DE69634497T2

DE69634497T2 - Il-6 mutein

Info

Publication number: DE69634497T2
Application number: DE69634497T
Authority: DE
Inventors: Marc Ehlers; Stefan Rose-John; Joachim Grotzinger
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Merck Serono SA
Priority date: 1996-04-09
Filing date: 1996-04-09
Publication date: 2006-01-26
Anticipated expiration: 2016-04-10
Also published as: BR9708648A; FI982198A0; CA2251355A1; ES2238690T3; NO984697D0; PT907737E; EA000852B1; NO322479B1; WO1997038103A1; CN1131309C; ATE291087T1; IL126484A0; DK0907737T3; CN1216063A; EP0907737A1; AU5686496A; JP2000508164A; WO1997038104A1; AU728267B2; JP4189866B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues IL-6-Mutein, eine für dieses codierende DNA-Sequenz, seine Verwendung in einer Therapie sowie eine pharmazeutische Zusammensetzung, die es umfasst.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Interleukin-6 wird nach Verletzung oder Infektion durch verschiedene Zelltypen ins Plasma freigesetzt. Es ist in einem Spektrum von Aktivitäten, wie Immunabwehr, Hämatopoese, Reifung von Megakaryozyten, Thrombozytenproduktion und Reaktion in der akuten Phase (1) involviert.
Außer dass IL-6 in der Wirtsabwehr eine zentrale Rolle spielt, ist es bei der Pathogenese einer Vielzahl von Krankheiten, wie Plasmozytom/Myelom, Osteoporose und neoplastische und Autoimmunkrankheiten involviert (1).
Der IL-6-Rezeptorkomplex an Zielzellen besteht aus zwei Untereinheiten, einer spezifischen Ligandenbindungsuntereinheit mit 80 kDa (IL-6Ra) und einem signaltransduzierenden Protein mit 130 kDa (gp130) (2–4). IL-6 bindet an IL-6Ra und der Komplex IL-6/IL-6Ra wird mit einem Dimer von gp130 assoziiert, wodurch das IL-6-Signal initiiert wird. IL-6 hat selbst keine messbare Affinität zu gp130 (5,6).
Interleukin-6 ist ein Protein, das durch N-terminale Heterogenität charakterisiert ist. Es wurde als ein 184 Aminosäure-Protein beschrieben (7) (diese Aminosäurenummerierung wird in dieser Patentanmeldung beibehalten). Sekundärstruktur-Voraussagen und Proteinmodellierung zeigten, dass IL-6 ein Glied der hämatopoetischen Cytokinfamilie ist, die durch vier antiparallele α-Helices (A, B, C und D) gekennzeichnet ist (8,9). LIF (leukemia inhibitory factor), CNTF (ziliärer, neurotropher Faktor), IL-11, CT-1 (Cardiotrophin-1) und OSM (Oncostatin M) gehören ebenfalls zu dieser Familie. Sie verwenden alle das gp130-Protein in ihrem Rezeptorkomplex, das ihre überlappenden Bioaktivitäten erklärt (1, 10, 11).
Deletionsstudien mit IL-6 zeigten, dass die N-terminalen 28 Aminosäurereste für die biologische Aktivität dieses Moleküls entbehrlich sind. Die Entfernung von mehr als 28 Aminosäuren inaktivierte das Protein (12). Weitere Studien sagten voraus, dass der C-Terminus und das Ende der A-B-Schleife/Beginn der B-Helix (Region 2c, Reste G77-E95) bei der Wechselwirkung mit IL-6Ra involviert sind (9, 13–16). Diese Resultate wurden durch das kürzlich veröffentliche humane IL-6-Modell (9) bestätigt, in dem diese zwei Regionen in enger Nachbarschaft sind.
Bis jetzt sind zwei Wechselwirkungsstellen von IL-6 mit gp130 identifiziert.

i. Eine Epitopkartierung des IL-6-Proteins mit neutralisierenden mAbs lieferte den Beweis, dass die Reste Q152-T162 (beginnend an der D-Helix) bei der gp130-Wechselwirkung involviert sind (17, 18). Eine Analyse von chimären humanen/Maus-IL-6-Proteinen zeigte das Vorliegen eines Epitops am Beginn der A-B-Schleife von IL-6, die bei der Kontaktierung und Aktivierung von gp130 involviert war (9, 19). In jüngerer Zeit wurde dieses Resultat bestätigt, indem gezeigt wurde, dass Leucin 57 bei dieser Wechselwirkung involviert ist (20). Diese Region ist in enger Nachbarschaft zum Beginn der Helix D, was zu der Annahme führt, dass diese zwei Regionen eine gemeinsame Wechselwirkungsstelle mit einem gp130 bilden (9, 19, 21).
ii. Eine zweite Wechselwirkungsstelle mit gp130 wurde in Analogie zu dem GH (Wachstumshormon)/GHR₂-Komplex definiert, dessen Struktur durch Röntgenstrahlanalyse geklärt worden war (22). Es wurde spekuliert, dass die Teile des GH, die für die Wechselwirkung mit dem zweiten GHR von Bedeutung sind, in IL-6-Protein, das für die Wechselwirkung mit einem gp130 von Bedeutung ist, dieselben sind (23, 24). Tatsächlich führt die Substitution von zwei Aminosäuren in der A-Helix (Y31D/G35F) und zwei Aminosäuren in der C-Helix (S118R/V121D) auch zu einem mutanten IL-6-Protein mit nahezu normaler Affinität zu IL-6Ra, aber ohne Bioaktivität. Diese vier Aminosäuren scheinen für die Wechselwirkung mit einem zweiten gp130-Protein wichtig zu sein (24, 25).

Im Hinblick auf die vorher diskutierte IL-6-Beteiligung in der Pathogenese einiger Krankheiten war die Entwicklung von Inhibitoren der IL-6-Aktivität Gegenstand aktiver Forschungen. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Ansätze verfolgt, die die Verwendung von Antikörpern gegen IL-6, gp130 oder gp80; die Verwendung von löslichem gp130 oder die Verwendung von Muteinen für IL-6 oder IL-6-Rezeptor einschließen.
Weiergräber et al. (FEBS Letters 379 (1996) 122–126) beschreiben die Verwendung von synthetischen Peptiden, die an Cellulosemembranen immobilisiert sind, für die Identifizierung von Stellen im Cytokin IL-6, die bei der Rezeptorbindung involviert sind, und die Identifizierung einer Region im extracellulären Teil des IL-6-Rezeptors, die für die Wechselwirkung mit seinem Liganden von Bedeutung ist.
Ehlers et al. (The Journal of Biological Chemistry, Bd. 370, Nr. 14, S.8158–8163, 1995) beschreiben die Kombination von zwei Mutationen von humanem IL-6, die eine gp130-Aktivierung beeinträchtigen, was zu einem wirksamen Interleukin-6-Rezeptor-Antagonist bei humanen Myelomzellen führt, der bei humanen Myelomzellen inaktiv war, und außerdem die Wildtyp-IL-Aktivität bei diesen Zellen vollständig inhibierte.
In ähnlicher Weise wurde die Entwicklung eines IL-6-Rezeptor-Antagonisten, der das IL-6-abhängige Wachstum von humanen Myelomzellen inhibiert, von Hon et al. (J. Exp. Med., Bd. 180, Dezember 1994, 2395–2400) beschrieben.
Die Anmelderin hat die Möglichkeit, neue IL-6-Muteine zu synthetisieren, die als IL-6-Rezeptor-Antagonisten wirken können, untersucht. Im Hinblick auf dieses Ziel bestand ein zu verfolgender wissenschaftlicher Ansatz darin, Muteine zu synthetisieren, die die Fähigkeit, an IL-6Ra zu binden, beibehalten, aber die Fähigkeit, gp130 zu gewinnen, verloren haben. Daher sollte das optimale Molekül eines sein, das keine IL-6-Aktivität zeigt, aber eine stärkere IL- 6Rα-Bindung als IL-6 zeigt und das im Vergleich zu IL-6 möglichst wenig Mutationen zeigt, um die Risiken einer Antigenität zu verringern.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die Anmelderin hat nun festgestellt, dass durch Kombination von Punktmutationen an Position 54 mit zwei Mutationen F170L/S176R, die die Affinität für IL-6Ra erhöhen, und zwei Mutationen Q159E/T162P, die die IL-6Ra-abhängige Wechselwirkung mit gp130 verringern, humane IL-6-Muteine erhalten werden, die die Rezeptorbindung beibehalten, gp130 aber nicht aktivieren. Ein Hauptgegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO:1 sowie auch Fragmente davon, die die folgenden Mutationen bezüglich der Aminosäuresequenz des natürlich vorkommenden IL-6 umfassen: Pro in Position 54, Glu in Position 159, Pro in Position 162, Leu in Position 170 und Arg in Position 176. Dieses Molekül verhielt sich bei der humanen IL-6-abhängigen Myelomzelllinie XG-1 als wirksamer IL-6-Antagonist und zeigt alle oben beschriebenen Vorteile.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein DNA-Molekül, das die DNA-Sequenz, die für das Polypeptid von SEQ ID NO:1 codiert, sowie ihre Varianten, die aus der Degeneration des genetischen Codes resultieren und für ein Polypeptid mit derselben Aktivität wie das von SEQ ID NO:1 codieren, umfasst.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Plasmidvektor, der die Nukleotidsequenz der Erfindung enthält.
Nach einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung des Proteins als Medikament bereit. Sie bezieht sich insbesondere auf die Verwendung des erfindungsgemäßen Proteins bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krankheiten, in denen IL-6 eine pathogenetische Wirkung hat, z.B. Plasmozytom/Myelom, Osteoporose und neoplastische und Autoimmunerkrankungen.
Das Medikament wird vorzugsweise in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung präsentiert, die das Protein der Erfindung zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägern und/oder Exzipientien umfasst. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen bilden einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung.
Ein Verfahren zur Herstellung des Muteins der Erfindung beruht auf der PCR-Technologie unter Verwendung synthetischer Oligonukleotide, die eine Fehlpaarung bei der Base, die mutiert werden soll, enthalten, als Primer.
Eine Expression eines der rekombinanten Proteine der Erfindung, wie sie hierin genannt wurden, kann in eukaryotischen Zellen (z.B. Hefen, Insekten- oder Säugerzellen) oder prokaryotischen Zellen unter Verwendung der geeigneten Expressionsvektoren erfolgen. Es kann ein beliebiges Verfahren, das auf dem Fachgebiet bekannt ist, angewendet werden.
Die DNA-Moleküle, die für das Polypeptid der Erfindung codieren, können z.B. durch Techniken, die auf dem Fachgebiet bekannt sind (siehe Sambrook et al., 1989) in geeignet konstruierte Expressionsvektoren insertiert werden. Doppelsträngige cDNA wird durch Homo polymer-Ansynthetisieren von Enden oder durch Restriktionsbindung, welche die Verwendung von synthetischen DNA-Linkern oder Ligationstechniken mit glatten Enden involviert, an Plasmidvektoren geknüpft: DNA-Ligasen werden verwendet, um die DNA-Moleküle zu ligieren, und ein unerwünschtes Verknüpfen wird durch Behandlung mit alkalischer Phosphatase vermieden.
Um fähig zu sein, das gewünschte Protein zu exprimieren, sollte ein Expressionsvektor auch spezifische Nukleotidsequenzen umfassen, die transkriptionale und translationale Regulationsinformationen, geknüpft an die DNA, die für das gewünschte Protein codiert, enthalten, so dass eine Genexpression und Produktion des Proteins ermöglicht wird. Damit das Gen transkribiert wird, muss diesem ein Promotor vorausgehen, der durch RNA-Polymerase erkennbar ist, an die Polymerase bindet und somit den Transkriptionsprozess initiiert. Eine Vielzahl solcher Promotoren sind in Verwendung, wobei sie mit verschiedenen Wirksamkeiten arbeiten (starke und schwache Promotoren).
Für eukaryotische Wirte können verschiedene transkriptionale und translationale Regulationssequenzen verwendet werden, und zwar in Abhängigkeit von der Natur des Wirts. Sie können aus viralen Quellen, z.B. Adenovirus, Rinderpapillomvirus, Affenvirus oder dergleichen, stammen, in denen die Regulationssignale mit einem besonderen Gen assoziiert sind, das einen hohen Expressionslevel hat. Beispiele sind der TK-Promotor des Herpes-Virus, der frühe SV40-Promotor, der Hefe-gal4-Genpromotor, usw. Es können Transkriptions-Initiations-Regulationssignale ausgewählt werden, die eine Repression und Aktivierung ermöglichen, so dass die Expression der Gene moduliert werden kann.
Das DNA-Molekül, das die Nukleotidsequenz umfasst, welche für das erfindungsgemäße Polypeptid codiert, wird in einen Vektor (in Vektoren) insertiert, der/die transkriptionale und translationale Regulationssignale funktionell gebunden hat/haben und der/die die fähig ist/sind, die gewünschten Gensequenzen in die Wirtszelle zu integrieren. Die Zellen, die durch die eingeführte DNA in stabiler Weise transformiert wurden, können selektiert werden, um einen Marker oder mehrere Marker einzuführen, die für eine Selektion von Wirtszellen sorgen, welche den Expressionsvektor enthalten. Der Marker kann auch für Phototrophie bei einem auxtropen Wirt, Biozidresistenz, z.B. Antibiotika, oder Schwermetalle, wie Kupfer oder dergleichen, sorgen. Das selektierbare Markergen kann entweder direkt an die DNA-Gensequenzen, die exprimiert werden sollen, gebunden sein oder kann durch Co-Transfektion in dieselbe Zelle eingeführt sein. Es können auch zusätzliche Elemente für eine optimale Synthese der erfindungsgemäßen Proteine notwendig sein.
Faktoren, die bei der Auswahl eines besonderen Plasmids oder viralen Vektors von Bedeutung sind, umfassen: die Leichtigkeit, mit der Rezipientenzellen, die den Vektor enthalten, von solchen Rezipientenzellen, die den Vektor nicht enthalten, erkannt und ausgewählt werden können; die Kopienzahl des Vektors, die in einem besonderen Wirt erwünscht ist, und ob es wünschenswert ist, fähig zu sein, den Vektor zwischen Wirtszellen verschiedener Spezies „hin und her zu bewegen".
Sobald der Vektor (die Vektoren) oder die DNA-Sequenz, die das Konstrukt (die Konstrukte) enthält, zur Expression präpariert wurde (wurden), kann (können) das DNA-Konstrukt (die DNA-Konstrukte) durch eines einer Reihe geeigneter Mittel in eine geeignete Wirtszelle eingeführt werden; Mittel sind: Transformation, Transfektion, Konjugation, Protoplastenfusion, Elektroporation, Calciumphosphat-Präzipitation, direkte Mikroinjektion, usw.
Wirtszellen können entweder prokaryotisch oder eukaryotisch sein. Bevorzugt sind eukaryotische Wirte, z.B. Säugerzellen, wie humane, Affen-, Maus- und chinesische Hamster-Eierstock(CHO)-Zellen, da sie post-translationale Modifikationen für Proteinmoleküle einschließlich korrekter Faltung oder Glykosilierung an korrekten Stellen, bereitstellen. Auch Hefezellen können post-translationale Peptidmodifikationen, einschließlich Glykosilierung, durchführen. Es gibt eine Reihe von rekombinanten DNA-Strategien, die starke Promotorsequenzen und hohe Kopienzahlen von Plasmiden verwenden, die für die Produktion der gewünschten Proteine in Hefe genutzt werden können. Hefe erkennt Leadersequenzen an klonierten Säugergenprodukten und sezerniert Peptide, die Leadersequenzen tragen (d.h. Prä-Peptide).
Nach Einführung des Vektors (der Vektoren) werden die Wirtszellen in einem selektiven Medium, das auf Wachstum von Vektor-enthaltenden Zellen selektiert, wachsen gelassen. Eine Expression der klonierten Gensequenzen) führt zur Produktion des gewünschten Proteins.
Eine Reinigung der rekombinanten Proteine wird nach einem der für diesen Zweck bekannten Verfahren durchgeführt, d.h. durch ein herkömmliches Verfahren durchgeführt, welches Extraktion, Präzipitation, Chromatographie, Elektrophorese oder dergleichen beinhaltet. Ein weiteres Reinigungsverfahren, das bevorzugt zur Reinigung des Proteins der Erfindung verwendet werden kann, ist Affinitätschromatographie unter Verwendung monoklonaler Antikörper, die das Zielprotein binden, und die produziert werden und an einer Gelmatrix, die in einer Säule enthalten ist, immobilisiert werden. Unreine Präparate, die das rekombinante Protein enthalten, werden durch die Säule geleitet. Das Protein wird durch den spezifischen Antikörper an die Säule gebunden, während die Verunreinigungen hindurchgehen werden. Nach dem Waschen wird das Protein durch eine Änderung beim pH-Wert oder der Ionenstärke vom Gel eluiert.
Die Erfindung wird nun anhand des folgenden Beispiels beschrieben, welches die vorliegende Erfindung in keiner Weise beschränken soll. Das Beispiel wird sich auf die unten spezifizierten Figuren beziehen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1. Punktmutationen von humanem IL-6-Protein. (A) Darstellung des humanen IL-6-Proteins mit den vier vorausgesagten α-Helices, die als schraffierte Kästchen gezeigt sind. Die Zahlen geben die vorausgesagten ersten und letzten Reste der α-Helices an. Die Aminosäuresequenzen der Regionen 2c und 2a mit ihrer Unterteilung in Region 2a1 und 2a2 von huma nem (oben) und murinem (unten) IL-6 sind gezeigt. Die produzierten Punktmutationen in der Region 2a sind dargestellt. (B) Anordnung der IL-6-Spezies in der Region 2a. (C) Bandpräsentation des humanen IL-6-Modells. Eine Darstellung von F78 (Boden), das für IL-6Ra-Bindung von Bedeutung ist, und K54 (oben), das für eine IL-6Ra-abhängige gp130-Wechselwirkung wichtig ist. Der N-Terminus entspricht Rest 17 von humanem IL-6 (Ehlers et al. 1994).
2. Nukleotidsequenz des humanen IL-6-Muteins der vorliegenden Erfindung. Sie enthält im Vergleich zum humanen IL-6 fünf Punktmutationen, an den Positionen 54, 159, 162, 170, 176. Solche Positionen sind fettgedruckt.
3. Bindung und Bioaktivität von K54-Punktmutanten von humanem IL-6. (A) Bindung der IL-6-Muteine an lösliches humanes IL-6Ra. Es sind Durchschnittswerte von zwei Experimenten gezeigt. (B) Proliferation von marinen B9-Zellen und (C) humanen XG-1-Zellen als Antwort auf IL-6-Mutanten. Es ist ein repräsentatives Beispiel von drei Experimenten gezeigt. (D) Induktion einer Haptoglobinexpression in humanen Hepatomzellen durch IL-6-Muteine. Die Menge an humanem IL-6, die für eine 50%ige Haptoglobinexpression benötigt wird, wurde als 100% gesetzt. Es sind die Durchschnittswerte von zwei Experimenten gezeigt.
4. Bindung und Bioaktivität von Punktmutationen von K54 in Kombination mit EP-LR. (A) Bindung der IL-6-Muteine an lösliches humanes IL-6Ra. Es sind Durchschnittswerte von zwei Experimenten gezeigt. (B) Proliferation von murinen B9-Zellen und (C) von humanen XG-1-Zellen als Reaktion auf IL-6-Mutanten. Es ist ein repräsentatives Beispiel von drei Experimenten gezeigt. (D) Induktion einer Haptoglobinexpression in humanen Hepatomzellen durch IL-6-Muteine. Der Grad der Haptoglobinexpression in Gegenwart von 1 μg/ml Mutante ist gezeigt. Es sind Durchschnittswerte von zwei Experimenten angegeben.
5. Antagonistischer Effekt von Punktmutationen von K54 in Kombination mit EP-LR auf die durch humanes IL-6 induzierte Proliferation von XG-1-Zellen. Die angegebenen Konzentrationen der IL-6-Mutanten wurden in Gegenwart von 100 pg/ml humanem IL-6 zu XG-1-Zellen gegeben und die Proliferation wurde gemessen. Es sind Durchschnittswerte von vier Experimenten gezeigt.
BEISPIELE
MATERIALIEN UND METHODEN
Chemikalien
Restriktionsenzyme AccI, EcoNI, HindIII, NcoI, NheI und XbaI wurden von AGS (Heidelberg, Deutschland) erhalten, Polynukleotidkinase, intestinale Kälberphosphatase und T4-DNA-Ligase waren von Boehringer Mannheim (Mannheim, Deutschland). Restriktionsenzym BspEI und Vent-DNA-Polymerase wurden von NEN Biolabs (Schwalbach, Deutschland) bezogen und Zellkulturmedien wurden von Gibco (Eggenstein, Deutschland) erhalten. Bolton-Hunter-Reagens (74 TBq/mmol) und tran[^3SS]-Markierung wurden von Amersham International (Amersham, Großbritannien) erhalten.
Oligonukleotide wurden von Pharmacia (Freiburg, Deutschland) erhalten.
Polyklonales Ziegen- und Kaninchen-Serum gegen humanes Haptoglobin wurden von Sigma (Deisenhofen, Deutschland) bezogen und mit alkalischer Phosphatse konjugiertes polyklonales Eselserum gegen Kaninchen-IgG wurde von Pierce (Rockford, USA) erhalten.
Humane IL-6-cDNA war ein Geschenk der Drs. T. Hirano und T. Kishimoto (Osaka, Japan).
Das bakterielle Expressionsplasmid pRSET 5d und die Wirtsbakterien BL21(DE3) wurden von Schöpfer et al., (26), beschrieben. Nach Ersetzen der Signalsequenzen durch ein Translations-Startcodon wurde die cDNA, die für humanes IL-6 codiert, unter Verwendung der Restriktionsstellen NcoI und HindIII in den Vektor pRSET 5d kloniert (27).
Die humane Myelomzelllinie XG-I wurde großzügigerweise von Dr. B. Klein (Nantes, Frankreich) geliefert.
Das lösliche IL-6-Protein wurde in E. coli exprimiert, renaturiert und gereinigt (28).
Das polyklonale monospezifische Antiserum gegen IL-6Ra wurde hergestellt, indem ein Teil der extracellulären Domäne des löslichen IL-6Ra-Proteins Kaninchen injiziert wurde (28).
Konstruktion von Expressionsvektoren
Um Punktmutationen an Aminosäure 54 in das humane IL-6 (pRSET Sd-huIL-6-K54X) einzuführen, wurden vier Oligonukleotide fusioniert und in die EcoNI-NheI-verdaute pRSET 5d-Mutante (2a) ligiert (9). Die Oligonukleotide waren:
Um die Punktmutationen von Aminosäure 54 mit den zwei Punktmutationen F170L/S176R (Kurzbezeichnung LR) und den zwei Punktmutationen Q159E/T162P (Kurzbezeichnung EP) zu kombinieren, wurden die Vektoren pRSET 6d-huIL-6-EP-K54X-LR konstruiert, indem NcoI-XbaI-cDNA-Fragmente aus pRSET-5d-huIL-6-K54X in den mit NcoI-XbaI-verdauten Vektor pRSET 6d-huIL-6-Q159E/T162P-2a2-F170L/S176R (Kurzbezeichnung pRSET 6d-huIL-6-EP-2a2-LR) ligiert wurden (19). Die Integrität aller Konstrukte wurde durch Restriktionsfragmentanalyse und DNA-Sequenzierung bewiesen (29).
Herstellung von Proteinen
BL21(DE3)-Bakterien wurden mit den geeigneten pRSET-Expressionsvektoren transformiert. Eine Genexpression und eine Rückfaltung von Proteinen, die aus Einschlusskörpern solubilisiert worden waren, wurde durchgeführt, wie es in der Literatur beschrieben ist (27, 30, 31). Rückgefaltete Proteine wurden zu einer Homogenität >90% gereinigt. Die Reinheit der rekombinanten Proteine wurde durch 12,5% SDS-PAGE und Silberfärbung untersucht.
Bindung von IL-6 an das lösliche humane IL-6Ra
Gereinigte IL-6-Mutantenproteine wurden in PBS, das 0,02% TWEEN 20/0,2% BSA enthielt, reihenverdünnt und mit 1 ng humanem ¹²⁵I-IL-6 (60.000–90.000 cpm/ng) und 1,7 ng löslichem humanen IL-6Ra, exprimiert in E. coli (28), versetzt, so dass ein Endvolumen von 500 μl erhalten wurde. Nach Inkubation über Nacht bei 4°C wurden IL-6/sIL-6Ra-Komplexe immunpräzipitiert, wobei ein IL-6Ra-Antiserum und Protein-A-Sepharose verwendet wurden; die Radioaktivität wurde durch g-Zählung bestimmt.
Biologische Assays
Für Assays auf murine B9- und humane XG-I-Proliferation wurden IL-6-Mutantenproteine auf die in den Figuren angegebenen Konzentrationen in Reihe verdünnt. Die Assays wurden durchgeführt, wie es in der Literatur beschrieben ist (32, 33). Eine B9-Einheit, die etwa 1 pg humanem IL-6- pro ml entspricht, führte zu einer halb-maximalen Proliferation von B9-Zellen. Mit humanen XG-1-Zellen wurde nach Stimulierung mit etwa 50 pg/ml humanem IL-6 eine halb-maximale Proliferation erreicht. Für den Assay auf Proteinsekretion in der akuten Phase wurden humane Hepatomzellen (Hep3B) in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10%igem fötalem Kälberserum kultiviert, in Kulturplatten mit 96 Vertiefungen plattiert und Konfluenz erreichen gelassen. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, für 1 h in DMEM ohne fötales Kälberserum hungern gelassen und anschließend für 20 h in 100 ml serumfreiem DMEM mit steigenden Mengen an IL-6-Muteinen behandelt. Die Menge an Haptoglobin, die in das Kulturmedium sezerniert worden war, wurde durch einen enzymgebundenen Immunsorbens-Assay detektiert (34).
RESULTATE
Aminosäure K54 von IL-6 ist bei der IL-6Ra-abhängigen gp130-Wechselwirkung involviert
Studien mit chimären human/murinen IL-6-Proteinen hatten gezeigt, dass die Region 2a2 (Reste 55–55) des IL-6-Proteins für die IL-6Ra-abhängige Wechselwirkung mit gp130 wichtig ist (19) (1A). Der Austausch dieser Reste gegen die entsprechenden murinen Aminosäuren resultierte in einer verringerten Bindung an gp130 und einer 30fach verringerten Bioaktivität auf humane XG-1-Zellen. Die Anordnung von zehn IL-6-Spezies zeigte, dass die positiv geladene K54 innerhalb der 2a2-Region in 8 Spezies konserviert wird, in der Maus- und Rattensequenz allerdings in die negativ geladene Asparaginsäure geändert ist (35, 36) (1B). Wir tauschten daher K54 (1C) durch die in 1A angegebenen Aminosäuren aus. Das Klo nierungsverfahren führte auch zu drei Doppelpunktmutationen von IL-6: C44F/K54E, C50F/K54N und S52R/K54N, die auch analysiert wurden (1A).
Um den Einfluss von K54-Punktmutationen auf die IL-6Ra-abhängige gp130-Wechselwirkung zu untersuchen, haben wir zuerst die Bindung an IL-6Ra durch Verdrängung der humanes ¹²⁵I-IL-6-Bindung an eine lösliche Form des IL-6Ra-Proteins durch einen Überschuss der Punktmutanten gemessen. Wie in 3A gezeigt ist, verdrängte nicht-markiertes humanes Wildtyp-IL-6 die humanes ¹²⁵I-IL-6-Bindung zu 50%, wenn es in 10-20fachem molarem Überschuss verwendet wurde. Die Punktmutante K54P und die Doppelmutante S52R/K54N zeigten eine 10fach höhere Affinität als humanes IL-6, wohingegen die Mutante K54E eine 3fach niedrigere Affinität als huIL-6 für IL-6Ra hatte. Die anderen untersuchten Mutanten zeigten eine ähnliche Affinität wie humanes IL-6. Wiederum stimulierten die Mutanten die Proliferation von murinen IL-6-abhängigen B9-Zellen zu einem ähnlichen Grad wie humanes IL-6, was zeigte, dass ihre Strukturen intakt waren (3B).
Für humane Myelom-XG-1-Zellen und humane Hepatomzellen war das Bioaktivitätsmuster der IL-6-Muteine: K54P > S52R/K54N > huIL-6 = K54F > K54D > K54E > C50F/K54N > C44F/K54E. So zeigten die Mutanten K54P und S52R/K54N, die die höchste Affinität für IL-6Ra hatten, auch die höchste Bioaktivität für humane Zellen. Der Austausch des positiven geladenen Lysin 54 gegen die entsprechende negativ geladene Asparaginsäure führte nur zu einer leicht reduzierten Bioaktivität für humane Zellen, wohingegen der Austausch gegen Glu zu einer wesentlichen Verringerung (10fach) der Bioaktivität führte.
Konzipierung neuer humaner IL-6-Rezeptor Antagonisten
Vor kurzem haben wir gezeigt, dass die Einführung der murinen Reste 50–55 (Region 2a2) und der zwei Punktmutationen F170L/S176R (Kurzbezeichnung LR), die die Affinität für IL-6-Ra erhöhen, in die Doppelmutante Q159E/T162P (Kurzbezeichnung IL-6-E), die eine verringerte Wechselwirkung mit gp130 zeigt, zu einem IL-6-Mutein ohne detektierbare Bioaktivität gegenüber humanen Zellen führt (19). Die Affinität dieser IL-6-Mutante (IL-6-EP-2a2-LR) für humanes IL-6Ra war ähnlich der für humanes IL-6. Diese IL-6-Mutante war ein wirksamer IL-6-Rezeptor-Antagonist für die hochempfindliche, von humanem IL-6-abhängige, humane Myelomzelllinie XG-1.
Wir führten die K54-Mutanten in die Mutante IL-6-EP-LR ein. Die resultierenden IL-6-Mutantenproteine wurden IL-6-EP-K54X-LR genannt, wobei X alle Mutationen bezeichnet, die in Position 54 eingeführt sind, (1A). Mutante IL-6-EP-C44F/K54E-LR und die Mutante IL-6-EP-K54E-LR zeigten eine reduzierte Affinität für das humane IL-6Ra, wohingegen sich alle anderen Mutanten wie humanes IL-6 verhielten (4A). Die Proliferation von murinen B9-Zellen war für Mutante IL-6-EP-2a2-LR und IL-6-EP-S52R/K54N-LR stark reduziert. Alle anderen Mutanten waren 5-10fach weniger aktiv als humanes IL-6 (4B). Dagegen war die Proliferation von humanen Myelom-XG-1-Zellen für die Mutanten IL-6-EP-LR, IL-6-EP-K54F-LR und IL-6-EP-S52R/K54N-LR um etwa drei Größenordnungen reduziert (4C). Alle anderen Mutanten zeigten keine detektierbare Bioaktivität. Bei den humanen Hep3B-Zellen zeigten nur die Mutanten IL-6-EP-LR und IL-6-EP-K54F-LR Restaktivität (4D).
Wenn Mutanten ohne Bioaktivität in steigenden Mengen humanen Myelomzellen (XG-1), die durch 100 pg/ml humanes IL-6 stimuliert worden waren, zugesetzt wurden, wurde eine Inhibierung der Proliferation beobachtet. 5 zeigt, dass der Zusatz der Mutanten IL-6-EP-2a2-LR und IL-6-EP-K54P-LR bei etwa 100 ng/ml zu 50%iger Inhibierung der Proliferation führte, wohingegen alle anderen Mutanten etwa 5–10fach weniger wirksam waren.
DISKUSSION
Aminosäure K54 ist Teil eines gp130-Bindungsepitops
Alle IL-6-Muteine mit Ersatz von K54 durch verschiedene Aminosäurereste binden effizient an das humane IL-6Ra. Interessanterweise führte die Einführung von P54 und die Doppelmutation S52R/K54N zu IL-6-Proteinen mit höherer Affinität für das humane IL-6Ra. Da die 2a2-Region, die den Rest 54 enthält, bei der gp130-Wechselwirkung involviert ist (19), ist dies wahrscheinlich ein indirekter Effekt. Wir gehen davon aus, dass das Vorliegen von P54 oder der geladenen Aminosäure Arginin in Position 52 zu einer Relokation der Schleife in Helix A und Helix B führt, wodurch die Position der Region 2C verändert wird, welche direkt bei der IL-6Ra-Wechselwirkung involviert ist. Der Ersatz des Lysin 54, das bei acht Spezies konserviert wird, durch eine Asparaginsäure, die bei Maus und Ratte konserviert ist, führt zu einer leicht reduzierten Bioaktivität, wohingegen der Ersatz durch Glutaminsäure zu einer substantiellen Verringerung (10fach) der Bioaktivität führt. Da Glutaminsäure eine Seitenkette trägt, die um eine Methylengruppe länger ist als die von Asparaginsäure, ist es wahrscheinlich, dass der Abstand zwischen der geladenen Gruppe und dem humanen IL-6Ra kritisch ist. Aus diesen Daten kann die Hypothese erstellt werden, dass K54 Kontakt zu einem negativ geladenen Rest des humanen gp130 herstellt und dass die Einführung einer negativ geladenen Aminosäure in Position 54 in humanem IL-6 zu einer Verringerung der Erkennung zwischen gp130 und dem IL-6/IL-6Ra-Komplex führt. Die Mutation der Cysteine 44 oder 50 führte zu IL-6-Proteinen mit nur leicht verringerter Bioaktivität, was die jüngeren Resultate von Rock et al. (34) bestätigt, die zeigen konnten, dass die Substitution der Cysteine 44 und 50 nicht zu inaktiven IL-6-Muteinen führt.
Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung
Die Struktur des humanes Wachstumshormon/Wachstumshormon-Rezeptor-Komplexes (GH/GHR₂) wurde geklärt (22). Die Wechselwirkungsstellen zwischen Wachstumshormon und seinem Rezeptor wurden ausgiebig mutiert (38–40) und der Beitrag einzelner Aminosäurereste zu der Bindungsenergie wurde bewertet (41). Da der Wachstumshormon-Rezeptor-Komplex bisher das einzige Rezeptor-Ligand-Paar der hämatopoetischen Cytokinfamilie ist, das auf atomarem Level verstanden wird, hat es als Paradigma für andere Glieder dieser Familie gedient. Für den Wachstumshormon-Rezeptor-Komplex wurde gezeigt, dass das wechselwirkende Epitop an beiden, Ligand und Rezeptor, aus etwa 30 Aminosäureresten besteht (41). Der Beitrag dieser Aminosäurereste ist allerdings nicht gleich. Die meiste Bindungsenergie wird durch zwei hydrophobe Wechselwirkungen bereitgestellt. Dieser Bindungskern wird von weniger bedeutenden Kontaktresten umrandet, welche im Allgemeinen hydrophil und teilweise hydratisiert sind, von denen nur ein Drittel zur Bindungsenergie beiträgt. Es wurde postuliert, dass die Einrichtung der Bindungsstelle auch auf andere Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen anwendbar ist (41).
Es wird allerdings davon ausgegangen, dass K54 einer der umgebenden Reste eines zentralen IL-6/gp130-Wechselwirkungsbereichs ist, der daher zu einem geringen Ausmaß zu der Bindungsenergie beiträgt. Der relativ starke Effekt der K54P-Substitution im antagonistischen IL-6-Mutein wird strukturellen Änderungen in der AB-Schleife zugeschrieben.
IL-6-Rezeptor Antagonisten
Bisher wurden zwei Hauptregionen von IL-6 identifiziert, von denen angenommen wird, dass sie gp130 kontaktieren: (i) die 2a2-Region (Reste 50–55) und Leucin 57, die durch den oberen Teil der Helix D von IL-6 ergänzt werden, und (ii) ein Epitop, das durch Teile der Helix A und Helix C gebildet wird (9, 18–21, 23, 24). Eine Bindung von IL-6 an IL-6Ra erfordert das Ende der A-B-Schleife (Rest 78) wie auch den C-Terminus des Proteins (9, 13–16). Es ist klar, dass zwei gp130-Moleküle für eine Signalinitiation notwendig sind, und es ist sehr wahrscheinlich, dass die Rolle der zwei gp130-Wechselwirkungsstellen innerhalb IL-6 darin besteht, die zwei gp130-Proteine ineinander greifen zu lassen. Alterationen innerhalb beider, mit gp130 wechselwirkende Regionen haben zu Molekülen geführt, die ihre Rezeptor-Bindungskapazität beibehielten, eine Signalgebung aber nicht initiieren konnten. Es wurde gezeigt, dass solche Moleküle als IL-6-Rezeptor-Antagonisten verwendet werden können (19, 21, 23, 24). Die Tatsache, dass gleichzeitig die IL-6Ra-Bindungscharakteristika von IL-6-Muteinen verbesssert wurden, hat zu sogenannten Superantagonisten geführt (19, 21, 24), was nahe legt, dass es möglich ist, die Bindungseigenschaften an verschiedene Rezeptoruntereinheiten in einer irgendwie unabhängigen Weise zu verändern.
Der neue IL-6-Rezeptor-Antagonist, der in dieser Patentanmeldung präsentiert wird, enthält eine einzelne K54P-Substitution innerhalb der 2a2-Region und ist ebenso wirksam wie das kürzlich entwickelte IL-6-Mutein mit 5 Aminosäureaustauschen in der 2a2-Region (19).
Interessanterweise zeigte das mutante K54P-Protein eine höhere IL-6Ra-Bindung als humanes IL-6, wohingegen die Kombinationsmutante mit EP und LR normale IL-6Ra-Bindung aufwies.
Was das therapeutische Potential von Cytokin-Rezeptor-Antagonisten angeht, so ist klar, dass je weniger Aminosäuren ausgetauscht werden, desto geringer ist die Chance, dass der Antagonist antigen sein wird. Diesbezüglich stellt das IL-6-Mutein IL-6-EP-K54P-LR gegenüber den bisher verfügbaren IL-6-Rezeptor-Antagonisten eine Verbesserung dar.
Literaturstellen:

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 wie auch Fragmente davon, die die folgenden Mutationen bezüglich der Aminosäuresequenz des natürlich vorkommenden humanen IL-6 umfassen: Pro in Position 54, Glu in Position 159, Pro in Position 162, Leu in Position 170 und Arg in Position 176.
DNA-Molekül, das die DNA-Sequenz, die für das Polypeptid von Anspruch 1 codiert, sowie ihre Varianten, die aus der Degeneration des genetischen Codes resultieren und für ein Polypeptid mit derselben IL-6-Antagonistaktivität auf die humane IL-6-abhängige Myelomzelllinie XG-1 wie das Polypeptid nach Anspruch 1 codieren, umfasst.
Vektor, der die DNA-Sequenz von Anspruch 2 umfasst.
Wirtszelle, die mit der DNA-Sequenz nach Anspruch 2 oder dem Vektor nach Anspruch 3 transformiert ist.
Verfahren zur Herstellung des Polypeptids nach Anspruch 1, umfassend: (a) Kultivieren der Wirtszellen nach Anspruch 4 in einem geeigneten Kulturmedium; und (b) Isolieren des Polypeptids aus dem Kulturmedium.
Polypeptid nach Anspruch 1 zur Verwendung als Medikament.
Polypeptid nach Anspruch 1 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von Krankheiten, in denen IL-6 eine pathogenetische Wirkung hat.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Polypeptid nach Anspruch 1 zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägern und/oder Exzipientien umfasst.