JPH05500614A - 顆粒球コロニー刺激因子レセプター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 顆粒球コロニー刺激因子レセプター 発明の背景 本発明はサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）レセプター、より詳細には顆粒球コ ロニー刺激因子レセプターに関するものである。

ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は、顆粒球関連プロジェニター細胞 （幹細胞）の増殖および分化を促進する系統特異性の造血蛋白質である。ヒトＧ −Ｃ５Ｆは成熟した好中球の機能を活性化することも示されている。ヒトＧ−Ｃ ３Ｆに対するｃＤＮＡ（ナガタ（Ｎａｇａｔａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３１９：４ １５．１９８６）およびマウスＧ−Ｃ３Ｆに対するｃＤＮＡ（ツチャ（Ｔｓｕｃ ｈｉｙａ）ら、ＰＮＡＳ　８３，７６３３．１９８６）が単離され、Ｇ−Ｃ３Ｆ の構造解明および生物学的解明がさらに可能となった。

Ｇ−Ｃ３Ｆは、Ｇ−Ｃ３Ｆ反応性細胞の原形質膜上に発現する特異的Ｇ−Ｃ３Ｆ レセプター蛋白質に結合することにより、細胞に対するその生物作用を開始する 。Ｇ−ＣＳ　ＦはＧ−Ｃ５Ｆレセプター（Ｇ−Ｃ５ＦＲ）に特異的に結合しつる ので、精製されたＧ−Ｃ３ＦＲ組成物はＧ−Ｃ３Ｆの診断アッセイに際して、ま た診断および療法に用いられるＧ−Ｃ３Ｆレセプター抗体を形成させる際に有用 であろう。さらに、精製されたＧ−Ｃ５Ｆレセプター組成物はＧ−ＣＳＦを結合 および封鎖する療法に直接用いることができ、これによりこのサイトカインの免 疫活性を調節する手段が提供される。Ｇ−Ｃ３ＦＲの構造特性および生物学的特 性、ならびにＧ−Ｃ５Ｆその他のサイトカイン刺激に対する種々の細胞集団の反 応においてＧ−Ｃ３ＦＲが果たす役割を調べるためには、またはＧ−Ｃ３ＦＲを 療法、診断もしくはアッセイに効果的に使用するためには、精製されたＧ−ＣＳ ＦＲ組成物が必要である。しかしこれらの組成物は、組換えＤＮＡ法を用いてレ セプターをコードする遺伝子をクローニングし、発現させることによって実際的 な収率で得られるにすぎない。生化学的分析に用いるＧ−Ｃ８ＦＲ分子を精製し 、またはＧ−Ｃ８ＦＲをコードする遺伝子をクローニングし、発現させる試みは 、適切なレセプター蛋白質またはｍＲＮＡの供給源が無いことによって妨げられ ている。本発明以前には高水準のＧ−ＣＳＦＲを構成的かつ継続的に発現する細 胞系列は知られておらず、このため配列決定または直接発現クローニング用の遺 伝子ライブラリーの構成に用いるレセプターの精製が妨げられている。

発明の要約 本発明は哺乳動物顆粒球コロニー刺激因子レセプター（Ｇ−Ｃ３ＦＲ）をコード するＤＮＡ配列またはそのサブユニットを提供する。好ましくはこれらのＤＮＡ 配列は下記よりなる群から選ばれる：　（ａ）天然Ｇ−Ｃ３ＦＲ遺伝子のコード 領域に由来するヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡクローン；　（ｂ）適度にスト リンジェントな条件下で（ａ）のｃＤＮＡクローンにハイブリダイズすることが でき、生物活性Ｇ−Ｃ３ＦＲ分子をコードするＤＮＡ配列：ならびに（ｃ）（ａ ）および（ｂ）に定めるＤＮＡ配列に対する遺伝子コードの結果としてディジェ ネレート（ｄｅｌｚｅｎｅｒａｔｅ）であり、生物活性Ｇ−ＣＳＦＲ分子をコー ドするＤＮＡ配列。本発明は上記に定めるＤＮＡ配列を含む組換え発現ベクター 、それらの組換え発現ベクターを用いて調製される組換えＧ−Ｃ３ＦＲ分子、お よびそれらの発現ベクターを用いる組換えＧ−Ｃ５ＦＲ分子の製法をも提供する 。

本発明は、単離または精製された、哺乳動物Ｇ−ＣＳＦＲからなる蛋白質組成物 をも提供する。好ましいＧ−Ｃ８ＦＲ蛋白質は可溶性形態の天然レセプターであ る。

本発明は、上記方法により調製された有効量の可溶性の天然または組換えレセプ ター蛋白質を含む、療法、診断、Ｇ−Ｃ３ＦＲのアッセイ、またはＧ−ＣＳＦＲ に対する抗体の形成に用いられる組成物をも提供する。本発明のこれらまたは他 の観点は後記の詳細な説明を参照することによって明らかになるであろう。

図面の簡単な説明 図１は、ヒトＧ−Ｃ３ＦＲ蛋白質をコードする領域を含むｃＤＮＡクローンＤ− ７および２５−１の制限地図を示す。

図２−５は、ヒト胎盤ライブラリーから単離されたクローンＤ−７のｃＤＮＡ配 列、およびこのクローンの予想アミノ酸配列を表す。クローンＤ−７から予想さ れる膜結合−成熟蛋白質全長のコード領域は、アミノ酸１−７５９により定めら れる。成熟蛋白質の予想Ｎ−末端Ｇｌｕをアミノ酸番号１と表示し、アンダーラ インを施した。６０４−６２９の推定−膜透過領域にもアンダーラインを施した 。

図６は、交互スプライシング整列の結果得られるクローン２５−１の３′側ヌク レオチド配列および予想されるＣ−末端アミノ酸配列を表す。クローン２５−１ のイントロン挿入配列の位置を図１のヌクレオチド２４１１の後に↓で示す。

イントロン−エクソン境界の位置を↓で示し、スプライス−ドナーおよびスプラ イス−アクセプター認識配列を四角で囲む。クローンＤ−７にも存在する配列に はアンダーラインを施した。

Ｇ−Ｃ３Ｆは、好中性顆粒球プロジェニター細胞の増殖および分化を誘導する発 育因子である。Ｇ−ＣＳＦの生物活性は“Ｇ−Ｃ３Ｆレセプター”または“Ｇ− Ｃ８ＦＲ″と呼ばれる特異的な細胞表面レセプターに結合することにより媒介さ れる。ここで用いるＧ−Ｃ５ＦＲは、天然の哺乳動物Ｇ−Ｃ５ＦＲアミノ酸配列 、たとえば図１に示すヒトＧ−Ｃ８ＦＲ配列、またはそれらのフラグメントと実 質的に類似するアミノ酸配列を含む蛋白質を意味し、それらは後記のようにＧ− Ｃ３Ｆ分子を結合することができ、または無傷のヒト原形質膜蛋白質と同様なそ れらの天然の形状において細胞へのＧ−Ｃ３Ｆ分子の結合により発生する生物シ グナルをトランスデユースすることができ、もしくは自然の（すなわち組換えに よらない）供給源からのＧ−Ｃ８ＦＨに対して形成された抗−〇−Ｃ３ＦＲ抗体 と交叉反応することができるという点で、生物活性である。Ｇ−Ｃ８ＦＲの個々 の形態には、図２−５（クローンＤ−７）のアミノ酸配列１−７５９、または図 ２−５および６に示すクローン２５−１によりコードされる蛋白質のアミノ酸配 列１−７７６に実質的に均等なポリペプチドが含まれる。“Ｇ−ＣＳ　Ｆレセプ ター”または“Ｇ−Ｃ８ＦＲ”という語には後記の可溶性Ｇ−Ｃ３Ｆレセプター が含まれるが、それらに限定されない。この明細書全体を通して用いられる“成 熟“という語は、天然遺伝子の全長転写体中に存在すると思われるリーダー配列 を欠如する形態で発現される蛋白質を意味する。種々の生物学的に均等な蛋白質 およびアミノ酸の同族体を以下に詳述する。

成熟Ｎ−末端アミノ酸は、シグナル開裂部位を判定するためのバイン（Ｈｅｉｊ ｎｅ、Ｇ、）、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１４：４６８３　（１９８６） のアルゴリズムに基づけば、Ｇｌｕ’（図２−５にアンダーラインを施し、アミ ノ酸１と表示する）であると推定される。しかしＳｅｒ”がＮ−末端Ｍｅｔから ２１番目のアミノ酸であり、小型アミノ酸残基Ｇ１ｙがこれに先行することが観 察され、これら両者はシグナル開裂部位を同定するための基準として受け入れら れていることに基づけば、幾つかの要因はＳｅｒ”が正しい成熟Ｎ−末端アミノ 酸であることを示唆する。成熟蛋白質の実際のＮ−末端アミノ酸は精製されたＧ −Ｃ８ＦＲ蛋白質を標準法により配列決定することにより確認しうる。従って上 記のものに均等なアミノ酸配列には、たとえば図２−５（クローンＤ−７）のア ミノ酸−３から７５９まで、または図２−５および６に示すクローン２５−１に よりコードされる蛋白質のアミノ酸−３から７７６までが含まれる。

レセプター蛋白質はそれらの天然の形状において、リガンドに結合する細胞外領 域、該蛋白質を原形質膜の脂質二重層内に固定する疎水性の膜透過領域、ならび に細胞質蛋白質および／または化学物質と相互作用して細胞の一連の細胞質内化 学反応を介して生物シグナルをエフェクターへ伝達する細胞質領域または細胞内 領域を備えた、無傷のヒト原形質膜蛋白質として存在する。疎水性の膜透過領域 、およびこの膜透過領域の直後の細胞質領域の高度に帯電したアミノ酸配列は共 同作用して、原形質膜を越えるＧ−Ｃ３ＦＲの輸送を停止する。本発明に関連し て用いられる“可溶性Ｇ−Ｃ３ＦＲ“または”５Ｇ−Ｃ３ＦＲ”は、天然Ｇ−Ｃ ＳＦＲの細胞外領域に相当するアミノ酸配列を含む蛋白質またはその実質的に均 等な同族体、たとえば図２−５のアミノ酸配列１−６０３に実質的に均等なアミ ノ酸配列を含むポリペプチドを意味する。均等な５Ｇ−ＣＳＦＲには、１または ２以上の置換、欠失または付加により図２−５に示す配列と異なっており、Ｇ− Ｃ８Ｆを結合する能力を保持し、Ｇ−Ｃ３Ｆが細胞表面結合Ｇ−Ｃ５Ｆレセブタ ー蛋白質を介してシグナルをトランスデユースする能力を抑制するポリペプチド が含まれる。５Ｇ−Ｃ３ＦＲ蛋白質は膜透過領域を欠如するので、それらはそれ らが産生される宿主細胞から分泌される。均等な可溶性Ｇ−ＣＳＦＲには、たと えば図２−５のアミノ酸配列−３から６０３までが含まれる。療法用配合物中に おいて投与した場合、５Ｇ−Ｃ３ＦＲ蛋白質は体内を循環して循環Ｇ−Ｃ３Ｆ分 子に結合し、Ｇ−Ｃ８Ｆと自然Ｇ−Ｃ３Ｆレセプターとの相互作用を防止し、Ｇ −Ｃ８Ｆ媒介による生物シグナル、たとえば免疫反応または炎症反応のトランス ダクションを抑制する。ポリペプチドがＧ−Ｃ８Ｆシグナルのトランスダクショ ンを抑制する能力は下記により測定しうる。すなわち細胞を組換えＧ−Ｃ３Ｆレ セプターＤＮＡでトランスフェクトし、組換えレセプターを発現させる。次いで 細胞をＧ−Ｃ３Ｆと接触させ、生じた代謝効果を検査する。リガンドの作用に起 因する作用が生じた場合、その組換えレセプターはシグナルトランスデユース活 性をもつ。ポリペプチドがシグナルトランスデユース活性をもつか否かを判定す る方法の一例は、イゼルダ（Ｉｄｚｅｒｄａ）ら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、Ｉ７１ ：８６１　（１９９０）；カーチス（Ｃｕｒｔｉｓ）ら、Ｐｒｏ。Ｎａｔｌ、Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８６：３０４５　（１９８９）：ブライベス（Ｐ　ｒ 　ｙｗｅ　ｓ）ら、ＥＭＢＯＪ、５：２１７９　（１，９８６）；チョウ（Ｃｈ ｏｕ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ。Ｃｈｅｍ、２６２　：１８４２　（１９８７）に示さ れる。あるいは内在性Ｇ−Ｃ８Ｆレセプターを発現し、Ｇ−ＣＳＦに対する検出 可能な生物反応を示す細胞系列の一次細胞を用いることもできる。

“実質的に類似する”Ｇ−Ｃ３ＦＲには、そのアミノ酸配列または核酸配列が１ または２以上の置換、欠失または付加により基準配列と異なっており、その実際 の作用はＧ−Ｃ３ＦＲ蛋白質の生物活性を保持しているものが含まれる。あるい は下記の場合、核酸サブユニットおよび同族体はここに示す特異的ＤＮＡ配列に “実質的に類似する”　；（ａ）そのＤＮＡ配列が天然の哺乳動物Ｇ−ＣＳＦＲ 遺伝子のコード領域に由来する：　（ｂ）そのＤＮＡ配列が適度にストリンジェ ントな条件下で（ａ）のＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができ、かつ生物 活性Ｇ−Ｃ８ＦＲ分子をコードする。あるいはそのＤＮＡ配列が（ａ）または（ ｂ）に定めるＤＮＡ配列に対する遺伝子コードの結果としてディジェネレートで あり、かつ生物活性Ｇ−Ｃ３ＦＲ分子をコードする。実質的に類似する同族体蛋 白質は、対応する天然Ｇ−Ｃ３ＦＲの配列に約３０％以上類似する。これより低 度の類似性をもつが、匹敵する生物活性を備えた配列は均等物であるとみなされ る。より好ましくは、同族体蛋白質は対応する天然Ｇ−Ｃ３ＦＲの配列に約８０ ％以上類似し、この場合それらは“実質的に等しい”と定義される。核酸配列の 定義に際して、実質的に類似するアミノ酸配列をコードしうる対象核酸配列はす べて、基準核酸配列に実質的に類似するとみなされる。類似率は、たとえばライ スコンシン大学ジェネティックス・コンピューター・グループ（ＵＷＧＣＧ）か ら得られるＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０を用いて配列情 報を比較することにより測定される。ＧＡＰプログラムは、ニードルマンおよび ブンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ、Ｗｕｎｓｃｈ）（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、４８ ＋４４３゜１９７０）のアラインメント法が、スミスおよびウォーターマン（Ｓ ｍｉｔｈ。

Ｗａｔｅｒｍａｎ）　（Ａｄｖ、　Ａｐｐｌ、　Ｍａｔｈ、２：４８２．１９８ １）により改良されたものを採用する。要約すると、ＧＡＰプログラムは類似す る整列した記号（すなわちヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を２種類の配列の うち短い方の記号の総数で割ったものとして類似性を定義する。ＧＡＰプログラ ムに関する好ましいデフオールド（ｄｅｆａｕｌｔ）パラメーターには下記のも のが含まれる：　（１）ヌクレオチドに関する単項（ｕｎａｒｙ）比較マトリッ クス（恒等式については１の数値、非恒等式についてはＯの数値を含む）、なら びにグリスコツおよびバーゲス（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｂｕｒｇｅｓｓ）、Ｎｕｃ ｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１４：６７４５，１９８６の重み付き比較マトリック ス、シュワルツおよびデイホフ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ、Ｄａｙｈｏｆｆ）編、Ａｔ １ａｓｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ 、ナショナル・バイオメディカル・リサーチ・ファウンデイション、ｐ、３５３ −３５８゜１９７９に記載、（２）各ギャップにつき３．０のペナルティ−１お よび各ギャップの各記号につきさらに０．１０のペナルティー：ならびに（３） エンドギャップについてはペナルティ−無し。

ここで用いる“組換え”は、蛋白質が組換え（たとえば微生物性または哺乳動物 性）発現系に由来することを意味する。“微生物性”とは、細菌または菌類（た とえば酵母）発現系において形成された組換え蛋白質を意味する。産生物として “組換え微生物性“は、本質的に天然の内在性物質を含まない微生物性発現系に おいて産生された蛋白質を定義する。大部分の細菌培養物、たとえば大腸菌（Ｅ 、Ｃｏ１１）において発現された蛋白質はグリカン（ｇｌｙｃａｎ）を含まない であろう。酵母において発現された蛋白質は、哺乳動物細胞において発現された ものと異なるグリコジル化パターンをもつ可能性がある。

本明細書全体においてＧ−Ｃ３Ｆレセプターの特性として用いられる“生物活性 ”とは、その分子が検出可能な量のＧ−Ｃ３Ｆを結合し、たとえばハイブリッド レセプター構造体の成分として細胞にＧ−Ｃ３Ｆ刺激を伝達し、または自然のく すなわち組換えによらない）供給源からのＧ−Ｃ３ＦＲに対して形成さｎた抗− Ｇ−Ｃ３ＦＲ抗体と交叉反応することができるのに十分な程度に、ここに開示す る本発明の形態とのアミノ酸配列類似性をもつことを意味する。好ましくは本発 明の範囲内の生物活性Ｇ−Ｃ８Ｆレセプターは、標準結合アッセイにおいてレセ プターｎｍｏ　１当たりＯ，ｌｎｍｏ１以上のＧ−Ｃ３Ｆ、極めて好ましくはレ セプターｎｍｏｌ当たりＱ、５ｎｍｏ１以上のＧ−Ｃ３Ｆを結合しつる（後記参 ＠）。

“ＤＮＡ配列”は、純粋な、すなわち内在性物質を含まない形で、かつ標準的な 生化学的方法により、たとえばクローニングベクターを用いてその配列およびそ の成分ヌクレオチド配列を同定、操作および回収しうる量または濃度で、少なく とも１回は実質的に単離されたＤＮＡに由来する、分離されたフラグメントの形 の、または比較的大きなりＮＡ構造体の成分としてのＤＮＡポリマーに関するも のである。これらの配列は真核細胞遺伝子に一般に存在する内在非翻訳配列、す なわちイントロンにより中断されないオープンリーディングフレームの形で供給 されることが好ましい。関連配列を含むゲノムＤＮＡも使用しうる。非翻訳ＤＮ Ａ配列がコード領域の操作または発現を妨げない場合、オーブンリーディングフ レームの５′側または３′側に存在してもよい。

“ヌクレオチド配列”は、デオキシリボヌクレオチドのヘテロポリマーに関する ものである。本発明により提供される蛋白質をコードするＤＮＡ配列をｃＤＮＡ フラグメントおよび短いオリゴヌクレオチドリンカーから、または一連のオリゴ ヌクレオチドから組み立てて、組換え転写ユニットにおいて発現しうる合成遺伝 子を提供することができる。

“組換え発現ベクター”は、Ｇ−Ｃ３ＦＲをコードする、下記アセンブリーより なる転写ユニットを含むＤＮＡを増幅または発現するために用いられる複製可能 な構造体に関するものである：　（１）遺伝子発現において調節の役割を果たす １または２以上の遺伝要素、たとえばプロモーターまたはエン／’ｌンサー、（ ２）ｍＲ，ＮＡ中へ転写されて蛋白質に翻訳される構造配列またはコード配列、 ならびに（３）適宜な転写および翻訳開始および終止配列。酵母の発現系に用い るための構造要素には、宿主により翻訳された蛋白質の細胞外分泌を可能にする リーダー配列が含まれることが好ましい。あるいはリーダーまたは輸送配列無し に組換え蛋白質が発現される場合、それはＮ−末端メチオニン残基を含んでもよ い。この残基は、発現した組換え蛋白質から所望によりのちに開裂して、最終産 物を与えることができる。

“組換え微生物性発現系“とは、適切な宿主微生物、たとえば大腸菌または酵母 、たとえば麦酒酵母（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の実質的に均一な単一培養物 であって、組換え転写ユニットを染色体ＤＮＡ中へ安定に一体化しているか、ま たは組換え転写ユニットをレジデント（ｒｅｓｉｄｅｎｔ）プラスミドの成分と して保有するものを意味する。一般にこの系を構成する細胞は、単一祖先系形質 転換体の後代である。ここで定義する組換え発現系は、発現すべきＤＮＡ配列ま たは合成遺伝子に結合した調節要素を誘導した際に異種蛋白質を発現するであろ う。

本明細書に関連してＧ−ＣＳＦＲまたは５Ｇ−ＣＳＦＲ蛋白質または蛋白質組成 物の純度を定義するために用いる“単離された”という語は、その蛋白質または 蛋白質組成物が他の天然または内在性蛋白質を実質的に含まず、かつ調製過程で の汚染蛋白質残渣の含量が質量で約１％以下であることを意味する。しかしこれ らの組成物は安定剤、キャリヤー、賦形剤または補助療法薬として添加される他 の蛋白質を含有しうる。Ｇ−Ｃ３ＦＲまたは５Ｇ−Ｃ３ＦＲは銀染色によりポリ アクリルアミドゲル中に単一蛋白質バンドとして検出しつる場合、単離されてい る。

Ｇ−Ｃ３ＦＲをコードするｃＤＮＡの単離哺乳動物Ｇ−Ｃ５ＦＲのコード配列は 、まずゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いて形成された組換えＤＮＡライブラリ ーから、Ｇ−Ｃ３ＦＲをコードするｃＤＮＡ配列を単離することにより得られる 。ｃＤＮＡライブラリーを構成するための好ましい方法は、哺乳動物Ｇ−Ｃ３Ｆ Ｒを発現する特定の細胞系列から得られるポリアデニル化ｍＲＮＡを調製し、こ のポリアデニル化ＲＮＡを逆転写によりｃＤＮＡに変換することである。ｃＤＮ Ａライブラリーを構成するための特に好ましいｍＲＮＡの細胞源はヒト胎盤ＲＮ Ａである。

ｃＤＮＡライブラリーはＧ−Ｃ３ＦＲ配列を含み、これらはＧ−Ｃ３ＦＲｃＤＮ Ａとハイブリダイズしつる適宜な核酸プローブでライブラリーをスクリーニング することによって容易に同定することができる。これらのプローブはここに開示 するヌクレオチド配列から誘導しつる。あるいは合成オリゴヌクレオチドサブユ ニットのりゲーションによりＧ−Ｃ３ＦＲ蛋白質をコードするＤＮＡを組み立て て、完全コード配列を提供することもできる。

本発明のＧ−Ｃ３ＦＲをコードするｃＤＮＡは直接発現クローニング法により単 離された。詳細には、まずヒト胎盤組織から標準法により細胞質ｍＲＮＡを単離 することによりｃＤＮＡライブラリーを構成した。ポリアデニル化ｍＲＮＡを単 離し、これを用いて二本鎖ｃＤＮＡを調製した。次いで精製したｃＤＮＡフラグ メントを後記実施例２に詳述したｐ　ｓ　ｆ　ＣＡＶベクターＤＮＡ中ヘリケー トした。Ｇ−Ｃ３ＦＲｃＤＮＡフラグメントを含むｐｓｆＣＡＶベクターを大腸 菌株ＤＨ５α中へ形質転換した。形質転換体を平板培養して平板光たり約８００ コロニーを得た。得られたコロニーを採取し、各プールを用いて、本質的にはコ ス７：／　（Ｃｏｓｍａｎ）ら（Ｎａｔｕｒｅ　３１２＋７６８．１９８４）お よびルスマン（Ｌｕｔｈｍａｎ）ら（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、１１：１２ ９５゜１９８３）の記載に従って、Ｃ０９−７細胞中へのトランスフェクション に用いるプラスミドＤＮＡを調製した。生物活性を示す細胞表面Ｇ−Ｃ８Ｆレセ プターを発現する形質転換体は、Ｇ−ＣＳＦＲが１２５Ｉ−Ｇ−Ｃ５Ｆ　（５Ｘ １０−１ＧＭ）を結合する能力をスクリーニングすることにより同定された。詳 細には、トランスフェクトしたＣ０８−７細胞を＋２５Ｉ−Ｇ−Ｃ３Ｆ含有培地 と共にインキユベートシ、細胞を洗浄して、結合していない標識Ｇ−ＣＳ　Ｆを 除去し、細胞単一層をＸ線フィルムと接触させてＧ−Ｃ３Ｆ結合濃度を検出した ：シムズ（Ｓｉｍｓ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４１：５８５　（１９８８）に従 う。この方法で検出されたトランスフェクシントは相対的に明るいバックグラウ ンドに対して暗い部分として現れる。

トランスフエクタントプールのアッセイまでに約６０００のＤＮＡプールにおけ る約３０，０００のｃＤＮＡをスクリーンするために用いたこの方法により、Ｇ −Ｃ５Ｆ結合に関して陽性部分が示された。この陽性プールからの細菌の凍結ス トック培養して増殖させ、平板培養して個々のコロニーを形成させ、検出可能な Ｇ−ＣＳＦ結合活性をもつ表面蛋白質の合成を行いつる単一クローンが同定され るまでこれらをスクリーンした。ヒトＧ−Ｃ５ＦＲｃＤＮＡと他の哺乳動物種に 由来するｃＤＮＡとの種間ハイブリダイゼーションにより、他の哺乳動物種のｃ ＤＮＡライブラリーからさらにｃＤＮＡクローンを単離することができる。

ハイブリダイゼーションに用いるために、Ｇ−Ｃ３ＦＲをコードするＤＮＡを当 業者に周知の方法で検出可能な物質、たとえば蛍光基、放射性原子または化学ル ミネセント基により共有結合標識することができる。これらのプローブは特定の 状態のインビトロ診断にも使用しつる。

大部分の哺乳動物遺伝子と同様に、哺乳動物Ｇ−Ｃ３Ｆレセプターは多重エキソ ン遺伝子によりコードされると思われる。転写後の異なるｍＲＮＡスプライシン グ過程に関与することができ、かつ本発明によるｃＤＮＡと広範な同一性または 類似性をもつ交互ｍＲＮＡ構造体は、本発明の範囲に含まれるとみなされる。

蛋白質および同族体 本発明は前記に定める単離された組換え哺乳動物Ｇ−Ｃ３ＦＲポリペプチドを提 供する。単離されたＧ−Ｃ３ＦＲポリペプチドは他の天然または内在性汚染物質 を実質的に含まず、かつ調製過程での汚染蛋白質残渣の含量が質量で約１％以下 である。これらのポリペプチドは付随する天然のパターンのグリコジル化を場合 により伴わない。本発明の哺乳動物Ｇ−Ｃ３ＦＲには、たとえば霊長類、ヒト、 げっ歯頚、イヌ科動物、ネコ科動物、ウシ科動物、ヒツジ、ウマおよびブタＧ− ＣＳＦＲが含まれる。本発明の範囲に包含されるＧ−Ｃ３ＦＲ誘導体には、生物 活性を保持する一次蛋白質の種々の構造形態も含まれる。たとえばイオン化性の アミノ基およびカルボキシル基が存在するため、Ｇ−Ｃ３ＦＲ蛋白質は酸性塩も しくは塩基性塩の形であるか、または中性の形であってもよい。個々のアミノ酸 残基は酸化または還元により修飾されていてもよい。

−次アミノ酸構造体は他の化学物質部分、たとえばグリコジル基、脂質、ホスフ ェート、アセチル基などと共有性もしくは凝集性のコンジュゲートを形成するこ とにより、またはアミノ酸配列変異体を形成することにより、修飾されていても よい。共有結合誘導体は、特定の官能基をＧ−ＣＳＦＲアミノ酸側鎖またはＮ− もしくはＣ−末端に結合させることにより製造される。本発明の範囲に包含され る他のＧ−Ｃ５ＦＲ誘導体には、Ｇ−Ｃ５ＦＲまたはそのフラグメントと他の蛋 白質またはポリペプチドとの共有性もしくは凝集性のコンジュゲート、たとえば 組換え体培養においてＮ−末端またはＣ−末端融合物として合成されるものが含 まれる。たとえばコンジュゲートしたペプチドは、翻訳と同時または翻訳後に蛋 白質の移動をその合成部位から細胞膜または細胞壁の内側または外側にある機能 部位へ向ける、蛋白質Ｎ−末端領域のシグナル（またはリーダー）ポリペプチド 配列であってもよい（たとえば酵母α−因子リーダー）。Ｇ−Ｃ３ＦＲ蛋白質融 合物は、Ｇ−Ｃ５ＦＲの精製または同定を容易にするために添加されるペプチド からなるものであってもよい（たとえばポリ−Ｈ１ｓ）。Ｇ−Ｃ８Ｆレセプター のアミノ酸配列は、ペプチドＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ −Ａｓｐ−Ｌｙｓ　（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）に結合していてもよい（ホップ（Ｈ。

ｐｐ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６：１２０４，１９８８）ｏ後者の 配列は抗原性が高く、特異的モノクローナル抗体が可逆的に結合したエピトープ を提供し、発現した組換え蛋白質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にす る。この配列もＡｓｐ−Ｌｙｓ対合の直後の残基においてウシ粘膜エンテロキナ ーゼにより特異的に開裂する。このペプチドによりキャップされた融合蛋白質は 大腸菌における細胞内分解に対しても耐性であろう。

Ｇ−ＣＳＦＲ誘導体は免疫原として、レセプターに基づくイムノアッセイにおけ る試薬として、またはＧ−Ｃ３Ｆその他の結合リガンドのアフィニティ精製法の 結合剤としても使用しうる。同様にＧ−Ｃ５ＦＲ誘導体は架橋剤、たとえばＭ− マレイミドベンゾイルスクシンイミドエステルおよびＮ−ヒドロキシスクシンイ ミドを用いて、システィンおよびリジン残基において得られる。Ｇ−Ｃ３ＦＲ蛋 白質は反応性側鎖基により種々の不溶性支持体、たとえばシアノゲンブロミド活 性化、ビスオキシラン活性化、カルボニルジイミダゾール活性化もしくはトシル 活性化アガロース構造体に共有結合することができ、またはポリオレフィン表面 に吸着する（グルタルアルデヒド架橋により、または架橋なしに）。支持体に結 合させると、Ｇ−ＣＳＦＲを用いて抗Ｇ−Ｃ３ＦＲ抗体またはＧ−Ｃ３Ｆを選択 的に結合することができる（アッセイまたは精製のために）。

本発明は天然パターンのグリコジル化を伴うか、または伴わないＧ−ＣＳＦＲを も包含する。酵母または哺乳動物発現系、たとえばＣ０８−７細胞において発現 されたＧ−Ｃ３ＦＲは、発現系に応じて分子量およびグリコジル化パターンが天 然分子と類似するか、またはわずかに異なる。細菌、たとえば大腸菌におけるＧ −Ｃ３ＦＲＤＮＡの発現によれば非グリコジル化分子が得られる。グリコジル化 部位が不活化された哺乳動物Ｇ−Ｃ８ＦＲの機能性変異体同族体は、オリゴヌク レオチド合成およびリゲーションにより、または部位特異性の突然変異生成法に より形成しつる。これらの同族体蛋白質は酵母発現系を用いて均一な還元炭水化 物の形で良好な収率において形成しうる。真核細胞蛋白質のＮ−グリコジル化部 位はアミノ酸トリブレットＡｓｎ−Ａ、−Ｚを特色とし、ここでＡ１はＰｒ。

以外のいずれかのアミノ酸であり、ＺはＳｅｒまたはＴｈｒである。この配列に おいてアスパラギンは炭水化物の共有結合のための側鎖アミノ基を提供する。こ の部位はＡｓｎまたは残基Ｚを他のアミノ酸で置換することにより、Ａｓｎまた はＺを欠失することにより、またはＡ１とＺの間に非Ｚ−アミノ酸を、もしくは ＡｓｎとＡ１の間にＡｓｎ以外のアミノ酸を挿入することにより、排除しうる。

Ｇ−Ｃ８ＦＨ誘導体はＧ−Ｃ３ＦＲまたはそのサブユニットの突然変異によって も得られる。ここで述べるＧ−Ｃ３ＦＲ突然変異体はＧ−Ｃ８ＦＲと同族のポリ ペプチドであるが、欠失、挿入または置換のため天然Ｇ−Ｃ３ＦＲと異なるアミ ノ酸配列をもつものである。

Ｇ−Ｃ３ＦＲの生物学的同族体は、たとえば残基もしくは配列を種々に置換する ことにより、または生物活性に不必要な末端もしくは内部残基もしくは配列を欠 失することにより構成しつる。たとえば脂肪族アミノ酸残基、たとえばＩｌｅ、 Ｖａｌ、ＬｅｕもしくはＡｌａを相互に置換することができ、または極性アミノ 酸残基、たとえばＬｙｓとＡｒｇ、ＧｌｕとＡｓｐ、もしくはＧｌｕとＡｓｎを 相互に置換することができる。復元に際して誤った分子内ジスルフィド結合が形 成されるのを防止するために、システィン残基を欠失させるか、または他のアミ ノ酸と置換することもできる。突然変異形成のための他の方法は、ＫＥＸ２プロ テアーゼ活性が存在する酵母系における発現を増強するために隣接アミノ酸残基 の修飾を伴うものである。一般に置換は保守的に行うべきである：すなわち極め て好ましい置換アミノ酸は、置換される残基のものと類似する物理化学的特性を もつものである。同様に欠失または挿入法を適用する場合、生物活性に対する欠 失または挿入の潜在的影響を考慮すべきである。

Ｇ−Ｃ３ＦＨのサブユニットは末端もしくは内部残基もしくは配列を欠失するこ とにより構成しうる。特に好ましいサブユニットには、細胞培地中へのレセプタ ーの分泌を容易にするためにＧ−Ｃ８ＦＲの膜透過領域および細胞内ドメインを 欠失するか、または親水性残基で置換されたものが含まれる。得られた蛋白質は Ｇ−Ｃ５Ｆを結合する能力を保持した可溶性の、切断されたＧ−Ｃ８ＦＨ分子で ある。

同族体Ｇ−Ｃ３ＦＲの発現のために構成されたヌクレオチド配列の突然変異体は 、もちろんコード配列のリーディングフレーム相を保守しなければならず、また ハイブリダイズしてレセプターｍＲＮＡの翻訳に不都合な影響を与えると思われ る二次的ｍＲＮＡ構造、たとえばループまたはヘアピンを生成する可能性のある 相補的領域を形成しないことが好ましい。突然変異部位は予測しつるが、突然変 異自体の性質を予測する必要はない。たとえば特定の部位における突然変異の最 適特性を選択するために、ターゲットコドンにおいてランダムな突然変異生成を 行い、発現したＧ−Ｃ３ＦＲ突然変異体を目的活性に関してスクリーンすること ができる。

Ｇ−ＣＳＦＲをコードするヌクレオチド配列におけるすべての突然変異が最終産 物において発現されるわけではなく、たとえば発現を増強するために、主として 転写されたｍＲＮＡにおける二次的な構造ループを避けるために（欧州特許出願 公開第７５．．４４４号明細書、参考としてここに引用する）、または選ばれた 宿主によってより容易に翻訳されるコドン、たとえば大腸菌発現のための大腸菌 優先コドンを提供するために、ヌクレオチド置換を行うことができる。

突然変異は天然配列のフラグメントへのリゲーンヨンを可能にする制限部位によ りフランクされた突然変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することにより 、特定の遺伝子座に導入することができる。リゲーションののち、得られた再構 成配列は目的とするアミノ酸の挿入、１換または欠失を含む同族体をコードする 。

あるいはオリゴヌクレオチド指向一部位特異性突然変異生成法を用いて、目的と する置換、欠失または挿入に従って変化した特定のコドンを含む、変化した遺伝 子を提供することもできる。上記の変化をなすための方法の一例は、ワルダー′ 　（Ｗａｌｄｅｒ）ら（Ｇｅｎｅ　４２：１３３．１９８６）：バラエル（Ｂａ ｕｅｒ）ら（Ｇｅｎｅ　３７：７３．１９８５）；クレイク（Ｃｒａｉｋ）（Ｂ ｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９８５年１月、１２−１９）ニスミス（Ｓｍｉｔ ｈ）ら（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａ ｎｄＭｅｔｈｏｄｓ、プレナム・プレス、１９８１）に記載され：ならびに米国 特許第４．５１８．５８４および４．７３７．４６２号明細書に適切な方法が示 されており、これらをここに参考として引用する。

本発明は、哺乳動物、微生物、ウィルスまたは足止の遺伝子に由来する適切な転 写または翻訳調節要素にオペラブル結合した（ｏｐｅｒａｂｌｙ　１１ｎｋｅｄ ）、哺乳動物Ｇ−Ｃ５ＦＲをコードする合成もしくはｃＤＮＡ由来のＤ　Ｎ　Ａ フラグメントまたは生物学的に均等な同族体を含む、組換え発現ベクターを提供 する。これらの調節要素には後に詳述するように転写プロモーター、転写を調節 する任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリポソーム結合部位をコードする 配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が含まれる。通常は複製原 点により与えられる、宿主における複製能、および形質転換体の認識を容易にす る選択遺伝子がさらに含まれていてもよい。ＤＮＡ領域は、互いに機能的に関連 する場合はオペラブル結合している。たとえばシグナルペプチドに関するＤＮＡ （分泌リーダー）は、ポリペプチドの分泌に関与する前駆物質として発現する場 合、そのポリペプチドに対するＤＮＡにオペラブル結合しており：プロモーター は、コード配列の転写を制御する場合、そのコード配列にオペラブル結合してお り、またはリポソーム結合部位は、コード配列が翻訳を可能にする位置にある場 合、そのコード配列にオペラブル結合している。一般にオペラブル結合とは、連 続的であること、および分泌リーダーの場合は連続的でありかつリーディングフ レーム内にあることを意味する。

微生物において発現すべき哺乳動物Ｇ−Ｃ８ＦレセプターをコードするＤＮＡ配 列は、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写を早期に終結する可能性のあるイントロンを 含まないことが好ましい、しかし転写の早期終結は、たとえばその結果有利なＣ −末端切断、たとえば細胞膜に結合しない可溶性レセプターを生成する膜透過領 域の欠失を含む突然変異体が生じる場合は望ましい。コード縮重のため、同一ア ミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にはかなりの変動がある可能性がある 。他の形態には、適度にストリンジェントな条件下で（５０℃、２ＸＳＳＣ）与 えられたｃＤＮＡ配列にハイブリダイズしつる配列、および生物活性Ｇ−Ｃ８Ｆ レセプターポリペプチドをコードする配列にハイブリダイズまたはデインエネレ ートしつる他の配列が含まれる。

形質転換した宿主細胞は、組換えＤＮＡ法により構成されたＧ−Ｃ５ＦＲベクタ ーで形質転換またはトランスフェクトされた細胞である。形質転換した宿主細胞 は、通常はＧ−Ｃ５ＦＲを発現するが、Ｇ−Ｃ３ＦＲＤＮＡのクローニングまた は増幅のために形質転換された宿主細胞はＧ−Ｃ３ＦＲを発現する必要はない。

発現した（、−Ｃ８ＦＲは、選ばれたＧ−Ｃ５ＦＲ，ＤＮＡに応じて細胞膜に付 着するか、または培養上澄液中へ分泌されるであろう。哺乳動物Ｇ−Ｃ５ＦＲの 発瑣に適した宿主細胞には、適宜なプロモーターの制御下にある原核細胞、酵母 またはより高等な真核細胞が含まれる。原核細胞には、グラム陰性またはグラム 陽性生物、たとえば大腸菌またはバチルスが含まれる。より高等な真核細胞には 、後記の哺乳動物由来の株細胞が含まれる。本発明のＤＮＡ構造体に由来するＲ ＮＡを用いて哺乳動物Ｇ−Ｃ３ＦＲを調製するために、無細胞翻訳系を用いるこ ともできる。細菌、菌類、酵母および哺乳動物細胞性宿主と共に用いるのに適し たクローニングおよび発現ベクターはパウェルズ（Ｐｏｕｗｅｌｓ）ら（Ｃｌｏ ｎｉｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、エルゼ ビル、ニューヨーク、１９８５）に記載されており、その関連する記述をここに 参考として引用する。

原核細胞発現宿主は、著しい蛋白質分解およびジスルフィド処理を必要としない Ｇ−ＣＳＦＲの発現に使用しつる。原核細胞発現ベクターは一般に１または２以 上の表現型の選択性マーカー、たとえば抗生物質耐性を付与するか、または独立 栄養要求性を供給する蛋白質をコードする遺伝子、および宿主内での増幅を保証 するために宿主により認識される複製原点を含む。形質転換に適した原核細胞に は、大腸菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｊｓ）、ネズミチフス菌 （Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ならびにシュードモナス 属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）　、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ ｅｓ）およびスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）内の多様 な菌種が含まれるが、他を特に用いることもできる。

細菌用として有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２ （ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝要素からなる市販のプラスミドに由来する選択性 マーカーおよび細菌性複製原点を含む。これら市販のベクターには、たとえばｐ ＫＫ２２３−３　（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ、スウェーデン、ウプ サラ）およびｐＧＥＭｌ　（プロメガ・バイオチク、米国ウィスコンシン州マデ ィソン）およびｐＣＡｖ／ＮｏＴ（ＡＴＣＣ受理Ｎｏ、６８０１４）が含まれる 。

これらのｐＢＲ３２２“主鎖”セクションを適宜なプロモーターおよび発現すべ き構造配列と結合させる。大腸菌は一般に大腸菌種に由来するプラスミド、ｐＢ Ｒ３２２の誘導体を用いて形質転換される（ポリパル（Ｂｏｌｉｖａｒ）ら、Ｇ ｅｎｅ　２：９５．１９７７）、ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイ クリン耐性に対する遺伝子を含み、従って形質転換した細胞を同定するための簡 単な手段を提供する。

組換え微生物発現ベクターに一般に用いられるプロモーターには、β−ラクタマ ーゼ（ベニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（チャン（Ｃｈａｎｇ ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　２７５：６１５，１９７８；およびゲラデル（Ｇｏｅｄｄ ｅＪ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　２８１：５４４，１９７９）、トリプトファン（ｔｒ ｐ）プロモーター系（ゲラデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）ら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓＲ ｅｓ、８：４０５７．１９８０および欧州特許出願公開第３６，７７６号明細書 ）およびｔａｃプロモーター（マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｍｏ１ｅｃｕ ｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、：７−ル ド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、ｐ、４１２．１９８２）が含まれる 。特に有用な細菌発現系は、ファージλＰＬプロモーターおよびｃ１８５７ｔＳ 温度不安定リプレッサーを用いる。λＰＬプロモーターの誘導体を取り込むアメ リカン・タイプ・カルチャー・コレクションから得られるプラスミドベクターに は、大腸菌株ＪＭＢ９　（ＡＴＣＣ３７０９２）のレジデントであるプラスミド ｐＨＵＢ２、および大腸菌ＲＰＩ（ＡＴＣＣ５３０８２）のレジデントであるプ ラスミドｐｐＰＬｃ２８が含まれる。

組換えＧ−Ｃ３ＦＲ蛋白質は、好ましくはサツカロミセスＩｊＥ（Ｓａｃｃｈａ ｒｏｍｙｃｅｓ）菌種からの酵母宿主、たとえば麦酒酵母菌においても発現しう る。

他の属の酵母、たとえばピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）またはクルイベロミセス属（ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）の酵母も使用しうる。酵母ベクターは一般に２μ 酵母プラスミドからの複製原点または自己複製配列（ＡＲ３）　、プロモーター 、Ｇ−Ｃ３ＦＲをコードするＤＮＡ、ポリアデニル化および転写終結のための配 列、ならびに選択遺伝子を含む。好ましくは酵母ベクターは複製原点、ならびに 酵母および大腸菌の双方を形質転換しつる選択性マーカー、たとえば大腸菌のア ンビンリン耐性遺伝子および麦酒酵母菌ｔｒｐｌ遺伝子（トリプトファン中での 増殖能を欠如する突然変異酵母株に対する選択マーカーを提供する）、ならびに 下流の構造配列の転写を誘導するための高度に発現する酵母遺伝子に由来するプ ロモーターを含む。その際、宿主細胞酵母ゲノム中にｔｒｐｌ障害があると、ト リプトファンの不在下で増殖させることにより形質転換を検出するために有効な 環境が提供される。

酵母ベクターにおける適切なプロモーター配列には、下記のものに対するプロモ ーターが含まれる：メタロチオネイン、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ヒッ ツェマン（Ｈｉ　ｔｚｅｍａｎ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５５：２０７ ３゜１９８０）または他の解糖酵素（ヘス（Ｈｅｓｓ）ら、Ｊ、Ａｄｖ、Ｅｎｚ ｙｍｅ　Ｒｅｇ、７：１４９，１９６８；およびホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）ら 、Ｂｆｏｃｈｅｍ−１７：４９００，１９７８）、たとえばエノラーゼ、グリセ ルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベー トデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェー トイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリ オースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコ キナーゼ。酵母における発現に用いるのに適したベクターおよびプロモーターは さらにヒッツェマンらの欧州特許出願公開第７３，６５７号明細書に記載される 。

好ましい酵母ベクターは、大腸菌における選択および複製のためのｐＢＲ３２２ からのＤＮＡ配列（Ａｍｐ’遺伝子および複製原点）、ならびにグルコース抑制 性ＡＤＨ２プロモーターおよびα−因子分泌リーダーを含む酵母ＤＮＡ配列を用 いて組み立てることができる。ＡＤＨ２プロモーターはルセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ ）ら（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５８：２６７４，１９８２）およびバイエル （Ｂｅｉｅｒ）ら（Ｎａｔｕｒｅ　３００ニア２４，１９８２）により報告され ている。異種蛋白質の分泌を指令する酵母α−因子リーダーは、プロモーターと 発現すべき構造遺伝子との間に挿入することができる。たとえばクルシャン（Ｋ ｕｒｊａｎ）ら、Ｃｅ１ｌ　３０：９３３，１９８２；およびビター（Ｂｉｔｔ ｅｒ）　ら、Ｐｒｏ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８１：５３３０゜ １９８４を参照されたい。リーダー配列は、異種遺伝子へのリーダー配列の融合 を容易にするのに有用な制限部位１または２以上をその３′末端に含むべく修飾 することができる。

適切な酵母形質転換プロトコールは当業者に知られている：その方法の一例はヒ ネン（Ｈｉｎｎｅｎ）ら、Ｐｒｏ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７５ ：１９２９．１９７８に記載されており、０．６７％酵母窒素ベース、０，５％ カザミノ酸、２％グルコース、１０μｇ／ｍＩアデニンおよび２０μｇ／ｍｌウ ラシルよりなる選択培地中でＴｒｐ“形質転換体を選択するものである。

ＡＤＨ２プロモーターを含むベクターにより形質転換された宿主菌株を発現のた めに、８０μｇ／ｍｌアデニンおよび８０μｇ／ｍｌウラシルを補給した１％酵 母エキス、２％ペプトンおよび１％グルコースよりなる富化培地中で増殖させる ことができる。培地のグルコースが消費された時点でＡＤＨ２プロモーターの抑 制解除が起こる。粗製の酵母上澄液を濾過により採取し、後続の精製の前に４℃ に保持する。

種々の哺乳動物または昆虫細胞培養系を用いて組換え蛋白質を発現させることが できる。昆虫細胞において異種蛋白質を産生ずるためのバキュロウィルス（Ｂａ ｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）系は、ラッコウおよびサマーズ（Ｌｕｃｋｏｗ、Ｓｕｍｍ ｅｒｓ）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６：４７　（１９８８）に解説され ている。適切な哺乳動物宿主細胞系列の例には、グルラマン（Ｇｌｕｚｍａｎ） （Ｃｅ　Ｉ　１　２３　：１７５，１９８１）により記載されたモンキー腎細胞 のＣＯ５−７系列、ならびにたとえばＬ細胞、Ｃ１２７，３Ｔ３、チャイニーズ ハムスター卵巣（ＣＨＯ）　、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞系列を含めた、適宜な ベクターを発現しつる他の細胞系列が含まれる。哺乳動物発現ベクターは非転写 要素、たとえば発現すべき遺伝子に結合した複製原点、適切なプロモーターおよ びエンハンサー、ならびに他の５′または３′側フランキング非転写配列、なら びに５′または３′側非翻訳配列、たとえば必要なリポソーム結合部位、ポリア デニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプタ一部位、ならびに転写終結配 列を含みつる。

を椎動物細胞の形質転換に用いられる発現ベクター中の転写および翻訳制御配列 はウィルス源から供給されてもよい。たとえば一般的に用いられるプロモーター およびエンハンサ−はポリオーマ、アデノウィルス２、シミアンウィルス４０（ ＳＶ４０）およびヒトサイトメガロウィルスに由来する。ＳＶ４０ウィルスゲノ ムに由来するＤＮＡ配列、たとえばＳＶ４０原点、初期（ｅ　ａ　ｒ　ｌ　ｙ） および後期（ｌａｔｅ）プロモーター、エンハンサ−、スプライスならびにポリ アデニル化部位を用いて、異種ＤＮＡ配列の発現に必要な他の遺伝要素を得るこ とができる。初期および後期プロモーターは共に、ＳＶ４０ウィルス複製原点を も含むフラグメントとしてこのウィルスから容易に得られるので、特に有用であ る（ファイヤーズ（Ｆｉｅｒｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　２７３：１１３，１９７８ ）、これより小さいか、または大きいＳＶ４０フラグメントも、ＨｉｎｄＩＩＩ 部位からウィルス複製原点に位置するＢｇｌＩ部位へ向かりて伸びた約２５０ｂ ｐの配列が含まれる限り使用しうる。さらに哺乳動物ゲノムＧ−Ｃ３ＦＲプロモ ーター、制御および／またはシグナル配列も、これらの制御配列が選ばれた宿主 細胞と親和性である限り使用しうる。組換え哺乳動物Ｇ−Ｃ５Ｆレセプターを産 生ずるために哺乳動物の高発現ベクターを使用することに関する詳細は、さらに 後記実施例２に示される。ベクターはたとえばオカヤマおよびバーブ（Ｏｋａｙ ａｍａ。

Ｂｅｒｇ）（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、３：２８０，１９８３）の記載に従 って構成しつる。

Ｃ１２７ネズミ乳房上皮細胞における哺乳動物レセプターｃＤＮＡの安定な高水 準発現に有用な系は実質的にコスマン（Ｃｏｓｍａｎ）ら（Ｍｏ１．Ｉｍｍｕｎ ｏｌ、２３：９３５．１９８６）の記載に従って構成しつる。

Ｇ−Ｃ３ＦＲＤＮＡの発現に特に好ましい真核細胞ベクターは、後記実施例２に 示される。ｐＣＡＶ／ＮＯＴと呼ばれるこのベクターは哺乳動物の高発現べフタ −ｐＤｃ２０１に由来し、ＳＶ４０、アデノウィルス２およびヒトサイトメガロ ウィルスからの調節配列を含む。

精製された哺乳動物Ｇ−Ｃ３Ｆレセプターまたは同族体は、本発明のＤＮＡ組換 え翻訳産生物を発現するのに適した宿主／ベクター系を培養し、次いでそれらを 培地または細胞抽出物から精製することにより調製される。

たとえば組換え蛋白質を培地中へ分泌する系からの上澄液をまず、市販の蛋白質 濃縮フィルター、たとえばアミコンまたはミリポア・ベリコン限外濾過ユニット により濃縮することができる。濃縮工程ののち、濃縮物を適切な精製用マトリッ クスに付与することができる。たとえば適切なアフィニティマトリックスは、適 切な支持体に結合したＧ−Ｃ３Ｆまたはレクチンまたは抗体分子からなる。ある いはアニオン交換樹脂、たとえばペンダントジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ） 基を含むマトリックスまたは支持体を用いることができる。マトリックスは蛋白 質精製に一般に用いられるアクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロ ースまたは他の種類のものである。あるいはカチオン交換工程を採用しうる。適 切なカチオン交換体には、スルホプロピルまたはカルボキンメチル基を含む種々 の不溶性マトリックスが含まれる。スルホプロピル基が好ましい。

最後に、１または２以上の逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ ）工程（疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒質、たとえばメチルその他の脂肪族ペンダント 基を含むシリカゲルを使用）を用いて、Ｇ−Ｃ３ＦＨ組成物をさらに精製するこ とができる。以上の精製工程の若干またはすべてを多様に組み合わせて、均質な 組換え蛋白質を得ることができる。

細菌培養において産生された組換え蛋白質は、通常は細胞ベレットからの初期抽 出、次いで濃縮、塩析、水性イオン交換またはサイズエクスクル−ジョンクロマ トグラフィ一工程のうち１または２以上により単離される。最後に高性能液体ク ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製工程に採用しつる。組換え哺乳動物Ｇ −Ｃ５ＦＲの発現に用いた微生物細胞は凍結−融解の反復、ソニケーション、機 械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含めたいずれか好都合な方法により破壊す ることができる。

哺乳動物Ｇ−Ｃ３ＦＲを分泌蛋白質として発現する酵母の発酵により、精製が大 幅に簡略化される。大規模発酵により得られる分泌された組換え蛋白質は、ウル ダル（Ｕｒｄａｌ）ら（Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ、２９６：１７１．１９８４） により示されるものと同様な方法によって精製しうる。この参考文献は組換えヒ トＧＭ−Ｃ３Ｆを調製用ＨＰＬＣカラムで精製するための連続した２工程逆相Ｈ ＰＬＣを記載している。

組換え培養において合成されたヒトＧ−ＣＳＦＲは、培養物からヒトＧ−Ｃ３Ｆ Ｒを回収するために採用した精製工程に応じた量および特性をもつ、蛋白質を含 めた非ヒト細胞成分が存在することを特色とする。これらの成分は通常は酵母、 原核細胞または非ヒト高等真核細胞に由来するものであり、１重量％以下程度の 無害な汚染量で存在する。さらに組換え細胞培養によって、普通はその起源とな る種、たとえば細胞、細胞浸出物または体液において自然界でＧ−Ｃ３ＦＨに付 随する可能性のある蛋白質を含まないＧ−Ｃ３ＦＲの産生が可能となる。

目的とする純度をもつＧ−Ｃ５ＦＲを生理学的に許容しうるキャリヤーと混合す ることにより、投与用のＧ−Ｃ３ＦＨ組成物が調製される。これらのキャリヤー は用いられる用量および濃度において受容者に無毒なものである。通常はこれら の組成物の調製は、Ｇ−Ｃ５ＦＲを緩衝剤、酸化防止剤、たとえばアスコルビン 酸、低分子量（約１０残基以下）ポリペプチド、蛋白質、アミノ酸、炭水化物（ グルコース、蔗糖またはデキストリンを含む）、キレート剤、たとえばＥＤＴＡ 、グルタチオン、ならびに他の安定剤および賦形剤と混和することを伴う。

Ｇ−ＣＳＦＲ組成物はＧ−Ｃ５Ｆ媒介による免疫反応を弱めるために使用しつる 。これらの結果を達成するためには、療法上有効な量のＧ−ＣＳＦＲ組成物を薬 剤用キャリヤーまたは希釈剤と共に哺乳動物、好ましくはヒトに投与する。

以下の実施例は説明のために提示され、限定のためのものではない。

実施例 実施例１ 結合アッセイ Ａ、Ｇ−Ｃ５Ｆの放射性標識。　Ｎ−末端に親水性オクタペプチドを含む融合蛋 白質の形の組換えヒトＧ−Ｃ３Ｆを酵母において分泌蛋白質として発現させ、ア フィニティクロマトグラフィーにより精製した（ホップ（Ｈｏｐｐ）ら、Ｂｉｏ ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６：１２０４，１９８８の記載に従う）。蛋白質を市 販の固相試薬１０ＤＯ−ＧＥＮ　（パース）により放射性標識した。この方法で は５μｇのｌ０ＤＯ−ＧＥＮを１０１０Ｘ７５のガラス製試験管の底に装入し、 ７５μｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７，４）および２０μＩ　（２ｍＣ ｉ）のＮａ１２５Ｉと共に４℃で２０分間インキュベートした。次いでこの溶液 を４５μ］、ＰＢＳ中の５μｇ　Ｇ−Ｃ３Ｆを入れた第２のガラス製試験管に移 した１４℃、２０分間。反応混合物を、２．５％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミン （ＢＳＡ）、０．２％（ｗ／ｖ）ナトリウムアジドおよび２０ｍＭへペス、ｐＨ ７，４（結合媒質）を含有するロスウェル・パーク・メモリアル・インスティチ ュート（ＲＰＭＩ）１６４０媒質で平衡化したベッド容量２ｍｌのセファデック スＧ−２５（シグマ）上でのゲル濾過により分画した。”５Ｉ−Ｇ−ＣＳＦの最 終プールを結合媒質中ｌＸｌ０−’Ｍの作業原液に希釈し、検出しうる程度のレ セプター結合活性損失なしに４℃で最高１力月間保存した。比放射能は常にｌＸ ｌ０”Ｃｐｍ／ｍｍｏｌ　Ｇ−Ｃ３Ｆである。放射性標識Ｇ−Ｃ３Ｆは下記によ りＧ−ＣＳＦレセプターのアッセイに用いられる。

Ｂ　膜結合アッセイ。　ヒト胎盤膜を、結合媒質中の１２ｓＩ−Ｇ−Ｃ８Ｆ、０ ゜１％バシトラシン、０６０２％アプロチニンおよび０．　４％ＢＳＡ　（全容 量１゜２ｍ１）と共に４℃で２時間インキュベートした。さらに１００×モル過 剰の非標識Ｇ−ＣＳＦを含有する対照試験管を同様にインキュベートし、非特異 的結合を測定した。次いで反応混合物を１５．ＯＯＯｘｇでミクロ遠心機により ５分間遠心分離した。上澄液を廃棄し、膜ペレットの表面を水冷した結合媒質で 慎重にすすぎ、放射能をガンマ線計数器により計数した。このアッセイ法により 、実施例２のＣＯ８細胞上澄液中に存在するＧ−Ｃ３ＦＲは約Ｉ　Ｘ　１０９Ｍ −’のに、および約３５ｋＤａの分子量をもつと判定された。

Ｃ１固相結合アッセイ。　Ｇ−Ｃ３ＦＲがなおＧ−Ｃ３Ｆ結合活性を保持するヒ ト細胞の界面活性剤抽出液からニトロセルロースに安定に吸着されうろことによ り、Ｇ−Ｃ５ＦＲの検出手段が得られた。細胞抽出液は、１％トライトンＸ−１ ００およびプロテアーゼ抑制剤カクテル（２ｍＭフェニルメチルスルホニルフル オリド、１０ＭＭペプスタチン、１０ＭＭロイペプチン、２ｍＭ　Ｏ−フェナン トロリンおよび２ｍＭ　ＥＧＴＡ）を含有する２×容量のＰＢＳと細胞ベレット を激しい渦式撹拌により混合することによって調製された。混合物を氷上で３０ 分間インキュベートしたのち、１２．０００×ｇで８℃において１５分間遠心分 離し、核その他の残層を除去した。２μｍアリコートの細胞抽出液を乾燥ＢＡ８ ５／２１ニトロセルロース膜（シュライヘル・アンド・シュル、ニューノ＼ンブ シャー州キーン）に乗せ、乾燥させた。組織培養皿中の３％　ｗ／ｖ　ＢＳＡを 含有するトリス（０，０５Ｍ）緩衝食塩液（０，１５Ｍ）ｐＨ７，５、中で、膜 を３０分間インキュベートし、非特異的結合部位をブロックした。次いで膜をＰ ＢＳ＋３％ＢＳＡ中の０．３μＭ　”Ｉ−Ｇ−Ｃ５Ｆで覆い、振盪しながら４℃ で２時間インキュベートした。この期間の終了した時点で、膜をＰＢＳ中で３回 洗浄し、コダックＸ−ＯｍａｔＡＲフィルムに一７０℃で１８時間乗せた。

このアッセイを行って、種々の細胞系列および組織源においてＧ−Ｃ８ＦＲの存 在を検出した。

Ｄ、可溶性Ｇ−Ｃ３ＦＲの結合アッセイ。　ＣＯ５−７細胞上澄液中に存在する 可溶性Ｇ−Ｃ３ＦＲを、Ｇ−Ｃ８Ｆ依存性細胞系列、またはＧ−Ｃ３Ｆレセプタ ーを発現する他のいずれかのヒト細胞もしくは細胞系列、たとえばヒト胎盤細胞 への”１−Ｇ−Ｃ３Ｆ結合の抑制により測定した。トランスフェクションの３日 ｔｉ：ＣＯ３−７細胞から上ｆｆｉ液を採取し、１１濃縮り、、”Ｉ−（、−Ｃ ３Ｆと共に３７℃で１時間、予備インキュベートした。適宜なＧ−ＣＳ　Ｆレセ プター保有細胞を添加して最終容量１５０μｍとなし、３７℃でさらに３０分間 インキュベートし、パーク（Ｐａ、ｒｋ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６１ ：４１７７　（１９８６）の記載に従ってアッセイおよび分析した。

実施例２ 種々のヒト細胞系列および組織を、Ｇ−ＣＳＦＨの発現に関して上記の実施例Ｉ Ａの記載に従つて調製した！２５７標識Ｇ−Ｃ３Ｆに対するそれらの結合能に基 づいてスクリーニングすることにより、Ｇ−Ｃ９ＦＲの組織源を選択した。ヒト 胎磐膜は妥当な数のレセプターを発現することが見出された。平衡結合試験が実 施例ＩＢに従って行われ、この膜がレセプター〇、４ｐｍｏｌ／蛋白質ｍｇとい う高いアフィニティ部位（Ｋ、＝　４　ｘ　１０９Ｍ″１）による＋２５１−Ｇ −Ｃ８Ｆの２相結合を呈することが示された。

ヒト胎盤組織から抽出した全Ｒ，ＮＡより単離したポリアデニル化ｍＲＮＡの逆 転写により、サイズ不定の（ｕｎｓ　ｉ　ｚｅｄ）ｃＤＮＡライブラリーを構成 した（オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｓｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、１．１９８７）６組繊 細胞をグアニジニウムイソチオシアネート溶液中で溶解することにより採取し、 全ＲＮＡをマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ ｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（−１−ルド・スプリング・ ハーバ−・ラボラトリ−，１９８２）に記載の標準法により単離した。

ポリアデニル化ＲＮＡをオリゴｄＴセルロースクロマトグラフィーにより単離し 、ガブラーおよびホフｖン（Ｇｕｂｌｅｒ、Ｈｏｆｆｍａｎ）、Ｇｅｎｅ　２５ ：２６３，１９８３のものと同様な方法で２重鎖ｃＤＮＡを調製した。すなわち オリゴｄＴをプライマーとして用いて、逆転写酵素によりポリアデニル化ＲＮＡ をＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドに変換した。次いでＲＮＡアーゼＨをＤＮＡポ リメラーゼＩと共に用いて、このＲＮＡ−（、ＤＮＡハイブリッドを２重鎖ｃＤ ＮＡに変換した。得られた２重鎖ｃＤＮＡをＴ４　ＤＮＡポリメラーゼによりプ ラント末端となした。得られたプラント末端ｃＤＮＡの５′末端に、ヘイマール （Ｈａ　ｙｍｅ　ｒ　］　ｅ）ら、Ｎｕｃｌｅａｒ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒ ｃｈ、１４：８６１５．１９８６の記載に従ってＢｇｌＩＩアダプターをリゲー トした。

リゲートしていないアダプターを６８℃でゲル濾過クロマトグラフィーにより除 去したところ、ｃＤＮＡ上に２４ヌクレオチドの非−自己相補性オーバーハング が残された。同じ方法を用いて哺乳動物発現ベクターｐ　ｓ　ｆ　ＣＡＶの５′ 側ＢｇＩＩＩ末端を、ｃＤＮＡに付加されたものに相補的な２４ヌクレオチドオ ーバーハングに変換した。最適割合のアダプター付きベクターおよびｃＤＮＡを Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼの存在下でリゲートした。透析したリゲーション 混合物を大腸菌株ＤＨ５ａ中へエレクトロポレートしくｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａ ｔｅ）、形質転換体をアンピシリン平板上で選択した。

得られたｃＤＮＡを真核細胞発現ベクターｐｓｆＣＡＶ中ヘリゲートした。これ は、哺乳動物細胞中へトランスフェクトされた場合にその多重クローニング部位 に挿入されたｃＤＮＡ配列を発現すべく設計されている。ｐ　ｓ　ｆ　ＣＡＶは ｐＤＣ２０１（ｐＭＬＳＶの誘導体、先にコスーｒン（Ｃｏｓｍａｎ）らにより 記載。

Ｎａｔｕｒｅ　３１２ニア６８，１９８４）、ＳＶ４０およびサイトメガロウィ ルスＤＮＡから組み立てられ、複製原点から転写方向へ順次下記よりなる＝　（ １）ＳＶ４０配列：複製原点、エンハンサ−配列、ならびに初期および後期プロ モーターを含むコオーディネート（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ）５１７１−５２７０ からのもの；　（２）サイトメガロウィルス配列：プロモーター領域およびエン ハンサ−領域を含む（ベヒャルト（Ｂｏｅｃｈａｒｔ）ら（Ｃｅ　ｌ　ｌ　４１ 　：　５２１゜１９８５）により公表された配列からのヌクレオチド６７１から ＋６３まで）；（３）アデノウィルス−２配列ニトリバータイトリーダー（ｔｒ ｉｐａｒｔｉｔｅ　１ｅａｄｅｒ、ＴＰＬ）のモーター後期プロモーターおよび 第１エキソンに対する配列を含むコオーディネート５７７９−６０７９からのも の、ＴＰＬの第２エキソンおよび第３エキソンの一部ならびにＸｈｏＩ、Ｋｐｎ Ｌ　Ｓｍａ　ＩおよびＢｇｌｌに対する部位を含む多重クローニング部位（ＭＣ ３）を含むコオーディネート７１０１−７１７２および９６３４−９６９３から のもノ：（４）ＳＶ４０配列：初期転写の多重ポリアデニル化および終止シグナ ルを含むコオーディネート４１２７−４１００および２７７０−２５３３からの もの、（５）アデノウィルス配列：ｐＤＣ２０１のウィルス付随ＲＮＡ遺伝子Ｖ ＡＩおよびＶＡＩＩのコオーディネート１０５３２−１１１５６からのもの；な らびに（６）ｐＢＲ３２２配列：アンビシリン耐性遺伝子および複製原点を含む コオーディネート４３６３−２４８６および１０９４−３７５からのもの。

得られた５ｆＣＡＶ中のヒト胎ｆｉｃＤＮＡライブラリーを用いて大腸菌株ＤＨ ５αを形質転換し、組換え体を平板培養して、平板当たり約５００−６００コロ ニー、およびスクリーン当たり約３０，０００の総コロニーを供給するのに十分 な平板を得た。コロニーを各平板から掻き取り、プールし、各プールからプラス ミドＤＮＡを調製した。次いでプールしたＤＮＡを用い、ルスマン（Ｌｕｔｈｍ ａｎ）ら、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１１：１２９５　（１９８３）および マツカッチャン（ＭｃＣｕｔｃｈａｎ）ら、Ｊ、Ｎａｔ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ ｔ。

４１　：３５１　（１９８６）の記載に従って、ＤＥＡＥ−デキストランの使用 、続いてクロロキン処理により、サブコンフルエント（ｓｕｂ−ｃｏｎｆｌｕｅ ｎｔ）層のモンキーＣＯ５−７細胞をトランスフェクトした。次いで細胞を３日 間培養増殖させ、挿入配列を一過性発現させた。３日後に細胞培養上澄液を廃棄 し、各平板の細胞単一層をＧ−Ｃ３Ｆ結合につき下記によりアッセイした。１． 　２Ｘ１０−１１Ｍの１２５１−標識フラグ（ｆ　１　ａｇ）−Ｇ−Ｃ５Ｆを含 有する結合媒質３ｍｌを各平板に添加し、平板を４℃で１２０分間インキュベー トした。次いで媒質を廃棄し、各平板を低温の結合媒質（標識Ｇ−Ｃ８Ｆを含有 しない）で１回、低温のＰＢＳで２回洗浄した。次いで各平板の縁を破壊して平 坦なディスクを残し、これを増強スクリーンを用いて一７０℃で７２時間、Ｘ線 フィルムと接触させた。

Ｇ−Ｃ３Ｆ活性は露光フィルム上に比較的均一なバックグラウンドに対して暗い スポットとして見えた。

この方法でライブラリーからの約３０．０００の組換え体をスクリーニングした のち、形質転換体の９プールがＧ−ＣＳ　Ｆ結合点（ｂｉｎｄｉｎｇ　ｆｏｃｉ ）を備えていることが観察され、これらはバックグラウンド露光に対比して明瞭 に認められた。

次いで陽性プールからの細菌の凍結ストックを用いて、約６０コロニーの平板を 得た。ニトロセルロースフィルター上にこれらの平板のレプリカを作成し、次い で平板を掻き取り、プラスミドＤＮＡを調製し、前記に従ってトランスフェクト し、陽性平板を同定した。この平板のニトロセルロースレプリカより得た個々の コロニーからの細菌を０．２ｍｌの培養液中で増殖させ、これを用いてプラスミ ドＤＮＡを得た。次いでこのプラスミドＤＮＡを前記に従ってＣＯ５−７細胞中 へトランスフェクトした。この方法により、ＣｏＳ細胞中でＧ−ＣＳ　Ｆ発現を 誘導しつる単一クローンであるクローンＤ−７を単離した。発現ベクター９ＣＡ Ｖ／ＮＯＴ　（ｐＤｃ３０２）中のこのＧ−Ｃ５ＦＲｃＤＮＡクローンで形質転 換された細菌のグリセリンストックは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ クシヨン（米ＩＥＩＭＤ２０８５２．ロックフィル、パークローン・ドライブ１ ２３０１）に受理番号６８１０２において寄託されている。

Ｇ−Ｃ８ＦＲをコードする他のｃＤＮＡクローンを同じ胎盤ライブラリーから単 離した。胎盤ｃＤＮＡライブラリーからの組換え体を大腸菌株ＤＨ５α上にプレ ートし、アンピンリン平板上で形質転換体を選択した。形質転換はヒトＧ−Ｃ３ ＦＲクローンＤ−７から調製された３２ｐ標識プローブを用いて高ストリンジェ ーンシー条件下で（６３℃、０．２ＸＳＳＣ）プラクハイブリダイゼーション法 によりスクリーニングされた。ハイブリダイズするクローン（クローン２５−１ ）を単離した。これはヌクレオチド２４１１の後にイントロン挿入配列を含み、 図６のヌクレオチド２４１２−２８３２を付加し、その結果リーディングフレー ムが変化し、これに対応してアミノ酸配列が変化している点以外は、クローンＤ −７に等しい。クローン２５−１の３′側ヌクレオチド配列および予想Ｃ−末端 アミノ酸配列を図６に示す。

実施例３ 可溶性ヒトＧ−Ｃ３ＦＲをコードするｃＤＮＡの構成可溶性ヒトＧ−Ｃ８ＦＲを 、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により前記の哺乳動物発現ベクターｐＤｃ ３０２中ヘクローン化した。下記のプライマーを用いた： ３′末端プライマー 従ってＰＣＴ産生物は５′末端および３′末端にそれぞれＡｓｐ７１８およびＢ ｇｌｌｌ制限部位を含む。これらの制限部位はｐＤｃ３０２中へのクローン化に 用いられる。３′側配列は図２〜５に示した配列に対してアンチセンスである。

ＰＣＲ反応のための鋳型は、Ｇ−ＣＳＦＲを含む前記のクローン２５−１である 。

次いでＧ−ＣＳＦＲをコードするＤＮＡ配列を、実質的にイニス（Ｉ　ｎｎ　ｉ 　ｓ）ら編、ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄ ｓａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（アカデミツク・プレス、１９９０）に記 載のＰＣＲにより増幅させた。次いで得られた増幅クローンを単離し、ｐＤｃ３ ０２中ヘリゲートし、前記に従ってモンキーＣ０８−７細胞において発現させた 。

実施例４ Ｇ−Ｃ３ＦＲに対するモノクローナル抗体の調製精製した組換えＧ−Ｃ３ＦＲ， たとえばヒトＧ−Ｃ３ＦＲの調製物、または高水準のＧ−ＣＳＦＲを発現するト ランスフェクトしたＣＯ８細胞を用いて、常法、たとえば米国特許第４．４１１ ．．９９３号明細書に記載の方法によりＧ−Ｃ８ＦＲに対するモノクローナル抗 体を形成した。これらの抗体はＧ−Ｃ３Ｆの毒作用その他の望ましくない作用を 改善する際にＧ−Ｃ８ＦレセプターへのＧ−Ｃ８Ｆの結合を阻害するのに、また はＧ−Ｃ３Ｆもしくは可溶性Ｇ−Ｃ３Ｆレセプターの診断もしくは研究用アッセ イの成分として有用であると思われる。

マウスを免疫処理するために、Ｇ−Ｃ３ＦＲ免疫原を完全フロインドアジュバン トに乳化し、１０−１００ｇの量でＢａ、ｌｂ／ｃマウスに皮下注射した。１〇 −１２日後に、免疫処理した動物を不完全フロインドアジュバントに乳化した追 加免疫原によりブースター処理し、その後毎週または隔週の免疫処理計画により 定期的にブースター処理した。ドツトプロットアッセイ（抗体サンドイッチ）ま たはＥＬＩＳＡ　（ｅｎｚｙｍｅ−］　１ｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎ ｔａｓｓａｙ）により試験するために、血清試料を定期的に眼窩後部採血または 尾先端切除により採取した。他のアッセイ法も適している。適宜な抗体価が検出 されたのち、陽性動物に食塩液中の抗原を静脈内注射した。３−４日後に動物を 層殺し、肺細胞を採取し、ネズミ骨髄腫細胞系列ＮＳＩに融合させた。この方法 により形成されたハイブリドーマ細胞系列を多数のミクロタイタープレートのＨ ＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）に接種し、非 融合細胞、骨髄腫ハイブリッドおよび肺細胞ハイブリッドの増殖を抑制した。

こうして形成されたハイブリドーマクローンはＧ−Ｃ３ＦＲとの反応性に関して 、たとえばエングバル（Ｅｎｇｖａｌｌ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、８：８７ １　（１９７１）および米国特許第４，７０３．００４号明細書に記載の方法を 適用して、ＥＬＩＳＡによりスクリーンすることができる。次いで陽性クローン を同質遺伝子的（ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ）Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔に注射し、高 濃度の（＞１ｍｇ／ｍｌ）抗Ｇ−Ｃ３ＦＲモノクローナル抗体を含む腹水を得た 。

得られたモノクローナル抗体を硫酸アンモニウム沈殿、続いてゲルエクスクル− ジョンクロマトグラフィー、および／または黄色ブドウ球菌（、Ｓ　ｔ　ａ　ｐ 　ｈ　ｙ　Ｉ　。

ｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）の蛋白質Ａに対する抗体の結合に基づくアフィニ ティクロマトグラフィーにより精製することができる。

ＦＩＧＬＩＲＥ　１ ＦＸＧ、！ ＡＧＴ　ＧＴＣＣＣＡ　ＧＡＣＣＣＡ　ＧＣＴ　ＣＡＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧ　Ｇ ＧＣＴＣＣＴＧＧ　ＧＴＧ　ＣＣＣＡＣＡ　２１９２Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　 Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｈｌｓ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　 Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　ＴｈｒＡＴＣＡＣＣＭＧ　ＣＴＣＡＣＡ　ＧＴＧ　Ｃ ＴＧ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＧＡＴ　ＧＡＡ　ＡＡＧ　ＭＧ　ＣＣＧ　ＧＴＧ　ＣＣ Ｃ２２８８１１ｅ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ 　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｐｒ。

ＴＧＧ　ＧＡＧ　ＴＣＣＣＡＴ　ＡＡＣＡＧＣＴＣＡ　ＧＡＧ　ＡＣＣＴＧＴ　 ＧＧＣＣＴＣＣＣＣＡＣＴ　ＣＴＧ　ＧＴＣ２３３６Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　 Ｈｌｓ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　 Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｖａ１ＧＣＡ　ＴＡＣＴＴＴ　ＭＧ　ＧＡＣＣＡＧ　 ＡＴＣＡＴＧ　ＣＴＣＣＡＴ　ＣＣＡ　ＧＣＣＣＣＡ　ＣＣＣ）ＪＴ　ＧＧＣ２ ４Ｂ０Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　工ｌｅ　Ｍｅｔ　Ｌ ｅｕ　）ｌｉｓ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｇ１■ ＧＧＴＴＴＧＣＡＡＡ　入λりりυ’ＪＪ講Ａ　２５４６国際調査報告 、　ＩＩｓ、　ＰＣＴ／［１３９０１０５４３４

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．生物活性哺乳動物Ｇ−ＣＳＦレセプター（Ｇ−ＣＳＦＲ）蛋白質をコードす る単離されたＤＮＡ配列。
2. ２．下記よりなる群から選ばれる、請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ配列：（ａ ）天然哺乳動物Ｇ−ＣＳＦＲ遺伝子のコード領域に由来するヌクレオチド配列を 含むｃＤＮＡクローン； （ｂ）適度にストリンジェントな条件下で（５０℃、２×ＳＳＣ）（ａ）のクロ ーンにハイブリダイズすることができ、生物活性Ｇ−ＣＳＦＲ分子をコードする ＤＮＡ配列；および （ｃ）（ａ）および（ｂ）に定めるＤＮＡ配列に対する遺伝子コードの結果とし てディジェネレートであり、生物活性Ｇ−ＣＳＦＲ分子をコードするＤＮＡ配列 。
3. ３．可溶性の生物活性哺乳動物Ｇ−ＣＳＦＲをコードする、請求の範囲第１項に 記載の単離されたＤＮＡ配列。
4. ４．請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ配列を含む組換え発現ベクター。
5. ５．請求の範囲第２項に記載のＤＮＡ配列を含む組換え発現ベクター。
6. ６．請求の範囲第３項に記載のＤＮＡ配列を含む組換え発現ベクター。
7. ７．請求の範囲第４項に記載のベクターを含む適切な宿主細胞を、発現を促進す る条件下で培養することを含む、哺乳動物Ｇ−ＣＳＦレセプターまたはその同族 体の製法。
8. ８．精製された生物活性哺乳動物Ｇ−ＣＳＦレセプター組成物。
9. ９．本質的にヒトＧ−ＣＳＦレセプターからなる、請求の範囲第８項に記載の精 製された生物活性哺乳動物Ｇ−ＣＳＦレセプター組成物。
10. １０．有効量の請求の範囲第８項に記載の哺乳動物Ｇ−ＣＳＦレセプター蛋白質 組成物、および適切な希釈剤またはキャリヤーからなる、哺乳動物における免疫 反応または炎症反応を調節するための組成物。
11. １１．有効量の請求の範囲第１０項に記載の組成物を投与することよりなる、哺 乳動物における免疫反応の調節法。
12. １２．請求の範囲第８項に記載の蛋白質組成物を使用することよりなる、Ｇ−Ｃ ＳＦもしくはＧ−ＣＳＦレセプター分子またはそれらの相互作用を検出するため のアッセイ法。
13. １３．哺乳動物Ｇ−ＣＳＦレセプターと免疫反応性である抗体。