DE69934308T2

DE69934308T2 - Il-6-antagonist peptide

Info

Publication number: DE69934308T2
Application number: DE69934308T
Authority: DE
Inventors: Ottaviano Serlupi-Crescenzi; Alessandro Bressan; Linda Della Pietra; Rita Anna PEZZOTTI
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Merck Serono SA
Priority date: 1998-05-18
Filing date: 1999-05-18
Publication date: 2007-03-29
Anticipated expiration: 2019-05-19
Also published as: CA2332817C; WO1999060013A3; ES2273492T3; JP4468578B2; ATE347563T1; US6838433B2; AU749616B2; IL139575A; CA2690399A1; IL139575A0; US6599875B1; US20030186876A1; JP2002527354A; AU4362799A; CY1105865T1; EP1078001B1; DE69934308D1; DK1078001T3; EP0972780A1; CA2690399C

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft IL-6-Antagonist-Peptide, die aufgrund ihrer Fähigkeit, an die intrazelluläre Domäne von gp130 zu binden, durch das Two-Hybrids-System aus einer Peptid-Bibliothek isolierbar sind und wenigstens 5 Aminosäuren enthalten. Insbesondere umfassen solche Peptide eine Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: SEQ ID NO: 6, sowie Salze, funktionelle Derivate, Vorläufer und Analoga davon.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, das Peptid in im Wesentlichen gereinigter Form bereitzustellen, um als aktiver Inhaltsstoff zur Verwendung in pharmazeutischen Zusammensetzungen in Pathologien, die IL-6-Aktivitätsinhibierung erfordern, geeignet zu sein.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das Two-Hybrid-System (THS) ist ein Verfahren, das Transkriptionsaktivität als ein System verwendet, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu detektieren. Eine Genfusion wird konstruiert, um für die DNA-Bindedomäne des Hefe-Transkriptionsfaktors GAL4 als Hybrid mit einem beliebigen Protein "X" (üblicherweise ein definiertes Säugerprotein, das das "Köder"-Bindungsziel" ("bait" binding target") darstellt) zu codieren. Ein zusätzliches Genfusionskonstrukt wird für die an beliebiges Protein "Y" (üblicherweise eine Bibliothek diverser Proteine, der "Fisch") fusionierte Transkriptionsaktivierungs-Domäne von GAL4 codieren (Fields et al., 1994). Immer wenn eine X-Y-Wechselwirkung auftritt, wird sie die Aktivierungsdomäne nahe an Orte auf der DNA bringen, die von der GAL4-DNA-Bindedomäne erkannt werden, was daher in der Expression eines flankierenden Reportergens, das durch diese DNA-Orte reguliert wird, resultiert. Die allgemein verwendeten Reportergene schließen ein: 1) lacZ, das blaue Kolonien auf Platten oder Filtern, die X-Gal enthalten, erzeugt; und 2) His3, ein Hefegen, das an Histidin-Biosynthese beteiligt ist, erforderlich für das Wachstum von Wirts-Hefezellen.
Kürzlich haben Fields und sein Team das THS zum Screening bzw. zur Durchmusterung einer Bibliothek von Zufallspeptiden, anstatt einer cDNA-Bibliothek, verwendet, um Peptide zu finden, die zur Bindung an das Retinoblastom-Protein (Rb) fähig sind (Yang et al., 1995).
Das Rezeptorsystem für Interleukin-6 (IL-6) besteht aus zwei verschiedenen Rezeptor- "Untereinheiten", bezeichnet als gp80 und gp130 (siehe Hirano et al., 1994).
Die Cytokine vom IL-6-Typ lösen ihr Signal durch Rezeptoren aus, die das gp130-Protein gemeinsam haben. Bei Ligandenbindung homo- oder heterodimerisiert gp130 mit dem LIF- und dem OSM-Rezeptor, wodurch assoziierte JAK-Tyrosinkinasen aktiviert werden. Die JAKs phosphorylieren den Signaltransduktor (gp130) und latente Transkriptionsfaktoren der STAT-Familie (Signal Transducer and Activator of Transcription), wie STAT1 und STAT3 im Falle von IL-6. STAT-Faktoren dimerisieren, translozieren zum Kern und binden Enhancer-Elemente bzw. Verstärkerelemente von auf IL-6-Antwortenden Genen (Lüttiken et al., 1993).
Deletionsanalyse der intrazellulären Domäne von gp130 hat kurze Bereiche von Aminosäuren, die als box1 und box2 bekannt sind, definiert, die hinreichend sind, um sowohl mitogene Aktivität als auch Bindung von JAK-Proteinen zu vermitteln (Vanderkuur et al., 1994): diese Aktivitäten wurden auch beobachtet, wenn die Bindungsstellen von STATs deletiert waren. Deshalb können JAK-Kinasen zwei Funktionen zugeschrieben werden: 1) Aktivierung von STAT-vermittelter Genexpression; 2) Aktivierung von STAT-unabhängiger mitogener Aktivität wenigstens in einigen hämatopoetischen Zellen.
Weitere Kinasen sind bekannt dafür, mit dem intrazellulären Anteil von gp130 zu assoziieren, z.B. Hck, Fes, Btk und Tec (Matsuda et al., 1995). Jedoch sind diese Interaktionen noch nicht auf der molekularen Ebene aufgeklärt worden. Darüber hinaus haben Tanner et al. gezeigt, dass die box1-Domäne von Cytokin-Rezeptoren für eine Interaktion mit JAK-Kinasen erforderlich, aber nicht ausreichend ist, und haben vorgeschlagen, dass die box1-Sequenzen mit anderen cytoplasmatischen Domänen-Sequenzen kooperieren, um JAK-Kinase-Assoziation zu bewirken (Tanner et al., 1995). Selbst das molekulare Gegenstück zu JAK-Kinasen von box1 und box2 ist nicht definiert worden.
Synthetische Peptide, die IL-6-Aktivität inhibieren, sind in der internationalen Patentanmeldung WO 97/13781 (YEDA) beschrieben worden, die Peptide betrifft, die vom gp80-Protein abgeleitet sind. Die internationale Patentanmeldung WO 97/48728 offenbart neun IL-6- und IL-6-Rezeptor-abgeleitete Peptide, die angeblich eine IL-6-Antagonist- oder -Agonist-Aktivität besitzen.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Als ein Ziel im THS haben wir den intrazellulären Anteil des humanen IL-6-Rezeptors (gp130-ICD) analysiert. Dieses THS-Screening sollte deshalb Kandidaten-Peptide ("candidate peptides") identifizieren, die fähig sind, direkt mit gp130-ICD auf eine Phosphorylierungsunabhängige Weise wechselzuwirken. Es ist bekannt, dass Phosphorylierungs-unabhängige Wechselwirkungen mit gp130-ICD bei der Transduktion des durch Cytokine vom IL-6-Typ ausgelösten Signals auftreten. gp130-ICD-Wechselwirkungsgegenstücke ("gp130-ICD interacting counterparts") dieses Typs umfassen Proteinkinasen der JAK-Familie (Darnell et al., 1994).
Daher ist der Hauptgegenstand der vorliegenden Erfindung ein IL-6-Antagonist-Peptid, isolierbar aus einer Peptid-Bibliothek durch das Two-Hybrids-System durch ihre Fähigkeit, an die intrazelluläre Domäne von gp130 zu binden und das wenigstens 5 Aminosäuren enthält. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthalten solche Peptide bis zu 30 Aminosäuren, bevorzugter 5–20, am bevorzugtesten 8–16.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist der im THS-Screening verwendete "Köder" ("X") die intrazelluläre Domäne (ICD) des gp130-Proteins. Eine derartige Domäne entspricht dem Bereich von der Aminosäure an Position 642 bis zur Aminosäure an Position 918 (Yamasaki K. et al., 1988) des IL6-R (gp130). Der "Fisch" im THS-Screening ist eine Bibliothek von Zufallspeptiden. Eine derartige Bibliothek kann eine beliebige kommerzielle Bibliothek sein oder kann durch bekannte Verfahren "in-house" bzw. betriebsintern produziert werden.
Falsch-Positive, die aus dem obenstehenden Screening hervorgehen, können eliminiert werden, wie es in der Literatur beschrieben ist (Bartel et al., 1993).
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können solche Peptide eine Aminosäuresequenz umfassen, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: SEQ ID NO: 6, sowie Salze, funktionelle Derivate davon.
"Analoga", wie der Begriff in der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, meint jene Peptide, in denen eine oder mehrere der Aminosäuren in den obenstehenden Sequenzen abgeändert sind, ohne die IL-6-Antagonist-Aktivität wesentlich zu beeinträchtigen. Insbesondere sind bevorzugte Abänderungen für Analoga in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung solche, die als "konservative" Substitutionen bekannt sind. Konservative Aminosäure-Substitutionen umfassen Aminosäureersetzungen durch synonyme Aminosäuren innerhalb der gleichen Gruppe, die hinreichend ähnliche physikochemische Eigenschaften haben, so dass Substitution zwischen Angehörigen der Gruppe die biologische Funktion des Moleküls erhalten wird, Grantham, Science, Bd. 185, S. 862–864 (1974).

Die synonymen Aminosäuregruppen sind jene, die in Tabelle I definiert sind. Bevorzugter sind die synonymen Aminosäuregruppen jene, die in Tabelle II definiert sind, und am bevorzugtesten sind die synonymen Aminosäuregruppen jene, die in Tabelle III definiert sind. TABELLE I Bevorzugte Gruppen synonymer Aminosäuren

Aminosäure	Synonyme Gruppe
Ser	Ser, Thr, Gly, Asn
Arg	Arg, Gln, Lys, Glu, His
Leu	Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
Pro	Gly, Ala, Thr, Pro
Thr	Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr
Ala	Gly, Thr, Pro, Ala
Val	Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val
Gly	Ala, Thr, Pro, Ser, Gly
Ile	Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile
Phe	Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe
Tyr	Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr
Cys	Ser, Thr, Cys
His	Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His
Gln	Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln
Asn	Gln, Asp, Ser, Asn
Lys	Glu, Gln, His, Arg, Lys
Asp	Glu, Asn, Asp
Glu	Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu
Met	Phe, Ile, Val, Leu, Met
Trp	Trp

TABELLE II Bevorzugtere Gruppen synonymer Aminosäuren

Aminosäure	Synonyme Gruppe
Ser	Ser
Arg	His, Lys, Arg
Leu	Ile, Phe, Met, Leu
Pro	Ala, Pro
Thr	Thr
Ala	Pro, Ala
Val	Met, Ile, Val
Gly	Gly
Ile	Ile, Met, Phe, Val, Leu
Phe	Met, Tyr, Ile, Leu, Phe
Tyr	Phe, Tyr
Cys	Ser, Cys
His	Arg, Gln, His
Gln	Glu, His, Gln
Asn	Asp, Asn
Lys	Arg, Lys
Asp	Asn, Asp
Glu	Gln, Glu
Met	Phe, Ile, Val, Leu, Met
Trp	Trp

TABELLE III Bevorzugteste Gruppen synonymer Aminosäuren

Aminosäure	Synonyme Gruppe
Ser	Ser
Arg	Arg
Leu	Ile, Met, Leu
Pro	Pro
Thr	Thr
Ala	Ala
Val	Val
Gly	Gly
Ile	Ile, Met, Leu
Phe	Phe
Tyr	Tyr
Cys	Ser, Cys
His	His
Gln	Gln
Asn	Asn
Lys	Lys
Asp	Asp
Glu	Glu
Met	Ile, Leu, Met
Trp	Trp

Der Begriff "Salze" bezieht sich sowohl auf Salze von Carboxylgruppen als auch auf Säureadditionssalze von Aminogruppen der erfindungsgemäßen Peptide oder Analoga davon. Salze einer Carboxylgruppe können durch Mittel gebildet werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, und schließen anorganische Salze, z.B. Natrium-, Calcium-, Ammonium-, Eisen- oder Zinksalze und dergleichen, und Salze mit organischen Basen, wie jene, die beispielsweise mit Aminen, z.B. Triethanolamin, Arginin oder Lysin, Piperidin, Procain und dergleichen, gebildet werden, ein. Saure Salze schließen z.B. Salze mit Mineralsäuren, wie z.B. Salzsäure oder Schwefelsäure, und Salze mit organischen Säuren, wie z.B. Essigsäure oder Oxasäure, ein. Natürlich müssen jegliche derartige Salze im Wesentlichen ähnliche Aktivität wie die erfindungsgemäßen Peptide oder ihre Analoga besitzen.
Die Definition "funktionelle Derivate", wie sie hierin verwendet wird, bezieht sich auf Derivate, die aus den funktionellen Gruppen, die auf den Seitenketten der Aminosäuregruppierungen oder auf den terminalen N- oder C-Gruppen vorhanden sind, gemäß bekannter Verfahren hergestellt werden, und werden von der Erfindung umfasst, wenn sie pharmazeutisch verträglich sind, d.h., wenn sie die Proteinaktivität nicht zerstören oder wenn sie den pharmazeutischen Zusammensetzungen, die sie enthalten, keine Toxizität verleihen. Solche Derivate schließen z.B. Ester oder aliphatische Amide der Carboxylgruppen und N-Acyl-Derivate von freien Aminogruppen oder O-Acyl-Derivate von freien Hydroxylgruppen ein und werden mit Acylgruppen, wie z.B. Alkanoyl- oder Aroylgruppen, gebildet.
Die "Vorläufer" sind Verbindungen, die im menschlichen oder tierischen Körper in die erfindungsgemäßen Peptide umgewandelt werden.
Die "IL-6-Antagonist-Aktivität" bedeutet Fähigkeit, IL-6-Aktivität durch Antagonisieren der Bindung von IL-6 an seinen Rezeptor und/oder durch Interferieren mit der Funktion des Rezeptorsystems, das intrazellulär molekulare Signale transduziert, die zur Genaktivierung in IL-6-abhängigen Zellen, wie beispielsweise Myelomzellen, führen, zu inhibieren. Deshalb kann derartige Aktivität durch einen beliebigen der auf dem Fachgebiet bekannten Assays gemessen werden. Solche Assays schließen Proliferation muriner T1165-Plasmozytom-Zellen, Wachstumshemmung von myeloiden M1-Leukämiezellen der Maus ("mouse M1 myeloid leukemia cells") oder Produktion von Akute-Phase-Proteinen durch Hepatomzellen ein.
Die erfindungsgemäßen Peptide können durch jedes beliebige auf dem Fachgebiet gut bekannte Verfahren hergestellt werden, z.B. Festphasensynthese oder Flüssigphasensynthese. Als Festphasensynthese wird beispielsweise die dem C-Terminus des zu synthetisierenden Peptids entsprechende Aminosäure an ein Trägermaterial gebunden, das in organischen Lösungsmitteln unlöslich ist, und durch abwechselnde Wiederholung von Reaktionen, eine, bei der Aminosäuren mit ihren α-Aminogruppen und functionellen Seitenkettengruppen, die mit geeigneten Schutzgruppen geschützt sind, eine nach der anderen in Reihenfolge vom C-Terminus zum N-Terminus kondensiert werden, und eine, bei der die an das Harz gebundenen Aminosäuren oder die Schutzgruppen der α-Aminogruppen der Peptide freigesetzt werden, wird die Peptidkette daher auf diese Weise verlängert. Festphasensyntheseverfahren werden, abhängig vom Typ der verwendeten Schutzgruppe, im Wesentlichen in das tBoc-Verfahren und das Fmoc-Verfahren eingeteilt.
Typischerweise verwendete Schutzgruppen umfassen tBoc (t-Butoxycarbonyl), Cl-Z (2-Chlorbenzyloxycarbonyl), Br-Z (2-Brombenzyloxycarbonyl), Bzl (Benzyl), Fmoc (9-Fluorenylmethoxycarbonyl), Mbh (4,4'-Dimethoxydibenzhydryl), Mtr (4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonyl), Trt (Trityl), Tos (Tosyl), Z (Benzyloxycarbonyl) und Cl₂-Bzl (2,6-Dichlorbenzyl) für die Aminogruppen; NO₂ (Nitro) und Pmc (2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl) für die Guanidinogruppen; und tBu (t-Butyl) für die Hydroxylgruppen.
Nach der Synthese des gewünschten Peptids wird es der Entschützungsreaktion unterworfen und von dem Feststoffträger abgelöst. Eine derartige Peptid-Ablösereaktion ("peptide cutting reaction") kann bei dem Boc-Verfahren mit Fluorwasserstoff oder Trifluormethansulfonsäure und bei dem Fmoc-Verfahren mit TFA durchgeführt werden.
Das so erhaltene rohe Peptid wird dann einer Reinigung unterworfen. Die Reinigung wird mittels eines beliebigen der für diesen Zweck bekannten Verfahren ausgeführt, d.h., eine beliebige konventionelle Verfahrensweise, die Extraktion, Präzipitation, Chromatographie, Elektrophorese oder dergleichen umfasst. Beispielsweise kann HPLC (high performance liquid chromatography) eingesetzt werden. Die Elution kann unter Verwendung eines Wasser-Acetonitril-basierten Lösungsmittels, das üblicherweise für die Proteinreinigung eingesetzt wird, durchgeführt werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, das Peptid in im Wesentlichen gereinigter Form bereitzustellen, damit es zur Verwendung in pharmazeutischen Zusammensetzungen, als aktiver Inhaltsstoff, bei Pathologien, die IL-6-Aktivitätsinhibierung erfordern, geeignet ist.
Pathologien, bei denen die neuen erfindungsgemäßen Peptide in vorteilhafter Weise für prophylaktische, therapeutische oder diagnostische Verwendungen verwendet werden, umfassen hämatologische Erkrankungen, Immunsystemerkrankungen, Knochenerkrankungen, Tumore und Autoimmunkrankheiten, sowie die Therapie zur Transplantation, die solide Organe und Zelltransplantate umfasst.
Spezifische Beispiele der oben genannten Kategorien umfassen die folgenden Erkrankungen: chronische lymphozytäre Leukämie (CLL), Plasmozytom/multiples Myelom, Castleman-Syndrom (CD), Osteoporose, Psoriasis, Multiple Sklerose, Lupus erythematosus, Diabetes, rheumatoide Arthritis, sowie Anämie und Auszehrung bei chronischen Erkrankungen.
Weitere Gegenstände und Vorteile der Erfindung werden in der nachstehenden Beschreibung offensichtlich sein.
Eine Ausführungsform der Erfindung ist die Verabreichung einer pharmakologisch wirksamen Menge des erfindungsgemäßen Peptids an Subjekte, die gefährdet sind, Pathologien zu entwickeln, die IL-6-Aktivitätsinhibierung erfordern, oder an Subjekte, die derartige Pathologien bereits zeigen.
Jeder beliebige Verabreichungsweg, der mit dem aktiven Prinzip kompatibel ist, kann verwendet werden, aber die parenterale Verabreichung wird bevorzugt, weil sie es erlaubt, systemische Wirkungen in kurzen Zeiten zu erhalten.
Die Dosis des Peptids, das verabreicht werden soll, hängt entsprechend dem Alter, Gewicht und der individuellen Antwort des Patienten, von der Grundlage der medizinischen Verordnungen ab.
Die pharmazeutische Zusammensetzung zur parenteralen Verwendung kann in injizierbarer Form, umfassend das Wirkprinzip und ein geeignetes Vehikel, hergestellt werden. Vehikel für die parenterale Verabreichung sind im Fachgebiet bekannt und umfassen beispielsweise Wasser, Salzlösung und physiologische Puffer. Das Vehikel kann kleinere Mengen von Exzipientien enthalten, um die Lösungsstabilität und Isotonizität aufrecht zu erhalten.
Die Herstellung der genannten Lösungen kann gemäß der gebräuchlichen Modalitäten durchgeführt werden.
Die vorliegende Erfindung ist unter Bezugnahme auf spezifische Ausführungsformen beschrieben worden, aber der Inhalt der Beschreibung umfasst alle Modifikationen und Substitutionen, die durch einen Fachmann auf dem Gebiet erbracht werden können, ohne die Bedeutung und den Zweck der Ansprüche zu erweitern.
Die Erfindung wird nun mittels der nachstehenden Beispiele beschrieben, die keinesfalls als die vorliegende Erfindung beschränkend ausgelegt werden sollten. Die Beispiele werden sich auf die Figuren beziehen, die hier im Nachstehenden spezifiziert werden.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1: Vektoren, die beim Screening bzw. Durchmustern auf gp130-bindende Peptide verwendet wurden. Das Plasmid pASgp130 codiert für GAL4-DNA-Bindedomäne (Aminosäurereste 1–147), fusioniert an gp130-ICD; das Plasmid pGADGH codiert für eine Bibliothek von Zufalls-16-mer-Peptiden (NNK)₁₆, fusioniert an die GAL4-Aktivierungsdomäne (Aminosäurereste 768–881).
2: Westernblotting von Hefeextrakten. CG-1945 (Bahnen 1 und 2) wurde mit pAS2-1, codierend für GAL4BD (Bahn 3), oder mit pASgp130, codierend für gp130-GAL4BD (Bahn 4), transformiert. Proteinextrakte wurden an einem 15% Acrylamid-SDS-Gel aufgetrennt und mittels eines Chemilumineszenz-Detektionssystems analysiert. Molekulargewichte sind angegeben (kilodalton). Der schwarze Pfeil bezeichnet gp130-GAL4BD; der graue Pfeil bezeichnet GAL4BD.
3: Peptid-Bibliothek-Transformation. Der Hefestamm CG-1945 wurde mit 60 μg an Bibliothekplasmiden ("library plasmids") transformiert. Die Zellen wurden auf SD/-Trp/-Leu/-His/+ 10 mM 3-AT-Agarmedium bei 30°C gezüchtet. Nach 4 Tagen erschienen einige His⁺-Kolonien auf den Platten. Bei der ersten Transformation haben wir 20 His⁺-Klone isoliert; nur 9 von ihnen, in der Figur nummeriert, waren auch lacZ⁺.
4: Peptide. Die durch THS isolierten Peptide: sie wurden in fünf Homologiegruppen angeordnet bzw. aufgestellt.
5: β-Galactosidase (LacZ)-Aktivität im Flüssig-Assay. Die Kombination von Klon E und gp130-ICD in Hefezellen brachte etwa 3 Units/ml LacZ-Aktivität hervor. Der Wert wird aus drei unabhängigen Experimenten erhalten.
6: Relevante Homologien. Sequenzalignment der Peptide E (E₁) und C mit mehreren gp130-assoziierten Tyrosinkinasen. Übereinstimmungen sind als Kursivbuchstaben angezeigt; basische Aminosäuren sind als (*) markiert; saure Aminosäuren sind unterstrichen.
BEISPIELE
Beispiel 1: Screening der Peptid-Bibliothek
Eine 16-mer-Zufallspeptid-Bibliothek ist mit dem Two-Hybrid-System (THS) gescreent bzw. durchmustert worden. Die codierende Sequenz der Hefe-GAL4-Aktivierungsdomäne (AD) wurde unter Erhaltung des Leserahmens mit einer Zufallsbibliothek synthetischer Oligonucleotide, die für die Peptide codieren, ligiert. Der verwendete Vektor, pGADGH, ist ein centromeres Plasmid, das den ADH1-Promotor und das Hefe-Leu2-Gen als einen selektierbaren Marker trägt (1). Es wird geschätzt, dass die Zufallspeptid-Bibliothek etwa 10⁷ unabhängige Klone enthält (siehe Material und Methoden).
RT-PCR wurde in HepG2-Zellen durchgeführt, um den intrazellulären Anteil von humanem gp130 zu isolieren. Die entsprechende cDNA wurde unter Erhaltung des Leserasters mit der codierenden Sequenz der Hefe-GAL4-Bindedomäne (BD) in das Plasmid pAS2-1 kloniert. Dieses ist ein centromeres Plasmid, das den ADH1-Promotor und das Hefe-TRP1-Gen als einen selektierbaren Marker trägt.
Die Expression von Fusionsprotein ist durch Westernblotting verifiziert worden (2).
In unseren Experimenten verwendeten wir den Hefestamm CG-1945, der zwei Reportergene, lacZ und His3, trägt (Estojak et al., 1995).
Wir verwendeten 60 μg der Peptid-Bibliothek für jede Transformation der Empfänger-Hefezellen, die zuvor mit dem für das Fusionsprotein gp130ic-GAL4BD codierenden Plasmid transformiert worden waren. Um den gewünschten interagierenden Klon in der AD-Bibliothek zu finden, haben wir etwa 2 × 10⁶ Klone gescreent.
Wir haben fünf Transformationen durchgeführt, und die Ergebnisse all dieser Transformationen sind in der untenstehenden Tabelle dargelegt:
Nach Selektion auf den Histidin-Nährstoffbedarf (d.h., Selektion auf THS-Wechselwirkungen mit dem His3-Reportergen) überlebte eine Gesamtzahl von 250 Klonen aus 1,8 × 10⁶ transformierten Klonen. Durch das Screening auf das zweite Reportergen lacZ haben wir schrittweise 26 positive Hefeklone gefunden (3).
Beispiel 2: Isolierung von echt-positiven Klonen
Um die große Mehrheit der restlichen Falsch-Positiven zu eliminieren, sind die THS-ausgewählten Plasmide, die für die Peptid-Bibliothek codieren, in den ursprünglichen Screening-Stamm ("screening strain"), CG-1945, unter den folgenden Bedingungen rücktransformiert worden: 1) ohne zusätzliches Plasmid; 2) mit einem Plasmid, das für die GAL4-DNA-Bindedomäne alleine codiert (pAS2-1); 3) mit dem vollständigen "Köder"-Plasmid oder 4) mit einem nicht-verwandten Fusionsprotein (wie dem an GAL4-BD fusionierten humanen Lamin-C) (Bartel et al., 1993).
Ein echt-positiver Klon ergibt nur unter der dritten Bedingung, die obenstehend aufgelistet ist, ein positives Signal.
Um die oben genannte Aufgabe zu bewältigen, haben wir positive "Fisch"-Plasmide bis zur Homogenität isoliert und sie in E. coli transformiert. Diese AD/Bibliothek-Plasmide ("AD/library plasmids") sind in E. coli selektiv amplifiziert worden, wobei sein LEU2-Marker verwendet wurde, um die leuB-Mutation des E. coli-Stammes HB101 zu komplementieren.
Diese Plasmide sind verwendet worden, um einen Hefestamm rückzutranformieren, um Falsch-Positive zu eliminieren, wie es oben beschrieben ist: nach diesen Verfahrensweisen selektierten wir neun positive Klone (4).
Die aus der Sequenzanalyse erhaltenen Daten haben gezeigt, dass (i) obwohl alle gescreenten bzw. durchmusterten Klone mehr als ein (NNK)₁₆-Oligonucleotid enthalten, nur die erste Oligonucleotidsequenz als eine GAL4 AD/Peptid-Fusion exprimiert wird, was an dem im Leserahmen liegenden Stop-Kodon am Ende jedes Oligonucleotids liegt; (ii) die meisten der isolierten Peptide die erwartete vollständige Länge von 16 Aminosäuren haben; (iii) einige der Peptide Homologien mit bekannten Proteinen, die mit gp130-ICD wechselwirken, zeigten.
Um gp130-ICD-Peptid-Wechselwirkung zu bestätigen, haben wir auch die Klonierungsvektoren durch Übertragen ("moving") des Bibliothek-Inserts von AD- auf den DNA-BD-Vektor und umgekehrt ausgetauscht. Wir haben den THS-Assay dann wiederholt (Van Aelst et al., 1993).
Wir haben auch β-Galactosidase-Flüssig-Assays durchgeführt, um die Transkriptionsaktivität zu quantifizieren: wie in 5 gezeigt, war der Fusionsprotein-Klon E/GAL4BD in Gegenwart von gp130-ICD/GAL4AD in der Lage, eine Transkriptionsaktivität des lacZ-Gens zu produzieren, die etwa 2 bis 3 Mal höher war als bei Abwesenheit von gp130-ICD/GAL4AD, was die nach der ersten Selektion detektierte Wechselwirkung bestätigt.
Homologien
Es stellte sich heraus, dass Recherche in Protein-Datenbanken sehr interessant war, weil sie Homologien zwischen den isolierten Peptiden und Proteinen, wie JAK1 und Tec, enthüllte, die konstitutiv mit der intracytoplasmatischen Domäne von gp130 assoziiert sind. Selbst wenn diese Homologien auf kleine Abschnitte beschränkt sind, könnten diese Ergebnisse nützlich sein, um unsere zukünftigen Untersuchungen zu leiten (6).
Wir haben den Klon E in zwei unabhängigen Transformationen ausgewählt: dieser Klon zeigt eine Homologie mit JAK1. Harpur und Mitarbeiter haben vorgeschlagen, dass die JAK-Kinasen in sieben Domänen aufgeteilt werden sollen, die als JAK-Homologien (JH)-Domänen 1 bis 7 bezeichnet werden (Harpur et al., 1992).
JH1 entspricht der Tyrosinkinase-Domäne und JH2 entspricht der mutmaßlichen Serin-Threonin-Kinase-Domäne, die Domänen JH3 bis JH7 sind nicht-katalytische Domänen und haben keine bekannte Funktion. Klon E zeigt eine kleine Region der Homologie mit JAK1: diese Homologie fällt in die JH4-Domäne.
Harpur und Mitarbeiter haben vorgeschlagen, dass die Assoziation von JAK2 mit dem GH-Rezeptor durch die nicht-katalytischen Domänen JH3 bis JH7 vermittelt werden muss: diese Domänen sind bei Mitgliedern der JAK-Familie strukturell und funktionell konserviert. JH4 ist die am stärksten konservierte unter diesen Domänen. Unsere Daten legen daher nahe, dass der durch Peptid E definierte Bereich von JAK1 eine funktionelle Rolle spielen könnte: er könnte eine JAK1-Bindungsstelle auf gp130 nachahmen. Auch der Klon C zeigt eine interessante Homologie mit Tyk2: diese Homologie fällt in die JH7.
Die anderen Klone zeigen Identitäten mit anderen Kinasen, wie LTKR, oder mit Proteinen, wie ANK1, deren Funktionen die Anheftung von integralen Membranproteinen an Cytoskelettbestandteile umfassen.
Diskussion
Studien von Cytokin-Signalwegen legen nahe, dass diese Signale durch Protein-Protein-Wechselwirkungen, die durch die Assoziation von kleinen, modularen Protein-Domänen mit kurzen und spezifischen Aminosäuresequenzen vermittelt werden, hervorgerufen werden. Z.B. sind Src-Homologie 2 (SH2)- und Src-Homologie 3 (SH3)-Domänen Regionen von 60–100 Aminosäuren, die mit phosphorylierten Tyrosinresten bzw. Prolin-reichen Regionen wechselwirken.
Es ist deshalb vorstellbar, dass diskrete bzw. einzelne Domänen der JAK-Kinasen oder der Rezeptoren für die Bindung der JAK-Kinasen erforderlich sind, und sie könnten in einigen Fällen die Spezifität einer derartigen Bindung bestimmen.
Publizierte Daten geben die genauen Stellen von gp130-ICD, die an einigen dieser Wechselwirkungen beteiligt sind, an: Beispielsweise ist die box1-Domäne von gp130 ein Motiv von acht Aminosäuren, das reich an Prolinresten ist. Diese Domäne sollte direkt an der Wechselwirkung mit den JAK-Kinasen beteiligt sein, auch wenn es wahrscheinlicher erscheint, dass die box1-Sequenz eine kritische Rolle bei der Bildung einer Sekundärstruktur spielt, die für die Interaktion zwischen JAK-Kinasen und den Cytokin-Rezeptoren erforderlich ist (Murakami et al., 1991). Eine weitere Domäne von gp130, die an Protein-Protein-Wechselwirkungen beteiligt ist, ist die Konsensussequenz YXPQ, die an STAT3- und STAT1-Aktivierung beteiligt ist (Gerhartz et al., 1996).
Wir haben die Assoziation von gp130-ICD mit einer Zufallspeptid-Bibliothek mittels des THS untersucht. Wir haben neun unabhängige Klone/Peptide identifiziert: diese Peptide zeigen Homologien mit Proteinen, die in Datenbanken vorliegen. Selbst wenn diese Homologien auf kleine Bereiche beschränkt sind, könnten diese Ergebnisse nützlich sein, um unsere zukünftigen Untersuchungen zu leiten.
Falls diese vorläufigen Daten bestätigt werden, könnten wir die genauen Regionen von Kinasen, z.B. JAK1, die an gp130-ICD binden, identifizieren. Unsere Daten könnten auch nahe legen, dass ein Two-Hybrid-System-Peptid-Screening eine geeignete Technik ist, um ähnliche Ergebnisse zu erlangen.
Materialien und Methoden
Konstruktion von Plasmiden, die für Hybridproteine codieren
Alle Hybridkonstrukte wurden unter Verwendung von Amplifikation durch RT-PCR geschaffen.
Die PCR-Reaktionen enthielten 10 μl cDNA von HepG2-Zellen, 50 pmol von jedem Primer (siehe unten), 2,5 Unit Stratagene Pfu-Polymerase, 0,2 mM von jedem der vier Desoxy nucleotidtriphosphate, 10 μl Pfu-Puffer, in einem Reaktionsvolumen von 100 μl, überschichtet mit 50 μl Mineralöl.
Die Amplifikation wurde für 30 Zyklen mit einem Temperaturprofil von 45 Sekunden bei 94°C, 45 Sekunden bei 60°C und 6 Minuten bei 72°C durchgeführt.
Alle PCR-Fragmente wurden mit geeigneten Restriktionsenzymen (EcoRI/BamHI für hgp130) über Nacht bei 37°C verdaut.
Die verdauten PCR-Produkte wurden durch Gelelektrophorese an niedrigschmelzende Agarose und durch Microcon 100 (Amicon) gereinigt. Diese Fragmente wurden mit dem Rapid DNA Ligations Kit (Boehringer Mannheim) sowohl in den pAS2-1- als auch den pGADGH-Vektor ligiert und in kompetente E. coli Top10F-Zellen (Invitrogen) transformiert.
Die MATCHMAKER-Zufallspeptid-Bibliothek ("MATCHMAKER Random Peptide Library") (Clontech) besteht aus synthetischen (NNK)₁₆-Oligonucleotiden (N = A, G, C oder t; K = T oder G), die von BamHI- und EcoRI-Stellen flankiert werden und ein terminales Stop-Kodon enthalten, wobei sie gerichtet in den Hochexpressionsvektor pGADGH mit GAL4-Aktivierungsdomäne (AD) kloniert sind. Aus dem Vektor wird eine Mischung von Zufallspeptiden mit 16 Basen langem Kodon ("Random 16-codon peptides"), die an die GAL4AD fusioniert sind, erzeugt. PCR-Primer
Die humane gp130-ICD-cDNA wurde unter Verwendung von Upgp130 und Logp130 PCR-amplifiziert.
DNA-Sequenzierung
DNA-Sequenzierung wurde an beiden Strängen ausgeführt, wobei das DNA-Sequenzierungs-Kit, Dye Primer Cycle Sequencing (Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA, USA) auf einem ABI Modell 373A-Sequenzierautomaten gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wurde.
Die Homologierecherche wurde gegen die GenBank, EMBL und Swiss-Prot-Datenbanken durchgeführt.
Sequenzierprimer
Primer 1 (GAL4 BD): 5' TCA TCG GAA GAG TAG 3' (SEQ ID NO: 11)
Primer 2 (GAL4AD): 5' TAC CAC TAC AAT GGA TG 3' (SEQ ID NO: 12)
E. coli-Stämme und Medien
HB101: F', hsdS20 (r'b, m'b), recA13, ara-14, pro A2, lacY1, galK2, rspL20 (Sm_r), xyl-5, mtl-1, supE44
Top10F': F', lacl^q, Tn10, Tei^r, mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80 lacZ ΔM15 ΔlacX74 deo R recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL endA1 nupG

LB (1 l): 10 g Bactotrypton

5 g Hefeextrakt

10 g NaCl

LB-Agar (1 l): 10 g Bactotrypton

5 g Hefeextrakt

10 g NaCl

1,5% Agar
Hefestamm und Medien
Der Saccharomyces cerevisiae-Stamm CG-1945 (Mat a, ura 3-52, his 3-200, lys 2-801, ade 2-101, trp 1-901, leu2-3, 112, gal4-542, gal 80-538, cyh^r 2, LYS:: GAL1 _UASs-GAL1_TATA-HIS3, URA3:: GAL4 _17-mer(x3)-CyC1 _TATA-lacZ) (Clontech Matchmaker) wurde für alle Assays verwendet. CG-1945 trägt zwei Reportergene unter der Kontrolle unterschiedlicher Promotoren: das lacZ-Gen unter der Kontrolle des CYC1-Promotors, dessen eigene stromaufwärts liegende Aktivierungssequenz durch GAL4-Bindungsstellen ersetzt ist, und das His3-Gen unter der Kontrolle des GAL1-Promotors.
Deshalb haben diese Promotoren kaum mehr als die GAL4-Bindungsstellen gemeinsam, und das Screening, das mit beiden Reportergenen in den gleichen Hefezellen durchgeführt wird, sollte viele Falsch-Positive eliminieren. Hefekulturen wurden bei 30°C entweder in YPD-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton und 2% Glucose) oder in SD-Minimalmedium (0,5% Hefe-Stickstoff-Basis ohne Aminosäuren, 2% Glucose und 1% gewünschte Aminosäure-Drop out-Lösung) gezüchtet.
Hefetransformation und β-Galactosidase-Assay
Fusionsgene wurden durch die Lithiumacetat-Transformationsverfahrensweise (16) in den Stamm CG-1945 eingeführt. Zur Durchführung einer ersten Selektion haben wir alle Zellen auf SD/-Trp-Leu-His+3AT 10 mM-Agarmedium ausgestrichen. Wenn eine Wechselwirkung zwischen gp130-ICD und einem Peptid auftritt, werden die zwei funktionellen GAL4-Domänen verbunden bzw. zusammengeführt, was die Histidin-Expression bewirkt. Hefezellen mit wechselwirkenden Hybridproteinen können deshalb in einem Medium, dem diese Aminosäure fehlt, wachsen.
3-AT (3-Amino-1,2,4-triazol), ein kompetitiver Inhibitor des Hefe-HIS3-Proteins (Imidazolglycerinphosphat-Dehydratase), wird verwendet, um geringe Konzentrationen von His3p zu inhibieren, die in manchen Reporterstämmen geringfügig ("leaky") exprimiert werden. Transformanten wurden bei 30°C wachsen gelassen, üblicherweise für 2–4 Tage, bis die Kolonien groß genug waren, um auf β-Galactosidase-Aktivität zu testen.
Transformanten wurden auf sterilem Whatman-Filter Nummer 1 repliziert, das auf selektivem Wachstumsmedium aufgelegt worden war. Nachdem Kolonien gewachsen waren, führten wir zwei oder mehrere Gefrier/Tau-Zyklen durch, wobei der Filter in flüssigen Stickstoff und bei Raumtemperatur für 0,5–1 Minute platziert wurde.
Der Filter wurde in 5 ml Z-Puffer/X-Gal-Lösung in einer sauberen 100 mm-Schale gegeben und bei 30°C typischerweise von 30 Minuten bis 8 Stunden inkubiert. Der Filter wurde getrocknet und photographiert, um die Daten aufzunehmen.
Es ist bekannt, dass Maus-p53-Protein und großes T-Antigen von SV40 im THS wechselwirken.
Die nachstehenden Plasmide, pVA3-1, das für die Hybride aus GAL4-DNA-Bindedomäne und murinen p53 codiert, und pTD1-1, das für die Hybride aus GAL4-Aktivierungsdomäne und großem T-Antigen aus SV40 codiert, wurden im β-Galactosidase-Assay als Positivkontrolle verwendet.
β-Galactosidase-Flüssig-Assay
Wir stellten 5 ml Über-Nacht-Kulturen in für Plasmide geeignetem flüssigen SD-Selektionsmedium her.
Wir transferierten 2 ml der Kultur zu 8 ml YPD und Inkubieren bei 30°C 3–5 Stunden lang, bis die Zellen in der mittleren log-Phase (O.D.₆₀₀ = 0,5–0,8) sind.
Die Kultur wurde bei 14.000 U/min 30 Sekunden lang zentrifugiert: im nächsten Schritt entfernen wir die Überstände, waschen die Zellen mit einem Volumen Z-Puffer und resuspendieren das Pellet in 900 μl Z-Puffer.
Zwei oder mehr Gefrier/Tau-Zyklen wurden sofort durchgeführt, wobei die Röhrchen in flüssigem Stickstoff und in einem 37°C-Wasserbad für 0,5–1 Minute platziert wurden. Schließlich gaben wir 0,7 ml β-Mercaptoethanol-Z-Pufferlösung und 160 μl ONPG (o-Nitrophenyl-β-galactopyranosid, Sigma), 4 mg/ml gelöst in Z-Puffer, zu jedem Röhrchen: die Röhrchen wurden bei 30°C inkubiert, bis sich die gelbe Farbe entwickelte.
Die Reaktion wurde durch Zugeben von 0,4 ml 1 M Na₂CO₃ gestoppt: wir nahmen die Zeit, die benötigt wurde, um die Ergebnisse zu erhalten, und die O.D.₄₂₀ der Proben auf.
β-Galactosidase-Einheiten wurden durch diese Formel berechnet:
β-Galactosidase-Einheiten = 1.000 × O.D.₄₂₀/(t × V × O.D.₆₀₀)
wobei: t = abgelaufene Inkubationszeit in min.; V = 0,1 ml; O.D.₆₀₀ = A₆₀₀ von 1 ml der Kultur.
Hefeproteinextrakt und Westernblotting
Für jeden transformierten Hefestamm stellten wir 5 ml-Über-Nacht-Kulturen in für unsere Plasmide geeignetem SD-Selektionsmedium her; wir stellen auch eine 10 ml-Kultur der nicht-transformierten CG-1945 in YPD als Negativkontrolle her. Für jeden Klon, der einzeln getestet werden soll (und die Negativkontrolle), transferierten wir die Über-Nacht-Kulturen in 50 ml des geeigneten Mediums.
Wir inkubierten die Kultur bei 30°C unter Schütteln, bis die O.D.₆₀₀ 0,4–0,6 erreichte: die Kultur wurde durch Umgießen in ein vorgekühltes 100 ml-Zentrifugenröhrchen rasch ge kühlt und sofort bei 1.000 × g 5 min lang bei 4°C zentrifugiert. Wir verwarfen den Überstand und resuspendierten das Zellpellet in 50 ml eiskaltem Wasser: das Pellet wurde durch Zentrifugation bei 1.000 × g für 5 min bei 4°C wiedergewonnen. Wir resuspendierten das Zellpellet mit Aufbrechpuffer ("Cracking buffer") (8 M Harnstoff, 5% SDS, 40 mM Tris-HCl, 0,1 mM ED-TA, Bromphenolblau, Protease-Inhibitorlösung); wir gaben 80 μl Glaskügelchen (425–600 μm, Sigma) zu. Die Proben wurden bei 70°C 10 Minuten lang erhitzt und 1 Minute lang Vortexbehandelt. Pelletdebris und nicht-aufgebrochene Zellen wurden in einer Mikrozentrifuge bei 14.000 U/min 5 Minuten lang herabzentrifugiert. Die Überstände wurden in frische 1,5 ml Schraubverschluss-Röhrchen transferiert und kurz gekocht. Die Proben wurden sofort auf ein Gel geladen oder bei –70°C gelagert.
Wir führten Westernblotting unter Verwendung löslicher Proteinextrakte aus den Transformanten durch, wobei auf ein 15%iges Acrylamidgel geladen wurde. Wir untersuchten die Blots mit monoklonalen GAL4-Domäne-spezifischen Antikörpern, z.B. den GAL4 BD- und AD-mAbs von Clontech. Zur Detektion verwendeten wir einen sekundären Antikörper: HRP-konjugiertes Ziege-anti-Maus-IgG (BIORAD).
Referenzen

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

IL-6-Antagonist-Peptid, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 6 umfasst, sowie Salze, funktionelle Derivate davon.
Peptid nach Anspruch 1, das bis zu 30 Aminosäuren enthält.
Peptid nach Anspruch 1, das aus der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6 besteht.
Peptid nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Verwendung als Medikament.
Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1–3 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Pathologie, ausgewählt aus hämatologischen Erkrankungen, Immunsystemerkrankungen, Knochenerkrankungen, Tumoren und Autoimmunkrankheiten, sowie zur Therapie für Transplantation, die solide Organe und Zelltransplantate umfasst.
Verwendung des Peptids nach einem der Ansprüche 1–3 zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen zur Behandlung von Erkrankungen, die IL-6-Antagonist-Aktivität erfordern.
Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend das Peptid nach einem der Ansprüche 1–3 zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern und/oder Exzipientien.