DE69332047T2 - Neurotrophe faktoren mit veränderter rezeptorbindungsspezifität - Google Patents

Neurotrophe faktoren mit veränderter rezeptorbindungsspezifität

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Description

    Einführung
  • Die vorliegende Erfindung stellt Nerven ernährende Mutantenfaktoren der Familie Nervenwachstumsfaktoren bereit, die eine modifizierte Rezeptor-Bindungsaffinität und biologische Spezifität aufweisen. Die Erfindung basiert zum Teil auf der Entwicklung eines Modell-Systems, das für das rationale Design von Analogen und Chimären von Nerven ernährenden Faktoren nützlich ist.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Die Kontrolle des Zellwachstums und der Zelldifferenzierung erfordert spezifische Faktoren, die ihre Wirkungen über eine Wechselwirkung mit Rezeptoren auf der Oberfläche von responsiven Zellen entfalten. Trotz der steigenden Zahl von Wachstums- und Differenzierungsfaktoren, die entdeckt und charakterisiert wurden, sind die präzisen Strukturen, die in die Bindung und biologische Aktivität involviert sind, und die folgenden und ursächlichen molekularen Ereignisse, die der Aktivierung mehrerer Rezeptoren zugrunde liegen, in weiten Bereichen unbekannt.
  • Der Nervenwachstumsfaktor (nerve growth factor; NGF) ist ein 118 Aminosäuren langes Polypeptid, das das Überleben, die Entwicklung und die Differenzierung des sympathetischen Nervensystems sowie von Teilen des sensorischen und zentralen Nervensystems steuert (Levi-Montalcini und Angeletti, 1968, Thoenen und Barde, 1980; Whittemore und Seiger, 1987; Thoenen et al., 1987). Die biologisch aktive Form des NGF ist ein Dimer von identischen Untereinheiten, von denen jede aus einem Vorläufer-Molekül erzeugt wird (Angeletti und Bradshaw, 1971; Angeletti et al., 1973). Ein cDNS-Klon für den NGF wurde zuerst in der Maus isoliert (Scott et al., 1983). Anschließend wurde das NGF-Gen in einer Zahl anderer Spezies einschließlich einiger Säuger, Vögel, Reptilien und Fische charakterisiert (Schwarz et al., 1989; Halböök et al., 1991).
  • Der NGF gehört zu einer Familie von strukturell und funktionell verwandten Molekülen, die gemeinsam als Neurotrophine der Familie des Nervenwachstumsfaktors bekannt sind, die wenigstens drei andere Mitglieder einschließt, und zwar den aus dem Gehirn abgeleiteten neurotrophen Faktor (brain derived neurotrophic factor; BDNF) (Barde et al., 1982; Leibrock et al., 1989) Neurotrophin-3 (NT-3) (Hohn et al., 1990; Maisonpierre et al., 1990; Rosenthal et al.; 1990, Ernfors et al., 1990) sowie Neurotrophin-4 (NT-4) (Hallbööck et al., 1991; Ip et al., 1992).
  • Der NGF wechselwirkt mit einem Rezeptor niedriger Affinität, der auf einer Vielzahl von Zelltypen sowohl neuronalen als auch nicht-neuronalen Ursprungs exprimiert wird (Emfors et al., 1988; Yan und Johnson, 1988; Heuer et al., 1990; Hallböök et al., 1990). Die anderen drei Neurotrophine der Nervenwachstumsfaktor-Familie können sich ebenfalls an den NGF-Rezeptor niedriger Affinität binden (Rodrigues-Tebar et al., 1990; Ernfors et al., 1990; Squinto et al., 1991; Hallböök et al., 1991). Dieser Rezeptor wird wiedergegeben durch ein Transmembran-Glycoprotein mit einer Molekularmasse von etwa 75.000 D (Dalton) (p75NGFR) das den NGF mit einer Kd von 10&supmin;&sup9; M bindet (Johnson et al., 1986; Radeke et al., 1987). Jedoch ist eine Bindung mit hoher Affinität (Kd = 10&supmin;¹¹M), die auf eine Subpopulation von p75NGFR-positiven Zellen beschränkt ist, erforderlich, um die biologische Wirkung von NGF zu vermitteln (Banerjee et al., 1973; Herrup und Shooter, 1973; Sutter et al., 1979; Richardson et al., 1986). Zwar ist die molekulare Beziehung zwischen den beiden Rezeptor-Zuständen nicht vollständig klar; es haben jedoch einige Berichte angegeben, dass die zytoplasmatische Domäne von p75NGFR der es an strukturellen Merkmalen fehlt, von denen bekannt ist, dass sie eine Signalübertragung bei anderen Rezeptoren vermitteln, für eine Bindung hoher Affinität und eine Signalübertragung erforderlich (Hempstead et al., 1989; Yan et al., 1991; Berg et al., 1991).
  • Es wurde kürzlich demonstriert, dass das Proto-Oncogen trk für einen funktionellen Rezeptor für den NGF kodiert (Kaplan et al., 1991a; Klein et al., 1991). Das Produkt des trk-Proto-Oncogens ist ein 140.000 D großes Protein (p140trk), das ein Mitglied der Tyrosinkinase-Familie von Transmembran-Rezeptoren ist (Martin-Zanca et al., 1991). Obwohl postuliert wurde, dass dieses Protein an dem Primärsignal- Übertragungsmechanismus von NGF teilnimmt, bestehen erheblich Meinungsverschiedenheiten in Bezug auf die Gleichgewichts-Bindungskonstante von p140trk für NGF. Während Klein et al., (1991) berichteten, dass p140trk den NGF sowohl mit niedrigen als auch mit hohen Affinitäten bindet, berichteten Kaplan et al. (1991) und Hempstead et al. (1991), daß p 140uk den NGF mit einer Aktivität bindet, die ähnlich derjenigen von p75NGFR ist, und daß eine Co-Expression für beide Rezeptoren dafür erforderlich ist, daß eine Bindung mit hoher Affinität auftritt. Kürzlich wurde gezeigt, dass das Produkt des trk-Proto-Oncogens einen funktionellen Rezeptor für NGF darstellt (Kaplan et al., 1991a, Klein et al.,1991). Das Binden des NGF an p140trk führt zu einer schnellen Phosphorylierung dieses Moleküls und einer Stimulierung seiner Tyrosin-Kinase-Aktivität (Kaplan et al., 1991a; Kaplan et al., 1991b; Klein et al., 1991).
  • Im Gegensatz dazu blieb die Rolle von p75NGFR bei der Signalübertragung schwer definierbar. Kürzlich wurde berichtet, dass die zytoplasmische Domäne dieses Rezeptors in eine Mediation der neuronalen Differenzierung involviert ist (Yan et al., 1991) und dass NGF eine Tyrosin-Phosphorylierung (Berg et al., 1991) in PC12-Zellen induzierte. Jedoch haben andere, kürzlich erstellte Studien gezeigt, dass polyklonale Antikörper gegen p75NGFR ein Binden von NGF an dieses Molekül und etwas von dem Binden mit hoher Aktivität beseitigen, jedoch biologische Antworten auf NGF nicht inhibieren (Weskamp und Reichardt, 1991). Jüngere Berichte, bei denen Zell-Linien verwendet wurden, die p140trk exprimieren, haben gezeigt, dass in Gegenwart des NGF dieses Rezeptormolekül ein Überleben und eine mitotische Proliferation von Fibroplasten in Abwesenheit von p75NGFR vermitteln kann (Cordon-Cardo et al., 1991). Diese Studien konnten die Möglichkeiten nicht ausschließen, dass ein Binden an p75NGFR wichtig sein könnte bei der Vermittlung von NGF-Antworten in Neuronen und neuronenartigen Zell-Linien. Es wurde auch kürzlich gezeigt, dass trk-Proto- Oncogene eine NGF-Responsivität in PC12-Zell-Linien, die für Mutanten-NGF nichtresponsiv sind, wieder erwecken kann (Loeb et al., 1991). Jedoch exprimierten diese Zellen immer noch erhebliche Konzentrationsmengen an p75NGJt wodurch sie es schwierig machten, zu beurteilen, ob die Gegenwart dieses Moleküls für die beobachteten funktionellen Wirkungen erforderlich war.
  • Ein besseres Verständnis des molekularen Mechanismus, auf dem der NGF seine biologischen Wirkungen entfaltet, wird von einer Untersuchung von Struktur-Funktions- Beziehungen und der Schaffung von NGF-Mutanten mit veränderten Eigenschaften geliefert. Anfängliche Untersuchungen entlang dieser Linie haben die funktionelle Wichtigkeit von hochgradig konservierten Aminosäure-Resten in dem Hühner-NGF analysiert (Ibàñez et al., 1990). In noch jüngerer Zeit hat eine Analyse chimärer Moleküle zwischen NGF und BDNF Regionen aufgezeigt, die in eine Bestimmung der biologischen speziellen Eigenschaften dieser beiden Faktoren involviert sind (Ibàñez et al., 1991a). Ein Vergleich von NGF-Genen von verschiedenen Spezies hat Kluster von Aminosäure-Resten offengelegt, die über verschiedene Gruppen von Wirbeltieren hochgradig konserviert sind (siehe Fig. 1, die die Konservierung von Aminosäure- Resten 25 bis 36 (Ein-Buchstaben-Code) in NGFs von verschiedenen Spezies und in dem homologen Bereich verschiedener Neutrophine demonstriert).
  • Fig. 1A zeigt eine Aneinanderreihung von Resten 25 bis 36 von NGF von der Ratte (Whittermore et al., 1988), der Maus (Scott et al., 1983), des Menschen (Ullrich et al., 1983), des Rinds (Meier et al., 1986), des Meerschweinchens (Schwarz et al., 1989), des Huhns (Ebendal et al., 1986; Meier et al., 1986), Xenopus (ref) und Schlange (Selby et al., 1987).
  • Fig. 1B zeigt eine Aneinanderreihung von Resten 25 bis 36 von NGF von der Ratte und die homologen Reste von BDNF von der Ratte (Maisonpierre et al., 1990), von NT-3 von der Ratte (Maisonpierre et al., 1990; Ernfors et al., 1990) und von NT-4 von Xenopus (Hallböök et al., 1991).
  • Von diesen konservierten Teilen ist die Region, die die Reste 25 bis 36 umfaßt, die am meisten hydrophile und ist daher diejenige, von der es am wahrscheinlichsten ist, dass sie sich auf der Oberfläche des NGF-Moleküls befindet (Meier et al., 1986; Ebendal et al., 1989). Synthetische Peptide, die auf der Grundlage diese Sequenzen entworfen wurden, inhibieren - wie gezeigt wurde - die biologische in vitro-Aktivität von NGF (Longo et al., 1990).
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt Nerven ernährende Mutantenmoleküle der Nervenfaktor-Familie bereit, die neue Rezeptor-Bindungsaffinitäten und -spezifitäten haben, verglichen zu ihren Ausgangsmolekülen. Die Erfindung basiert zum Teil auf der Verwendung von NGF als Modellsystem zur Bestimmung der Rolle spezieller Aminosäuren beim Binden des Moleküls sowohl an den p75-Rezeptor als auch an den p140trk-Rezeptor. Die vorliegende Erfindung basiert auf der weiteren Entdeckung, dass bei Verwendung solcher Modellsysteme Modifikationen an dem NGF durchgeführt werden können, die zu einem Verlust des Vermögens des Moleküls führen, sich an p75NGFR zu binden, während das Vermögen des Moleküls erhalten bleibt, sich an p140trk zu binden und eine biologische Aktivität zu zeigen, die vergleichbar mit derjenigen des Moleküls des Wild-Typs ist. In verschiedenen Ausführungsformen führen Modifikationen, die an NGF wie auch an entsprechenden Bereichen in anderen Gliedern der Familie der Nervenwachstumsfaktoren durchgeführt werden, zu neurotrophen Faktoren mit größerer Spezifität gegenüber dem trk-Signal-übertragenden Rezeptoren.
    • Beschreibung der Figuren
  • Fig. 1: Vergleich von Aminosäure-Resten 25 bis 36 (Ein-Buchstaben-Code) in NGFs von verschiedenen Spezies.
  • Fig. 2: Stabilität des Ausgangs- und Mutanten-NGF in COS Zellen.
  • Fig. 3: Auswirkung der E35A-Mutation auf das Processing des NGF- Propeptids
  • Fig. 4: Kompetitive Rezeptor-Bindung und biologische Aktivitäten des Ausgangs-(WT) und Mutanten-NGF.
  • Fig. 5: Biologische Aktivitäten in PC12-Zellen von Ausgangs-NGF und NGF- Mutanten mit fehlender Rezeptor-Bindung bei niedriger Affinität.
  • Fig. 6: Kompetitive Rezeptor-Bindung des Ausgangs-NGF und von NGF- Mutanten.
  • Fig. 7: Wirkung der K95A-Mutation auf die Rezeptor-Bindung von NGF an Rezeptoren bei verschiedenen Zelltypen.
  • Fig. 8: Biologische Aktivitäten in sympathetischen Neuronen von Ausgangs- NGF und NGF-Mutanten mit fehlender Bindung an p75NOl1t
  • Fig. 9: Funktionelle Zerlegung der Rezeptor-Bindungsstelle von NGF an p75NGFR
    • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Der Nervenwachstumsfaktor (nerve growth factor; NGF) bindet sich wie viele andere Wachstumsfaktoren und Hormone an zwei verschiedene Rezeptor-Moleküle auf der Membran von responsiven Zellen. Das Produkt des Proto-Oncogens trk, pll.O, ist ein Tyrosinkinase-Rezeptor, der kürzlich als signalübertragender Rezeptor für den NGF identifiziert wurde. Die Rolle des NGF-Rezeptors niedriger Affinität, p75NGFR Fit bei der Signalübertragung ist weniger klar. Die Kristallstruktur von NGF wurde kürzlich bestimmt, obwohl die Strukturen, die in einer Rezeptor-Bindung und in die biologische Aktivität involviert sind, nach wie vor unbekannt sind.
  • Auf eine aktive Stelle (site) gerichtete Mutagenese in Kombination mit Bindungs- Tests und biologischen Tests liefert ein wertvolles Mittel zur Abschätzung der funktionellen Bedeutung von Aminosäure-Resten, die mit dem Binden Nerven ernährender (neurotropher) Moleküle in Verbindung stehen. Solche Untersuchungen, kombiniert mit der Auflösung der dreidimensionalen Kristallstruktur von NGF (McDonald et al., 1991) ermöglicht die rationale Entwicklung Nerven ernährender Moleküle mit veränderten Rezeptor-Bindungseigenschaften.
  • Dementsprechend ist die vorliegende Erfindung gerichtet auf neue Nerven ernährende Mutantenfaktoren, in denen die einzige Modifikation das Ersetzen einer oder mehrerer Aminosäuren in dem Nerven ernährenden Ausgangsfaktor oder Nerven ernährenden Faktor des Wild-Typs der Familie der Nervenwachstumsfaktoren ist. Solche Modifikationen werden selektiert, um so das Binden des Faktors an den NGF-Rezeptor niedriger Affinität zu reduzieren, während man das Vermögen des Faktors, sich an einen trk-Rezeptor zu binden, beibehält.
  • Gemäß den im Rahmen der vorliegenden Erfindung in Betracht kommenden Ausführungsformen verändert eine Modifikation spezieller Aminosäure-Reste die Spezifität des NGF. Auf der Grundlage der dreidimensionalen Struktur von NGF wurde bestimmt, dass diese Veränderungen Veränderungen bei Aminosäure-Resten in einem β- Haarnadel-Loop sind, der auf dem außenseitigen Arm des NGF-Dimers nach außen zeigt (McDonald et al., 1991). Wie im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschrieben wird, scheinen Reste mit einer positiv geladenen Seitenkette innerhalb dieses Bereichs verantwortlich zu sein für den Hauptkontakt zwischen NGF und p75NGFR.
  • Die Anmelder haben entdeckt, dass NGF-Moleküle, die in diesen Positionen mutiert wurden, sich nicht an das p75NGFR binden, sondern die Bindung an das trk-Proto- Oncogen-Produkt erhalten und ihre biologische Aktivität aufrecht erhalten. Diese Ergebnisse schlagen vor, dass p140trk allein ausreichend ist - wenigstens in einer Kultur - um eine biologische Aktivität von NGF in neuronalen Zellen zu vermitteln. Experimente, die unter Verwendung mutierter NGFs durchgeführt wurden, zeigen, dass ein Binden an p75NGFR nicht für die Induktion einer frühen Gen-Expression erforderlich ist, wie beispielsweise c-fos, oder für eine neuronale Differenzierung von PC12-Zellen erforderlich ist. Weiter wurden weder ein Neurit-Auswachsen noch ein neuronales Überleben kultivierter sympathetischer Neuronen, die sowohl p75NGFRm-RNS und Protein (Emfors et al., 1988; Yan und Johnson, 1988) als auch trk-m-RNS exprimieren (G. Barbany, unveröffentlicht) durch den Verlust der Bindung an p75NGFR beeinträchtigt. Diese Ergebnisse zeigen zum ersten Mal, dass das trk-Proto-Oncogen-Produkt allein ausreichend dafür ist, einen Response an NGF in kultivierten neuronalen Zellen zu vermitteln, was damit einzigartige Möglichkeiten dafür eröffnet, die Rolle sowohl von p75NGFR als auch von p140trk bei der Vermittlung der biologischen Aktivitäten von NGF zu enträtseln und einzigartige Nerven ernährende (neurotrophe) Moleküle mit verbesserten Bindungsspezifitäten zu schaffen.
  • Obwohl es möglich sein kann, dass sich bei den im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschriebenen Mutanten NGF über eine unterschiedliche Bindungsstelle an eine neue Tasche bindet, die durch ein Heterodimer von p75NGfX und p140trk geschaffen wurde (Hempstead et al., 1991) oder das alternativ freie p75NGFR immer noch mit dem Komplex NGF-p140trk in Kontakt steht und auf diesem Wege bei der Signalübertragung zusammenarbeiten, wurden p75NGFR-p140trk-Komplexe nicht bei Vernetzungsexperimenten entdeckt, die entweder mit PC12-Zellen oder sensorischen Neuronen unter Bedingungen durchgeführt wurden, die einen Nachweis von p75NGFR- oder p140trk- Homodimere erlaubten (Meakin und Shooter, 1991). Die Tatsache, dass die Mutantenmoleküle gemäß der vorliegenden Erfindung eine Bindung an p140trk beibehalten, spricht stark für die Tatsache, dass die biologischen Aktivitäten allein durch dieses Rezeptormolekül vermittelt wurden.
  • Obwohl es nicht beabsichtigt ist, dass dies eine Beschränkung bildet, wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung postuliert, dass in bestimmten Neurotrophinen der Nervenwachstumsfaktor-Familie, nämlich bei NGF, NT-3 und NT-4, die positiv geladenen Aminosäuren in dem β-Haarnadel-Loop 30 bis 34 eine signifikante Rolle bei dem Vermögen der Moleküle spielen, sich an p75NGFR zu binden. So werden gemäß einer Ausführungsform der Erfindung Veränderungen an einer oder einigen dieser Aminosäuren in der Weise durchgeführt, dass die Gesamt-Ladung in diesem Bereich verändert wird. Dadurch wird das Vermögen des Moleküls, sich an p75LNGFR zu binden, reduziert, wobei das Vermögen der Moleküle beibehalten wird, sich an ihre entsprechenden trk-Rezeptoren zu binden. Gemäß der im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Definition ist der Aminosäure-Rest 1 der erste Aminosäure-Rest in dem reifen Protein.
  • In einer solchen Ausführungsform wird die positiv geladene Seitenkette von Lys32 beispielsweise durch die Methylgruppe von Ala ersetzt. Eine solche Reduktion verringert das Binden des Moleküls an p75NGFR auf 5% der Bindung, die bei dem Ausgangs-NGF beobachtet wird (Tabelle 2 und Fig. 6). In einer anderen Ausführungsform reduziert die Änderung von Lys34 zu Ala das Binden an A875-Zellen auf 55% des Wertes im Ausgangsmolekül. In noch einer weiteren Ausführungsform wird das gleichzeitige Ersetzen von Lys32, Lys34 und Glu35 durch Alanin dazu verwendet, vollständig das Binden des Mutantenmoleküls an p75NGFR zu beseitigen. Im Fall jeder dieser Mutanten behalten die Moleküle trotz eines verringerten oder völlig fehlenden Bindens an p75NGFR die biologische Aktivität des Wild-Typs an Auswüchsen sympathetischer Ganglien.
  • In einer zusätzlichen Ausführungsform werden Nerven ernährende Mutanten-Faktoren auf der Grundlage der Entdeckung entworfen, daß positiv geladene Aminosäuren um die Aminosäure 25 in einem zweiten β-Haarnadel-Loop mit Lys32 und Lys34 wechselwirken können und so eine positiv geladene Grenzfläche bilden, die in eine Bindung an p75NGFR involviert ist. Eine gleichzeitige Modifikation von Lys32 und mit einem der beiden anderen Lysin-Reste (Lys34 oder Lys35) führt zu einem Verlust der Bindung an p75NGFR. Trotz des Fehlens einer Bindung an p75NGFR binden sich diese Mutanten an p140trk und behalten ihre biologische Aktivität bei, wie durch neuronale Differenzierung von PC12-Zellen und das Überleben kultivierter sympathetischer Neuronen gemessen wurde.
  • Da die drei anderen bekannten Neurotrophine sich ebenfalls an den NGF-Rezeptor niedriger Affinität binden können (Rodrigues-Tebar et al., 1990; Ernfors et al., 1990; Squinto et al., 1991; Hallböök et al., 1991), wird erwartet, dass vergleichbare Änderungen in den entsprechenden Aminosäuren zu vergleichbaren Veränderungen der Bindungsspezifität führen, wobei sie nicht das Vermögen dieser Moleküle beeinträchwird in allen vier Proteinen, die insoweit beschrieben wurden, erhalten (in Xenopus NT-4 ist die Aminosäure-Position an Position 95 Lys, während in Human-NT-4 die Positionen 94 und 96 die positiv geladenen Aminosäuren Glutamin und Arginin sind). Weiter wird in NT-3 und NT-4 Lys32 ersetzt durch Arg. Lys34 wird auch in NT-4 beibehalten. Dementsprechend wird eine Veränderung bezüglich irgendeiner dieser positiv geladenen Aminosäuren (z. B. durch Ersetzen der positiv geladenen Aminosäure durch eine neutrale oder negativ geladene Aminosäure) zur Senkung der Bindung an p75NGFR als im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegend angesehen.
  • Die vorliegende Erfindung schließt auch veränderte Moleküle ein, wobei andere Modifikationen an dem β-Haarnadel-Loop-Bereich um Lys95 gemacht werden. Beispielsweise werden in BDNF die Reste der Lys32 und Lys34 ersetzt durch Ser bzw. durch Gly. Interessanterweise weist der räumlich nahe Loop der Reste 93 bis 96 in BDNF drei aufeinander folgende positiv geladene Reste (zwei Lysine und einen Arginin- Rest) auf, die eine Kompensation für das Fehlen von Lys32 und Lys34 darstellen können. Ein chimäres NGF-Molekül, in dem die Reste 23 bis 35 (variabler Bereich I) durch die entsprechenden Werte in BDNF ersetzt wurden (Ibàñez et al., 1991a) zeigten eine zehnfache Verringerung der Bindung an PC12-Zellen bei niedriger Affinität. Das Binden niedriger Affinität wurde wieder hergestellt in einem weiteren chimären Molekül, das sowohl den variablen Bereich I als auch die Reste 94 bis 98 aufweist (variabler Bereich V), und zwar aus BDNF, was zeigt, dass die drei positiv geladenen Reste in den Positionen 95, 96, und 97 in BDNF das Fehlen von Lys32 und Lys34 kompensieren können. Obwohl beide Moleküle NGF und BDNF gleichermaßen für die Bindung an p75NGFR zu konkurrieren scheinen, erkennt dieser Rezeptor auch Unterschiede zwischen den beiden Liganden, die sich im Fall von BDNF in positiver Kooperativität und langsamer Dissoziations-Kinetik widerspiegeln (Rodriguez-Tebar et al., 1990). Es scheint daher, dass BDNF und NGF von p75NGFR erkannt werden als ähnliche, wenn auch nicht identische Strukturen. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschriebenen Ergebnisse liefern eine strukturelle Erklärung für die beobachteten Unterschiede zwischen NGF und BDNF und schlagen vor, dass andere Neurotrophine mit p75NGFR über denselben Bereich in Wechselwirkung sein können.
  • Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind Modifikationen von Nerven ernährenden (neurotrophen) Ausgangsfaktoren zur Erhöhung ihrer Stabilität. Wie im Rahmen der Beschreibung beschrieben wird, scheint eine selektive Modifikation einer oder mehrerer der Aminosäure-Reste, die zwischen der Aminosäure 25 und der Aminosäure 36 der Nerven ernährenden Faktoren der Nervenwachstumsfaktor- Familie erscheinen, die Stabilität der Faktoren zu verändern. Dementsprechend kommt im Rahmen der Erfindung auch eine Veränderung solcher Aminosäuren in Betracht, gefolgt von einem Schritt des Messens der Stabilität und biologischen Aktivität der veränderten Moleküle zur Selektion solcher Faktoren, die ihre biologische Aktivität beibehalten, jedoch eine erhöhte Stabilität aufweisen, verglichen zu dem Ausgangsmolekül.
  • Die vorliegende Erfindung, die Zweitgenerations-Faktoren betrifft, die von Nerven ernährenden Faktoren abgeleitet sind, wie beispielsweise NGF, BDNF, NT-3 und NT- 4, kann verwendet werden zur Behandlung von Krankheiten in im wesentlichen derselben Weise wie die Ausgangsfaktoren. Beispielsweise können sie zur Behandlung von Krankheiten und Störungen des Nervensystems verwendet werden, die mit Veränderungen des Musters der Expression eines Nerven ernährenden Faktors in Verbindung stehen oder die von einem Kontakt mit dem Nerven ernährenden Faktor Vorzüge ziehen können.
  • In bezug auf Faktoren, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden und sich nicht an p7SNGFR binden, können solche Moleküle eine erhöhte Spezifität gegenüber Ziel-Zellen haben und können daher in niedrigeren Dosierungen wirksam sein. Weiter können solche Moleküle weniger Nebenwirkungen als die Ausgangs-Moleküle hervorrufen, die sich an eine weiter verbreitete Menge neuronaler Zellen binden. Ein rückwärts gerichteter Transport, von dem angenommen wird, dass er durch p75NGFR vermittelt wird, könnte durch die Verwendung von mutierten Neurotrophinen verhindert werden, wodurch eine lokale Wirkung mutierter Neurotrophine in bestimmten Bereichen des Gehirns ermöglicht wird, wo ihre Rezeptoren hoher Affinität ausgedrückt werden (wie beispielsweise im Hippocampus im Anschluß an Gehirnverletzungen).
    • Materialien und Methoden
  • Die folgenden experimentellen Verfahrensweisen wurden im Rahmen der in der Beschreibung beschriebenen Experimente verwendet.
    • DNS-Klonierung und auf aktive Stellen gerichtete Mutagenese
  • Ein 770 Basenpaare großes EcoRI-Fragment, das die pre-pro NGF-Kodierungssequenz von dem NGF-Gen der Ratte enthielt (Whittemore et al., 1988) wurde in pBS KS+ kloniert (Stratagene). Einzelsträngige DNS von diesem Plasmid wurde als Schablone für Oligonukleotid bezogene, auf die aktive Stelle gerichtete Mutagenese verwendet, wie sie durch Kunkel et al. (1985) beschrieben wurde und detailliert in der Beschreibung von Ibàñez et al. (1990) beschrieben wurde. Die ersetzten Stellen wurden durch Nukleotidsequenz-Analyse nach dem Ketten-Beendigungsverfahren (Sanger et al., 1977) bestätigt. Zur Expression des Proteins wurden dann Einschub-Teile, die die gewünschten ersetzten Stellen enthielten, in pXM unterkloniert (Yang et al., 1986).
    • Herstellung und Quantisierung rekombinanter Proteine
  • COS-Zellen, die bis etwa 70% Konfluenz gewachsen waren, wurden einer Transfektion mit 25 ug Plasmid-DNS per 100 mm Schale unter Anwendung des DEAE-Dextran- Chloroquin-Protokolls unterworfen (Luthman und Magnussen, 1983). Um Unterschiede in den Mengen an rekombinantem Protein zu korrigieren, die durch die verschiedenen Konstrukte erzeugt wurden, ließ man 35 mm-Schalen, die parallel einer Transfektion unterworfen worden waren, in Gegenwart von 100 uCI/ml 355-Cystein wachsen (Amershan). Alliquote Teile konditionierter Medien wurden dann durch SDS/PAGE analysiert, und die Mengen an rekombinantem Protein in den verschiedenen Proben wurden nach Densitometer-Scannen der entsprechenden Autoradiogramme equilibriert, wie dies früher beschrieben wurde (Ibàñez et al., 1991b). Die absolute Menge an Ausgangs-NGF-Protein wurde durch quantitatives Immunoblotting konditionierter Medien und durch Messung der biologischen Aktivität in kultivierten sympathetischen Ganglien unter Verwendung von Standard-Proben von gereinigtem Maus-NGF (Ibàñez et al., 1990; Ibàñez et al., 1991b) bewertet. Die von diesen Analysen erhaltenen Daten wurden dann zur Bestimmung der Protein-Konzentration in den Proben verwendet, die Mutanten-Proteine enthielten.
    • Puls-Chase und Immunopräzipitation
  • Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen 4 h lang in Cysteinfreiem Medium inkubiert. Die Zellen wurden dann mit 1mCI/ml 355-Cystein während 15 min Puls-markiert. Der Chase wurde durchgeführt durch Ersetzen des Markier- Mediums durch komplettes Medium, das mit 2 mg/ml kalten Cysteins verstärkt war. Parallele Vertiefungen wurden zu verschiedenen Zeiten ausgetragen, und Zellextrakte und konditioniertes Medium wurden mit polyklonalem Kaninchen-Antiserum (Kaninchen Nr. 30) gegen Maus-NGF (Ebendal et al., 1989) immunopräzipitiert und durch SDS/PAGE unter reduzierenden Bedingungen analysiert, wie dies früher beschrieben wurde (Ibàñez et al., 1990; Ibàñez et al., 1991b).
    • Bindungsassays
  • Maus-NGF wurde mit ¹²&sup5;I nach den Chloramin-T-Verfahren bis zu einer mittleren spezifischen Aktivität von 3 · 10&sup7; cpm/ug markiert. Ratten-PC12-Zellen (Greene und Tischler, 1976), menschliche A875-Zellen (Buxser et al., 1983) und Maus-rtrk-3T3- Zellen (Kaplan et al., 1991a) wurden in einer Menge von 2 bis 10 · 106 Zellen/ml verwendet. Binden unter stationären Bedingungen wurde in Kompetitionstests gemessen, die bei 37ºC unter Verwendung von 1,5 · 10&supmin;&sup9; M l251-NGF und Reihen- Verdünnungen konditionierter Medien durchgeführt wurden, die äquivalente Mengen an Ausgangs-NGF-Protein oder mutiertem NGF-Protein enthielten. Alle Komponenten wurden zur gleichen Zeit zugesetzt, und die Zellen wurden durch Zentrifugieren gewonnen, nachdem Gleichgewicht erreicht worden war (1 bis 2 h Inkubieren). Kontroll-Experimente unter Verwendung von Medium von zum Schein transfektierten COS-Zellen zeigten, dass andere Proteine, die in dem konditionierten Medium zugegen waren, keine Wirkung auf das Binden von ¹²&sup5;I-NGF an die Zellen hatten. Ein nichtspezifisches Binden wurde in einer parallelen Inkubation gemessen, der wenigstens ein 1000-facher molarer Überschuß an unmarkiertem NGF zugesetzt worden war. Alle Ergebnisse wurden im Hinblick auf dieses nichtspezifische Binden korrigiert, das immer weniger als 10% der gesamten Bindung betrug. Die Konzentration jedes Mutanten-NGF und Wild-Typ-NGF, die eine 50% Bindung ergaben (IC50), wurde bestimmt, und das relative Binden wurde berechnet unter Verwendung der Beziehung (Mutant-IC&sub5;&sub0;/Wild-Typ-IC&sub5;&sub0;) · 100.
    • Biologische Tests
  • Reihen-Verdünnungen konditionierter Medien, die äquivalente Mengen an rekombinantem Protein (im Bereich von 0,2 bis 20 ng/ml) enthielten, wurden im Hinblick auf eine biologische Aktivität an explantierten sympathetischen Hühner-Embryonen- Ganglien (Tag 9) getestet, wie dies vorher beschrieben worden war (Ebendal, 1984; Ebendal, 1989). Faser-Auswachsen wurde auf einer semiquantitativen Skala in biologischen Einheiten (biological unit; BU) durch Vergleich mit Standards punktemäßig bewertet, die mit gereinigtem Maus-NGF erhalten worden waren, für den 1 BU Äquivalent etwa 5 ng/ml ist. Die Konzentration jedes NGF-Proteins, das auf dieser Skala 0,5 BU ergab, wurde bestimmt und zum Berechnen der relativen Aktivität im Vergleich zu derjenigen verwendet, die mit dem Ausgangs-NGF erhalten worden war.
  • PC12-Zellen, die in 35 mm-Vertiefungen plattiert wurden, die mit Poly-D-Lysin überzogen waren, wurden mit Reihen-Verdünnungen konditionierter Medien inkubiert, die äquivalente Mengen an rekombinantem Protein enthielten. Bei unterschiedlichen Zeit- intervallen wurde der Prozentwert an Zellen mikroskopisch bestimmt, die Fasern trugen, die länger als zwei Zelldurchmesser waren.
  • Die Induktion von c-fos-mRNS wurde durch quantitative Northern-Blot-Analyse der Gesamt-m-RNS von PC12-Zellen gemessen, die mit Verdünnungen konditionierter Medien behandelt worden waren, die äquivalente Mengen rekombinanter Ausgangs- NGF und Mutanten-NGF enthielten. Die gesamte RNS wurde extrahiert, wie dies vorher beschrieben wurde (Ibàñez et al., 1990). 10 ug der gesamten RNS wurden in einem 1% Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt, das 0,7% Formaldehyd enthielt, und wurden auf Nitrocellulose-Membranen überführt. Die Filter wurden dann mit einem α-³²P-dCTP radiomarkiertem Ratten-c-fos-Genfragment hybridisiert (Curran et al., 1987) und wurden bei hoher Stringenz gewaschen. Die Menge an c-fos-m-RNS wurde durch Densitometer-Scannen von Autoradiogrammen bestimmt.
  • Dissoziierte Neuronen des oberen zervikalen Ganglions von Ratten (Tag 1 nach der Geburt) wurden in 35 mm-Vertiefungen, die mit Poly-D-Lysin beschichtet waren, in einer Dichte von 30.000 Zellen/Vertiefung kultiviert. Reihen-Verdünnungen konditionierter Medien, die äquivalente Mengen an rekombinantem Protein enthielten, wurden zum Zeitpunkt des Plattierens zugesetzt, und das neuronale Überleben wurde nach 72 Stunden durch Phasenkontrast-Mikroskopie bestimmt.
    • Beispiel 1 Aminosäure-Reste im β-Haarnadel-Loop 30-34, die in eine Rezeptor-Bindung zu PC12- Zellen involviert sind. Experimente und Ergebnisse
  • Konditioniertes Medium, das gleiche Mengen an mutanten NGF-Proteinen enthielt, wurde verwendet, um ¹²&sup5;I-NGF von seinen Rezeptoren auf der NGF-responsiven Pheochromocytoma-Zellinie PC12 zu verdrängen. Kompetitive Bindungs-Test wurden durchgeführt, wobei man Konzentrationen von ¹²&sup5;I-NGF (ca. 1,5 nM) verwendete, bei denen 80% des radiomarkierten Liganden, der mit den Zellen assoziiert war, an NGF- Rezeptoren niedriger Affinität gebunden wird (Sutter et al., 1979). Es wurden Konzentrationen der Ausgangs-Proteine und Mutanten-Proteine berechnet (Tabelle 1), die erforderlich waren, um 50% des ¹²&sup5;I-NGF von den PC12-Zellen zu verdrängen (ICSO). Das konservative Ersetzen von Lys25 durch Arg oder das Ersetzen eines der drei Reste (26, 27 und 29) durch Ala beeinträchtigte die Affinität des Proteins für Rezeptoren auf PC12-Zellen nicht (Tabelle 1). Jedoch wurde eine 3- bis 4-fache Verringerung der Bindungsaffinität beobachtet, wenn Asp30 oder Ile31 modifiziert wurden (siehe Beispiel 2, Tabelle 1, und Fig. 4A). Die wichtige Bedeutung von Ile31 wurde weiter getestet durch Ersetzen durch Met (der Rest, der an dieser Position in BDNF auftritt) (Leibrock et al., 1989), und durch Val. Interessanterweise erlaubte nur die am meisten konservative Änderung (131 V) eine Bindungsaffinität, die ähnlich derjenigen des Ausgangs-NGF war (Tabelle 1). Eine merkliche Reduktion der Rezeptor-Bindung wurde nach Ersatz von Lys32 durch Ala beobachtet; in diesem Fall wurde die Affinität etwa 6-fach reduziert, verglichen mit dem Ausgangs-NGF (Tabelle 1 und Fig. 4A). Ein Ersetzen von Lys34 durch Ala und von Val36 durch Leu verringerte die Bindung auf 50 bzw. 45% des Wild-Typs (Tabelle 1 und Fig. 4A). Überraschenderweise zeigte die unvollständig verarbeitete E35A-Mutante eine Bindungsaffinität, die nahe derjenigen der Ausgangsverbindung war (Tabelle 1 und Fig. 4A), was anzeigt, dass Zwischenstufen in der NGF-Biosynthese an NGF-Rezeptoren in einer Weise gebunden werden können, die so effizient wie diejenige des reifen Proteins ist.
    • Diskussion
  • Die Kristallstruktur des NGF-Dimers (McDonald et al., 1991) legt eine neue Struktur offen, die aus drei antiparallelen Paaren von -Strängen und vier Loop-Bereichen besteht, die fast alle varible Reste enthalten, die zwischen verschiedenen, mit NGF in Zusammenhang stehenden Molekülen beobachtet wurden. Einer dieser Loops entspricht den Resten, die in der vorliegenden Untersuchung analysiert wurden, und schließt einen β-Haarnadel-Turn (Reste 30 bis 34) ein. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Reste im Bereich 25 bis 36 wichtig für die Stabilität, die Rezeptor-Bindung und die biologische Aktivität des NGF-Moleküls sind (Fig. 9A).
  • Es wurde gezeigt, dass Lys25 eine wichtige strukturelle Rolle spielt, da nur die nahe verwandte Gruppe Arg, jedoch nicht Ala oder Gln die Gruppe Lys an dieser Position unter Bildung eines stabilen Proteins ersetzen konnten. In Übereinstimmung mit diesem Ergebnis legte die Kristallstruktur offen, dass Lys25 eine Seitenketten- Wasserstoffbindung nach G1u55 macht, die wichtig für das korrekte Falten des NGF- Proteins ist (McDonald et al., 1991). Eine Streichung von A1a28 verhinderte die Akkumulation des NGF-Proteins in dem konditionierten Medium und zeigt eine strukturelle Rolle für diese Position an.
  • Ein Ersetzen von Glu35 durch Ala führte zur Produktion von unvollständig bearbeiteten Polypeptiden im Bereich von 23 bis 34K; von diesen wurde gezeigt, dass sie eine ähnliche Rezeptor-Bindungsaffinität und biologische Aktivität aufweisen wie das vollständig verarbeitete Ausgangsmolekül. Die Tatsache, dass früher gezeigt wurde, dass eine in vitro synthetisierte NGF-Vorstufe voller Länge von 35K sehr niedrige Werte biologischer Aktivität aufweist, legt nahe, dass ein Entfernen einiger Aminoterminaler Sequenzen wichtig für die Aktivierung der NGF-Vorstufe sein kann (Edwards et al., 1988). Unsere Ergebnisse zeigen auch, dass - zusätzlich zu konservierten Domänen in dem NGF-Propeptid (Suter et al., 1991) Reste in dem reifen Molekül auch eine Rolle in der Biosynthese des vollständig verarbeiteten, reifen NGF spielen.
  • Ein Ersetzen der nicht-polaren Seitenkette bei Val36 durch Leu beeinflußt - wie ebenfalls gezeigt wurde - die Rezeptor-Bindung an PC12-Zellen. Im Gegensatz zu Ile31 ist Val36 tief in dem NGF-Monomer verborgen, und es scheint, dass dieser Rest in die Bildung des hydrophoben Kerns der NGF-Untereinheit involviert ist (McDonald et al., 1991). Die Tatsache, dass Leu, nicht jedoch Ala, Val an dieser Position ersetzen kann, zeigt die Wichtigkeit des hydrophoben Beitrags von Val36 zum Kern des Moleküls und legt nahe, dass die reduzierte Bindung der V36L-Mutante wahrscheinlich strukturelle Umgestaltungen widerspiegelt, die zur Unterbringung der größeren Leu- Seitenkette an dieser Position erforderlich sind.
    • Beispiel 2 Modifikation von Asp30 und Ile31 Experimente und Ergebnisse
  • Die spezielle biologische Aktivität der mutanten NGF-Proteine wurde zuerst untersucht, indem man ihr Vermögen zum Stimulieren eines Neurit-Auswachsens von sympathetischen Ganglien bei E9-Küken testete (Levi-Montalcini und Angeletti, 1968; Ebendal 1984; Ebendal 1989). In Übereinstimmung mit ihrem Vermögen zum Verdrängen von ¹²&sup5;I-NGF von PC12-Zellen waren die biologischen Aktivitäten der Mutanten K25R, T26A, T27A und T29A alle ähnlich der Aktivität des Ausgangs-NGF (Tabelle 1). Um die Möglichkeit zu testen, daß die Thr-Reste ihre Modifikation kompensieren könnten, wenn sie einzeln geändert würden, wurde eine Dreifach-Mutante erzeugt, in der drei Thr-Reste gleichzeitig durch Ala ersetzt werden. Jedoch schlug der Versuch fehlt, diese Mutante in dem Medium transfektierter Zellen auf nachweisbare Konzentrationen anzureichern (Tabelle 1).
  • Eine 4-fache Vernngerung der biologischen Aktivität wurde bei der D30N-Mutante und der I31A-Mutante beobachtet (Tabelle 1 und Fig. 4B), was mit deren jeweiligen Rezeptor-Bindungsaffinitäten korrelierte (Tabelle 1). Zum Eliminieren der Möglichkeit, daß die verringerte Aktivität auf die reduzierte Stabilität dieser Mutantenmoleküle zurückzuführen war (Fig. 2C), wurde eine Induktion von c-fos-mRNS in PC12- Zellen getestet. Es ist wohl dokumentiert, daß eine maximale Induktion von c-fosmRNS in diesen Zellen innerhalb von 30 bis 45 min nach Kontakt mit NGF stattfindet (Milbrandt, 1986; Gizang-Ginsberg und Ziff, 1990), einem Zeitraum, der 20 bis 30 mal kürzer ist als die geschätzten Halbwertszeiten dieser Moleküle. Ein Peak in c-fosmRNS wurde nach 30 min Kontakt von PC12-Zellen mit dem Ausgangs-NGF nachgewiesen (Fig. 4C). Sowohl die D30N-Mutante als auch die I31A-Mutante induzierten maximale c-fos-mRNS-Konzentrationen nach 30 min. die jedoch 3- bis 4-fach niedriger waren als die Maximal-Konzentration, die mit dem Ausgangs-NGF erhalten wurde (Fig. 4C).
  • Interessanterweise zeigten vier Mutanten mit verringerten Bindungsaffinitäten zu PC12-Zellen (I31M, K32A, K34A und V36L) Werte der biologischen Aktivität wie der Ausgangs-NGF (Tabelle 1 und Fig. 4B). So beeinträchtigte bei der K32A- Mutante die 6-fache Vernngerung des Bindungsvermögens nicht die biologische Aktivität des Moleküls in den sympathetischen Ganglien (vergleiche Fig. 4A und B). In Übereinstimmung mit den Rezeptor-Bindungsdaten neigte die E35A-Mutante ein Niveau der biologischen Aktivität wie das Ausgangsmolekül, und zwar trotz der Tatsache, daß es nur etwa 5% eines korrekt verarbeiteten reifen Proteins enthielt (Tabelle 1 und Fig. 4B).
    • Diskussion
  • Einige wichtige Wasserstoffbindungs-Seitenketten sind in der NGF-Untereinheit verborgen, einschließlich Asp30 (McDonald et al., 1991).
  • Diese Ergebnisse zeigten, daß die Halbwertszeit des NGF-Moleküls um etwa das 20- fache verringert wird, wenn Asp30 durch Ala ersetzt wird, ein Rest, der die vorgeschlagene Wasserstoffbindung von der Seitenkette von Asp30 zur Hauptkette bei Lys34 verhindern würde. Die verringerte Rückgewinnung und Halbwertszeit der D30N-Mutanten zeigen, daß Asn an dieser Position arbeiten kann, wenn auch mit geringerer Effizienz. Andererseits führte die Elimination oder das Ersetzen von Gly33 durch Alanin zu einem Verlust bei der Gewinnung des NGF-Proteins wahrscheinlich aufgrund einer verringerten Stabilität des Moleküls. Glycin an dieser Position erlaubt die Bildung eines Turns, in dem die Hauptketten-Torsionswinkel außerhalb des erlaubten Bereichs für Aminosäuren mit einer Seitenkette liegen (Sibanda et al., 1989). Zusammengenommen legen die Ergebnisse mit den Mutanten bei Asp30 und Gly33 nahe, daß diese Reste eine strukturelle Rolle bei der Stabilisierung des β-Haarnadel- Loops 30 bis 34 spielen und daß ihre Modifikation funktionelle Effekte durch Änderungen der Konformation des Loops (Fig. 9A) haben können. Die starke Bewahrung dieser Positionen in anderen Mitgliedern der NGF-Familie legt nahe, daß diese Reste eine ähnliche Rolle in den anderen drei Neurotrophinen spielen können.
  • Als Ergebnis des Turns 30 bis 34 wird der hydrophobe Ile31-Rest auf der Oberfläche des NGF-Moleküls freigelegt. Ersetzen dieses Restes durch Ala reduzierte sowohl die Rezeptor-Bindung in PC12-Zellen als auch die biologische Aktivität. Interessanterweise stellte sich nur die biologische Aktivität, nicht jedoch die Rezeptorbindung, wieder ein nach einem Ersetzen des Restes durch Met, während im Wild-Typ-Molekül das Binden und die biologische Aktivität nach einem Wechsel nach Val beobachtet werden konnten. Außerdem zeigen die Vorab-Ergebnisse eine 5-fache Reduktion der Bindung an p140trk in der I31A-Mutante, zeigten jedoch Werte wie beim Ausgangsmolekül in I31M. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse eine Rolle für die nichtpolare Seitenkette des Restes Ile31 sowohl im Hinblick auf die biologische Aktivität dar, die mit der Bindung an p140frk korreliert, als auch bei der Bindung mit niedriger Affinität (Fig. 9A).
    • Beispiel 3 Gleichzeitiges Ersetzen von Lys32, Lys34 und Glu35 durch Ala
  • Die drei geladenen Reste Lys32, Lys34 und Glu35, bei denen eine einzelne Mutation keine Auswirkung auf die biologische Aktivität hatte, wurden gleichzeitig ersetzt durch Ala, wodurch die geladenen Seitenketten an diesen Positionen eliminiert wurden. Interessanterweise wurde dieses Mutanten-Protein vollständig als voll verarbeitetes Protein gewonnen, und zwar trotz der Tatsache, daß es die E35A-Mutation enthielt (Fig. 3A). Die Dreifach-Mutation verringerte das Bindevermögen dieses Proteins an PC12-Zellen auf weniger als 1% des Werts, der bei dem Ausgangsmolekül beobachtet wurde (Tabelle 1 und Fig. 4A). Dasselbe Ergebnis wurde erhalten, wenn die Zellen mit dem Mutanten-Protein 2 Stunden vor der Zugabe von ¹²&sup5;I-NGF vorinkubiert wurden (nicht gezeigt). Jedoch war die biologische Aktivität des Dreifach- Mutanten-Proteins in sympathetischen Ganglien nahe der Aktivität des Ausgangs- NGF (Tabelle 1 und Fig. 4B).
  • Neurit-Auswachsen wurde in PC12-Zellen getestet, um im Test herauszufinden, ob der Verlust des Bindevermögens mit der biologischen Aktivität in diesen Zellen korrelierte (Fig. 5A). Die einzelne Änderung von Lys32, Lys34 und Glu35 nach Ala änderte das Vermögen der Proteine nicht signifikant, ein Neurit-Auswachsen zu stimulieren, und dies trotz ihrer unterschiedlichen Affinitäten zu NGF-Rezeptoren auf diesen Zellen. Darüber hinaus zeigte die Dreifach-Mutante (K32A+K34A+E35A) auch die Aktivität der Ausgangsverbindung trotz ihrer stark verringerten Bindung niedriger Affinität zu PC12-Zellen (Fig. 5A).
  • Die Möglichkeit, daß die offensichtliche Diskrepanz, die zwischen dem Bindungsvermögen und der biologischen Aktivität beobachtet wurde, auf einen langsameren, Rezeptor-vermittelten Abbau zurückzuführen war, wurde ebenfalls untersucht. Wie bei anderen Peptid-Hormonen beobachtet wurde, die einer Rezeptor-vermittelten Endocytose unterliegen (d. h. Insulin), kann sich eine verringerte Bindungsaffinität nicht immer in eine verringerte biologische Aktivität übersetzen, wenn dies über einen längeren Zeitraum untersucht wird. Als Konsequenz des verringerten Bindungsvermögens können Mutantenmoleküle eine niedrige Rate des Rezeptor-vermittelten Abbaus aufweisen, was zu einer langsameren, jedoch verlängerten biologischen Aktivität führt, die die Werte der Ausgangsverbindung erreichen kann, wenn dies über einen gewissen Zeitraum integriert wird. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, wurde die Kinetik sowohl einer frühen (c-fos mRNA-Induktion) und einer hinausgeschobenen (Stimulation des Neurit-Auswachsens) Antwort in PC12-Zellen untersucht. Trotz ihrer verringerten Bindungsaffinitäten induzierten sowohl die K32A-Mutante als auch die Dreifach-Mutante c-fos mRNS und Neurit-Auswachsen mit demselben Zeitverlauf und derselben Intensität wie bei dem Ausgangsmolekül (Fig. 5B und C).
    • Beispiel 4 Auswirkung einer Mutation von Lys32 und Lys34 auf die NGF-Bindung
  • Es wurden Rezeptor-Bindungs-Tests an PC12-Zellen unter Verwendung hoher Konzentrationen an ¹²&sup5;I-NGF durchgeführt, bei denen das meiste des beobachteten Bindens ein Binden des Typs niedriger Affinität ist (Sutter et al., 1979). Da jedoch PC12- Zellen sowohl p75NGFR-Rezeptoren als auch p140trk-Rezeptoren exprimieren (Herrup und Thoenen, 1979; Hosang und Shooter, 1985; Kaplan et al., 1991b), können diese Ergebnisse keine klare Unterscheidung zwischen der Bindung der Mutanten-NGFs an eines dieser beiden Moleküle erbringen. Daher wurden die Bindungsaffinitäten der Mutanten K32A, K34A und E35A und der Triple-Mutante K32A+K34A+E35A zu A875-Zellen verglichen, einer menschlichen Melanom-Zellinie, die hohe Mengen nur an p75NGFR exprimiert (Buxser et al., 1983), und an rtrk-3T3-Zellen, einer Fibroblasten-Zellinie, die nur Ratten-p140trk exprimiert (Kaplan et al., 1991a).
  • Der Ersatz der positiv geladenen Seitenkette von Lys32 durch die Methylgruppe von Ala verringerte das Binden des Moleküls an p75NGFR auf 5% der Bindung, die bei dem Ausgangs-NGF beobachtet wurde (Tabelle 2 und Fig. 6). Die Änderung von Lys34 nach Ala reduzierte das Binden zu A875-Zellen auf 55% des Werts der Ausgangsmoleküle. Jedoch beseitigte das gleichzeitige Ersetzen von Lys32, Lys34 und Glu35 vollständig das Binden des Mutantenmoleküls an p75NGFR (Tabelle 2 und Fig. 6). Die Einzel-Änderung von Glu35 nach Ala hatte keine Wirkung auf die Bindungsaffinität zu A875-Zellen (Tabelle 2 und Fig. 6), was anzeigt, daß der Verlust des Bindungsvermögens, der bei der Dreifach-Mutante beobachtet wurde, auf die Modifikation der positiv geladenen Reste Lys32 und Lys34 zurückzuführen war.
  • Trotz ihrer 20-fachen Reduktion des Bindungsvermögens an p75NGFR war die K32A- Mutante ununterscheidbar von dem Ausgangs-NGF in bezug auf das Binden an p140trk das auf rtrk-3T3-Zellen gezeigt wurde (Tabelle 2 und Fig. 6). Ähnlich zeigten auch die K34A-Mutante und die E35A-Mutante die Affinität der Ausgangsverbindung gegenüber p140trk (Tabelle 2 und Fig. 6). Interessanterweise behielt die Dreifach-Mutante, die es nicht schaffte, ¹²&sup5;I-NGF von p75NGFR zu verdrängen, ein signifikantes Bindevermögen gegenüber p140trk bei, und zwar bei etwa 55% des Werts, der bei dem Ausgangs-NGF beobachtet wurde (Tabelle 2 und Fig. 6). Weiter bilden in einer zusätzlichen Ausführungsform, die das NGF-Molekül einschließt, Lys32, Lys34 und Lys95 eine positiv geladene Grenzfläche, die in das Binden an p75NGFR involviert ist. Eine gleichzeitige Modifikation von Lys32 mit einer Modifikation eines der beiden anderen Lysin-Reste führt zu einem Verlust des Bindungsvermögens gegenüber p75NGFR Trotz des Fehlens des Bindevermögens gegenüber p75NGIX behalten diese Mutanten ein Bindungsvermögen gegenüber p140trk sowie biologische Aktivität bei, wie gemessen wurde durch Neuronen-Differenzierung von PC12-Zellen und Überleben kultivierter sympathetischer Neuronen.
    • Beispiel 5 Modifikation von Resten im Bereich 25 bis 36 verändert die Stabilität des NGF-Moleküls
  • Eine Alanin-Scanning-Mutagenese (Cunningham und Wells, 1989) wurde angewandt, um strukturell und funktionell wichtige Reste in dem Bereich zwischen den Aminosäure-Resten 25 und 36 von Ratten-NGF herauszufinden. Dieser Bereich ist hochgradig konserviert bei verschiedenen Spezies von Wirbeltieren (Fig. 1A), und zeigt 50 bis 60% Konservierung in anderen Gliedern der NGF-Familie (Fig. 1B). Mutanten-Proteine wurden vorübergehend in COS-Zellen exprimiert. Die Ausbeute an Mutanten-Protein-Produktion wurde durch SDS-PAGE von metabolisch markierten Polypeptiden in konditionierten Medien transfektierter Zellen abgeschätzt, um hinsichtlich der Menge an Mutanten-Protein zu standardisieren, das für eine Bindung an den Rezeptor und für biologische Tests verwendet wird. Wie in Tabelle 1 gezeigt, schwankten die Werte an Mutanten-NGF-Proteinen über einen Bereich mit dem Faktor 10. Fünf der Mutanten-NGF-Proteine (K25A, A28Δ, D30A, G33Δ und V36A) reicherten sich nicht in dem Medium in nachweisbaren Mengen an. Interessanterweise entsprechen diese Reste den fünf Positionen von dieser Domain, die bei den verschiedenen Gliedern der NGF-Familie strikt konserviert werden (Fig. 1B). Kein Protein wurde entdeckt, nachdem entweder Lys25 oder Gly33 in die ähnlicheren Aminosäure- Reste Gln und Ala geändert wurden (Tabelle 1). Im Gegensatz dazu konnten die Mutanten D30A und V36A durch Ersetzen nach Asn bzw. Leu gerettet werden, dies jedoch bei niedrigeren Werten als in den Fällen, die bei dem Wild-Typ-(WT)-Protein beobachtet wurden (Tabelle 1). Lys25 wurde ebenfalls in Arg ausgetauscht, die am meisten konservative Ersatz-Reaktion, die an dieser Position möglich ist. Diese Mutation erlaubte den Nachweis von NGF-Protein mit etwa 50% der Werte des Ausgangs- Proteins (Tabelle 1).
  • Die Schwankungen, die bei den Mengen an Mutanten-Protein beobachtet wurden, können Unterschiede bei der Protein-Synthese, in der Stabilität oder in der Abscheidung einzelner Polypeptide in COS-Zellen widerspiegeln. Um zwischen diesen Möglichkeiten zu unterscheiden, wurden Puls-Chase-Experimente durchgeführt, gefolgt von Immunopräzipitation und SDS-PAGE. Nach 15 min Puls konnte ein vorherrschendes 23K großes Ausgangs-NGF-Vorstufen-Protein von Zellextrakten immunopräzipitiert werden (Fig. 2A). Vollständig verarbeiteter, reifer NGF mit 13K wurde nach 30 Minuten Chase nachgewiesen, und fast die Gesamtmenge des intrazellulären NGF verschwand nach drei Stunden. Das Verschwinden von intrazellulärem NGF korrelierte mit dem Auftreten von NGF in dem Medium, das einen Peakwert bei 6 h nach dem Chase erreichte und bei diesem Wert für wenigstens 14 weitere Stunden blieb (Fig. 2B). Die I31A-Mutante, die mit einer Konzentration 3- bis 4-fach unter derjenigen des Ausgangs-NGF produziert wurde (Tabelle 1), sammelte sich in den transfektierten Zellen in einem ähnlichen Ausmaß an wie bei dem Ausgangs-Protein (Fig. 2A). Jedoch wurden niedrigere Konzentrationen der I31A-Mutante in dem Medium nachgewiesen, und ein Abfall von 50% wurde in den letzten 17 h nach dem Chase beobachtet (Fig. 2B), was eine verringerte Stabilität des I31A-Proteins anzeigt. In ähnlicher Weise sank die Menge des D30N-Mutanten-Proteins, das in 10-fach niedrigeren Werten als der Ausgangs-NGF produziert wurde (Tabelle 1) signifikant nach 3 h des Chase (Fig. 2C). Darüber hinaus konnten sehr niedrige Werte des D30A-Mutanten- Proteins nach 3 Stunden des Chase beobachtet werden, obwohl sie auf nicht nachweisbare Werte in den folgenden 12 h absanken (Fig. 2C). Die reduzierten Halbwertszeiten der Mutanten-Proteine I31A, D30N und D30A, die zu 18, 12 bzw. 3 h geschätzt wurden, zeigen an, daß die reduzierten Ausbeuten dieser Mutanten auf die niedrigere Stabilität dieser Proteine in den konditionierten Medien zurückzuführen waren. Die stark verringerten Peak-Werte, die nach 3 h des Chase bei den Mutanten D30N und D30A beobachtet wurden, legten nahe, daß in diesem Fall die Protein-Synthese auch beeinträchtigt sein könnte (Fig. 2C).
    • Beispiel 6 Ersatz von Glu35 durch Ala
  • Vollständig verarbeitetes, reifes E35A-Mutanten-Protein wurde in den konditionierten Medien in einer Konzentration entdeckt, die 5% des Werts für den Ausgangs-NGF entspricht (Tabelle 1). Jedoch wurden nach einer Immunopräzipitation einige Polypeptide höheren Molekulargewichts (im Bereich von 23 bis 34K) beobachtet, die nur sehr schwach in der Probe mit dem Ausgangs-NGF nachgewiesen werden konnten (Fig. 3A). Eine Vorbehandlung der konditionierten Medien bei 70ºC in Gegenwart von 1% SDS und 1,5M NaCl vor der Immunopräzipitation beeinträchtigte das Polypeptid-Muster nicht, das von der E35A-Mutante immunopräzipitiert worden war (nicht gezeigt), was anzeigt, daß die Polypeptide höheren Molekulargewichts keine unverwandten Proteine darstellen, die mit der E35A-Mutante copräzipitierten. Statt dessen legt die Größe dieser Polypeptide nahe, daß sie unvollständig verarbeitete Zwischenstufen der Biosynthese des E35A-Proteins darstellen. Puls-Chase-Experimente unter Verwendung dieser Mutante legten offen, daß sowohl die unvollständig verarbeitete Form als auch die reife Form dieses Proteins in den konditionierten Medien sehr stabil waren (Fig. 2C und 3B).
    • Beispiel 7 Wirkung von Veränderungen bei Lys95 auf die Bindung an p75NGFR Experimente und Ergebnisse
  • Die Ergebnisse mit der Lys32-Mutante, der Lys34-Mutante und der Dreifach-Mutante legen nahe, daß diese beiden positiv geladenen Reste Kontaktpunkte zwischen NGF und dem p75NGFR Molekül ausbilden. Eine Untersuchung der NGF-Kristallstruktur mittels Computergraphik legte offen, daß ein weiterer positiv geladener Rest, Lys95, den Werten Lys32 und Lys34 räumlich nahe benachbart ist. Wie im Fall der beiden anderen Reste zeigt Lys95 ebenfalls vollständig nach außen und nimmt nicht an Sekundär-Wechselwirkungen teil. Um die Möglichkeit zu testen, daß Lys95 ebenfalls an dem Kontakt mit dem p75NGFR-Molekül teilnehmen könnte, wurde dieser Wert durch Ala ersetzt. Eine Doppel-Mutante K32A+K95A und eine Vierfach-Mutante K32A+K34A+E35A+K95A wurde ebenfalls erzeugt. Die K95A-Mutante zeigte eine Bindung von 65% gegenüber PC12-Zellen, verglichen mit dem Ausgangs-NGF (Fig. 7). Jedoch reduzierte sich bei einer Kombination von K95A mit K32A oder bei K32A+K34A+E35A das Bindungsvermögen an PC12-Zellen drastisch auf 0,7% der Werte der Ausgangsverbindung (Fig. 7). Die Reduktion des Niederaffinitäts- Bindungsvermögens gegenüber PC12-Zellen korrelierte mit dem Verlust des Bindungsvermögens gegenüber p75NGFR exprimiert auf A875-Zellen (Tabelle 2 und Fig. 7). Im Fall der Vierfach-Mutante konnte kein IC&sub5;&sub0;-Wert berechnet werden. Jedoch behielten trotz ihres Unvermögens zum Binden von p75NGFR diese Mutanten das Vermögen zum Verdrängen von ¹²&sup5;I-NGF von p140trk bei, die auf Fibroblasten exprimiert worden waren (Tabelle 2 und Fig. 7) und förderten ein Neurit-Auswachsen bei sympathetischen Neuronen (Fig. 8A) mit signifikanten Werten.
  • Die Dreifach-Mutante K32A+K34A+E35A und die Doppel-Mutante K32A+K95A bieten eine Möglichkeit zum Untersuchen der Rolle von p75NGFR beim neuronalen Überleben. Dissoziierte sympathetische Neuronen vom oberen zervikalen Ganglion der Ratten, wurden im Hinblick auf ein Überleben nach 3 Tagen in Kultur getestet. Weniger als 5% der Zellen überlebten in Gegenwart von Medien von zum Schein transfektierten Zellen oder in normalen Medien, wenn verglichen mit dem Ausgangs- NGF oder gereinigtem Maus-NGF (Fig. 8B). Jedoch in Kulturen, die mit den Mutanten NGFs behandelt worden waren, war das Ausmaß eines neuronalen Überlebens identisch demjenigen, das beobachtet worden war bei dem Ausgangs-Protein ( Fig. 8B).
    • Diskussion
  • Die Kristallstruktur von NGF legte einen Kluster von nach außen zeigenden, positiv geladenen Seitenketten nahe dem β-Haarnadel-Loop 30 bis 34 und um diesen herum offen (Fig. 9B und C) (McDonald et al., 1991). Es ist möglich, daß die hohe negative Gesamtladung, die für das p75NGFR beobachtet wurde (ein geschätzter Wert pI von 4, 4) (Radeke et al., 1987) eine komplementäre ionische Wechselwirkung von dem hochgradig basischen NGF-Dimer (Pl 9,3 in diesem Bereich) erfordern kann. Die hier präsentierten Ergebnisse liefern eine starke Stütze für die Vorstellung, daß diese positiv geladenen Aminosäure-Reste als Hauptpunkte des Kontakts zwischen NGF und p75NGFR dienen. Einige Beweisanzeichen stützen diese Hypothese: Zum Ersten sind - wie durch die Kristallstruktur offengelegt wurde - die Reste Lys32, Lys34 und Lys95 in starkem Maße nach außen zeigend angeordnet (50 bis 70% Seitenketten- Lösungsmittel-Zugänglichkeit), und ihre Seitenketten haben keine strukturelle Rolle in dem Molekül (McDonald et al., 1991). Zum Zweiten verringerte, wie hier gezeigt wurde, ein Ersetzen von Lys32 durch Ala die Affinität der Mutante gegenüber Rezeptoren auf PC12-Zellen unter Niederaffinitäts-Bindungs-Bedingungen um das 6-fache. Zum Dritten reduzierte das gleichzeitige Ersetzen von Lys32, Lys34 und Glu35 weiter das Niederaffinitäts-Binden gegenüber PC12-Zellen auf weniger als 1% des Werts, der bei dem Ausgangs-NGF beobachtet wurde. Dies war nicht auf die E35A-Mutation zurückzuführen, da ein Ersetzen von Glu35 durch Ala die Bindungsaffinität nicht veränderte. Zum Vierten hatte ein Ersetzen von Lys95 einen synergistischen Effekt, wenn es mit K32A kombiniert war, indem es das Bindungsvermögen gegenüber PC12- Zellen auf fast unnachweisbare Werte verringerte. Zum Fünften korrelierte in allen Fällen der Verlust an Niederaffinitäts-Bindungsvermögen gegenüber PC12-Zellen mit dem Verlust an Bindungsvermögen gegenüber p75, ausgedrückt an A875-Zellen. Im Fall der Dreifach-Mutante K32A+K34A+E35A und der Doppel-Mutante K32A+K95A verschwand das Bindungsvermögen gegenüber p75NGFR vollständig bzw. wurde 150-fach verringert. Zum Sechsten behielten trotz des Verlustes an Bindungsvermögen gegenüber p75NGFR alle Mutanten-NGFs ihr Bindungsvermögen gegenüber p140trk und ihre biologische Aktivität bei, was weiter zeigt, daß dieser Verlust an Niederaffinitäts-Bindungsvermögen nicht auf drastische Veränderungen der Konformation der Mutanten-Proteine zurückzuführen ist.
  • Die synergistischen Wirkungen, die bei den mehrere Lysin-Reste aufweisenden Mutanten beobachtet wurden, zeigen an, daß positiv diese p75NGFR-Reste bei der Bindung einer Grenzfläche zum Binden an p75NGFR kooperieren (Fig. 9B und C). Der Rest Lys32 scheint den stärksten Kontakt zu machen, gefolgt von Lys34 und Lys95, die wahrscheinlich verantwortlich sind für die Rest-Bindung, die in der K32A-Mutante beobachtet wird. Weitere positiv geladene Reste, wie die früher untersuchten Reste Arg100 und Arg103 (Ibàñez et al. 1990) und vielleicht Lys88, können auch zu der Bindungs-Grenzfläche beitragen (Fig. 9B und C). Der Verlust an Bindungsvermögen gegenüber p75NGFR in der Mutante K32A+K34A+E35A und in der Mutante K32A+K95A legen nahe, daß eine Minimal-Zahl positiver Ladungen auf der Oberfläche des NGF-Moleküls erforderlich sind, um einen stabilen Kontakt mit p75NGFR herzustellen. Dieses Modell schließt die Möglichkeit nicht aus, daß andere Arten des Kontakts wie beispielsweise der über den hydrophoben Rest Ile31 auch zu einer Stabilisierung der Verbindung zwischen NGF und p75NGFR beitragen können.
  • Die anderen drei bekannten Neurotrophine können sich auch an den Niederaffinitäts- NGF-Rezeptor binden (Rodriguez-Tebar et al. 1990; Ernfors et al., 1990; Squinto et al., 1991; Hallböök et al., 1991). Der Rest Lys95 ist in allen vier Proteinen konserviert, die bisher beschrieben wurden, und in NT-3 und in NT-4 ist Lys32 ersetzt durch Arg, einen anderen positiv geladenen Aminosäure-Rest. Lys34 ist auch in NT-4 konserviert. Jedoch sind in BDNF Lys32 und Lys34 ersetzt durch Ser bzw. Gly. Interessanterweise weist der räumlich benachbarte Loop der Reste 93 bis 96 in BDNF drei aufeinanderfolgende positiv geladene Reste auf, die die Abwesenheit von Lys32 und Lys34 kompensieren können. Zur Stütze dieser Hypothese zeigte ein chimäres NGF- Molekül, in dem die Reste 23 bis 35 (variabler Bereich I) durch die entsprechenden Reste in BDNF ersetzt sind (Ibàñez et al., 1991a), eine 10-fache Verringerung des Niederaffinitäts-Bindungsvermögens gegenüber PC12-Zellen. Das Niederaffinitäts- Bindungsvermögen wurde in einem anderen chimären Molekül wiedereingestellt, das sowohl den variablen Bereich I als auch die Reste 94 bis 98 (variabler Bereich V) von BDNF enthält, was anzeigt, daß die drei positiv geladenen Reste an den Positionen 95, 96 und 97 in BDNF tatsächlich das Fehlen der Reste Lys32 und Lys34 kompensieren können. Obwohl sowohl NGF als auch BDNF in gleicher Weise um eine Bindung an p75NGFR zu konkurrieren scheinen, erkennt dieser Rezeptor auch Unterschiede zwischen den beiden Liganden, die im Fall von BDNF durch eine positive Kooperativität und eine langsamere Dissoziationskinetik widergespiegelt werden (Rodriguez-Tebar et al., 1990). Es scheint daher, daß BDNF und NGF von p75NGFR als ähnliche, wenn auch nicht identische Strukturen erkannt werden. Diese Ergebnisse bieten eine strukturelle Erklärung für die beobachteten Unterschiede zwischen NGF und BDNF und legen nahe, daß andere Neurotrophine mit p75NGFR über denselben Bereich wechselwirken können.
  • Die vorliegende Erfindung soll nicht hinsichtlich des Umfangs durch die speziellen Ausführungsformen, die hier beschrieben sind, beschränkt werden. Tatsächlich werden Fachleuten in diesem technischen Bereich aus der vorangehenden Beschreibung und den beigefügten Figuren verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu den Ausführungsformen, die in der Beschreibung beschrieben sind, offensichtlich. Solche Modifikationen sollen in den Umfang der nachfolgenden Patentansprüche fallen. Tabelle 1
  • a) Mutanten werden abgekürzt durch den Wild-Typ-(WT)-Rest (Bezeichnung der einzelnen Aminosäuren, gefolgt von der Codierungsnummer und dem Mutanten-Rest. Δ gibt an, daß der entsprechende Rest gestrichen wurde.
  • b) Werte im stationären Zustand, berechnet nach SDS-PAGE von metabolisch markierten konditionierten Medien. Die kurze Linie gibt an, daß der Wert an Mutanten-Protein unterhalb des Nachweiswerts lag (< 2% des WT-NGF).
  • c) Daten von Zwei-Dose-Response-Experimenten, schwankend über ± 10% der hier angegebenen Mittelwerte.
  • d) Daten basierend auf der vollständig verarbeiteten Form (Details: siehe Text).
  • e) Daten basierend sowohl auf der verarbeiteten als auch auf der unverarbeiteten Form (Details: siehe Text). Tabelle 2
    • Referenzen
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  • Yang, Y. C., Ciarlette, A. B., Temple, P. A., Chung, M. P., Kovacic, S., WitekGianotti, J. S., Leary, A. C., Kritz, R, Donahue, R. E., Wong, G. G. und Clark, S. C. (1986).
  • Menschlicher IL-3 (Multi-CSF): Identifikation durch Expressions-Klonen eines neuen hämatopoetischen Wachstumsfaktors, der dem Maus-Faktor IL-3 verwandt ist. Cell 47, 3 bis 10.
    • SEQUENZLISTEN
  • (1) ALLGEMEINE INFORMATION
  • (i) ANMELDER: Persson, Hakan B. et al.
  • (ii) TITEL DER ERFINDUNG: Neurotrophe Faktoren mit veränderten Rezeptor- Bindungsspezifitäten
  • (iii) ZAHL DER SEQUENZEN: 6
  • (iv) KORRESPONDENZADRESSE:
  • (A) ADRESSAT: Pennie & Edmonds
  • (B) STRASSE: 1155 Avenue of the Americas
  • (C) STADT: New York
  • (D) STAAT: New York
  • (E) LAND: USA
  • (F) POSTLEITZAHL: 10036-2711
  • (v) COMPUTERLESBARE FORM:
  • (A) TYP MEDIUM: Diskette
  • (B) COMPUTER: IBM PC (kompatibel)
  • (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
  • (D) SOFTWARE: Patentin Release Nr. 1,0, Version Nr. 1,25
  • (vi) LAUFENDE ANMELDEDATEN:
  • (A) ANMELDUNGS-NR. US 07/847,369
  • (B) ANMELDETAG: 6. März 1992
  • (C) KLASSIFIKATION:
  • (viii) INFORMATION ÜBER DEN ANWALT/VERTRETER
  • (A) NAME: Misrock, S. Lesije
  • (B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 18,872
  • (C) REFERENZ/INTERNES AKTENZEICHEN: 6526-097
  • (ix) INFORMATION ÜBER TELEKOMMUNIKATIONSVERBINDUNGEN
  • (A) TELEFON: 212 790-9090
  • (B) TELEFAX: 212 869-971
  • (C) TELEX: 66141 PENNIE
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ-ID NR. 1:
  • (i) CHARAKTERISTISCHE EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ
  • (A) LÄNGE: 12 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜL-TYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID NR. 1:
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ-ID NR. 2:
  • (i) CHARAKTERISTISCHE EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
  • (A) LÄNGE: 12 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜL-TYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID NR. 2:
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ-ID NR. 3:
  • (i) CHARAKTERISTISCHE EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
  • (A) LÄNGE: 12 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜL-TYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID NR. 3:
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ-ID NR. 4:
  • (i) CHARAKTERISTISCHE EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
  • (A) LÄNGE: 12 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜL-TYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID NR. 4:
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ-ID NR. 5:
  • (i) CHARAKTERISTISCHE EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
  • (A) LÄNGE: 12 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜL-TYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID NR. 5:
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ-ID NR. 6:
  • (i) CHARAKTERISTISCHE EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
  • (A) LÄNGE: 12 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
  • (D) TOPOLOGIE: unbekannt
  • (ii) MOLEKÜL-TYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID NR. 6:

Claims (14)

1. Ein nervenernährender Mutantenfaktor, wobei der besagte Faktor einen nervenernährenden Faktor des wilden Typs umfasst, in dem die einzige Änderung in der Sequenz des Faktors der Ersatz einer oder mehrerer positiv geladener Aminosäuren aus den Aminosäuren 30 bis 34 oder den Aminosäuren 93 bis 98 ist und in dem die besagte Änderung die Fähigkeit des nervenernährenden Mutantenfaktors zur Bindung von p75NGFR im Vergleich zum nervenernährenden Faktor des wilden Typs ist, der nervenernährende Mutantenfaktor jedoch die Fähigkeit zur Bindung an einen Rezeptor für Tyrosinkinase (trk) aufrecht erhält.
2. Ein nervenernährender Mutantenfaktor gemäß Anspruch 1, in dem die einzige Änderung der Sequenz des Faktors der Ersatz einer oder mehrer positiv geladener Aminosäuren aus den Aminosäuren 30 bis 34 ist.
3. Der nervenernährende Mutantenfaktor gemäß Anspruch 2, in dem der besagte nervenernährende Faktor des wilden Typs aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Nervenwachstumsfaktor, einem aus dem Gehirn stammenden Wachstumsfaktor, NT-3 und NT-4 besteht.
4. Der nervenernährende Mutantenfaktor gemäß Anspruch 3, in dem die besagte Änderung der Ersatz von Lys32 ist.
5. Der nervenernährende Mutantenfaktor gemäß Anspruch 3, in dem die besagte Änderung den Ersatz von Lys 34 umfasst.
6. Der nervenernährende Mutantenfaktor gemäß Anspruch 3, in dem der besagte nervenernährende Faktor des wilden Typs NT-3 oder NT-4 ist und die besagte Änderung der Ersatz von Arg32 ist.
7. Der nervenernährende Mutantenfaktor gemäß Anspruch 1, in dem die besagte einzige Änderung der Sequenz des Faktors der Ersatz einer oder mehrerer positiv geladener Aminosäuren aus den Aminosäuren 93 bis 98 ist.
8. Der nervenernährende Mutantenfaktor gemäß Anspruch 7, in dem der besagte nervenernährende Faktor des wilden Typs aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einem Nervenwachstumsfaktor, aus einem aus dem Gehirn stammenden Wachstumsfaktor, NT-3 und NT-4 besteht.
9. Der nervenernährende Mutantenfaktor gemäß Anspruch 8, in dem die besagte Änderung der Ersatz von Lys 95 ist.
10. Der nervenernährende Mutantenfaktor gemäß Anspruch 9, in dem der besagte Lys 95 durch Ala ersetzt wird.
11. Der nervenernährende Mutantenfaktor gemäß Anspruch 1, in dem der besagte nervenernährende Faktor des wilden Typs NT-3 ist und der besagte Ersatz eine oder mehrere Aminosäuren ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist /sind, die aus Arg32, His34, Asn93 und Asn94 besteht.
12. Der nervenernährende Mutantenfaktor gemäß Anspruch 8, in dem der besagte nervenernährende Faktor des wilden Typs BDNF ist und der besagte Ersatz eine oder mehrerer Aminosäuren ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist/sind, die aus Lys95, Lys96 und Arg97 besteht.
13. Der nervenernährende Mutantenfaktor gemäß Anspruch 8, in dem der besagte nervenernährende Faktor des wilden Typs NT-4 ist und der besagte Ersatz aus G1u94 oder Arg95 besteht.
14. Ein Verfahren zur Auswahl eines nervenernährenden Mutantenfaktors mit verminderter Fähigkeit zur Bindung von p75PGFR und der dennoch gleichzeitig die Fähigkeit zur Bindung an einen Rezeptor für Tyrosinkinase (trk) aufrecht erhält, umfassend
a) den Ersatz von wenigstens einer positiv geladener Aminosäure aus den Aminosäuren 30 bis 34 oder Aminosäuren 93 bis 98 des Faktors des wilden Typs durch eine nicht geladene oder negativ geladene Aminosäure; und
b) Auswahl eines Mutantenfaktors mit verminderter Fähigkeit zur Bindung von p75NGFR und der dennoch gleichzeitig die Fähigkeit zur Bindung an einen Rezeptor für Tyrosinkinase (trk) aufrecht erhält.
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