JP3279573B2 - 新規の変異型ｃｄ４０ｌ - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 ヒトCD40タンパク質（CD40）は、30,600の分子量を持
つ277アミノ酸からなるペプチド、および疎水性アミノ
酸を多く含む19アミノ酸からなる分泌シグナルペプチド
である（Stamenkovicら、EMBO J.,8:1403,1989）。CD4
0は、膜が二つの形のTNFレセプター（Smithら、Scienc
e,248:1019.1990;およびSchallら、Cell,61:361、199
0）、神経成長因子レセプター（Jhonsonら、Cell,47:54
5.1986）、Ｔ細胞抗原OX40（Mallettら、EMBO J.,9:10
63,1990）、ヒトFas抗原（Itohら、Cell,66:233,1991）
およびマウス４−1BBレセプター（Kwonら、Cell Immun
ol.121:414,1989［Kwonら、Ｉ］およびKwonら、Proc.Na
tl.Acad.Sci..USA,86:1963、1989［Kwonら、II］）を含
むレセプターの族に属する。ヒトの成熟型CD40タンパク
質の分子量（グリコシル化を除く）は、28,300である。
つ277アミノ酸からなるペプチド、および疎水性アミノ
酸を多く含む19アミノ酸からなる分泌シグナルペプチド
である（Stamenkovicら、EMBO J.,8:1403,1989）。CD4
0は、膜が二つの形のTNFレセプター（Smithら、Scienc
e,248:1019.1990;およびSchallら、Cell,61:361、199
0）、神経成長因子レセプター（Jhonsonら、Cell,47:54
5.1986）、Ｔ細胞抗原OX40（Mallettら、EMBO J.,9:10
63,1990）、ヒトFas抗原（Itohら、Cell,66:233,1991）
およびマウス４−1BBレセプター（Kwonら、Cell Immun
ol.121:414,1989［Kwonら、Ｉ］およびKwonら、Proc.Na
tl.Acad.Sci..USA,86:1963、1989［Kwonら、II］）を含
むレセプターの族に属する。ヒトの成熟型CD40タンパク
質の分子量（グリコシル化を除く）は、28,300である。
活性化されたCD4＋ Ｔ細胞は、CD40（CD40L）のため
のリガンドを高レベルで発現している。ヒトCD40L、膜
結合糖タンパク質は、Spriggsら、J.Exp.Med.,176:1543
（1992）およびWO93/082087に記載されているように、
末梢血液Ｔ細胞よりクローン化した。マウスCD40Lのク
ローニングは、Armitageら、Nature,357:80,1992に記載
されている。CD40Lは、共刺激因子が何も存在しなくて
もＢ細胞の増殖を誘導し、また、サイトカイン存在下で
イムノグロブリンの生成を誘導することができる。CD40
Lは、Ｃ末梢に細胞外領域、膜貫通領域およびＮ末端に
細胞内領域を持つ膜ポリペプチドII型である。可溶型の
CD40Lは、CD40Lの細胞外領域またはそのフラグメントを
含む。CD40Lの生物活性は、CD40Lの細胞外領域とCD40と
の結合によって仲介され、Ｂ細胞の増殖および抗体分泌
（IgE分泌を含む）の誘導を含む。
のリガンドを高レベルで発現している。ヒトCD40L、膜
結合糖タンパク質は、Spriggsら、J.Exp.Med.,176:1543
（1992）およびWO93/082087に記載されているように、
末梢血液Ｔ細胞よりクローン化した。マウスCD40Lのク
ローニングは、Armitageら、Nature,357:80,1992に記載
されている。CD40Lは、共刺激因子が何も存在しなくて
もＢ細胞の増殖を誘導し、また、サイトカイン存在下で
イムノグロブリンの生成を誘導することができる。CD40
Lは、Ｃ末梢に細胞外領域、膜貫通領域およびＮ末端に
細胞内領域を持つ膜ポリペプチドII型である。可溶型の
CD40Lは、CD40Lの細胞外領域またはそのフラグメントを
含む。CD40Lの生物活性は、CD40Lの細胞外領域とCD40と
の結合によって仲介され、Ｂ細胞の増殖および抗体分泌
（IgE分泌を含む）の誘導を含む。
本発明以前には、天然型CD40Lの結合アフィニティー
より高いヒトCD40Lとの結合アフィニティーを示したCD4
0用リガンドは、知られていなかった。従って、この技
術分野では、そのようなCD40リガンドの変異型（mutei
n）の同定および特徴付けが必要である。
より高いヒトCD40Lとの結合アフィニティーを示したCD4
0用リガンドは、知られていなかった。従って、この技
術分野では、そのようなCD40リガンドの変異型（mutei
n）の同定および特徴付けが必要である。
発明の概要 新規のサイトカイン（以後“CD40L"と呼ぶ）は、WO93
/08207に記載されたように単離され特徴付けされた。本
発明は、新規のヒトCD40L変異型をコードする単離され
たDNA分子およびその補体を含む。単離されたDNA分子
は、配列番号２（配列中、アミノ酸194のシステインが
トリプトファンで置換されている）に示すアミノ酸配列
を持つポリペプチドをコードするDNA、およびアミノ酸1
94のトリプトファンを含む変異型のフラグメントである
ポリペプチドをコードするDNAからなるグループから選
択される。
/08207に記載されたように単離され特徴付けされた。本
発明は、新規のヒトCD40L変異型をコードする単離され
たDNA分子およびその補体を含む。単離されたDNA分子
は、配列番号２（配列中、アミノ酸194のシステインが
トリプトファンで置換されている）に示すアミノ酸配列
を持つポリペプチドをコードするDNA、およびアミノ酸1
94のトリプトファンを含む変異型のフラグメントである
ポリペプチドをコードするDNAからなるグループから選
択される。
DNAによってコードされるCD40L変異型のフラグメント
は、配列番号２のアミノ酸１から261、35から261、34か
ら225、113から261、113から225、120から261または120
から225のアミノ酸を含むペプチドからなるグループよ
り選択され、配列番号２のアミノ酸194に該当するアミ
ノ酸であるシステインは、トリプトファンで置換されて
いる。厳密条件下で（6xSSC中、63℃で一晩ハイブリダ
イゼーション;3xSSC中、55℃で洗浄）任意の前記のDNA
とハイブリダイズし、かつCD40と結合するペプチドであ
って、配列番号２のアミノ酸194に該当するアミノ酸で
あるシステインがトリプトファンで置き換えられている
ペプチドをコードするDNAも調製され得る。
は、配列番号２のアミノ酸１から261、35から261、34か
ら225、113から261、113から225、120から261または120
から225のアミノ酸を含むペプチドからなるグループよ
り選択され、配列番号２のアミノ酸194に該当するアミ
ノ酸であるシステインは、トリプトファンで置換されて
いる。厳密条件下で（6xSSC中、63℃で一晩ハイブリダ
イゼーション;3xSSC中、55℃で洗浄）任意の前記のDNA
とハイブリダイズし、かつCD40と結合するペプチドであ
って、配列番号２のアミノ酸194に該当するアミノ酸で
あるシステインがトリプトファンで置き換えられている
ペプチドをコードするDNAも調製され得る。
さらに、本発明は、本発明のDNA分子によってコード
される新規のCD40L変異型を提供する。新規の変異型
は、前述した配列番号２のアミノ酸配列においてアミノ
酸194のシステインがトリプトファンで置き換えられて
いる配列を有する点で、ヒトの天然型CD40Lとは異な
る。新規の変異型は、CD40を結合し、アミノ酸194にト
リプトファンを含むCD40Lの細胞外ドメインのフラグメ
ントを含んでいる。好ましくは、フラグメントは、配列
番号２のアミノ酸194に該当するアミノ酸であるシステ
インがトリプトファンで置き換えられている、配列番号
２のアミノ酸１から261、35から261、34から225、113か
ら261、113から225、120から261、または120から225を
含む、最も好ましくはアミノ酸113から261を含むペプチ
ドからなるグループから選択される。
される新規のCD40L変異型を提供する。新規の変異型
は、前述した配列番号２のアミノ酸配列においてアミノ
酸194のシステインがトリプトファンで置き換えられて
いる配列を有する点で、ヒトの天然型CD40Lとは異な
る。新規の変異型は、CD40を結合し、アミノ酸194にト
リプトファンを含むCD40Lの細胞外ドメインのフラグメ
ントを含んでいる。好ましくは、フラグメントは、配列
番号２のアミノ酸194に該当するアミノ酸であるシステ
インがトリプトファンで置き換えられている、配列番号
２のアミノ酸１から261、35から261、34から225、113か
ら261、113から225、120から261、または120から225を
含む、最も好ましくはアミノ酸113から261を含むペプチ
ドからなるグループから選択される。
図面の簡単な説明 図１は、バイオセンサーアッセイで測定した、三量体
のヒトおよびネズミのCD40Lならびに二量体のヒトおよ
びネズミのCD40LとCD40/Fcとの結合について示してい
る。
のヒトおよびネズミのCD40Lならびに二量体のヒトおよ
びネズミのCD40LとCD40/Fcとの結合について示してい
る。
図２は、バイオセンサーアッセイでの三量体のヒトCD
40L（図2A）および単量体のヒトのCD40L（図2B）の２つ
の調製物とCD40/Fcとの結合について示している。
40L（図2A）および単量体のヒトのCD40L（図2B）の２つ
の調製物とCD40/Fcとの結合について示している。
発明の詳細な説明 WO93/08207に記載のように、ネズミおよびヒトCD40の
リガンドとして作用することのできる新規のポリペプチ
ドを、単離し、配列決定した。本発明は、新規のヒトCD
40L変異型およびそれらの補体をコードするDNA分子を提
供する。単離したDNA分子は、配列番号２のアミノ酸194
のシステインがシステイン以外のアミノ酸で置換されて
いる、配列番号２に示したようなアミノ酸配列を持つポ
リペプチドをコードするDNA、およびそのフラグメント
をコードするDNAからなるグループより選択される。好
ましくは、残基194のシステインの代わりに用いられる
アミノ酸は、トリプトファンである。
リガンドとして作用することのできる新規のポリペプチ
ドを、単離し、配列決定した。本発明は、新規のヒトCD
40L変異型およびそれらの補体をコードするDNA分子を提
供する。単離したDNA分子は、配列番号２のアミノ酸194
のシステインがシステイン以外のアミノ酸で置換されて
いる、配列番号２に示したようなアミノ酸配列を持つポ
リペプチドをコードするDNA、およびそのフラグメント
をコードするDNAからなるグループより選択される。好
ましくは、残基194のシステインの代わりに用いられる
アミノ酸は、トリプトファンである。
CD40Lは、CD40のリガンドであり、TNFレセプタースー
パーファミリーの一員のレセプターである。全長のCD40
Lは、そのＣ末端に細胞外領域、膜貫通領域、およびＮ
末端に細胞内領域を持つ、膜結合ポリペプチドである。
CD40Lの可溶形は、細胞外領域またはそのフラグメント
から作ることができる。ヒトCD40Lの細胞外領域は、配
列番号１のアミノ酸47からアミノ酸261にわたる。CD40L
の生物活性は、CD40との結合によって仲介され、Ｂ細胞
の増殖および活性化されたＢ細胞からの免疫グロブリン
分泌の誘導を含む。
パーファミリーの一員のレセプターである。全長のCD40
Lは、そのＣ末端に細胞外領域、膜貫通領域、およびＮ
末端に細胞内領域を持つ、膜結合ポリペプチドである。
CD40Lの可溶形は、細胞外領域またはそのフラグメント
から作ることができる。ヒトCD40Lの細胞外領域は、配
列番号１のアミノ酸47からアミノ酸261にわたる。CD40L
の生物活性は、CD40との結合によって仲介され、Ｂ細胞
の増殖および活性化されたＢ細胞からの免疫グロブリン
分泌の誘導を含む。
本明細書中に記載されている新規のCD40L変異型は、C
D40Lポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の突然
変異によって得られた。本明細書中のCD40L変異型（mut
ein）または類似体（analog）は、天然のCD40Lと実質的
に相同であるが、一つまたは複数の欠失、挿入または置
換のために、天然型配列のCD40Lポリペプチドとは異な
るアミノ酸配列を持っているポリペプチドである。CD40
Lの類似体は、オリゴヌクレオチドの合成および結合に
よって、または部位特異的突然変異誘発技術によって調
製された、DNA構築物から合成することができる。
D40Lポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の突然
変異によって得られた。本明細書中のCD40L変異型（mut
ein）または類似体（analog）は、天然のCD40Lと実質的
に相同であるが、一つまたは複数の欠失、挿入または置
換のために、天然型配列のCD40Lポリペプチドとは異な
るアミノ酸配列を持っているポリペプチドである。CD40
Lの類似体は、オリゴヌクレオチドの合成および結合に
よって、または部位特異的突然変異誘発技術によって調
製された、DNA構築物から合成することができる。
当業者は、アミノ酸194にトリプトファンを有するCD4
0LをコードするDNAに、さらなる変異を施すことができ
ることを、認識するであろう。
0LをコードするDNAに、さらなる変異を施すことができ
ることを、認識するであろう。
一般的には、置換は、保存的に行われねばならない、
即ち、最も好ましい置換アミノ酸は、天然のCD40Lの様
式と実質的に等価な様式でそれらのレセプターを結合す
る本発明のタンパク質の能力に影響を与えないアミノ酸
である。保存的置換の例としては、結合ドメインの外側
のアミノ酸の置換、およびCD40Lの二次構造および／ま
たは三次構造を変化させないアミノ酸の置換が含まれ
る。さらなる例として、Ile、Val、LeuまたはAlaを互い
に置換すると言ったような一つの脂肪族残基をもう一つ
の脂肪族残基に置換すること、またはLysとArg;GluとAs
p;あるいはGluとAsnの間の置換のような一つの極性残基
をもう一つの極性残基に置換することが含まれる。その
他のそのような保守的置換では、例えば、同様の疎水性
性質を持つ領域全体の置換が良く知られている。
即ち、最も好ましい置換アミノ酸は、天然のCD40Lの様
式と実質的に等価な様式でそれらのレセプターを結合す
る本発明のタンパク質の能力に影響を与えないアミノ酸
である。保存的置換の例としては、結合ドメインの外側
のアミノ酸の置換、およびCD40Lの二次構造および／ま
たは三次構造を変化させないアミノ酸の置換が含まれ
る。さらなる例として、Ile、Val、LeuまたはAlaを互い
に置換すると言ったような一つの脂肪族残基をもう一つ
の脂肪族残基に置換すること、またはLysとArg;GluとAs
p;あるいはGluとAsnの間の置換のような一つの極性残基
をもう一つの極性残基に置換することが含まれる。その
他のそのような保守的置換では、例えば、同様の疎水性
性質を持つ領域全体の置換が良く知られている。
同様に、欠失または挿入戦略を採用する場合、生物活
性への欠失または挿入による潜在的効果を考慮しなけれ
ばならない。本発明のタンパク質のサブユニットは、末
端あるいは内部の残基または配列を欠失させて、フラグ
メントを形成することによって構築できる。CD40Lの配
列を他のTNFファミリー構成員の配列および構造と比較
することによって、作り出すことのできる突然変異の型
についての指針もさらに提供される。
性への欠失または挿入による潜在的効果を考慮しなけれ
ばならない。本発明のタンパク質のサブユニットは、末
端あるいは内部の残基または配列を欠失させて、フラグ
メントを形成することによって構築できる。CD40Lの配
列を他のTNFファミリー構成員の配列および構造と比較
することによって、作り出すことのできる突然変異の型
についての指針もさらに提供される。
本発明のCD40L変異型のアミノ酸の一次構造は、CD40L
誘導体を作り出すために、グルコシル基、脂質、リン
酸、アセチル基およびその類似物等のような他の化学的
部分と共有結合または凝集結合を形成することによっ
て、または、アミノ酸配列変異体を作り出すことによっ
て、修飾することができる。CD40Lの共有結合誘導体
は、CD40Lアミノ酸側鎖、またはCD40L変異型若しくはそ
の細胞外ドメインのＮ末端あるいはＣ末端に、特別な官
能基を連結させることによって調製される。
誘導体を作り出すために、グルコシル基、脂質、リン
酸、アセチル基およびその類似物等のような他の化学的
部分と共有結合または凝集結合を形成することによっ
て、または、アミノ酸配列変異体を作り出すことによっ
て、修飾することができる。CD40Lの共有結合誘導体
は、CD40Lアミノ酸側鎖、またはCD40L変異型若しくはそ
の細胞外ドメインのＮ末端あるいはＣ末端に、特別な官
能基を連結させることによって調製される。
本発明の範囲内にあるCD40Lのその他の誘導体には、
Ｎ末端またはＣ末端の融合といったような組換え培地内
での合成によるような、CD40Lあるいはそのフラグメン
トをその他のタンパク質あるいはポリペプチドと共有結
合または凝集させた複合体が含まれる。例えば、複合体
は、翻訳と同時にまたは翻訳後にその合成部位から細胞
膜または細胞壁の内側または外側の部位へ複合体を運搬
することに関する、CD40LポリペプチドのＮ末端領域ま
たはＣ末端領域のシグナルまたはリーダーポリペプチド
を含むことができる（例えば、サッカロミセスのα因子
リーダー）。
Ｎ末端またはＣ末端の融合といったような組換え培地内
での合成によるような、CD40Lあるいはそのフラグメン
トをその他のタンパク質あるいはポリペプチドと共有結
合または凝集させた複合体が含まれる。例えば、複合体
は、翻訳と同時にまたは翻訳後にその合成部位から細胞
膜または細胞壁の内側または外側の部位へ複合体を運搬
することに関する、CD40LポリペプチドのＮ末端領域ま
たはＣ末端領域のシグナルまたはリーダーポリペプチド
を含むことができる（例えば、サッカロミセスのα因子
リーダー）。
CD40Lポリペプチド融合体は、CD40Lの精製および同定
を容易にするために加えたポリペプチド（例えば、ポリ
−His）、または新規の多機能性本体を提供するための
その他のサイトカインとの融合を含む。その他のサイト
カインには、例として、任意のインターロイキン−１か
ら13、TNF（腫瘍壊死因子）、GM−CSF（顆粒球マクロフ
ァージ−コロニー刺激因子）、Ｇ−CSF（顆粒球−コロ
ニー刺激因子）、MGF（肥満細胞成長因子）、EGF（表皮
成長因子）、PDGF（血小板由来成長因子）、NGF（神経
成長因子）、EPO（エリスロポエチン）、γ−IFN（ガン
マ−インターフェロン）、４−1BB−Ｌ（４−1BBリガン
ド）、並びに免疫細胞の成長、分化または機能に影響す
るその他のサイトカインが含まれる。
を容易にするために加えたポリペプチド（例えば、ポリ
−His）、または新規の多機能性本体を提供するための
その他のサイトカインとの融合を含む。その他のサイト
カインには、例として、任意のインターロイキン−１か
ら13、TNF（腫瘍壊死因子）、GM−CSF（顆粒球マクロフ
ァージ−コロニー刺激因子）、Ｇ−CSF（顆粒球−コロ
ニー刺激因子）、MGF（肥満細胞成長因子）、EGF（表皮
成長因子）、PDGF（血小板由来成長因子）、NGF（神経
成長因子）、EPO（エリスロポエチン）、γ−IFN（ガン
マ−インターフェロン）、４−1BB−Ｌ（４−1BBリガン
ド）、並びに免疫細胞の成長、分化または機能に影響す
るその他のサイトカインが含まれる。
CD40Lの生物活性は、例えば、CD40のリガンド結合ド
メインとの結合を競合させること（例えば、競合結合ア
ッセイ）によって定量することができる。いくつかの有
効な結合アッセイをここに開示する。当業者らは、単離
したCD40タンパク質（即ちCD40/Fc）または細胞が発現
するCD40のいずれかを用いて、容易に日常的実験を適用
して結合アッセイを開発することができる。
メインとの結合を競合させること（例えば、競合結合ア
ッセイ）によって定量することができる。いくつかの有
効な結合アッセイをここに開示する。当業者らは、単離
したCD40タンパク質（即ちCD40/Fc）または細胞が発現
するCD40のいずれかを用いて、容易に日常的実験を適用
して結合アッセイを開発することができる。
また、Ｂ細胞増殖アッセイで生物活性を測定すること
によっても、CD40Lをアッセイすることができる。ヒト
Ｂ細胞は、Defranceら、J.Immunol.,139:1135、1987に
記載の方法に従って、負の選択およびパーコール密度沈
降による精製によって、ヒトの扁桃腺から得ることがで
きる。CD40Lに応答する細胞増殖を測定するためには、
バーキットリンパ腫細胞系を用いることができる。バー
キットリンパ腫細胞系の例としては、例えば、Raji（AT
CC CCL 86）、Daudi（ATCC CCL 213）およびNamalw
a（ATCC CRL 1432）が含まれる。
によっても、CD40Lをアッセイすることができる。ヒト
Ｂ細胞は、Defranceら、J.Immunol.,139:1135、1987に
記載の方法に従って、負の選択およびパーコール密度沈
降による精製によって、ヒトの扁桃腺から得ることがで
きる。CD40Lに応答する細胞増殖を測定するためには、
バーキットリンパ腫細胞系を用いることができる。バー
キットリンパ腫細胞系の例としては、例えば、Raji（AT
CC CCL 86）、Daudi（ATCC CCL 213）およびNamalw
a（ATCC CRL 1432）が含まれる。
CD40Lの生物活性を定量するその他のアッセイは、CD4
0Lまたはその誘導体もしくは類似体による活性化に応答
するＢ細胞によって生成される免疫グロブリンを測定す
ることによる。ポリクローナル免疫グロブリンの分泌
は、例えば、5x105B細胞/ml培地と共に、少なくとの７
日間インキュベートすることによって、測定することが
できる。免疫グロブリ（Ig）の生成は、Maliszewski
ら、J.Immunol.,144:3028、1990［Maliszewskiら、Ｉ］
またはMaliszewskiら、Eur.J.Immunol.,20:1735、1990
［Maliszewskiら、II］に記載された方法に従って、ELI
SAアッセイによって測定することができる。
0Lまたはその誘導体もしくは類似体による活性化に応答
するＢ細胞によって生成される免疫グロブリンを測定す
ることによる。ポリクローナル免疫グロブリンの分泌
は、例えば、5x105B細胞/ml培地と共に、少なくとの７
日間インキュベートすることによって、測定することが
できる。免疫グロブリ（Ig）の生成は、Maliszewski
ら、J.Immunol.,144:3028、1990［Maliszewskiら、Ｉ］
またはMaliszewskiら、Eur.J.Immunol.,20:1735、1990
［Maliszewskiら、II］に記載された方法に従って、ELI
SAアッセイによって測定することができる。
CD40Lポリペプチドは、二量体または三量体の様なオ
リゴマーとして存在することもある。オリゴマーは、異
なるCD40Lポリペプチド上のシステイン残基間に形成さ
れたジスルフィド結合によって連結されている。あるい
は、米国特許第5,073,627号（ここに参照として採用さ
れる）に記載されたように、２つの可溶性CD40Lドメイ
ンをリンカー配列で結合することもできる。また、可溶
性CD40L（細胞外ドメイン）および免疫グロブリンのFc
領域（例えば、配列番号４）を含む融合タンパク質を発
現させることによって、CD40Lポリペプチドを作りだ
し、二価のCD40Lを形成することもできる、抗体の重鎖
および軽鎖で作られた融合タンパク質は、CD40L細胞外
領域を４つほど持つCD40Lオリゴマーを形成するであろ
う。三量体のCD40Lは、溶液中で三量体を形成するペプ
チド［例えば、酵母GCN4「ロイシンジッパー」（配列番
号５）の変異型、または肺の界面活性剤であるプロテイ
ンＤ（surfactan protein Ｄ）（SPD）三量体化ドメ
イン（配列番号6;Hoppeら、FEBS Letters,344:191,199
4）］に続いてCD40Lの細胞外ドメインを含む融合タンパ
ク質をコードするDNAを発現させることによって、調製
される。
リゴマーとして存在することもある。オリゴマーは、異
なるCD40Lポリペプチド上のシステイン残基間に形成さ
れたジスルフィド結合によって連結されている。あるい
は、米国特許第5,073,627号（ここに参照として採用さ
れる）に記載されたように、２つの可溶性CD40Lドメイ
ンをリンカー配列で結合することもできる。また、可溶
性CD40L（細胞外ドメイン）および免疫グロブリンのFc
領域（例えば、配列番号４）を含む融合タンパク質を発
現させることによって、CD40Lポリペプチドを作りだ
し、二価のCD40Lを形成することもできる、抗体の重鎖
および軽鎖で作られた融合タンパク質は、CD40L細胞外
領域を４つほど持つCD40Lオリゴマーを形成するであろ
う。三量体のCD40Lは、溶液中で三量体を形成するペプ
チド［例えば、酵母GCN4「ロイシンジッパー」（配列番
号５）の変異型、または肺の界面活性剤であるプロテイ
ンＤ（surfactan protein Ｄ）（SPD）三量体化ドメ
イン（配列番号6;Hoppeら、FEBS Letters,344:191,199
4）］に続いてCD40Lの細胞外ドメインを含む融合タンパ
ク質をコードするDNAを発現させることによって、調製
される。
融合タンパク質は、所望の配列からフラグメントを酵
素で切断および結合する慣用的技術を用いて、調製する
ことからできる。合成オリゴヌクレオチドを用いるPCR
技術は、所望のフラグメントを調製および／または増殖
させるために用いることができる。所望の配列を示すオ
ーバーラップした合成のオリゴヌクレオチドもまた、融
合タンパク質をコードするDNA構築物を調製するために
用いることができる。また、融合タンパク質は、CD40
L、ならびに、リーダー（またはシグナルペプチド）配
列、オリゴマー化領域（例えば、Fc領域、ロイシンジッ
パー部分または適当なジッパー部分）リンカー配列、お
よび融合タンパク質を容易に精製または迅速に検出する
ための手段を提供する免疫原性の高い部分をコードする
配列を含む、２つまたはそれより多くの付加配列を含む
ことができる。
素で切断および結合する慣用的技術を用いて、調製する
ことからできる。合成オリゴヌクレオチドを用いるPCR
技術は、所望のフラグメントを調製および／または増殖
させるために用いることができる。所望の配列を示すオ
ーバーラップした合成のオリゴヌクレオチドもまた、融
合タンパク質をコードするDNA構築物を調製するために
用いることができる。また、融合タンパク質は、CD40
L、ならびに、リーダー（またはシグナルペプチド）配
列、オリゴマー化領域（例えば、Fc領域、ロイシンジッ
パー部分または適当なジッパー部分）リンカー配列、お
よび融合タンパク質を容易に精製または迅速に検出する
ための手段を提供する免疫原性の高い部分をコードする
配列を含む、２つまたはそれより多くの付加配列を含む
ことができる。
シグナルペプチドは、細胞からのタンパク質の分泌を
促進する。典型的なシグナルペプチドは、アミノ酸配列
８のアミノ酸−26から−１である。Flag（登録商標）オ
クタペプチド（Hoppら、Bio/Technology,6:1204,1988）
は、融合タンパク質の生物活性を変化させず、高い免疫
原性を持ち、そして発現した融合タンパク質の迅速な検
出および容易な精製を可能にする、特異的モノクローナ
ル抗体によって可逆的に結合されるエピトープを提供す
る。また、Flag（登録商標）配列は、ウシの粘膜のエン
テロキナーゼによって、Asp−Lys対に続くすぐの残基で
特異的に切断され、このペプチドでキャップされた融合
タンパク質はまた、大腸菌内での細胞内分解にも耐性で
ある。Flag（登録商標）と結合するネズミのモノクロー
ナル抗体は、ATCCに寄託され（寄託番号 HB 9259）;F
lag（登録商標）配列を含む融合タンパク質を抗体を用
いて精製する方法は、米国特許第5,011,912号に記載さ
れており、ここに参照として採用される。
促進する。典型的なシグナルペプチドは、アミノ酸配列
８のアミノ酸−26から−１である。Flag（登録商標）オ
クタペプチド（Hoppら、Bio/Technology,6:1204,1988）
は、融合タンパク質の生物活性を変化させず、高い免疫
原性を持ち、そして発現した融合タンパク質の迅速な検
出および容易な精製を可能にする、特異的モノクローナ
ル抗体によって可逆的に結合されるエピトープを提供す
る。また、Flag（登録商標）配列は、ウシの粘膜のエン
テロキナーゼによって、Asp−Lys対に続くすぐの残基で
特異的に切断され、このペプチドでキャップされた融合
タンパク質はまた、大腸菌内での細胞内分解にも耐性で
ある。Flag（登録商標）と結合するネズミのモノクロー
ナル抗体は、ATCCに寄託され（寄託番号 HB 9259）;F
lag（登録商標）配列を含む融合タンパク質を抗体を用
いて精製する方法は、米国特許第5,011,912号に記載さ
れており、ここに参照として採用される。
適当なFc領域は、プロテインＡあるいはプロテインＧ
と結合することが出来るFc領域と定義されるか、あるい
は、Fc領域を含む融合タンパク質の精製あるいは検出に
用いることのできる抗体によって認識される。望ましい
Fc領域は、ヒトのIgG1またはネズミのIgG1のFc領域を含
む。一つの例として、配列番号４に示すヒトのIgG1 Fc
領域が挙げられる。適当なFc領域のフラグメント、例え
ば、プロテインＡとの結合に応答するアミノ酸の配列を
欠失させ、そうすることによってフラグメントがプロテ
インＧとは結合するがプロテインＡとは結合しないよう
にした、ヒトIgG1のFc領域もまた、用いることができ
る。
と結合することが出来るFc領域と定義されるか、あるい
は、Fc領域を含む融合タンパク質の精製あるいは検出に
用いることのできる抗体によって認識される。望ましい
Fc領域は、ヒトのIgG1またはネズミのIgG1のFc領域を含
む。一つの例として、配列番号４に示すヒトのIgG1 Fc
領域が挙げられる。適当なFc領域のフラグメント、例え
ば、プロテインＡとの結合に応答するアミノ酸の配列を
欠失させ、そうすることによってフラグメントがプロテ
インＧとは結合するがプロテインＡとは結合しないよう
にした、ヒトIgG1のFc領域もまた、用いることができ
る。
CD40Lがその二次構造および三次構造内へ適切に畳込
まれることを確保するために、CD40Lの細胞外領域をオ
リゴマー化部分から充分に離すことによって分離するリ
カー配列もまた用いることができる。適当なリンカー配
列は、（１）可動性を持つ伸びたコンフォメーションを
とり、（２）融合タンパク質の機能性ドメインと相互作
用しうる規定の二次構造をとる傾向を示さず、そして
（３）タンパク質の機能性ドメインとの相互作用を促進
できる最小の疎水性または荷電特性を持つであろう。タ
ンパク質のフレキシブル領域の代表的な表面アミノ酸
は、Gly、AsnおよびSerを含む。実質的には、Gly、Asn
およびSerを含むアミノ酸配列の任意の置換は、リンカ
ー配列の上記基準を満足させると予想される。Thrおよ
びAlaのような、その他の中性に近いアミノ酸もまた、
リンカー配列内に用いることができる。リンカー配列の
長さは、融合タンパク質の生物活性に有意な影響を与え
ることなく、変化させることができる。機能ドメインを
分離し、そして立体緩衝を防ぐために用いることができ
る重要でないＮ末端またはＣ末端アミノ酸を融合タンパ
ク質が持つような配列では、リンカー配列は必要でな
い。
まれることを確保するために、CD40Lの細胞外領域をオ
リゴマー化部分から充分に離すことによって分離するリ
カー配列もまた用いることができる。適当なリンカー配
列は、（１）可動性を持つ伸びたコンフォメーションを
とり、（２）融合タンパク質の機能性ドメインと相互作
用しうる規定の二次構造をとる傾向を示さず、そして
（３）タンパク質の機能性ドメインとの相互作用を促進
できる最小の疎水性または荷電特性を持つであろう。タ
ンパク質のフレキシブル領域の代表的な表面アミノ酸
は、Gly、AsnおよびSerを含む。実質的には、Gly、Asn
およびSerを含むアミノ酸配列の任意の置換は、リンカ
ー配列の上記基準を満足させると予想される。Thrおよ
びAlaのような、その他の中性に近いアミノ酸もまた、
リンカー配列内に用いることができる。リンカー配列の
長さは、融合タンパク質の生物活性に有意な影響を与え
ることなく、変化させることができる。機能ドメインを
分離し、そして立体緩衝を防ぐために用いることができ
る重要でないＮ末端またはＣ末端アミノ酸を融合タンパ
ク質が持つような配列では、リンカー配列は必要でな
い。
アミノ酸残基または配列のさまざまな付加あるいは置
換、または生物活性または結合に必要でない末端あるい
は内部残基あるいは配列の欠失、をコードするDNA構築
物を調製することができる。例えば、酵母の発現系を用
いると、均一の還元された炭水化物類似体の発現を許す
が、細胞外CD40LのＮ−グリコシル化部位を修飾して、
グリコシル化を排除することができる。真核生物のポリ
ペプチド内のグリコシル化部位は、アミノ酸のトリプレ
ット、Asn−Ｘ−Ｙ（式中,XはProを除く任意のアミノ酸
であり、ＹはSerまたはThrである）を特徴とする。この
トリプレットをコードするヌクレオチド配列の適当な修
飾は、Asn側鎖の炭水化物残基の結合を防ぐ置換、付加
または欠失を結果として生ずるであろう。
換、または生物活性または結合に必要でない末端あるい
は内部残基あるいは配列の欠失、をコードするDNA構築
物を調製することができる。例えば、酵母の発現系を用
いると、均一の還元された炭水化物類似体の発現を許す
が、細胞外CD40LのＮ−グリコシル化部位を修飾して、
グリコシル化を排除することができる。真核生物のポリ
ペプチド内のグリコシル化部位は、アミノ酸のトリプレ
ット、Asn−Ｘ−Ｙ（式中,XはProを除く任意のアミノ酸
であり、ＹはSerまたはThrである）を特徴とする。この
トリプレットをコードするヌクレオチド配列の適当な修
飾は、Asn側鎖の炭水化物残基の結合を防ぐ置換、付加
または欠失を結果として生ずるであろう。
突然変異誘発のその他の方法は、KEX2プロテアーゼ活
性が存在する酵母系での発現を強化するために、二塩基
性のアミノ酸残基をコードする配列を修飾することを含
む。CD40Lポリペプチドのサブユニットは、末端あるい
は内部の残基または配列をコードする配列を欠失させる
ことによって、構築することができる。さらに、突然変
異を誘発する部位の選択で、当業者を援助するために、
その他の分析を行うことができる。例えば、WO93/08207
（この開示は、ここに参照として採用される）は、リガ
ンドのアゴニストおよびアンタゴニストを選択する方法
について考察している。
性が存在する酵母系での発現を強化するために、二塩基
性のアミノ酸残基をコードする配列を修飾することを含
む。CD40Lポリペプチドのサブユニットは、末端あるい
は内部の残基または配列をコードする配列を欠失させる
ことによって、構築することができる。さらに、突然変
異を誘発する部位の選択で、当業者を援助するために、
その他の分析を行うことができる。例えば、WO93/08207
（この開示は、ここに参照として採用される）は、リガ
ンドのアゴニストおよびアンタゴニストを選択する方法
について考察している。
ネズミのCD40L cDNAの配列は、直接発現技術によっ
て得られた；ヒトCD40L配列は、ネズミのCD40L cDNAを
プローブとして用いる交差種ハイブリダイゼーション技
術によって、得られた。両方とも、WO93/08207に記載さ
れている。簡単に言えば、ヒトCD40の細胞外領域（レセ
プター；配列番号３）は、Stamenkovicらが公表した配
列を基にしたプライマーを用いて、ポリメラーゼ鎖反応
（PCR）技術によってクローン化された。CD40/Fc融合タ
ンパク質は、CD40の細胞外ドメインをコードするDNAを
ヒトIgG1（配列番号４）のFcドメインをコードするDNA
と融合させることによる、PCR技術を用いて得られた。
精製された可溶性CD40タンパク質は、CD40Lの仲介する
生物活性と拮抗することができた。
て得られた；ヒトCD40L配列は、ネズミのCD40L cDNAを
プローブとして用いる交差種ハイブリダイゼーション技
術によって、得られた。両方とも、WO93/08207に記載さ
れている。簡単に言えば、ヒトCD40の細胞外領域（レセ
プター；配列番号３）は、Stamenkovicらが公表した配
列を基にしたプライマーを用いて、ポリメラーゼ鎖反応
（PCR）技術によってクローン化された。CD40/Fc融合タ
ンパク質は、CD40の細胞外ドメインをコードするDNAを
ヒトIgG1（配列番号４）のFcドメインをコードするDNA
と融合させることによる、PCR技術を用いて得られた。
精製された可溶性CD40タンパク質は、CD40Lの仲介する
生物活性と拮抗することができた。
cDNAライブラリーは、ビオチニル化されたCD40/Fc融
合タンパク質の結合を基にして、FACS（蛍光活性化細胞
選別）によって選別されたEL4細胞系から調製された。
選別されたEL−４細胞によるCD40のリガンドの発現に基
づく蛍光強度が明らかにシフトするまで、細胞を５回選
別した。簡単に言えば、cDNAを合成し、からのpDC406ベ
クター内に挿入し、大腸菌内に形質転換した。形質転換
株をプールし、プールからDNAを単離し、そして、CV1−
EBNA細胞にトランスフェクトして、発現クローニングラ
イブラリーを作成した。CD40Lの一過性発現を可能にす
るために、トランスフェクトされたCV1−EBNA細胞をス
ライド上で培養した。放射能標識したCD40/Fcでスライ
ドをスクリーニングし、そして、光のバックグラウンド
に対するオートーラジオグラフの銀粒子の存在を確認す
ることによって、CD40Lを発現している細胞を同定する
ために試験した。
合タンパク質の結合を基にして、FACS（蛍光活性化細胞
選別）によって選別されたEL4細胞系から調製された。
選別されたEL−４細胞によるCD40のリガンドの発現に基
づく蛍光強度が明らかにシフトするまで、細胞を５回選
別した。簡単に言えば、cDNAを合成し、からのpDC406ベ
クター内に挿入し、大腸菌内に形質転換した。形質転換
株をプールし、プールからDNAを単離し、そして、CV1−
EBNA細胞にトランスフェクトして、発現クローニングラ
イブラリーを作成した。CD40Lの一過性発現を可能にす
るために、トランスフェクトされたCV1−EBNA細胞をス
ライド上で培養した。放射能標識したCD40/Fcでスライ
ドをスクリーニングし、そして、光のバックグラウンド
に対するオートーラジオグラフの銀粒子の存在を確認す
ることによって、CD40Lを発現している細胞を同定する
ために試験した。
ネズミのCD40LのcDNA配列およびそれより推論される
アミノ酸配列を提供するために、標準的技術を用いて、
単一のクローンを単離し、配列決定した。ヒトの相同体
のCD40L cDNAは、交差種ハイブリダイゼーション技術
によって見いだされた。簡単に言えば、ヒト末梢血液リ
ンパ球（PBL）cDNAライブラリーを、活性化された末梢
血液リンパ球より作成した。ネズミのCD40Lのヌクレオ
チド13からヌクレオチド793までのネズミのCD40Lのコー
ド領域に対応して、ネズミのプローブを構築した。交差
種ハイブリダイゼーションの標準的技術を用い、プロー
ブを用いてヒトCD40Lを発現するクローンを同定した。
ヒトCD40Lのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、配列
番号１および２に示す。
アミノ酸配列を提供するために、標準的技術を用いて、
単一のクローンを単離し、配列決定した。ヒトの相同体
のCD40L cDNAは、交差種ハイブリダイゼーション技術
によって見いだされた。簡単に言えば、ヒト末梢血液リ
ンパ球（PBL）cDNAライブラリーを、活性化された末梢
血液リンパ球より作成した。ネズミのCD40Lのヌクレオ
チド13からヌクレオチド793までのネズミのCD40Lのコー
ド領域に対応して、ネズミのプローブを構築した。交差
種ハイブリダイゼーションの標準的技術を用い、プロー
ブを用いてヒトCD40Lを発現するクローンを同定した。
ヒトCD40Lのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、配列
番号１および２に示す。
組換えDNA技術によってCD40Lを発現するための組換え
発現ベクターには、哺乳動物、微生物、ウイルスまたは
昆虫の遺伝子から誘導されたような適当な転写または翻
訳調節ヌクレオチド配列に機能するように（operably）
連結させた、CD40Lポリペプチドをコードする合成また
はcDNA誘導のDNAフラグメントを含むCD40L cDNA配列が
含まれる。調節配列の例としては、遺伝子発現に調節的
役割を持つ配列（例えば、調節プロモーターまたはエン
ハンサー）、所望であれば転写を制御するためのオペレ
ーター配列、mRNAリボソーム結合部位をコードする配
列、および転写および翻訳の開始ならびに終止を制御す
る適当な配列が含まれる。
発現ベクターには、哺乳動物、微生物、ウイルスまたは
昆虫の遺伝子から誘導されたような適当な転写または翻
訳調節ヌクレオチド配列に機能するように（operably）
連結させた、CD40Lポリペプチドをコードする合成また
はcDNA誘導のDNAフラグメントを含むCD40L cDNA配列が
含まれる。調節配列の例としては、遺伝子発現に調節的
役割を持つ配列（例えば、調節プロモーターまたはエン
ハンサー）、所望であれば転写を制御するためのオペレ
ーター配列、mRNAリボソーム結合部位をコードする配
列、および転写および翻訳の開始ならびに終止を制御す
る適当な配列が含まれる。
調節配列がCD40L DNA配列と機能上関係する場合に、
ヌクレオチド配列は機能しうるように（operably）連結
している。例えば、プロモーターヌクレオチド配列がCD
40L DNAの転写を制御するならば、プロモーターヌクレ
オチド配列は機能しうるようにCD40L DNA配列に連結し
ている。さらになお、リボソーム結合部位が翻訳を促進
するためにベクター内に位置するならば、リボソーム結
合部位は機能しうるようにCD40Lポリペプチド配列に連
結しているであろう。さらに、シグナルペプチドをコー
ドする配列を発現ベクター内に取り込むこともできる。
例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のDNA配列
を、機能しうるようにCD40L DNA配列に連結することが
できる。
ヌクレオチド配列は機能しうるように（operably）連結
している。例えば、プロモーターヌクレオチド配列がCD
40L DNAの転写を制御するならば、プロモーターヌクレ
オチド配列は機能しうるようにCD40L DNA配列に連結し
ている。さらになお、リボソーム結合部位が翻訳を促進
するためにベクター内に位置するならば、リボソーム結
合部位は機能しうるようにCD40Lポリペプチド配列に連
結しているであろう。さらに、シグナルペプチドをコー
ドする配列を発現ベクター内に取り込むこともできる。
例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のDNA配列
を、機能しうるようにCD40L DNA配列に連結することが
できる。
CD40Lポリペプチドの発現に適当な宿主細胞には、原
核生物、酵母またはより高度な真核生物細胞が含まれ
る。原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性の生物
体、例えば、大腸菌またはBacilliが含まれる。形質転
換に適当な原核生物宿主細胞には、例えば、大腸菌、枯
草菌、Salmonella typhimurium並びにシュードモナ
ス、ストレプトマイセスおよびサッカロマイセス属のさ
まざまなその他の種が含まれる。より高度な真核生物細
胞には、哺乳動物起源の確立された細胞系が含まれる。
無細胞翻訳系もまた、本明細書中に開示したDNA構築物
から誘導されたRNAを用いてCD40Lポリペプチドを生成す
るために用いることができた。細菌、真菌、酵母および
哺乳動物細胞宿主で用いるために適当なクローニング用
および発現用ベクターは、例えば、Pouwelsら、Cloning
Vector:A Laboratory Manual,Elsevier,New York
（1985）に記載されている。
核生物、酵母またはより高度な真核生物細胞が含まれ
る。原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性の生物
体、例えば、大腸菌またはBacilliが含まれる。形質転
換に適当な原核生物宿主細胞には、例えば、大腸菌、枯
草菌、Salmonella typhimurium並びにシュードモナ
ス、ストレプトマイセスおよびサッカロマイセス属のさ
まざまなその他の種が含まれる。より高度な真核生物細
胞には、哺乳動物起源の確立された細胞系が含まれる。
無細胞翻訳系もまた、本明細書中に開示したDNA構築物
から誘導されたRNAを用いてCD40Lポリペプチドを生成す
るために用いることができた。細菌、真菌、酵母および
哺乳動物細胞宿主で用いるために適当なクローニング用
および発現用ベクターは、例えば、Pouwelsら、Cloning
Vector:A Laboratory Manual,Elsevier,New York
（1985）に記載されている。
組換えCD40L DNA配列を持つ発現ベクターを、適当な
宿主微生物または哺乳動物の細胞系の実質的に均一な培
養物内に感染（transfect）または形質転換（transfor
m）する。形質転換された宿主細胞は、CD40Lポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列で形質転換またはトラ
ンスフェクトした細胞であり、CD40Lポリペプチドを発
現する。発現したCD40Lポリペプチドは、宿主細胞およ
び宿主細胞内に挿入された遺伝子構築物の性質に依存し
て、宿主細胞内に位置する、および／または培養液上澄
み液体内に分泌されるであろう。
宿主微生物または哺乳動物の細胞系の実質的に均一な培
養物内に感染（transfect）または形質転換（transfor
m）する。形質転換された宿主細胞は、CD40Lポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列で形質転換またはトラ
ンスフェクトした細胞であり、CD40Lポリペプチドを発
現する。発現したCD40Lポリペプチドは、宿主細胞およ
び宿主細胞内に挿入された遺伝子構築物の性質に依存し
て、宿主細胞内に位置する、および／または培養液上澄
み液体内に分泌されるであろう。
原核生物の宿主細胞内にトランスフェクトされた発現
ベクターは、一般的には、一つまたはそれより多くの選
択可能な表現型マーカーを含んでいる。選択可能な表現
型マーカーは、例えば、抗体耐性を授与するまたは栄養
素要求性を供給するタンパク質をコードする遺伝子、お
よび宿主内での増幅を確実にするように宿主によって認
識される複製開始点である。原核生物宿主細胞のその他
の有効な発現ベクターには、商品として入手可能なプラ
スミドから誘導された細菌起源の選択可能マーカーが含
まれる。この選択可能マーカーは、クローニングベクタ
ーpBR322（ATCC 37017）の遺伝要素を含むことができ
る。pBR322は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐
性に関する遺伝子を含み、それ故、形質転換された細胞
を同定するための単純な手段を提供する。pBR322の「骨
格（backbone）」部分を、適当なプロモーターおよびCD
40L DNA配列と結合する。その他の商品として入手可能
なベクターには、例えば、pKK223−３（Pharmacia Fin
e Chemicals,Uppsala,Sweden）およびpGEM1（Promega
Biotec,Madison,WI,USA）が含まれる。
ベクターは、一般的には、一つまたはそれより多くの選
択可能な表現型マーカーを含んでいる。選択可能な表現
型マーカーは、例えば、抗体耐性を授与するまたは栄養
素要求性を供給するタンパク質をコードする遺伝子、お
よび宿主内での増幅を確実にするように宿主によって認
識される複製開始点である。原核生物宿主細胞のその他
の有効な発現ベクターには、商品として入手可能なプラ
スミドから誘導された細菌起源の選択可能マーカーが含
まれる。この選択可能マーカーは、クローニングベクタ
ーpBR322（ATCC 37017）の遺伝要素を含むことができ
る。pBR322は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐
性に関する遺伝子を含み、それ故、形質転換された細胞
を同定するための単純な手段を提供する。pBR322の「骨
格（backbone）」部分を、適当なプロモーターおよびCD
40L DNA配列と結合する。その他の商品として入手可能
なベクターには、例えば、pKK223−３（Pharmacia Fin
e Chemicals,Uppsala,Sweden）およびpGEM1（Promega
Biotec,Madison,WI,USA）が含まれる。
プロモーター配列は、組換え原核生物宿主細胞発現ベ
クターに共通して用いられている。共通プロモーター配
列には、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクト
ースプロモーター系（Changら、Nature,275:615,1978;
およびGoeddelら、Nature,281:544、1979）、トリプト
ファン（trp）プロモーター系（Goeddelら、Nucl.Acids
Res.,8:4057,1980;およびEP−Ａ−36776）、およびta
cプロモーター（Maniatis、Molecular Cloning:A Lab
oratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,4
12,1982）が含まれる。特に有用な原核生物宿主細胞発
現系には、ファージλ PLプロモーターおよびcI857ts
不耐熱性レプレッサー配列が用いられている。American
Type Culture Collectionから入手可能な、λ PL
プロモーターの誘導体を組み込むプラスミドベクターに
は、プラスミドpHUB2［大腸菌株JMB9（ATCC 37092）内
に常在］およびpPLc28［大腸菌RR1（ATCC53082）内に常
在］が含まれる。
クターに共通して用いられている。共通プロモーター配
列には、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクト
ースプロモーター系（Changら、Nature,275:615,1978;
およびGoeddelら、Nature,281:544、1979）、トリプト
ファン（trp）プロモーター系（Goeddelら、Nucl.Acids
Res.,8:4057,1980;およびEP−Ａ−36776）、およびta
cプロモーター（Maniatis、Molecular Cloning:A Lab
oratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,4
12,1982）が含まれる。特に有用な原核生物宿主細胞発
現系には、ファージλ PLプロモーターおよびcI857ts
不耐熱性レプレッサー配列が用いられている。American
Type Culture Collectionから入手可能な、λ PL
プロモーターの誘導体を組み込むプラスミドベクターに
は、プラスミドpHUB2［大腸菌株JMB9（ATCC 37092）内
に常在］およびpPLc28［大腸菌RR1（ATCC53082）内に常
在］が含まれる。
CD40Lは、酵母宿主内で望ましくはSaccharomyces属
（例えば、S.cerevisiae）からの、酵母宿主細胞内で発
現させることができる。PichiaまたはKluyveromycesの
ようなその他の酵母の属もまた、用いることができる。
酵母ベクターは、時として、２μ酵母プラスミドからの
複製開始配列、自己複製配列（ARS）、プロモーター領
域、ポリアデニル化配列、および転写終止配列を含んで
いるであろう。望ましくは、酵母ベクターは、複製開始
配列および選択可能マーカーを含む。適当な酵母ベクタ
ーのプロモーター配列には、メタロチオネイン、３−ホ
スホグリセレートキナーゼ（Hitzemanら、J.Biol.Che
m.,255:2073、1980）、あるいはその他の解糖系の酵素
（Hessら、J.Adv.Enzyme Reg.,7:149、1968;およびHol
landら、Biochem.,17:4900、1978）、例えばエノラー
ゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲ
ナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラー
ゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフ
ェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムター
ゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソ
メラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコ
キナーゼ等が含まれる。酵母発現に用いられるその他の
適当なベクターおよびプロモーターは、さらに、Hitzem
an、EPA−73,657に記載されている。
（例えば、S.cerevisiae）からの、酵母宿主細胞内で発
現させることができる。PichiaまたはKluyveromycesの
ようなその他の酵母の属もまた、用いることができる。
酵母ベクターは、時として、２μ酵母プラスミドからの
複製開始配列、自己複製配列（ARS）、プロモーター領
域、ポリアデニル化配列、および転写終止配列を含んで
いるであろう。望ましくは、酵母ベクターは、複製開始
配列および選択可能マーカーを含む。適当な酵母ベクタ
ーのプロモーター配列には、メタロチオネイン、３−ホ
スホグリセレートキナーゼ（Hitzemanら、J.Biol.Che
m.,255:2073、1980）、あるいはその他の解糖系の酵素
（Hessら、J.Adv.Enzyme Reg.,7:149、1968;およびHol
landら、Biochem.,17:4900、1978）、例えばエノラー
ゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲ
ナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラー
ゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフ
ェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムター
ゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソ
メラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコ
キナーゼ等が含まれる。酵母発現に用いられるその他の
適当なベクターおよびプロモーターは、さらに、Hitzem
an、EPA−73,657に記載されている。
また、哺乳動物または昆虫の宿主細胞培養系を、組換
えCD40Lポリペプチドを発現させるために用いることも
できる。適当な哺乳動物宿主細胞系の例としては、サル
の腎臓細胞のCOS−７系（ATCC CRL1651）（Gluzman
ら、Cell.23:175.1981）、Ｌ細胞、C127細胞、3T3細胞
（ATCC CCL163）、チャイニーズハムスター卵巣（CH
O）細胞、HeLa細胞およびBHK（ATCC CRL10）細胞系が
含まれる。適当な哺乳動物発現ベクターには、構造遺伝
子に連結された、複製開始点、プロモーター配列、エン
ハンサーの等の非転写エレメント；リボソーム結合部
位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアク
セプター部位ならびに転写終止配列等の5'または3'近接
非転写配列；が含まれる。
えCD40Lポリペプチドを発現させるために用いることも
できる。適当な哺乳動物宿主細胞系の例としては、サル
の腎臓細胞のCOS−７系（ATCC CRL1651）（Gluzman
ら、Cell.23:175.1981）、Ｌ細胞、C127細胞、3T3細胞
（ATCC CCL163）、チャイニーズハムスター卵巣（CH
O）細胞、HeLa細胞およびBHK（ATCC CRL10）細胞系が
含まれる。適当な哺乳動物発現ベクターには、構造遺伝
子に連結された、複製開始点、プロモーター配列、エン
ハンサーの等の非転写エレメント；リボソーム結合部
位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアク
セプター部位ならびに転写終止配列等の5'または3'近接
非転写配列；が含まれる。
哺乳動物の宿主細胞発現ベクターの転写および翻訳制
御配列は、ウイルスゲノムから切り出すことができる。
例えば、一般に用いられる哺乳動物細胞プロモーター配
列およびエンハンサー配列は、ポリオーマウイルス、ア
デノウイルス２、シミアンウイルス40（SV40）およびヒ
トのサイトメガロウイルスから誘導される。SV40のウイ
ルスゲノムに由来するDNA配列、例えば、SV40開始点、
初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライ
ス、およびポリアデニル化部位を用いて、哺乳動物宿主
細胞内で構造遺伝子配列の発現に必要とされるその他の
遺伝エレメントを提供することができる。ウイルスの初
期および後期プロモーターは、両方とも、ウイルスの複
製開始点も含むであろうフラグメントとしてウイルスゲ
ノムから容易に得られるので、特に有用である（Fiers
ら、Nature,273:113、1978）。SV40のウイルス複製開始
部位内に位置するHind III部位からBgl I部位にわたる
約250bpの配列を含む限り、より小さいまたはより大き
いSV40フラグメントもまた用いることができる。
御配列は、ウイルスゲノムから切り出すことができる。
例えば、一般に用いられる哺乳動物細胞プロモーター配
列およびエンハンサー配列は、ポリオーマウイルス、ア
デノウイルス２、シミアンウイルス40（SV40）およびヒ
トのサイトメガロウイルスから誘導される。SV40のウイ
ルスゲノムに由来するDNA配列、例えば、SV40開始点、
初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライ
ス、およびポリアデニル化部位を用いて、哺乳動物宿主
細胞内で構造遺伝子配列の発現に必要とされるその他の
遺伝エレメントを提供することができる。ウイルスの初
期および後期プロモーターは、両方とも、ウイルスの複
製開始点も含むであろうフラグメントとしてウイルスゲ
ノムから容易に得られるので、特に有用である（Fiers
ら、Nature,273:113、1978）。SV40のウイルス複製開始
部位内に位置するHind III部位からBgl I部位にわたる
約250bpの配列を含む限り、より小さいまたはより大き
いSV40フラグメントもまた用いることができる。
模範的な哺乳動物の発現ベクターは、OkayamaおよびB
erg（Mol.Cell Biol.,3:280、1983）によって開示され
た方法に従って、構築することができる。Cosmanら、Na
ture,312:768,1984に記載された、有用な高発現ベクタ
ーであるPMLSV N1/N4は、ATCC39890として寄託されて
いる。さらなる有用な哺乳動物発現ベクターは、EP−Ａ
−0367556、および米国特許出願番号07/701,415、1991
年５月16日出願、ここに参照として採用される、に記載
されている。CD40Lのような、II型タンパク質の細胞外
領域を発現させるためには、米国特許第4,965,195号に
記載されたインターロイキン−７（IL−７）のシグナル
配列、または米国特許出願06/626,667、1984年７月２日
出願、に記載のインターロイキン−２レセプターのシグ
ナル配列のような、異種のシグナル配列を加えねばなら
ない。
erg（Mol.Cell Biol.,3:280、1983）によって開示され
た方法に従って、構築することができる。Cosmanら、Na
ture,312:768,1984に記載された、有用な高発現ベクタ
ーであるPMLSV N1/N4は、ATCC39890として寄託されて
いる。さらなる有用な哺乳動物発現ベクターは、EP−Ａ
−0367556、および米国特許出願番号07/701,415、1991
年５月16日出願、ここに参照として採用される、に記載
されている。CD40Lのような、II型タンパク質の細胞外
領域を発現させるためには、米国特許第4,965,195号に
記載されたインターロイキン−７（IL−７）のシグナル
配列、または米国特許出願06/626,667、1984年７月２日
出願、に記載のインターロイキン−２レセプターのシグ
ナル配列のような、異種のシグナル配列を加えねばなら
ない。
組換えCD40Lポリペプチドの精製 CD40Lポリペプチドは、CD40Lポリペプチドを発現する
ために必要な培養条下で形質転換された宿主細胞を培養
することによって、調製することができる。次に、その
結果得られた発現したポリペプチドを、培養液または細
胞抽出物より精製することが出来る。所望であれば、CD
40Lポリペプチドを、商品として入手可能なタンパク質
濃縮フィルター、例えば、AmiconまたはMillipore Pel
licon限外ろ過ユニットを用いて、濃縮することができ
る。濃縮段階の後、濃縮物を、ゲルろ過媒質のような精
製用マトリックスに負荷することができる。あるいは、
陰イオン交換樹脂、例えば、遊離のジエチルアミノエチ
ル（DEAE）基を持つマトリックスまたは基質、を用いる
ことができる。マトリックスは、アクリルアミド、アガ
ロース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質の
精製に共通して用いられるその他の型であることができ
る。あるいは、陽イオン交換段階を用いることもでき
る。適当な陽イオン交換体には、スルホプロピルまたは
カルボキシメチル基を含むさまざまな不溶性マトリック
スが含まれる。スルホプロピル基が好ましい。
ために必要な培養条下で形質転換された宿主細胞を培養
することによって、調製することができる。次に、その
結果得られた発現したポリペプチドを、培養液または細
胞抽出物より精製することが出来る。所望であれば、CD
40Lポリペプチドを、商品として入手可能なタンパク質
濃縮フィルター、例えば、AmiconまたはMillipore Pel
licon限外ろ過ユニットを用いて、濃縮することができ
る。濃縮段階の後、濃縮物を、ゲルろ過媒質のような精
製用マトリックスに負荷することができる。あるいは、
陰イオン交換樹脂、例えば、遊離のジエチルアミノエチ
ル（DEAE）基を持つマトリックスまたは基質、を用いる
ことができる。マトリックスは、アクリルアミド、アガ
ロース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質の
精製に共通して用いられるその他の型であることができ
る。あるいは、陽イオン交換段階を用いることもでき
る。適当な陽イオン交換体には、スルホプロピルまたは
カルボキシメチル基を含むさまざまな不溶性マトリック
スが含まれる。スルホプロピル基が好ましい。
最終的に、さらにCD40Lを精製するために、疎水性RP
−HPLC媒体（例えば、遊離のメチルあるいはその他の脂
肪族の基を持つシリカゲル）を用いる一段階またはそれ
より多段階の逆相高速液体クロマトグラフィー（RP−HP
LC）を用いることができる。前述の精製段階のいくつか
またはすべてをさまざまに組み合わせて、実質的に均一
な組換えタンパク質を提供するために用いることもでき
る。
−HPLC媒体（例えば、遊離のメチルあるいはその他の脂
肪族の基を持つシリカゲル）を用いる一段階またはそれ
より多段階の逆相高速液体クロマトグラフィー（RP−HP
LC）を用いることができる。前述の精製段階のいくつか
またはすべてをさまざまに組み合わせて、実質的に均一
な組換えタンパク質を提供するために用いることもでき
る。
発現したCD40Lポリペプチドをアフィニティー精製す
るために、CD40リガンド結合ドメインを含むアフィニテ
ィーカラムを用いることもまた、可能である。CD40Lポ
リペプチドは、高塩の溶出バッファーでアフィニティー
カラムから取り出し、次に、用いられるより低塩のバッ
ファーで透析することができる。
るために、CD40リガンド結合ドメインを含むアフィニテ
ィーカラムを用いることもまた、可能である。CD40Lポ
リペプチドは、高塩の溶出バッファーでアフィニティー
カラムから取り出し、次に、用いられるより低塩のバッ
ファーで透析することができる。
細菌培養で生成した組換えタンパク質は、通常、最初
に宿主細胞の崩壊、遠心分離、不溶性ポリペプチドであ
れば細胞ペレットからの、または、可溶性ポリペプチド
であれば上澄み液からの抽出、さらに、一段階またはそ
れより多段階の濃縮、塩析、イオン交換、アフィニティ
ー精製または限外ろ過クロマトグラフィーによって、単
離される。最終的には、RP−HPLCを最終精製段階に用い
ることができる。微生物細胞は、凍結融解循環、音波処
理、機械的崩壊または細胞溶解剤の使用を含む、任意の
慣用的方法に従って崩壊させることができる。
に宿主細胞の崩壊、遠心分離、不溶性ポリペプチドであ
れば細胞ペレットからの、または、可溶性ポリペプチド
であれば上澄み液からの抽出、さらに、一段階またはそ
れより多段階の濃縮、塩析、イオン交換、アフィニティ
ー精製または限外ろ過クロマトグラフィーによって、単
離される。最終的には、RP−HPLCを最終精製段階に用い
ることができる。微生物細胞は、凍結融解循環、音波処
理、機械的崩壊または細胞溶解剤の使用を含む、任意の
慣用的方法に従って崩壊させることができる。
形質転換した酵母の宿主細胞は、望ましくは、分泌ポ
リペプチドとしてCD40Lを発現させるために用いられ
る。このことは精製を簡易化にする。酵母宿主細胞発酵
から分泌された組換えポリペプチドは、Urdalら（J.Chr
omatog.,296:171,1984）によって開示された方法に類似
した方法に従って、精製することができる。Urdalら
は、調製用HPLCカラム上でヒトの組換えIL−２を精製す
るために順々に行う２段階の逆相HPLCについて記載して
いる。
リペプチドとしてCD40Lを発現させるために用いられ
る。このことは精製を簡易化にする。酵母宿主細胞発酵
から分泌された組換えポリペプチドは、Urdalら（J.Chr
omatog.,296:171,1984）によって開示された方法に類似
した方法に従って、精製することができる。Urdalら
は、調製用HPLCカラム上でヒトの組換えIL−２を精製す
るために順々に行う２段階の逆相HPLCについて記載して
いる。
CD40L組成物の投与 本発明は、適当な希釈剤またはキャリヤー中の有効量
のCD40L変異型を含む治療組成物、および組成物を用い
て哺乳動物を治療する方法を提供する。治療的使用で
は、精製したCD40L変異型を、徴候に適当な方式で治療
するために、患者、望ましくはヒトに投与する。そのた
めに、例えば、所望の治療効果を達成するように投与さ
れる（例えば、アミノ酸194にトリプトファンを含む、
可溶性CD40L変異型の形の）CD40L変異型医薬組成物を、
ボーラス注射、連続注入、移植物からの持続性遊離、ま
たはその他の適当な技術によって、与えることができ
る。
のCD40L変異型を含む治療組成物、および組成物を用い
て哺乳動物を治療する方法を提供する。治療的使用で
は、精製したCD40L変異型を、徴候に適当な方式で治療
するために、患者、望ましくはヒトに投与する。そのた
めに、例えば、所望の治療効果を達成するように投与さ
れる（例えば、アミノ酸194にトリプトファンを含む、
可溶性CD40L変異型の形の）CD40L変異型医薬組成物を、
ボーラス注射、連続注入、移植物からの持続性遊離、ま
たはその他の適当な技術によって、与えることができ
る。
典型的には、CD40L変異型治療薬剤は、精製したCD40L
変異型を生理学的に受容可能なキャリヤー、補助剤また
は希釈剤と共に含む医薬組成物の形で投与されるであろ
う。そのようなキャリヤーは、用いられる投与量および
濃度では患者に毒性を示さないであろう。通常、そのよ
うな組成物の調製は、バッファー、アスコルビン酸のよ
うな抗酸化剤、低分子量（約10残基より小さい）ポリペ
プチド、タンパク質、アミノ酸、グルコース、スクロー
スまたはデキストランを含む炭水化物、EDTAのようなキ
レート剤、グルチオンならびにその他の安定化剤および
補助剤とCD40L変異型を合わせることを伴う。中性緩衝
化食塩水または同一種の血清アルブミンと混合した食塩
水は、典型的な適切な希釈剤である。
変異型を生理学的に受容可能なキャリヤー、補助剤また
は希釈剤と共に含む医薬組成物の形で投与されるであろ
う。そのようなキャリヤーは、用いられる投与量および
濃度では患者に毒性を示さないであろう。通常、そのよ
うな組成物の調製は、バッファー、アスコルビン酸のよ
うな抗酸化剤、低分子量（約10残基より小さい）ポリペ
プチド、タンパク質、アミノ酸、グルコース、スクロー
スまたはデキストランを含む炭水化物、EDTAのようなキ
レート剤、グルチオンならびにその他の安定化剤および
補助剤とCD40L変異型を合わせることを伴う。中性緩衝
化食塩水または同一種の血清アルブミンと混合した食塩
水は、典型的な適切な希釈剤である。
以下の実施例は、特定の実施態様を説明するものであ
って、本発明の範囲を制限するものではない。ここに引
用したすべての文献の関連した開示は、特別に参照とし
て採用される。
って、本発明の範囲を制限するものではない。ここに引
用したすべての文献の関連した開示は、特別に参照とし
て採用される。
実施例１ この実施例は、２種類の固相結合アッセイ：第一のア
ッセイ（ａ）は、CD40を結合する三量体のCD40Lの能力
を評価するために用いることができ、そして、第二のア
ッセイ（ｂ）は、CD40Lの存在を検出するために用いる
ことができる：について説明している。
ッセイ（ａ）は、CD40を結合する三量体のCD40Lの能力
を評価するために用いることができ、そして、第二のア
ッセイ（ｂ）は、CD40Lの存在を検出するために用いる
ことができる：について説明している。
（ａ）定量的CD40L ELISA CD40/Fcを、WO93/08207に記載の方法に従って、調製
し精製し、そして、これを用いて96穴のプレート（Corn
ing Easy Wash ELISA プレート、Corning,NY,USA）
をコートする。プレートを、PBS中の2.5μg/穴のCD40/F
cで、一晩４℃でコートし、PBS中の１％脱脂粉乳で、室
温で１時間ブロックする。試験されるサンプルを、PBS
中の10％のヤギ正常血清で希釈し、そして穴あたり、50
μｌを加える。未知のサンプルの滴定を二重に走行さ
せ、そして、CD40Lの対照標準の滴定を走行させて標準
曲線を作成する。プレートをサンプルと共にインキュベ
ートし、45分間室温に制御し、そして、PBSで４回洗浄
した。第二段階試薬、ウサギ抗オリゴマー化ジッパーを
加え（50μl/穴、濃度約2.5μg/ml）、プレートを室温
で45分間インキュベートする。再度、プレートを前述の
方法に従って洗浄し、そして、西洋わさびのペルオキシ
ダーゼ（Tago,Burlingame,CA,USA）と結合させたヤギの
Ｆ（ab'）２ 抗−ウサギIgGを加える。プレートを45分
間、室温でインキュベートし、前述のように洗浄し、そ
して、発色原であるテトラメチルベンジデンを加えて
（TMB;100μl/穴）、15分間室温におくことによって、C
D40Lの存在を検出する。100μl/穴の2N−H2SO4を加える
ことによって、発色原の反応を停止し、穴のOD450−OD
562を測定した。未知サンプルで得られたOD値を標準曲
線より得られた値と比較することによって、三量体のCD
40Lの量を定量することが出来る。値は、mlあたりの結
合ユニット数として表される。結合ユニットは、標準と
してリガンドの精製Fc融合タンパク質を用いて、概算で
ざっと1ngのタンパク質である。この方法で、さまざま
な異なるバッチのCD40L三量体の濃度および特異的活性
を測定した。
し精製し、そして、これを用いて96穴のプレート（Corn
ing Easy Wash ELISA プレート、Corning,NY,USA）
をコートする。プレートを、PBS中の2.5μg/穴のCD40/F
cで、一晩４℃でコートし、PBS中の１％脱脂粉乳で、室
温で１時間ブロックする。試験されるサンプルを、PBS
中の10％のヤギ正常血清で希釈し、そして穴あたり、50
μｌを加える。未知のサンプルの滴定を二重に走行さ
せ、そして、CD40Lの対照標準の滴定を走行させて標準
曲線を作成する。プレートをサンプルと共にインキュベ
ートし、45分間室温に制御し、そして、PBSで４回洗浄
した。第二段階試薬、ウサギ抗オリゴマー化ジッパーを
加え（50μl/穴、濃度約2.5μg/ml）、プレートを室温
で45分間インキュベートする。再度、プレートを前述の
方法に従って洗浄し、そして、西洋わさびのペルオキシ
ダーゼ（Tago,Burlingame,CA,USA）と結合させたヤギの
Ｆ（ab'）２ 抗−ウサギIgGを加える。プレートを45分
間、室温でインキュベートし、前述のように洗浄し、そ
して、発色原であるテトラメチルベンジデンを加えて
（TMB;100μl/穴）、15分間室温におくことによって、C
D40Lの存在を検出する。100μl/穴の2N−H2SO4を加える
ことによって、発色原の反応を停止し、穴のOD450−OD
562を測定した。未知サンプルで得られたOD値を標準曲
線より得られた値と比較することによって、三量体のCD
40Lの量を定量することが出来る。値は、mlあたりの結
合ユニット数として表される。結合ユニットは、標準と
してリガンドの精製Fc融合タンパク質を用いて、概算で
ざっと1ngのタンパク質である。この方法で、さまざま
な異なるバッチのCD40L三量体の濃度および特異的活性
を測定した。
（ｂ）定性的ドットブロット CD40L三量体（１μｌの粗上清液またはカラム画分）
を、乾燥BA85/21ニトロセルロース膜（Schleicherおよ
びSchuell、Keene、NH）に吸収させ、そして乾燥させ
る。膜は、組織培養皿内、１％ w/v BSAを含むトリス
（0.05M）緩衝化食塩水（0.15M）pH7.5内で１時間イン
キュベートし、非特異的結合部位をブロックする。この
時間の終わりに、膜をPBS中で３回洗浄し、そしてウサ
ギの抗−オリゴマー化ジッパー抗体を、１％BSAを含むP
BS中のおおよそ10μg/mlの濃度で加え、次いで、膜を室
温で１時間インキュベートする。再度、膜を上記の方法
に従って洗浄し、西洋わさびのペルオキシダーゼ（HR
P）で標識した抗体（ヤギの抗ウサギIg等;Sourthern B
iotech,Birmingham,A Ｌ）を１％BSAを含むPBS中でお
およそ1:1000に希釈して、加える。室温で１時間インキ
ュベートした後、膜を洗浄し、発色原（即ち、４−クロ
ロナフトール試薬,KirkegardおよびPerry、Gaithersbur
g,MD）を加える。室温で10分間発色させ、そして膜を水
でリンスすることによって、反応を止める。膜を洗浄
し、濃い藍色の存在を分析することによって、CD40Lの
存在を決定する。細胞培地上澄み液体中および精製カラ
ム画分中のCD40L三量体の存在または非存在を決定する
ために、このアッセイが用いられた。さらに、アッセイ
は、未知のサンプルの色の強度を、既知濃度の対照の強
度と比較することによって、CD40L三量体の相対量を定
量する半定量的方法を提供する。
を、乾燥BA85/21ニトロセルロース膜（Schleicherおよ
びSchuell、Keene、NH）に吸収させ、そして乾燥させ
る。膜は、組織培養皿内、１％ w/v BSAを含むトリス
（0.05M）緩衝化食塩水（0.15M）pH7.5内で１時間イン
キュベートし、非特異的結合部位をブロックする。この
時間の終わりに、膜をPBS中で３回洗浄し、そしてウサ
ギの抗−オリゴマー化ジッパー抗体を、１％BSAを含むP
BS中のおおよそ10μg/mlの濃度で加え、次いで、膜を室
温で１時間インキュベートする。再度、膜を上記の方法
に従って洗浄し、西洋わさびのペルオキシダーゼ（HR
P）で標識した抗体（ヤギの抗ウサギIg等;Sourthern B
iotech,Birmingham,A Ｌ）を１％BSAを含むPBS中でお
およそ1:1000に希釈して、加える。室温で１時間インキ
ュベートした後、膜を洗浄し、発色原（即ち、４−クロ
ロナフトール試薬,KirkegardおよびPerry、Gaithersbur
g,MD）を加える。室温で10分間発色させ、そして膜を水
でリンスすることによって、反応を止める。膜を洗浄
し、濃い藍色の存在を分析することによって、CD40Lの
存在を決定する。細胞培地上澄み液体中および精製カラ
ム画分中のCD40L三量体の存在または非存在を決定する
ために、このアッセイが用いられた。さらに、アッセイ
は、未知のサンプルの色の強度を、既知濃度の対照の強
度と比較することによって、CD40L三量体の相対量を定
量する半定量的方法を提供する。
実施例２ この実施例は、チャニイーズハムスターの卵巣（CH
O）細胞中にCD40L三量体を発現させるためのヒトCD40LD
NA構築物の構築について記載している。CD40L三量体
は、リーダー配列、およびオリゴマー化ジッパーと呼ば
れる33のアミノ酸配列（配列番号５）、次いでアミノ酸
51からアミノ酸261（配列番号１）までのヒトCD40Lの細
胞外領域を含む。構築物は、ヒトCD40Lを含むプラスミ
ドから適当なDNAを切断し、発現ベクターpCAVDHFR内にD
NAを連結させることによって調製した。得られた構築物
を、CAV/DHFR−CD40LTと名付けた。pCAVDHFRは、サイト
メガロウイルス、SV40、およびアデノウイルス２から誘
導された調節配列を、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（dihy
drofolate reductase）（DHFR）と共に含み、宿主細胞
染色体内への所望の遺伝子のランダムな取り込みを許
す。DHFRの発現は、DHFR-宿主細胞が、グリシン、ヒポ
キサンチンおよびチミジン（GHT）を含まない培地中で
増殖することを可能にする。また、CHO中でネズミCD40L
三量体が発現するように、同様の構築物を作成した。リ
ーダーおよびオリゴマー化ジッパー配列に加えて、ネズ
ミの構築物は、三量体化ドメイン（「ロイシンジッパ
ー」またはオリゴマー化ジッパー）とネズミのCD40Lの
細胞外領域との間に、Flag（登録商標）と呼ばれるオク
タペプチドをコードする配列を含んでいた。ヒトCD40L
をコードするDNAのヌクレオチドおよびアミノ酸の配列
を、それぞれ、配列番号７および８に示す。さらなる構
築物も、標準法を用いて調製することができる。例え
ば、米国特許第4,656,134号に記載されているような二
重のプロモーターを採用するベクター、または、米国特
許第4,937,190号あるいはKaufmanら、Nucl.Acid Res.,
19:4485,1991に記載されているようなエンハンサー配列
を用いるベクターもまた、CHO細胞内でCD40Lを発現する
構築物を調製するために有用である。
O）細胞中にCD40L三量体を発現させるためのヒトCD40LD
NA構築物の構築について記載している。CD40L三量体
は、リーダー配列、およびオリゴマー化ジッパーと呼ば
れる33のアミノ酸配列（配列番号５）、次いでアミノ酸
51からアミノ酸261（配列番号１）までのヒトCD40Lの細
胞外領域を含む。構築物は、ヒトCD40Lを含むプラスミ
ドから適当なDNAを切断し、発現ベクターpCAVDHFR内にD
NAを連結させることによって調製した。得られた構築物
を、CAV/DHFR−CD40LTと名付けた。pCAVDHFRは、サイト
メガロウイルス、SV40、およびアデノウイルス２から誘
導された調節配列を、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（dihy
drofolate reductase）（DHFR）と共に含み、宿主細胞
染色体内への所望の遺伝子のランダムな取り込みを許
す。DHFRの発現は、DHFR-宿主細胞が、グリシン、ヒポ
キサンチンおよびチミジン（GHT）を含まない培地中で
増殖することを可能にする。また、CHO中でネズミCD40L
三量体が発現するように、同様の構築物を作成した。リ
ーダーおよびオリゴマー化ジッパー配列に加えて、ネズ
ミの構築物は、三量体化ドメイン（「ロイシンジッパ
ー」またはオリゴマー化ジッパー）とネズミのCD40Lの
細胞外領域との間に、Flag（登録商標）と呼ばれるオク
タペプチドをコードする配列を含んでいた。ヒトCD40L
をコードするDNAのヌクレオチドおよびアミノ酸の配列
を、それぞれ、配列番号７および８に示す。さらなる構
築物も、標準法を用いて調製することができる。例え
ば、米国特許第4,656,134号に記載されているような二
重のプロモーターを採用するベクター、または、米国特
許第4,937,190号あるいはKaufmanら、Nucl.Acid Res.,
19:4485,1991に記載されているようなエンハンサー配列
を用いるベクターもまた、CHO細胞内でCD40Lを発現する
構築物を調製するために有用である。
得られた連結生成物は、Lipofectin（登録商標）Reag
entまたはLipofectamine（商標）Reagent（Gibco BR
L、Gaithersburg、MD）のいずれかを用いて、CHO細胞内
にトランスフェクトされた。これらの試薬は両方とも、
培養細胞に適用する場合に細胞内への核酸の取り込みを
促進する、脂質−核酸複合体（またはリポソーム）を形
成するために用いられる、商品として入手可能な試薬で
ある。pCAVDHFR−CD40LT構築物でトランスフェクトされ
た細胞を、GHT非存在下、DMEM:F12培地内で選択した。G
HT非存在下で増殖できる細胞は、実施例16に記載の方法
に従って、固相結合アッセイを用いて、CD40Lの生成に
ついて試験された。結果から、このトランスフェクショ
ン系では、Lipofectamine（商標）Reagentの方が、より
高速でのトランスフェクションに成功したことが示され
た。
entまたはLipofectamine（商標）Reagent（Gibco BR
L、Gaithersburg、MD）のいずれかを用いて、CHO細胞内
にトランスフェクトされた。これらの試薬は両方とも、
培養細胞に適用する場合に細胞内への核酸の取り込みを
促進する、脂質−核酸複合体（またはリポソーム）を形
成するために用いられる、商品として入手可能な試薬で
ある。pCAVDHFR−CD40LT構築物でトランスフェクトされ
た細胞を、GHT非存在下、DMEM:F12培地内で選択した。G
HT非存在下で増殖できる細胞は、実施例16に記載の方法
に従って、固相結合アッセイを用いて、CD40Lの生成に
ついて試験された。結果から、このトランスフェクショ
ン系では、Lipofectamine（商標）Reagentの方が、より
高速でのトランスフェクションに成功したことが示され
た。
おおよそ160のクローンを、スクリーニングし、２つ
の陽性のクローンを同定し、さらなる研究に進めた。GH
Tを含まないEMDE:F12培地内に、細胞を進め、上記の固
相結合アッセイでCD40L三量体の生成を評価することに
よって、安定性をモニターした。これらの結果に基づ
き、CD40L DNAで安定にトランスフェクトされ、CD40L
三量体をおおよそ１μg/106細胞／日で生成し分泌し
た、一つのクローンを選んだ。他のベクターおよび本実
施例に記載したDNA配列のすべてまたは一部を含むさら
なる構築物を用いて、実質上ここに記載したように、安
定にトランスフェクトされた細胞系をさらに調製するこ
とができる。
の陽性のクローンを同定し、さらなる研究に進めた。GH
Tを含まないEMDE:F12培地内に、細胞を進め、上記の固
相結合アッセイでCD40L三量体の生成を評価することに
よって、安定性をモニターした。これらの結果に基づ
き、CD40L DNAで安定にトランスフェクトされ、CD40L
三量体をおおよそ１μg/106細胞／日で生成し分泌し
た、一つのクローンを選んだ。他のベクターおよび本実
施例に記載したDNA配列のすべてまたは一部を含むさら
なる構築物を用いて、実質上ここに記載したように、安
定にトランスフェクトされた細胞系をさらに調製するこ
とができる。
ひとたび、そのような安定にトランスフェクトされた
細胞を同定したならば、トランスフェクトされた細胞の
大規模培養を行い、CD40L三量体を含む上澄み液を蓄積
させた。適当な大規模培養の条件は、バイオリアクター
の使用を含む。同様の方法を行い、おおよそ0.05μg/10
6細胞／日でネズミのCD40L三量体を分泌したCHO細胞系
の作り出した。ヒトまたはネズミのいずれかのCD40L構
築物で安定にトランスフェクトされたCH0細胞は、pCAVD
HFRプラスミドからのDHFR遺伝子を獲得しており、メト
トレキセートに耐性である。CD40L三量体の生成を増加
させるために、メトトレキセートを培地に加え、CD40L
三量体DNAのコピー数を増幅させることができる。
細胞を同定したならば、トランスフェクトされた細胞の
大規模培養を行い、CD40L三量体を含む上澄み液を蓄積
させた。適当な大規模培養の条件は、バイオリアクター
の使用を含む。同様の方法を行い、おおよそ0.05μg/10
6細胞／日でネズミのCD40L三量体を分泌したCHO細胞系
の作り出した。ヒトまたはネズミのいずれかのCD40L構
築物で安定にトランスフェクトされたCH0細胞は、pCAVD
HFRプラスミドからのDHFR遺伝子を獲得しており、メト
トレキセートに耐性である。CD40L三量体の生成を増加
させるために、メトトレキセートを培地に加え、CD40L
三量体DNAのコピー数を増幅させることができる。
実施例３ この実施例は、いくつかの異なるCD40L構築物の結合
アフィニティーについて説明している。アフィニティー
実験は、生物特異的相互反応分析（biospecific Inter
action analysis）（BIA）によって、バイオセンサー
（生物学的認識機構を感作装置または変換器と結びつけ
た装置）を用いて行った。典型的なバイオセンサーは、
Pharmacia Biosensor AB（Uppsala,Sweden;Fagerstam
L.G.、Technique in Protein Chemistry II、J.
J.Villafranca編、Acad.Press,NY,1991を参照のこと）
からのBIAcore（商標）である。BIAcore（商標）は、２
種類の生物分子の相互作用をモニターするために、光学
現像表面プラスモン共鳴（KretscmannおよびRaether、
Z.Naturforschung、Teil.A.,23:2135,1968）を用いる。
105から1010M-1の範囲のアフィニティー定数、および10
3から106M-1s-1の範囲の会合速度定数を持つ分子対は、
BIAcore（商標）での特徴付けに適している。
アフィニティーについて説明している。アフィニティー
実験は、生物特異的相互反応分析（biospecific Inter
action analysis）（BIA）によって、バイオセンサー
（生物学的認識機構を感作装置または変換器と結びつけ
た装置）を用いて行った。典型的なバイオセンサーは、
Pharmacia Biosensor AB（Uppsala,Sweden;Fagerstam
L.G.、Technique in Protein Chemistry II、J.
J.Villafranca編、Acad.Press,NY,1991を参照のこと）
からのBIAcore（商標）である。BIAcore（商標）は、２
種類の生物分子の相互作用をモニターするために、光学
現像表面プラスモン共鳴（KretscmannおよびRaether、
Z.Naturforschung、Teil.A.,23:2135,1968）を用いる。
105から1010M-1の範囲のアフィニティー定数、および10
3から106M-1s-1の範囲の会合速度定数を持つ分子対は、
BIAcore（商標）での特徴付けに適している。
バイオセンサーチップを、ヤギの抗ヒトIgG1 Fcでコ
ートし、これを用いて、CD40/Fcをチップに結合させ
た。次いで、別のCD40L構築物を濃度を増加させながら
加えた；チップは、水酸化ナトリウムを加えることによ
って、構築物を違える度ごとに再生した。二種類の別々
の実験を行った。第一の実験では、ヒトのCD40L二量体
（CD40L/Fc）、ヒトのCD40L三量体（CD40L/「ロイシン
ジッパー」）、ならびにネズミのCD40L二量体および三
量体（実質上、ヒトCD40Lに記載した方法に従って調製
した）を比較した。第二の実験では、ヒトのCD40L三量
体の結合を、二種類の異なるヒトのCD40L単量体の調製
物（TNFと最も相同な細胞外ドメインの部分のみを含
む）の結合と比較した。得られたデータを分析し、異な
るCD40L構築物のアフィニティー定数および会合度定数
を測定した。得られたデータを下の表１および図１およ
び２に示した。
ートし、これを用いて、CD40/Fcをチップに結合させ
た。次いで、別のCD40L構築物を濃度を増加させながら
加えた；チップは、水酸化ナトリウムを加えることによ
って、構築物を違える度ごとに再生した。二種類の別々
の実験を行った。第一の実験では、ヒトのCD40L二量体
（CD40L/Fc）、ヒトのCD40L三量体（CD40L/「ロイシン
ジッパー」）、ならびにネズミのCD40L二量体および三
量体（実質上、ヒトCD40Lに記載した方法に従って調製
した）を比較した。第二の実験では、ヒトのCD40L三量
体の結合を、二種類の異なるヒトのCD40L単量体の調製
物（TNFと最も相同な細胞外ドメインの部分のみを含
む）の結合と比較した。得られたデータを分析し、異な
るCD40L構築物のアフィニティー定数および会合度定数
を測定した。得られたデータを下の表１および図１およ
び２に示した。
データの分析により、TNFに最も相同な細胞外ドメイ
ンの部分のみを含むCD40L単量体は、オリゴマー化CD40L
より少々低いアフィニティーではあるが、CD40と結合す
る能力を持つことが示された。第二の実験における結合
率の分析では、CD40/Fc分子あたりのCD40L単量体の単位
結合がCD40L三量体の２倍ほど多いことが示され、２つ
のCD40L単量体は一つのCD40/Fc二量体と結合し、一つの
CD40L三量体は、一つのCD40/Fc二量体を結合することが
確認された。
ンの部分のみを含むCD40L単量体は、オリゴマー化CD40L
より少々低いアフィニティーではあるが、CD40と結合す
る能力を持つことが示された。第二の実験における結合
率の分析では、CD40/Fc分子あたりのCD40L単量体の単位
結合がCD40L三量体の２倍ほど多いことが示され、２つ
のCD40L単量体は一つのCD40/Fc二量体と結合し、一つの
CD40L三量体は、一つのCD40/Fc二量体を結合することが
確認された。
実施例４ この実施例は、数多くのCD40リガンド／ジッパードメ
イン融合タンパク質の変異型の調製について説明してい
る。酵母で発現した構築物の突然変異（変異体14、18、
32、41、43、10PPおよび18PP）は、PCRの取込みの間違
いによって生じ（Mulradら、Yeast,8:79、1992）、分泌
改良変異株のように分泌の明らかな増加を基に選択し
た。変異体14、18、32、41および43は、S.cerevisiaeで
単離された。変異株10PPおよび18PPは、P.pastorisで単
離された。哺乳動物細胞で発現する構築物の変異体（FL
194.W、194.W、LZ12V、215.T、255.Fおよび194.S）もま
た、PCRを用いて調製され、部位特異的突然変異誘発の
結果であるか、またはPCRのランダム生成物であるかの
いずれかであった。得られた変異の型およびそれらの活
性への影響（実質的に実施例１に記載したように固相結
合アッセイにおいてCD40を結合する能力）を下の表２に
示す。
イン融合タンパク質の変異型の調製について説明してい
る。酵母で発現した構築物の突然変異（変異体14、18、
32、41、43、10PPおよび18PP）は、PCRの取込みの間違
いによって生じ（Mulradら、Yeast,8:79、1992）、分泌
改良変異株のように分泌の明らかな増加を基に選択し
た。変異体14、18、32、41および43は、S.cerevisiaeで
単離された。変異株10PPおよび18PPは、P.pastorisで単
離された。哺乳動物細胞で発現する構築物の変異体（FL
194.W、194.W、LZ12V、215.T、255.Fおよび194.S）もま
た、PCRを用いて調製され、部位特異的突然変異誘発の
結果であるか、またはPCRのランダム生成物であるかの
いずれかであった。得られた変異の型およびそれらの活
性への影響（実質的に実施例１に記載したように固相結
合アッセイにおいてCD40を結合する能力）を下の表２に
示す。
変異体18PPは、分子内に単一の変異のみを持ち、酵母
での分泌に充分な影響を与える。変異体41は２つの変異
を持ち、それらは両方ともジッパードメインのイソロイ
シン残基にある。ジッパー内の変異は、活性に明らかな
影響を与えることなく、酵母からの分泌を改善する。変
異体194.Wは酵母細胞で発現し、イオン交換クロマトグ
ラフィー段階［194.W（ｃ）］の組み合わせによるか、
あるいはオリゴマー化ジッパー部分を結合するモノクロ
ーナル抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィー
［194.W（ａ）］によるかのいずれかで、精製した。酵
母で発現した変異体（194.W）は、実施例３に記載の方
法に従って実質的に行われたバイオセンサーアッセイで
CD40により大きなアフィニティーを示し、且つ、Ｂ細胞
増殖アッセイでは、酵母で発現した野生型のCD40リガン
ド／ジッパードメイン融合タンパク質（WT）より大きな
生物活性を示した。これらの結果を表３に示す。
での分泌に充分な影響を与える。変異体41は２つの変異
を持ち、それらは両方ともジッパードメインのイソロイ
シン残基にある。ジッパー内の変異は、活性に明らかな
影響を与えることなく、酵母からの分泌を改善する。変
異体194.Wは酵母細胞で発現し、イオン交換クロマトグ
ラフィー段階［194.W（ｃ）］の組み合わせによるか、
あるいはオリゴマー化ジッパー部分を結合するモノクロ
ーナル抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィー
［194.W（ａ）］によるかのいずれかで、精製した。酵
母で発現した変異体（194.W）は、実施例３に記載の方
法に従って実質的に行われたバイオセンサーアッセイで
CD40により大きなアフィニティーを示し、且つ、Ｂ細胞
増殖アッセイでは、酵母で発現した野生型のCD40リガン
ド／ジッパードメイン融合タンパク質（WT）より大きな
生物活性を示した。これらの結果を表３に示す。
さらに、哺乳動物細胞で発現したFL194Wもまた、半定
量的ウエスタンブロット分析でWTCD40Lより高い結合を
示した。
量的ウエスタンブロット分析でWTCD40Lより高い結合を
示した。
配列番号５の三量体形成ジッパーの位置に肺の表面活
性タンパク質Ｄ（SPD）の三量体化ドメイン（配列番号
6;Hoppeら、FEBS Letters,344:191、1994）を置換する
ことによって、さらなる構築物を調製した。この構築物
は、S.cerevisiaeおよび哺乳動物細胞内で、低いレベル
で発現する。前記の方法に従って、活性を測定する；そ
のような構築物に基づいたさまざまな変異体もまた調製
され、上記の方法に従って、分泌またはその他の生成特
性を最適化することができる。
性タンパク質Ｄ（SPD）の三量体化ドメイン（配列番号
6;Hoppeら、FEBS Letters,344:191、1994）を置換する
ことによって、さらなる構築物を調製した。この構築物
は、S.cerevisiaeおよび哺乳動物細胞内で、低いレベル
で発現する。前記の方法に従って、活性を測定する；そ
のような構築物に基づいたさまざまな変異体もまた調製
され、上記の方法に従って、分泌またはその他の生成特
性を最適化することができる。
実施例５ この実施例は、いくつかの異なるCD40L構築物の結合
アフィニティーについて説明している。アフィニティー
実験は、実質的には実施例３に記載の方法による、生物
特異的相互作用分析（BIA）によって、実施例４記載の
２つの構築物を用いて、行った。表４に示した結果は、
野生型（WT）CD40LTの２つの異なる調製物、および変異
型（194.W）の３つの異なる調製物で得られた平均値を
示す。結果を以下に示す。
アフィニティーについて説明している。アフィニティー
実験は、実質的には実施例３に記載の方法による、生物
特異的相互作用分析（BIA）によって、実施例４記載の
２つの構築物を用いて、行った。表４に示した結果は、
野生型（WT）CD40LTの２つの異なる調製物、および変異
型（194.W）の３つの異なる調製物で得られた平均値を
示す。結果を以下に示す。
これらの結果は、CD40LT 194.Wが、野生型CD40LTよ
りCD40/Fcにより高いアフィニティーを持つことを、確
証する。
りCD40/Fcにより高いアフィニティーを持つことを、確
証する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 ファンズロウ，ウィリアム・シー，ザ・ サード アメリカ合衆国ワシントン州98023，フ ェデラル・ウェイ，サウス・ウエスト・ スリーハンドレッドアンドトゥエンティ セブンス・プレース 218 (72)発明者 スプリッグス，メラニー・ケイ アメリカ合衆国ワシントン州98119，シ アトル，トゥエルブス・アベニュー・ウ エスト 2256 (72)発明者 スリニヴァッサン，サブハッシニ アメリカ合衆国ワシントン州98034，カ ークランド，ノース・イースト・ワンハ ンドレッドアンドトゥエンティナイン ス・ストリート 11325 (72)発明者 ギブソン，マリールー・ジー アメリカ合衆国カリフォルニア州92009, カールズバッド，ウィステリア・ウェイ 7209 (56)参考文献 国際公開93／8207（ＷＯ，Ａ１) 国際公開94／10308（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (8)
- 【請求項１】CD40L変異型をコードする単離されたDNAで
あって、 （ａ）配列番号２においてアミノ酸194のシステインを
トリプトファンで置き換えたアミノ酸配列を持つポリペ
プチドをコードするDNA;および、 （ｂ）（ａ）に記載のポリペプチドの断片をコードする
DNA、ここにおいて当該断片はCD40に結合する活性を有
し、そしてアミノ酸194にトリプトファンを含む、前記D
NA; からなる群より選択される前記DNA。 - 【請求項２】配列番号２のアミノ酸１から261、35から2
61、34から225、113から261、113から225、120から26
1、または120から225を含むポリペプチドからなる群よ
り選択されるポリペプチドをコードする、請求項１記載
の単離されたDNA。 - 【請求項３】さらに、配列番号５に示したアミノ酸配列
を持つオリゴマー化ジッパーをコードするDNAを含む、
請求項２記載の単離DNA。 - 【請求項４】DNAが、配列番号２のアミノ酸113から261
からなるCD40Lの細胞外ドメインのフラグメントのアミ
ノ末端の先端に融合したオリゴマー化ジッパーを含む融
合タンパク質をコードする、請求項３記載の単離DNA。 - 【請求項５】請求項１ないし４のいずれか１項に記載の
DNAを含む組換え発現ベクター。 - 【請求項６】請求項５記載の組み換え発現ベクターで形
質転換または感染された宿主細胞。 - 【請求項７】発現を促進する条件下で請求項６記載の宿
主細胞を培養し、そして培地からCD40Lポリペプチドを
回収することを含む、CD40Lポリペプチドを調製する方
法。 - 【請求項８】請求項１から４のいずれか１項に記載のDN
Aによってコードされる、CD40Lポリペプチド。
Applications Claiming Priority (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/484,624 | 1995-06-07 | ||
| US08/477,733 US5981724A (en) | 1991-10-25 | 1995-06-07 | DNA encoding CD40 ligand, a cytokine that binds CD40 |
| US484,624 | 1995-06-07 | ||
| US08/477,733 | 1995-06-07 | ||
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