JP3403403B2 - 顆粒球コロニー刺激因子レセプターをコードするｄｎａ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、顆粒球コロニー刺激因子レセプターをコー
ドするDNAに関し、さらに詳しくは、顆粒球コロニー刺
激因子（以下、Ｇ−CSFと称する）と特異的に結合し得
るレセプターペプチドをコードするDNA、該DNAを含有す
る発現ベクター、該ベクターを含有する形質転換体、並
びに該形質転換体を培養することにより、該レセプター
を製造する方法に関するものである。さらにまた本発明
は、このようにして製造された組換えＧ−CSFレセプタ
ーに関するものである。

背景技術 血液細胞の増殖と分化はコロニー刺激因子（CSF）と
称するホルモン様の増殖および分化因子によって制御さ
れている［メトカルフ（Metcalf,D.）、ネイチャー（Na
ture）、339、27〜30（1989）］。CSFは、その作用する
状況または段階に応じて顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−
CSF）、顆粒球−マクロファージのコロニー刺激因子（G
M−CSF）、マクロファージのコロニー刺激因子（Ｍ−CS
F）およびインターロイキン３（IL−３）に大別され
る。それらの内、Ｇ−CSFは好中性顆粒球の増殖および
分化に重要な役割を担っており、血液中の好中球濃度の
制御、並びに成熟好中球の賦活化に深く関与しているこ
とが分かっている［ナガタ（Nagata,S.）、ハンドブッ
ク・オブ・エクスペリメンタル・ファルマコロジー（Ha
ndbook of Experimental Pharmacology）、「ペプチド
・グロウス・ファクター・アンド・デア・レセプターズ
（Peptide Growth Factors and Their Receptors）」、
スポーン（Sporn,M.B.）およびロバーツ（Roberts,A.
B.）編、スプリンガー−バーラグ、ハイデルベルク（Sp
ringer−Verlag,Heidelberg）、Vol.95/I、699〜722頁
（1990）；ニコラ（Nicola,N.A.）、Annu.Rev.Bioche
m.、58、45〜77（1989）］。即ち、Ｇ−CSFは好中球の
前駆細胞に存在するレセプター（Ｇ−CSFレセプター）
を介して該細胞に作用し、その増殖、あるいは分化を刺
激して主に好中性顆粒球を与える［ニコラ（Nicola,N.
A.）およびメトカルフ（Metcalf,D.）、プロシィーディ
ングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンシィーズ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、81、3765〜37
69（1984）］。

Ｇ−CSFにはその他、様々な作用があり、例えば、組
換えDNA技術で得られたＧ−CSCFを用いたインビボの動
物実験により、該Ｇ−CSFが好中球の調節因子であるこ
とが示唆された（ツチヤら、EMBO J.６、611−616（198
7）；ニコラら、Annu.Rev.Biochem.58、45−77（198
9））。また、がん患者へのＧ−CSF投与が化学療法およ
び骨髄移植療法に有利であることを示す臨床報告もある
（モースチンら、Trends Pharmacol.Sci.10、154−159
（1989））。その一方で骨髄性白血病細胞などのがん細
胞の増殖がＧ−CSFによって刺激される場合のあること
も知られている。

このように、Ｇ−CSFは臨床上極めて重要な生理活性
物質であるにもかかわらず、作用機構には不明な点が残
されており、より有効な治療および診断を構成する上
で、作用機構の解明が待たれている。そのためには細胞
表面に存在するヒトＧ−CSFレセプターを生化学的に特
性化し、該レセプターとＧ−CSFとの相互作用を研究す
る必要がある。

ところで、Ｇ−CSFの作用する細胞は好中球の前駆体
および成熟した好中球、および種々の骨髄性白血病細胞
に限定されている（ニコラおよびメトカーフ、Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 81、3765−3769（1984）、ベグレー
ら、Leukemia １、１−８（1987）、パークら、Blood 7
4、56−65（1989））。ヒトＧ−CSFは174アミノ酸、ネ
ズミＧ−CSFは178アミノ酸からなるポリペプチドであ
り、ヒトＧ−CSFとネズミＧ−CSFの相同性はアミノ酸配
列レベルで72.6％と高く、種特異性は殆んど認められな
いことも明らかである（ニコラら、Nature 314、625−6
28（1985））。他方、Ｇ−CSFレセプターは非血液細
胞、例えばヒト内皮細胞（ブッソリノら、Nature 337、
471−473（1989））および胎盤（ウズマキら、Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 86、9323−9326（1989））にも存在し
ていることが最近、報告され、Ｇ−CSFの作用は一層興
味深いものがある。

以上のように、Ｇ−CSFとＧ−CSFレセプターとの相互
作用の解明は学問的な見地からも価値があるが、臨床面
においても、造血性疾患または他の疾患の予防および治
療におけるＧ−CSFの投与方法の確立、ひいてはより正
確で有効な処置を達成するために重要である。他方、レ
セプター自身の用途として、可溶化型Ｇ−CSFレセプタ
ーが、ある種のＧ−CSF依存性ヒト白血病細胞（サント
リら、J.Immunol 139、3348−3354（1987））の増殖阻
害に臨床上有用である可能性も存在する。さらに、骨髄
性白血病細胞などのがん細胞がＧ−CSFにより増殖する
可能性もあり、該細胞におけるＧ−CSFレセプターの発
現を検討し、Ｇ−CSFの臨床応用をより有効に行うこと
ができる。このように、研究および実用化の両面でＧ−
CSFレセプターには様々な有用性が指摘されており、Ｇ
−CSFレセプター遺伝子およびそのタンパク質の安定的
な供給が望まれる。

近年、多くの生理活性物質の製造に遺伝子工学の技術
が利用されている。遺伝子工学による物質生産において
は、通常、目的とするポリペプチドをコードするDNAの
クローニングを行い、該DNAを適当な発現ベクターに組
み込み、得られた組換えDNAを用いて微生物や動物細胞
等を形質転換し、目的物質を発現させる。

Ｇ−CSFレセプターを遺伝子工学の技術により生産す
るには、まず目的物質であるＧ−CSFレセプターをコー
ドするDNAのクローニングを行う必要があるが、Ｇ−CSF
レセプターは細胞表面における存在が極めて少数（細胞
あたり、数百〜2000個）であるためにそのcDNAのクロー
ニングが容易でなかった。

発明の開示 本発明者らは、ヒトＧ−CSFとネズミＧ−CSFとのアミ
ノ酸レベルでの相同性が72.6％と高く、種特異性は殆ん
ど認められないことから、それぞれのＧ−CSFとＧ−CSF
レセプターとの間に交差反応が予測される、ということ
に着目し、まず、研究ならびに診断分析に適用し得るＧ
−CSFレセプターを得ることを目的として、ネズミ（マ
ウス）骨髄性白血病NFS−60細胞から、そのレセプター
を可溶化し、分子量100,000から130,000のタンパク質と
して精製した。精製方法としては、例えば、細胞膜懸濁
液をCHAPS｛３−［（３−コラミドプロピル）ジメチル
アンモニオ］−１−プロパンスルホン酸｝で抽出した
後、その抽出液をＧ−CSFアフィニティークロマト（組
換えヒトＧ−CSFをゲル樹脂に結合したアフィニティー
クロマト）で処理し、次いでゲル濾過で精製することが
できる。

一方、NFS−60細胞から得たmRNAを逆転写し、ネズミ
のＧ−CSFレセプターをコードするcDNA（以下、Ｇ−CSF
レセプターcDNAという）を単離、クローニングすること
に初めて成功した。次いで、このcDNAの塩基配列を決定
し、アミノ酸配列を推定した。ネズミＧ−CSFレセプタ
ーcDNAの塩基配列および推定のアミノ酸配列を第１図に
示す。

ネズミＧ−CSFレセプターcDNAを含有する発現クロー
ニングベクターでCOS細胞を形質転換すると、該細胞はN
FS−60細胞上に存在する天然のネズミＧ−CSFレセプタ
ーと同様の性質を有するレセプターを発現した。ネズミ
Ｇ−CSFレセプターcDNAの塩基配列に基づいてＧ−CSFレ
セプターのアミノ酸配列を類推し、他の増殖因子レセプ
ターファミリーのそれと比較した結果、このネズミＧ−
CSFレセプターは、それらと共通する特徴を有すること
が明らかになった（第７図参照）。また、このようにし
て得たネズミＧ−CSFレセプターをコードするDNAから調
製したプローブは、ヒトＧ−CSFレセプターとハイブリ
ダイズした。これはＧ−CSFレセプターには種特異性が
なく、ヒトＧ−CSFレセプターはマウスＧ−CSFレセプタ
ーと非常に相似していることを示すものであり、従って
ネズミＧ−CSFレセプターDNAは、ヒトＧ−CSFレセプタ
ーを製造する為のいわば中間体として極めて有用であ
る。

次に本発明者らはヒトＧ−CSFレセプターを十分な
量、供給することを目的として、ネズミＧ−CSFレセプ
ターをコードするDNAから調製したプローブを用い、ヒ
ト胎盤およびU937細胞由来の全（total）mRNAから作成
したcDNAライブラリーをスクリーニングし、ヒトＧ−CS
FレセプターをコードするcDNAをクローニングすること
に成功した。

本発明のヒトＧ−CSFレセプターをコードするプラス
ミドで形質転換されたサルCOS細胞は天然のヒトＧ−CSF
レセプターと同様のＧ−CSFとの特異的な結合特性を有
するヒトＧ−CSFレセプターを産生した。

即ち、本発明はＧ−CSFレセプターをコードするDNAを
提供するものである。また本発明はＧ−CSFレセプター
をコードしている発現ベクターを提供するものである。
さらに本発明は、該発現ベクターで培養細胞を形質転換
し、形質転換体を培地に培養し、培養物からＧ−CSFレ
セプターを回収することからなるＧ−CSFレセプターの
製造方法を提供するものである。

なお、本明細書中、Ｇ−CSFレセプターペプチドなる
語句は、成熟Ｇ−CSFレセプターのみならず、該レセプ
ター分子の一部であって、Ｇ−CSFとの特異的結合活性
を有するペプチド分子の全てを指すものとする。

本発明により、従来、単離が困難であったヒトＧ−CS
Fレセプターを遺伝子組換え法により容易に得ることが
可能となったので、そのようにして得られた組換えＧ−
CSFレセプターを用いてＧ−CSF、およびＧ−CSFレセプ
ターの作用機構および臨床（診断および治療）適用のた
めの研究、並びに実用化を推進することができる。ま
た、Ｇ−CSFを白血病などの癌患者に臨床応用する際
に、当該癌細胞がＧ−CSFレセプターを発現しているか
否かを、Ｇ−CSFレセプターcDNAをプローブとして用い
て容易に検討することができる。従って、そのようなcD
NAはＧ−CSFの有効な臨床応用に役立つと考えられる。
さらに、可溶化型Ｇ−CSFを遺伝子組換え法により大量
に生産し、その三次構造を解析する、等により、Ｇ−CS
Fレセプターに、効率よく結合するタンパク質や化合物
を開発することも可能である。

ネズミＧ−CSFレセプターをコードするDNAのクローニ
ングは、次記の方法により行われた。即ち、Ｇ−CSFレ
セプターの発現率が高いマウス骨髄性白血病細胞NFS−6
0からＧ−CSFレセプターを精製し、その分子量が100,00
0−130,000ダルトンであることを確認した。さらに、該
細胞から、グアニジンチオイソシアネート/CsCl法で全R
NAを調製し、poly（Ａ）RNAを選択した。次いで、逆転
写酵素、DNAポリメラーゼなどを用いて２本鎖cDNAを合
成し、哺乳類発現ベクターCDM8（シード、Nature 329、
840−842（1987））をベクターとするcDNAライブラリー
を構築した（60−80クローンの884プール）。各プール
からプラスミドDNAを調製してCOS−７細胞に導入し、放
射性ヨウ素でラベルしたＧ−CSFを用いて結合活性を示
す２つのプールI62およびJ17を選択した。これらのプー
ルから、Ｇ−CSFとの結合活性が高い２個の独立のクロ
ーン、プラスミドpI62およびpJ17を同定した。これらの
プラスミドで形質転換されたCOS細胞は、Ｇ−CSFと結合
活性を有するレセプターを発現した。

次いで、プラスミドpJ17およびpI62の塩基配列を決定
した結果、これらはいずれもネズミＧ−CSFレセプター
の完全なコーディング領域を含有しているが、poly
（Ａ）配列もpoly（Ａ）付加シグナルも含有していない
ことが分かった。そこで、pJ17の2.5kb Hind III−Xba
Iをプローブとするコロニーハイブリザイゼーションに
よって、上記cDNAライブラリーを再度スクリーニング
し、陽性クローンの１つ（pF1）を選択した。これは603
bpの3'非コーディング領域と、２個の重複するpoly
（Ａ）付加シグナルを含有していた、これら３個のクロ
ーン化cDNA（pI62、pJ17およびpF1）の塩基配列および
それより類推されるアミノ酸配列を第１図に示す。ま
た、その模式図および制限酵素切断点地図、並びにハイ
ドロパシープロットを第２図に示す。

本発明によりクローニングされたネズミＧ−CSFレセ
プターcDNAは以下の特徴を有する。

ヌクレオチド180−162の開始コドンATGとヌクレオチ
ド2691−2693の終止コドンTAGとの間に長いオープン・
リーディング・フレーム（2,511ヌクレオチド）を有す
る。その5'上流側には３個の開始コドンとなり得るコド
ンが、73、105および126位に存在しているが、いずれの
下流にも短いオープン・リーディング・フレームしか存
在しない。プラスミドpI62をHind III消化してcDNAから
これらATGコドンを欠失させてもCOS細胞内での組換えＧ
−CSFレセプターの発現は増減しないということが分か
った。

さらに、ロング・オープン・リーディング・フレーム
のＮ−末端配列には疎水性アミノ酸からなる配列が存在
し、これはシグナル配列と思われる。そして、代表的な
シグナルペプチド開裂部位の配列との比較によりＮ−末
端25アミノ酸がシグナル配列と類推された。

以上から、成熟ネズミＧ−CSFレセプターは、812アミ
ノ酸から成り、理論分子量90,814であると結論された。
この値は¹²⁵Iヨウ素放射Ｇ−CSFとの結合実験の値（実
施例２（２）参照、第５図）や精製ネズミＧ−CSFレセ
プターの分子量（95,000−125,000）と比較して5,000−
35,000ダルトン少ない。この差異はおそらくＧ−CSFレ
セプターの細胞外領域に認められる11個の推定Ｎ−グリ
コシル化部位（Asn−Ｘ−Thr/Ser）の幾つかに糖鎖が結
合していることによるものであろう（第１図）。

成熟Ｇ−CSFレセプターのアミノ酸配列のヒドロパシ
ープロット（第２図、Ｂ）（カイトおよびドゥーライ
ト、J.Mol.Biol.157、105−132（1982））によると、Le
u−602からCys−625に至る24個のアミノ酸は非荷電アミ
ノ酸であり、３個の塩基性アミノ酸がこれに続く。これ
らの特徴は多くの膜タンパク質における膜貫通領域に認
められる特徴と一致している。

このように、成熟Ｇ−CSFレセプターは601アミノ酸の
細胞外ドメイン、24アミノ酸の膜貫通領域（単一のトラ
ンスメンブラン領域）、および187アミノ酸の細胞質ド
メインからなる。細胞外ドメインのNH₂末端373コのアミ
ノ酸はシステイン残基に富んでおり（17/373アミノ
酸）、これは多くのレセプターのリガンド結合領域に共
通する性質である（マクドナルトら、British Medical
Bulltein 455、54−569（1989））。エリスロポエチレ
ンレセプター（ドアンドレらCell 57、277−285（198
9））と同様、Ｇ−CSFレセプターもプロリンに富み（80
残基、9.9％）、また、ネズミＧ−CSFレセプターはトリ
プトファン残基をかなり高含有率で含有する（26残基、
3.2％）。

以上から明らかな様に、本発明により決定されたネズ
ミＧ−CSFレセプターは、増殖および分化因子のレセプ
ターに共通する特徴である、Ｎ末端のシグナル配列、単
一のトランスメンブラン領域、Ｎ末端部分における細胞
外ドメイン、Ｃ末端部分における細胞ドレインから成
る。

さらに、ネズミＧ−CSFレセプターのアミノ酸配列と
他の増殖因子のレセプターのアミノ酸配列とを比較して
以下の結果を得た（第７図）。比較に用いたのは、成長
ホルモン、プロラクチン、エリスロポエチン、IL−６、
IL−２、IL−４、IL−３、GM−GSFのレセプターであっ
て、これらはすべて増殖因子レセプター群に属する。7A
図に示されているように増殖因子レセプター群で共通に
見い出されるシステインとトリプトファン残基はＧ−CS
Fレセプターにおいても保存されており、“WSXWS"モチ
ーフ（ギアリング、EMBO J.83、667−3676（1989）、イ
トウら、Science 247、324−326（1990））もアミノ酸
残基294−298に認められ、該Ｇ−CSFが同群に属するこ
とを示唆している。このＧ−CSFレセプターと他の血液
細胞増殖因子レセプター群の比較により、Ｇ−CSFとIL
−６の相同性は44.6％であるが、そのレセプター間の相
同性はＧ−CSFレセプターとプロラクチンレセプターと
の相同性に比較して低い。また、第7B図に示されている
ようにＧ−CSFレセプターの細胞外領域のアミノ酸配列
（376−601）とニワトリコンタクチン（ランシト、J.Ce
ll.Biol.107、1561−1573（1988））の細胞外領域の一
部とに有意な相同性が認められる。コンタクチンは神経
細胞表面糖タンパク質（130KD）であって神経系の細胞
間情報伝達に関連しているとされている。コンタチンの
アミノ酸残基737−818は細胞、ヘペリンおよびDNAとの
結合に関連するフィブロネクチンIII型セグメントと相
同性を保持しており、この領域は細胞同士の付着に重要
な役割を担っていると思われる。骨髄では常に顆粒球が
形成されており、好中球の前駆細胞と骨髄質細胞との直
接相互作用の存在が示されている（ロバートら、Nature
332、376−378（1988））。上記のネズミＧ−CSFレセ
プターとコンタクチンの細胞外領域の類似性はこの領域
が好中球の前駆細胞と骨髄質細胞との相互作用に関与し
ていることを示唆するものである。

Ｇ−CSFの細胞質ドメインは、他の増殖因子レセプタ
ーと同様、セリン（12.8％）およびプロリン（12.3％）
に富む。そして、Ｇ−CSFレセプターのトランスメンブ
ランおよび細胞質領域の配列はIL−４レセプターと有意
に類似する。

第７（ｃ）図に示すように、Ｇ−CSFレセプターのト
ランスメンブラン領域および細胞質領域の最初の46アミ
ノ酸はネズミIL−４の対応する領域と相同である（50.0
％）。さらに、Ｇ−CSFレセプターのアミノ酸残基672−
808はIL−４レセプターのアミノ酸残基557−694と有意
な類似性を持つ（45.4％）。このことは、Ｇ−CSFによ
る細胞への情報伝達とIL−４による情報伝達が同様の機
構で起こっていることを示唆するものである。

本発明においては、ネズミ白血病細胞NFS−60細胞か
ら得たmRNAの逆転写によりcDNAを得たが、このcDNAは同
一動物の他の細胞（例えば、WEHI−3BD⁺細胞やマウス骨
髄細胞）のmRNAからも得ることができる（第６図参
照）。また、それは他の動物種（例えばヒト）のゲノム
とも相同である。

Ｇ−CSFレセプターの3.7kb mRNAはNFS−60細胞のみな
らずWEHI−3BD⁺にも検出された（同図）。このことはＧ
−CSFによるNFS−60細胞の増殖とWEHI−3BD⁺細胞の分化
が同一Ｇ−CSFレセプターに関連していることを示唆す
るものである。NFS−60およびWEHI−3BD⁺細胞に対する
Ｇ−CSF作用が増殖と分化という異なる結果をもたらす
のは、レセプターより下流のシグナル伝達機構が異なる
ことに起因すると思われる。例えば、骨髄細胞の分化に
関与すると思われるｃ−mybおよびevi−１部位がNFS−6
0細胞内では再編成されているが、WEHI−3BD⁺細胞内で
は再編成されていないという相違点が報告されている
（モリシタら、Cell 54、831−840（1989））。

本発明のネズミＧ−CSFレセプターをコードするDNAは
第１図記載の塩基配列に従って得ることができる。これ
は、受託番号、微工研菌寄第11353号（FERM Ｐ−1135
3）の下で通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託され（寄託日：平成２年３月９日）、その後ブダ
ペスト条約の下で国際寄託に移管されたEscherichia co
li.pI62から常法通り単離することができる（国際寄託
における受託番号：微工研条寄第3312号（FERM BP−33
12;移管日：平成３年３月16日）。あるいは化学合成す
ることも可能であり、さらには該配列に基づいて、通
常、約30ヌクレオチドのプローブを合成し、これをゲノ
ムライブラリーまたはcDNAライブラリーのハイブリザイ
ゼーションプローブとして用いることにより、得ること
もできる。そのようなライブラリーは、上記のごとく、
Ｇ−CSFレセプターを発現する任意の種、例えばヒト、
マウス、ラット、その他の動物から調製することができ
る。プローブとして用いるDNAの合成およびハイブリザ
イゼーション法は当業者に既知である。ゲノムライブラ
リーおよびcDNAライブラリーの調製も当業者既知であ
る。

また本発明のヒトＧ−CSFレセプターをコードするcDN
Aのクローニングは、次記の方法により行われた。即
ち、Ｇ−CSFレセプターの発現率が高いヒト胎盤およびU
937細胞（human histiocytic lymphoma,ATCC CRL1593）
から全RNAを調製し、poly（Ａ）RNAを選択した。次い
で、逆転写酵素、DNAポリメラーゼなどを用いて２本鎖c
DNAを合成し、哺乳類発現ベクターpEF−BOS（第14図参
照）を用いてcDNAライブラリーを構築した。一方、前述
のネズミＧ−CSFをコードするDNAからハイブリダイゼー
ションプローブを調製し、該プローブを用いるコロニー
ハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイ
ゼーションによって上記cDNAライブラリーをスクリーニ
ングし、陽性クローンを選択した。

U937細胞から調製したcDNAライブラーから５個の陽性
クローンが単離された（pHQ1〜pHQ5）。他方、ヒト胎盤
から調製したcDNAライブラリーから100個以上の陽性ク
ローンが得られ、その内６個の陽性クローンを単離して
EcoR I消化し、得られたEcoR I断片をpBluescript SK
（＋）でサブクローニングした。次いで、単離したcDNA
を制限酵素マッピングおよびDNA配列決定により分析し
た。その結果、クローンは以下の３クラスに分類される
ことが分かった。胎盤およびU937細胞から得られたcDNA
の大部分がクラス１に属していた。

クラス1:プラスミドpHQ3（U937細胞）およびpHG12（胎
盤） このクラスのクローンは836アミノ酸のタンパク質を
コードする大きいオープン・リーディング・フレームを
有する。その塩基配列および推定のアミノ酸配列を第８
図Ａに示す。推定のアミノ酸配列のヒドロパシー分析に
より、このクラスのcDNAによってコードされているＧ−
CSFレセプターは、Ｎ末端から23アミノ酸残基のシグナ
ル配列、604残基の細胞外ドメイン、26残基からなる膜
貫通領域（トランスメンブラン・ドメイン）、および18
3残基の細胞質ドメインを含有することが示された。プ
ラスミドpHQ3（pHG12と同一）の制限酵素切断点は第９
図に記載されている。

このプラスミドにコードされているヒトＧ−CSFレセ
プター（813アミノ酸）の推定の分子量は従来のヒトＧ
−CSFレセプターの分子量と30,000〜60,000ダルトン相
違している。これは細胞外領域に存在する９個の潜在的
Ｎ−グリコシル化部位がグリコシル化されていることに
よるものと考えられる。

本発明によりクローニングされたヒトＧ−CSFレセプ
ターとネズミＧ−CSFレセプターとの相同性はヌクレオ
チド配列レベルで72％、アミノ酸配列レベルで62.5％で
あり、アミノ酸配列における相同性は分子の全領域を通
して均一であった。このヒトＧ−CSFレセプターの細胞
外ドメインには17個のシステイン残基があり、その14個
はヒトおよびネズミで保存されている。さらに該細胞外
ドメインには、サイトカインレセプターに共通する保存
的な“WSXWS"モチーフも存在しており、ヒトＧ−CSFレ
セプターがサイトカインレセプター群に属することが示
された。

クラス2:プラスミドpHQ2（U937細胞） プラスミドpHQ2の塩基配列は、pHQ3の配列から、ヌク
レオチド番号2,034−2,121の88ヌクレオチドが欠失して
いることを除いてpHQ3のそれと同一である。この88ヌク
レオチド領域には膜貫通領域が含まれている。該プラス
ミドの欠失開始部位から下流のヌクレオチド配列を第８
図Ｂに示す。

図から明らかに、pHQ2においては、欠失部位から下流
の150アミノ酸をコードする翻訳リーディングフレーム
の配列がpHQ3の配列と異なっており、分泌、可溶化型の
Ｇ−CSFレセプターをコードしていると考えられる。こ
のレセプターは748アミノ酸からなり、分子量の計算値
は82,707である。

クラス3:プラスミドpHQ11およびpHQ5（胎盤） これらのプラスミドはpHQ3の配列において、ヌクレオ
チド番号2,210位に81bpの挿入を含有するものである。
挿入位置はＧ−CSFレセプターの細胞質ドメインであり
翻訳オープンリーディングフレームは変化していない。
挿入部分のヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列
を第８図Ｃに示す。プラスミドpHQ2によってコードされ
ているレセプターのアミノ酸数はクラス１のＧ−CSFレ
セプターよりも27個多く、分子量は2,957大きい。この
挿入部を有するcDNAの制限地図を第９図に示す。

上記３種のヒトＧ−CSFレセプターcDNAのＧ−CSFとの
結合活性を調べたところ、クラス１のプラスミドpHQ3で
形質転換されたサルCOS細胞はネズミ¹²⁵I−Ｇ−CSFと高
い親和性を有していた（結合における解離定数は550pM
であり、レセプター数は3.4×10⁴個／細胞）。この結合
における親和性は、COS細胞によって発現されたネズミ
Ｇ−CSFレセプターに対するネズミＧ−SCFの結合におけ
る親和性とほぼ同一であった。天然にU937細胞表面に存
在するレセプターに対するヒトＧ−CSFの結合親和性は
解離定数424pMである［パーク（Park,L.S.）、ワールド
ロン（Waldron,P.E.）、フレンド（Friend,D.）、サッ
センフェルド（Sassenfeld,H.M.）、プライス（Price,
V.）、アンダーソン（Anderson,D）、コスマン（Cosma
n,D.）、アンドリュー（Andrews,R.G.）、バーンステイ
ン（Bernstein,I.D.）およびアーダル（Urdal,D.L.）、
ブラッド（Blood）、74、56〜65（1989）］ことから、p
HQ3によってコードされているポリペプチドはＧ−CSFと
十分に高い親和性を有するレセプターである。

他方、クラス２のpHQ2によりコードされたポリペプチ
ドは一部を欠失していることから、pHQ2cDNAで形質転換
されたCOS細胞とネズミ¹²⁵I−Ｇ−CSFとの結合は極めて
低レベルであった。解離定数は440pMであって結合部位
は６×10³/細胞であった。このことからも膜貫通領域を
欠くpHQ2によりコードされているレセプターは細胞から
分泌された可溶化型であると考えられる。

クラス３のcDNAの結合特性を調べるために、pHQ3cDNA
の5'側の配列とpHG11の3'側の配列とを哺乳類発現ベク
ターpEF−BOSに挿入して発現プラスミドpQW11を構築し
た。このプラスミドを用いてCOS細胞を形質転換し、得
られた形質転換とネズミ¹²⁵I−Ｇ−CSFとの結合分析を
行った結果、細胞質ドメインにおける27アミノ酸挿入体
は、Ｇ−CSFとの結合活性に殆んど影響していないこと
が分かった。

本発明のヒトＧ−CSFレセプターをコードするDNAの塩
基配列は第８図に記載されている。このDNAは、受託番
号、微工研菌寄第11566号、第11567号および第11568号
の下で通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託され（寄託日：平成２年６月28日）、その後ブダペス
ト条約の下、平成３年３月16日付けで国際寄託に移管さ
れたEscherichia coli.pHQ2、Escherichia coli.pHQ3お
よびEscherichia coli.pHG11から常法通り単離すること
ができる。これらの国際寄託における受託番号および移
管日は下記の通りである。Escherichia coli.pHQ2;受託
番号：微工研条寄第3313号（FERM BP−3313）;Escheri
chia coli.pHQ3:微工研条寄第3314号（FERM BP−331
4）;Escherichia coli.pHG11:微工研条寄第3315号（FER
M BP−3315）。

本発明者らはまた、これらのヒトＧ−CSFレセプターc
DNAから調製したプローブを用い、ノーザンハイブリダ
イゼーションにより、種々のヒト組織細胞をＧ−CSFレ
セプターRNAの存在に関して分析した。U937細胞、胎盤
およびKG−１細胞が3.7kbの単一バンドを与え、中で
も、胎盤がＧ−CSFレセプターのmRNAを大量に発現して
いることが確認された。

さらに、PCR法により、細胞により発現されるレセプ
ターの種類を検討し、クラス1G−CSFレセプターは、U93
7および胎盤細胞の両者、クラス２の可溶化型レセプタ
ーはU937細胞、挿入体を有するクラス３レセプターは胎
盤細胞により発現されることを確認した。

また、サザーンハイブリダイゼーションにより、Ｇ−
CSFレセプターをコードする遺伝子の数を検討した結
果、ヒトハプロイドゲノムあたり、単一の遺伝子が存在
することを見いだした。

本発明により、ヒトＧ−CSFレセプターをコードするD
NAのヌクレオチド配列が明らかになったので、このDNA
を用いて適当な宿主系で機能する発現ベクターを構築
し、その発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、得られ
た形質転換体を培養することにより、組換えヒトＧ−CS
Fレセプターを製造することができる。このようにして
得られた組換えヒトＧ−CSFレセプターは、白血病の診
断やヒトＧ−CSFの作用機構の解明等、様々な目的に有
用である。

本発明のＧ−CSFレセプターをコードするcDNAのヌク
レオチド配列はマウスについては第１（ａ）図、第１
（ｂ）図、第１（ｃ）図およびヒトについては第８
（ａ）図、第８（ｂ）図、第８（ｃ）図に記載されてい
るが、当業者ならば、これらのDNAから、ヌクレオチド
の挿入、置換または欠失により、容易に同様の活性を有
する誘導体を導くことができるということを理解するで
あろう。従って、そのようにして導かれるDNAも本発明
の範囲に包含されるものである。

本発明の目的を達成するために用いるＧ−CSFと結合
するポリペプチドは、必ずしも成熟Ｇ−CSFレセプター
であることを必要としない。むしろ、Ｇ−CSFとの結合
活性を有する断片であることが好ましい場合もある。同
様に、成熟Ｇ−CSFレセプターをコードするDNAの全配列
および、Ｇ−CSFをコードするDNAとの結合活性を有す
る、成熟Ｇ−CSFレセプターの一部をコードするDNA断片
もまた有用である。

従って本発明は、Ｇ−CSFと結合し得るレセプターペ
プチド、並びに該ペプチドをコードするDNAを提供する
ものである。

このように、本発明のＧ−CSFレセプターペプチドを
コードするDNAは、成熟Ｇ−CSFレセプター、並びに該成
熟Ｇ−CSFレセプターのＧ−CSFとの結合活性を有するペ
プチド断片をコードするDNAを包含する。

本発明のDNAを用いて他の動物種のＧ−CSFレセプター
をコードするDNAを得、Ｇ−CSFレセプターの発現ベクタ
ーを構築し、適当な培養細胞に導入して、Ｇ−CSFレセ
プターを発現させることができる。

本発明のＧ−CSFレセプターをコードするDNAを含有す
る発現ベクターは種々の方法で構築することができるの
で、当業者は適宜選択すればよい。Ｇ−CSFレセプター
遺伝子の発現に適したベクターは、Ｇ−CSFレセプターD
NA配列の挿入部位の直ぐ上流に転写開始のためのプロモ
ーターを有するものが好ましい。適当なプロモーターも
当該技術分野で既知であり、宿主細胞内での機能特性に
応じて選択することができる。例えば、マウスメタロチ
オナインプロモーターおよびSV−40スモールＴプロモー
ターを、それぞれ、ネズミおよびサル細胞に用いること
ができる。細菌プロモーターを、細菌内でＧ−CSFを発
現させるのに用いることもできる。Ｇ−CSFレセプター
配列の挿入部位下流にpoly−Ａシグナルがあることが望
ましい。ベクター中には薬物耐性マーカーのような選択
可能マーカーが存在することが望ましい。特に望ましい
マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を挙げることが
できる。

発現ベクターはＧ−CSFレセプターをコードするDNAを
適当なベクターに挿入することにより構築することがで
きる。適当なベクターは、プロモーター、polyAシグナ
ル、選択マーカーその他の条件を考慮し、当該技術分野
で既知のものから選択する。本発明のcDNAを挿入し、培
養細胞に導入してこのcDNAを発現する目的に用いること
ができるDNAベクターとして、例えばpSV2、ウシパピロ
ーマウィルスDNAを挙げることができる。

本発明のＧ−CSFレセプターの発現に用い得る培養細
胞は複製可能で第１図もしくは第８図記載のDNAを発現
し得るものであればよい。例えば、大腸菌のような原核
性微生物、S.セレビシエのような真核性微生物、さらに
は哺乳類細胞が用いられる。組織培養細胞にはトリ、ま
たは哺乳類細胞、例えばネズミ、ラットおよびサル細胞
が含まれる。適当な宿主細胞−ベクターシステムの選択
および使用方法等は、当業者に既知であり、それらの内
から本発明のＧ−CSFレセプターをコードするcDNAの発
現に適した系を任意に選択することができる。

以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明する
が、これらの実施例は本発明を制限するものではない。

実施例 実施例１ ネズミＧ−CSFレセプターDNAのクローニング １）細胞 ネズミ骨髄性白血病細胞NFS−60（ワインシュタイン
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83、5010−5014（198
6）；セント・ジュード・チャイルドレンズ・リサーチ
・ホスピタルのJ.Ihle氏から寄贈）を、10％ウシ胎児血
清（FCS）および10〜20単位/mlの組換えマウスIL−３を
加えたRPMI1640培地で培養した。

COS−７細胞は常法通り10％FCS含有ダルベッコの改良
イーグル培地（DMEM）で維持した。

２）組換えＧ−CSFなどの増殖、分化因子 ヒトＧ−CSFcDNA（ツチヤら、1987、前掲）を担持す
るウシパピローマウイルス発現ベクター（フクナガら、
Proc.Natl.Acad.Sci,USA 81、5086−5090（1984））で
形質転換したマウスC127I細胞の培養液より、ヒト組換
えＧ−CSFを精製した。

マウスＧ−CSFを、同様の発現システムを用い、均一
タンパク質として精製した。チャイニーズハムスターの
卵巣細胞によって産生されたヒト組換えＧ−CSFおよび
Ｍ−CSFは中外製薬（日本）から得た。

E.coliによって産生されるヒト組換えＧ−CSFはアマ
ーシャム（Amersham）から購入した。

マウス組換えIL−３およびGM−CSFはミヤジマおよび
アライ氏（DNAXインスティチュート）から得た。

マウス組換えIL−６およびマウス組換えLIFは、それ
ぞれ、ヒラノ氏（大阪大学）およびニコラ氏（ウオルタ
ー・エリザ・ホール・インスティチュート）から得た。

ラットプロラクチンはケミコンインターナショナル、
インコーポレーテッドから購入した。

放射性ヨウ素でラベルしたネズミ組換えＧ−CSFは、
改良IODO−GEN法（フレイカーおよびスペック、Bioche
m.Biophys.Res.Commun.80、849−857（1978））により
作成した［比活性:6−８×10⁴cpm/ngタンパク質（1,200
〜1,600cpm/fmole）］。以下、これを¹²⁵I−Ｇ−CSFと
表記する。

３）CDM8cDNAライブラリー 対数増殖期のNFS−60細胞からグアニジンイソチオシ
アネート/CsCl法で全RNAを調製し、オリゴ（dT）−セル
ロースカラムクロマトグラフィーでpoly（Ａ）RNAを選
択した。逆転写酵素（生化学工業から購入）とアマーシ
ャム社のキットを用い、文献記載（ナガタら、Nature 3
19、415−418（1986））に従って２本鎖cDNAを合成し
た。

得られた平滑末端cDNAにBstX Iアダプターを付加し、
１％アガロースゲルで電気泳動した。1.8kb以上のcDNA
をゲルから回収し、BstX I−消化哺乳類発現ベクターCD
M8（シード、1987、前掲）に結合（ライゲーション）さ
せ、得られたDNAでE.coli MC1061/p3細胞を形質転換し
た（電気穿孔法、ダウエルら、Nucleic Acids Res.16、
6127−6145（1988））。

４）DNAの調製 ６×10⁴個の細菌コロニーを24ウエルのマイクロタイ
タープレートに、ウエルあたり60〜80コロニーの密度で
プレートした。コロニーの各プールごとにグリセリン培
養を調製した。各グリセリン培養の一部をLBブロスに接
種し、煮沸法（ボイリング法）で各プールからプラスミ
ドDNAを調製し（マニアティスら、Molecular Clonign:A
Laboratory Manual 1982）、フェノール抽出およびエ
タノール沈澱に付した。

５）COS−７細胞のトランスフェクション ６ウエルのマイクロタイタープレートでCOS−７細胞
の単層培養を得、この細胞を改良DEAEデキストラン法
（ソンパイラックおよびダンナ、Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 787、575−7578（1981））により上記４）で調製し
たプラスミドDNAを用いてトンランスフェクションし
た。

即ち、約50％の全面成長した細胞を血清不含DMEMで３
回洗浄し、37℃で８時間、50mM Tris−HCl（pH7.3）、
0.3mg/ml DEAE−デキストランおよびプラスミドDNA1μ
ｇを含有するDMEM0.6ml中でインキュベートした。20％
グリセリン含有Tris−HCl緩衝化食塩水を用い、室温で
２分間グリセリンショックに付した後、細胞をDMEMで２
回洗浄し、10％FCS含有DMEM中でインキュベートした。

６）Ｇ−CSFレセプターを発現しているCOS−７細胞（形
質転換体）のスクリーニング トランスフェクションから72時間後、COS−７細胞
を、10％FCSおよび20mM HEPES含有DMEM（pH7.3）（結合
培地）で洗浄し、結合培地0.6ml中の¹²⁵I−Ｇ−CSF（1.
7×10⁵cpm（200pM））と共に37℃で２時間インキュベー
トした。結合しなかった放射活性Ｇ−CSFを除去し、細
胞を0.7mM CaCl₂と0.5mM MgCl₂を補充したりん酸緩衝化
食塩水（PBS）で３回、PBSで１回洗浄した。次いで、細
胞をトリプシン処理して回収し、細胞と結合した放射活
性をAUTO−GAMMA 5000 MINAXI ガンマカウンター（Pac
kard）で計数した。¹²⁵IでラベルしたＧ−CSFとCDM8ベ
クターでトランスフェクトされたCOS細胞とのバックグ
ラウンド結合は308±38（SD）cpmであった。一方、cDNA
を含むプラスミドDNAのプールで形質転換したCOS細胞の
うち、２つのプール（I62とJ17）のプラスミドDNAを導
入したCOS細胞が¹²⁵I−Ｇ−CSFと有意な結合を示した
（それぞれ500cpm、912cpm）。

各陽性プール（I62とJ17）から得た144の独立のクロ
ーンを24ウエルのマイクロタイタープレート（６プレー
ト）で培養し、12×12クローンを用いてsib選択に付し
た（マニアティスら、前述、1982）。プラスミドのミニ
プレパレーション、およびCOS−７細胞のトランスフェ
クションの後、¹²⁵I−Ｇ−CSFとの結合反応を行い、各
陽性プールから単一のクローンを選択した。

すなわち、プールI62およびJ17の細菌クローンを各12
クローンの12サブグループに分けた。幾つかのサブグル
ープはCOS細胞への¹²⁵I−Ｇ−CSFの結合反応が3710およ
び4010cpmであった。そして各陽性サブグループの単一
のクローンを分析して２個の独立のクローンpI62および
pJ17を同定した。pI62およびpJ17のプラスミドDNAでCOS
−７細胞をトランスフェクトしたときの¹²⁵I−Ｇ−CSF
結合値はそれぞれ30300cpmおよび31600cpmであった。次
いで、プラスミドpJ17およびpI62の塩基配列を決定した
ところ、これらはいずれもＧ−CSFレセプターの完全な
コーディング領域を含有しているが、poly（Ａ）配列も
poly（Ａ）付加シナルも含有していないことが分かっ
た。そこで、pJ17の2.5kb Hind III−Xba Iをプローブ
とするコロニーハイブリザイゼーションによって、上記
cDNAライブラリーを再度スクリーニングし、陽性クロー
ンの１つ（pF1）を選択した。これら603bpの3'非コーデ
ィング領域を含み、その領域には、２個の重複するpoly
（Ａ）付加シグナルが存在していた。これら３個のクロ
ーン化cDNA（pI62、pJ17およびpF1）の塩基配列および
それより類推されるアミノ酸配列を第１図に示す。ま
た、その模式図および制限酵素切断点地図、並びにハイ
ドロパシープロットを第２図に示す。

実施例２ クローニングしたネズミＧ−CSFレセプターD
NAの特性化 １）クローン化Ｇ−CSFレセプターの結合活性 ¹²⁵I−Ｇ−CSFとCOS細胞およびNSF−60細胞との結合
を調べた。

15cmのプレート上で培養したCOS細胞を、20μｇのpI6
2またはpJ17でトランスフェクションした。グリセリン
ショック後、12時間後に６ウエルのマイクロタイタープ
レートに分割して入れ、10％FCS含有DMEM中、60時間培
養した。細胞を結合培地で洗浄し、種々の量の¹²⁵I−Ｇ
−CSF（10pM−1.2nMの範囲）と一緒に４℃で４時間イン
キュベートした。¹²⁵I−Ｇ−CSFと細胞の非特異結合を
測定するために大過剰の非標識Ｇ−CSF（800nM）の存在
下で結合反応を行い、全結合活性から非特異的に結合し
た放射活性を差し引くことにより特異的結合活性を求め
た。

一方、5.2×10⁶個のNFS−60細胞を、種々の濃度の¹²⁵
I−Ｇ−CSFを含有する10％FCSと20mM HEPES（pH7.3）
からなるRPMI−1640培地0.3ml中で４℃で４時間インキ
ュベートすることにより、該細胞とＧ−CSFとを結合さ
せた。第３図に結果を示す。Ａは¹²⁵I−Ｇ−CSFとCOS細
胞との飽和結合を示す。上記のごとく、プラスミドpJ17
で１×10⁶COS細胞をトランスフェクションした後、種々
の量の¹²⁵I−Ｇ−CSFの存在下、過剰量の非標識Ｇ−CSF
の存在下または非存在下でインキュベートした。○は全
結合、△は非特異結合、●は特異結合を表し、特異結合
は全結合と非特異結合の差として求めた値である。Ｂは
COS細胞へのＧ−CSF結合データのスキャッチャードプロ
ットを示すグラフである。Ｃは¹²⁵I−Ｇ−CSFのNFS−60
細胞への飽和結合を示すグラフであって、○は全結合、
△は非特異結合、●は特異結合を表し、特異結合は全結
合と非特異結合の差として求めた値である。ＤはNFS−6
0細胞へのＧ−CSF結合データのスキャッチャードプロッ
トを示すグラフである。該グラフから、COS細胞で発現
されたＧ−CSFレセプターの平衡解離定数は290pMであっ
て、細胞あたり3.0×10⁴コのレセプターが存在すること
が分かる。COS細胞のトランスフェクション効率を10−2
0％とする（ソンパイラックおよびドナ、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 78、7575−7578（1981））と、トランスフェ
クション陽性のCOS細胞は組換えＧ−CSFレセプターを1.
5〜3.0×10⁵コ／細胞の頻度で発現していると予測され
る。NFS−60細胞上の固有のＧ−CSFレセプターの平衡解
離定数は180pM（第3D図）であるので、これらの結果は
プラスミドpJ17にコードされているcDNAがネズミＧ−CS
Fに高い親和性を有するレセプターを発現するのに充分
であることを示唆している。

次いで、COS細胞で発現された組換えＧ−CSFレセプタ
ーのＧ−CSFとの結合特異性を調べた。上記と同様にＧ
−CSFレセプターのcDNA（pJ17）でトランスフェクショ
ンされたCOS細胞を１μｇの非標識ネズミＧ−CSF、ヒト
Ｇ−CSF、ネズミGM−CSF、ネズミIL−６、ネズミLIF、
ラットプロラクチンまたはヒトＭ−CSFの存在下または
非存在下で2ngの¹²⁵I−Ｇ−CSFと一緒にインキュベート
した。ヒトＧ−CSFとしては、ネズミC127細胞、チャイ
ニーズハムスターの卵巣細胞または大腸菌によって産生
された組換えヒトＧ−CSFを用いた。各実験でCOS細胞と
結合した¹²⁵I−Ｇ−CSFの放射活性を競合物質不在の場
合の値に対する％で表した。結果を第４図に示す。

ヒトＧ−CSFはネズミＧ−CSFとネズミWEHI−3B D⁺細
胞との結合に競合する（ニコラら、1985、前掲）。哺乳
類細胞または大腸菌のいずれかによって産生された非標
識組換えヒトＧ−CSFは、標識したネズミＧ−CSFと、プ
ラスミドpJ17でトランスフェクションされたCOS細胞の
結合反応において充分競合した（第４図）。これに対
し、非標識組換えネズミGM−CSF、ネズミIL−３、ネズ
ミIL−６、ネズミ白血病阻害因子（LIF）、ラットプロ
ラクチンまたはヒトＭ−CSFによっては¹²⁵I−Ｇ−CSFの
COS細胞への結合は全く、阻害されなかった。

２）クロスリンキング反応 Ｇ−CSF¹²⁵I−Ｇ−CSFとCOS細胞によって発現された
レセプターとのクロスリンキング反応を以下のようにし
て行った。

上記のごとく、プラスミドpI62でトランスフェクショ
ンした８×10⁵のCOS細胞（3.5cmプレート）を1.2nMの
¹²⁵I−Ｇ−CSFと一緒に、1.5μＭの非標識Ｇ−CSFの存
在または非存在下、結合培地0.6ml中、４℃で2.5時間イ
ンキュベートした。セルリフターを用いてプレートから
細胞をかきとり、PBS1mlで３回洗浄した。クロスリンキ
ング反応は、150μＭスベリン酸ジスクシンイミジル（D
SS）および150μＭ酒石酸ジスクシンイミジル（DST）を
含有するPBS1ml中で20分間、氷上で行った。1MTris−HC
l（pH7.4）50μを加えて反応を止め、遠心して細胞を
収集し、プロテアーゼインヒビター混合物（2mM EDTA、
2mM（ｐ−アミノフェニル）メタンスルホニルフルオリ
ド塩酸塩、2mM O−フェナンスロリン、0.1mMロイペプチ
ン、１μg/mlペプスタチンＡおよび100単位/mlアプロチ
ニン）を含有する１％Triton X−100 15μで細胞を
溶解した。遠心して上清を得、この澄明なライゼート
（10μ）をSDSの存在下４〜20％ポリアクリルアミド
ゲルグラディエント電気泳動にかけて分析した（レム
リ、Nature 227、680−685（1970））。強化スクリーン
を用い、−80℃で２日間Ｘ−線フィルムに感光した。サ
イズマーカーとして¹⁴Cラベル分子標準（レインボウマ
ーカー、アマーシャム）を並行して電気泳動させた。結
果を第５図に示す。レーン２は過剰量の非標識ネズミＧ
−CSFの存在下、レーン３および４は非存在下のクロス
リンキング反応の結果を表す。ただし、レーン３ではDS
SおよびDSTを含まない反応の結果である。レーン５はネ
ズミNFS−60細胞（３×10⁶細胞／レーン）を同様に¹²⁵I
−Ｇ−CSFと一緒に、過剰量の非標識Ｇ−CSFの存在下、
レーン６は非存在下でインキュベートし、DSSおよびDST
によりクロスリンキングさせた実験の結果を表す。レー
ン１および７はそれぞれサイズマーカーとして用いた¹⁴
Cラベル分子量標準（レインボウマーカー、アマーシャ
ム）である。タンパク質標準の分子量をkdで示す。

NFS−60細胞上のＧ−CSFレセプターと標識化ネズミＧ
−CSF（分子量25,000）とのクロスリンキング反応で見
掛けの分子量125,000−155,000（レーン６）が得られ、
これはNFS−60上のネズミＧ−CSFレセプターの分子量が
100,000−130,000であることを示唆している。同様に、
ネズミ¹²⁵I−Ｇ−CSFとCOS細胞上で発現したレセプター
とのクロスリンキング反応で分子量120,000−150,000
（レーン４）に主バンドを得、これはNFS−60細胞に検
出した値とやや異なっている。これらのバンドはクロス
リンキング反応を非標識Ｇ−CSFの存在下（レーン２お
よび５）、または結合試薬が存在しないとき（レーン
３）には認められなかった。COS細胞とNFS−60細胞の分
子量に僅かな相違はこれらの細胞系でのレセプターのグ
リコシル化が相違することで説明することができる。

３）ハイブリダイゼーション コロニーハイブリダイゼーションとノーザンハイブリ
ダイゼーションを文献記載の方法（マニアティス、Cold
Spring Harbor、New York:Cold Spring Harbor Labora
tory（1982））に従って行った。プローブとして、クロ
ーンpJ17の2.5kb Hind III−Xba I断片をランダムプラ
イマーラベリング法（ファインバーグおよびボーゲルシ
ュタイン、Anal.Biochem.13、26−13（1983））により
³²Pで標識したものを用いた。ノーザンハイブリダイゼ
ーションの結果を第６図に示す。

ネズミの種々の組織から調製した全RNAまたはpoly
（Ａ）RNAを用いた。それらは、L929（レーン１）、NFS
−60（レーン２および３）、FDC−P1（レーン４）、WHE
I−3BD⁺（レーン５）またはマウス組織、脳（レーン
６）、肺（レーン７）、脾臓（レーン８）、骨髄（レー
ン９）、肝臓（レーン10）、および腎臓（レーン11）で
ある。全RNA30μｇ（レーン１、および３〜11）またはp
oly（Ａ）RNA2μｇ（レーン２）を6.6％ホルムアルデヒ
ド含有1.3％アガロースゲル電気泳動にかけ、上記の文
献記載の方法に従い、ノーザンハイブリザイゼーション
で分析した。

実施例３ クローニングしたネズミＧ−CSFレセプターD
NAの塩基配列および該DNAにコードされているポリペプ
チドのアミノ酸配列 １）ヌクレオチド配列決定 DNA配列決定はT7−DNAポリメラーゼ（ファルマシア）
およびα−³²S dATPαＳ（アマーシャム）を用いるジデ
オキシヌクレオチド鎖決定法で行った。結果を第１図お
よび第２図に示す。

第１図はネズミＧ−CSFレセプターcDNA（pI62、pJ17
およびpF1）のヌクレオチド配列およびそれより類推さ
れるアミノ酸配列を示す。各ラインの上下の数字はそれ
ぞれ、ヌクレオチド位置およびアミノ酸位置を表し、ア
ミノ酸は成熟Ｇ−CSFレセプターのCys−１から始まって
いる。アミノ酸配列でシグナル配列および膜貫通領域に
は下線を引いた。２つのオーバーラップしたpoly（Ａ）
付加シグナル（AATAAA）にも下線を引いて示した。潜在
的なＮ−グリコシル化部位（Asn−Ｘ−Ser/Thr）（細胞
外領域の11および細胞質領域の２）は箱で囲まれてい
る。

第２図はネズミＧ−CSFレセプターcDNAであって、Ａ
は３つの独立したcDNA（pI62,pJ17,pF1）の模式図およ
び制限地図である。長方形で囲んだ部分はオープンリー
ディングフレームである。点描および塗り潰した部分は
それぞれ、シグナル配列および膜貫通領域を表す。制限
酵素切断部位も示されている。ＢはネズミＧ−CSFレセ
プターのアミノ酸配列のヒドロパシープロットであっ
て、これは10残基のウインドウを用いるカイトおよびド
ゥーライトの方法（1982）によって得られた。図の下の
番号は前駆体タンパク質のアミノ酸残基の位置を表す。

２）Ｇ−CSFレセプターのアミノ酸配列と他の成長因子
レセプターアミノ酸配列との比較（第７図）。

第７（ａ）図にＧ−CSFレセプターとプロラクチンお
よび成長ホルモンレセプターを並列に示す。ネズミＧ−
CSFレセプターの96−317アミノ酸配列とラットプロラク
チンおよびヒト成長ホルモンレセプターとを比較し、幾
つかのギャップ（−）を導入して得られる最大ホモロジ
ーを示す。２配列における同一残基は実線で囲み、好ま
しい（favored）置換と見なされる残基は破線で囲まれ
ている。好ましいアミノ酸置換は以下のグループのいず
れか１つに属する対のアミノ酸間における置換と定義さ
れる:S,T,P,AおよびG;N,D,EおよびQ;H,RおよびK;M,I,L
およびV;F,YおよびＷ。増殖因子レセプター類（ファミ
リー）の９メンバー（Ｇ−CSF、プロラクチン、成長ホ
ルモン、エレイスロポエチン、GM−CSF、IL−２β、IL
−３、IL−４およびIL−６）の間で保存されているアミ
ノ酸は、各ラインの下に括弧を付けて、また括弧なしに
記載されている。括弧のない残基は８以上のメンバーに
保存されていたが、括弧をした残基はファミリーの５〜
７メンバーに保存されていた。

第７（ｂ）図は第７（ａ）図と同様に、ネズミＧ−CS
Fレセプターの376−601アミノ酸配列とニワトリコンタ
クチンのアミノ酸配列とを並行に示した図である。

第７（ｃ）図はネズミＧ−CSFレセプターの602−808
アミノ酸配列を上記のようにネズミIL−４レセプターと
並列に記載した図である。

第７（ｄ）図はネズミＧ−CSFレセプターの模式図で
あって、箱で囲んだ範囲は成熟Ｇ−CSFレセプターを表
す。“TM"はトランスメンブラン領域、領域“A"は他の
成長因子レセプター（プロラクチンおよび成長ホルモン
レセプター）と同様のドメイン（222アミノ酸）を表
し、“WSXWS"モチーフが見られる。ネズミＧ−CSFレセ
プターの領域“B"（226アミノ酸）とニワトリコンタク
チンとは類似する。領域“C"（211アミノ酸）はトラン
スメンブランドメイン（下線）およびＧ−CSFレセプタ
ーの細胞質ドメインを含み、ネズミIL−４レセプターの
２個の領域と類似している。

実施例４ ヒトＧ−CSFレセプターcDNAのクローニング （１）ヒトＧ−CSFレセプターcDNAクローンの単離 U937細胞からpoly（Ａ）RNAを調製し、逆転写酵素
（生化学工業から購入）とアマーシャム社のcDNA合成キ
ットを用い、文献記載（ナガタら、Nature、319、415〜
418（1986））の方法に従って２本鎖cDNAを合成した。
得られた平滑末端cDNAにBstX1アダプターを付加し、１
％アガロースゲルで電気永動した。2.5kb以上のcDNAを
ゲルから回収し、哺乳類発現ベクターpEF−BOS（第14
図）に結合させ、得られたDNAでE.coli DH1細胞を電気
穿孔法（ダウエルら、Nucleic Acids Res.、16、6127−
6145（1988））を用いて形質転換した。

次いで、得られたライブラリーの合計3.4×10⁴個のク
ローンをコロニーハイブリダイゼーションでスクリーニ
ングした。

ハイブリダイゼーションプローブはネズミＧ−CSFレ
セプターcDNAの2.5kbHind III−Xba I断片をランダムオ
リゴヌクレオチドプライマー標識法［サンブルック（Sa
mbrook,J.）、フリッツ（Fritsch,E.F.）およびマニア
ティス（Maniatis,T.）、モレキュラー・クローニング
（Molecular Cloning）（1989）：ア・ラボラトリー・
マニュアル（A Laboratory Manual）、第２版、コール
ド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（Cold Sprin
g Harbor,New York）：コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laborator
y）］により³²Pでラベルしたものを用いた。ここで用い
たプローブはネズミＧ−CSFレセプターcDNA（pI62）で
ある。そのヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列
を添付の第１図に示す。なお、この第１図においてシグ
ナル配列および膜貫通領域には下線が付されている。ま
た、潜在的なＮ−グリフシル部位は四角で囲まれてい
る。

ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション
温度を28℃に下げ、フィルターを37℃において150mM Na
Cl/15mMクエン酸ナトリウム、pH7.0/0.1％NaDodSo₄で洗
浄する他は文献［フクナガ（Fukunaga,R.）、マツヤマ
（Matsuyama,M.）、オカムラ（Okamura,H.）、ナガタ
（Nagata,K.）、ナガタ（Nagata,S.）およびソカワ（So
kawa,Y.）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucl.
Acids Res.）、14、4421〜4436（1986）］に従って行っ
た。即ち、コロニーのレプリカフィルターを作製し、各
ニトロセルロースフィルターと95℃で５分間加熱後急冷
したプローブとを28℃で12時間ハイブリダイゼーション
させた。次いで、上記記載の方法でフィルターを洗浄
後、オートラジオグラフィーにより目的のクローンを探
索した。

他方、λgt11を用いて構築されたヒト胎盤cDNAライブ
ラリーをクローンティック（Clonetech）社より購入
し、ネズミＧ−CSFレセプターcDNAを用いるプラークハ
イブリダイゼーションによりスクリーニングした。

即ち、約1.5×10⁶個のクローンのファージDNAをベン
トンおよびディビスによって記載された方法（Benton,
W.D.＆ Davis,R.W.,Science,196,180−182（1977））に
よってニトロセルロースフィルターに移した後、プラー
クハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。
用いたプローブDNAおよびハイブリダイゼーション条件
は、上記に記載したU983 cDNAライブラリーのスクリー
ニングに用いたプローブおよび条件と同一である。

U937細胞から調製したcDNAライブラリーから５個の陽
性クローンを単離した（pHQ1〜pHQ5）。

他方、ヒト胎盤cDNAライブラリー（1.5×10⁶個）とネ
ズミＧ−CSFレセプターcDNAとのプラークハイブリダイ
ゼーションにおいて100個以上の陽性シグナルを示すク
ローンが得られ、その６個の陽性クローン（λHG4、
５、11、12、14および18）のEcoR I断片をpBluescript
SK（＋）ベクターにサブクローンし、pHQ4、５、11、1
2、14あるいは18と命名した。

DNAの塩基配列決定のために、エキソヌクレアーゼIII
およびmung beanヌクレアーゼ（サンブルックら、前
掲）を用いて約300bpづつ欠失した一連のプラスミドを
調製した。そして、配列決定はT7DNAポリメラーゼ、dea
za dGTPおよびα−³⁵SdATPα−Ｓを用い、ジデオキシ鎖
ターミネーション法で行なった。

配列決定の結果、U937および胎盤cDNAライブラリーか
ら単離されたcDNAは以下の３クラスに分類されることが
分かった。

クラス1:プラスミドpHQ3（U937）およびpHG12（胎盤） U937および胎盤cDNAライブラリーから単離された大部
分のcDNAがこのクラスに属する。これらプラスミドの塩
基配列および推定のアミノ酸配列を第８図Ａに示す。ま
た、その制限酵素切断部位を示す地図を第９図に示す。

これらのクラス１のプラスミドは836アミノ酸からな
るタンパク質をコードする大きいオープンリーディング
フレームを有している。推定のアミノ酸配列のヒドロパ
シー分析の結果、図面から明らかなように、Ｎ−末端23
アミノ酸残基がシグナル配列に相当し、604残基の細胞
外ドメイン、26残基の、膜貫通領域、および183残基の
細胞質ドメインが続く。この細胞外領域には９個の潜在
的Ｎ−グリコシル化部位が存在する。

また、このcDNAによってコードされているペプチドの
細胞外ドメインには17個のシステイン残基が存在し、内
14個はヒトおよびネズミで保存されている。また、該ド
メインにはサイトカインレセプターで保存されている
“WSXWS"モチーフも存在しており、ヒトＧ−CSFレセプ
ターがサイトカインレセプターに属することが示され
た。

このクラス１のプラスミドでコードされているヒトＧ
−CSFレセプター（813アミノ酸）とネズミＧ−CSFレセ
プターの相同性はヌクレオチド配列レベルで72％、アミ
ノ酸配列レベルで62.5％であった。また、アミノ酸配列
における相同性は分子の全領域を通して均一であった。

クラス2:プラスミドpHQ2（U937細胞） プラスミドpHQ2の塩基配列は、pHQ3の配列から、ヌク
レオチド番号2,034−2,121の88ヌクレオチドが欠失して
いることを除いてpHQ3のそれと同一である。欠失配列の
末端は、第８図Ａ記載の配列の黒い矢頭で示されてい
る。

図から明らかなように、この88ヌクレオチドの欠失領
域には膜貫通領域が含まれている。欠失部分から下流の
ヌクレオチド配列を第８図Ｂに示す。

pHQ2においては、欠失部位から下流の150アミノ酸を
コードする翻訳リーディングフレームがこの欠失により
変化しており（第９図参照）、分泌、可溶化型のＧ−CS
Fレセプターをコードしていると考えられる。この可溶
化型レセプターは748アミノ酸からなり、分子量計算値
は82,707である。

クラス3:プラスミドpHG11およびpHG5（胎盤） これらプラスミドのヌクレオチド配列はpHQ3のヌクレ
オチド番号2,210位に81bpDNA断片が挿入されたものであ
る。挿入位置はＧ−CSFレセプターの細胞質ドメイン内
にあり、第８図Ａにおいて太い矢印で表示した部位であ
る。翻訳オープンリーディングフレームは変化していな
い。挿入体のヌクレオチド配列および推定の塩基配列を
第８図Ｃに示す。従ってプラスミドpHQ2にコードされて
いるレセプターは第１クラスのＧ−CSFレセプターより
もアミノ酸数で27、分子量で2,957大きいことになる。

これら３クラスのプラスミドのヌクレオチド配列およ
び推定のアミノ酸配列は第８図に記載されている。この
図において、ＡにおけるpHQ2の配列における種々の記号
等は以下の意味を有する。アミノ酸配列の番号はアミノ
酸Gluを番号１とするものである。シグナル配列および
膜貫通領域は太い下線、Ｎ−グリコシル化部位（Asn−
Ｘ−Thr/Ser）は四角で示されている。サイトカインレ
セプターファミリーに保存されている“WSXWS"モチーフ
部分は２重下線で示されている。黒の矢頭はpHQ2におい
て欠失されている配列の末端、太い矢印はpHG11におけ
る挿入体の挿入部位を表す。細い矢印は後述のPCR法に
用いたオリゴヌクレオチドプライマー部分を示す。Ｂに
おいて、Δから下流の配列は、pHQ2における、pHQ3の欠
失されたヌクレオチド2,034から下流の配列に相当する
ヌクレオチド配列、および推定のアミノ酸配列を示す。
ＣはpHG11に含有されている、pHQ3のアミノ酸657位への
挿入体のヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列で
ある。挿入された配列は括弧で囲まれている。

上記３クラスのプラスミドの制限地図は第９図に示さ
れている。図中、四角で囲んだ部分はオープンリーディ
ングフレーム、陰影を付けた部分はシグナル配列、塗り
つぶした部分は膜貫通領域を表す。pHQ2における斜線部
分は他のcDNAのオープンリーディングフレームから変化
した部分であって、異なるアミノ酸をコードする配列を
表す。pHG11における斜線部分は27アミノ酸をコードす
る挿入体配列部分を表す。

（２）ヒト細胞におけるＧ−CSFレセプターmRNAの検出 上記cDNAから調製したプライマーを用い、ポリメラー
ゼ鎖反応（PCR）法によってヒトＧ−CSFレセプターmRNA
を検出した。

１本鎖cDNAの合成およびPCRは実質上カワサキ［カワ
サキ（Kawasaki,E.S.）、ピーシーアール・プロトコー
ルズ（PCR Protocols）、「ア・ガイド・トゥー・メソ
ッズ・アンド・アプリケーション（A guide to methods
and application）」、アイニス（Innis,M.A.）、ゲル
ファンド（Gelfand,D.H.）、シャインスキー（Shinsky,
J.J.）およびホワイト（White,T.J.）ら編、（アカデミ
ック・プレス、サン・ディエゴ、カリフォルニア（Acad
emic Press,San Diego,CA））、21頁〜27頁（1990）］
の方法に従って行い、結果を第12図に示した。

即ち、ヒト胎盤またはU937細胞から得た全RNA（レー
ン２および５）またはpoly（Ａ）RNA（レーン21および
４）、あるいはヒト胎盤（レーン３および６）２μｇを
反応混合物50μ中、ランダム６量体（ヘキサマー）0.
5μｇとAMV逆転写酵素80単位の存在下、既述（カワサキ
ら、前掲）の如くし、cDNA合成に付した（カワサキら、
前掲）。

反応混合物５μをとり、下記の順（フォワード）お
よび逆（リバース）プライマー各50nmolを含有するPCR
バッファー100μで希釈し、80℃に予備加熱したDNAサ
ーマルサイクラー（パーキン−エルマー−セタス）中に
置いた。

次いで、Tagポリメラーゼ2.5単位を加えて反応を開始
した。PCRの条件は以下の通りである。95℃で1.5分、70
℃で1.5分、72℃で1.5分、のサイクルを30回行う。

最後に、生成物（反応混合物の10％）をTBEバッファ
ー中、1.5％アガロースゲル電気泳動にかけ臭化エチジ
ウム蛍光で観察した。サイズマーカーとして、BamH Iお
よびMva I消化pBR322を同時に電気泳動しDNA断片のサイ
ズを塩基対で示した。単離したDNAに対応する増幅したD
NA断片（A1、A2、B1およびB2）を矢印で示した。

第12図において、レーン１〜３の試料はヌクレオチド
番号1,790−1,810の順プライマーと2,179−2,156の逆プ
ライマーの組を用いて増幅したものである。レーン４〜
６は、第２のオリゴヌクレオチド（ヌクレオチド番号2,
086〜2,105および2,322〜2,303）を特異的プライマーと
して増幅した試料である。

図から明らかなように、U937および胎盤細胞のいずれ
もクラスIG−CSFレセプターを発現し、U937細胞は可溶
性Ｇ−CSFレセプターを発現し、さらに、胎盤細胞は細
胞質領域に挿入体を有するＧ−CSFレセプターを発現す
ることが確認された。

実施例５ クローニングしたＧ−CSFレセプターcDNAに
よるCOS細胞の形質転換および形質転換体の結合活性 ネズミ¹²⁵I−Ｇ−CSFと実施例４で得たcDNAで形質転
換されたCOS細胞との結合を調べた。

ネズミ組換えＧ−CSFの標識化、ヒトＧ−CSFレセプタ
ーcDNAを含有する発現ベクターによるCOS細胞の形質転
換、および¹²⁵I−Ｇ−CSFのCOS細胞への結合アッセイは
前述のネズミの実施例で開示した方法に従って行った。

プラスミドpHG11を用いて、細胞質領域に挿入体を有
する完全長さのcDNAを構築した。即ち、プラスミドpHG1
1を制限酵素（Nhe I、宝酒造により購入）完全消化、Bs
tX I（1,425）（宝酒造より購入）部分消化した。制限
酵素の反応条件は、宝酒造からの酵素に添付されている
反応条件に従った。

次いで、1.38kb BstX I−Nhe I断片とpHQ3の6.9kb Bs
tX I−Nhe I断片とをT4−DNAリガーゼ（宝酒造より購
入）を用いて結合させてpQW11を構築した。そして、こ
れらのcDNAを含有する発現プラスミド（pHQ2、pHQ3およ
びpQW11）でCOS細胞を形質転換し、¹²⁵I−Ｇ−CSFに対
する結合を検討した。

即ち、15cmのプレート上で培養したCOS細胞と、20μ
ｇのpHQ2、pHQ3またはpQW11でトランスフェクションし
た。グリセリンショク後、12時間後に６ウエルのマイク
ロタイタープレートに分割して入れ、10％FCS含有DMEM
中、60時間培養した。細胞を結合培地（10％FCSFおよび
20mM HEPES（pH7.3）含有DMEM）で洗浄し、種々の量の
¹²⁵I−Ｇ−CSF（10pM〜1.2nMの範囲）と一緒に４℃で４
時間インキュベートした。¹²⁵I−Ｇ−CSFと細胞の非特
異的結合を測定するために、大過剰の非標識Ｇ−CSF（8
00nM）の存在下で結合反応を行い、全結合活性から非特
異的に結合した放射活性を差し引くことにより特異的結
合活性を求めた。第10図Ａは、¹²⁵I−Ｇ−CSFのCOS細胞
への飽和結合活性、第10図Ｂはそのスキャッチャード解
析の結果を示す。この際、ネズミＧ−CSFレセプターcDN
Aも同様にCOS細胞へ導入し、Ｇ−CSFの結合活性を検討
した。

第10図において、▲はネズミＧ−CSFレセプターcDNA
で形質転換されたCOS細胞を示す。そしてヒトＧ−CSFレ
セプターcDNAで形質転換されたCOS細胞の内、pHQ3によ
る形質転換体は○、pHQ2による形質転換体は●、pQW11
による形質転換体は△で示されている。

第10図から、pHQ3あるいはpHQ11で形質転換されたサ
ルCOS細胞はネズミ¹²⁵I−Ｇ−CSFと高い親和性を有し、
結合における解離定数は550pM、レセプター数は3.4×10
⁴個／細胞であることが分かる。また、pHQ2cDNAで形質
転換されたCOS細胞とネズミ¹²⁵I−Ｇ−CSFとの結合は、
プラスミドpHQ2が一部を欠失したペプチドをコードして
いることから、極めて低レベルであった（解離定数440p
M、結合部位６×10³/細胞）。このことは膜貫通領域を
欠くpHQ2によりコードされたレセプターは細胞から分泌
され、培地中に蓄積されている可能性を強く示唆してい
る。

また、プラスミドpQW11による形質転換体とpHQ3によ
る形質転換体がほぼ同等のネズミ¹²⁵I−Ｇ−CSFに対す
る結合活性を示すことは、細胞質ドメインにおける27ア
ミノ酸挿入体がＧ−CSFの結合に殆ど影響していないこ
とを示している。

なお、形質転換体の発現により取得されるヒトＧ−CS
Fレセプターの精製については、前述の天然のマウスＧ
−CSFレセプターの精製方法を使用することができる。

実施例６ ヒトＧ−CSFレセプターをコードするDNAおよ
びmRNAの分析 ノーザンハイブリダイゼーションおよびサザーンハイ
ブリダイゼーションにより、ヒトＧ−CSFレセプターを
コードするDNAまたはRNAを分析した。

全RNAは種々の細胞系統および新鮮なヒト臨月胎盤か
ら既述（サンブルック、前掲）のごとくグアニジンイソ
チオシアネート/CsCl法を用いて調製した。

他方、細胞DNAはヒトＴリンパ球から、文献（フクナ
ガら、Nucleic,Acids Res.、14、4421−4436（1986））
に記載された方法に従い調製した。

サザーンおよびノーザンブロットハイブリダイゼーシ
ョンはヒトＧ−CSFレセプターcDNAを含有するプラスミ
ドpHQ3のXho I DNAフラグメント（3kb）をプローブとし
て、文献記載の方法（マニアティスら、Molecular Clon
ing、Cold Spiring Harbor Laboratory（1982））に従
って行なった。

１）Ｇ−CSFレセプター転写物およびゲノムDNAの分析 種々の細胞からのmRNAをヒトＧ−CSFレセプターcDNA
をプローブとするノーザンハイブリダイゼーションによ
り試験した。

結果を第11図に示す。用いた細胞は以下の通りであ
る。ヒトU937細胞（レーン１および２）、ヒトKG−１
（レーン３）、ヒトHL−60（レーン４）、ヒトFL（レー
ン６）、ヒトCHU−２（レーン７）、およびヒト胎盤
（レーン５および８）。

U937:human histiocytic lymphoma,ATCC CRL1593 KG−1:human acute myelogenous leukemia,ATCC CCL2
46 HL−60:human promyelocytec leukemia,ATCC CCL240 FL:human amnion,ATCC CCL62 また、レーン２〜６および８は全RNA（20μｇ）、レ
ーン１および７はpoly（Ａ）RNA（１μｇ）を表す。

第11図Ａは、ヒトＧ−CSFレセプターcDNAをDNAプロー
ブとし、ハイブリダイゼーション後フィルターをＸ−線
フィルムに40時間、感光させて得た像の模写図である
（ただし、レーン８は２時間）。

U937、胎盤およびKG−１から得たRNAでは3.7kbに単一
のバンドが観察される。しかも、胎盤由来のRNAに検出
されたシグナルはU937由来RNAにおけるそれの20倍以上
である。

Ｂは、ブロットを再度、³²P標識ヒト延長因子（エロ
ンゲーションファクター）１αcDNA［ウエツキ（Uetsuk
i,T.）、ナイトウ（Naito,A.）、ナガタ（Nagata,S.）
およびカジロ（Kaziro,Y.）、ジャーナル・オブ・バイ
シオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、264、5
791〜5798（1990）］によるハイブリダイゼーションに
付し、フィルターをＸ線フィルムに１時間感光させて得
た像の模写図である。この場合には、どの細胞から調製
したRNAも殆んど同様のシグナルが得られた。これらの
結果は胎盤がＧ−CSFレセプターのmRNAを非常に大量に
発現していることを示しており、Ｇ−CSFの胎盤成長促
進作用を示唆するものである。

２）サザーンハイブリダイゼーション サザーンハイブリダイゼーション法によりヒトＧ−CS
Fレセプターをコードする遺伝子の数を検討した。

ヒトゲノムDNA10μｇをEcoR I、Hind III、BamH I、B
gl II、Xba I、Pst I、Sac IおよびApa Iで消化し、0.8
％アガロースゲル電気泳動にかけた。DNAをニトロセル
ロースフィルターに移し、³²P標識ヒトＧ−CSFレセプタ
ーcDNAとハイブリダイズした。この際、DNAサイズマー
カーを同時に泳動した。

結果を第13図に示す。図はEcoR I（レーン１）、Hind
III（レーン２）、BamH I（レーン３）、Bgl II（レー
ン４）、Xba I（レーン５）、Pst I（レーン６）、Sac
I（レーン７）およびApa I（レーン８）の各消化断片に
関する分析結果を示すものである。制限酵素EcoR I、Hi
nd III、Bgl II、およびXba Iで消化したDNAには１〜２
個のバンドしか認められないが、BamH I、Pst I、Sac
I、およびApa Iで消化したDNAはそれぞれ４〜５個のバ
ンドが認められる。第９図記載のごとく、ヒトＧ−CSF
レセプターcDNAは3BamH I、6Pst I、2Sac I、および3Ap
a I制限酵素切断部位を有するので、この結果よりヒト
ハプロイドゲノムあたり１個のＧ−CSFレセプター遺伝
子が存在すると推定される。

図面の簡単な説明 第１図はネズミＧ−CSFレセプターのヌクレオチド配
列およびそれより類推されるアミノ酸配列の模式図、第
２図はネズミＧ−CSFレセプターcDNA（pI62、pJ17およ
びpF1）の模式図、制限地図およびヒドロパシープロッ
トを示すグラフ、第３図は組換えネズミＧ−CSFを発現
するCOS細胞およびNFS−60細胞とネズミ¹²⁵I−Ｇ−CSF
との結合を示すグラフであって、Ａはネズミ¹²⁵I−Ｇ−
CSFとCOS細胞との飽和結合、ＢはCOS細胞へのネズミＧ
−CSF結合データのスキャッチャードプロットを示すグ
ラフ、Ｃはネズミ¹²⁵I−Ｇ−CSFのNFS−60細胞への飽和
結合を示すグラフ、ＤはNFS−60細胞へのネズミＧ−CSF
結合データのスキャッチャードプロットを示すグラフ、
第４図はCOS細胞で発現された組換えネズミＧ−CSFレセ
プターとネズミＧ−CSFとの結合特異性を表すグラフ、
第５図はCOS細胞およびNF−60細胞で発現されたネズミ
Ｇ−CSFレセプターのクロスリンキング反応の結果を表
すグラフ、第６図はネズミＧ−CSFレセプターmRNAのノ
ーザンハイブリダイゼーション分析の結果を表す写真の
模写図、第７図はネズミＧ−CSFレセプターのアミノ酸
配列と他の成長因子レセプターアミノ酸配列とを対比さ
せて示した配列図およびネズミＧ−CSFレセプターの模
式図である。

第８図はヒトＧ−CSFレセプターをコードするcDNAの
ヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列であって、
ＡはプラスミドpHQ3およびpHG12のヌクレオチド配列お
よび推定のアミノ酸配列、ＢはpHQ2の配列の内、pHQ3の
配列と異なる配列部分であって、pHQ3のヌクレオチド番
号2,034から下流に相当する配列のヌクレオチド配列お
よび推定のアミノ酸配列、ＣはpHG11の配列の内、pHQ3
に挿入されている挿入体のヌクレオチド配列および推定
のアミノ酸配列の模式図である。第９図は第８図記載の
pHQ3およびpHG12、pHQ2、並びにpHG11の制限酵素地図の
模式図である。第10図はCOS細胞により発現された組換
えヒトＧ−CSFレセプターのネズミＧ−CSFとの結合特性
を示すグラフであり、Ａは¹²⁵I−Ｇ−CSFのCOS細胞への
飽和結合を示すグラフ、ＢはＧ−CSF結合データのスキ
ャッチャード解析の結果を示すグラフである。第11図は
ヒトＧ−CSFレセプターmRNAのノーザンハイブリダイゼ
ーション分析の結果を示す写真の模写図である。第12図
はヒトＧ−CSFレセプターmRNAのPCRにおける結果を示す
写真の模写図である。第13図はヒトＧ−CSFレセプター
のサザーンハイブリダイゼーション分析の結果を示す写
真の模写図、第14図は発現ベクターpEF−BOSの模式図で
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 特表 平５−500614（ＪＰ，Ａ) Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．61，Ｎｏ．２ （1990．Ａｐｒ．）ｐ．341−350 Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．74，Ｎｏ．１ （1989）ｐ．56−65 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (14)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下のいずれかのアミノ酸配列を含み、顆
   粒球コロニー刺激因子との結合活性を有するタンパク質
   をコードするDNA。 （１）下記の式（ａ）〜（ｃ）に記載のアミノ酸配列に
   おいて、アミノ酸番号１−812で表されるアミノ酸配
   列、および （２）下記の式（ａ）〜（ｂ）に記載のアミノ酸配列に
   おいて、アミノ酸番号１−601で表されるアミノ酸配
   列。 【化１】 【化２】 【化３】
2. 【請求項２】以下のいずれかのアミノ酸配列からなるタ
   ンパク質をコードするDNA。 （１）下記の式（ａ）〜（ｃ）に記載のアミノ酸配列に
   おいて、アミノ酸番号１−812で表されるアミノ酸配
   列、および （２）下記の式（ａ）〜（ｂ）に記載のアミノ酸配列に
   おいて、アミノ酸番号１−601で表されるアミノ酸配
   列。 【化４】 【化５】 【化６】
3. 【請求項３】以下のいずれかの塩基配列からなるDNA。 （１）下記の式（ａ）〜（ｃ）に記載の塩基配列におい
   て、ヌクレオチド番号255−2690で表される塩基配列、
   および （２）下記の式（ａ）〜（ｂ）に記載の塩基配列におい
   て、ヌクレオチド番号255−2057で表される塩基配列。 【化７】 【化８】 【化９】
4. 【請求項４】以下のいずれかのアミノ酸配列を含み、顆
   粒球コロニー刺激因子との結合活性を有するタンパク質
   をコードするDNA。 （１）下記の式Ａ（ａ）およびＡ（ｂ）に記載のアミノ
   酸配列において、アミノ酸番号１−813で表されるアミ
   ノ酸配列、 （２）下記の式Ａ（ａ）およびＡ（ｂ）に記載のアミノ
   酸配列におけるアミノ酸番号１−595で表されるアミノ
   酸配列と、式Ｂに記載のアミノ酸配列におけるアミノ酸
   番号596−748で表されるアミノ酸配列からなるアミノ酸
   配列、および （３）下記の式Ａ（ａ）およびＡ（ｂ）に記載のアミノ
   酸配列におけるアミノ酸番号１−813で表されるアミノ
   酸配列のアミノ酸番号657位Gluおよび658位Aspの間に、
   下記の式Ｃに記載のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号
   658−684で表されるアミノ酸配列が挿入されてなるアミ
   ノ酸配列。 【化１０】 【化１１】 【化１２】
5. 【請求項５】以下のいずれかのアミノ酸配列からなるタ
   ンパク質をコードするDNA。 （１）下記の式Ａ（ａ）およびＡ（ｂ）に記載のアミノ
   酸配列において、アミノ酸番号１−813で表されるアミ
   ノ酸配列、 （２）下記の式Ａ（ａ）およびＡ（ｂ）に記載のアミノ
   酸配列におけるアミノ酸番号１−595で表されるアミノ
   酸配列と、式Ｂに記載のアミノ酸配列におけるアミノ酸
   番号596−748で表されるアミノ酸配列からなるアミノ酸
   配列、および （３）下記の式Ａ（ａ）およびＡ（ｂ）に記載のアミノ
   酸配列におけるアミノ酸番号１−813で表されるアミノ
   酸配列のアミノ酸番号657位Gluおよび658位Aspの間に、
   下記の式Ｃに記載のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号
   658−684で表されるアミノ酸配列が挿入されてなるアミ
   ノ酸配列。 【化１３】 【化１４】 【化１５】
6. 【請求項６】以下のいずれかの塩基配列からなるDNA。 （１）下記の式Ａ（ａ）およびＡ（ｂ）に記載の塩基配
   列において、ヌクレオチド番号239−2677で表される塩
   基配列、 （２）下記の式Ａ（ａ）およびＡ（ｂ）に記載の塩基配
   列におけるヌクレオチド番号239−2033で表される塩基
   配列と、式Ｂに記載の塩基配列におけるヌクレオチド番
   号2034−2482で表される塩基配列からなる塩基配列、お
   よび （３）下記の式Ａ（ａ）およびＡ（ｂ）に記載の塩基配
   列におけるヌクレオチド番号239−2677で表される塩基
   配列のヌクレオチド番号2,209位Ｇと2,210位Ｇとの間
   に、下記の式Ｃに記載の塩基配列おけるヌクレオチド番
   号2,210−2,290で表される塩基配列が挿入されてなる塩
   基配列。 【化１６】 【化１７】 【化１８】
7. 【請求項７】以下のいずれかのアミノ酸配列を含み、顆
   粒球コロニー刺激因子との結合活性を有するタンパク
   質。 （１）下記の式（ａ）〜（ｃ）に記載のアミノ酸配列に
   おいて、アミノ酸番号１−812で表されるアミノ酸配
   列、および （２）下記の式（ａ）〜（ｂ）に記載のアミノ酸配列に
   おいて、アミノ酸番号１−601で表されるアミノ酸配
   列。 【化１９】 【化２０】 【化２１】
8. 【請求項８】以下のいずれかのアミノ酸配列からなるタ
   ンパク質。 （１）下記の式（ａ）〜（ｃ）に記載のアミノ酸配列に
   おいて、アミノ酸番号１−812で表されるアミノ酸配
   列、および （２）下記の式（ａ）〜（ｂ）に記載のアミノ酸配列に
   おいて、アミノ酸番号１−601で表されるアミノ酸配
   列。 【化２２】 【化２３】 【化２４】
9. 【請求項９】以下のいずれかのアミノ酸配列を含み、顆
   粒球コロニー刺激因子との結合活性を有するタンパク
   質。 （１）下記の式Ａ（ａ）およびＡ（ｂ）に記載のアミノ
   酸配列において、アミノ酸番号１−813で表されるアミ
   ノ酸配列、 （２）下記の式Ａ（ａ）およびＡ（ｂ）に記載のアミノ
   酸配列におけるアミノ酸番号１−595で表されるアミノ
   酸配列と、式Ｂに記載のアミノ酸配列におけるアミノ酸
   番号596−748で表されるアミノ酸配列からなるアミノ酸
   配列、および （３）下記の式Ａ（ａ）およびＡ（ｂ）に記載のアミノ
   酸配列におけるアミノ酸番号１−813で表されるアミノ
   酸配列のアミノ酸番号657位Gluおよび658位Aspの間に、
   下記の式Ｃに記載のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号
   658−684で表されるアミノ酸配列が挿入されてなるアミ
   ノ酸配列。 【化２５】 【化２６】 【化２７】
10. 【請求項１０】以下のいずれかのアミノ酸配列からなる
    タンパク質。 （１）下記の式Ａ（ａ）およびＡ（ｂ）に記載のアミノ
    酸配列において、アミノ酸番号１−813で表されるアミ
    ノ酸配列、 （２）下記の式Ａ（ａ）およびＡ（ｂ）に記載のアミノ
    酸配列におけるアミノ酸番号１−595で表されるアミノ
    酸配列と、式Ｂに記載のアミノ酸配列におけるアミノ酸
    番号596−748で表されるアミノ酸配列からなるアミノ酸
    配列、および （３）下記の式Ａ（ａ）およびＡ（ｂ）に記載のアミノ
    酸配列におけるアミノ酸番号１−813で表されるアミノ
    酸配列のアミノ酸番号657位Gluおよび658位Aspの間に、
    下記の式Ｃに記載のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号
    658−684で表されるアミノ酸配列が挿入されてなるアミ
    ノ酸配列。 【化２８】 【化２９】 【化３０】
11. 【請求項１１】請求項１〜６のいずれかに記載のDNAを
    含有する発現ベクター。
12. 【請求項１２】請求項11記載の発現ベクターを含有する
    形質転換体。
13. 【請求項１３】請求項12記載の形質転換体を培地に培養
    し、得られた培養物から顆粒球コロニー刺激因子と結合
    し得る生成物を回収することからなる顆粒球コロニー刺
    激因子レセプターの製造方法。
14. 【請求項１４】請求項13記載の方法で製造された顆粒球
    コロニー刺激因子レセプター。