JPH03224490A - 神経成長因子を真核生物細胞において発現させるための遺伝子ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、形質転換細胞から神経成長因子（βＮＧＦ）
と呼ばれるポリペプチドを得るための方法、より正確に
は適当な真核生物セルラインに挿入可能な遺伝子構築物
を使用する組換えＤＮＡ技術によって、生物学的に活性
なヒト成熟型（β−サブユニット）を得るための方法に
関する。

Ａ、神経成長因子（ＮＧＦ） 神経成長因子（Ｎ　Ｇ　Ｆ　）はマウス肉腫で初めて発
見され［レビーモンタルシニ（Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌ
ｃｉｎｉ、　Ｒ）らのＪ、　Ｅｘｐ、　Ｚｏｏｌ、　１
１６：３２Ｌ　１９５１］、次いで雄性マウス唾液顎下
腺［バロン（Ｖａｒｏｎ、　Ｓ、　）らのＢｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ　８：２２０２，１９６７コ、およびヘビ
毒液［アンジェレッチ（Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ、　Ｒ，Ｈ
，）のＰｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ
、　、　Ｕ、　ＳＡ、　６５：６６８．１９７０］から
精製されて均質にされた。

ＮＧＦか比較的豊富な池の供給源として、モルモットの
前立腺［ハーバ−（）ｌａｒｐｅｒ、　Ｇ、　Ｐ、　）
らのＮａｔｕｒｅ　２７９：１６０．１９７９］および
ヒト胎盤［ゴールドスティン（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、　
Ｌ、　Ｄ、　）らのＮｅｕｒｏｃｈｅｍ、　Ｒｅｓ、　
　３：１７５．１９７８、およびワーカ−（Ｗａｌｋｅ
ｒ、　Ｐ、　）らのＬｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅ　２６１
９５、１９８０．フィディア特許４７７４５Ａ８ｇ］な
とが指摘されている。他の組織、例えば哺乳動物の中枢
神経系に少量のＮＧＦが見いだされている［バロン（Ｖ
ａｒｏｎ、　Ｓ、　）のＤｉｓｃｕｓｓｉｏｎｓ　ｉｎ
　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、　■巻、３号、　１９８
５およびヘフチ（Ｈｅｆ　ｔ　ｉ、　Ｆ、　）らのＮｅ
ｕｒｏｓｃ　１ｅｎｃｅ　１４：５５，１９８５コ。こ
れらＮＧＦの供給源と見掛は上の作用部位との生理学的
な関係は明らかとは言えないが、ＮＧＦと応答する細胞
由来の神経支配が必要である種々の上皮組織からＮＧＦ
は分泌されていると一般に考えられている。

通常、マウス唾液顎下腺から入手されたＮＧＦが、ＮＧ
Ｆをインビトロおよびインビボで試験するために使用さ
れる。ＮＧＦのインビトロにおける生物学的活性の範囲
は、−次神経細胞およびクローン化セルラインの両者に
おいて決定された。

インビトロでＮＧＦと応答する一次神経細胞には、を髄
神経節根由来の胎児の知覚性ニューロン（胎児日数８−
１２）、交感神経節由来の自律神経系ノルアドレナリン
作動性胎児ニューロン、発育期にある隔膜およびクロム
親和性副腎細胞由来のコリン作動性胎児ニューロンがあ
る。知覚および自律神経系ニューロンはその生存および
発育がＮＧＦによって左右されるか、コリン作動性ニュ
ーロンは、生存するためばかりでなく、その分化、すな
わち神経伝達物質と連結する表現型特性の発現のために
もＮＧＦを必要としないようである。発育の初期にある
クロム親和性副腎細胞（神経冠から誘導）にＮＧＦを加
えると、神経の表現型が発現される。インビトロにおい
てＮＧＦと２答するセルラインの中には、文献に記載さ
れているように、神経冠の腫瘍から誘導されるクロム親
和性副腎細胞、いわゆるクロム親和性細胞腫細胞（ＰＣ
ｌ３）およびヒト神経芽細胞腫細胞がある。β−ＮＣＦ
で処置すれば、それらの細胞はその挙動を変え、強烈な
増殖期から細胞分裂状態に移行する。

マウス唾液顎下腺から入手された神経成長因子は、化学
的および免疫化学的プロフィルによっても良好に特性化
される。ネズミ腺由来のＮＧＦは、Ｚｎ”原子と配位結
合している３つのサブユニ、ト（α、β、γ）から構成
された７ｓ型のタンパク質複合体く分子量約１４０，０
００ダルトン）のように作用する。

この７８分子の生物学的活性について最も興味深い部分
は、それぞれ分子量１３．２５０の１１８アミノ酸から
形成されている２つのポリペプチド鎖から構築されてい
る。その鎖すなわちモノマー各々は、２つのシスティン
残基間の共有結合を形成する３つのスルフィド架橋を有
しており、それはそのタンパク質の三次構造に強い安定
性を付与している。弱い結合によってそれぞれ結合され
たＮＧＦの２つのモノマーは分子量２６．５００のダイ
マーを形成している。その生物学的活性はいわゆる２、
５８または通常はβ−サブユニットと呼ばれるダイマー
と関連していることか示されている。これがモノマーに
も存在しているが否がは知られていない。

遺伝子工学の手法により、このＮＧＦのβ−サブユニッ
ト（β−ＮＧＦ）をコードしている遺伝子を同定するこ
とかできた［スコツト（Ｓｃｏｔｔ、　Ｊ、　）らのＮ
ａｔｕｒｅ　３０２：５３８．１９８３、ウシリッチ（
Ｕｌｌｒｉｃｈ、　Ａ、　）らのＮａｔｕｒｅ　３０３
：８２１．１９８３、欧州特許公開第０１２１３３８号
］。この分子をコードしているヒト遺伝子は染色体Ｉの
短い腕に配置されており、その生物学的に活性な分子に
当たる分子量２６，５００の分子よりも大きな分子の合
成をコードしている。

したかって、その遺伝子は初期には、より大きなＮＧＦ
前駆体またはプローＮＧＦの合成を指令している。さら
に、ＮＧＦのβ−サブユニ、トをコード口ている遺伝子
は、トリからヒトに及ぶ様々な種において高度に保存さ
れていることが証明されている［メイアー（Ｍｅｉｅｒ
、　Ｒ，）らのＥＭＢＯＪ、　５：１４８９１９８６］
。

ネズミ、ヒト、ウシおよびニワトリのβ−ＮＧＦのヌク
レオチド配列を解明することにより、これら分子の保存
部位および非保存部位と、それらの生物学的活性および
抗原性に対する関係との比較が可能になった。β−ＮＧ
Ｆの発生期における全体としての保存性は驚くほどに高
い。雄性マウスの唾液顎下腺から精製した成熟型のＮＧ
Ｆにおける１１８個のアミノ酸のうち、ウシβ−ＮＧＦ
においては１６個、ニワトリβ−ＮＧＦにおいては１９
個およびヒトβ〜ＮＧＦにおいてはｉｌｌしか異なって
おらず、ウシおよびヒトのβ−ＮＧＦ間では６個のアミ
ノ酸が異なるのみである。すべてのシスティン残基がす
べての種において正確に保存されている。β−ＮＣＦの
３つのＳ’−３架橋を還元すれば、その生物学的活性が
完全に喪失される。アミノ酸配列における全体としての
高いレベルの保存性と免疫化学的形態の交叉反応性の低
さとは一見矛盾しているが、それは種間のアミノ酸の変
動が特異的な一集団（クラスター）」の中に配置されて
いることに由来している。バイトロバシー・トレーシン
グ（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ　ｔｒａｃｉｎｇｓ）によ
り、これらの変動が、強力な抗原決定基と考えられる親
水性部位の殆どすべてに存在していることを証明するこ
とがてきる。これまてに試験されたすべての種のＮＧＦ
分子では、ただ一つの親水性領域しか厳密には保存され
ていないことか認められた。

Ｂ２組換えＤＮＡ法 組換えＤＮＡ法により、目的のタンパク質を大量に発現
させることのできる一連のヘクターを構築することが可
能である。この手法によれば、分子生物学者は目的タン
パク質を産生ずることのできる雑種分子を作成するよう
ＤＮＡ配列を組み合わせることができる。この方法は、
制限酵素による切断、このようにして得られたフラグメ
ントのリガーゼによる連結などの種々の反応、組み立て
ようとするオリゴヌクレオチドの化学的合成、および当
業界における種々の研究所における入手可能な他の方法
などを利用するものである［マニアチス（Ｍａｎｉａｔ
　ｉｓ、　Ｔ、　）らのＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ＭａｎｕａＬ　
コールド・スプリング・ノ＼−パー・ラボラトリ−、コ
ールド・スプリング・ラボラトリ−ニューヨーク、１９
８２］。高いレベルの発現を得るため、組み立てようと
するＤＮＡ要素には実質的な情報が存在していなければ
ならない。例えば、Ｐｉ製起点、抗生物質に対する選択
性、発現プロモーター、目的遺伝子の転写のアクチペー
ター、および該材料の研究者に知られている池の特性で
ある。これらの要素を適当な方法で組合わせてプラスミ
ドを得るに当たり、目的遺伝子を転写および翻訳の調節
配列について天然の状態で挿入すれば、得られたプラス
ミドは発現によって規定される。このようにして、プラ
スミドすなわち発現ベクターは、宿主細胞においてタン
パク質を発現することができる。次いで、あるｆｉｔ　
製法ｉ：よって、タンパク質を得ればよい。例えば成長
因子などの多くの遺伝子の発現を天然で制御している要
素（プロモーター）は、上記の発現ではそれ程強くなく
、知られていないことが多い天然の適切な条件下におい
てのみ活性化される。この目的では、活性が知られてい
るプロモーター、例えば−連のバボバウイルス、または
他の既知のプロモーター遺伝子配列を使用する。したが
って、高いレベルの発現のために使用される要素は、種
々の遺伝子部分を結合させてバイブリッドを形成するこ
とを目的として構成された、種々の起ｇ（真核生物、細
菌、ウィルスなと）のＤＮＡの組合わせ物である。遺１
云子の転写および畦訳活性は、調節配列およびコード化
配列の間の適切な距離に左右される。

この導入を行う際の、調節配列を適当に操作するための
最良の方法の１つは、導入した遺伝子を天然遺伝子にお
けるのと同一の位置に配置させることである。使用され
る１つの系は、調節配列がコード化配列の幾つかのアミ
ノ酸をも含何しているものである。この導入遺伝子を伴
う結合物（ユニオン）は融合タンパク質を導く。しかし
、融合部分を除去すれば、より高い生物学的価値を得る
ことができる。この融合タンパク質の手法を使用しない
場合における、調節配列に近接して位置する遺伝子を得
るための通常の手法は、それらのクローニングを行える
適当な制限部位の存在に左右される。適合性部位が近く
に存在せずに、別の部位にある場合、所望の制限部位を
含有するオリゴヌクレオチドまたはリンカ−を合成して
それを有するセグメントの結合物を調製すればよい。リ
ンカ−を使用することのできる制限部位か近くに存在し
ない場合は、Ｂａ１３１またはＳｌを使用してＤＮＡを
欠失させる手法を使用する。この場合は正確に欠失させ
ることかできないので、常に種々のクローンの配列決定
を行っていずれが最適であるかを確認する必要がある。

これらの系は分子生物学者にとっては非常に限定された
ものであり、結局、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）など
の、新しく出現した手法としての役割を持つ代替の手段
を開拓する必要がある［サイキ（Ｓａｉｋｉ）らの５ｃ
ｉｅｎｃｅ２３９：４８７．１９８８、およびシャーフ
（Ｓｃｈａｒｆ、　Ｓ、　Ｊ、　）の５ｃｉｅｎｃｅ　
２３３＋１０７６、１９８６］。

この手法によれば、遺伝子セグメントを１０’にまで増
幅させることができる。その原理は、対合することので
きる２つのオリゴヌクレオチドであって、その各々が増
幅させようとするＤＮＡ鎖の１つであるものの使用に基
づいている。調査した遺伝子配列に対する２つのオリゴ
ヌクレオチドの距離により、産生され得る分子の大きさ
か決定される。これら２つのオリゴヌクレオチドは、以
後のクローニングが行える制限部位かそれらの配列の内
側に存在するように構築する。この制限部位は天然に存
在しているものか、または最少数の塩基を変性して特別
に構築する。部位−特異的突然変異として定義すること
のできるこの方法によれば、分子生物学者は理論的に決
定した位置に制限部位を作成することができる。他方、
他の遺伝子セグメントに適合する部位を作成すれば、ク
ローニングが容易になるか、特に、原理を定めた種々の
遺伝子セグメントが結合する可能性をも招来させること
になる。この手法は、直接突然変異に基つくクローニン
グとして定義することができる。

実際には、組換えＤＮＡ法によれば、直接突然変異によ
って完全なヘテロローガスなポリペプチドを発現させる
ことができ、あるいは類似のポリペプチドのアミノ酸配
列部分と融合したヘテロローガスなポリペプチドを発現
させることができる。

一般には、この方法によって得られる産物は生物学的に
活性でない［英国特許出願公開第２００７６７６Ａ号、
ベンゼル（Ｗｅｎｚｅｌ）、Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｃｉ
ｅｎｔｉｓｔ　６８６６４、１９８０］。

神経成長因子のβ−サブユニットのヒト遺伝子を単離で
きることは、重要な可能性をもたらすものである。この
希少価値あるタンパク質を十分量生産することは、組換
えＤＮＡ技術を使用することによって可能である。実際
に、神経成長タンパク質は、種々の神経障害性疾患を処
置するために臨床的に使用できるものとして許容され得
るものである。この意味から、ＮＧＦのβ−サブユニッ
トを組換えＤＮＡ技術によって入手することに関連した
文献か存在する［欧州特許公開第０１２１３８８号、ブ
ルース（Ｂｒｕｃｅ、　Ｇ、）らのＮｅｕｒｏｂｉｏｌ
ｏｇＹ　ｏｆ　Ａｇｉｎｇｌｏ：８９．１９８９、ツー
（Ｈｕ、　Ｇ、　）らのＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ　７０：５７．１９８８、ニドワード（
Ｅｄｗａｒｄｓ、　Ｒ，Ｈ，）のＭｏｆ、　Ｃｅ１１．
　Ｂｉｏｌ、　８：２４５６．１９８８、エンフォース
（Ｅｍｆｏｒｓ、　Ｐ、　）のＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８６：４７５６．１９８９コ
。生産するに当たっては、微生物細胞においては廉価に
発現させることができない場合にのみ、細菌ではなく哺
乳動物細胞を選択する。Ｅ、ｃｏｌｉ（大腸菌）などの
細菌セルラインで特定のタンパク質を産生させるほうが
、実際上非常に経済的であるが、般にこの宿主／ベクタ
ー系はタンパク質を形作るアミノ酸の線状配列しか正確
に再製できず、そして細菌中に一種の不溶性の固まりと
して提供するものである。インターフェロンまたは幾つ
かの動物成長タンパク質などの特定の小分子の場合はイ
ンビトロにおいて分子を正確に折り畳むことができ、そ
のような場合など、大腸菌は、特定の産物が経済的に有
利な態様でこの材料から調製できると仮定すれば、選択
に当たっての系となるであろう。これらの系は、単一の
ジスルフィド結合を有するタンパク質と一般に関連する
場合、および良好に規定されたフンフォーメーションを
必要としない′（診断性抗原またはワクチン成分として
の）用途を有するペプチドまたはタンパク質に使用する
場合には最も生産的なものである。

神経成長因子が属する治療用タンパク質においては、活
性であり、かつ使用できるために正しいフンフォーメー
ションが要求され、さらに抗原性の応答が存在しないこ
とが必要とされる。この調製方法には、組換えＤＮＡか
ら入手されるタンパク質のためのグリコジル化、正しい
ジスルフィド結合の生成、および他の形質導入後修飾が
包含されよう。細菌セルラインであるＥ　、　ｃｏｌｉ
はこの要件を満たすことができず、哺乳動物真核性細胞
および酵母ではそれが可能である。バイオテクノロジー
によって入手したヒトβ−ＮＧＦを医薬活性物質として
適用するには、これらの問題を考慮に入れるべきある。

ＮＧＦの活性は、二量体、すなわち１１８個のアミノ酸
の２つの類似したポリペプチドの組合わせ物に由来する
ことが示されている。メルカプトエタノールにより還元
した場合、その生物学的活性は実際上ゼロに下降する。

システィンを組合わせて３つのジスルフィド架橋を再生
しようという試みがあるが、これは、統計学的観点から
、１５分の１の確率でしか天然物に相当する構造と同等
である正しい構造の分子が得られない。最終的に得られ
たＥ、ｃｏｌｉにおける分子は、構造の相同性およびそ
の医薬活性物質としてのヒトへの適用を保証できるもの
ではない。実際、均質になるまで精製した後でも、Ｅ、
ｃｏｌｉから産生されたヒトＮＧＦは、ネズミβ−ＮＧ
Ｆと特異的であるポリクローナル抗体による免疫プロッ
ティング法において、生物学的に活性な二量体とは帰属
されない一連のバンドが認められている。さらに、この
構造物および形態物の混合物は、胎盤組織などの天然起
源から精製した類似のヒト型と比較して生物学的活性が
１０倍低いことが示されている。

Ｅ　、　ｃｏｌｉにおいて神経成長因子をクローニング
して入手するこの方法では、目的とするタンノ＜り質を
高い発現レベルで産生じたとしても、インビボに投与し
た場合に二次効果を招来しかねない一連の不正確な分子
、例えば天然に存在するこの分子の生物学的活性を認識
して阻害してしまうような抗体が産生される。それと同
時に、Ｅ　、　ｃｏｌｉにおいてその成熟分子をクロー
ニングすれば、除去できない開始メチオニンを提示し、
それは分子の露出部分に位置しているので、確実に免疫
原性である。

他の方法は、真核生物細胞でプレプロＮＧＦをクローニ
ングすることに関係しており、真核生物細胞に天然で存
在する特定のベブチターゼによる攻撃を利用して成熟分
子を得るものである。具体的には、チャイニーズ／’ｌ
ムスター卵巣（ＣＨＯ）を使用してクローニングを行う
。頒布されている文献から、すべてのゲノムがクローニ
ングされたヒトＮＧＦは未だ配列決定されていないが、
その遺伝子は１．ｏｋＤａ以上にも伸長していることが
示されティる［ウシリッチ（Ｕｌｌｒｉｃｈ、　Ａ、　
）らのＮａｔｕｒｅ　３０３：８２１．１９８３］。こ
のように長い遺伝子は通常のクローニングが行えないの
で、この全ゲノム配列とは別に行う。その方法は、この
タンパク質のコード化部分しか含有していないｃＤＮＡ
の部分をクローニングするものである。現在、ヒトＮＧ
Ｆの完全なｃＤＮＡは単離されていないが（幾つかの配
列は、５゛部分を欠いている）、他の起源（マウス、ウ
シ、ニワトリなど）のＮＧＦメツセンジャーについて多
（の情報が知られており［メイアー（Ｍｅｉｅｒ、　Ｒ
，）らのＥＭＢＯＪ、　５１４８９．１９８６、セルビ
ー（Ｓｅｌｂｙ、　ｔｌ。

」、）のＪ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　
１８：２９３．１９８７］、これらにより、興味深い推
論を導くことかできる。マウスのＮＧＦ遺伝子は単一コ
ピーで存在し、異なる大きさ（ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）の
少なくとも４つの異なるメツセンジャーを産生ずる［セ
ルビー（Ｓｅｌｂｙ、　Ｍ、　Ｊ、　）らのＭｏ１．　
Ｃｅｌ　１．　Ｂｉｏｌ、　７　：　３０５７．１９８
７］。これらの異なる大きさは、特に異なるＡＵＧ開始
コドンに反映されたものであり、成熟タンパク質におけ
るー１８７および−１２１位か最も重要である。これら
のメツセンジャーは種々の組織においてそれに相当する
種々の豊富さて存在している。顎下腺においては、−１
８７から始まるメツセンジャーは、１２１から始まるも
のと比較して１０倍豊富である。しかし、種々の証拠に
より、脳において発現されるＮＧＦメツセンジャーが最
モ一定のバーセンテイジであるのはそれか正確に−１２
１のＡＵＧを使用しているからであることが示されてい
る。

発明の要旨 本発明は、調節部位とヒトＮＧＦのβ−サブユニットタ
ンパク質をコードしている部位との間が天然の距離だけ
離れている発現ベクターであるために、天然の配列に存
在するものとは異なる、ポリペプチドに融合した１つま
たはそれ以上のアミノ酸か存在していないヒト神経成長
因子のβ−サブユニノ）（ｈβ−ＮＧＦ）の成熟型を培
養培地で得ることのできる、ＣＨＯなどの真核生物セル
ラインで使用するための該発現ベクターによって、ヒト
ＮＧＦのβ−サブユニットを入手する方法に関するもの
である。このようにして入手されたポリペプチドは、適
当な標的細胞で使用した場合、生物学的活性を示す。

本明細書に記載しているｈβ−ＮＧＦは、神経機能を維
持し、その損失を予防するために、ならびに慢性型また
は急性型の病態、脳血管性、感染性、炎症性、圧迫性、
代謝異常性などの急性疾患の晩期における神経変性状態
および免疫系の調整（ｍｏｄｕｌａｔ　１ｏｎ）状態、
を回復させるためにも、使用することかできる。

本発明はさらに、インビボにおいて移植することができ
るような、細胞トランスフェクションのために使用する
ことのできる遺伝子構築物を目的とするものである。こ
れら構築物の中には、局所レヘルで、投与する食餌の機
能に応じてヒト成長因子の活性型を特異的に産生ずるこ
とができるものかあり、したがって遺伝子を制御下に置
（ことか可能である。

本発明はさらに、該ベクターを含有する形質転換セルラ
イン、およびｈβ−ＮＧＦを産生ずるその培養物を目的
とするものである。本発明はまた、神経栄養性因子のβ
−ユニントと、天然のガングリオシドまたはその銹導体
または半合成同族体またはそれらの塩との、１つまたは
それ以上の新規複合体を活性物質として含有する医薬調
製物を目的とするものである。

簡単な図面の説明 第１図は、ヒト起源の神経成長因子β−サブユニットの
ポリペプチドにおけるバイトロバ／シティ−（ｈｙｄｒ
ｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）のプロフィルである。

第２図は、ｐＭＳＧｐｈＮＧＦ発現ベクターの構築を模
式図的に示すものである。

第３図は、ｐＭ　Ｓ　Ｇ　ｐｈＮ　Ｇ　Ｆ発現ベクター
の模式図である。

第４図は、ｐＳ　Ｖ　４０ＭＴｐｈＮＧ　Ｆ発現ベクタ
ーの構築を模式図的に示すものである。

第５図は、ｐｓ　Ｖ　４０ＭＴｐｈＮＧ　Ｆ発現ベクタ
ーの模式図である。

第６図は、ｐＳ　Ｖ　４０ｐｈＮＧ　Ｆ発現ベクターの
構築を模式図的に示すものである。

第７図は、ｐｓＶ４０ｐｈＮＧＦ発現ベクターの模式図
である。

第８図は、ｐｓＶ４０ｈＮＧＦ発現ベクターの構築を模
式図的に示すものである。

発明の詳細な説明 上記の証拠から、−１２１のメチオニンかう正確に開始
して本発明のヒトβ−ＮＧＦをクローンした。このハイ
ドロバラシティープロフィルの分析により、−１２１お
よび一１０４間のアミノ酸が先導ペプチドとして機能し
ていることが示され、このことはこのタンパク質が分泌
される得ることを示している。このプロフィルはホップ
（Ｈｏｐｐ）らのＰｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　７８：３８２４
．１９８１に記載されている方法にしたがった、ヒト起
源の神経成長因子のサブユニットのポリペプチドにおけ
るハイドロパシシティーフロフィルであり、それは第１
図に示している。−１２１／−１０４として示される位
置は、先導ペプチドを表しており、＋１／＋１１８とし
て示される位置はヒト起源の神経成長因子β〜サブユニ
ットのポリペプチドのアミノ酸配列を表している［ウシ
リノチ（Ｕｌｌｒｉｃｈ）らのＮａｔｕｒｅ　３（１３
：８２１．１９８３コ。成熟タンパク質を得るための特
定のペプチダーゼであって、生物学的に活性なペプチド
に相当する＋１から＋１１８のアミノ酸配列を得ること
ができるペプチダーゼが存在する。ＮＧＦを正常に合成
する細胞に含有されているこのペプチダーゼは、ＡＴ−
２０細胞にも含有することが示された。実際、これらの
細胞にネズミ起源のワクシニアウィルスプレプロＮＧＦ
を含有するベクターを導入することにより、それら細胞
は成熟ＮＧＦを分泌することかできるようになり、変性
および還元の条件下でのゲルにおいて１４ｋＤａの分子
を生産することができる［エトワードス（Ｅｄｗａｒｄ
ｓ、　Ｒ，Ｈ，）のＭｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、
　８：２４５６゜１９８ｇ］。

本発明者らは、既述の神経成長因子のβ−サブユニット
を得るに当たっての前述の経験の機能に関し、画期的な
方法において、真核生物細胞で使用することのできる１
つまたはそれ以上のベクターの構築物を比較した。ＰＣ
Ｒ法を使用すれば、種々の発現ベクターと適合し得るよ
うに作成された部位を有するプレプロＮＧＦがクローニ
ングされ、それらの制限部位は調節配列およびコード化
配列間の距離が可能な限り天然の距離を保持するよう配
置されており、β−ＮＧＦサブユニットノ発現に関する
文献に既に記載されている遺伝子構築物とは全く異なる
状況であった。ブリティッシュ・テクノロジー［Ｂｒ１
ｔｉｓｈ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｔｄ、、オックス
フォード、英国］から入手される、制限部位が以後に突
然変異を行えるように作成されている修飾された成熟ヒ
トＮＧＦ（ｈβ−ＮＧＦ）配列とブレプＣＩＮＣＦの部
分とを結合させた。本発明の目的としては、これらの制
限部位の存在は限定的に解すべきてなく、さらに遺伝子
の起源も限定的に考えるべきでない。

この仮定から始めて、本発明者らは次に、ＳＶ４０（サ
ルウィルス４０）、ＭＴＴＶ（マウス乳癌ウィルス）、
ｈＭＴＩ［ａ（ヒトメタロチオネインｌ１ａ）などの種
々のプロモーターの制御下に、プレプロｈβ−ＮＧＦを
クローンした。次いで、プラスミドに導入したこれらの
遺伝子配列をＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、得られ
た細胞がまさに培養培地に生物学的な活性型のｈ−ＮＧ
Ｆを産生できることを証明した。このプレプロＮＧＦは
本分子の組み立てには必須であることが立証されており
、それによりβ−サブユニットのみを発現させることが
でき、そしてその遺伝子構築物全体は正しいと考えられ
ることが示されている。

Ａ、使用した一般的方法 製造元の取り扱い説明書にしたがって、ＤＮＡの鎖を制
限酵素で攻撃する。一般には、プラスミド１゜８を溶液
２０μＱ中、酵素１単位で切断する。温度およびインキ
ュベート時間は使用する酵素に応じて変動するが、一般
には３７℃、１時間である。インキュベートした後、プ
ラスミドおよび遺伝子セグメントを、４０ｍＭ　　トリ
ス／塩酸、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ中
、アガロースゲルＬＭＰアガロース［Ｂ　ＲＬ、　米国
］テａｔ製Ｌ、次イテシェネクリーンＴＭ（ＧＥＮＥｃ
ＬＥＡＮ７Ｍ）キット［ＢＩＯｌｏｔ　Ｉｎｃ、、う・
ジヨウ、カリフォルニア、米国コを使用してアガロース
から溶１ｆｆすせる。５°末端におけるコピー反応を行
うため、ポリメラーゼ（クレノー）１０単位を使用して
ＤＮＡを１５°Ｃで１５分間処置する。リガーゼとして
は、１３°Ｃ２１２時間の反応物２０μｇにおいて、Ｄ
ＮＡ０．５μｇ当たり１単位の濃度でＴ４リガーゼを使
用する。

プラスミド中に正しい配列であることを確認する分析を
行うため、ＨＢＩＯＩ細胞を形質転換し、５０μｇ　／
ｘＱアンピシリン抗生物質を含有するＬＢ　（Ｌｕｒｉ
ａ　Ｂｅｒｔａｎｉ）培地におけるアガロース平板中で
形質転換体を選択する。得られたＨＢＩＯＩに含有され
るプラスミドを、１００μｇ／ｍＱアンピシリンのＬ　
Ｂ中で増殖させ、キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）［ＤＩＡ
ＧＥＮ　ＧｍｂＨ，デュッセルドルフ、西ドイツ］牛。

トを使用して精製し、少量調製物または大量調製物とす
る。キアゲン法によって細菌細胞から発現ベクターを調
製する。

以下のようにして臨月期のヒト胎盤からＰＣＲ反応用の
ＤＮＡを調製する。０．４ｃｍ３片の絨毛膜をハサミで
切り出し、５０ｍＭ　　トリス／塩酸ｐＨ７，８、ｌｏ
ｏｍＭ　ＥＤＴＡ、ｌ　ＯＯ＋ｕＭ　ＮａＣｌ２．１％
５ＤＳ７００μＱ中に懸濁する。次いで、これにブロテ
イナーゼ（Ｋ　　１００μｇ＃１２）３５μＱを加え、
５５°Ｃで一晩インキユベートする。次いで、溶液２０
μＱを１３μｇ／村ＲＮＡアーゼＡに加え、さらに２時
間インキュベートする。フェノールを使用して２つの抽
出物を調製し、クロロホルムを使用して２つの抽出物を
調製する。次いで、１容量のインプロパ／−ルを添加し
、ＤＮＡをガラス毛細管上に析出させる。この時点で、
７０％および１００％エタノールに通過させ、乾燥する
。得られたＤＮＡを試験管内でゆつ（つと撹拌させなが
ら、緩衝液（ＩＣ）ｎＭトリス／塩酸ｐＨ７，４，１ｍ
ＭＥＤＴＡ）中に溶解する。数時間後、溶解したＤＮＡ
を遺伝子増幅のために準備する。

ＰＣＲを行うには通常、ＤＮＡ０．１μｇで十分である
。

製造元であるギブコ（ＧＩＢＣＯ）の操作法にしたがっ
て、またはリン酸カルシウム法によって、ＣＨＯ細胞（
ＣＣＬ６１）、およびデヒドロ葉酸還元酵素遺伝子が無
い（ＤＨＦＲ−）ことに基づく修飾ＣＨ○をリポソーム
でトランスフェクトする。

Ａ、２　　リポソームのトランス７エフ２１フ５ 殖させた細胞を、トランスフェクションする前日にトリ
プシン処理して置換し、翌日には全面成長の７０−８０
％に達しているようにする。トランスフェクトするプラ
スミドＤＮＡを濃度にして水５０μｑ中、ＤＮＡｌ０μ
ｇにまで希釈し、次いてそれにリボフェクチン”（Ｌｉ
ｐｏｆｅｃｔ　ｉｎＴ′４）　（ギブコ）５０μＱを加
え、全体をポリスチレン管に入れる。１５分経過後、得
られた混合物を、オブチメン（ＯＰＴＩＭＥＮ）培地（
ギブコ）で前もって洗浄した細胞に加える。このように
して得た細胞を８時間インキユベートシ、次いでウシ胎
仔血清を含有する通常の培地を加え、継続して増殖させ
る。

この方法のトランスフェクションのための緩衝液は、２
倍に濃縮したＢＢＳ（２ＸＢＢＳ）および０、２５Ｍ　
ＣａＣｌ２ｚである。２ＸＢＢＳは以下のようにして調
製する：５０ｍＭＮ，Ｎービスー２−（ヒドロキシエチ
ル）−２−アミノエタンスルホン酸［カルビオケム（Ｃ
ａｌｂｉｏｃｈｅｎ）］、２２８０ｍＭＮａＣＱ、およ
び１　、　５　ｍＭ　Ｎ　ａｔ　Ｈ　Ｐ　Ｏ　４を水に
溶解し、そのｐＨを６　５とし、次いでその全体を０．
４５μ屑で濾過し、同時に２．５Ｍ　ＣａＣＱｔの溶液
として１０ｘＣａＣＣｔを調製する。

細胞を５Ｘ１０’細胞／１０ｃｘ平板／増殖培地１０Ｒ
（２で植え付け、３５°Ｃで一晩インキユベートする。

プラスミド２０μｇを、０．２　！５Ｍ　ＣａＣｌ２ｚ
、５μｇおよび２ＸＢＢＳ　　０．５Ｒ（２と混合する
。

この混合物を環境温度で１５分間インキュベートする。

次いで、得られた混合物を培地に染み込ませ、そのすべ
てを３％二酸化炭素中、３５°Ｃで一晩インキュベート
シた。本発明のベクターを有する安定な形質転換細胞を
得るため、ｈβ−ＮＧＦを発現するベクターであるｐｓ
Ｖ　２Ｎ６０ベクターを比率１０：ｌで加えてコトラン
スフエクションを行つ。このトランスフェクションの２
日後、得られた細胞をトリプシン処理し、このトランス
フェクションと比較して１０倍低い濃度で平板に植え付
け、１ｚｇ＃（Ｇ４１８硫酸ネオマイシン（ギブコ）を
使用して安定な形質転換体の選択を即座に開始する。次
いで、サザーンプロットにより、その遺伝子構築物の組
込みに関して形質転換体を分析する。

Ａ、４　　発現 発現させるため、１５ｍＭ　Ｈｅｐｅｓおよび１０９ウ
シ胎仔血清を含有するハムス（Ｈａｎ’ｓ）Ｆ　１２／
［ＭＥＨ−２１に、すべての細胞の培地を維持さする。

ｈβ−ＮＧＦを精製するため、その培地を３Ｅ毎に変更
するに当たり、血清不含の新鮮培地と贋換する。

Ｂ、好ましい態様 Ｂ、　１．発現ベクターの構築の説明 ３つの異なるベクターを調製する：第１およこ第２のも
のは、調節要素、それぞれＭＭＴ　Ｖ　（マウス乳癌ウ
ィルス）およびｈＭＴＩＩＡ（ヒトメタロチオネインｎ
ａ）を化学的に誘導することがで岩る２つのベクターで
ある。この方法では、ｈβ−心ＧＦ遺伝子を制御下に発
現させることができる。

それとは対照的に、第３のベクターでは、ｈβ−きＧＦ
を５Ｖ４０（サルウィルス４０）プロモーターの制御下
にクローンする。

Ｂ、２．ｐＭＳＧ発現ベクターにおけるクローニング ｐＭＳＧベクターをファルマシア［アップサラ、スウェ
ーデン］から入手した。この会社の取り扱い説明書にし
たがって、導入する遺伝子を、ＮｈｅＩおよび５ａｉｌ
制限部位間の多重クローニング部位に挿入しなければな
らない。この遺伝子はその最初のＡＵＧによって翻訳さ
れる。この場合、神経成長因子はＭＭＴＶＬＴＲ（マウ
ス乳癌ウィルスの長い末端反復）のプロモーターの制御
下にある。このプロモーターの活性は、糖質コルチコイ
ド、例えばデキサメサゾンを投与することによって誘発
させることができる。この転写では、５ｖ４０の小さな
ｔ−抗原によってスプライシングが起こり、ＳＶ４０の
長いｔ−抗原によってボッアデニル化が起こる。このプ
ラスミドはさらに、安定に形質転換されたＣＨＯＫＩ細
胞を選択するために使用される牛サンチン・グアニン・
ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｘｇｐｔ）の細菌
遺伝子をも含有している。

このプラスミドにおいてプレプロＮＧＦをクローニング
できるようにＰＣＲ手法を利用するに当たり、調節配列
とプレプロＮＧＦのコード化配列との間の距離が可能な
限り天然の距離を保持するよう、開始ＡＵＧの直前に制
限部位を作成する。

２つのオリゴヌクレオチドを合成する；塩基９１２２お
よび９１４７間における第１のものは（ウシリッチのＮ
ａｔｕｒｅ　３０３：８２１．１９８３）は、以下の配
列を有するべきである： Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅゝ’ＧＣＡＴ
ＡＧＣＧＴＡ　ＡＴＧ　ＴＣＣＡＴＣＴＴＧ　ＴＴＣＴ
。

既述のようにして開始ＡＵＧの前の塩基を突然変異させ
、次いで以下の配列を有する合成オリゴを作成する： Ｘｂａｉ　　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ
”　ＴＧＴ　ＣＴＡＧ　ＡＧＴ　ＡＴＧ　ＴＣＣＡＴＧ
　ＴＴＧ　ＴＴＣＴ３このオリゴヌクレオチドを（Ｘｂ
ａＩ）と呼ぶ。９５２１および９３４２間の塩基を含有
する第２のオリゴヌクレオチド（ウシリッチのＮａｔｕ
ｒｅ　３０３：８２１゜１９８３）は、ＰＣＲを行える
この配列と相補的であり、以下の配列を有する； ＣＯＲＩ ”　ＧＧＣＧＧ　ＡＡＴＴ　ＣＴＣＧＧＴＧＧＴＧＧＡ
Ｃ。

このオリゴヌクレオチドは、プレプロＮＧＦを成熟ＮＧ
Ｆに結合することのできるＥｃｏＲＩ部位をその内側に
含有している。このオリゴヌクレオチドを（ＥｃｏＲＩ
）と呼ぶ。

オリゴヌクレオチド合成機を使用し、これら２つのオリ
ゴヌクレオチドを、３３０Ｂ　　ＤＮＡ合成機［アプラ
イド・バイオシステムズ（ＡＰｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ）、米国コの標準的な手法にしたがって、ホ
スホルアミダイト法により固相内に合成する。

これらを、（ａ）５５℃で１２時間アンモニア中で処理
し、（ｂ）減圧遠心機で乾燥し、（ｃ）２．５Ｍ酢酸ア
ンモニウム中に再懸濁し、（ｄ）３容量の冷エタノーノ
喧−２０℃）で沈澱させ、そして（ｅ）８０％冷エタノ
ールで再洗し、水に再懸濁する。２つのオリゴヌクレオ
チドの濃度を分光器によって分析スル。パーキン・エル
マー・セッスのＤＮＡサーマル・サイクラ−・アンプリ
フィケーター［Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｎｅｒ　Ｃｅｔｕｓ
　ＤＮＡ　Ｔｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ａｍｐ１３ｒ
ｉｃａｔｏｒ］によって増幅操作を行い、その増幅のた
めに関連したＤ　Ｎ　Ａ　”アンブリファイア−［パー
キン・エルマー−セツス］キットの試薬を使用する。手
短に説明すれば、２００μＭの各オリゴヌクレオチド、
それぞれ０．５μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、
ｄＧＴＰオリゴヌクレオチド、およびヒトＤＮＡ０．１
μｇを含有する混合物、および０．５単位のＴＡＱポリ
メラーゼを含有する全混合物中１００μｇの反応緩衝液
を使用し、そのすべてをパラフィン油で被覆して蒸発を
防ぐ。ヒトＤＮＡの場合はその装置を３５サイクルで操
作して増幅反応を行う。両方の場合ともそのサイクルは
以下のようである１９４℃で１分、４５℃で２分、７２
°Ｃで３分。３００ｂｐの増幅したフラグメントは、ジ
ェ不クリーン０８キット［ＢＩＯ１０１Ｉｎｃｌ、う・
ジョラ、カリフォルニア、米国］を使用してアガロース
を融解することによって、低融解アガロース［ヌンーブ
（ＮｕＳｉｅｖｅ）］ケル中でｔｉｄＲシた。得られた
ＤＮＡをＸｂａｉおよびＥｃｏＲＩ制限酵素で切断し、
既述のように再精製する。このようにして精製したフラ
グメントをｐＧＥＭ４ベクター［プロメガ（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ）　］のＸｂａｉおよびＥｃｏＲＩ部位にクローン
する。この濁られたプラスミドをｐＧＥＭ４Ｘｂａ−Ｎ
ＧＦと呼ぶ。

このプラスミド（ｐＧＥＭ４Ｘｂａ−ＮＧＦ）をＨｉｎ
ｄｍ−ＥｃｏＲＩ部位で切断し、得らしｔ：３００　ｂ
ｐフラグメントを精製し、ｐＵ０１８ＢＢＧ２６ベクタ
ー［ブリティッシュ・バイオテクノロジー、Ｌｔｄ、　
（Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｔ
ｄ、　）、オックス７を一ド、英国］のＨ１ｎｄｌＩｆ
−Ｅ　ｃｏＲＩ部位にクローンする。ｐＬＪｃ１８ＢＢ
Ｇ２６はｈβ−ＮＧＦを構成するカセットの遺伝子を含
有しており、すなわちその配列の内側には、天然のもの
ではないので、決定したドメインを置換することのでき
る制限部位、換言すれば突然変異を行うことのできる制
限部位が作成されている。この得られたベクターをｐＵ
Ｃ１８ｈＮＧＦｃと呼ぶ。このベクターをＢａｍＨｌで
切断し、タレノーポリメラーゼによって５°において伸
長部をコピーする。それをＸｂａＩ部位で切断し、得ら
れた７６０ｂｐフラグメントをアガロースゲルによって
精製する。このフラグメントをｐＭＳＧ発現ベクターの
Ｎｈｅｌおよび５ｆｆｌａ１部位間にクローンする。ｐ
ＭＳＧｐｈＮＧＦと呼ぶこのベクターを入手するための
要約した図式を第２図に示し、そのベクターの模式図を
第３図に示す。

メタロチオネインＵ　ａ（Ｍ　Ｔ　Ｕ　ａ）はＺｎ”ま
たはＣｄ”°または池の重金属イオンによって誘発させ
ることができ、したがってその発現を制御できるので、
このベクターを調製した。さらに、このプロモーターの
発現を強化するため、ＭＴＩＩａのプロモーターの５’
末端にＳＶ４０エンハンサ−を付加し、同時にＳＶ４０
の小さなｔ−抗原およびポリＡをスプライシングおよび
ポリアデニル化に常に使用する。最初に、以下のように
してメタロチオネインのプロモーターをプレプロｈβ−
ＮＧＦに結合させるニブラスミド（ｐｈＭＴ　Ｉ　Ｉ　
Ａ）を制限酵素ＨｉｎｄＴＩＩおよびＢａｍＨＸで切断
することによってメタロチオネインのプロモーターを単
離シ［カリシ（Ｋａｒｉｎ、　Ｈ，）のＮａｔｕｒｅ　
２９９ニア９７．１９８２］、プロモーターを含有する
得られた８４１ｂｐフラグメントをｐＧＥＭ４ベクター
ロブロメガ・マジソン（Ｐｒ。

ｍｅｇａ　Ｍａｄｉｓｏｎ）、Ｗ＋、米国コのＨ１ｎｄ
ＩＩ［−Ｂ　ａｍＨＩ部位にクローンする。このベクタ
ーをｐＧＥＭ４ｈＭＴＩＩａと呼ぶ。このプロモータ一
部分は、幾つかの天然のコドンを伴って３°側に伸びて
おり、ＡＵＧメチオニンの最初のコドンを含有し、その
直後にＢａｍＨＩ制限部位が見いだされる。ｈＭＴ■ａ
のプロモーターの最初のメチオニンを使用することによ
ってプレプロｈβ−ＮＧＦをこのプロモーターの制御下
にクローニングできるよう、遺伝子を相内に運ぶことが
できるようなりａｍＨＩ制限部位を最初のＡＵＧの直後
に作成した、塩基９１３３および９１６０［ウシリッチ
のＮａｔｕｒｅ　３０３：８２１、１９８３］間のオリ
ゴヌクレオチドを構築する。配列： Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｔ
ｈｒ　Ｌｅｕ　ｌｉｅ”　ＴＧ　ＴＣＣＡＴＧ　ＴＴＧ
　ＴＴＣＴＡＣＡＣＴ　ＣＴＧ　ＡＴＣＡＣ３を有する
合成オリゴヌクレオチドを、以下の配列のように突然変
異させる： ａｍＨｌ ”ＴＧＧ　ＡＴＣＣＡＴＴＧＴＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＧ
ＡＴＣＡＣ３このオリゴヌクレオチドをＢａｍＨＩと呼
ぶ。変化させた塩基はアミノ酸配列の変化をも包含して
おり、実際、ＡｓｐからＳｅｔおよびＰｒｏからＭｅ忙
、それぞれ２番目および３番目のアミノ酸変化を包含し
ている。しかし、この変化はハイドロパシシティーのプ
ロフィルに対してたいした影響はなく、その分子は正常
に分泌される。

このオリゴヌクレオチドはＥｃｏＲＩオリゴヌクレオチ
ドと共に、上記のプレプロＮＧＦの増幅に使用される。

得られた精製フラグメントをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲ
Ｉ部位で切断し、次いでｐＧＥＭ４ｈＭＴＩＩａベクタ
ーのＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位間にクローン
する。そのベクターをｐｃｈＭＴｐｈＮＧＦと呼ぶ。

ＳＶ４０のエンハンサ−（アクチベーター）を得るため
、以下のようにしてＰＭＳＧｐｈＮＧＦプラスミドから
取り出す。ＰＭＳＧｐｈＮＧＦベクターをＢａｍＨｌで
切断し、次いでクレノーポリメラーゼを使用して５゛に
おいて伸長部をコピースル。

次いで、それをＨｉｎｄｌ［［で切断し、得られた５０
０ｂｐ７ラグメントをｐｃ　Ｅ　Ｍ　３のＮａｅＩおよ
びＨｉｎｄＵｌ制限部位間にクローンする。得られたベ
クターをｐＧＳＶ４０と呼ぶ。

発現ベクターを得るため、上記の片を以下のようにフラ
グメントのトリプル・ユニオンで結合スる：　ｐＭＳ　
ＧｐｈＮＧ　ＦベクターをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ
制限酵素で切断し、得られた１５００ｂｐフラグメント
を精製する。ｐＧｈＨＴｐｈＮ　Ｇ　ＦベクターをＨ１
ｎｄｌＩ［−Ｅ　ｃｏＲＩ酵素で切断し、１１００ｂｐ
フラグメントを精製する。これら２つのフラグメントを
共に、ｐＧＳＶ４０ベクターのＨｉｎｄＩＩＩおよびＢ
ａｍＨＩ制限部位間にクローンする。ｐＳＶ４０ＭＴｐ
ｈＮＧＦと呼ばれるこの発現ベクターを得るための要約
した図式を第４図に示し、このベクターの模式図を第５
図に示す。

このベクターｐｓＶ４０ＭＴｐｈＮＧＦを、ｐＳＶ２Ｎ
ｅｏプラスミドと共に二重トランスフェクションとして
ＣＨＯＫＩ細胞に安定に導入し、既述のようにｌ１ｇ／
ｆｆ１２ネオマイシンＧ４１８（ギブコ、ＢＲＬ）によ
って選択する。このプラスミドをｐｈＭＴプラスミドと
共にコトランスフェクトし、高いコピー数を含有するコ
ロニーを選択する。この場合、ＣＨＯＫＩ細胞を５０ｍ
Ｎ硫酸亜鉛に２４時間暴露し、メタロチオネインの合成
を誘発させて、濃度２．５μＭから始めて２０μＭまで
の濃度の塩化カドミウムを使用して選択する。ｈＮＧＦ
の高いコピー数を含有する細胞をこの分子の発現に使用
する。

ｐＧＥＭ４ＸｂａＮＦプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩおよ
びＥｃｏＲＩ制限酵素で切断し、得られた３００ｂｐフ
ラグメントをｐＳＶ４０　ＭＴ、ｐｈＮＧＦベクターの
ＨｉｎｄＩ［ＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位間に置換する
。ｐＳ　Ｖ　４０ｐｈＮＧ　Ｆと呼ばれるこのベクター
を得るための要約した図式を第６図に示し、そのベクタ
ーの模式図を第７図に示す。

これは、調節配列がＳＶ４０プロモーター／エンハンサ
−に帰属される標準的な構築ベクターである。このベク
ターをＣ）（ＯＫＩ細胞内にｐＳＶ２Ｎｅｏプラスミド
と共にコトランスフェクトし、神経成長因子のβ−ポリ
ペプチドを産生ずるクローンを分析する。

ＣＨＯＫｌ　　ｄｈｆｒ細胞における選択前述のベクタ
ーの遺伝子をＣＨＯＫＩ　　Ｄｆｈｒ内で増幅させるた
め、ＤＨＦＲ＋の遺伝子をｈＮＧＦの遺伝子から上流に
クローニングするこトニより、そのベクターを実質的に
修飾する。ＤＨＦＲ＋をコードしているｐｓＶ２ｄｈｆ
ｒベクターをＨｉｎｄＩ１１部位で切断し、次いでポリ
メラーゼを使用して５゛において伸長部をコピーする。

次いで、それをＢａｍＨ部位で切断し、得られた１８０
０ｂｐフラグメントを、ｐｓＶ４０ｈＮＧＦベクターに
おけるＸｈｏＩ制限部位（上記のようにポリメラーゼに
より平滑末端にした）、およびＢａｍＨＩにクローンす
る。このようにして、ｐｓＶ４０ｈＮＧＦ発現−選択プ
ラスミドを作成する。このベクターの要約した図式を第
８図に示す。

このプラスミドを、ヌクレオチドを含有しておらず、１
０％ウシ胎仔胎仔を含有するアルファＭＥＭ培地中のＣ
ＨＯＫＩ細胞に普通にトランスフェクトする。２日後、
細胞をトリプシン処理し、前述の濃度のｌ／１０にし１
．ＭＴＭ（メトトレキサート）１０μＭから５００μＭ
までを使用して増幅を行う。最高濃度でも生存している
細胞を、ｈＮＧＦの発現に使用する。

生物学的活性の測定 既述の３つのベクターのうちの１つを挿入した後、それ
らを安定化した後のＣＨＯセルライン培養培地中におけ
る生物学的活性を測定するためのインビトロ試験を、ク
ロム親和性細胞腫胎児細胞ｐｃ−１２において行う［グ
リーン（Ｇｒｅｅｎｅ　Ｌ、　Ａ、　）らのＲｅｖ、　
Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　３：３５３．１９８２］。非形質
転換ＣＨＯセルラインが増殖している培養培地を使用す
るか、または培養培地中に存在するｈβ−ＮＧＦの活性
をネズミ起源もしくはウシ起源のＮＧＦに特異的なポリ
クローナル抗体により阻害することによって、この反応
の特異性を確認する。既述の個々のベクターによって形
質転換されて安定化されている３つのセルラインは、ヒ
トＮＧＦのβ−サブユニットをその生物学的な活性型で
産生ずる。

医薬組成物 本発明のｈβ−ＮＧＦは、医薬的に有用な組成物を製造
するための既知の方法によって製剤化することができる
。既述した組換えＤＮＡによって得られたヒトＮＧＦ分
子（β〜サブユニット）を含有する、ガングリオシドお
よびリン脂質をも含有することある医薬組成物の製剤化
方法は、患者に投与することのできる医薬的に許容され
得る組成物を調製するための既知の方法を包含し、それ
により、医薬的に許容され得るビヒクルと共に混合物中
に混合し得るｈＮＧＦ分子の有効量を調整することがで
きる。適当なビヒクル、および他のタンパク質を含有す
るその製剤は、例えば［レミングトンの医薬科学Ｊ　［
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ
ｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、マツグ・パフリッシング・カンパ
ニーイーストン、　Ｐａ、　、米国、　１９８５］に記
載されている。

これらのビヒクルには、注射用の［沈渣製剤（ｄｅｐｏ
ｓｉｔ　ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）Ｊが包含される。

これらのことに基ついて、本発明の医薬製剤には、適切
なｐＨに緩衝化するために、および生理学的液と等強性
にするために加えられる、１つまたはそれ以上の医薬的
に許容され得るビヒクルまたは希釈剤を共に含有する神
経成長因子の溶液剤、またはその凍結乾燥粉末剤が包含
されるが、これらは総括的なものではない。凍結乾燥剤
を調製する場合は、例えばマンニトールまたはグリシニ
ン（ｇｌｙｃｉｎｉｎ）などの支持賦形剤を使用すれば
よく、また所望のｐＨを有する適切な等張性緩衝化溶液
を得るためには、所望の容量の適当な緩衝化溶液を調製
する。所望の容量の等偏性溶液中にある、組換えＤＮＡ
によって得られた神経成長因子の分子の医薬組成物のた
めの製薬的溶液として、上記と同様の溶液を使用するこ
とができ、それには毎度所望のｐＨ１例えば中性ｐトｔ
の等強性医薬調製物を得るために適当な濃度のリン酸塩
またはクエン酸塩を含有する生理学的緩衝化溶液を使用
すること、か包含されるが、それに限定されない。

本発明の医薬製剤としてはさらに、水溶性の自動乳化性
のグリコゼラチン型またはその他のものなどの凍結乾燥
した賦形剤を含有する直腸投与用の串刺が挙げられるが
、それに限定されない。この調製物では、組換えＤＮＡ
によって得られた神経成長因子を全賦形剤の重量に対し
て０９０１％から１７１％の含量で存在させればよい。

この串刺には、適量のアセチルサリチル酸塩を含有させ
ることができるが、それに限定されない。

上記医薬調製物は経口、経直腸、腸管外、局所、吸入用
、脳内に適用することを目的とすることができる。した
がって、それは固形または半固形型であり、例えば糖衣
錠、錠剤、ゼラチン様ふた（ｇｅｌａｔｉｎｏｕｓ　ｏ
ｐｅｒｃｕｌａ）、カプセル剤、串刺、ゼラチン軟カプ
セルなどである。腸管外または脳内通用のためには、筋
注、皮下投与用の剤形、または静脈内もしくは脳内注入
もしくは注射に適切な剤形を選択する。したがって、そ
れには、活性物質の溶液剤、および活性物質の凍結乾燥
粉末剤であって、それらの用途に適切な、かつ生理学的
液に適合する浸透性を有する１つまたはそれ以上の医薬
的に許容され得る賦形剤または希釈剤が組み合わされた
ものを挙げることができる。局所投与用には、通常使用
するものとしてクリームまたは軟膏の剤形の調製物が考
えられ、吸入用には鼻腔スプレーなどのスプレー剤の調
製物か考えられる。

本発明の調製物は、ヒトまたは動物に投与することがで
きる。溶液剤、スプレー剤、軟膏およびクリームでは活
性成分を０．０１％から１０％含有し、固形剤の調製物
では活性成分を５％から５０％含有するものが好ましい
。投与すべき剤形は、適応症、所望の効果、および選択
した投与方法によって変動する。

本発明はさらに、神経成長因子ＮＧＦのβ−サブユニッ
トとガングリオシドまたはその誘導体との新規複合体に
おける既述の適応症に対する用途に関する。ヒトに対す
る注射（皮下または筋注または脳内）の毎日の投与量は
、体重１ｋｇ当たり活性物質０．０５ｍｇから５ｍｇと
種々変動する。

これまで本発明を説明してきたが、本明細書に記載した
方法が種々の態様で改変できることは明らかである。こ
のような改変は、本発明の思想および範囲から逸脱する
ものと解してはならず、当業者にとって自明と考えられ
るすべての改変は、本発明の特許請求の範囲内に包含さ
れるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒト起源の神経成長因子β−サブユニノトハ
イドロババラティーのプロフィルヲ示スゲラフであり、
第２図は、ｐＭＳＧｐｈＮＧＦ発現ベクターの構築法を
示す模式図であり、第３図は、ｐＭ　Ｓ　ＧｐｈＮ　Ｇ
　Ｆ発現ベクターの模式図であり、第４図は、ｐＳ　Ｖ
　４０ＭＴｐｈＮＧ　Ｆ発現ベクターの構築法を示す模
式図であり、第５図は、ｐＳＶ４０ＭＴｐｈＮＧＦ発現
ベクターの模式図であり、第６図は、ｐＳ　Ｖ　４０ｐ
ｈＮＧ　Ｆ発現ベクター（１）構築法を示す模式図であ
り、第７図は、ｐｓＶ４０ｐｈＮＧＦ発現ベクターの模
式図であり、そして第８図は、ｐＳＶ４０ｈＮＧＦ発現
ベクターの構築法を示す模式図である。 ！！許出出願人　フイディーア・ソシエタ・ベル・アチ
オニ 代　理　人　弁理士　青白　葆　（外１名）第６図 第８図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）ヒトβ−ＮＧＦをコードしている第１のＤＮ
   Ａ配列、 （ｂ）該第１のＤＮＡ配列の５’末端に融合している、
   プレプロヒトβ−ＮＧＦをコードしている第２のＤＮＡ
   配列、 （ｃ）該第２のＤＮＡ配列の５’末端に直接融合してい
   るプロモーター−エンハンサー調節要素を含有している
   複製可能な発現ベクターであって、該ベクターによって
   形質転換された適当な哺乳動物細胞における発現のため
   のヒトβ−ＮＧＦをコードしている該発現ベクター。 ２、該調節要素がマウス乳癌ウィルス（ＭＭＴＶ）プロ
   モーターである請求項１に記載の複製可能な発現ベクタ
   ー。 ３、該調節要素がヒトメタロチオネインIIａ（ｈＭＴＩ
   ＩＡ）プロモーターである請求項１に記載の複製可能な
   発現ベクター。 ４、該調節要素がＳＶ４０プロモーターである請求項１
   に記載の複製可能な発現ベクター。 ５、請求項１から請求項４までのいずれかに記載の発現
   ベクターによって形質転換されている組換え宿主細胞。 ６、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である
   、請求項４に記載の組換え宿主細胞。 ７、（ａ）プレプロＮＧＦと結合することのできるＥｃ
   ｏＲ I 制限部位を有する第１の３ＯＯｂｐＤＮＡフラ
   グメントを調製し、 （ｂ）該第１の３００ｂｐＤＮＡフラグメントを、ヒト
   β−ＮＧＦをコードしている遺伝子を含有する第１のプ
   ラスミドのＨｉｎｄIIIおよびＥｃｏＲ I 制限部位間に
   クローニングし、第２のプラスミドを調製し、 （ｃ）該第２のプラスミドをＢａｍＨ I およびＸｂａ
   I で切断し、７６０ｂｐフラグメントを調製し、（ｄ
   ）該７６０ｂｐフラグメントを、ヒトβ−ＮＧＦ遺伝子
   のためのプロモーターを含有するプラスミドにクローニ
   ングし、第３のプラスミドを調製し、 （ｅ）該第３のプラスミドを切断して、該プロモーター
   および該ヒトβ−ＮＧＦ遺伝子を含有するＮＧＦ遺伝子
   −含有フラグメントを単離し、（ｆ）該ＮＧＦ遺伝子−
   含有フラグメントおよびプレプロβ−ＮＧＦＤＮＡ配列
   をプラスミドにクローニングし、該ヒトβ−ＮＧＦ遺伝
   子に隣接するプレプロβ−ＮＧＦＤＮＡ配列と隣接して
   いる該プロモーターを含有するプラスミドを得る、こと
   を特徴とする、ヒトβ−ＮＧＦをコードしている発現ベ
   クターの調製方法。 ８、（ａ）配列： 【遺伝子配列があります】 を有するＸｂａ I オリゴヌクレオチドを調製し、（ｂ
   ）配列： 【遺伝子配列があります】 を有するＥｃｏＲ I オリゴヌクレオチドを調製し、（
   ｃ）該Ｘｂａ I および該ＥｃｏＲ I オリゴヌクレオチ
   ドをｐＧＥＭ４ベクターのＸｂａ I およびＥｃｏＲ I
   制限部位にクローニングし、ｐＧＥＭ４Ｘｂａ−ＮＧ
   Ｆプラスミドを調製し、 （ｄ）該ｐＧＥＭ４Ｘｂａ−ＮＣＦプラスミドをＨｉｎ
   ｄIIIおよびＥｃｏＲ I 部位で切断し、第１の３００ｂ
   ｐフラグメントを調製し、 （ｅ）該第１の３００ｂｐフラグメントをｐＵＣ１８Ｂ
   ＢＧ２６プラスミドのＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲ I 部位に
   クローニングし、ｐＵＣ１８ｈＮＧＦｃを調製し、（ｆ
   ）該ｐＵＣ１８ｈＮＧＦｃをＢａｍＨ I およびＸｂａ
   I 部位で切断し、７６０ｂｐフラグメントを調製し、 （ｇ）該７６０ｂｐフラグメントをｐＭＳＧベクターの
   Ｎｈｅ I およびＳｍａ I 部位にクローニングし、ｐＭ
   ＳＧｐｈＮＧＦプラスミドを調製し、 （ｈ）ｐＢＲ３２２をＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨ I で
   切断することにより、メタロチオネインIIａ（ＭＴＩＩ
   ａ）プロモーター−含有フラグメントを単離し、（ｉ）
   該ＭＴＩＩａプロモーター−含有フラグメントをｐＧＥ
   Ｍ４ベクターのＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨ I 部位にク
   ローニングし、ｐＧＥＭ４ｈＭＴＩＩａベクターを調製
   し、 （ｊ）プレプロＮＧＦＤＮＡ配列をＢａｍＨ I および
   ＥｃｏＲ I で切断し、得られたフラグメントをｐＧＥ
   Ｍ４ｈＭＴＩＩａのＢａｍＨ I およびＥｃｏＲ I 制限
   部位間にクローニングし、ｐＧｈＭＴｐｈＮＧＦを調製
   し、 （ｋ）ｐＭＳＧｐｈＮＧＦをＢａｍＨ I で切断し、ク
   レノーポリメラーゼによって５’延長部をコピーし、Ｈ
   ｉｎｄIIIで切断し、次いで得られた５００ｂｐフラグ
   メントをｐＧＥＭ３のＮａｅ I およびＨｉｎｄIII部位
   間にクローニングすることにより、ｐＧＳＶ４０を調製
   し、 （１）ｐＧｈＭＴｐｈＮＧＦをＨｉｎｄIIIおよびＥｃ
   ｏＲ I で切断して第１のフラグメントを得、ｐＭＳＧ
   ｐｈＮＧＦをＥｃｏＲ I およびＢａｍＨ I で切断して
   第２のフラグメントを得、そして該第１および第２のフ
   ラグメントをｐＧＳＶ４０のＨｉｎｄIIIおよびＢａｍ
   Ｈ I 部位間にクローニングすることにより、ｐＳＶ４
   ０ＭＴｐｈＮＧＦを調製する ことを特徴とする、ヒトβ−ＮＧＦをコードしている発
   現ベクターの調製方法。 ９、請求項１から請求項５までのいずれかに記載のベク
   ターによって形質転換されている組換え宿主細胞におい
   て発現させ、そのようにして産生されたヒトβ−ＮＧＦ
   を回収することを特徴とする方法。 １０、請求項６に記載の組換え宿主細胞を発現させ、そ
   のようにして産生されたヒトβ−ＮＧＦを回収すること
   を特徴とする方法。 １１、請求項９に記載の方法によって産生されたヒトβ
   −ＮＧＦポリペプチド。 １２、請求項１０に記載の方法によって産生されたヒト
   β−ＮＧＦポリペプチド。 １３、ヒト起源の夾雑タンパク質を伴わない請求項１１
   に記載のポリペプチドを医薬的に許容され得る担体また
   は希釈剤と共に含有してなる医薬組成物。 １４、ヒト起源の夾雑タンパク質を伴わない請求項１２
   に記載のポリペプチドを医薬的に許容され得る担体また
   は希釈剤と共に含有してなる医薬組成物。