CN101260398B - 神经生长因子基因定位改造动物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过转基因方法获得的动物及其制备方法和应用。具体地，本发明涉及利用胚胎干细胞(ES)培养技术和同源重组技术将目的基因定位整合到小鼠基因组中，从而获得稳定表达目的基因的转基因动物。该方法得到的动物可以应用于基础研究和获得目的蛋白。更具体地本发明涉及使用神经生长因子基因定位改造小鼠及其制备人源性神经生长因子及其突变体蛋白质的方法和应用。
Description
技术领域
本发明涉及通过转基因方法获得的动物及其制备方法和应用。具体地，本发明涉及利用胚胎干细胞（ES）培养技术和同源重组技术将目的基因定位整合到小鼠基因组中，从而获得稳定表达目的基因的转基因动物。该方法得到的动物可以应用于基础研究和获得目的蛋白。更具体地本发明涉及使用神经生长因子基因定位改造小鼠及其制备人源性神经生长因子及其突变体蛋白质的方法和应用。
背景技术
神经生长因子（Nerve Growth Factor,NGF）是最早被发现和被证实的细胞生长调节因子,也是研究得最清楚的神经营养因子[Ho JL,He S,Hu A等人，J Exp Med,1995,181(4):1493-1505.]。NGF在神经系统的神经干细胞的增殖、分裂转化和神经元的发育、轴突的生长、递质的合成及细胞的凋亡等阶段均起着重要作用[Sayada C,Denamur E,Elion J等人，Gene,1992,120(1):129-130.]。其促进胚胎和发育中交感、感觉神经元的分化和成熟，还参与维持成年交感神经元的正常功能和营养支持成年感觉神经元[Zhang D,Yang X,Berry J,等人，J In2fect Dis,1997,176(4):1035-1040.]。中枢神经系统的基底前脑胆碱能神经元和纹状体的胆碱能中间神经元的发育、分化也受到NGF的调节[Pal S,Barnhart KM,Wei Q,等人Vaccine,1999,17(5):459-465.]。由于NGF生物功能的重要性，表明它具有重要的临床应用价值。人NGF是由α、β和γ3种肽链以α2β2γ2的形式,通过非共价键结合而成的。进一步发现其中β亚单位具有神经生长因子完全的生物学功能,它是由2个118氨基酸通过非共价键结合而成的二聚体，每个单体内有3组二硫键，3个二硫键的正确形成对蛋白的折叠起重要作用，进而影响到β-NGF的生物学活性（Cys58-Cys108,Cys68-Cys110，Cys15-Cys80）。由于人NGF在体内含量甚微，而且受人体材料来源的限制，使人β-NGF不可能大规模生产。许多人曾尝试用基因工程的方法生产人β-NGF，但由于β-NGF在细菌、酵母的表达系统中不能正确进展和修饰以及二聚体化，以至于得到的表达产物缺少活性（DeBernardez Clark E,Schwarz E,Rudolph,R等人，1999;309:217-36.Ikemura H,Takagi H,Inouye M,等人，J Biol Chem.1987 Jun 5;262(16):7859-64.NishizawaM,Ozawa F,Higashizaki T,等人，Appl Microbiol Biotechnol.1993Feb;38(5):624-30.）。利用哺乳动物细胞表达人β-NGF在理论上存在较大的优势，但表达量较低，难以规模化（C.ANTHONY ALTAR,Louis E.BURTONt,GREGORY L。Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.88,pp.281-285,January 1991）。而且可能其生物学活性并不等同于从人体中提取得到的NGF。例如，美国的Genentech公司开发的重组人NGF三期临床结果并不理想。所以虽然重组人NGF已经在多种生物中（细菌、酵母、CHO细胞昆虫和细胞）被表达，并且被作为用于治疗的药物已经研究了很长时间，但都还没有作为药品被批准使用。
由于众多人类基因在小鼠中有同源性并且小鼠繁殖期短、个体较小易于养殖，因此，小鼠是研究哺乳动物和人类基因功能的模式生物。过去的许多年已经通过对小鼠进行基因突变处理获得了许多种表达外源蛋白质的小鼠。NGF的生物学作用以及NGF与其受体的相互作用的研究一直是神经和发育生物学研究的热点。Crowley利用基因敲除技术将小鼠的NGF基因破坏，观察对神经发育的影响（Crowley C,Spencer SD,Nishimura MC,等人Cell.1994 Mar25;76(6):1001-11.）。实验证实感觉和交感神经元对NGF有严格的依赖性，其它神经营养因子不能弥补NGF对这些神经元的作用。另外Smeyne等敲除了NGF的细胞高亲合力受体TrkA,以考察TrkA在神经发育中的作用（Smeyne RJ,Klein R,Schnapp A,et al.Nature.1994 Mar 17;368(6468):193-4.）。但NGF和TrkA整体基因敲除后的小鼠在胚胎发育中死亡或出生后生命力低下，这可能是由于NGF或其受体在发育过程中存在重要的作用，所以这种基因敲除小鼠对研究NGF与其受体的特异作用方面存在局限性。因此，如何对小鼠的NGF基因进行改造以稳定表达小鼠NGF蛋白质的突变体蛋白是本领域仍未解决的问题。
成年雄性小鼠颌下腺内NGF的含量很高，而且由于小鼠繁殖快，便于饲养，所以小鼠可以成为提取和纯化NGF的良好来源。目前上市的β-NGF就是从小鼠颌下腺中提取得到的。但与鼠源性的NGF相比，人NGF在啮齿类动物和变态反应性脑脊髓炎及帕金森氏病的实验模型中都有更好的治疗效果；而且人源神经生长因子相比鼠源NGF具有更小的免疫原性，在人体内更具有稳定性和安全性。80年代末以来，在基因打靶技术的基础上发展起来的基因敲入（knock-in）技术，为我们生产人NGF提供了新的途径。通过同源重组技术以及小鼠ES细胞培养技术将人的NGF基因替换了小鼠的NGF基因，从这种转基因小鼠的颌下腺中可以提取到大量的成熟人β-NGF蛋白，可用于研究和规模化生产。
但这一转基因方法的用途并不局限于此。例如，NGF的生物学作用以及NGF与其受体的相互作用的研究一直是神经和发育生物学研究的热点。Crowley利用基因敲除技术将小鼠的NGF基因破坏，观察对神经发育的影响（Crowley C,Spencer SD,Nishimura MC,et al.Cell.1994 Mar25;76(6):1001-11.）。实验证实感觉和交感神经元对NGF有严格的依赖性，其它神经营养因子不能弥补NGF对这些神经元的作用。另外Smeyne等敲除了NGF的细胞高亲合力受体TrkA,以考察TrkA在神经发育中的作用（SmeyneRJ,Klein R,Schnapp A,et al.Nature.1994 Mar 17;368(6468):193-4.）。但NGF和TrkA整体基因敲除后的小鼠在胚胎发育中死亡或出生后生命力低下，这可能是由于NGF或其受体在发育过程中存在重要的作用，所以这种基因敲除小鼠对研究NGF与其受体的特异作用方面存在局限性。体外突变得到的NGF突变体为研究NGF与其受体的作用提供了良好的基础。例如利用只与TrkA结合而不与其低亲合力受体P75结合的突变体NGF可以考察P75的作用，使研究更有目的性、针对性和特异性（Horton A,Laramee G，Wyatt S,等人，Mol CellNeurosci.1997;10(3-4):162-72.Ryden M,Hempstead B,Ibanez CF,等人，JBiol Chem.1997 Jun 27;272(26):16322-8）。我们利用基因敲入技术将突变的NGF构建入了小鼠中，得到了NGF突变体小鼠。为在整体动物水平上研究NGF突变体及其受体功能研究开辟了新的道路。同时也为在体内筛选和纯化高活性和安全性的NGF突变体开辟了一条新的途径。
发明内容
根据本发明的一个目标是提供一种转基因动物，其中该动物基因组中的NGF-β基因被改造，进而该动物表达该种动物NGF-β的突变体蛋白质。
在本发明中所使用的术语“动物”是指其基因组包含NGF-β基因的动物，例如但不限于啮齿类、猪、猫、人、鸡、蛇、蛙、鱼等，其中优选啮齿类动物例如小鼠、大鼠等，最优选小鼠。
在本发明中所使用的术语“该种动物NGF-β的突变体蛋白质”是指具有NGF-β蛋白质活性的突变体蛋白质，具有至少70%的同源性，优选至少80%的同源性，更优选至少90%的同源性蛋白质，例如可以是具有人NGF-β蛋白质的氨基酸序列的蛋白质。
在本发明中，氨基酸序列的同源性，通常可通过已知的软件或电脑程序如BestFit或Gap配对比较程序进行确定。
在本发明中，转基因动物的基因组中至少一条染色体上的NGF-β基因被目的基因或其突变体基因所替换。优选的是，转基因动物的基因组中全部的NGF-β基因被外源目的基因或其突变体基因所替换。
本发明进一步的目标是提供一种制备转基因啮齿类动物的方法，其特征在于通过同源重组技术使所述动物基因组中的NGF-β基因被改变，从而表达该种动物NGF-β基因的突变体蛋白质。
根据本发明的一个方面，提供了一种获得转基因啮齿类动物的方法，其中通过同源重组技术使所述动物的NGF-β基因被改变，进而使该动物表达该动物NGF-β的突变体蛋白质，其中，所述NGF-β的突变体蛋白质为SEQ IDNO:23所示基因编码的人源NGF-β蛋白质；所述啮齿类动物为小鼠；所述同源重组技术包括以下步骤：
1）构建打靶载体，其中所述载体含有SEQ ID NO:23所示的人源NGF-β蛋白质编码基因；
2）使用步骤1）中所构建的打靶载体转染小鼠胚胎干细胞；
3）制备供体囊胚；
4）将步骤2）中获得的经过转染的小鼠胚胎干细胞显微注射入步骤3）中所获得的供体囊胚中；
5）将步骤4）中所获得的供体囊胚转移到受体动物的子宫中；以及
6）获得转基因动物。
在构建打靶载体中，同源臂的长度对打靶效率影响很大，原则上同源臂越长，发生同源重组的几率就越大，所以大多数载体同源臂的长度在5～8Kb之间。同源臂和正负选择标记的相对位置决定了只有通过同源重组打靶成功的克隆才能通过药物培养基被筛选出来。但为了进一步确定是否打靶成功，通常采用PCR的方法进行验证，设计引物时采用的原则是：一个引物同正选择标记基因序列退火，另一个引物同打靶载体外侧相临的基因组序列退火。由于PCR扩增的效率取决于两个引物之间的距离，所以通常情况下，两侧的同源臂长度是不对称的。有长短臂之分，以便于PCR进行检测。同时长臂要足够长，保证有足够的同源序列形成染色体交换复合体。为了增加同源重组的几率，并避免过长而造成实验操作上的困难以及后续检测中的复杂性，优选短臂的长度为1～10Kb，其中优选2Kb。优选长臂的长度为1～10Kb，其中优选3～8Kb，最优选5Kb。
对于载体的选择，正如本领域中所熟知的，载体是能够或者辅助将实体从一种环境转入其它环境的工具。某些在重组DNA技术中所使用的载体能够使例如DNA片断（例如异源DNA片断例如异源cDNA片断）被转入寄主内和/或靶细胞内，以达到复制该含有本发明中所使用的和/或表达本发明所使用蛋白质的核苷酸序列的载体的目的。在重组DNA技术中所使用的载体的例子包括但不限于质粒、染色体、人工染色体或病毒。在本发明中所使用的载体包括但不限于pLoxPneo、pPNT等质粒载体。
本发明还涉及使用根据本发明所制备的转基因啮齿类动物生产该动物NGF-β突变体蛋白质的方法，其包括以下步骤：
1）根据本发明所述的方法培养啮齿类动物，其中，所述啮齿类动物为小鼠；
2）从步骤1）中所培养的动物的组织中提取目标蛋白，其中，所提取的目标蛋白是SEQ ID NO:23所示基因编码的人源NGF-β蛋白质；其中，所述的组织为颌下腺。
对于所述的提取目标蛋白的动物组织没有特别的限定，例如包括但不限于颌下腺。
在本发明中所生产的该种动物NGF-β的突变体蛋白质”是指具有NGF-β蛋白质活性的突变体蛋白质，与该种动物NGF-β蛋白质的氨基酸序列具有至少70%的同源性，优选至少80%的同源性，更优选至少90%的同源性蛋白质，例如可以是具有人NGF-β蛋白质的氨基酸序列的蛋白质。
进一步，本发明还提供了通过本发明所提供的制备NGF-β蛋白质突变体的方法所制备的小鼠NGF-β蛋白质的突变体。其中在本发明中小鼠NGF-β蛋白质的突变体是指具有NGF-β蛋白质活性的突变体蛋白质，与小鼠NGF-β蛋白质的氨基酸序列具有至少70%的同源性，优选至少80%的同源性，更优选至少90%的同源性蛋白质，例如可以是具有人NGF-β蛋白质的氨基酸序列的蛋白质。
所制备的NGF-β蛋白质可以被制成药学上可以接受的药物组合物。在本发明中，药物组合物是一种含有药学有效量的药学活性药物或由药学有效量的药学活性药物组成的组合物。其优选含有药学上可以接受的载体、稀释剂或赋形剂（包括其组合）。用于治疗应用的可以接受的载体或稀释剂是药物领域中熟知的。对药物载体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据所期望的给药路线和标准的药物实践而选择。所述药物组合物可以包括（或另外）赋形剂或稀释剂、任何适当的粘结剂、润滑剂、悬浮剂、包被剂、溶剂。药学上可以接受的载体的例子包括例如水、盐溶液、乙醇、硅树脂、蜡、凡士林油、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖、凝胶、乳糖、淀粉糖、硬脂酸镁、云母、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、香精油、脂肪酸单甘油酯和二甘油脂、石油烃脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
附图说明
图1A是pLoxPneo载体质粒的结构示意图，图1B是打靶载体pm-hNGF的结构示意图，图1C是的打靶载体pm-hNGF的构建过程示意图；
图2A是打靶载体pm-mNGF的结构示意图，图2B是打靶载体pm-mNGF的构建过程示意图；
图3是人NGF成熟肽基因定位整合小鼠胚胎干细胞的鉴定的Southern印迹结果示意图；
图4是人NGF成熟肽基因定位整合小鼠胚胎干细胞的鉴定的PCR结果示意图；
图5是β-NGF突变体基因定位整合小鼠胚胎干细胞的鉴定的Southern印迹结果示意图；
图6是人β-NGF基因定位整合小鼠的PCR鉴定基因型结果示意图；
图7是人β-NGF成熟肽基因定位整合小鼠的鉴定的Southern杂交鉴定结果示意图；
图8是β-NGF突变体基因定位整合小鼠的鉴定的Southern印迹鉴定结果示意图；
图9是利用SDS-PAGE鉴定所提取蛋白质分子量大小结果示意图；
图10是利用等电聚焦电泳测定所提取蛋白的等电点结果示意图；
图11是所提取人神经生长因子的比活测定的结果示意图；
图12是所提取突变NGF的受体结合实验结果示意图。
实施例
实施例1 人NGF成熟肽基因打靶载体的构建。
1）合成下列引物片段：
P1 Eco RI CGGAATTCgtccctagctcacttcattcaagga
P2 ggaagatgggatgggaggatgagcgcttgctccggtgagt
P3 actcaccggagcaagcgctcatcctcccatcccatcttccacaggggcga
P4 gggctgcaggcaagtcaggctcttctcacagcctt
P5 aaggctgtgagaagagcctgacttgcctgcagcccccttccccacct
P6 BglII ACCAGATCTgccatgacaggcctcaggaga
P7 SalI CGGAATTCGTCGACggtttcatgttaagattgcctttgctc
P8 NotI CGGAATTCGCGGCCGCtcctggaaccaggagtcagagggaatggat
2）上游长臂构建：
以小鼠基因组DNA(1μg)为摸板，用引物P1+P2各100ng,Pfu高保真酶2.5单位，dNTP 250μmol/L,2.5mmol/L MgCl2,25mmol/L TrisHCl(pH8.3)进行PCR反应(94℃30秒，55℃30秒，72℃4分，使用Perkin Elmer 9700型PCR仪,共30循环)，PCR产物经1%琼脂糖电泳后用Qiagen Gel Extraction Kit（购自QIAGEN）纯化，获得4.4kb DNA片断；以引物P3+P4各100ng为引物，以人基因组DNA(1μg)为模板进行PCR扩增（条件同上，但72℃延伸时间45秒），获得扩增0.37kb DNA片断，并同样电泳分离纯化；以小鼠基因组DNA为模板，P5+P6各100ng为引物同上条件进行PCR扩增，获得0.65kb DNA片断，并同样进行分离纯化工；将上述3片段各取100ng,混合后为模板，以引物P1+P6各100ng进行PCR扩增（条件同上，72℃延伸时间5分），获得5.4kb DNA片段，并通过同上方法电泳分离纯化。
3）下游短臂构建：
以小鼠基因组DNA为模板(1μg)，引物P7+P8各100ng进行PCR扩增（条件同上，72℃延伸2分），获得2kb DNA片段，并同上通过琼脂糖电泳分离并纯化。
4）打靶载体的构建：
pLoxPneo载体质粒（图1A）用Eco RI+Kpn I(Biolabs,下同)酶切，通过1%琼脂糖电泳后，用Qiagen Gel Extraction Kit纯化；上游长臂DNA片段用EcoRI+Kpn I消化，琼脂糖电泳后回收2.06kb DNA片段并同上纯化(中间片段)，将该片段与上述载体连接后转化大肠杆菌DH5α,挑取正确的克隆。将经序列分析正确的质粒用Kpn I+Bam HI酶切，回收后用做克隆载体，上游长臂片段用KpnI+BglII酶切，回收3.4kb DNA片段，插入上述构建载体，转化大肠杆菌DH5α,挑选正确的克隆。将正确的质粒用XhoI+NotI酶切，经电泳后回收作为克隆载体，将下游短臂用SalI+NotI消化，电泳回收后克隆至上述载体，获得打靶载体pm-hNGF（图1B）,构建过程如图1C所示。构建的质粒通过核酸序列分析证实正确后用于基因打靶。
实施例2：β-NGF基因突变体打靶载体的构建
本实施例是在小鼠β-NGF成熟肽基因基础上改变了三个氨基酸位点。
1）合成引物p2’、P3’、P4’和P5’：
P2’5’ggaagactgggtgggtggatgagcgcttgctccggtgagt 3’
P3’5’actcaccggagcaagcgctcatccacccacccagtcttccacatggggg 3’
P4’5’gggctgcaggcaagtcagcctcttcttgtagcctt 3’
P5’5’aaggctacaagaagaggctgacttgcctgcagcccccttccccacct 3’
2)NGF突变体的获得：
合成以引物P3’+P4’各100ng为引物，以鼠基因组DNA(1μg)为摸板Pfu高保真酶2.5单位，dNTP 250μmol/L,2.5mmol/L MgCl2,25mmol/LTrisHCl(pH8.3)进行PCR反应(94℃30秒，55℃30秒，72℃45秒，使用PerkinElmer 9700型PCR仪,共30循环)，PCR产物经1%琼脂糖电泳后用Qiagen GelExtraction Kit（购自QIAGEN）纯化，获得0.37kb DNA片段。以获得0.37kb DNA片段为模板，利用stratagen公司的点突变试剂盒将NGF成熟肽的第32位Lys、34位Lys、35位Glu突变成Ala，获得突变体基因片段。具体方法参考stratagen公司的点突变试剂盒说明书。
3）上游长臂构建：
以小鼠基因组DNA(1μg)为模板，用引物P1+P2’各100ng,Pfu高保真酶2.5单位，dNTP 250μmol/L,2.5mmol/L MgCl2,25mmol/L TrisHCl(pH8.3)进行PCR反应(94℃30秒，55℃30秒，72℃4分，使用Perkin Elmer 9700型PCR仪,共30循环)，PCR产物经1%琼脂糖电泳后用Qiagen Gel Extraction Kit（购自QIAGEN）纯化，获得4.4kb DNA片断；以小鼠基因组DNA为模板，P5’+P6各100ng为引物同上条件进行PCR扩增，获得0.65kb DNA片断，并同样进行分离纯化；将上述两片段与2）中的NGF突变体片段共三片段各取100ng,混合后为模板，以引物P1+P6各100ng进行PCR扩增（条件同上，72℃延伸时间5分），获得5.4kb DNA片段，并通过同上方法电泳分离纯化。
4）下游短臂构建：同实施例1
5）打靶载体的构建:
pLoxPneo载体质粒用Eco RI+Kpn I(Biolabs,下同)酶切后纯化；上游长臂DNA片段用Eco RI+Kpn I消化，回收2.06kb DNA片段，将该片段与上述载体连接后转化大肠杆菌DH5α,挑取正确的克隆。将经序列分析正确的质粒用Kpn I+Bam HI酶切，回收后用做克隆载体，上游长臂片段用KpnI+BglII酶切，回收3.4kb DNA片段，插入上述构建载体，转化大肠杆菌DH5α,挑选正确的克隆。将正确的质粒用XhoI+NotI酶切，经电泳后回收作为克隆载体，将下游短臂用SalI+NotI消化，电泳回收后克隆至上述载体，获得打靶载体pm-mNGF（图2A）,构建过程如图2B所示。构建的质粒通过核酸序列分析证实正确后用于基因打靶。
实施例3 人NGF成熟肽基因定位整合小鼠胚胎干细胞的获得.
1)滋养层细胞的培养和处理:
解冻小鼠原代成纤维细胞至2个100mm平皿中，于滋养层细胞培养液（DMEM，15%FBS，0.1mMβ-巯基乙醇，0.1mmol/L青-链霉素，0.1mmol/L L-谷氨酰胺，0.1mM非必需氨基酸）、37℃、5%CO2培养3天后，用胰蛋白酶消化处理并转移到6个150mm组织培养皿培养，3天后，再转移到40个150mm组织培养皿中培养3～4天，直到细胞铺满皿底。用终浓度为10μg/ml的丝裂霉素C处理成纤维细胞，37℃培养2～3h。将含丝裂霉素C处理过的，已失去有丝分裂活性的成纤维细胞冻存，制备为成滋养层细胞。
2)电穿孔法转染ES细胞:
滋养层细胞形成后，接种129/ter小鼠胚胎干细胞，培养基为在滋养层细胞培养液中添加1000U/ml LIF。转染前用1ml 0.25％的胰酶处理，然后加入3.5ml ES细胞培养基洗涤后悬浮于PBS之中。质粒pm-hNGF 50μg,用NotI酶切使重组载体线性化，与1ml上述ES上述细胞悬液混合，用基因脉冲仪(Biorad),600V,25μF电击转染，室温1分后加入7ml ES细胞培养基，加入4个已长满滋养层细胞的培养皿，生长24h后加G418至280μg/ml,gancyclovir2μmol/L,继续培养7天(每天换培养基)，然后挑取克隆。
3)人NGF成熟肽基因定位整合小鼠胚胎干细胞的鉴定:
⑴Southern印迹:提取ES细胞和G418/FIAU双抗性克隆的基因组DNA,然后用EcoRI消化,用打靶载体5’端的探针a进行Southern印迹。野生型应该在10kb处有一阳性条带。而因为在人NGF成熟肽基因中有一EcoRI位点，所以在同源重组后的ES细胞中在5kb处还会有一条阳性带，如图3
⑵PCR鉴定：引物1（5’gctcatcctcccatcccatcttccaca 3’）位于于成熟肽基因5’端，引物2（5’gaacgagatcagcagcctctgttcca 3’）位于Neo基因上。利用引物1和引物2扩增，在野生型胚胎干细胞中不会扩增出条带，而在同源重组后的干细胞中扩增出1200bP的扩增条带（图4），PCR产物通过EcoRI进行酶切鉴定。并通过DNA序列分析证实小鼠NGF基因组DNA上的成熟肽基因已被人基因所替换。
实施例4 β-NGF突变体基因定位整合小鼠胚胎干细胞的获得。
1）β-NGF突变体基因定位整合小鼠胚胎干细胞的获得方法同实施例3
2）β-NGF突变体基因定位整合小鼠胚胎干细胞的鉴定:
⑴Southern印迹:提取ES细胞和G418/FIAU双抗性克隆的基因组DNA,然后用Bam HI消化,用下游同源臂5’端的探针b进行Southern印迹。野生型应该在800bp处有一阳性条带。而在同源重组后的ES细胞中由于两个Bam HI位点之间插入了neo基因，所以阳性条带增至了2.7kb左右（图5）。
⑵PCR鉴定：设计NGF成熟肽5’端引物1(5’gctcatccacccacccagtcttccaca3’)和Neo基因上的引物2（5’gaacgagatcagcagcctctgttcca 3’）。在野生型胚胎干细胞中不会扩增出条带，将在同源重组后的干细胞中扩增出1200bP的扩增条带，PCR产物通过DNA序列分析证实小鼠NGF基因组DNA上的成熟肽基因已被突变的基因所替换。
实施例5 人NGF成熟肽基因定位整合小鼠的获得
1）供体囊胚的制备：
取4-6周C57BL/6J不动情雌鼠，腹腔注射5单位孕马血清促性腺激素(Pregnant mare serum gonadotropin),48h后腹腔注射5单位人绒毛膜促性腺激素，并将雌鼠转移至有种雄鼠的笼中与雄鼠交配。48h后检查小鼠，有阴栓者分笼饲养。交配第四天后，引颈处死供体雌鼠，解剖找到子宫，用剪刀将左右两侧子宫在输卵管与子宫角的衔接处剪下，然后小心剪下子宫的联体部分，置于无菌的60mm培养皿中。再用剪刀在子宫头与子宫尾分别剪去输卵管和子宫角部分，使得两根单独的子宫是畅通的。用一次性注射器吸足量的Brinster’s BMOC-3(GIBCO BRL)培养液套上5号针头，在视体解剖镜下插入子宫腔，推动注射针栓冲洗子宫腔，小鼠胚胎将迅速沉降至培养皿底部。取一个35mm的培养皿，滴上数滴培养液，再盖上矿物油。在视体镜下用冲卵管收集胚胎并转移至培养液滴中，放于37℃、5%CO2培养箱中培养2小时。
2）囊胚显微注射：
注射用ES细胞应在数天前解冻，注射当天早晨换上新鲜的ES细胞培养液，1～2小时后胰酶处理，作成单细胞悬液保存在Brinster’s BMOC-3培养液中。从35mm培养皿中挑选约10个形态饱满、边界清晰、囊胚腔较大的囊胚转移到安装好持卵管和注射针的注射槽内。在10倍镜下用注射针吸取10～15枚小而圆的ES细胞，在40倍镜下用吸卵管吸附囊胚的一侧，将注射针调整至对准囊胚的中心并使它们处于同一水平面。转动注射针的操纵杆，使注射针快速刺破囊胚的壁，进入囊胚腔，推动注射泵使ES细胞顺序进入囊胚腔，小心拔出注射针。按照囊胚情况和受体鼠数量决定囊胚注射的个数。注射后的囊胚置Brinster’s BMOC-3培养液液滴里培养。
3）胚胎的子宫移植：
受体鼠为昆明白假孕鼠，是经过与结扎输精管的雄鼠交配后的雌鼠。用酒精消毒受体鼠背部，在右侧靠近第一腰锥的部位做一个1cm左右横向切口。向两侧拉展直至可透过腹膜看见右侧卵巢及其脂肪垫。在腹膜上用尖镊撕开一个3mm的小口。左手夹住脂肪垫向外拉出，子宫随之可见。用小号止血钳夹住少许脂肪垫稍作固定。将移卵管接上一个口控管，在体视解剖镜下依次小心吸入培养液、气泡、培养液、气泡、注射后的囊胚、气泡、少量培养液。左手持尖镊夹住在子宫和输卵管接口处附近2mm远的子宫壁，右手持一个4号注射器针头和移卵管。在解剖镜下，针头在紧挨尖镊处避开血管扎一个小孔，将移卵管的前端小心插入小孔中。将胚胎缓慢吹入子宫中。子宫和肠系膜送回腹腔，封闭切口。（见基因打靶技术，p133.杨晓等，科学出版社）。
4）转基因小鼠的获得：
如果移植手术成功，17天后可有幼鼠出生，数天后可从毛色上判断是否获得高嵌合度的嵌合体小鼠。选择嵌合度高的嵌合体小鼠与C57BL/6J交配，在子代中可获得纯棕色的转基因杂合子小鼠。将这些杂合子小鼠交配可筛选出纯合子转基因小鼠。
实施例6 β-NGF突变体基因定位整合小鼠的获得。
具体方法同实施例5。
实施例7 人NGF成熟肽基因定位整合小鼠的鉴定：
1）鼠基因组DNA的制备：
剪15天小鼠尾巴尖约0.5cm放入Eppendorf管中。每管加入鼠尾裂解缓冲（0.5%SDS,0.1M NaCl,0.05M EDTA,0.01M Tris-Cl pH8.0,蛋白酶K，200ug/ml）400ul。然后50℃保温过夜。每管加入200ul饱和的NaCl（6M），剧烈震荡混匀，然后置于冰上10min。室温14000rpm离心10min，将上清转移到干净的Eppendorf管中，每管加入0.8ml乙醇，混匀。14000rpm离心5min，弃上清，室温干燥后将DNA重悬于50～100ul TE中。
2）PCR鉴定小鼠的基因型：
引物1（5’acaggactcaccggagcaagcgctcat 3’）位于于成熟肽基因5’端，引物2(5’gaacgagatcagcagcctctgttcca3’)位于Neo基因上。引物3（5’gaactcccagtgtggataagtaga3’）位于成熟肽基因下游非编码区，引物4（5’aatagtagagaagcagccatcagagca 3’）位于下游同源臂5’端。以提取的小鼠基因组DNA(1μg)为摸板，用引物1+引物2各100ng,Pfu高保真酶2.5单位，dNTP250μmol/L,2.5mmol/L MgCl2,25mmol/L TrisHCl(pH8.3)进行PCR反应(94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，使用Perkin Elmer 9700型PCR仪,共30循环)，PCR产物经1%琼脂糖电泳，在野生型C57BL/6J小鼠中没有特异性扩增条带出现；在杂合子和纯合子转基因小鼠中将有1200bP的扩增条带。扩增条带经分离纯化后用于测序，以确定为人NGF成熟肽基因。以引物3+引物4各100ng为引物，进行PCR扩增（条件同上，但72℃延伸时间2分钟），PCR产物经1%琼脂糖电泳，野生型C57BL/6J将出现190bp的条带；杂合子转基因小鼠也会出现一条190bp条带，但在2000bp处还会出现一条扩增带；纯合子转基因小鼠只在2000bp出现一条扩增带(图6)。
3)纯合子小鼠的NGF成熟肽基因序列测定：
剪纯合子小鼠尾巴尖约0.5cm放入Eppendorf管中。每管加入鼠尾裂解缓冲（0.5%SDS,0.1M NaCl,0.05M EDTA,0.01M Tris-Cl pH8.0,蛋白酶K，200ug/ml）400ul。然后50℃保温过夜。每管加入200ul饱和的NaCl（6M），剧烈震荡混匀，然后置于冰上10min。室温14000rpm离心10min，将上清转移到干净的Eppendorf管中，每管加入0.8ml乙醇，混匀。14000rpm离心5min，弃上清，室温干燥后将DNA重悬于50～100ul TE中。
设计成熟肽基因上游引物(5’AATCCCTTTCAACAGGACTCACCGGAGCAA 3’)和NGF成熟肽下游引物（5’AAGGGGGCTGCAGGCAAGTCAGCCTCTTC 3’）。以提取的小鼠基因组DNA(1μg)为摸板，Pfu高保真酶进行PCR反应(94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，使用Perkin Elmer 9700型PCR仪,共30循环)，PCR产物经1%琼脂糖电泳后纯化，TA克隆后测序。测序结果表明成熟肽基因为人β-NGF成熟肽基因。序列如下：
TCATCATCCCATCCCATCTTCCACAGGGGCGAATTCTCGGTGTGTGACAGTGTCAGCGTGTGGGTTGGGGATAAGACCACCGCCACAGACATCAAGGGCAAGGAGGTGATGGTGTTGGGAGAGGTGAACATTAACAACAGTGTATTCAAACAGTACTTTTTTGAGACCAAGTGCCGGGACCCAAATCCCGTTGACAGCGGGTGCCGGGGCATTGACTCAAAGCACTGGAACTCATATTGTACCACGACTCACACCTTTGTCAAGGCGCTGACCATGGATGGCAAGCAGGCTGCCTGGCGGTTTATCCGGATAGATACGGCCTGTGTGTGTGTGCTCAGCAGGAAGGCTGTGAGAAGAGCCTGA
4)Southern杂交鉴定：
提取鼠尾基因组DNA后用EcoRI消化。用打靶载体5’端的探针a进行Southern印迹，野生型C57BL/6J应该在10kb处有一阳性条带。而因为在人NGF成熟肽基因中有一EcoRI位点，所以在杂合子子代小鼠中在5kb处还会有一条阳性带。在纯合子转基因小鼠中只有5kb处阳性条带（图7）。
实施例8 β-NGF突变体基因定位整合小鼠的鉴定：
1）PCR鉴定和结果同实施例7
2）纯合子小鼠的NGF成熟肽基因序列测定
剪纯合子小鼠尾巴尖约0.5cm放入Eppendorf管中。每管加入鼠尾裂解缓冲（0.5%SDS,0.1M NaCl,0.05M EDTA,0.01M Tris-Cl pH8.0,蛋白酶K，200ug/ml）400ul。然后50℃保温过夜。每管加入200ul饱和的NaCl（6M），剧烈震荡混匀，然后置于冰上10min。室温14000rpm离心10min，将上清转移到干净的Eppendorf管中，每管加入0.8ml乙醇，混匀。14000rpm离心5min，弃上清，室温干燥后将DNA重悬于50～100ul TE中。
设计成熟肽基因上游引物(5’AATCCCTTTCAACAGGACTCACCGGAGCAA 3’)和NGF成熟肽下游引物（5’AAGGGGGCTGCAGGCAAGTCAGCCTCTTC 3’）。以提取的小鼠基因组DNA(1μg)为摸板，Pfu高保真酶进行PCR反应(94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，使用Perkin Elmer 9700型PCR仪,共30循环)，PCR产物经1%琼脂糖电泳后纯化，TA克隆后测序。测序结果表明成熟肽基因为小鼠β-NGF突变体成熟肽基因。序列如下：
TCATCCACCCACCCAGTCTTCCACATGGGGGAGTTCTCAGTGTGTGACAGTGTCAGTGTG
TGGGTTGGAGATAAGACCACAGCCACAGACATCGCCGGCGCGGCTGTGACAGTGCTGGCC
GAGGTGAACATTAACAACAGTGTATTCAGACAGTACTTTTTTGAGACCAAGTGCCGAGCC
TCCAATCCTGTTGAGAGTGGGTGCCGGGGCATCGACTCCAAACACTGGAACTCATACTGC
ACCACGACTCACACCTTCGTCAAGGCGTTGACAACAGATGAGAAGCAGGCTGCCTGGAGG
TTCATCCGGATAGACACAGCCTGTGTGTGTGTGCTCAGCAGGAAGGCTACAAGAAGAGGC
TGA
3)Southern印迹鉴定:
提取鼠尾基因组DNA后用Bam HI消化。用下游同源臂5’端的探针b进行Southern印迹，野生型C57BL/6J应该在800bp处有一阳性条带。而在β-NGF突变基因同源重组后，由于两个Bam HI位点之间插入了neo基因，所以杂合子小鼠在2.7kb左右还会有一条阳性条带。纯合子转基因小鼠中只有2.7kb处阳性条带（图8）。
实施例9 人NGF成熟肽基因定位整合的小鼠颌下腺中神经生长因子的提取
1)提取方法：
健康雄性小鼠，体重30～40g，在一级实验室内，颈椎脱臼处死后，立即摘取颌下腺。按1：2～5(g:ml)加入纯化水，用高速组织粉碎机充分匀浆，匀浆液再用冷纯化水稀释2～3倍后12000rpm离心1小时，取离心上清液在0.02M pH6.8PB中充分透析。CM-Sepharose FF层析柱用0.02M pH6.8 PB充分平衡后上样。上样后用平衡液冲洗，收集蛋白流出峰。蛋白流出液置0.25mM pH6.8PB中透析24h，其间换透析液2～3次。透析后液加1M乙酸缓冲液（pH4.0）迅速降低pH至4.0，然后加NaCl使成0.4M，静置约5min后10000g离心30min，取上清。CM-SepharoseFF层析柱用pH4.0、0.05M乙酸液（含0.4M NaCl）充分平衡后上样，上样后用平衡液冲洗到基线后再用pH9.0，0.05M Tris缓冲液洗脱杂峰至基线后，在该液下用0～0.4M NaCl梯度洗脱，收集目标蛋白峰。然后目标蛋白经凝胶过滤层析，Superdex G75prep grade层析柱用0.05MpH9.0（含0.15M NaCl）充分平衡后上样，收集目标蛋白峰。经凝胶过滤层析纯化的蛋白用孔径20nm除病毒膜包过滤除病毒，收集滤过液。
2）电泳鉴定：提取的蛋白利用SDS-PAGE鉴定其分子量大小（鉴定结果见图9）。同时做等电聚焦电泳以测定蛋白的等电点（鉴定结果见图10）。
实施例10 β-NGF突变基因定位整合小鼠颌下腺中神经生长因子的提取：
方法同实施例9，SDS-PAGE电泳结果见图9
实施例11 人神经生长因子的比活测定以进一步鉴定实施例9所提取蛋白质
采用鸡胚背根神经节培养法测定：培养瓶底部涂鼠尾胶，干燥，用含10%FCS DMEM培养液洗涤2次后加3ml DMEM培养液平衡过夜，临用倒弃培养液。取8日龄鸡胚背根神经节（DRG），接种于涂有鼠尾胶原的培养瓶中，每瓶接种3-5个神经节。置二氧化碳培养箱内，5%CO2，37℃培养2小时后，加入用DMEM培养液按3倍梯度稀释的NGF待测样品。结果判断标准：无突起生长判为“-”，少量突起判为“+”，突起较长较密据其程度判为“++”～“+++”，突起最长最密为“++++”，过量抑制以“#”表示。以生长最长最密时每毫升中待测样品的含量作为一个活性单位。测活结果见图11。(图9说明：图11重组人NGF诱导鸡胚背根神经节分化1：27ng/ml NGF；2：9ng/mlNGF；3：3ng/ml NGF；4：1ng/ml NGF；5：0.33ng/ml NGF；6：阴性对照，DRG培养在DMEM培养基中)。
实施例12 突变体NGF的生物学特性鉴定及其活性测定：
1)突变NGF的受体结合实验：
将野生型小鼠NGF和突变的NGF用125I标记。然后分别加入表达TrkA的细胞和表达P75的A875人黑肿瘤细胞中。配体和受体复合物用N-hydroxysuccinimidyl-4-azidobenzoate进行化学铰链，裂解细胞，铰链后的复合物在4℃免疫沉淀过夜，SDS电泳后放射自显影。结果显示突变的NGF和野生型的NGF都能够与高亲合力受体TrkA结合，而突变后的NGF不能与P75结合。图12（说明：1TrkA-WtNGF复合物放射自显影2TrkA-Mutant NGF复合物放射自显影3P75-WtNGF复合物放射自显影4P75Mutant NGF复合物放射自显影）
2)突变NGF比活性测定:
采用鸡胚背根神经节培养法测定：培养瓶底部涂鼠尾胶，干燥，用含10%FCS DMEM培养液洗涤2次后,加3ml DMEM培养液平衡过夜，临用倒弃培养液。取8日龄鸡胚背根神经节（DRG），接种于涂有鼠尾胶原的培养瓶中，每瓶接种3-5个神经节。结果判断标准：无突起生长判为“-”，少量突起判为“+”，突起较长较密据其程度判为“++”～“+++”，突起最长最密为“++++”，过量抑制以“#”表示。结果发现在高浓度的情况下突变NGF和野生型NGF对促进神经节生长的能力相当（27ng/ml、9ng/ml、）。而在低浓度下(3ng/ml、1ng/ml、0.3ng/ml)促进神经节生长的能力明显减弱。
测定方法同实施例11
实施例13 人神经生长因子制剂配方
1）人神经生长因子冻干制剂：
神经生长因子半成品用Lowry法测定含量，将蛋白液用无热原25mM、pH6.8的PB(含0.05%人血白蛋白、5%甘露醇)稀释至所需体积，经0.22μm滤膜过滤后，无菌分装后冷冻、干燥，轧盖，4℃保存。
2）人神经生长因子水针剂：
神经生长因子半成品用Lowry法测定含量，将蛋白液用无热原25mM、pH6.8的PB(含0.05%人血白蛋白)稀释至所需体积，经0.22μm滤膜过滤后，无菌分装后轧盖，-20℃保存。
3）神经生长因子滴眼液：
神经生长因子半成品用Lowry法测定含量，将蛋白液用无热原20mM、pH6.8的PB(含终浓度均为3.33mg/ml甘氨酸、丙氨酸和精氨酸及0.5%NaCl)稀释至所需体积，经0.22μm滤膜过滤后，无菌分装后轧盖，-20℃保存。
实施例14 突变神经生长因子制剂配方：
方法同实施例13
根据上述，显然可对本发明作大量的改变。因此，在所附的权利要求范围内，除了上述具体描述的方法外，可用其它方法实施本发明。
Claims (2)
1.一种获得转基因啮齿类动物的方法，其特征在于通过同源重组技术使所述动物的NGF-β基因被改变，进而使该动物表达该动物NGF-β的突变体蛋白质，其中，所述NGF-β的突变体蛋白质为SEQ ID NO:23所示基因编码的人源NGF-β蛋白质；所述啮齿类动物为小鼠；所述同源重组技术包括以下步骤：
1）构建打靶载体，其中所述载体含有SEQ ID NO:23所示的人源NGF-β蛋白质编码基因；
2）使用步骤1）中所构建的打靶载体转染小鼠胚胎干细胞；
3）制备供体囊胚；
4）将步骤2）中获得的经过转染的小鼠胚胎干细胞显微注射入步骤3）中所获得的供体囊胚中；
5）将步骤4）中所获得的供体囊胚转移到受体动物的子宫中；以及
6）获得转基因动物。
2.一种制备啮齿类动物NGF-β的突变体蛋白质的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）根据权利要求1所述的方法培养啮齿类动物，其中，所述啮齿类动物为小鼠；
2）从步骤1）中所培养的动物的组织中提取目标蛋白，其中，所提取的目标蛋白是SEQ ID NO:23所示基因编码的人源NGF-β蛋白质；其中，所述的组织为颌下腺。
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