DE69033937T2

DE69033937T2 - Verfahren zur Herstellung von genetischen Vektoren zur Expression vom Nerven-Wachstumsfaktor in eukaryotischen Zellen

Info

Publication number: DE69033937T2
Application number: DE69033937T
Authority: DE
Inventors: Lanfranco Callegaro; Francesco Della Valle; Alessandro Negro
Original assignee: Fidia SpA
Current assignee: Fidia Farmaceutici SpA
Priority date: 1989-11-16
Filing date: 1990-11-16
Publication date: 2002-11-14
Anticipated expiration: 2010-11-17
Also published as: ES2173856T3; JPH03224490A; IT8948564A0; FI905691L; YU217890A; FI905691A0; HUT61047A; DE69033937D1; IT1238348B; FI905691A7; AR246983A1; NZ236058A; CA2030108C; IE904120A1; PT95911A; CN1051934A; EP0432510A1; IT8948564A1; PT95911B; CA2030108A1

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erhalt des Polypeptids, welches Nerven-Wachstumsfaktor genannt wird (β- NGF), aus transformierten Zellen und genauer Glas Verfahren zum Erhalt der menschlichen, biologisch aktiven, reifen Form (β- Untereinheit) durch rekombinante DNA-Technologie unter Verwendung von genetischen Konstrukten, welche in geeignete eukaryontische Zelllinien eingebracht werden können.

A. Nerven-Wachstumsfaktor (NGF)

Der Nerven-Wachstumsfaktor (NGF) wurde zuerst in Maus- Sarkom-Tumoren entdeckt (Levi-Montalcini, R. et al., J. Exp. Zool. 116: 321, 1951) und wurde dann aus Speicheldrüsen des Unterkiefers einer männlichen Maus (Varon, S. et al., Biochemistry 6: 2202, 1967) und aus Schlangengift (Angeletti, R. H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 65: 668, 1970) aufgereinigt und zur Homogenität gebracht. Viele andere verhältnismäßig reichhaltige NGF-Quellen sind angegeben worden, einschließlich die Prostata des Meerschweinchens (Harper G. P. et al., Nature 279: 160, 1979) und menschliche Placenta (Goldstein, L. D. et al., Neurochem. Res. 3: 175, 1978, Walker, P. et al., Life Science 26: 195, 1980, Fidia Patent 47745A88). Kleine Mengen von NGF sind in anderen Geweben gefunden worden, wie zum Beispiel das zentrale Nervensystem von Säugern (Varon, S., Discussions in Neuroscience, Bd. II, Nr. 3, 1985; Hefti, F. et al., Neuroscience 14: 55, 1985). Die physiologische Beziehung zwischen diesen potenziellen Quellen für NGF und deren apparenten Wirkorten sind nicht sehr klar; im Allgemeinen wird aber angenommen, dass NGF von verschiedenen peripheren Geweben sekretiert wird, welche eine Innervierung von denjenigen Zellen benötigen, welche auf den NGF antworten.
Der NGF, welcher aus der Unterkiefer-Speicheldrüse der Maus erhalten wird, ist derjenige, der für Studien über die Aktivität von NGF in vitro und in vivo am häufigsten verwendet wird. Der Bereich an biologischer Aktivität von NGF in vitro wurde sowohl an primären Nervenzellen als auch an clonierten Zelllinien bestimmt. Unter den primären Nervenzellen, welche in vitro auf den NGF antworteten, sind fötale sensorische Neuronen (Fötus Tag 8-12) aus den Wurzeln des spinalen Ganglions, autonome noradrenerge fötale Neuronen aus dem sympathischen Ganglion, cholinerge fötale Neuronen aus dem Septum und chromaffine suprarenale Zellen während der Entwicklung. Während die sensorischen und sympathischen Neuronen von NGF abhängen, um zu überleben und sich zu entwickeln, scheinen die cholinergen Neuronen NGF nicht zum Überleben, sondern ausschließlich für ihre Differenzierung zu benötigen, d. h. zur Expression der phänotypischen Merkmale, welche an den Neurotransmitter gekoppelt sind. Die Zugabe von NGF zu den chromaffinen suprarenalen Zellen (erhalten aus der Neuralleiste) während der ersten Phase ihrer Entwicklung verursacht die Expression des Nerven-Phänotyps. Die chromaffinen suprarenalen Zellen, welche aus Tumoren der Neuralleiste erhalten wurden, Phäochromocytom-Sellen (PC12) genannt, und menschliche Neuroblastom-Zellen gehören zu den Zelllinien, welche in vitro auf NGF antworten, wie in der Literatur beschrieben. Nach Behandlung mit β-NGF verändern diese Zellen ihr Verhalten und gehen aus einer stark proliferativen Phase in einen postmitotischen Zustand über.
Der Nerven-Wachstumsfaktor, welcher aus der Unterkiefer- Drüse der Maus erhalten wurde, ist derjenige, welcher am besten charakterisiert ist, auch anhand eines chemischen und immunchemischen Profils. Der NGF aus murinen Drüsen wirkt wie ein Protein-Komplex vom 75-Typ (Molekulargewicht etwa 140.000 Dalton), welcher aus drei Untereinheiten (α, β, γ) zusammengesetzt ist, die ein Zn&spplus;-Atom koordinieren.
Der interessanteste Bereich des 7S-Moleküls in Bezug auf seine biologische Aktivität ist aus zwei Polypeptid-Ketten zusammengesetzt, wovon jede ein Molekulargewicht von 13.250 hat und aus 118 Aminosäuren besteht. Jede Kette oder jedes Monomer besitzt drei Sulfid-Brücken, welche kovalente Bindungen zwischen zwei Cystein-Resten ausbilden, die eine starke Stabilität der dreidimensionalen Struktur des Proteins verleihen. Die zwei Monomere von MOB, welche miteinander durch schwache Bindungen verknüpft sind, bilden ein Dimer mit einem Molekulargewicht von 26.500 aus. Es ist gezeigt worden, dass die biologische Aktivität mit dem Dimer assoziiert ist, welches 2.55- oder allgemein β-Untereinheit genannt wird. Es ist nicht bekannt, ob diese auch in dem Monomer anwesend ist.
Die Verfahren der Gentechnik haben es möglich gemacht, das Gen zu identifizieren, welches die βUntereinheit von NGF codiert (β-NGF) (Scott, J. et al., Nature 302: 538, 1983; Ullrich, A, et al., Natur 303821, 1983; EP Patent- Veröffentlichung Nr. 0 121 338). Das menschliche Gen, welches das Molekül codiert, ist auf dem kurzen Arm von Chromosom 1 lokalisiert und codiert für die Synthese eines Moleküls, welches viel größer ist, als dem Molekulargewicht von 26.500 entspricht, welches die biologische Aktivität des Moleküls ausmacht. Deshalb weist das Gen zunächst die Synthese eines NGF-Vorläufers oder Pro-NGF von größeren Ausmaßen an. Es ist weiter gezeigt worden, dass das Gen, welches die β-Untereinheit von NGF codiert, in verschiedenen Arten, vom Vogel bis zum Menschen, stark konserviert ist (Meier, R. et al., EMBO J. 5: 1489, 1986).
Die Aufklärung der Nucleotid-Sequenzen vom murinen β-NGF, vom NGF des Menschen, vom Rind und vom Huhn hat einen Vergleich der konservierten Stellen dieser Moleküle und derjenigen, welche nicht konserviert sind, und deren Beziehung zur biologischen Aktivität und Antigenität ermöglicht. Die umfassende Konservierung von β-NGF während der Evolution ist überraschend hoch. Von 118 Aminosäuren der reifen Form von NGF, welches aus der Unterkiefer-Speicheldrüse einer männlichen Maus aufgereinigt wurde, sind im β-NGF vom Rind 16 Aminosäuren unterschiedlich, 19 im β-NGF vom Huhn und 11 im menschlichen β-NGF, während es nur 6 unterschiedliche Aminosäuren zwischen dem β-NGF vom Rind und vom Menschen gibt. Sämtliche Cystein-Reste sind in allen Arten streng konserviert. Die Reduktion der drei S-S-Brücken von β-NGF verursacht den vollständigen Verlust seiner biologische Aktivität. Die apparente Diskrepanz zwischen dem hohen Grad an umfassender Konservierung der Aminosäuren-Sequenzen und die niedrige Kreuzreaktivität des immunchemischen Typs beruhen auf der Tatsache, dass die Unterschiede der Aminosäuren zwischen den Arten in spezifischen "Clustern" lokalisiert sind. Durch Hydropathieanalyse Äst es möglich zu zeigen, dass diese Veränderungen nahezu vollständig an hydrophilen Stellen auftreten, welche als potenzielle antigene Determinanten angesehen werden. Für alle Arten, welche bisher untersucht wurden, wurde nur eine hydrophile Region gefunden, welche in den NGF-Molekülen streng konserviert ist.

B. Rekombinante DNA-Technologie

Rekombinante DNA-Technologie macht es mögliche Vektor- Serien zu konstruieren, die in der Lage sind, ein Protein von Interesse in großen Mengen zu exprimieren. Diese Technologie ermöglicht den Molekularbiologen, DNA-Sequenzen zu verknüpfen, um Hybrid-Moleküle zu erzeugen, welche in der Lage sind, das interessierende Protein herzustellen. Die Verfahren verwenden verschiedene Reaktionen wie Spalten mit Restriktionsenzymen, das Verbinden der so erhaltenen Fragmente mit Ligase, chemische Synthese von zu verknüpfenden Oligonucleotiden und andere erhältliche Verfahren aus verschiedenen Laboratorien auf diesem Sektor (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Laboratory NY, 1982). Um hohe Raten an Expression zu erhalten, müssen die zu verknüpfenden DNA-Elemente notwendige Informationen aufzeigen. Zum Beispiel einen Replikationsursprung, eine Selektion für Antibiotika, einen Expressions- Promotor, Transkriptions-Aktivatoren des interessierenden Gens und andere Eigenschaften, welche dem Züchter dieses Materials bekannt sind. Die Kombination dieser Elemente in geeigneter Weise ergibt ein Plasmid, wenn das interessierende Gen auf natürliche Art und Weise hinsichtlich der regulatorischen Sequenzen der Transkription und Translation eingebaut wird, wobei das resultierende Plasmid durch Expression definiert wird. Damit ist das Plasmid oder der Expressionsvektor in der Lage, das Protein in Wirtszellen zu exprimieren. Das Protein kann unter Verwendung eines Aufreinigungssystems erhalten werden. Die Elemente (Promotoren), welche natürlicherweise die Expression zahlreicher Gene kontrollieren, wie zum Beispiel Wachstumsfaktoren, sind nicht sehr stark in ihrer Expression und werden nur unter natürlichen, geeigneten Bedingungen aktiviert, welche häufig nicht bekannt sind. Zu diesem Zweck werden Promotoren verwendet, deren Aktivität bekannt ist, zum Beispiel ein Virus aus der Papovaviren-Serie oder andere bekannte verstärkende Gen-Sequenzen. Die Elemente, welche zur Expression in hohen Raten verwendet werden, sind deshalb eine Kombination von DNA verschiedenen Ursprungs (eukaryontisch, bakteriell, viral etc.), welche am Ende verschiedener, zur Bildung eines Hybrids verbundener Bereiche von Genen angebracht werden. Die Transkriptions- und Translations- Aktivität eines Gens hängt von den geeigneten Abständen zwischen regulatorischen und codierenden Sequenzen ab.
Nachdem diese Einführung durchgeführt wurde, ist einer der besten Wege für ein geeignetes Funktionieren der regulatorischen Sequenzen derjenige, bei welchem das eingebrachte Gen an die gleiche Stelle wie das natürliche Gen platziert wird. Ein System, welches verwendet wird, ist dasjenige, in welchem die regulatorischen Sequenzen auch einige Aminosäuren der codierenden Sequenzen umfassen. Die Vereinigung mit dem eingebrachten Gen resultiert dann in einem Fusionsprotein. Wenn andererseits der fusionierte Bereich entfernt wird, ist es möglich, höhere biologische Werte zu erhalten. Falls das Verfahren der Fusionsproteine nicht verwendet wird, hängen die herkömmlichen Technologien zum Erhalt der Gene, welche in unmittelbarer Nachbarschaft der regulatorischen Sequenzen lokalisiert sind, von der Existenz geeigneter Restriktionsschnittstellen ab, die deren Clonierung zu erlauben. Wenn kompatible Stellen in der unmittelbaren Nachbarschaft nicht existieren, jedoch an davon verschiedenen Stellen, ist es möglich, mit der Synthese eines Oligonucleotids oder Linkers, welches oder welcher die gewünschte Restriktionsstelle enthält, die Vereinigung der Segmente zu erhalten. Falls in der unmittelbaren Nachbarschaft keiner Restriktionsschnittstellen existieren, welche die Verwendung des Linkers erlauben, dann wird die Deletionstechnik für die DNA mit Bal 31 oder S1 verwendet. Diese Möglichkeit erlaubt keine genaue Deletion, und es ist jedes Mal erforderlich, die verschiedenen Clone durch Sequenzierung zu überprüfen, um zu sehen, welcher der am besten geeignete ist. Diese Systeme sind für den Molekularbiologen in hohem Maße einschränkend, und als Folge davon ist es notwendig, alternative Strategien mit dem Aufkommen neuer Technologien zu entwickeln, wie diejenige der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (Saiki et al., Science 239: 487, 1988; Scharf, S. J., Science 233: 1076, 1986).
Mit dieser Technik ist es möglich, ein Gen-Segment bis zu dem Faktor 106 zu amplifizieren. Das Prinzip basiert auf der Verwendung von zwei Oligonucleotiden, welche gepaart werden können, bzw. jeder auf einem der beiden zu amplifizierenden DNA-Stränge. Der Abstand, der hinsichtlich der getesteten Gensequenz zwischen den beiden Oligonucleotiden liegt, ergibt die Dimensionen des herzustellenden Moleküls. Diese beiden Oligonucleotide sind so entworfen worden, dass innerhalb ihrer Sequenz eine Restriktionsschnittstelle vorliegt, welche ihre nachfolgende Clonierung erlaubt. Diese Restriktionsschnittstelle ist natürlicherweise anwesend oder wird ad hoc durch Degeneration der minimalen Anzahl von Basen entworfen. Dieser Ansatz, welcher als ortsgerichtete Mutagenese definiert werden kann, macht es möglich, Restriktionsschnittstellen an Positionen zu entwerfen, welche durch den Molekularbiologen theoretisch bestimmt werden. Die Konstruktion von Schnittstellen, welche mit anderen Gen-Segmenten kompatibel sind, erlaubt einerseits die leichte Clonierung, eröffnet aber insbesondere die Möglichkeit, unterschiedliche Gen-Segmente auf zielgerichtete Art und Weise miteinander zu vereinen. Diese Technik kann als Clonierung durch direkte Mutagenese definiert werden. In der Praxis ist es durch rekombinante DNA- Technologie möglich, vollständig heterologe Polypeptide durch direkte Expression zu exprimieren, oder alternativ können die heterologen Polypeptide, mit einem Teil einer Aminosäuresequenz eines ähnlichen Polypeptids fusioniert, exprimiert werden. Im Allgemeinen sind Produkte, welche auf diese Art und Weise erhalten wurden, licht biologisch aktiv (Britische Patentanmeldung Veröffentlichungs-Nr. 2007676A; Wenzel, American Scientist 68, 664, 1980).
Die Fähigkeit, das menschliche Gen der β-Untereinheit des Nerven-Wachstumsfaktors zu isolieren, eröffnet uns eine wichtige Möglichkeit. Es ist möglich, durch rekombinante DNA- Technologie eine ausreichende Menge dieses seltenen Proteins herzustellen. Tatsächlich kann das Nerven-Wachstumsfaktor- Protein zur klinischen Verwendung bei der Behandlung verschiedener neurodegenerativer Erkrankungen zugelassen werden. In dieser Hinsicht ist der Erhalt der β-Untereinheit von NGF durch rekombinante DNA-Technologie dokumentiert (Europäische Patent Veröffentlichungs-Nr. 0121388; Bruce, G. et al., Neurobiology of Aging 10: 89, 1989; Hu, G. et al., Nucleic Acids Research 70: 57, 1988; Edwards, R. H., Mol. Cell. Biol. 8: 2456, 1988; Emfors, P., Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 4756, 1989). Für die Herstellung werden nur in denjenigen Fällen Säugerzellen anstelle von Bakterien ausgewählt, in welchen eine weniger kostspielige Expression in mikrobiellen Zellen nicht möglich ist. Tatsächlich ist es viel wirtschaftlicher, bestimmte Proteine in bakteriellen Linien wie E. coli herzustellen, doch dieses Wirt/Vektor-System reproduziert im Allgemeinen nur die lineare Sequenz der Aminosäuren genau, welche das Protein ausmachen, wobei eine Art unlösliche Masse in dem Bakterium erhalten wird. Nimmt man an, dass ein vorgegebenes Produkt in einer wirtschaftlich vorteilhaften Art aus diesem Material hergestellt werden kann, könnte E. coli das System der Wahl sein, wie im Falle von bestimmten kleineren Molekülen wie Interferone und einige tierische Wachstums-Proteine, bei denen eine korrekte Faltung des Moleküls in vitro möglich ist. Diese Systeme sind am produktivsten in den Fällen, die im Allgemeinen diejenigen Proteine mit einer einzelnen Disulfidbrücke betreffen, und bei Peptiden oder Protein, deren/dessen Verwendung (als diagnostisches Antigen oder als Impfstoff-Komponente) keine gut definierte Konformation erfordert.
Therapeutische Proteine, zu welchen der Nerven-Wachstumsfaktor (β-NGF) gehört, benötigen eine korrekte Konformation, um aktiv und verwendbar zu sein, und es ist ebenfalls erforderlich, dass sie frei von einer Antigen-Antwort sind. Der Herstellungsprozess für das anhand der rekombinanten DNA erhaltene Protein könnte Glycosylierung, die Ausbildung von korrekten Disulfid-Brücken und andere Post-Transduktions- Modifikationen umfassen. Die bakterielle Linie E. coli ist nicht in der Lage, dieses Erfordernis zu gewährleisten, während eukaryontische Säugerzellen und Hefen dazu in der Lage sind. Die potenzielle Anwendung von menschlichem β-NGF als ein pharmazeutisches Mittel, welches durch Biotechnologie erhalten wurde, sollte diese Probleme berücksichtigen.
Es ist gezeigt worden, dass die Aktivität des NGF von der dimeren Form abhängt, d. h. vom Zusammenbau zweier ähnlicher Polypeptide aus 118 Aminosäuren. Die Reduktion mit Mercaptoethanol lässt die biologische Aktivität nahezu auf Null abfallen. Renaturierungsversuche von drei Disulfid- Brücken, um eine Reassoziation des Cysteins zu gewährleisten, ergeben statistisch gesehen mit einer Wahrscheinlichkeit von 1 aus 15 ein Molekül mit korrekter Struktur, das gleich demjenigen ist, welches dem natürlichen entspricht. Als Folge davon garantiert der Erhalt des Moleküls in E. coli nicht die Homologie der Struktur und seine Anwendung als pharmazeutisches Mittel im Menschen. Nachdem der menschliche NGF, welcher in E. coli hergestellt wurde, bis zur Homogenität aufgereinigt wurde, zeigt er im Immunblot mit polyclonalen Antikörpern, welche spezifisch für den murinen β-NGF sind, tatsächlich eine Serie von Banden, welche nicht der biologisch aktiven dimeren Form zugeordnet werden können. Darüber hinaus ist gezeigt worden, dass die biologische Aktivität dieses Gemischs von Strukturen und Formen im Vergleich zu der ähnlichen menschlichen Form, welche aus natürlichen Quellen aufgereinigt wurde, wie aus Placenta-Gewebe, zehn Mal schwächer ist.
Dieser Ansatz, den Nerven-Wachstumsfaktor in E. coli zu clonieren und zu erhalten, wenn dadurch einerseits hohe Expressionsraten des interessierenden Proteins erzeugt würden, produziert eine Reihe von ungenauen Molekülen, welche nach Verabreichung in vivo sekundäre Effekte verursachen könnten, zum Beispiel Antikörper, welche die biologische Aktivität des natürlicherweise anwesenden Moleküls erkennen und blockieren würden. Gleichzeitig zeigt die Clonierung des reifen Moleküls in E. coli ein nicht zu beseitigendes initiales Methionin, welches sicherlich immunogen ist, weil es an einem ungeschützten Teil des Moleküls platziert ist.
Ein anderer Ansatz betrifft das Clonieren des Präpro-NGF in eukaryontischen Zellen und besteht in der vorteilhaften Beanspruchung des Angriffs der spezifischen Peptidasen, welche natürlicherweise in den eukaryontischen Zellen anwesend sind, um das reife Molekül zu erhalten. Insbesondere wird die Clonierung mit Zellen aus dem Ovar des chinesischen Hamsters (CHO) durchgeführt. Gemäß der aktuellen Literatur ist die vollständige genomische Clonierung des menschlichen NGF nicht sequenziert worden, es ist aber gezeigt worden, dass das Gen auf mehr als 10 kDa ausgedehnt ist (Ullrich, A. et al., Nature 303: 821, 1983). Das Gen, welches derart ausgedehnt ist, erlaubt keine herkömmliche Clonierung, welche von dieser gesamten genomischen Sequenz ausgeht. Der Ansatz ist der einer Clonierung eines Teils der cDNA, welche nur die codierenden Bereiche des Proteins enthält. Zur Zeit ist die vollständige cDNA für menschlichen NGF noch nicht isoliert (einige Sequenzen an der 5'-Position fehlen); es ist jedoch viel Information von den NGF-Boten anderen Ursprungs bekannt (Maus, Rind, Huhn etc.) (Meier, R. et al., EMBO J. 51489, 1986; Selby, H. J., J. of Neuron Research 18: 293, 1987), welche zu interessanten Herleitungen führen kann. Das Maus-NGF-Gen liegt in einer einzigen Kopie vor und produziert mindestens vier unterschiedliche Boten von unterschiedlichen Dimensionen (Selby, M. J. et al., Mol. Cell. Biol. 7: 3057, 1987). Diese unterschiedlichen Dimensionen spiegeln sich im Speziellen in den unterschiedlichen Start-AUG-Codons wider, wobei die wichtigsten an den Positionen -187 und -121 hinsichtlich des reifen Proteins liegen. Diese Boten sind im Hinblick auf verschiedene Gewebe in unterschiedlicher relativer Abundanz anwesend. Diejenigen, welche bei -187 beginnen, liegen in der Unterkiefer-Speicheldrüse 10 Mal häufiger vor im Vergleich mit denjenigen, die bei -121 beginnen. Unterschiedliche Hinweise haben jedoch gezeigt, dass die beständigste Prozentzahl an NGF-Boten, welche im Gehirn exprimiert werden, genau das AUG an Position -121 verwenden.
Die vorliegende Erfindung betrifft deshalb einen replizierbaren Expressionsvektor, der menschlichen β-NGF codiert, zur Expression in geeigneten Säugerzellen, die mit dem Vektor transformiert sind, wobei der Vektor (α) eine erste DNA-Sequenz, die die Aminosäure-Sequenz des menschlichen β-NGF von Position +1 bis +118 codiert; (b) eine zweite DNA-Sequenz, die die Präpro-Aminosäure-Sequenz von menschlichem β-NGF von Position -121 bis -1 codiert, welche an das 5'-Ende der ersten DNA-Sequenz fusioniert ist; und (c) ein regulatorisches Promotor-Enhancer-Element, das direkt an das 5-Ende der zweiten DNA-Sequenz fusioniert ist, umfasst, was ermöglicht, die reife Form der β-Untereinheit von menschlichem Nerven- Wachstumsfaktor (hβ-NGF) in Abwesenheit von einer oder mehreren Aminosäuren, welche an das Polypeptid fusioniert sind und unterschiedlich zu denjenigen sind, die in seiner natürlichen Sequenz vorliegen, aus dem Kulturmedium zu erhalten. Das somit erhaltene Polypeptid zeigt biologische Aktivität, welche für geeignete Zielzellen verwendet werden kann.
Das hβ-NGF, welches in dieser Erfindung beschrieben ist, kann für die Erhaltung oder das Verhindern des Verlusts der Nervenfunktion, für deren Wiederherstellung in pathologischen Zuständen vom chronischen oder akuten Typ, in neurodegenerativen Situationen, sogar in verspäteten Phasen von akuten Pathologien, wie Schäden der Hirngefäße, infektiöse, entzündliche, zusammenpressende, metabolische Schädigungen und bei Zuständen der Modulation des Immunsystems verwendet werden. Das erhaltene Polypeptid wird weiter ohne kontaminierende Proteine menschlichen Ursprungs erhalten, welche eine ungewünschte biologische Aktivität zeigen könnten.
Die Erfindung ist weiterhin auf genetische Konstruktionen ausgerichtet, welche für Zell-Transfektionen, einschließlich denjenigen, welche in vivo implantiert werden können, verwendet werden können. Einige dieser Konstruktionen können im lokalen Bereich spezifisch die aktive Form des menschlichen Wachstumsfaktors als Folge einer verabreichten Diät produzieren, d. h. es ist möglich, das Gen unter Kontrolle zu halten.
Die Erfindung ist weiter auf die transformierte Zelllinie ausgerichtet, welche diese Vektoren enthält, und auf deren Züchtung, durch welche das hβ-NGF hergestellt wird.
Fig. 1 ist ein Hydropathieprofil der β-Untereinheit des Polypeptids vom Nerven-Wachstumsfaktor menschlichen Ursprungs.
Fig. 2 ist eine Darstellung der Konstruktion des pMSGphNGF-Expressionsvektors in Diagramm-Form.
Fig. 3 ist eine Darstellung des pMSGphNGF- Expressionsvektors in Diagramm-Form.
Fig. 4 ist eine Darstellung der Konstruktion des pSV40MT phNGF-Expressionsvektors in Diagramm-Form.
Fig. 5 ist eine Darstellung des pSV40MTphNGF- Expressionsvektors in Diagramm-Form.
Fig. 6 ist eine Darstellung der Konstruktion des pSV40phNGF-Expressionsvektors in Diagramm-Form.
Fig. 7 ist eine Darstellung des pSV40phNGF- Expressionsvektors in Diagramm-Form.
Fig. 8 ist eine Darstellung der Konstruktion des pSV40hNGF-Expressionsvektors in Diagramm-Form.
Ausgehend von diesen Hinweisen wurde der erfindungsgemäße menschliche β-NGF cloniert, welcher genau mit dem Methionin an Position -121 beginnt. Analysen des Hydropathie-Profils zeigten, dass die Aminosäuren zwischen -121 und -104 als Leader-Peptid wirken können, was zeigt, dass dieses Protein sekretiert werden kann. Dieses Profil ist in Fig. 1 gezeigt und ist das Hydropathie-Profil der Untereinheit des Polypeptids vom Nerven-Wachstumsfaktor menschlichen Ursprungs gemäß dem beschriebenen Verfahren (Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 3824, 1981). Die Position, welche als -121/- 104 angegeben ist, identifiziert das Leader-Peptid, während die Position, welche als +1/+118 angegeben ist, die Aminosäure-Sequenz der β-Untereinheit des Polypeptids vom Nerven-Wachstumsfaktor menschlichen Ursprungs angibt (Ullrich et al., Nature 303: 821, 1983). Um das reife Protein zu erhalten, gibt es eine spezifische Peptidase, welche es möglich macht, die Aminosäure-Sequenz von +1 und bei +118 zu erhalten, welche dem biologisch aktiven Peptid entspricht. Es wurde gezeigt, dass diese Peptidase, welche in den Zellen enthalten ist, die normalerweise NGF synthetisieren, auch in den AT-20-Zellen enthalten ist. Durch Einbringen eines Vektors in diese Zellen, welcher aus einem Vacciniavirus-Präpro-NGF von murinem Ursprung besteht, sind diese wirklich in der Lage, reifen NGF zu sekretieren, was die Herstellung eines Moleküls von 14 kDa im Gel unter denaturierenden und reduzierenden Bedingungen ermöglicht (Edwards, R. H., Mol. Cell. Biol. 8: 2456, 1988).
Als Folge der vorausgehenden Erfahrungen, um die β- Untereinheit des Nerven-Wachstumsfaktors, wie vorstehend beschrieben, zu erhalten, verglichen die Erfinder der vorliegenden Erfindung auf innovative Art und Weise die Herstellung von einem oder mehreren Vektoren, welche in eukaryontischen Zellen verwendet werden können. Die PCR- Technik wurde verwendet, um das Clonieren des Präpro-NGF durchzuführen, womit Stellen geschaffen wurden, welche mit verschiedenen Expressionsvektoren kompatibel sind, und diese Restriktionsschnittstellen wurden so lokalisiert, dass die Abstände zwischen den regulatorischen Sequenzen und den codierenden Sequenzen so natürlich wie möglich erhalten blieben, eine Situation, welche sich von den genetischen Konstruktionen, welche zuvor zur Expression der β-NGF- Untereinheit in der Literatur beschrieben wurden, ziemlich stark unterscheidet. Der Teil des Präpro-NGF wurde mit einer modifizierten Sequenz vom reifen menschlichen NGF (hβ-NGF) verknüpft, welche von British Technology Ltd. (Oxford, Great Britain) erworben wurde und in welchen Restriktionsschnittstellen geschaffen wurden, um die nachfolgende Mutagenese zu gewähren. Die Anwesenheit dieser Restriktionsschnittstellen sollte für die Zwecke der Erfindung nicht als eingrenzend angesehen werden, geradeso wie der Ursprung des Gens nicht als einschränkend angesehen werden sollte.
Ausgehend von dieser Voraussetzung clonierten die Erfinder der vorliegenden Erfindung dann den Präpro-hβ-NGF unter der Kontrolle von verschiedenen Promotoren wie SV40 (Affenvirus 40), MMTV (Mouse Mammary Tumor Virus), hMTIIa (human metallothionein IIa). Diese genetischen Sequenzen, die in die Plasmide eingebracht wurden, wurden dann in CHO-Zellen transfiziert, um zu zeigen, dass gerade diese Zellen in der Lage sind, das h-NGF-Polypeptid in seiner biologisch aktiven Form in dem Kulturmedium herzustellen. Dieser Präpro-NGF hatte sich für den Zusammenbau des Moleküls als notwendig herausgestellt, was die ausschließliche Expression der β- Untereinheit ermöglicht und was zeigt, dass die gesamte genetische Konstruktion als richtig angesehen werden konnte.

A. Angewandte allgemeine Verfahren:

Die Angriffe auf die DNA-Ketten mit Restriktionsenzymen werden gemäß den Beschreibungen der herstellenden Firmen durchgeführt. Im Allgemeinen wird 1 ug des Plasmids mit 1 U Enzym in 20 ul Lösung gespalten; die Temperatur und Inkubationszeit hängen von dem verwendeten. Enzym ab, im Allgemeinen 1 Stunde bei 37ºC. Nach der Inkubation werden das Plasmid und die genetischen Segmente in einem Agarosegel aus LMP-Agarose (BRL, United States of America) in 40 mM Tris/HCl, 20 mM Natriumacetat, 1 mM EDTA aufgereinigt und dann mit dem Kit GENECLEANTM (BIO 101 Inc., La Jolla, CA, USA) aus der Agarose eluiert. Für die Vervielfältigunsreaktionen am 5'-Ende wird die DNA für 15 Minuten bei 15ºC mit 10 U Polymerase (Klenow) behandelt. Als Ligasen wird die T4-Ligase in einer Konzentration von 1 U pro 0,5 ug DNA in einer Reaktion von 20 ul bei 13ºC für 12 Stunden verwendet.
Analysen, um die richtigen Sequenzen in dem Plasmid zu bestätigen, werden durchgeführt, indem HB101-Zellen transformiert werden und die ausgewählten Transformanten auf Agarose-Platten in LB (Luria Bertani)-Nedium mit 50 ug/ml Ampicillin-Antibiotikum gezüchtet werden. Das Plasmid, welches im HB101 enthalten ist, wird in LB, 100 ug/ml Ampicillin vermehrt und aufgereinigt, entweder für kleine oder große Präparationen mit dem Kit von Qiagen (QIAGEN GmbH, Düsseldorf, Bundesrepublik Deutschland). Die Expressionsvektoren werden nach dem Qiagen-Verfahren aus Bakterienzellen hergestellt.
Die DNA für PCR-Reaktionen wird zum geeigneten Zeitpunkt auf die folgende Art und Weise aus menschlicher Plazenta hergestellt. Ein Stück Chorion-Zotten von 0,4 cm³ wird mit einer Schere kleingeschnitten und in 700 ul 50 mM Tris/HCl pH 7,8, 100 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% SDS suspendiert. Dazu werden dann 35 ul Proteinase (K, 100 ug/ml) zugegeben und über Nacht bei 55ºC inkubiert. Dann werden zu 20 ul einer Lösung 13 ug/ml RNase A zugegeben und für weitere 2 Stunden inkubiert. Es werden zwei Extraktionen mit Phenol und zwei mit Chloroform durchgeführt. Die DNA wird dann an einer Glas- Kapillare durch Zugabe von 1 Volumen Isopropabol zum Ausfällen gebracht. An diesem Punkt werden einige Durchgänge mit 70% und 100% Ethanol durchgeführt, und dann wird getrocknet. Die DNA wird in einem Puffer (10 mM Tris/HCl pH 7,4, 1 mM EDTA) gelöst, wobei sie unter leichtem Schütteln in einem Teströhrchen verbleibt. Nach einigen Stunden ist die gelöste DNA zur genetischen Amplifikation bereit. Normalerweise sind 0,1 ug DNA ausreichend, um mit der PCR fortzufahren.
Die Transfektion der CHO-Zellen (CCL 61) und der CHO- Zellen, welche durch die Abwesenheit des Dehydrofolat- Reduktase-Gens (DHFR-) modifiziert sind, werden mit Liposomen durchgeführt, indem man dem Verfahren der herstellenden Firma GIBCO folgt, oder mit Calciumphosphat.

A.2 Transfektion von Liposomen

Die Zellen, welche in alpha-MEM mit 5% fötalem Kälberserum gezüchtet wurden, werden am Tag vor der Transfektion trypsinisiert und neu ausplattiert, sodass sie am nächsten Tag eine Konfluenz von 70-80% erreichen würden. Die zu transfizierende Plasmid-DNA wird auf eine Konzentration von 10 ug DNA in 50 ul H&sub2;O verdünnt, zu welcher dann 50 ul LipofectinTM (GIBCO) zugegeben werden; das Ganze erfolgt in einem Polystyrol-Röhrchen. Nachdem man 15 Minuten gewartet hat, wird dieses Gemisch zu den Zellen zugegeben, welche zuvor mit dem Medium OPTI-MEM (GIBCO) gewaschen worden waren. Auf diese Art und Weise werden die Zellen für 8 Stunden inkubiert, und dann wurde das normale Medium, enthaltend fötales Kälberserum, zugegeben, um die Züchtung fortzufahren.

A.3 Verfahren zur Transfektion mit Calciumphosphat, um eine stabile Transformation zu erhalten.

Die Puffer für die Transfektion in diesem Verfahren sind: zweifach konzentriertes BBS (2 · BBS) und 0,25 M CaCl&sub2;. Das 2 · BBS wird wie folgt hergestellt: 50 mM N,N-Bis-2-(hydroxyethyl)-2-amino-ethansulfonsäure (Calbiochem); 280 mM NaCl und 1,5 mM Na&sub2;HPO&sub4; werden in Wasser gelöst und der pN-Wert wird auf 6,5 eingestellt und dann wird das Ganze bei 0,45 um filtriert, während 10 · CaCl&sub2; als Lösung von 2,5 M CaCl&sub2; hergestellt wird.
Die Zellen werden zu 5 · 10&sup5; Zellen pro 10 cm Platte pro 10 ml Wachstumsmedium ausgesät und über Nacht bei 35ºC inkubiert. 20 ug Plasmid werden mit 0,5 ul 0,25 M CaCl&sub2; und 0,5 ml 2 · BBS gemsicht, das Gemisch wird für 15 Minuten bei Umgebungstemperatur inkubiert. Das Gemisch wird dann in das Medium eingeträufelt und das Ganze wird über Nacht bei 35ºC in 3% CO&sub2; inkubiert. Um mit unseren Vektoren stabil transformierte Zellen zu erhalten, wird eine Kotransfektion durchgeführt, indem zu dem Vektor, welcher hβ-NGF exprimiert, der pSV2Neo-Vektor in einem Verhältnis von 10 zu 1 zugegeben wird. Zwei Tage nach der Transfektion werden die Zellen trypsinisiert und in einer 10-fach geringeren Konzentration im Vergleich mit der Transfektion auf Platten ausgesät, und sofort wird die Selektion der stabilen Transformationen mit 1 mg/ml G418 Neomycinsulfat (GIBCO) begonnen. Die Transformanten werden dann durch das Southern-Blotverfahren auf die Integration der genetischen Konstruktion analysiert.

A.4 Expression

Alle Medien der Zellen werden zur Expression in Ham F12/DME H-21 mit 15 mM Hepes und 10% fötalem Kälberserum gehalten. Das Medium wird alle drei Tage gewechselt und zur Aufreinigung des hβ-NGF gegen frisches Medium ohne Serum ausgetauscht.

B. Bevorzugte Ausführungsformen

B.1. Beschreibung der Konstruktion der Expressionsvektoren

Drei unterschiedliche Vektoren werden hergestellt; bei dem ersten und zweiten handelt es sich um zwei Vektoren, in welchen die regulatorischen Elemente, MMTV (Mouse Mammary Tumor Virus) bzw. hMTIIA (menschliches Metallothionein IIa), chemisch induziert werden können. Auf diese Art und Weise ist es möglich, das hβ-NGF-Gen kontrollierbar zu exprimieren. Im Gegensatz dazu ist der hβ-NGF in dem dritten Vektor unter der Kontrolle des SV40 (Affenvirus 40)-Promotors cloniert.

B.2. Clonierung in den pMSG-Expressionsvektor

Der pMSG-Vektor wurde von Pharmacia (Uppsala, Schweden) erworben. In Übereinstimmung mit den Beschreibungen der Firma muss das Gen, welches eingebracht werden soll, zwischen die Nhe I- und Sal I-Restriktionsschnittstellen in der multiplen Clonierungs-Stelle eingebaut werden. Das Gen wird von seinem ersten AUG translatiert; in diesem Falle ist der Nerven2 Wachstumsfaktor unter der Kontrolle des Promotors vom MMTVLTR (lange terminale Wiederholung des Mouse-Mammary-Tumor-Virus). Die Aktivität dieses Promotors kann durch Verabreichung von Glucocorticoiden, zum Beispiel Dexamethason, induziert werden. Bei der Transkription findet das Spleißen mit Hilfe des kleinen SV40-T-Antigens und die Polyadenylierung mit Hilfe des großen SV40-T-Antigens statt. Dieses Plasmid enthält auch das bakterielle Gen für Xarithin-guanin-phosphoribosyl-transferase (XGPT), welches verwendet wird, um die stabil transformierten CHO-KI-Zellen zu selektionieren.
Um eine Clonierung des Präpro-NGF in dieses Plasmid zu erlauben, wird die PCR-Technik verwendet, mit welcher eine Restriktionsschnittstelle unmittelbar vor dem initialen AUG geschaffen wird, um die Abstände zwischen den regulatorischen Sequenzen und den codierenden Sequenzen des Präpro-NGF so natürlich wie möglich zu erhalten. Es werden zwei Oligonucleotide synthetisiert: das erste zwischen den Basen 9122 und 9147 (Ullrich, A., Nature 303: 821, 1983) sollte die folgende Sequenz haben:
Die Basen vor dem initialen AUG sind, wie vorstehend bemerkt, mutiert, und dadurch hat das synthetisierte Oligo die folgende Sequenz:
Dieses Oligonucleotid wird (XbaI) genannt. Das zweite Oligonucleotid, welches die Basen zwischen 9521 und. 9342 umfasst (Ullrich, A., Nature 303: 821, 1983), ist komplementär zu dieser Sequenz, um die PCR zu erlauben, und hat die folgende Sequenz.
Dieses Oligonucleotid enthält in seiner Mitte die EcoRI- Stelle, um das Verbinden des Präpro-NGF mit dem reifen NGF zu erlauben. Dieses Oligonucleotid wurde (EcoRI) genannt.
Diese beiden Oligonucleotide werden mit einem Oligonucleotid-Syntheseautomaten gemäß dem Verfahren für Phosphoamidite durch Verwendung der Standard-Verfahren des 330B-DNA-Syntheseautomaten (Applied Biosystems, USA) in Festphase synthetisiert. Diese sind: (α) für 12 Stunden bei 55ºC in NH&sub3; behandelt; (b) in einer Vakuum-Zentrifuge zum Trocknen gebracht; (c) in 2,5 M Ammoniumacetat resuspendiert; (d) mit 3 Volumina kaltem Ethanol (-20ºC) ausgefällt; und (e) erneut mit 80% kaltem Ethanol gewaschen und in Wasser resuspendiert. Die Konzentration der beiden Oligonucleotide wird mit einem Spektralphotometer bestimmt. Das Amplifikations-Verfahren wird mit einem Perkin Elmer Cetus-DNA Termal Cycler-Amplifikationsautomaten durchgeführt, und die für die Amplifikation verwendeten Reagenzien sind diejenigen des dazu gehörigen DNATM-Amplifyer-Kits (Perkin Elmer-Cetus). Kurz gesagt wird ein Gemisch jedes Oligonucleotids in einer Konzentration von 200 pH, je 0,5 uM dATP, dTTP, dCTP, dGTP- Nucleotid und 0,4 ug menschlicher DNA und Reaktionspuffer in einem Gesamtansatz von 100 ul mit 0,5 U TAQ-Polymerase verwendet, wobei das Ganze mit Paraffinöl bedeckt wird, um die Verdunstung zu verhindern. Die Amplifikationsreaktion wird durchgeführt, indem das Instrument im Falle von menschlicher DNA für 35 Zyklen betrieben wird. In beiden Fällen ist der Zyklus folgender: 1 Minute bei 94ºC, 2 Minuten bei 45ºC, 3 Minuten bei 72ºC. Das amplifizierte Fragment von 300 bp wurde in einem niedrig schmelzenden Agarose (NuSieve)-Gel gereinigt, indem der GENECLEANTM-Kit (BIO 101 Inc., La Jolla, CA, USA) verwendet wurde, um die Agarose aufzulösen. Die DNA wird mit XbaI und EcoRI-Restriktionsenzymen gespalten und nochmals wie vorstehend aufgereinigt. Das derart aufgereinigte Fragment wird in die XbaI- und EcoRI-Stellen des pGEM4-Vektors (Promega) cloniert. Das erhaltene Plasmid wird pGEM4Xba-NGF genannt.
Dieses Plasmid (pGEM4Xba-NGF) wird an den HindIII-EcoRI- Stellen gespalten, und das Fragment von 300 bp wird, nachdem es aufgereinigt wurde, in die HindIII-EcoRI-Stellen des pUC18BBG26-Vektors (British Biotechnology Ltd. Oxford, UK) cloniert. Der pUC18BBG26 enthält das Gen des aus Kassetten konstruierten hβ-NGF, d. h.. innerhalb seiner Sequenz sind Restriktionsschnittstellen geschaffen worden, welche nicht natürlich sind und welche deshalb die Substitution bestimmter Domänen ermöglichen, d. h. in anderen Worten, sie erlauben Mutagenese. Der erhaltene. Vektor wird pUC18hNGFC genannt. Dieser Vektor wird mit BamHI gespalten und die Verlängerung an der 5'-Seite mit Klenow-Polymerase kopiert. Es wird an der XbaI-Stelle gespalten, und das Fragment von 760 bp wird mit einem Agarose-Gel aufgereinigt. Dieses Fragment wird zwischen die NheI- und SmaI-Stellen des pMSG-Expressionsvektors cloniert. Das zusammenfassende Diagramm für den Erhalt dieses Vektors, welcher pMSGphNGF genannt wird, ist in Fig. 2 dargestellt, während die Darstellung in Diagramm-Form des gleichen Vektors in Fig. 3 angegeben ist.

B.3. Clonierung von NGF unter die Kontrolle von Metallothionein

Dieser Vektor wurde hergestellt, da Metallothionein IIa (MTIIa) mit Zn&spplus;&spplus; oder mit Cd&spplus;&spplus; oder mit anderen Schwermetallionen induziert werden kann; deshalb kann seine Expression kontrolliert werden. Darüber hinaus wird an dem 5'- Ende des Promotors von MTIIa der SV40-Enhancer angefügt, um die Expression dieses Promotors zu potenzieren, während das kleine T-Antigen und die Poly A-Stelle des SV40 jedes Mal für das Spleißen und die Polyadenylierung verwendet werden. Zuerst wird der Promotor des Metallothionein mit dem Präpro hβ-NGF wie folgt verbunden: der Promotor des Metallothionein wird aus dem Plasmid (phMTIIa) isoliert, indem dieses mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI gespalten wird (Karin, H., Nature 299: 797, 1982), das Fragment von 841 bp, welches den Promotor umfasst, wird in die HindIII-BamHI-Stellen des pGEM4-Vektors (Promega Madison, WI, USA) cloniert. Dieser Vektor wird pGEM4hMTIIa genannt. Dieser Promotorbereich ist am 3'-Ende mit einigen natürlichen Codons verlängert, enthält das erste Codon das AUG-Methionin und unmittelbar danach wird die BamHI-Restriktionsschnittstelle gefunden. Um die Clonierung des Präpro-hβ-NGF unter diesem Promotor zu erlauben, wobei das initiale Methionin des Promotors von hMTIIa verwendet wird, wird ein Oligonucleotid zwischen den Basen 9133 und 9160 konstruiert (Ullrich, A., Nature 303: 821, 1983), wobei eine BamHI-Restriktionsschnittstelle unmittelbar nach dem initialen AUG geschaffen wird, welche erlaubt, das Gen in Phase zu bringen. Das synthetisierte Oligonucleotid, welches die nachfolgende Sequenz hat
wird in die folgende Sequenz mutiert:
Dieses Oligonucleotid wird BamHI genannt. Die ausgetauschten Basen umfassen auch eine Veränderung der Aminosäure-Sequenz; tatsächlich verändern sich die zweite und dritte Aminosäure von Ser zu Asp bzw. von Met zu Pro. Diese Veränderung hat jedoch keinen großen Einfluss auf das Hydropathie-Profil, und das Molekül wird normal sekretiert.
Dieses Oligonucleotid wird zusammen mit dem EcoRI- Oligonucleotid verwendet, um das Präpro-NGF wie vorstehend zu amplifizieren. Das gereinigte Fragment wird an den BamHI- und EcoRI-Stellen gespalten und dann zwischen die BamHI- und EcoRI-Restriktionsschnittstellen des pGEM4hMTIIa-Vektors cloniert. Der Vektor wird pGhMTphNGF genannt.
Um den Enhancer (Aktivator) von SV40 zu erhalten, wird letzteres aus dem pMSGphNGF-Plasmid wie folgt entnommen: der pMSGphNGF-Vektor wird mit BamHI gespalten und dann die Verlängerung an der 5'-Seite mit Klenow-Polymerase kopiert. Dann wird es mit HindIII gespalten, und das Fragment von 500 bp wird zwischen die NaeI- und HindIII- Restriktionsschnittstellen des pGEM3 cloniert. Der erhaltene Vektor wurde pGSV40 genannt.
Um den Expressionsvektor zu erhalten, werden die vorstehend erwähnten Teile in einer Dreifach-Vereinigung von Fragmenten wie folgt verbunden: der pMSGphKGF-Vektor wird mit EcoRI- und. BamHI-Restriktionsenzymen gespalten, und das Fragment von 1500 bp wird aufgereinigt. Der pGhHTphNGF-Vektor wird mit den HindIII-EcoRI-Enzymen gespalten, und das Fragment von 1100 bp wird aufgereinigt. Diese beiden Fragmente werden zusammen in den pGSV40-Vektor zwischen die HindIII und BamHI- Restriktionsschnittstellen cloniert. Das zusammenfassende Diagramm zum Erhalt dieses Expressionsvektors, welcher pSV40MTphNGF genannt wird, ist in Fig. 4 dargestellt, während die Darstellung in Diagramm-Form des gleichen Vektors in Fig. 5 angegeben ist.
Dieser Vektor pSV40MTphNGF wird als eine Doppel- Transfektion zusammen mit dem pSV2Neo-Plasmid in die CHO-KI- Zellen eingebracht und wie vorstehend durch 1 mg/ml Neomycin G418 (GIBCO, BRL) selektioniert. Dieses Plasmid wird mit dem phMT-Plasmid cotransfiziert, um eine Selektion von Kolonien zu erhalten, welche eine hohe Anzahl von Kopien enthalten. In diesem Fall werden die CHO-KI-Zellen für 24 Stunden mit 50 mM Zinksulfat versetzt, um die Synthese von Metallothionein zu induzieren, und mit Cadmiumchlorid selektioniert, wobei mit einer Konzentration von 2,5 uM bis 20 uM begonnen wird. Diejenigen Zellen, welche eine hohe Anzahl von Kopien des hNGF haben, werden für die Expression des Moleküls verwendet.

B.4. Clonierung von NGF unter dem Promotor-Enhancer von SV40

Das pGEM4XbaNF-Plasmid wird mit HindIII- und EcoRI- Restriktionsenzymen gespalten, und das Fragment von 300 bp wird in den pSV40MTphNGF-Vektor zwischen die HindIII- und EcoRI-Restriktionsschnittstellen substituiert. Das zusammenfassende Diagramm zum Erhalt dieses Vektors, welcher pSV40phNGF genannt wird, ist in Fig. 6 dargestellt, während die Darstellung in Diagramm-Form des gleichen Vektors in Fig. 7 angegeben ist.
Dies ist ein konstitutiver Standardvektor, in welchem die regulatorischen Sequenzen dem SV40-Promotor/Enhancer zugeordnet werden. Dieser Vektor wird mit dem pSV2Neo-Plasmid stabil in die CHO-Kl-Zellen cotransfiziert, und die Clone, welche das β-Polypeptid des Nerven-Wachstumsfaktors herstellen, werden analysiert.

Selektion in den CHO-KI-DHFR-Zellen

Um die Gen-Amplifikation des vorstehenden Vektors in den CHO-KI-DHFR-Zellen zu erhalten, wird der Vektor nachfolgend modifiziert, indem das Gen für DHFR+ stromaufwärts vom Gen für MNGF cloniert wird. Der pSV2dhfr-Vektor, welcher DHFR+ codiert, wurde an der HindIII-Stelle gespalten und dann die Verlängerung an der 5'-Seite mit Polymerase kopiert. Dann wird er an der BamHI-Stelle gespalten, und das Fragment von 1800 bp wird in die XhoI-Restriktionsschnittstelle, welche wie vorstehend mit Polymerase mit glatten Enden versehen wurde, und die BamHI-Stelle im pSV40hNGF-Vektor cloniert. Auf diese Art und Weise wird das pSV40hNGF-Expressions-Selektions- Plasmid geschaffen. Das zusammenfassende Diagramm für den Erhalt dieses Vektors ist in Fig. 8 dargestellt.
Dieses Plasmid wird normalerweise in einem alpha-MEM- Medium ohne Nucleoside mit 10% fötalem Serum der Kuh in CHO- KI-Zellen transfiziert. Nach zwei Tagen werden die Zellen trypsinisiert und auf 1/10 der vorherigen Konzentration gebracht, und die Amplifikation wird mit 10 uM bis zu 500 uM MTX (Methrotrexat) begonnen. Diejenigen Zellen, welche die höchsten Konzentrationen von MTX überlebten, werden für die Expression von hNGF verwendet.

Bestimmung von biologischer Aktivität

In vitro-Studien zur Bestimmung der biologischen Aktivität in dem Kulturmedium von der CHO-Zelllinie nach Insertion von einem der drei Vektoren, welche vorstehend beschrieben wurden, werden nach ihrer Stabilisation in chromaffinen fötalen Zellen, PC-12, (Green L. A, et al., Rev. Neurosci. 3: 353, 1982) durchgeführt. Die Spezifität der Reaktion wird unter Verwendung eines Kulturmediums, in welchem die nichttransformierten CHO-Linien wachsen, oder - durch Blockade der Aktivität des hβ-NGF mit polyclonalen Antikörpern, welche für den NGF murinen Ursprungs oder vom Rind abstammen spezifisch sind, in dem Kulturmedium überprüft. Die drei Zelllinien, welche mit den einzelnen, vorstehend beschriebenen Vektoren transformiert und stabilisiert wurden, stellen die β- Untereinheit des menschlichen NGF in biologisch aktiver Form her.

Arzneimittel

Der erfindungsgemäße hβ-NGF kann gemäß bekannten Verfahren formuliert werden, um zweckmäßige Arzneimittel herzustellen. Die Formulierung von Arzneimitteln, welche das menschliche aus rekombinanter DNA hergeleitete NGF-Molekül (β-Untereinheit) enthalten und im Hinblick darauf ohne und gegebenenfalls auch mit Gangliosiden und Phospholipiden beschrieben sind, umfasst bereits bekannte Verfahren für die Herstellung von Arzneimitteln, welche vom pharmazeutischen Standpunkt aus verträglich und an einen Patienten verabreichbar sind, wobei es möglich ist, eine wirksame Menge des hNGF-Moleküls in einem Gemisch mit einem Vehikel, welches vom pharmazeutischen Standpunkt aus verträglich ist, zu kombinieren. Geeignete Vehikel und ihre Formuliereungen, welche andere Proteine umfassen, sind zum Beispiel in "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA, 1985) beschrieben. Diese Vehikel umfassen injizierbare "Abscheidungs-Formulierungen".
Auf der Grundlage des Vorstehenden umfassen die Arzneimittel, obwohl nicht ausschließlich, Lösungen des Nerven-Wachstumsfaktors oder seines gefrier-getrockneten Pulvers in Verbindung mit einem oder mehreren Vehikeln oder Verdünnungsmitteln, welche vom pharmazeutischen Standpunkt her verträglich sind und in Mitteln, welche auf einen geeigneten pH-Wert gepuffert sind, enthalten sind und welche isosmotisch mit den physiologischen Flüssigkeiten sind. Im Fall von gefrier-getrockneten Präparationen können unterstützende Excipienten verwendet werden, wie zum Beispiel, jedoch nicht ausschließlich, Mannit oder Glycinin, und es werden geeignete gepufferte Lösungen des gewünschten Volumens bereitgestellt, um angemessene, isotonische, gepufferte Lösungen zu erhalten, welche den gewünschten pH-Wert haben. Ähnliche Lösungen können für pharmazeutische Lösungen für Arzneimittel des Nerven- Wachstumsfaktor-Moleküls verwendet werden, welcher aus rekombinanter DNA in isotonischen Lösungen des gewünschten Volumens erhalten wurde, und beinhalten, jedoch nicht ausschließlich, die Verwendung von physiologischen gepufferten Lösungen mit Phosphat oder Citrat in geeigneten Konzentrationen, um jeder Zeit isotonische Arzneimittel mit dem gewünschten pH-Wert, zum Beispiel einem neutralen pH-Wert, zu erhalten.
Das Arzneimittel umfasst weiter, jedoch ohne darauf beschränkt zu sein, Zäpfchen für die rektale Verabreichung mit gefrier-getrockneten Excipienten, zum Beispiel wasserlösliche, autoemulgierende vom Glycogelatine-Typ oder andere. In diesen Präparationen kann der Nerven-Wachstumsfaktor, welcher aus der rekombinanten DNA erhalten wurde, in Mengen vorliegen, welche zwischen 0,01 Gewichts-% und 1/1 Gewichts-% des gesamten Excipienten betragen. Die Zäpfchen können, ohne darauf beschränkt zu sein, geeignete Mengen Acetylsalicylat enthalten.
Diese Arzneimittel können zur oralen, rektalen, parenteralen, lokalen, inhalativen, intracerebralen Verwendung gedacht sein. Deshalb liegen sie in fester oder halbfester Form, zum Beispiel als Dragees, Tabletten, gelatinöse Opercula, Kapseln, Zäpfchen, Kapseln aus weicher Gelatine vor. Für die parenterale und intracerebrale Verwendung können Formen verwendet werden, welche für die intramuskuläre, subcutane Verabreichung gedacht sind oder welche für intravenöse oder intracerebrale Infusionen oder Injektionen geeignet sind, und deshalb können Lösungen von aktiven Verbindungen und gefrier-getrockneten Pulvern der aktiven Verbindungen mit einem oder mehreren Empfängern oder mit Verdünnungsmitteln kombiniert werden, welche vom pharmazeutischen Standpunkt verträglich sind, welche für die vorstehend erwähnten Verwendungen geeignet sind und welche bezüglich der Osmolarität mit den physiologischen Flüssigkeiten verträglich, sind. Zur lokalen Verwendung können Präparationen in Form von Creme oder Salbe zur topikalen Verwendung gedacht sein; zur Verwendung durch Inhalation sind Präparationen in Spray-Form, zum Beispiel nasale Sprays, gedacht.
Die erfindungsgemäßen Präparationen können zur Verabreichung an Menschen oder Tiere gedacht sein. Sie enthalten vorzugsweise von 0,01% bis 10% der aktiven Komponente für Lösungen, Sprays, Salben und Cremen und von 1% bis 100% und vorzugsweise von 5% bis 50% der aktiven Verbindung für Präparationen in fester Form. Die zu verabreichende Dosis hängt von der Indikation, von der erwünschten Wirkung und der Art der Verabreichung ab, welche ausgewählt wurde.
Die Erfindung umfasst auch die therapeutische Verwendung von all den neuen Komplexen von Gangliosiden oder Derivaten mit der β-Untereinheit des Nerven-Wachstumsfaktors NGF für die Vorstehend bereits erwähnten Indikationen. Die tägliche Dosis für Menschen durch Injektion (subcutan oder intramuskulär oder intracerebral) variiert von 0,05 mg bis 5 mg aktiver Substanz pro kg Körpergewicht.
Es ist klar, dass die Methoden der Erfindung, wie sie beschrieben ist, auf verschiedene Arten modifiziert werden können. Solche Modifikationen sind nicht als Abweichungen von dem Geist und dem Ausblick der Erfindung gedacht, und all diejenigen Modifikationen, welche dem Fachmann offensichtlich erscheinen, sind innerhalb des Schutzumfangs der folgenden Ansprüche umfasst:

Claims

1. Replizierbarer Expressionsvektor, der menschlichen β-NGF codiert, zur Expression in geeigneten Säugerzellen, die mit dem Vektor transformiert sind, wobei der Vektor umfaßt:

(a) eine erste DNA-Sequenz, die die Aminosäuresequenz des menschlichen β-NGF von Position +1 bis +118 codiert;

(b) eine zweite DNA-Sequenz, die die Präpro-Aminosäuresequenz von menschlichem β-NGF von Position -121 bis -1 codiert, welche an das 5'-Ende der ersten DNA-Sequenz fusioniert ist; und

(c) ein regulatorisches Promotor-Enhancer-Element, das direkt an das 5'- Ende der zweiten DNA-Sequenz fusioniert ist.

2. Replizierbarer Expressionsvektor nach Anspruch 1, wobei die zweite DNA- Sequenz (b) Basenaustausche enthält, die an Position -120 zu einem Aminosäureaustausch von Ser zu Asp und an Position -119 von Met zu Pro führt.

3. Replizierbarer Expressionsvektor nach Anspruch 1 oder 2, wobei das regulatorische Element der Mouse-Mammary-Tumor-Virus (MMTV)-Promotor ist.

4. Replizierbarer Expressionsvektor nach Anspruch 1 oder 2, wobei das regulatorische Element der menschliche Metallothionein-IIa-Promotor ist.

5. Replizierbarer Expressionsvektor nach Anspruch 1 oder 2, wobei das regulatorische Element der SV40-Promotor ist.

6. Replizierbarer Expressionsvektor, umfassend ein DNA-Fragment von etwa 760 Basenpaaren, das menschlichen Präpro-β-NGF von Position -121 bis Position +118 codiert, bestehend aus:

(a) einem menschlichen genomischen DNA-Fragment von etwa 300 Basenpaaren, erhalten durch Polymerase-Kettenreaktion-Amplifikation menschlicher genomischer DNA unter Verwendung der Primer mit der Sequenz 5'-TGT CTAG ATG TCC ATG TTG TTC TTT-3' und 5'- GGCGG AATT CTCGGTGGTGGACCC-3';

(b) einem 460 Basenpaare langen EcoRI-BamHI-Fragment, das einen Teil des menschlichen β-NGF codiert und direkt an das 3-Ende des 300 Basenpaare langen Fragments (a) fusioniert ist;

wobei das 760 Basenpaare lange Fragment zwischen die NheI- und SmaI- Schnittstellen des Plasmids pMSG inseriert ist.

7. Replizierbarer Expressionsvektor, umfassend ein DNA-Fragment von etwa 760 Basenpaaren, das menschlichen Präpro-β-NGF von Position -121 bis Position +118 codiert, bestehend aus:

(a) einem menschlichen genomischen DNA-Fragment von etwa 300 Basenpaaren, erhalten durch Polymerase-Kettenreaktion-Amplifikation menschlicher genomischer DNA unter Verwendung der Primer mit der Sequenz 5-TGG ATCC ATTGTTCTACACTCTGATCACCC-3' und 5'- GGCGG AATT CTCGGTGGTGGACCC-3';

(b) einem 460 Basenpaare langen EcoRI-BamHI-Fragment, das einen Teil des menschlichen β-NGF codiert und direkt an das 3'-Ende des 300 Basenpaare langen Fragments (a) fusioniert ist;

(c) einem 500 Basenpaare langen BamHI-HindIII-Fragment, umfassend ein SV40-Enhancer-Element;

(d) einem 841 Basenpaare langen HindIII-BamHI-Fragment, umfassend einen Promotor eines Maus-Metallothionein-IIa-Gens;

wobei der SV40-Enhancer (c) funktionell mit dem 5'-Ende des Maus- Metallothionein-IIa-Promotor (d) verbunden ist, dessen 3-Ende wiederum funktionell mit dem 5'-Ende des 760 Basenpaare langen DNA-Fragments verbunden ist, das menschlichen Präpro-β-NGF zwischen den NaeI- und BamHI-Schnittstellen von pGEM3 codiert.

8. Replizierbarer Expressionsvektor, umfassend ein DNA-Fragment von etwa 760 Basenpaaren, das menschlichen Präpro-β-NGF von Position -121 bis Position +118 codiert, bestehend aus:

(a) einem menschlichen genomischen DNA-Fragment von etwa 300 Basenpaaren, erhalten durch Polymerase-Kettenreaktion-Amplifikation menschlicher genomischer DNA unter Verwendung der Primer mit der Sequenz 5'-TGG ATCC ATTGTTCTACAC TCT GAT CACCC-3 und 5-GGCGG AATT CTCGGTGGTGGACCC-3';

(c) einem 500 Basenpaare langen BamHI-HindIII-Fragment, umfassend ein SV40-Enhancer Element;

(d) einem 841 Basenpaare langen HindIII-BamHI-Fragment, umfassend einen Promotor und ein Initiator-Methionin eines Maus-Metallothionein IIa-Gens;

wobei der SV40-Enhancer (c) funktionell mit dem 5'-Ende des Maus- Metallothionein-IIa-Promotors (d) verbunden ist, dessen 3'-Ende wiederum funktionell mit dem 5'-Ende des 760 Basenpaare langen DNA-Fragments verbunden ist, das menschlichen Präpro-β-NGF zwischen der NaeI- und der BamHI-Schnittstelle von pGEM3 codiert.

9. Rekombinante Wirtszelle, die mit dem Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 8 transformiert ist.

10. Zelle nach Anspruch 9, wobei die Zelle eine Säugerzelle ist.

11. Zelle nach Anspruch 9, wobei die Säugerzelle eine CHO-Zelle ist.

12. Verfahren zur Herstellung eines Expressionsvektors, der menschlichen β- NGF codiert, umfassend:

(a) Herstellung eines XbaI-Oligonucleotids mit der Sequenz 5'-TGG ATCC ATTGTTCTACACTCTGATCACCC-3' und eines EcoRI- Oligonucleotids mit der Sequenz 5'GGCGG AATT CTCGGTGGTGGACCC-3';

(b) Amplifikation eines 300 Basenpaare langen DNA-Fragments durch eine Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung der XbaI- und EcoRI-Oligonucleotide als Primer und menschlicher genomischer DNA als Matrizen-DNA;

(c) Clonierung des 300 Basenpaare langen DNA-Fragments in die XbaI- und EcoRI-Schnittstellen des pGEM4-Vektors zur Herstellung eines pGEM4Xba-NGF-Plasmids;

(d) Schneiden des pGEM4Xba-NGF-Plasmids an der HindIII- und EcoRI- Schnittstelle zur Herstellung eines ersten 300 Basenpaare langen Fragments;

(e) Clonierung des ersten 300 Basenpaare langen Fragments in die HindIII-EcoRI-Schnittsteilen des pUC18BBG26-Plasmids zur Herstellung von pUC18hNGFc;

(f) Schneiden von pUC18hNGFc an der BamHI- und XbaI-Schnittstelle, zur Herstellung eines 760 Basenpaare langen Fragments;

(g) Clonierung des 760 Basenpaare langen Fragments in die NheI- und SmaI-Schnittstellen eines pMSG-Vektors zur Herstellung eines pMSGphMGF-Plasmids;

(h) Isolierung eines den Metallothionein-IIa-(MTIIa)-Promotor enthaltenden Fragments durch Schneiden von phMTIIa mit HindIII und BamHI;

(i) Clonierung des MTIIa-Promotor enthaltenden Fragments in die HindIII- und BamHI-Schnittstellen des pGEM4-Vektors zur Herstellung eines pGEM4hMTIIa-Vektors;

(j) Schneiden einer Präpro-NGF-DNA-Sequenz mit BamHI und EcoRI und Clonierung des entstandenen Fragments zwischen die BamHI- und EcoRI-Schnittstellen von pGEM4hMTIIa zur Herstellung von pGhMTphNGF;

(k) Schneiden von pMSGphNGF mit BamHI, Kopieren des 5'-Überhanges mit Klenow-Polymerase, Schneiden mit HindIII und Clonierung des entstandenen 500 Basenpaare langen Fragments zwischen die NaeI- und HindIII-Schnittstellen von pGEM3 zur Herstellung von PGSV40; und

(l) Schneiden von pGhMTphNGF mit HindIII und EcoRI, um ein erstes Fragment herzustellen, Schneiden von pMSGphNGF mit EcoRI und BamHI, um ein zweites Fragment herzustellen, und Clonierung des ersten und zweiten Fragments zwischen die HindIII- und BamHI- Schnittstellen von pGSV40, um pSV40MTphNGF herzustellen.

13. Verfahren zur Herstellung von menschlichem β-NGF, umfassend:

(i) Transformation einer Säugerzelle mit dem replizierbaren Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 8;

(ii) Züchtung der transformierten Zelle; und

(iii) Gewinnung des menschlichen β-NGF, der in der Kultur produziert wurde.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Säugerzelle eine CHO-Zelle ist.

15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei der replizierbare Expressionsvektor die Struktur von pSV40MTphNGF- hat, einem Vektor umfassend ein DNA-Fragment von etwa 760 Basenpaaren, das menschlichen Präpro-β-NGF von Position -121 bis Position +118 codiert, bestehend aus:

(a) einem menschlichen genomischen DNA-Fragment von etwa 300 Basenpaaren, erhalten durch Polymerase-Kettenreaktion-Amplifikation menschlicher genomischer DNA unter Verwendung der Primer mit der Sequenz 5'-TGG ATCC ATTGTTCTACAC TCT GAT CACCC-3' und 5-GGCGG AATT CTCGGTGGTGGACCC-3';

(c) einem 500 Basenpaare langen BamHI-HindII-Fragment, umfassend ein SV40-Enhancer-Element;

(d) einem 841 Basenpaare langen HindIII-BamHI-Fragment, umfassend einen Promotor und Initiator-Methionin eines Maus-Metallothionein-IIa- Gens;

wobei der SV40-Enhancer (c) funktionell an das 5-Ende des Maus Metallothionein-IIa-Promotors (d) fusioniert ist, dessen 3'-Ende wiederum funktionell an das 5'-Ende des 760 Basenpaare langen DNA-Fragments fusioniert ist, das menschlichen Präpro-β-NGF zwischen den NaeI- und BamHI-Schnittstellen von pGEM3 codiert.