

在存在或不存在连续稀释的抗人CD16(FcRγIII)功能阻断抗体(克隆3G8；BD Biosciences)、存在25ng/ml B^*3501结合CMV肽IPSINVHHY(ProImmune)和20μg/ml HuMAb 2H5的条件下，针对巨细胞病毒(CMV)特异性T细胞应答预筛选(Astarte，Inc)的人MHC I类单倍体B^*3501+PBMC培养11天，然后如上所述通过流式细胞术分析肽特异性CD8+细胞数。结果显示在图35中。抗CD16剂量依赖性地逆转了2H5和2H5NF介导的肽特异性CD8+T细胞扩增的抑制，这表明2H5和2H5 NF抑制是通过2H5和2H5 NF与CD16+效应细胞相互作用介导的。与2H5相比，逆转2H5 NF介导的抑制需要大约高1000-倍的3G8。阴性同种型对照没有抑制肽特异性CD8+T细胞扩增，无论3G8浓度如何，3G8对功能阻断的阳性对照W6/32抑制肽特异性CD8+T细胞扩增有极少的影响或者没有影响。

实施例24:使用细胞毒素偶联的抗CD70抗体治疗体内肾癌肿瘤异种移植模型

为了检测抗体对肿瘤生长的体内效果，用毒素偶联的抗CD70抗体体内治疗植入肾癌肿瘤的小鼠。

786-O(ATCC保藏号CRL-1932)和Caki-1(ATCC保藏号HTB-46)细胞用标准实验程序在体外扩增。6-8周龄的雄性CB17.SCID小鼠(Taconic，Hudson，NY)每只小鼠在右胁皮下植入在0.2mlPBS/Matrigel(1:1)中的250万个786-O或Caki-1细胞。在植入后对小鼠称重，使用电子卡尺测量肿瘤三维，每周两次。肿瘤体积计算为高度×宽度×长度。荷有平均200mm³肿瘤的小鼠随机分入治疗组。在第0天，小鼠腹膜内给予PBS载体、毒素偶联的同种型对照抗体或毒素偶联的抗CD70 HuMAb 2H5。可以与本发明的抗体偶联的毒素化合物的例子在2005年9月26日提交的美国临时申请序号60/720,499中描述。当肿瘤达到肿瘤终点(2000mm³)时对小鼠行安乐死。结果显示在图36A(786-O)和36B(Caki-1)中。与毒素偶联的抗CD70抗体2H5延长了达到肿瘤终点体积(2000mm³)的平均时间，并且延缓了肿瘤生长的进展。治疗组动物的体重变化小于10％。因此，用抗CD70抗体-毒素偶联物进行治疗对淋巴瘤肿瘤生长具有直接的体内抑制效果。

 

SEQIDNO:	序列	SEQ IDNO:	序列
				1	VH氨基酸2H5	26	VK CDR1氨基酸2H5
2	VH氨基酸10B4	27	VK CDR1氨基酸10B4
				3	VH氨基酸8B5	28	VK CDR1氨基酸8B5
4	VH氨基酸18E7	29	VK CDR1氨基酸18E7
				5	VH氨基酸69A7	30	VKCDR1氨基酸69A7
6	VK氨基酸2H5	31	VK CDR2氨基酸2H5
				7	VK氨基酸10B4	32	VKCDR2氨基酸10B4
8	VK氨基酸8B5	33	VK CDR2氨基酸8B5
				9	VK氨基酸18E7	34	VKCDR2氨基酸18E7
10	VK氨基酸69A7	35	VK CDR2氨基酸69A7
				11	VH CDR1氨基酸2H5	36	VK CDR3氨基酸2H5
12	VH CDR1氨基酸10B4	37	VK CDR3氨基酸10B4
				13	VH CDR1氨基酸8B5	38	VK CDR3氨基酸8B5
14	VH CDR1氨基酸18E7	39	VK CDR3氨基酸18E7
				15	VH CDR1氨基酸69A7	40	VK CDR3氨基酸69A7
16	VH CDR2氨基酸2H5	41	VH核苷酸2H5
				17	VH CDR2氨基酸10B4	42	VH核苷酸10B4
18	VH CDR2氨基酸8B5	43	VH核苷酸8B5
				19	VH CDR2氨基酸18E7	44	VH核苷酸18E7
20	VH CDR2氨基酸69A7	45	VH核苷酸69A7
				21	VH CDR3氨基酸2H5	46	VK核苷酸2H5
22	VH CDR3氨基酸10B4	47	VK核苷酸10B4
				23	VH CDR3氨基酸8B5	48	VK核苷酸8B5
24	VH CDR3氨基酸18E7	49	VK核苷酸18E7
				25	VH CDR3氨基酸69A7	50	VK核苷酸69A7
51	VH 3-30.3种系氨基酸	54	VK L6种系氨基酸
				52	VH 3-33种系氨基酸	55	VK L18种系氨基酸

 

53

VH 4-61种系氨基酸

56

VK L15种系氨基酸

序列表

Claims (59)

1.一种分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体：

(a)以1×10^-7M或更低的K_D与人CD70结合；和

(b)与肾细胞癌肿瘤细胞系结合。

2.权利要求1的抗体，其为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型的全长抗体。

3.权利要求1的抗体，其为抗体片段或单链抗体。

4.权利要求1的抗体，其中所述抗体以5.5×10^-9M或更低的K_D与人CD70结合。

5.权利要求1的抗体，其中所述抗体以3×10^-9M或更低的K_D与人CD70结合。

6.权利要求1的抗体，其中所述抗体以2×10^-9M或更低的K_D与人CD70结合。

7.权利要求1的抗体，其中所述抗体被内化。

8.权利要求1的抗体，其中所述肾细胞癌肿瘤细胞系选自786-O、A-498、ACHN、Caki-1和Caki-2细胞系。

9.权利要求1的抗体，其中所述抗体与B细胞肿瘤细胞系结合。

10.权利要求9的抗体，其中所述B细胞肿瘤细胞系选自Daudi、HuT 78、Raji和Granta519细胞系。

11.权利要求1的抗体，其中所述抗体缺乏岩藻糖残基。

12.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体与参比抗体交叉竞争结合CD70，其中所述参比抗体：

(a)以1×10^-7M或更低的K_D与人CD70结合；和

(b)与肾细胞癌肿瘤细胞系结合。

13.权利要求12的抗体，其中所述参比抗体包含：

(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的轻链可变区。

14.权利要求12的抗体，其中所述参比抗体包含：

(a)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的轻链可变区。

15.权利要求12的抗体，其中所述参比抗体包含：

(a)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的轻链可变区。

16.权利要求12的抗体，其中所述参比抗体包含：

(a)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链可变区。

17.权利要求12的抗体，其中所述抗体与B细胞肿瘤细胞系结合。

18.权利要求17的抗体，其中所述B细胞肿瘤细胞系选自Daudi、HuT 78、Raji和Granta 519细胞系。

19.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括产自或源自人V_H 3-30.3基因或人V_H 3-33基因的重链可变区，其中该抗体与CD70特异性结合。

20.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括产自或源自人V_K L6基因、人V_K L18基因或人V_K L15基因的轻链可变区，其中该抗体与CD70特异性结合。

21.权利要求17的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其进一步包括产自或源自人V_H 3-30.3基因或人V_H 3-33基因的重链可变区。

22.权利要求1的抗体，其包含：

(a)包含SEQ ID NO：9的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：13的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO：17的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：21的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO：25的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO：29的轻链可变区CDR3。

23.权利要求1的抗体，其包含：

(a)包含SEQ ID NO：10的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：14的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO：18的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：22的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO：26的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO：30的轻链可变区CDR3。

24.权利要求1的抗体，其包含：

(a)包含SEQ ID NO：11的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：15的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO：19的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：23的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO：27的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO：31的轻链可变区CDR3。

25.权利要求1的抗体，其包含：

(a)包含SEQ ID NO：12的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：16的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO：20的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：24的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO：28的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO：32的轻链可变区CDR3。

26.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括：

(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的轻链可变区；

其中该抗体与CD70特异性结合。

27.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括：

(a)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的轻链可变区；

其中该抗体与CD70特异性结合。

28.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括：

(a)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的轻链可变区；

其中该抗体与CD70特异性结合。

29.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括：

(a)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链可变区；

其中该抗体与CD70特异性结合。

30.一种组合物，其含有权利要求1-29任一项的抗体或其抗原结合部分，和药学上可接受的载体。

31.一种免疫偶联物，其包含与治疗剂连接的权利要求1-29任一项的抗体或其抗原结合部分。

32.一种组合物，其含有权利要求31的免疫偶联物和药学上可接受的载体。

33.权利要求31的免疫偶联物，其中所述治疗剂是细胞毒素。

34.一种组合物，其含有权利要求33的免疫偶联物和药学上可接受的载体。

35.权利要求31的免疫偶联物，其中所述治疗剂是放射性同位素。

36.一种组合物，其含有权利要求35的免疫偶联物和药学上可接受的载体。

37.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1-29任一项的抗体或其抗原结合部分。

38.一种表达载体，其包含权利要求37的核酸分子。

39.一种宿主细胞，其包含权利要求38的表达载体。

40.一种制备抗CD70抗体的方法，包括在权利要求39的宿主细胞中表达该抗体，并且从宿主细胞中分离该抗体。

41.一种治疗或预防以表达CD70的肿瘤细胞肿瘤为特征的疾病的方法，包括给受试者施用有效治疗或预防该疾病的量的权利要求1-29任一项的抗体或其抗原结合部分。

42.权利要求41的方法，其中所述疾病是癌症。

43.权利要求42的方法，其中所述癌症选自：肾细胞癌(RCC)、透明细胞RCC、胶质母细胞瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、多发性骨髓瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、结节性小卵裂细胞淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、伦纳特淋巴瘤、免疫母细胞性淋巴瘤、T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T细胞白血病(T-ALL)、中心母细胞/中心细胞性(cb/cc)滤泡性淋巴瘤、B系弥漫性大细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性淋巴结病(AILD)-样T细胞淋巴瘤、HIV相关体腔淋巴瘤、胚胎性癌、未分化鼻咽癌、施明克瘤、卡斯尔曼病、卡波西肉瘤、多发性骨髓瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症和B细胞淋巴瘤。

44.权利要求42的方法，其中所述癌症是肾细胞癌。

45.权利要求42的方法，其中所述癌症是淋巴瘤。

46.权利要求41的方法，其中所述抗体缺乏岩藻糖残基。

47.一种治疗需要所述治疗的受试者的自身免疫病的方法，包括给该受试者施用治疗有效量的权利要求1-29任一项的抗体或其抗原结合部分，由此减轻自身免疫病的症状。

48.权利要求47的方法，其中所述自身免疫病是狼疮。

49.一种预防具有发生自身免疫病危险的受试者的自身免疫病的方法，包括给该受试者施用有效量的权利要求1的抗体或其抗原结合部分，由此预防或减轻自身免疫病症状的发展。

50.一种治疗需要所述治疗的受试者的炎症的方法，包括给该受试者施用治疗有效量的权利要求1的抗体或其抗原结合部分，由此减轻炎症。

51.权利要求50的方法，其中所述抗体缺乏岩藻糖残基。

52.一种治疗需要所述治疗的受试者的病毒感染的方法，包括给该受试者施用治疗有效量的权利要求1-29任一项的抗体或其抗原结合部分，由此减轻病毒感染的症状。

53.权利要求52的方法，其中所述病毒感染选自以下病毒的感染：人类免疫缺陷病毒(HIV)、肝炎(甲、乙、丙)、疱疹病毒(例如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II和CMV、EB病毒)、腺病毒、流感病毒、虫媒病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、痘苗病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒和虫媒病毒脑炎病毒、和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)。

54.在抑制肿瘤细胞生长的方法中使用的权利要求1-29任一项的抗体或其抗原结合部分。

55.权利要求1-29任一项的抗体或其抗原结合部分在制备用于抑制肿瘤细胞生长的药物中的用途。

56.在减轻自身免疫病症状的方法中使用的权利要求1-29任一项的抗体或其抗原结合部分。

57.权利要求1-29任一项的抗体或其抗原结合部分在制备用于减轻自身免疫病症状的药物中的用途。

58.在减轻病毒感染症状的方法中使用的权利要求1-29任一项的抗体或其抗原结合部分。

59.权利要求1-29任一项的抗体或其抗原结合部分在制备用于减轻病毒感染症状的药物中的用途。

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