CN1079992A - 具有经改变的受体结合特性的神经营养因子 - Google Patents

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Abstract

述及一种改变受体结合特性及神经营养性因子 稳定性方法。陈述了具有经改变的受体结合特性的 突变形神经营养性因子。特定的实施方案包括结 trk受体但不与低亲合力NGF受体结合的神经营养 性因子。

Description

本发明提供了经修饰的受体亲和力和生物特性的，神经生长因子族中的突变型神经营养性因子。本发明部分上是以对于合理设计神经营养性因子的类似物和嵌合体为有用的模型体系的发展为基础的。
对细胞生长和分化的控制需要特定的因子，这些因子通过与应答细胞表面上的受体相互作用而发挥其作用。尽管已被发现和表征过的生长和分化因子的数目正在增加，但与结合和生物活性有关的准确结构以及构成多种受体的活化基础的有关联和成因果关系的分子活动尚鲜为人知。
神经生长因子（NGF）是一种118氨基酸多肽，该多肽控制交感神经系统，以及部分感觉和中枢神经系统的生存、发育和分化（Levi-Montalcini    and    Angeletti，1968;Thoenen    and    Barde，1980;Whittemore    and    Seiger，1987;Thoenen    et    al.，1987）。生物活性形态的NGF是一种相同亚单位组成的二聚物，其中，每一亚单位都是由母体分子得到的（Angeletti    and    Bradshaw，1971;Angietti    et    al.，1973）。首次在小鼠中分离出NGF的cDNA克隆（Scott    et    al.，1983）。其后，在一系列其它物种中，包括某些哺乳动物、鸟类、爬行动物和鱼类中，该NGF基因已得以表征（Schwarz    et    al.，1989;Hallbǒǒk    et    al.，1991）。
NGF属于一个结构上和功能上相关的分子族，总称为神经生长因子族的促神经激素，该族至少包括三个其他成员，脑的衍生的神经营养性因子（BDNF）（Barde    et    al.，1982;Leibrock    et    al.，1989）、促神经激素-3（NT-3）（Hohn    et    al.，1990;Maisonpierre    et    al.，1990;Rosenthal    et    al.，1990;Ernfors    et    al.，1990）和促神经激素-4（NT-4）（Hallbǒǒk    et    al.，1991;lp    et    al.，1992）。
NGF与神经和非神经源两者的各种细胞类型上所表达的低亲和力受体相互作用（Ernfors et al.，1988;Yan and Johnson，1988;Heuer et al.，1990;Hallbook et al.，1990）。该神经生长因子族的其他三种促神经激素也能与低亲和力NGF受体结合（Rodriguez-Tebar et al.，1990;Ernfors et al.，1990;Squinto et al.，1991;Hallbook et al.，1991）。以10-9M Kd结合了NGF的约75000道尔顿横跨膜糖蛋白代表了这一受体（P75NGFR）（Johnson et al.，1986;Radeke et al.，1987）。然而，局限于P75NGFR-阳性细胞亚群的高亲和力结合（Kd＝10-11M）对传递NGF的生物作用是必需的（Banerjee et al.，1973;Herrup and Shooter，1973;Sutter et al.，1979;Richardson et al.，1986）。尽管两种受体状态之间的分子关系不完全清楚，但某些报导已指出，对高亲和力结合和信号转导而言，需要没有结构特征的P75NGF的胞质范围，而这些结构特征对在其他受体中传递信号转导是已知的（Hempstead et al.，1989;Yan et al.，1991;Berg et al.，1991）。
最近已经证明，原始致癌基因trk将NGF的功能受体编码（Kaplan et al.，1991a;Klein et al.，1991）。此trk原始致癌基因的产物是140000道尔顿的蛋白质（P140trk），该蛋白质是横跨膜受体的酪氨酸激酶族的一员（Martin-Zanca et al.，1991）。尽管已假定，该蛋白质参与了NGF的主要信号转导机制，但关于NGF的P140trk的平衡结合常数仍有相当大的争议。另一方面Klein等（1991）曾报导：P140trk以低和高两种亲和力结合了NGF，Kaplan等（1991）和Hampstead等（1991）报导：P140trk以类似于P75NGFR结合的亲和力结合了NGF，以及对此二受体而言，为产生高亲和力结合需要合并表达。
最近已表明trk原始致癌基因产物构成了NGF的功能受体编码（Kaplan et al.，1991a;Klein et al.，1991）。与P140trk结合的NGF导致这一分子的快速磷酸化并刺激其酪氨酸激酶的活性（Kaplan et al.，1991a;Kaplan et al.，1991b;Klein et al.，1991）。
相反，P75NGFR在信号转导中的作用仍然是难以捉模的。最近报导，这一受体的胞质范围与传递神经元分化有关（Yan et al.，1991）并与在PC12细胞中NGF诱导酪氨酸磷酸化有关（Berg et al.，1991）。然而，其他最新的研究已表明，抗P75NGFR的多克隆抗体消除NGF对这一分子的结合和及某些高亲和力结合，但不会抑制对NGF的生理反应（Weskamp and Reichardt，1991）。使用表达P140trk细胞系的最新报导已证明，当存在NGF时，这一受体分子可没有在P75NGFR时作为引起纤维细胞的存活和有丝分裂的增殖的媒介（Cordon-Cardo et al.，1991）。这些研究不能排除在神经元和神经元状细胞系中对P75NGFR的结合作为引起NGF反应的媒介是很重要的这一可能性。最近还表明了trk原始致癌基因可夺回突变型NGF非反应PC12细胞系中的NGF反应能力（Loeb et al.，1991）。然而，这些细胞仍然表达大量的P75NGFR，从而难于评估，是否存有这类对被观察的功能效果而言是必需的分子。
通过研究结构-功能关系和具有改变性能的NGF突变体的产生，提供了对NGF借以发挥其生物效应的分子机理的更好了解。在这一方向上的最初研究已分析了在雏鸡NGF中高度保守的氨基酸残基的功能重要性（lbà nez et al.，1990）。更近的是，对NGF和BDNF之间嵌合分子的分析已描绘出与确定这两种因子生物特性有关的区域（lbà nez et al.，1990a）。比较来自不同物种的NGF基因，展现了在所有不同族的脊椎动物中高度保守的氨基酸残基（参见图1，该图证明在来自不同物种的NGF中和不同促神经激素的同源区域中氨基酸残基25-36是保守的（单字母代码））。图1A示出了来自大鼠（Whittemore et al.，1988）、小鼠（Scott et al.，1983）、人（Ullrich et al.，1983）、牛（Meier et al.，1986）、豚鼠（Schwarz    et    al.，1989），雏鸡（Ebendal    et    al.，1986;Meier    et    al.，1986），爪蟾属（参考文献）和蛇（Selby    et    al.，1987）NGF的氨基酸残基25-36的列线。图1B示出了来自大鼠NGF的和大鼠BDNF的（Maisonpierre    et    al.，1990）、大鼠NT-3的（Maisonpierre    et    al.，1990;Ernfors    et    al.，1990）和爪蟾属NT-4（Hallbǒǒk    et    al.，1991）的同源残基的残基25-36列线。
在这些保守的部分中间，扫过残基25-36的区域是最亲水的，从而看来会存在于NGF分子的表面上（Meier    et    al.，1986;Ebendal    et    al.，1989）。已表明由这一序列设计的合成肽抑制试管内的NGF的生物活性（Longo    et    al.，1990）。
本发明提供了神经生长因子族的突变型神经营养性分子，这些分子与其亲本分子比较具有新的受体结合亲和力和特性。本发明部分地是基于将NGF用作确定该分子与P75NGFR和P140trk两种受体结合时的特定氨基酸的模型体系。本发明基于一种进一步的发现：当使用这种模型体系时，可对NGF进行修饰，以导致该分子与P75NGFR结合的能力下降，而同时保持该分子与P140trk结合的能力并且显示出有可与野生型分子相比的生物活性。在不同的实施方案中，对NGF以及对神经生长因子族其他成员相应区域所作的修饰产生具有对trk信号转导受体更大特性的神经营养性因子。
图1.来自不同物种的NGF中氨基酸残基25-36（单字母代码）的比较。
图2.COS细胞中亲本和突变NGF的稳定性。
图3.E35A突变对前肽处理时的影响。
图4.亲本（野生型）及突变体NGF的竞争性受体结合和生物活性。
图5.低亲和力受体结合不足的和NGF突变体亲本NGF在PC12细胞中的生物活性。
图6.亲本NGF和NGF突变体的竞争性受体结合。
图7.K95A突变体对NGF与在不同细胞类型上的受体的受体结合的影响。
图8.亲本NGF和与P75NGFR结合不足的NGF突变体在交感神经元中的生物活性。
图9.NGF与P75NGFR的受体结合的位点的功能剖析。
神经生长因子（NGF），与许多其他生长因子和激素一样，与在应答细胞上的两种不同受体分子结合。原始致癌基因trk的产物P140trk是一种当前已被鉴定为NGF信号转导受体的酪氨酸激酶受体。在信号转导中，低亲和力NGF受体，P75NGFR的作用还不够清楚。尽管涉及受体结合和生理活性的结构仍是未知的，但最近已确定了NGF的晶体结构。
与结合及生物分析相联的位点-定向诱变提供了评价与神经营养性因子的结合有关的氨基酸残基功能重要性的有用工具。与鉴别NGF的三维晶体结构相联的这些研究（McDonald    et    al.，1991）能对具有改变了受体结合性能的神经营养性因子作合理设计。
因此，本发明的目的是针对新的，突变型神经营养性因子，这些因子是通过修饰一种或多种属神经生长因子族中的亲本或野生型神经营养性因子的氨基酸而产生的。所选择的这些修饰足以在保持该因子与trk受体结合能力的同时，降低该因子与低亲和力NGF受体的结合。
如本申请中所预期的，对特定氨基酸残基的修饰改变了NGF的特性。基于NGF的三维结构，已确定，这些氨基酸残基的改变是在NGF二聚物的外臂处露出的β-发夹环中（McDonald et al.，1991）。如本文所述，在这一区域内的带有正电荷侧链的残基似乎是与对NGF和P75NGFR之间的主接触应答的。
申请人已发现，在这些部位上突变的NGF不与P75NGFR结合，但仍保持与trk原始促癌基因的结合和活性。这些结果提示：P140trk单独，至少在培养物中已足以传递神经元细胞中NGF的生物活性。使用突变体的NGF所进行的实验表明了，对早期基因如C-fos表达的诱导或对PC12细胞的神经元的分化都不需要与P75NGFR的结合。此外，无论是表达P75NGFRmRNA和蛋白质（Ernfors et al.，1988;Yan and Johnson 1988）和trk mRNA（G.Barbany，unpublished）的经培养的交感神经元的轴突赘疣抑或神经元的存活均不受与P75NGFR的结合下降的影响。这些结果首次表明，trk原始致癌基因产物足以单独向培养过的神经元细胞中的NGF传递一种应答，从而开辟了阐明在传递NGF生物活性中P75NGFR和P140trk两者的作用以及产生具有改善结合特性的独特神经营养性因子的独特的可能性。
尽管有可能在本文所述的突变体中，NGF通过不同的结合位点与由P75NGFR和P140trk的杂二聚物所产生的新囊结合（Hempstead et al.，1991）或另一方面，游离的P75NGFR仍能接触复合体NGF-P140trk并以这一方式在信号转导中共同作用，但在可以检测P75NGFR或P140trk同型二聚体的条件下（Meakin and Shooter，1991）无论是以PC12细胞抑或以感觉神经元所进行的交联实验均不能检测出P75NGFR-P140trk复合体。本发明的突变分子保持着与P140trk结合的事实，有力地支持了所观察到的生物活性是被这一受体分子单独传递的事实。
本文所主张的，但不是为了限定的是，在神经生长因子族中的某些促神经激素中，即在NGF、NT-3和NT-4中，在β发夹环30-40中的荷正电的氨基酸在该分子与P75NGFR结合的能力方面起重要作用。因而，按照本发明的一个实施方案，使这些氨基酸中的一种或几种进行变换，以使这一区域的全部电荷改变，从而降低该分子与P75LNGF结合的能力，同时保持该分子与其相应的trk受体结合的能力。此处所使用的，氨基酸残基1是成熟蛋白质中第一氨基酸。
在这样一个实施方案中，赖氨酸32（Lys32）的带正电荷侧链被例如丙氨酸（Ala）的甲基所取代。这样的变换作用将该分子与P75NGFR的结合减少至亲本MGF与之结合时所观察到的该结合的5%（表2和图6）。在另一实施方案中，赖氨酸32（Lys32）转变成丙氨酸（Ala）使之与A875的结合减少至亲本的结合程度的55%。在另一个实施方案中，还采用将赖氨酸32（Lys32）、赖氨酸34（Lys34）和谷氨酸35（Gln35）同时被丙氨酸取代以完全消除该突变分子与P75NGFR的结合。在这此突变体中的每一个的场合下，尽管降低或没有与P75NGFR的结合，但这些分子在交感神经节的外殖体上仍保持野生型生物活性。
在又一个实施方案中，根据在第二β-发夹环中的氨基酸95周围的荷正电的氨基酸可以与赖氨酸32（Lys32）和赖氨酸34（Lys34）相互作用以形成与结合P75NGFR有关的带正电荷界面这一发现设计突变型神经营养因子。同时用两种赖氨酸（赖氨酸34（Lys34）或赖氨酸95（Lys95））中的任一个对赖氨酸32（Lys32）的修饰导致与P75NGFR结合的丧失。尽管缺乏与P75NGFR结合，当以PC12细胞的神经元分化和经培育的交感神经元的存活率测量时，这些突变体仍能与P140trk结合并保持其生物活性。
由于其他三种已知的促神经激素也可与低亲和力NGF受体结合（Rodriguez-Tebar et al.，1990;Ernfors et al.，1990;Squinto et al.，1991;Hallbook et al.，1991），因此可预期到在相应的氨基酸中的类似变化会导致结合特性的类似改变，同时不影响这些分子与其有关的信号转导trk受体结合的能力。赖氨酸95（Lys95）在迄今所述的全部四种蛋白质中是保守的（在爪蟾属NT-4中，位置95的氨基酸是赖氨酸（Lys），而在人体NT-4中位置94和96中为荷正电的氨基酸谷氨酰胺和精氨酸）。另外，在NT-3和NT-4中，赖氨酸32（Lys 32）被精氨酸（Arg）所取代。赖氨酸34在NT-4中也是保守的。因此，本发明预料到，任意这些荷正电的氨基酸的变化（例如以中性，.或荷负电的氨基酸取代荷正电的氨基酸）会降低与P75NGFR的结合。
本发明也包括对赖氨酸95（Lys95）周围的β-环区进行过其他修饰而改变了的分子。例如，在BDNF中，赖氨酸32（Lys32）和赖氨酸34（Lys34）分别被丝氨酸（Ser）和甘氨酸（Gly）所取代。有意义的是，BDNF中残基93-96的立体上封闭的环具有可以补偿缺少有赖氨酸32（Lys32）和34（Lys34）的三个连串的荷正电的残基（两个赖氨酸和一个精氨酸）。具有被BDNF中相应残基取代的残基23-35（可变化区1）的嵌合NGF分子（Lbà nez et al.，1991a）显示出：与PC12细胞的低亲和力结合降低10倍。该低亲和力结合在含有变化区1和来自BDNF的残基94-98（变化区V）的另一嵌合分子中被恢复，这表明了BDNF中位置95、96和97处的三个荷正电残基可补偿有赖氨酸32（Lys32）和赖氨酸34（Lys34）的缺乏。尽管NGF和BDNF两者都显示出对P75NGFR有同等竞争力的结合，但在BDNF的场合下，这一受体也可识别由正协同作用和较慢的分解动力学所反映出的两种配合体之间的区别（Rodriguez-Tebar et al.，1990）。从而显得BDNF和NGF可被类似但结构不相同的P75NGFR所识别。本文所述的这些结果对所观察到的NGF和BDNF之间的区别提供了结构上的解释并提示：其它促神经激素可以通过相同的区域与P75NGFR相互作用。
在本文被具体体现的是对亲本神经营养性因子的修饰增强其稳定性。如本文所述，对一个或多个产生于神经生长因子族的神经营养性因子的氨基酸25和36之间的氨基酸残基的选择性修饰，显得改变这些因子的稳定性。因此，本发明设想改变这些氨基酸，随后测量所改变分子的稳定性和生物活性，以选择与亲本分子相比，仍保持其生物活性，但具有增强了的稳定性的那些因子。
涉及由神经营养性因子，如NGF、BDNF、NT-3和NT-4衍生的第二代因子的本发明可以与亲本因子相同的方式被用于治疗疾病。例如，它们可用以治疗可能与神经营养性因子模型表达改变有关的或可能因在神经营养性因子中的暴露的神经系统的疾病和紊乱。
就按照本发明制得的，不与P75NGFR结合的因子而论，这些分子可具有针对靶细胞的提高了的特性并从而以较低剂量使用是有效。另外，这些分子产生的副作用比与较广泛分布的神经元细胞系类结合的亲本分子所产生的副作用小。姑且被认为是由P75NGFR所传递的逆向输送可通过使用突变的促神经激素而被防止并由此可在表达其高亲和力受体的脑的规定区域中（如在脑损伤后的海马中）产生突变的促神经激素的局部效应。
材料和方法
本文所述的全部实验的使用如下实验步骤。
DNA克隆和位点-定向诱变
将含有来自大鼠NGF基因的前-原NGF编码序列的770碱基对EcoRⅠ片段（Whittemore    et    al.，1988）克隆成PBS    KS+（Stratagene）。使用来自这一质粒的单股DNA作为如Kunkel等.，（1985）所述以及为lbaNez等.，（1990）详述的以低核苷酸为基的位点-定向诱变的样板。以链-终止法进行的核苷酸序列分析（Sanger    et    al.，1977）证实这类转换。为了蛋白质表达，然后将含有所需转换物DNA插入物在pXM中亚克隆（Yang    et    al.，1986）。
重组体蛋白质的制备和数量
利用葡聚糖-氯奎程序（Luthman    and    Magnusson，1983）将生长至70%合生的COS细胞转染25μg质粒DNA/100mⅢ。为了校正由不同构造制得的重组体蛋白质数量的差别，将平行转染的35mmⅢ在有100μcl/ml35S-半胱氨酸存在下生长（Amersham）。然后通过SDS/PAGE分析条件培养基的等分试样并在如上所述的相应放射自显影照片的光密度计扫描后平衡不同试样的重组体蛋白质的量（lbanez et al.，1991b）。利用提纯的小鼠NGF的标准样品通过条件培养基的定量免疫印迹和通过测量经培养的交感神经节中的生物活性分析亲本NGF蛋白质的绝对量（lbà nez et al.，1990;lbanet et al.，1991b）。然后利用由这些分析所得到的数据测定含突变体蛋白质的试样中该蛋白质的浓度。
脉冲追踪和免疫沉淀
在转染后48小时，将细胞在无半胱氨酸的培养基中培育4小时。然后用1mCi/ml35S-半胱氨酸在15分钟内对这些细胞作脉冲标记。通过用加了2mg/ml冷半胱氨酸的完全培养基取代标记培养基进行此追踪。在不同时间收获平行的井并用抗小鼠NGF的多克隆兔抗血清（兔no.30）使细胞提取物和条件培养基免疫沉淀（Ebendal et al.，1989）并通过在如前所述的还原条件下（lbà nez et al.，1990;lbà nez et al.，1991b）用SDS/PAGE对其进行分析。
结合试验
通过氯胺-T法用125Ⅰ将小鼠NGF标记至平均比放射性为3×107cpm/μg。以2-10×106细胞/ml使用大鼠PC12细胞（Greene and Tischler，1936），人A875细胞（Buxser et al.，1983）和小鼠rtrk-3T3细胞（Kaplan et al.，1991a）使用1.5×10-9M125Ⅰ-NGF连续稀释的含有相等量亲本的或突变的NGF蛋白质的条件培养基，于37℃进行竞争试验测定稳态结合。以相同时间添加所有组分并在达到平衡后（1-2小时培养）通过离心分离收集这些细胞。使用得自伪转染COS细胞的培养基进行的对比实验表明，在条件培养基中存在的其他蛋白质对125Ⅰ-NGF与细胞的结合没有任何效果。在向其中添加至少过量1000倍摩尔的未标记NGF的平行培养中测定非特性结合。对全部结果进行这一非特性结合的校正，该结合总是小于总结合的10%。测定得到50%结合（IC50）的各种突变体和野生型NGF的浓度。使用关系式：（突变体IC50/野生型IC50）×100计算相对的结合。
生物试验
对含有相等量重组体蛋白质（范围为0.2-20ng/ml）连续稀释的条件培养基在如上所述的人工培植的9天期小鸡胚胎交感神经节上进行生物活性试验（Ebendal，1984;Ebendal，1989）。通过与从提纯的小鼠NGF得到的标准样品比较，以生物单位（BU）的半定量标度计算纤维赘疣，对其而言1BU相当于约5ng/ml。测定每种以这一标度而给出的0.5BU的NGF蛋白质的浓度，并用以计算与以亲本NGF所得到活性相比而成的相对活性。
用连续稀释的含有相等量重组体蛋白质的条件培养基培养将涂在覆以聚-D-酪氨酸的35mm井中的细胞进行培养。用显微镜在不同时间间隔测定带有长于二个细胞直径的纤维的细胞的百分数。
通过对来自含有相等量重组体亲本和突变体NGF的条件培养基稀释物处理过的PC12细胞的全部mRNA进行定量Northen印迹分析，测量C-fos mRNA的诱导。按如上所述（lbà nez et al.，1990）提取全部RNA。在含有0.7%甲醛的琼脂糖凝胶中将10μg总RNA电泳，然后转移入硝化纤维膜上。然后用α-32P-αCTP放射性标记的大鼠C-fos基因片段（Curran et al.，1987）与滤料杂交并严格地洗涤。通过放射自显影照相的光密度计扫描测定C-fos mRNA的量。
在35mm涂覆聚-D-酪氨酸的井中以30000细胞/井的密度培养得自出生后一天大鼠的上颈神经节的离解的神经元。按涂覆时间添加顺次稀释的含有相等量重组体蛋白质的条件培养基并在72小时后通过相差显微镜测定神经元的存活率。
实施例1
和与PC12细胞受体结合有关的β-发夹环30-34中的氨基酸基团
实验与结果
使用含有等量突变体NGF蛋白质的条件培养基从其在NGF应答嗜铬细胞瘤细胞系PC12上的受体中置换125Ⅰ-NGF。用这样一种浓度的125Ⅰ-NGF（～1.5nm）进行竞争性结合试验：在该浓度下80%与该细胞相关的放射性标记配体与低亲和力NGF受体相结合。（Sutter et al.，1979）。计算从PC12细胞（IC50）中置换出50%125Ⅰ-NGF所需的亲本的和突变型蛋白质浓度（表1）。精氨酸（Arg）对赖氨酸25（Lys25）的保守置换或任意这三种残基（26、27和29）被丙氨酸（Ala）置换都不会影响该蛋白质对PC12细胞上的受体的亲和力（表1）。然而，当修饰天冬氨酸30（Asp30）或异亮氨酸31（He31）时，观察到亲和力降低3-4倍（见实施例2，表1和图4A）。此外，通过用甲硫氨酸（Met）（在BDNF中这一位置上产生的基团）（Leibrok    et    al.，1989）和用缬氨酸（Val）置换进一步测试异亮氨酸的重要性。有意义的是，只有最保守的变更（131V）才可使结合亲和力类似于亲本NGF（表1）。在用丙氨酸（Ala）置换赖氨酸32（Lys32）后可观察到受体结合的显著降低，在该场合下，与亲本NGF相比降低约6倍（表1和图4A）。用丙氨酸（Ala）置换赖氨酸34（Lys34）和用亮氨酸（Leu）置换缬氨酸36（Val）分别将结合降低到50和45%（重量）（表1和图4A）。出乎意料的是，未经完全处理的E35A突变体显示接近于亲本的结合亲和力（表1和图4A），这表明了NGF生物合成的中间体可与NGF受体象成熟细胞一样有效地结合。
讨论
NGF二聚物的晶体结构（McDonald    et    al.，1991）展现了一种由三对不平行的股和四个环区所组成的新型结构，所述环区包含几乎所有可在不同NGF相关分子间见到全部可变残基。这些环中的一个相应于在本发明的研究中所分析的残基团并包括一个β-发夹转折（基团30-34）。我们的结果表明，区域25-36中的这些残基对NGF分子的稳定性、受体结合和生物活性是重要的（图9A）。
由于只有密切相关的精氨酸（Arg），而不是丙氨酸（Ala）或谷氨酰胺（Gln）可在这一位置置换赖氨酸（Lys）形成稳定的蛋白质，因此表明了赖氨酸25（Lys25）起一种重要的结构作用。按照这一观点，该晶体结构展示了赖氨酸25（Lys25）使侧链氢与谷氨酸55（Glu55）结合，这对NGF蛋白质的正确折叠是重要的（McDonald    et    al.，1991）。丙氨酸28（Ala28）的缺失阻止了NGF蛋白在条件培养中累积，而该累积是表明这一位置的结构作用的。
谷氨酸35（Glu35）置换丙氨酸（Ala）导致产生了23-34K范围的未完全处理多肽，该多肽显示了具有与经完全处理的亲本分子类似的受体结合亲和力和生物活性。在试管内合成的35K全长NGF母体早就表明具有非常低的生物活性这一事实提示了去除某些氨基终端序列对激活NGF母体可能是重要的（Edwards    et    al.，1988）。我们的结果也证明，除了NGF前肽中的保守范围外（Suter    et    al.，1991），成熟分子中的残基也在完全处理的成熟NGF的生物合成中起作用。
用亮氨酸（Leu）置换缬氨酸36（Val36）上的非极性侧链也显出将影响与PC12细胞的受体结合。与异亮氨酸31（11e31）相反，缬氨酸36（Val36）深埋在NGF单聚物中并似乎与形成NGF亚单位的疏水芯有关（McaDonald    et    al.，1991）。是亮氨酸（Leu），而不是丙氨酸（Ala）可在这一位置置换缬氨酸（Val）的事实表明了缬氨酸36（Val36）对该分子芯疏水作用的重要性并提出了，缬氨酸36（V36L）突变体结合的降低可能反映了为在这一位置容纳较大的亮氨酸（Leu）侧链所需的结构上的重新安排。
实施例2
Asp30和Ile31的修饰
实验及结果
首先通过检测该突变性NGF蛋白的刺激出自E9小鸡交感神经节的轴突赘疣的能力来研究其特有的生物活性（Levi-Montalcini and Angeletti 1968）;Ebendal 1984;Ebendal 1989）。与其从PC12细胞中置换125Ⅰ-NGF的能力一致，该突变体K25R、T26A、T27A及T29A的生物活性都与亲本NGF的该活性相似（表1）。为检测在单个地改变时的Thr残基可对其修饰作出补偿的可能性，在三个Thr残余同时被Ala取代的场合下产生一个三重突变体。然而，该突变体未能在转染细胞介质中以可检测的程度积累起来（表1）。
通过与其相应的受体结合亲合性（表1）相关的D30N和131A突变体（表1及图4B）看到生物活性下降了4倍。为消除因这些突变体分子稳定性的降低（图2C）而使活性下降的可能性，在PC12细胞中检测C-fos    mRNA的诱发。资料证明，在这些细胞中的C-fos    mRNA诱发的最大值发生在暴露NGF后的30-45分钟之内（Milbrandt，1986;Gizang-Ginsberg    and    Ziff，1990），时间周期比这些分子的估计半存留期短20-30倍，在PC12细胞暴露于亲本NGF（图4C）30分钟后，测到C-fos    mRNA中的峰。D30N和131A两种突变体在30分钟后诱发出最大量的C-fos    mRNA，然而，该值比从亲本NGF（图4C）所获得的最大值小4倍。
有意义的是，具有降低了的，对PC12细胞（131M、K32A、K34A及V36L）的结合亲合性的四种突变体显示出亲本水平的生物活性（表1及图4B）。因此，对K32A突变体而言，结合力降低了6倍并不影响其在交感神经节中的生物活性（比较图4A和B）。尽管事实上E35A突变体仅含约5%的经正确处理的成熟蛋白（表1和图4B），根据受体结合力数据，它仍显示出亲本水平的生物活性。
讨论
某些重要的氢键合侧链掩盖在该NGF亚单位中，包括Asp30中（McDonald    et    al.，1991）。这些结果表明，当被Ala，一种不使所推荐的氢键成为在Lys34处结合到该主键的Asp30侧链的残基取代Asp30时，该NGF分子的半留期缩短了约20倍。D30N突变体的这一降低了的回收率及半存留期表明，Asn可在这一位置起作用，虽然该作用的效率较低。另一方面，去除Gly33或用丙氨酸取代Gly33导致NGF蛋白回收率的减少，可能这是由于该分子的稳定性下降的缘故。在该位置甘氨酸可因有一超出带有侧链的氨基酸允许范围的主链扭转角而形成一个转折（Sibanda    et    al.，1989）。综合起来，因Asp30及Gly33突变体带来的这一结果暗示，这些残基对β-发夹环30-34的稳定起了结构性的作用，以及通过改变该环的结构而使它们的修饰具有功能性的效果（图9A）。这些部位在NGF族其它成员中的高度保守暗示着这些残基在其它三种促神经激素中也起着类似的作用。
由于在30-34处的转折，该疏水的Ⅰle31就暴露在分子的表面上。Ala对这一残基的取代降低了在PC12细胞中的受体结合力和生物活性。有意义的是，在取代成Met后，仅生物活性而不是受体结合力被夺走，而变成Val后可见到野生型的结合和生物活性。另外，初步结果表明与131A突变体中的P140trk的结合降低了5倍，而在131M中的这一结合为亲本水平。综合看来，这些结果暗示了Ⅰle31非极性侧链在与P140trk结合相关生物活性及低的亲合结合两方面的作用（图9A）。
实施例3
以Ala同时取代Lys32、Lys34及Glu35
其中每单个突变对生物活性不产生影响的三个带电残基Lys32、Lys34及Glu35被Ala同时取代，从而在这些位置消除该带电侧链。有意义的是尽管事实上这种突变蛋白含有E35A突变（图3A），但它仍能作为充分处理过的蛋白完全回收。该三重突变将这些蛋白对PC12细胞的结合降低到小于对亲本分子所观察到的这一结合的1%（表1及图4A）。在添加125Ⅰ-NGF前在该细胞用该突变蛋白将这些细胞预培养2小时时，得到同样的结果（未示出）。然而，该三重突变体在交感神经节中的生物活性与亲本NGF活性很接近（表1及图4B）。
检查PC12细胞中的神经赘疣以检测与这些细胞中的生物活性相关的结合是否减少（图5A）。
单个Lys32、Lys34及Glu35改变成Ala并未明显地改变这些蛋白刺激神经赘疣的能力，尽管它们与这些细胞上的NGF受体的亲合力不同。此外，该三重突变体（K32A+K34A+E35A）还具有亲本活性，虽然它对PC12细胞的低亲合力结合大大减小（图5A）。
由于受体间较慢的降解而在结合和生物活性间观察到明显不同的可能性也经受检查。如以其它的经受受体间内吞作用的肽激素（如胰岛素）所能看到的，当经过长时间的检查时，降低的结合亲合力不是总能解释成一种降低了的生物活性。由于这一结合的下降，突变体分子可有一较低的受体间的降解率，导致较慢的，但时间延长的，在积累一段时间后能达到亲本水平的生物活性。为调查这一可能性，研究了PC12细胞中的早期的（C-fos    mRNA诱导）和晚期（刺激轴突赘疣）的应答动力学。尽管它们的结合亲合力下降，但K32A和该三重突变体均以与亲本分子相同的时间过程和强度诱导了C-fos    mRNA和轴突赘疣（图5B和C）。
实施例4
Lys32及Lys34的突变对NGF结合的影响
对PC12细胞所作的受体结合试验是用高浓度125Ⅰ-NGF完成的，在这一浓度下，大部分观察到的这种结合是低亲合力类型的（Sutter et al.，1979）。然而，由于PC12细胞表达P75NGFR和P140trk这两种受体（Herrup and Thoenen，1979;Hosang and Shooter，1985;Kaplan et al.，1991b），所以这些结果不能清楚地区分NGF与这两种分子中的任一种的结合。因此，将突变体K32A、K34A、E35A和三重突变体K32A+K34A+E35A对A875，即一种仅表达高量P75NGFR的人类黑素瘤细胞系（Buxser et al.，1983）的结合亲合力与对rtrk-3T3细胞，即一种表达大鼠P140trk的成纤维细胞系（Kaplan et al.，1991a）的结合亲合力进行比较。
用Ala的甲基取代Lys32的带正电荷的侧链使该分子对P75NGFR的结合降低到亲本NGF所观察到的这种结合的5%（表2及图6）。Lys34改变成Ala使A875细胞的结合降低到亲本水平的50%。然而Lys32、Lys34及Glu35的同时取代则完全消除了该突变体分子对P75NGFR的结合（表2及图6）Glu单独改变成Ala对与A875细胞的结合亲合力没有影响（表2及图6），这表明，对该三重突变体所观察到的这种结合的减少是由于修饰了带正电荷残基Lys32及Lys34的缘故。
尽管其对P75NGFR的结合下降了20倍，但K32A突变体在对表达在rtrk-3T3细胞上的P140trk的结合方面仍难与亲本NGF区分（表2，图6）。类似的是，K34A和E35A突变体也显示出与亲本一样的对P140trk的亲合力（表2及图6）。有意义的是，未从P75NGFR中取代125Ⅰ-NGF的该三重突变体仍保留对P140trk的明显的结合，程度为对亲本NGF所观察到的这种结合的约55%（表2及图6）。再者，在另一涉及NGF分子的实施方案中，Lys32、Lys34及Lys95形成一种关系到对P75NGFR结合的正电荷界面。用两种其它的赖氨酸中的任一种修饰Lys32导致了对P75NGFR结合的下降。尽管缺少对P75NGFR的结合，当通过PC12细胞的神经元分化及经培养的交感神经的存活率进行测量时，这些突变体仍保留对P140trk的结合以及生物活性。
实施例5
25-36区域中残基的修饰改变NGF分子的稳定性
应用丙氨酸-扫描诱变（Cunnigham    and    Wells，1989）以描绘在大鼠NGF的氨基酸残基25和36之间区域中结构和功能上重要残基的图形。这一区域在不同的脊椎动物的物种中高度保守（图1A），并且在NGF族中的其它成员中保守50-60%（图1B）。突变型蛋白被瞬时地在COS细胞中表达。为使用于受体结合的生物分析的突变蛋白的量标准化，用在规定的转染细胞的条件培养基中的经代谢标记的多肽的SDS-PAGE来评估突变型蛋白的产率。如在表1中所示，突变型NGF蛋白在整个一段10倍的范围内变化。五种该突变型蛋白（K25A、A28△、D30A、G33△及V36A）未在该培养基中以可测出的水平积累。有意义的是，这些残基相应于来自在NGF族不同成员中严格保守的这一范围中的五个位置（图1B）。在Lys25或Gly33分别变成更类似的氨基酸残基Gln和Ala后均未检测到蛋白（表1）。相反，D30A和V36A突变体可因分别被取代成Asn和Leu而被夺走，尽管减少的程度低于对野生型（wt）蛋白所观察到的这一程度（表1）。Lys25也变成在这一位置最可能保守取代的Arg。这种突变得以以约50%的亲本蛋白水平测到NGF蛋白（表1）。
在突变型蛋白的量上所观察到的变化可反映出COS细胞中各单独的多肽的蛋白合成、稳定性或分泌方面的差别。为区别这些可能性，进行脉冲追踪实验，然后再进行免疫沉淀和SDS-PAGE。15分钟的脉冲后，可从细胞提取物中免疫沉淀出占优势的23K亲本NGF前体蛋白。经充分处理，追踪30分钟后测到突变体13K    NGF，而3小时后几乎全部细胞内NGF均已消失。细胞内NGF的消失与追踪后6小时呈峰值状态的，而且在该水平保持至少14小时以上的，在该培养基中出现的NGF有关（图2B）。所产生的比亲本NGF低3-4倍的131A突变体（表1）在该转染细胞中累积到与亲本蛋白相类似的程度（图2A）。然而，在该培养基中检测到较低量的131A突变体，而在追踪后最后17小时发现下降了50%（图2B），这表明131A蛋白的稳定性下降。类似的是，在3小时追踪后以比亲本NGF低10倍的量产生的D30N突变型蛋白（表1）明显减少（图2C）。另外，追踪3小时后还可看到含量非常低的D30A突变蛋白，然而在以后的12小时后它们下降到测不出的程度（图2C）。131A、D30N和D30A突变型蛋白的经缩短的半存留期分别估计为18、12和3小时，这表明这些突变体产率下降的原因是由于这些蛋白在条件培养基中的稳定性较低的缘故。追踪3小时后在D30N和D30A突变体中所见到的大大下降的峰值暗示，在此情况下蛋白合成也受到影响（图2C）。
实施例6
Glu35取代Ala
在条件培养基中，检测到含量相应于亲本NGF的5%的经充分处理的，成熟的E35A突变型蛋白（表1）。然而，经免疫沉淀后，某些在该亲本NGF样品中仅被极微弱地测到的分子量较高的多肽（在20-34K的范围内）观察到（图3A）。在70℃，有1%SDS和1.5M    NaCl存在，在免疫沉淀之前的条件培养基的预处理不影响从E35A突变体中免疫沉淀出该多肽的模式（未示出），这表明分子量较高的多肽不代表与E35A突变体共沉淀的不相关的蛋白。反之，这些多肽的尺寸暗示：它们代表未经完全处理的，在E35A蛋白生物合成中的中间体。用此突变体所作的脉冲追踪实验表明：这一蛋白质未经完全处理的及成熟的两种形式在条件培养基中是非常稳定的（图2C及3B）。
实施例7
Lys95中的改变对P75NGFR结合的影响
实验及结果
以Lys32、Lys34和三重突变体所取得的结果暗示，这二种带正电荷的残基构成3NGF和P75NGFR之间的接触点。计算机图形所作的NGF结晶结构实验表明：另一带正电的残基，Lys 95在立体形态上接近于Lys32及Lys34。当在其它两种残基的情况下时，Lys95也被充分暴露，而且不参与二次相互作用。为检测Lys95也能参加与P75NGFR分子接触的可能性，用Ala取代这种残基，还产生了二重突变体K32A+K95A及一种四重突变体K32A+K34A+E35A+K95A。K95A突变体与亲本NGF相比显示出为与PC12细胞结合的65%（图÷）。然而K95A与K32A或与K32A+K34A+E35A的结合将与PC12细胞的结合急剧地降至亲本水平的0.7%（图7）。对PC12细胞的低亲合力结合的下降是与表达在A875细胞上P75NGFR结合的下降相关（表2及图7）。在四重突变体的情况下，未能测到IC50。然而，尽管它们没有与P75NGFR结合的能力，但这些突变体保留了从表达在成纤维细胞上的P140trk中取代125Ⅰ-NGF的能力（表2及图7）并以明显的程度助长来自交感神经元的轴突赘疣（图8A）。
三重突变体K32A+K34A+E35A及二重突变体K32A+K95A提供了检验在神经元存活中P75NGFR的作用的可能性。检测经培养3天后，自大鼠上颈部神经节中分离出的交感神经元的存活率。当与亲本NGF或提纯的小鼠NGF比较时，不到5%的这种细胞在有得自经模拟转染的细胞的介质存在时，或在正常的介质中存活（图8B）。然而，在用突变型NGF处理过的培养液中，神经元存活的这一程度与对亲本蛋白所观察的这一程度相同（图8B）。
讨论
NGF的晶体结构表明：暴露出带正电荷侧链的基团群接近于并环绕β-发夹环30-34（图9B和C）（McDonald et al.，1991）。对P75NGFR所观察到的高的，总共的负电荷（估计为4Pl）（Radeke et al.，1987）可能需来自这一区域中的高碱性NGF二聚物（Pl 9.3）的辅助离子相互作用。这里提到的结果对这样一种概念提供了强有力的支持，即：这些带正电的氨基酸残基起着NGF和P75NGFR间的主接触点的作用。一系列证据支持这一假说：首先，如为结晶结构所表明的那样，Lys32、Lys34和Lys95被高度暴露（50-70%的侧链溶剂可达性），而且其侧链在该分子中无结构作用（McDonald et al.，1991）。其次，如本文所示，用Lys32取代Ala将该突变体对在低亲合力结合条件下结合在PC12细胞上的受体的亲合力降低了6倍。第三，Lys32、Lys34和Glu35的同时取代进一步将对PC12细胞的低亲合力结合降低到对亲本NGF所观察到的这一结合的1%以下。这不归因于E35A的突变，因为用Glu35取代Ala并未改变结合的亲合力。第四，当与K32A结合时，取代Lys95有一种协同效应，它将对PC12细胞的结合降低到几乎测不出的程度。第五，在所有的情况下，对PC12细胞的低亲合力结合的下降与对表达在A875的细胞上P75NGFR的结合的下降相关。在三重突变体K32A+K34A+E35A及二重突变体K32A+K95A的情况下，与P75NGFR的结合完全消失或分别下降150倍。第六，尽管对P75NGFR的结合减少，但所有的突变型NGF仍保留对P140trk的结合及生物活性，这进一步证实，低亲合力结合的减少不归因于该类突变型蛋白结构中的剧烈变更。
对该多重赖氨酸突变体所观察到的这种协同效应表明：这些带正电的P75NGFR残基在形成与P75NGFR结合的界面时起配合作用（图9B及C）。Lys32看来似乎是形成这种最强的接触，再加上Lys34，它们可能是这种在K32A突变体中观察到的残基结合的主要原因。另外的带正电的残基，如先前研究过的Arg100和Arg103（Ibà nez et al.，1990）及可能有的Lys88也会对该结合界面产生影响（图9B和C）。K32A+K34A+E35A及K32A+K95A突变体中的对P75NGFR的结合的减少说明：在NGF的表面上需要有最小数量的正电荷，以提供与P75NGFR的稳定接触。这种模式不排除这样的可能性：即，其它类型的接触，例如疏水残基Ⅰle31也会有助于使NGF和P75NGFR间的结合稳定。
其它三种已知的促神经激素也可与该低亲合力NGF受体结合（Rodriguez-Tebar    et    al.，1990;Ernfors    et    al.，1990;Squinto    et    al.，1991;Hallbook    et    al.，1991）。Lys95被保守在迄今所述及的所有四种蛋白中，而在NT-3和NT-4中，Lys34被Arg，另外的带正电的氨基酸残基所取代。Lys34还保守在NT-4中，然而，在BDNF中，Lys32和Lys34分别被Ser和GLy取代。有意义的是，BDNF中的残基93-96的立体封闭环有三个可补偿Lys32和Lys34缺乏的连续的带正电荷残基。为支持这种假说，具有被BDNF中相应残基取代的残基23-35（可变区Ⅰ）的嵌合NGF分子（Ibà nez et al.，1991a）显示降低10倍的对PC12细胞的低亲合力结合。该低亲合力结合在另外的，得自BDNF的，包含可变区Ⅰ和残基94-98（可变区Ⅴ）的嵌合分子中被恢复，这表明在BDNF中的位置95、96和97的这三个带正电残基确实可补偿Lys32和Lys34的缺乏。虽然NGF和BDNF在与P75NGFR的结合上不相上下，但这种受体也能识别该二种配位体间的区别，在BDNF的情况下这类区别是以正的协同性和较慢离解动力学反映出来的（Rodriguez-Tébar et al.，1990）。因此，很明显BDNF和NGF虽然类似但结构不同还是可被P75NGFR所识别。这些结果对在NGF和BDNF间所观察到的区别作了结构上的解释，并说明其它的促神经激素可通过同一区域与P75NGFR相互作用。
本发明不限于本文所述的特定实施方案的范围。实际上对本技术领域中的普通技术人员而言从上面的叙述及附图将很清楚：除本文上述的内容之外，本发明有多种的变化。这些变化用来进入所附的权利要求书的范围中。
表1
野生型和突变型NGF蛋白质的相关产率、与PC12细胞受体结合和特定生物活性。
突变型蛋白a产率b受体结合c生物活性c
野生型    野生型的(%)
wild  type    100    100    100
K25A    -    -    -
K25Q    -    -    -
K25R    50    130    100
T26A    40    100    100
T27A    46    120    63
A28△    -    -    -
T29A    18    71    74
T26A+T27A+T29A    -    -    -
D30A    -    -    -
D30N    11    25    23
I31A    28    30    25
I31M    50    35    100
I31V    34    130    100
K32A    76    16    100
G33△    -    -    -
G33A    -    -    -
K34A    53    50    100
E35A 5d85e85e
K32A+K34A+E35A    65    <1    65
V36A    -    -    -
V36L    51    33    90
a.以野生型（wt）残基（单个氨基酸标记），再以其密码子号及该突变体残基缩写这些突变体，△表示被删去的相应的残基。
b.代谢标记的条件培养基的SDS-DAGE后算出的稳态程度。短线表示突变型蛋白量低于可测出程度（＜2%（wt）NGF）。
c.得自剂量-应答实验的数据，它们在本文报导的平均值的±10%的范围内变化。
d.基于充分处理形式的数据（详见主文）。
e.基于经处理及未经处理形式的数据（详见主文）。
表2
野生型和突变型NGF蛋白质与A875和rtrk-N1H3T3细胞的相关受体结合。
突变型蛋白    与A875    与rtrk-NIH
细胞的结合    3T3细胞的结合
野生型的(%)
野生型    100    100
K32A    5    100
K34A    55    90
E35A    100    100
K32A+K34A+E35A no IC5055
K95A    55    80
K32A+K95A    <1    40
K32A+K34A+E35A+K95A no IC5040
得自三个单独实验的数据，它们在本文报导的平均值的×10%的范围内变动。

Claims (18)

1、一种突变型神经营养性因子，所述因子包括一种具有对一个或多个氨基酸修饰而致使最终的该突变型神经营养性因子保持对irk受体的结合能力，但降低对低亲合力NGF受体的结合能力的亲本营养性因子。
2、权利要求1的突变型神经营养性因子，其中所述的亲本神经营养性因子系选自由神经生长因子、脑引发神经营养性因子、NT-3和NT-4所组成的组中。
3、权利要求2的突变型神经营养性因子，其中所述的修饰由以不带电的或带负电的氨基酸在氨基酸30-34或氨基酸93-98取代至少一个带正电的氨基酸所构成。
4、权利要求3的突变型神经营养性因子，其中所述的修饰是取代Lys95。
5、权利要求4的突变型神经营养性因子，其中所述的Lys95被Ala取代。
6、权利要求3的突变型神经营养性因子，其中所述的亲本神经营养性因子是神经生长因子。
7、权利要求6的突变型神经营养性因子，其中所述的修饰是取代Lys32。
8、权利要求6的突变型神经营养性因子，其中所述的修饰是取代Lys34。
9、权利要求7的突变型神经营养性因子，其中所述的修饰还包括取代Lys34。
10、权利要求7的突变型神经营养性因子，其中所述的修饰还包括取代Lys95。
11、权利要求3的突变型神经营养性因子，其中所述的亲本神经营养性因子是NT-3，而所述的修饰是取代选自由Arg32、His34、Asn93及Asn94所组成的组中的一种或多种氨基酸。
12、权利要求3的突变型神经营养性因子，其中所述的亲本神经营养性因子是BDNF，而所述的修饰是取代选自由Lys95、Lys96及Arg97所组成的组中的一种或多种氨基酸。
13、权利要求3的突变型神经营养性因子，其中所述的亲本神经营养性因子是NT-3或NT-4而所述的修饰是取代Arg32。
14、权利要求3的突变型神经营养性因子，其中所述的亲本神经营养性因子是NT-4而所述修饰是取代Glu94或Arg96。
15、改变神经营养性因子的受体结合特性的方法，它包括修饰所述因子以降低该因子对低亲合力NGF受体的结合能力。
16、权利要求15的方法，其中所述的修饰包括以相对来说不带电的氨基酸取代带正电的氨基酸。
17、权利要求15的方法，其中所述的修饰由以一个不带电的或带负电的氨基酸在氨基酸30-34或氨基酸93-98取代至少一个带正电的氨基酸。
18、增强神经营养性因子稳定性的方法，它包括改变产生于该因子的氨基酸25-36间的氨基酸残基，
通过与亲本分子比较测量此经改变的分子的稳定性和生物活性，及选择那些证实生物活性与亲本分子基本相同，稳定性较亲本分子增强了的因子。
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