DE69404401T3

DE69404401T3 - Erythropoietin-Analoga mit zusätzlichen Glycosylierungsstellen

Info

Publication number: DE69404401T3
Application number: DE69404401T
Authority: DE
Inventors: Steven G. Newbury Park Elliot; Thomas E. Arlington Byrne
Original assignee: Kirin Amgen Inc
Current assignee: Amgen K A Inc
Priority date: 1993-08-17
Filing date: 1994-08-16
Publication date: 2005-11-24
Anticipated expiration: 2014-08-17
Also published as: UA49793C2; DK0640619T3; NO2007008I2; NO2007008I1; ATE155796T1; IL110669A; CZ291342B6; NO323104B1; IL192290A0; FI951792A0; CN1105030A; NO951445L; EP0640619A1; WO1995005465A1; CN1057534C; AU7632794A; NO951445D0; EP0640619B2; CZ91795A3; RU95115239A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Erythropoietin-Analoga mit mindestens einer zusätzlichen Stelle für die Glycosylierung oder Erythropoietin-Analoga mit einer Deletion von einer oder mehreren Glycosylierungsstellen in menschlichem Erythropoietin und ein Hinzufügen einer gleichen Anzahl von nicht natürlicherweise vorkommenden Glycosylierungsstellen. Die Erfindung betrifft ebenfalls DNA-Sequenzen, die diese Erythropoietin-Analoga codieren und rekombinante Plasmide und Wirtszellen für die Expression der Analoga.
Hintergrund der Erfindung
Erythropoietin (EPO) ist ein Glycoprotein-Hormon, das an der Reifung erythroider Vorläuferzellen zu Erythozyten beteiligt ist. Es ist wesentlich für die Regulierung der Gehalte an roten Blutzellen im Kreislauf. Natürlich auftretendes Erythropoietin wird von der Leber während des fötalen Lebens und von der Niere von Erwachsenen produziert und zirkuliert im Blut und stimuliert die Produktion von roten Blutzellen im Knochenmark. Anämie ist nahezu ausnahmslos eine Folge von Nierenversagen aufgrund verringerter Produktion von Erythropoietin von der Niere. Rekombinantes Erythropoietin, das durch gentechnologische Techniken hergestellt wird, die die Expression eines Proteinprodukts von einer Wirtszelle, die mit dem Gen, das Erythropoietin codiert, transformiert worden ist, einschließt, hat sich als wirksam erwiesen, wenn es bei der Behandlung von Anämie eingesetzt wird, die von chronischem Nierenversagen herrührt.
Niedrige Mengen von Erythropoietin sind normalerweise im menschlichen Harn vorhanden, wohingegen Individuen, die an aplastischer Anämie leiden, erhöhte Mengen von Erythro poietin im Harn aufweisen. Die Reinigung von Erythropoietin aus menschlichem Harn von Miyake et al., J. Biol. Chem., 252, 5558, 1977, verwendete als Ausgangsmaterial Harn von Individuen mit aplastischer Anämie. Bis jetzt konnte jedoch nicht gezeigt werden, daß Erythropoietin aus Harn therapeutisch nützlich ist.
Die Identifizierung, Klonierung und Expression von Genen, die Erythropoietin codieren, sind beschrieben in der US-PS 4,703,008 (Lin). Eine Beschreibung der Reinigung von rekombinantem Erythropoietin aus Zellmedium ist beschrieben in der US-PS 4,667,016 (Lai et al.). Die Expression und Gewinnung von biologisch aktivem, rekombinanten Erythropoietin aus Säugetierwirtszellen, die das Erythropoietin-Gen auf rekombinanten Plasmiden enthalten, hat zum ersten Mal Mengen von Erythropoietin verfügbar gemacht, die für therapeutische Anwendungen geeignet sind. Zusätzlich hat die Kenntnis der Gensequenz und die Verfügbarkeit von größeren Mengen von gereinigtem Protein zu einem besseren Verständnis des Wirkungsmodus dieses Proteins geführt.
Viele Zelloberflächen- und sekretorische Proteine, produziert durch eukaryotische Zellen, werden mit einer oder mehreren Oligosaccharid-Gruppen modifiziert. Diese Modifizierung, bezeichnet als Glycosylierung, kann die physikalischen Eigenschaften von Proteinen dramatisch beeinflussen und kann auch für die Proteinstabilität, Sekretion und subzelluläre Lokalisierung wichtig sein. Richtige Glycosylierung kann für die biologische Aktivität wesentlich sein. Tatsächlich liefern einige Gene aus eukaryotischen Organismen, wenn sie in Bakterien (z. B. E. coli) exprimiert werden, denen Zellprozesse für die Glycosylierungsproteine fehlen, Proteine, die wegen ihres Mangels an Glycosylierung mit geringer oder keiner Aktivität gewonnen werden.
Die EP-A-428267 beschreibt Analoga von menschlichem Erythropoietin mit einem oder mehreren Austauschen in der Aminosäuresequenz von menschlichem Erythropoietin, das zu einem Anstieg der Anzahl der Stellen für Sialinsäure-Bindung führt. Die Analoga haben eine größere Anzahl von Kohlenhydratketten als menschliches Erythropoietin.
Glycosylierung tritt an spezifischen Stellen entlang der Polypeptid-Rückgratkette auf und weist üblicherweise zwei Typen auf: O-verknüpfte Oligosaccharide sind an Serin- oder Threonin-Reste gebunden, während N-verknüpfte Oligosaccharide an Asparagin-Reste gebunden sind, wenn sie Teil der Sequenz Asn-X-Ser/Thr sind, in der X jede Aminosäure mit Ausnahme von Prolin sein kann. Die Strukturen von N-verknüpften und O-verknüpften Oligosacchariden und die Zuckerreste, die in jedem Typ anzutreffen sind, sind unterschiedlich. Ein Zuckertyp, der üblicherweise bei beiden anzutreffen ist, ist N-Acetylneuraminsäure (im weiteren als Sialinsäure bezeichnet). Sialinsäure ist üblicherweise der terminale Rest von sowohl N-verknüpften als auch O-verknüpften Oligosacchariden und kann wegen ihrer negativen Ladung dem Glycoprotein saure Eigenschaften verleihen.
Sowohl aus menschlichem Harn gewonnenes Erythropoietin als auch rekombinantes Erythropoietin (exprimiert in Säugetierzellen) mit der Aminosäuresequenz 1–165 von menschlichem Erythropoietin enthalten drei N-verknüpfte und eine O-verknüpfte Oligosaccharid-Ketten, die zusammen etwa 40% des gesamten Molekulargewichts des Glycoproteins ausmachen. N-verknüpfte Glycosylierung tritt an Asparagin-Resten auf, die an den Positionen 24, 38 und 83 angeordnet sind, während O-verknüpfte Glycosylierung an einem Serin-Rest auftritt, der an der Position 126 angeordnet ist (Lai et al., J. Biol. Chem., 261, 3116, 1986; Broudy et al., Arch. Biochem. Biophys., 265, 329, 1988). Es ist gezeigt worden, daß die Oligosaccharid-Ketten mit terminalen Sialinsäure-Resten modifiziert sind. Enzymatische Behandlung von glycosyliertem Erythropoietin, um alle Sialinsäure-Reste zu entfernen, führt zu einem Verlust an in vivo-Aktivität, beeinflußt aber nicht die in vitro-Aktivität (Lowy et al., Nature 185, 102, 1960; Goldwasser et al., J. Biol. Chem., 249, 4202, 1974). Dieses Verhalten ist erklärt worden durch die schnelle Ausscheidung von Asialo-Erythropoietin aus dem Kreislauf durch Wechselwirkung mit dem Asialoglycoprotein-Bindungsprotein der Leber (Morrell et al., J. Biol. Chem., 243, 155, 1968; Briggs et al., Am. J. Physiol. 227, 1385, 1974, Ashwell et al., Methods Enzymol. 50, 287, 1978). Somit besitzt Erythropoietin nur biologische in vivo-Aktivität, wenn es sialyliert ist, um seine Bindung durch das Leber-Bindungsprotein zu verhindern.
Die Rolle der anderen Komponenten in den Oligosaccharid-Ketten von Erythropoietin ist nicht gut definiert. Es ist gezeigt worden, daß teilweise deglycosyliertes Erythropoietin wesentlich reduzierte in vivo-Aktivität hat, verglichen zu der glycosylierten Form, aber die in vitro-Aktivität beibehält (Dordal et al., Endocrinology 116, 2293, 1985; Lin Patent, supra). In einer anderen Studie jedoch verringert die Entfernung von N-verknüpften oder O-verknüpften Oligosaccharid-Ketten alleine oder zusammen durch Mutagenese von Asparagin- oder Serin-Resten, die Glycosylierungsstellen sind, die in vitro-Aktivität des veränderten Erythropoietins, das in Säugetierzellen produziert wird, stark (Dube et al., J. Biol. Chem. 263, 17516, 1988).
Glycoproteine, wie etwa Erythropoietin, können unter Verwendung von Techniken wie etwa isoelektrischer Fokussierung (IEF) in unterschiedlich geladene Formen getrennt werden. Mehrere Gruppen haben über IEF-Studien an rohen und teilweise gereinigten Erythropoietin-Präparationen berichtet (Lukowsky et al., J. Biochem. 50, 909, 1972; Shelton et al., Biochem. Med. 12, 45, 1975; Fuhr et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 98, 930, 1981). Höchstens drei oder vier Fraktionen mit Erythropoietin-Aktivität wurden in diesen Studien durch IEF unterschieden und keine wurde im Hinblick auf den Kohlenhydratgehalt charakterisiert. Zusätzlich wurde keine Korrelation zwischen den isoelektrischen Punkten der Fraktionen und ihrer biologischen Aktivität hergestellt.
Während der Reinigung von Harn-Erythropoietin aus menschlichem Harn, diskutiert bei Miyake et al., supra, wurde über zwei Erythropoietin-Fraktionen aus Hydroxylapatit-Chromatographie, bezeichnet mit II und IIIA, berichtet, daß sie dieselbe spezifische Aktivität besäßen. Eine anschließende Kohlenhydrat-Analyse der Fraktionen II und IIIA zeigte, daß Fraktion II einen höheren mittleren Sialinsäure-Gehalt aufwies als Fraktion IIIA (Dordal et al., supra).
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, abgetrennte und isolierte Isoformen von Erythropoietin mit einem definierten Sialinsäure-Gehalt und gesteigerter biologischer Aktivität zur Verfügung zu stellen. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die solche Moleküle enthalten, würden therapeutischen Nutzen besitzen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Erythropoietin-Analoga von menschlichem Erythropoietin, umfassend eine Aminosäuresequenz, die einschließt mindestens eine zusätzliche Stelle für die Glycosylierung. Die zusätzlichen Stellen für die Glycosylierung können resultieren in einer größeren Anzahl von Kohlenhydratketten und höherem Sialinsäure-Gehalt, als menschliches Erythropoietin. Erythropoietin-Analoga, umfassend Aminosäuresequenzen, die einschließen eine Deletion von einer oder mehreren Glycosylierungsstellen und einem Hinzufügen von einer gleichen Anzahl von nicht-natürlicherweise vorkommende Glycosylierungsstellen werden ebenfalls bereitgestellt. Analoga, umfassend ein Hinzufügen von einer oder mehreren Aminosäuren zu dem Carboxy-terminalen Ende von Erythropoietin, wobei das Hinzufügen mindestens eine Glycosylierungsstelle bereitstellt, werden ebenfalls eingeschlossen. Die Erfindung umfaßt ferner DNA-Sequenzen, die solche Erythropoietin-Analoga codieren und rekombinierte Plasmide und Wirtszellen für die Expression der Analoga.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt ein analytisches isoelektrisches Fokussierungsgel der getrennten rekombinanten Erythropoietin-Isoformen. Gelspuren 1–11 zeigen Isoformen, die im Bereich von weniger sauer (höherer pI) in Spur 1 bis sauer (niedrigerer pI) in Spur 11 liegen. Gereinigtes rekombinantes Erythropoietin, das eine Mischung der Isoformen 9–14 enthält, ist ebenfalls in der ganz linken und der ganz rechten Spur des Gels gezeigt.
2 zeigt die Beziehung zwischen der Anzahl von Sialinsäuren pro Erythropoietin-Isoform und der spezifischen in vivo-Aktivität jeder Isoform, ausgedrückt als Einheiten pro mg Erythropoietin-Polypeptid. In 2A wurde die Konzentration jeder Erythropoietin-Isoform mit dem Bradford-Proteintest bestimmt; in 2B wurde die Konzentration durch Extinktion bei 280 nm bestimmt, in 2C wurde die Konzentration durch RIA bestimmt.
3 zeigt ein analytisches isoelektrisches Fokussierungsgel definierter Mischungen rekombinanter Erythropoietin-Isoformen, hergestellt mit Anionenaustauscherchromatographie unter verschiedenen Bedingungen. Die Gelspuren 1–6 stellen entsprechend Erythropoie tin-Isoformen dar, die nach dem Waschen der Q-Sepharose-Fast-Flow-Säule mit 150 mM Essigsäure, pH 4,7, 150 mM Essigsäure (ungepuffert, 200 mM Essigsäure, pH 4,7, 250 mM Essigsäure, pH 4,7, 300 mM Essigsäure, pH 4,7 oder 300 mM Essigsäure (ungepuffert) in einem Waschschritt mit hohem Salzgehalt eluiert worden sind. Gereinigtes rekombinantes Erythropoietin, das eine Mischung von Isoformen enthält, wie erhalten unter Verwendung der Verfahren, die in Beispiel 2 von Lai et al., supra, beschrieben sind, mit der Ausnahme, daß die DEAE-Agarose-Chromatographie durch Q-Sepharose-Chromatographie ersetzt wird, ist auch in der ganz linken Spur des Gels dargestellt.
4 zeigt die Trennung der Erythropoietin-Isoformen 8–12, die erreicht wurde, indem zellkonditioniertes Medium, das auf eine Säule aus Q-Sepharose aufgebracht worden war, einem Gradienten mit abnehmendem pH und ansteigender Ionenstärke unterzogen wurde. Aliquots von Fraktionen mit gerader Nummer von Fraktion 2 bis Fraktion 40 wurden einer analytischen isoelektrischen Fokussierung unterzogen. Gereinigtes rekombinantes Erythropoietin, das eine Mischung von Isoformen enthielt, die unter Verwendung von Verfahren erhalten wurden, die in Beispiel 2 von Lai et al., supra, beschrieben sind, mit der Ausnahme, daß DEAE-Agarose-Chromatographie durch Q-Sepharose-Chromatographie ersetzt ist, ist auch in der ganz linken Spur des Gels dargestellt.
5 zeigt die Aminosäuresequenz von menschlichem Erythropoietin. Quadrate zeigen Asparagin-Reste, an denen N-verknüpfte Kohlenhydratketten gebunden sind und ein Stern zeigt den Serin-Rest, der durch eine O-verknüpfte Kohlenhydratkette modifiziert ist.
6A, 6B und 6C zeigen die Serien der Klonierungsschritte, die zur Erzeugung der Plasmide für die Konstruktion und Analyse der Analoga von menschlichem Erythropoietin verwendet wurden. Diese Analoga haben Aminosäuren, geändert wie in 5 gezeigt, die zusätzliche Glycosylierungsstellen bereitstellen.
7 zeigt eine Western-Blot-Analyse von COS-Zellüberständen von Erythropoietin, mit der menschlichen Sequenz, und den angegebenen Erythropoietin-Analoga. Die Analoga [Asn⁹, Ser¹¹] EPO, [Asn⁶⁹] EPO, [Asn¹²⁵, Ser¹²⁷] EPO und [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] EPO sind konstruiert worden wie in Beispiel 6 beschrieben. Zusätzliche Analoga [Pro¹²⁵, Thr¹²⁷] EPO und [Asn¹²⁶, Ser¹²⁸] EPO, die keine zusätzlichen Kohlenhydratketten enthalten, sind zum Vergleich gezeigt.
8 zeigt eine Western-Blot-Analyse von COS-Zellüberständen von Erythropoietin menschlicher Sequenz und zeigt Erythropoietin-Analoga nach Behandlung mit N-Glycanase. Die Analoga [Thr¹²⁵] EPO und [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] EPO wurden konstruiert wie in Beispiel 6 beschrieben. Die Analaga [Val¹²⁶] EPO, [Pro¹²⁴] EPO, [Pro¹²⁵] EPO, [Thr¹²⁷] EPO, [Pro¹²⁵, Ser¹²⁷] EPO und [Thr¹²⁵, Ser¹²⁷] EPO sind zum Vergleich gezeigt.
9 zeigt ein isoelektrisches Fokussierungsgel von den Gemischen 2, 3 und 4, erhalten durch Q-Sepharose und C4-Umkehrphasenchromatographie von Zellmedium, das das Wachstum von CHO-Zellen, transfiziert mit Erythropoietin cDNA, enthaltend die [Thr¹²⁵] Mutation enthalten. Gereinigtes rekombinantes Erythropoietin, enthaltend ein Gemisch der Isoformen, wurde erhalten unter Verwendung der Verfahren beschrieben in Beispiel 2 von Lai et al., supra, mit der Ausnahme, daß DEAE-Agarose-Chromatographie durch Q-Sepharose-Chromatographie ersetzt worden ist, ist ebenfalls in der linken und rechten Spur des Gels gezeigt.
10 zeigt eine Western-Blot-Analyse von COS-Zellüberständen von rekombinantem menschlichen Erythropoietin (rHuEPO) und ausgewählten Analoga. Die Konstruktion der Analoga ist beschrieben in Beispiel 6. Analoga N9, N14, N18, N19, N21, N24 und N39 haben mindestens eine zusätzliche Kohlenhydratkette, wie durch die langsamere Gel-Mobilität gezeigt ist.
11 zeigt eine Western-Blot-Analyse von COS-Zellüberständen von rekombinantem menschlichen Erythropoietin und EPO N14-Analoga, während der N-Glycanase-Verdauung. Die Zeitpunkte wurden nach 0, 4, 12 und 45 Minuten und über Nacht-Verdauung, genommen.
12 zeigt ein isoelektrisches Fokussierungsgel von EPO N14-Analoga-Isoform-Präparationen. Der Isoform-Pool mit niedrigem pI enthält EPO N14-Analoga mit größtenteils 6–12 Sialinsäuren pro Molekül, der Isoform-Pool mit mittlerem pI enthält N14-Analoga mit größ tenteils 10–15 Sialinsäuren pro Molekül und der Isoform-Pool mit hohem pI enthält EPO N14-Analoga mit größtenteils 12–17 Sialinsäuren pro Molekül.
13 zeigt die Pharmakokinetik von rekombinantem menschlichen Erythropoietin, isolierter Isoform 14 und EPO N14-Analoga (Isoformen 15–17) nach intravenöser Injektion in Ratten.
14 zeigt einen kalten Ersetzungs-Assay der ¹²⁵I-markierten rekombinanten menschlichen Erythropoietin-Bindung an den Erythropoietin-Rezeptor in Gegenwart von variierenden Mengen von nicht markiertem rHuEPO, isolierter Isoform 14 oder EPO N14-Analoga.
15 zeigt eine Maus-Hämatokrit-Studie, vergleichend die Aktivität von EPO N14-Isoform-Pool mit hohem pI (0,036 und 0,0712 μg), isolierter Isoform 14 (0,036 und 0,0712 μg), EPO 177-Isoform-Pool mit niedrigem pI (0,0712 μg) und rHuEPO (0,071 μg).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Erythropoietin-Isoformen bereit. Die spezifischen Isoformen von Erythropoietin, erhalten gemäß der vorliegenden Erfindung und ihre Eigenschaften, können von der Art des Ausgangsmaterials abhängen. Zum Beispiel sind die Isoformen von vom Harn abgeleiteten menschlichen Erythropoietin verschieden zu den Isoformen von rekombinantem Erythropoietin. In einer bevorzugten Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf eine Erythropoietin-Isoform mit einer spezifischen Anzahl (d. h. eine festgelegte Anzahl größer als 0) von Sialinsäuren pro Erythropoietin-Molekül, wobei die Anzahl ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 1–14. Vorteilhafterweise ist die Anzahl 9, 10, 11, 12, 13 oder 14. In einer anderen Ausführungsform ist die Anzahl größer als 14, vorteilhafterweise 16–23.
Der Begriff "Erythropoietin-Isoform", wie er hierin verwendet wird, betrifft Erythropoietin-Präparationen mit einem einzigen isoelektrischen Punkt (pI) und mit derselben Aminosäuresequenz. Der Begriff "Erythropoietin", wie hierin verwendet, schließt natürlich-vorkommendes Erythropoietin, vom Harn abgeleitetes menschliches Erythropoietin genauso wie nicht-natürlicherweise-vorkommende Polypeptide mit einer Aminosäuresequenz und Glycosylie rung, ausreichend verdoppelt von der des natürlicherweise-vorkommenden Erythropoietins ein, um in vivo-biologische Eigenschaft zu zeigen, die Knochenmarkszellen veranlassen, Reticulozyten und rote Blutzellen herzustellen, ein.
Es ist festgestellt worden, daß diskrete Isoformen von rekombinantem Erythropoietin mit der Aminosäuresequenz von aus Harn gewonnenem menschlichen Erythropoietin Erythropoietin-Molekülen mit 1–14 Sialinsäuren entsprechen und jede Isoform, die im gereinigten rekombinanten Erythropoietin vorliegt, eine in vivo-Aktivität besitzt, die in Beziehung zur Anzahl von Sialinsäuren steht, die die Isoform besitzt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Erythropoietin das Produkt der Expression einer exogenen DNA-Sequenz, die in eine nicht-menschliche eukaryotische Wirtszelle transfiziert worden ist, d. h. in einer bevorzugten Ausführungsform ist das Erythropoietin "rekombinantes Erythropoietin". Rekombinantes Erythropoietin wird vorteilhafterweise gemäß dem Verfahren hergestellt, das in der sich im gemeinsamen Eigentum befindlichen US-PS 4,703,008 (Lin) beschrieben ist, die hierdurch durch Bezugnahme miteinbezogen wird. Rekombinantes Erythropoietin wird vorteilhafterweise gemäß der allgemeinen Verfahren gereinigt, die in Beispiel 2 der sich im gemeinschaftlichen Besitz befindlichen US-PS 4,667,016 (Lai et al.) beschrieben sind, die hierdurch durch Bezugnahme miteinbezogen wird oder alternativ gemäß dem Verfahren, das in Beispiel 2 beschrieben ist (Lai et al.), wobei DEAE-Agarose-Chromatographie durch Q-Sepharose-Chromatographie ersetzt ist.
Erythropoietin, gereinigt gemäß Beispiel 2, wie bei Lai et al., supra, beschrieben, enthält sechs Isoformen, wenn es durch IEF analysiert wird. Zusätzlich ist wenigstens eine zusätzliche Isoform mit höherer Azidität unter Verwendung der chromatographischen Verfahren, die in Beispiel 4 beschrieben sind, nachgewiesen worden. (Diese saure Form, die auf einem IEF-Gel bei > 14 Sialinsäuren wandert, kann nicht auf Sialinsäure beruhende negative Ladungen enthalten, wie durch die Beständigkeit eines Teils der Ladung gegenüber einer Sialidase-Verdauung gezeigt worden ist.) Diese Isoformen unterscheiden sich voneinander durch den Sialinsäure-Gehalt. Wie in den Beispielen dargestellt, wird dies dadurch belegt, daß 10 dieser Isoformen durch präparative IEF isoliert und der Sialinsäuregehalt von 5 von diesen bestimmt wurde. Bei den auf Sialinsäure-Gehalt untersuchten Isoformen ist festgestellt worden, daß 5 Isoformen entweder 9, 10, 11, 12 oder 13 Sialinsäure-Reste enthielten.
Es gibt eine Beziehung zwischen der relativen spezifischen in vivo-Aktivität von Erythropoietin und der Anzahl von Sialinsäure-Resten pro Erythropoietin-Molekül aus den Isoformen 5 bis 11 (jede Isoform wird hierin durch die Anzahl von Sialinsäuren pro Erythropoietin-Molekül bezeichnet). Die Isoformen 11 bis 14 besitzen ungefähr dieselbe relative spezifische in vivo-Aktivität. Die Isoformen 5 bis 14 werden auf in vivo-Aktivität mit dem Bio-Assay, basierend auf exhypoxischen polycythämischen Mäusen getestet und die Menge jeder vorhandenen Isoform wird mit dem Bradford-Proteintest, der Absorption bei 280 nm oder durch einen Radioimmunoassay (RIA) auf Erythropoietin bestimmt. RIA-Bestimmungen (Egrie et al., Immunobiology 172, 213, 1986), ausgedrückt als Einheiten/ml werden durch 212.770 Einheiten/mg Erythropoietin-Polypeptid die mittlere spezifische Aktivität von gereinigtem Erythropoietin, wie bestimmt durch RIA, geteilt, um Proteinkonzentrationen von isolierten Isoformen oder Isoform-Mischungen zu ergeben, ausgedrückt als mg Erythropoietin-Polypeptid/ml. Wie in den Beispielen gezeigt, steigen die relativen spezifischen an vivo-Aktivitäten schrittweise von Isoform 5 bis Isoform 11 (siehe Tabelle 2).
Die spezifischen in vivo-Aktivitäten, auf die hierin Bezug genommen wird, sind Messungen relativer spezifischer in vivo-Aktivitäten und sind nicht Messungen absoluter spezifischer in vivo-Aktivitäten. Für die Zwecke dieser Anmeldung werden die spezifischen Aktivitäten nur verwendet, um relative Aktivitäten von Isoformen zu vergleichen, die unter Verwendung desselben Tests getestet worden sind, unter Verwendung derselben Bedingungen, einschließlich derselben internen Standards, derselben Tierart, wobei dieselbe Analyse der Daten verwendet wurde, um spezifische Aktivität zu berichten, desselben Tests zur Bestimmung des Proteingehalts. Es ist nicht beabsichtigt, daß jeder spezifische in vivo-Aktivitätswert, der für irgendeine Isoform berichtet worden ist, einen inhärenten oder absoluten Wert für diese Isoform darstellt.
Diese Erfindung stellt auch Zusammensetzungen zur Verfügung, die zwei oder mehr Erythropoietin-Isoformen umfassen. In einer Ausführungsform umfassen die Zusammensetzungen eine Mischung von Isoformen mit mehr als einer vorbestimmten Anzahl von Sialinsäuren pro Erythropoietin-Molekül, z. B. mehr als 11 Sialinsäuren pro Erythropoietin-Molekül oder mehr als 12 Sialinsäuren pro Molekül, z. B. ein Gemisch der Isoformen 12, 13 und 14. In einer anderen Ausführungsform umfassen die Zusammensetzungen Mischungen von Isoformen mit einer vorbestimmten Anzahl von Sialinsäuren pro Erythropoietin-Molekül, z. B. weniger als 12, aber mehr als 8 Sialinsäuren pro Molekül, wie z. B. in einer Mischung der Isoformen 9, 10 und 11. Die Erfindung stellt auch Zusammensetzungen von Erythropoietin-Isoformen zur Verfügung, in denen die relativen Mengen der Isoformen identisch oder verschieden sind. Zum Beispiel könnte eine Mischung der Isoformen 9, 10 und 11 die Isoformen in einer Vielzahl von Verhältnissen vorliegen, wie etwa 1 : 1 : 1, 2 : 3 : 1 oder 20 : 20 : 1.
Vorteilhafterweise umfassen die Zusammensetzungen Mischungen von weniger als 4 Isoformen, z. B. eine Mischung der Isoformen 11, 12 und 13 oder eine Mischung von 12 und 14 oder eine Mischung von 7 und 13.
Um Mischungen von Erythropoietin-Isoformen herzustellen, stellt diese Erfindung auch Verfahren zur gleichzeitigen Isolierung ausgewählter Erythropoietin-Isoformen zur Verfügung. Diese Verfahren schließen die Isolierung einzelner Isoformen durch Techniken wie präparative isoelektrische Fokussierung oder Herstellung von Mischungen von Isoformen mit einer vorbestimmten Anzahl von Sialinsäuren pro Molekül (z. B. mehr als 11) mit Techniken wie Ionenaustauscherchromatographie oder Chromatofokussierung ein. Alle diese Techniken besitzen als ihre Grundlage die Trennung von Proteinen entsprechend der Ladung. Im allgemeinen umfassen die Ionenaustauscherchromatographie und Chromatofokussierung das Aufbringen von entweder rohem menschlichen Erythropoietin (zellkonditionierte Medien) oder gereinigtem Material auf ein Säulenharz unter Bedingungen, die die Bindung eines Teils oder der Gesamtheit der Erythropoietin-Isoformen an das Harz ermöglicht. Für rohe Erythropoietin-Präparationen ist es bevorzugt, das Protein auf die Säule bei etwa pH 7 aufzubringen, während für gereinigte Präparationen das Protein auf die Säule bei pH 7 bis hinunter zu pH 4 aufgebracht werden kann. Nach dem Waschen der Säule mit Puffer bei etwa pH 4 werden diejenigen Erythropoietin-Isoformen, die an die Ionenaustauschersäule gebunden bleiben, durch Anheben des pHs und der Salzkonzentration des Puffers oder durch Anwenden eines Gradienten mit abnehmendem pH und ansteigender Ionenstärke bei etwa pH 4 eluiert. Für die Chromatofokussierung werden die Isoformen aus der Säule durch einen Gradienten mit abnehmendem pH oder durch Waschen der Säule mit einer hohen Salzkonzentration eluiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden individuelle Isoformen isoliert unter Verwendung der Ionenaustauscherchromatographie. Als ein Beispiel wird die Isoform 14 isoliert unter Verwendung der Ionenaustauscherchromatographie, wie in Beispiel 8 beschrieben.
Ebenfalls offenbart sind bestimmte Analoga von menschlichem Erythropoietin. Wie hierin verwendet, betrifft der Ausdruck "Analoga von menschlichem Erythropoietin" Erythropoietin mit einer oder mehreren Veränderungen in der Aminosäuresequenz von menschlichem Erythropoietin, die zu einem Anstieg in der Anzahl von Stellen für Sialinsäure-Bindung führen. Analoga werden durch ortsgerichtete Mutagenese erzeugt mit Additionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäureresten, die Stellen verändern, die für die Glycosylierung verfügbar sind. Solche Analoga besitzen eine größere Anzahl von Kohlenhydratketten als menschliches Erythropoietin.
Die Erythropoietin-Analoga der vorliegenden Erfindung umfassen eine Aminosäuresequenz, die mindestens eine zusätzliche Stelle für die Glycosylierung einschließt. Analoga mit Mengen von Sialinsäuren größer als die, die in menschlichem Erythropoietin gefunden werden, werden erzeugt durch Hinzufügen von Glycosylierungsstellen, die nicht die Sekundär- oder Tertiär-Konformation, erforderlich für die biologische Aktivität, stören. Vorteilhafterweise besitzt das Analogon von menschlichem Erythropoietin 1, 2 oder 3 zusätzliche Stellen für die N-Glycosylierung oder O-Glycosylierung, resultierend in dem Hinzufügen von 1, 2 oder 3 zusätzlichen N-verknüpften oder O-verknüpften Kohlenhydratketten. Zum Beispiel wird ein Leucin an Position 69 durch ein Asparagin ersetzt, um die Sequenz Asn-Leu-Ser zu liefern, die als eine vierte Stelle für die N-Glycosylierung dient. Solch eine Veränderung kann üblicherweise bis zu 4 zusätzliche Sialinsäuren pro Molekül bereitstellen. Beispiele für andere Veränderungen, die zusätzliche N- oder O-Glycosylierungsstellen erzeugen, sind Alanine an den Positionen 125 zu Threonin und Alanine an den Positionen 124 und 125 zu Prolin bzw. Threonin. Analoga können konstruiert werden, die eine oder mehrere zusätzliche N-verknüpfte und O-verknüpfte Ketten, z. B. Analoga NO1 und NO2, beschrieben in Tabelle 5, haben. Wie der Fachmann erkennt, schließt die vorliegende Erfindung viele andere Analoga von menschlichem Erythropoietin ein mit zusätzlichen Stellen für die Glycosylierung.
Analoga mit einer erhöhten Menge von Kohlenhydrat-Bindungen an einer Glycosylierungsstelle werden ebenfalls von der Erfindung umfaßt. Diese Analoga schließen gewöhnlich ein die Substituierung von einer oder mehreren Aminosäuren, die in nächster Nähe zu einer N-verknüpften oder O-verknüpften Stelle sind. Als Ergebnis dieser Aminosäure-Austausche hat ein größerer Teil der Erythropoietin-Polypeptide eine Kohlenhydrat-Modifikation. Die Glycosylierungsstellen können natürlicherweise vorkommen oder können durch Mutation erzeugt werden. Zum Beispiel erzeugte das Analoga N13 keine zusätzliche Kohlenhydratkette, selbst wenn eine Glycosylierungsstelle an Position 88 eingeführt wurde. Jedoch haben die Analoga N14 und N18, bei denen ein Serin- bzw. Valin-Rest an die Stelle 87 gesetzt wurde, eine zusätzliche Kohlenhydratkette an Position 88.
Ebenfalls werden durch die Erfindung Analoga bereitgestellt, die eine oder mehrere Aminosäuren haben, die das Carboxy-terminale Ende von Erythropoietin verlängern und bei denen die Carboxy-terminale Verlängerung mindestens eine zusätzliche Kohlenhydratstelle bereitstellt. In einer Ausführungsform wurde ein Analogon konstruiert durch Fusion der Carboxyterminalen 28 Aminosäuren von menschlichem Chorion-Gonadotropin (HCG) zu dem Arginin-Rest an Position 166 von menschlichem Erythropoietin. Das HCG Carboxy-terminale Fragment hatte vier Stellen für die O-Glycosylierung (Kessler et al., J. Biol. Chem. 254, 7907, 1979).
Die Tabellen 3, 4 und 5 zeigen Erythropoietin-Analoga, die zusätzliche Stellen für N-verknüpfte und/oder O-verknüpfte Kohlenhydratketten haben. Die Analoga haben die Sequenz Asn-X-Ser/Thr, die an verschiedenen Positionen in der menschlichen Erythropoietin-Polypeptidkette eingesetzt wurde, um N-verknüpfte Stellen zu erzeugen oder haben Serin- oder Threonin-Reste eingeführt, um O-verknüpfte Stellen zu erzeugen.
Tabelle 6 zeigt solche Analoga mit mindestens einer zusätzlichen N-verknüpften oder einer zusätzlichen O-verknüpften Kohlenhydratkette oder mit zusätzlichen N-verknüpften und O-verknüpften Ketten gleichzeitig, wie durch die Wanderung der Glycoproteine auf den SDS-Gelen gezeigt wird (Beispiel 7). Wie die Tabellen 3–6 zeigen, haben Analoga mit 1 oder mehreren zusätzlichen Stellen für die Kohlenhydrat-Anlagerung nicht notwendigerweise zur Folge, daß die Erythropoietin-Moleküle zusätzliche Kohlenhydratketten aufweisen. Zum Bei spiel resultierte die Substitution der Threonin-Reste an den Positionen 123 und 125 in der Hinzufügung einer O-verknüpften Kohlenhydratkette, wohingegen die Substitution von Serin oder Threonin an anderen Positionen nicht zu Analoga mit zusätzlichen O-verknüpften Ketten führte (siehe Tabelle 4). Jedoch resultiert die Substitution durch Asparagin-Reste an den Positionen 30, 51, 57, 69, 88, 89, 136 und 138 in der menschlichen Erythropoietin-Aminosäuresequenz in der Addition einer N-verknüpften Kette an diesen Stellen. Die Fusion eines HCG-Polypeptid-Fragments an den Arginin-Rest an Position 166 des menschlichen Erythropoietins führte zu einem Erythropoietin-HCG-Fusionsmolekül mit mindestens zwei zusätzlichen O-verknüpften Kohlenhydratketten.
Die Erythropoietin-Analoga der vorliegenden Erfindung umfassen ebenfalls Erythropoietin mit einer Aminosäuresequenz, die ein Rearrangement von mindestens einer Stelle für die Glycosylierung einschließt. Ein Rearrangement einer Glycosylierungsstelle, wie hier verwendet, bezieht sich auf die Deletion von einer oder mehreren Glycosylierungsstellen im menschlichen Erythropoietin und dem Hinzufügen von einer oder mehreren nicht-natürlicherweise-vorkommenden Glycosylierungsstellen. Die Analoga R1, R2 und R3 sind Beispiele für solche Rearrangements und wurden konstruiert durch die Deletion der N-verknüpften Stellen an den Positionen 24, 38 oder 83 und dem Hinzufügen von einer N-verknüpften Stelle an der Position 88. Jedoch sind eine Vielzahl von anderen Typen von Kohlenhydratstellen-Rearrangements möglich und die resultierenden Analoga können oder können nicht eine größere Anzahl von Glycosylierungsstellen, verglichen zum menschlichen Erythropoietin, aufweisen.
Die Analoga R1, R2 und R3 wurden analysiert hinsichtlich der in vivo-biologischen Aktivität und die Ergebnisse sind gezeigt in Tabelle 7. Das Einfügen einer N-verknüpften Kette bei Asn 88 stellte die biologische Aktivität wieder her von Erythropoietin mit Deletionen von irgendeiner von drei natürlicherweise-vorkommenden N-verknüpften Stellen. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Positionen der Kohlenhydratketten in Erythropoietin verändert werden können, um nützliche Analoga zu erzeugen, ohne die biologische Aktivität signifikant zu beeinflussen.
Von der vorliegenden Erfindung werden ebenfalls umfaßt DNA-Sequenzen, die Erythropoietin-Analoga codieren mit zusätzlichen Stellen für die N-verknüpften und/oder O-verknüpften Ketten, Analoga mit einem Rearrangement von mindestens einer Anlagerungsstelle für eine Kohlenhydratkette und Analoga mit einer oder mehreren Aminosäuren, die das Carboxyterminale Ende von Erythropoietin verlängern. Verfahren, die verwendet worden sind, um Wechsel in der menschlichen Erythropoietin-DNA-Sequenz für die Zwecke des Erzeugens und Änderns der Bindungsstellen für Kohlenhydrate einzuführen, sind in Beispiel 6 beschrieben.
Diese Erythropoietin Analoga können das Produkt der Expression einer exogenen DNA-Sequenz, d. h. hergestellt durch rekombinante DNA-Technologie sein oder können synthetisch hergestellte Produkte sein. Eine exogene DNA-Sequenz umfaßt cDNA, genomische DNA oder chemisch-synthetisierte DNA, die ein Erythropoietin-Analogon codiert. Rekombinante DNA-Plasmide und eukaryotische Wirtszellen, nützlich für die Expression dieser Analoga, werden ebenfalls bereitgestellt. Expressionsvektoren schließen jeden Vektor ein, der fähig ist, klonierte DNA-Sequenzen in einer eukaryotischen Wirtszelle zu exprimieren, insbesondere solche Vektoren, die verwendet werden für die Expression in COS- und CHO-Zellen. Beispiele von solchen Vektoren schließen die Plasmide pEC und pDECΔ, beschrieben in Beispiel 6 der Beschreibung, ein. Die Kultivierung von COS- und CHO-Wirtszellen, die Erythropoietin-Analoga exprimieren, wurde ausgeführt unter Verwendung bekannter Verfahren.
Isolierte Isoformen und Gemische von Isoformen, abgeleitet von Erythropoietin-Analoga, wurden erhalten unter Verwendung der Verfahren, die vorstehend für das Herstellen von Isoformen von menschlichem Erythropoietin beschrieben wurden. Diese Verfahren schließen die isoelektrische Fokussierung, die Ionenaustauscherchromatographie und die Chromatofokussierung ein. Bevorzugt wird die Ionenaustaucherchromatographie verwendet, um individuelle Isoformen und Gemische von Isoformen, abgeleitet von Erythropoietin-Analoga, herzustellen.
Das Ansteigen der Anzahl von Kohlenhydratketten bei Erythropoietin und daher die Anzahl von Sialinsäuren pro Erythropoietin-Molekül kann vorteilhafte Eigenschaften wie eine gesteigerte Löslichkeit, größere Resistenz gegenüber Proteolyse, reduzierte Immunogenität, gesteigerte Serum-Halbwertszeit und gesteigerte biologische Aktivität verleihen.
Konditioniertes Medium von CHO-Zellen, die Erythropoietin-Analoga exprimieren, wurden bezüglich der in vivo-biologischen Aktivität analysiert und die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Mehrere getestete Analoga hatten eine Aktivität, die dreifach oder höher von der war von menschlichem Erythropoietin. Insbesondere die Analoga mit einer zusätzlichen N-verknüpften Kohlenhydratkette entweder an den Positionen 30 oder 88 zeigten eine 2- bis 3fach höhere Aktivität als menschliches Erythropoietin, wohingegen Analoga mit zusätzlichen O-verknüpften Ketten als Ergebnis einer Fusion von menschlichem Erythropoietin an das HCG-Polypeptid-Fragment eine 2fach höhere Aktivität hatten.
Zwei Erythropoietin-Analoga mit zusätzlichen Kohlenhydratketten wurden gereinigt und Isoform-Gemische mit verschiedenen Sialinsäure-Gehalten wurden isoliert (Beispiel 8). Thr¹²⁵ und Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ (EPO N14)-Analoga wurden getrennt in drei getrennte Isoform-Fraktionen und die an vivo-biologische Aktivität für jede Fraktion wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt, und zeigen, daß EPO N14-Isoform-Fraktionen mit höherem Sialinsäure-Gehalt eine größere in vivo-Aktivität hatten.
Eine Mischung von Isoformen mit hohem Sialinsäure-Gehalt von EPO N14-Analoga und rekombinantem menschlichen Erythropoietin (Isoformen 9–14) wurden in Rezeptor-Bindungsstudien, pharmakokinetischen Experimenten und Experimenten, um den Anstieg im Hämatokrit der Maus zu bestimmen, untersucht. Die Ergebnisse dieser Assays zeigen, daß eine direkte Beziehung zwischen dem Sialinsäure-Gehalt, der Halbwertszeit und der Fähigkeit, den Hämatokrit von behandelten Mäusen zu erhöhen, besteht. Daher, wie in den 13, 14 und 15 gezeigt, hatte das Isoform-Gemisch von EPO N14 mit hohem Sialinsäure-Gehalt eine signifikant längere in vivo-Halbwertszeit und verursachte einen höheren Anstieg im Hämatokrit als entweder die isolierte Isoform 14 oder rekombinantes menschliches Erythropoietin, selbst wenn das Isoform-Gemisch von N14 mit hohem Sialinsäure-Gehalt nicht genauso stark an den Rezeptor bindet.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung Säugetier-(z. B. Chinese Hamster Ovary, CHO)-Wirtszellen, die Erythropoietin-Isoformen von menschlichem Erythropoietin vorzugsweise synthetisieren oder Erythropoietin-Analoga mit mehr als einer spezifischen Anzahl von Sialinsäuren pro Molekül, z. B. mehr als 10 Sialinsäuren pro Molekül synthetisieren. Erythropoietin-Moleküle haben N-verknüpfte oder O-verknüpfte Oligosaccharid-Strukturen, die den Sialinsäure-Gehalt des Moleküls beschränken können. Zum Beispiel stellen tetraverzweigte (vier-armige) N-verknüpfte Oligosaccharide gewöhnlicherweise vier mögliche Stellen für Sialinsäure-Bindung bereit, während bi- und triverzweigte Oligosaccharid-Ketten, die die tetraverzweigte Form an Asparagin-verknüpften Stellen ersetzen können, üblicherweise nur höchstens zwei oder drei gebundene Sialinsäuren aufweisen. O-verknüpfte Oligosaccharide stellen üblicherweise zwei Stellen für Sialinsäure-Bindung bereit. So können Erythropoietin-Moleküle insgesamt 14 Sialinsäure-Reste binden, vorausgesetzt, daß alle drei N-verknüpften Oligosaccharide tetraverzweigt sind. Säugetierzellkulturen werden auf diejenigen Zellen gescreent, die bevorzugt tetraverzweigte Ketten zu rekombinantem Erythropoietin hinzufügen, wodurch die Anzahl von Stellen für Sialinsäure-Bindung maximiert wird.
Die N-verknüpften Oligosaccharide von Harn-Erythropoietin enthalten Sialinsäure in sowohl einer α-2,3- als auch einer α-2,6-Bindung an Galactose (Takeuchi et al., J. Biol. Chem. 263, 3657, 1988). Typischerweise wird die Sialinsäure in der α-2,3-Bindung zu Galactose auf dem Mannose-α-1,6-Zweig hinzugefügt und die Sialinsäure in der α-2,6-Bindung wird zu Galactose auf dem Mannose-α-1,3-Zweig hinzugefügt. Die Enzyme, die diese Sialinsäure hinzufügen (β-Galactosid-α-2,3-Sialyltransferase und β-Galactosid-α-2,6-Sialyltransferase) sind am effizientesten im Hinzufügen von Sialinsäure an den Mannose-α-1,6- bzw. den Mannose-α-1,3-Zweig.
Dihydrofolat-Reduktase (DHFR) defiziente Chinese Hamster Ovary (CHO)-Zellen sind eine üblicherweise verwendete Wirtszelle für die Produktion von rekombinanten Glycoproteinen, einschließlich rekombinantem Erythropoietin. Diese Zellen exprimieren nicht das Enzym β-Galactosid-α-2,6-Sialyltransferase und fügen daher nicht Sialinsäure in der α-2,6-Bindung zu N-verknüpften Oligosacchariden von Glycoproteinen, die in diesen Zellen produziert werden, hinzu (Mutsaers et al., Eur. J. Biochem. 156, 651, 1986; Takeuchi et al., J. Chromatogr. 400, 207, 1987). Daher fehlt rekombinantem Erythropoietin, produziert in CHO-Zellen, Sialin säure in der 2,6-Bindung an Galactose (Sasaki et al., 1987, supra; Takeuchi et al., 1987, supra).
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das menschliche Erythropoietin oder ein Erythropoietin-Analogon in CHO-Zellen produziert, die mit einem funktionellen Gen für β-Galactosid-α-2,6-Sialyltransferase transfiziert sind, um den Einbau von Sialinsäure in die α-2,6-Bindung an Galactose zu bewirken. Die resultierenden Isoformen enthalten Sialinsäuren mit sowohl α-2,3- als auch α-2,6-Bindungen an Galactose; siehe Lee et al., J. Biol. Chem. 264, 13848, 1989, die hierdurch durch Bezugnahme miteinbezogen wird, für eine Offenbarung von Techniken zur Herstellung modifizierter CHO-Zellen oder anderer Säugetier-Wirtszellen.
Ebenfalls umfaßt von der Erfindung sind pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine therapeutisch wirksame Menge einer spezifischen Isoform oder Mischungen von Isoformen zusammen mit einem geeigneten Verdünnungsmittel, Adjuvans und/oder Trägermittel umfassen, die in der Erythropoietin-Therapie nützlich sind. Pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge eines Erythropoietin-Analogons zusammen mit einem geeigneten Verdünnungsmittel, Adjuvans und/oder Träger, werden ebenfalls umfaßt. Eine "therapeutisch wirksame Menge", wie hierin verwendet, bezieht sich auf diejenige Menge, die für einen vorgegebenen Zustand und ein Verabreichungsschema eine therapeutische Wirkung erzielt. Die Verabreichung von menschlichem Erythropoietin oder Erythropoietin-Analoga erfolgt vorzugsweise über parenteralem Weg. Der spezifische ausgewählte Weg wird von dem zu behandelnden Zustand abhängen. Die Verabreichung von Erythropoietin-Isoformen wird vorzugsweise als Teil einer Formulierung vorgenommen, die ein geeignetes Trägermittel, wie etwa Humanserumalbumin, ein geeignetes Verdünnungsmittel, wie eine gepufferte Kochsalzlösung und/oder ein geeignetes Adjuvans enthält. Die erforderliche Dosis wird bei Mengen liegen, die ausreichend sind, um den Hämatokrit von Patienten anzuheben, und wird in Abhängigkeit von der Schwere des zu behandelnden Zustands, dem verwendeten Verabreichungsverfahrens und dergleichen, variieren.
Die folgenden Beispiele werden angeboten, um die Erfindung vollständiger zu veranschaulichen, sollten aber nicht als den Schutzumfang derselben beschränkend angesehen werden.
Der in den in vivo-Bioassays, die in den Beispielen eingesetzt werden, verwendete Erythropoietin-Standard ist ein rekombinanter Erythropoietin-Standard, der gegen einen teilweise gereinigten Harn-Erythropoietin-Standard standardisiert wurde. So werden nur relativ spezifische in vivo-Aktivitäten gemessen. Ebenfalls werden die spezifischen in vivo-Aktivitäten in "Einheiten/ml", "Einheiten/mg" und "Einheiten/A₂₈₀" und nicht als "IU/ml", "IU/mg" und "IU/A₂₈₀" ausgedrückt, weil der eingesetzte Erythropoietin-Standard nicht direkt mit irgendeinem existierenden internationalen Standard korreliert worden ist.
Beispiel 1: Isolierung von rekombinanten Erythropoietin-Isoformen
Rekombinantes Erythropoietin wird hergestellt, wie beschrieben bei Lin, supra. Rekombinantes Erythropoietin, das als Ausgangsmaterial für die erste und die dritte Isoform-Isolierung verwendet wird, wird gemäß dem Verfahren gereinigt, das in Beispiel 2 des in gemeinschaftlichem Besitz befindlichen Patents von Lai et al., supra, beschrieben ist. Ausgangsmaterial für die zweite und die fünfte Isoform-Isolierung wird gemäß Lai et al., supra, unter Verwendung der Modifikation der Q-Sepharose-Chromatographie, gereinigt. Diese Präparationen enthalten eine Mischung von Isoformen von rekombinantem Erythropoietin mit derselben Aminosäuresequenz wie aus Harn gewonnenem menschlichem Erythropoietin und enthalten überwiegend die Isoformen 9 bis 14. Ausgangsmaterial für die vierte Isoform-Präparation ist das Material, das während des Waschschritts der Anionenaustauschsäule in Beispiel 2 von Lai et al. mit 5 mM Essigsäure/1 mM Glycin/6 M Harnstoff eluiert wurde. Diese Fraktion enthält Isoformen mit weniger als oder genau 9 Sialinsäuren und wurde durch Gelfiltrationschromatographie weiter gereinigt, wie in Beispiel 2 von Lai et al. beschrieben ist, vor der Verwendung im präparativen isoelektrischen Fokussierungsverfahren. Die sechste Isoform-Präparation verwendete als ihr Ausgangsmaterial eine gereinigte Präparation von rekombinantem Erythropoietin mit 4 bis 13 Sialinsäure-Resten. Dieses Material wurde nach Beispiel 2 von Lai et al. gereinigt, mit der Ausnahme einer Modifikation an der Anionenaustauschsäule (Elution des rekombinanten Erythropoietins mit einem Natriumchlorid-Gradienten bei pH 8,4 und Weglassen des Essigsäure/Harnstoff-Waschschritts, was zur Retention des Großteils der Isoformen, die im Ausgangsmaterial vorhanden sind, führt.
Sechs verschiedene Präparationen von einzelnen Isoformen werden durch präparative isoelektrische Fokussierung in einem granulierten Gelbett (Ultrodex, LKB) durchgeführt, im wesentlichen wie nach LKB Application Note 198. Pharmalyte (Pharmacia)-2,5-5-Ampholyte (Pharmacia) werden verwendet und das Gelbett enthält 5 M Harnstoff.
In der ersten Präparation werden ungefähr 20 mg rekombinantes Erythropoietin in 6,8 ml 20 mM Natriumcitrat/100 mM Natriumchlorid, pH 7,0 auf das Gel aufgebracht und bei 8 Watt für 16 Stunden fokussiert. Nach der isoelektrischen Fokussierung werden die Isoform-Banden im Gel durch einen Papierkontaktabdruck des Gelbetts sichtbar gemacht. Der Abdruck wird durchgeführt und das durch Eintauchen in 3 Wechselbäder (ungefähr jeweils 10 Minuten, Raumtemperatur) mit Fixierlösung (40% Methanol/10% Essigsäure/10% TCA/3,5% Sulfosalicylsäure) fixiert, einem Wechselbad (ungefähr 10 Minuten) aus 40% Methanol/10% Essigsäure (30–60°C) unterworfen für 15 Minuten bei 60°C in 0,125% Coomassie-Blue R-250/40% Methanol/10% Essigsäure angefärbt und dann in 7,5% Methanol/10% Essigsäure entfernt, um die getrennten Isoformen sichtbar zu machen. Die Region des granulierten Gelbetts, die die Isoformen enthält (~50% des Harzes) wird entfernt, Wasser wird zugegeben (ungefähr 16 ml) und die Aufschlämmung wird in eine 5,5 × 24,5 Inch große Scheibe gegossen und zu ungefähr 40 g Nettogewicht eingedampft. Diese Präparation wird ein zweites Mal fokussiert und ein Kontaktabdruck des Gelbettes wird angefertigt wie zuvor. Der Teil des Gels, der jede der sechs sichtbaren Isoformen enthält, wird aus dem Gelbett entfernt.
Um die Isoformen aus dem Gel zu eluieren, wird eine Lösung, die 10 mM Tris-HCl, pH 7,0/5 mM Chaps enthält, zu jeder Isoform zugegeben, um eine Aufschlämmung zu erzeugen. Die Aufschlämmungen werden in kleine Säulen gegeben und mit dem Tris-Chaps-Puffer gewaschen. Die Durchflußmengen werden gesammelt und getrennt auf kleine Säulen aufgebracht (offene Säulenkonfiguration), die Vydac-C4-Umkehrphasenharz enthalten, das equilibriert ist in 20% Ethanol/10 mM Tris-HCl, pH 7,0. Die Säulen werden schrittweise mit 20% Ethanol/10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 35% Ethanol/10 mM Tris-HCl, pH 7,0 und 65% Ethanol/10 mM Tris-HCl, pH 7,0 entwickelt. Die Fraktion, die bei 65% Ethanol/10 mM Tris eluiert, wird 1 : 1 mit 10 mM Tris-HCl, pH 7,0 verdünnt und einer Konzentration unterzogen und anschließend puffergetauscht zu 10 mM Tris-HCl, pH 7,0 unter Verwendung eines Mikrokonzentrators Centricon-10 (Amicon). Analytische isoelektrische Fokussierung dieser Präpa ration wird im wesentlichen so durchgeführt, wie beschrieben in der LKB technical note 250, unter Verwendung von Servalyte-3-5-Ampholinen (Serva) in einem Polyacrylamidgel, das 5 M Harnstoff enthält.
In einer zweiten Präparation werden ungefähr 26 mg rekombinantes Erythropoietin in 6,5 ml deionisiertem Wasser auf das Gel aufgebracht und bei 2,5 Watt für 35 Minuten und 10 Watt für ungefähr 17 Stunden fokussiert. Die Banden des fokussierten Proteins, die im Gelbett sichtbar sind, werden als 11 verschiedene Pools entfernt. Jeder Pool wird mit deionisiertem Wasser auf etwa 7,5 ml gebracht und 20 ml von jedem der resultierenden Pool-Überstände werden einer analytischen isoelektrischen Fokussierung unterzogen, wie oben beschrieben. Zu jedem der Pools werden 5 ml 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 zugegeben und die Aufschlämmungen werden jede in kleine Säulen gegeben und die flüssige Phase hindurchfließen gelassen. Das Harz wird mit ungefähr 3 Volumenteilen 0,5 M Tris-HCl, pH 7 gewaschen und die Spüllösung wird mit einer Durchflußmenge vereinigt. Die Eluenten werden konzentriert und 20 mM Natriumcitrat/100 mM Natriumchlorid, pH 7,0 unter Verwendung von Einweg-Ultrafiltrationseinheiten von Amicon mit einem Molekulargewichtsschnitt von 10.000 Dalton puffergetauscht. Die konzentrierten Lösungen (ungefähr 0,5 ml) werden dann durch einen Zelluloseacetat-Filter mit einem Schnitt von 0,2 μm hindurchgegeben. Auf der Basis analytischer isoelektrischer Fokussierung werden 5 Pools gefunden, die überwiegend die einzelnen Isoformen 10, 11, 12, 13 und 14 enthalten.
In einer dritten Präparation werden ungefähr 30 mg rekombinantes Erythropoietin in 21,8 ml destilliertem Wasser auf das Gel aufgebracht und bei 2 Watt für 25 Minuten, 10 Watt für 20 Stunden und 15 Watt für 15 Minuten fokussiert. Protein-Banden, die einzelnen Isoformen entsprechen, werden sichtbar gemacht und aus dem Gelbett entfernt. Destilliertes Wasser wird zu den Gel-isolierten Isoformen zugegeben, um eine Aufschlämmung zu erzeugen, und die resultierenden Überstände werden durch analytische isoelektrische Fokussierung analysiert. Ein gleiches Volumen von 1 M Tris-HCl, pH 7,2, wird zu jeder Aufschlämmung hinzugefügt, die Suspensionen werden in getrennte kleine Säulen plaziert und die flüssige Phase läßt man durch die Säule hindurchfließen, um die Isoformen zu eluieren. Jede Durchflußmenge wird konzentriert und zu 20 mM Natriumcitrat/100 mM Natriumchlorid, pH 7,0 unter Verwendung von Einweg-Ultrafiltrationseinheiten von Amicon mit einem Molekularge wichtsschnitt von 10.000 Dalton puffergetauscht. Ein analytisches isoelektrisches Fokussierungsgel zeigte, daß die Pools erhalten wurden, die überwiegend die einzelnen Isoformen 9, 10, 11, 12, 13 und 14 enthielten.
Eine vierte Isoform-Präparation verwendete als ihr Ausgangsmaterial Erythropoietin, das die Isoformen 3–9 enthielt (hergestellt wie oben beschrieben). Vor der präparativen isoelektrischen Fokussierung, die im wesentlichen durchgeführt wurde, wie für die Präparationen 1–3 oben beschrieben, wurden die Ampholyte (Pharmalyte 2,5–5) in einer isoelektrischen Rotofor-Fokussierungszelle für Flüssigphase (Bio-Rad, Richmond, CA) vorfraktioniert, um einen für die niedrigen isoelektrischen Punkte des Ausgangsmaterials geeigneteren Ampholyt-Bereich zu liefern. Die Vorfraktionierung wurde durchgeführt, indem 6,7 ml Pharmalyte 2,5–5 mit 15 g Harnstoff vermischt und gereinigtes Wasser zugegeben wurde, um das Volumen auf 50 ml zu bringen. Diese Mischung wurde im Rotofor bei 10 Watt, 1°C für 5 1/2 Stunden unter Verwendung von 0,1 M Phosphorsäure und 0,1 M Natriumhydroxid als dem Anolyten bzw. Catholyten fraktioniert. Die Ampholyt-Fraktionen mit gemessenen pHs von zwischen 4,5 und ungefähr 6 wurden bei der isoelektrischen Flachbett-Fokussierung verwendet.
Ampholyte wurden von den Isoformen unter Verwendung eines Centrieluters (Amicon, Danvers, MA) und eines Centricons mit einem Schnitt von 10.000 MW (Amicon) unter Verwendung der folgenden Parameter abgetrennt: 0,18 M Tris-Puffer pH 8,8, 100 Volt, 25–30 mA, für 3 Stunden. Die Isoformen wurden dann in 0,1 M Natriumchlorid durch Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex-G-25 (Pharmacia)-Puffer getauscht. Analytische isoelektrische Fokussierung der fünf resultierenden Pools zeigte, daß sie die Isoformen 4, 5, 6, 7 und 8 enthielten. Isoform 4 lief als mehrere Banden, was anzeigte, daß sie in gewissem Umfang einen Abbau durchlaufen hatte.
Die fünfte Isoform-Präparation wurde durch die Hinzufügung eines Vorfokussierungsschrittes zum isoelektrischen Flachbett-Fokussierungsverfahren modifiziert. In dieser Modifikation wurde das Protein nicht zur Ampholyt/Harnstoff/Gel-Mischung vor der Elektrophorese zugegeben, sondern wurde zum isoelektrischen Fokussierungsapparat im Anschluß an die Erzeugung des pH-Gradienten im Gelbett zugegeben. Im Anschluß an eine Vorfokussierung für 75 Minuten (1500 Volt-Stunden) wurde der Abschnitt des Gelbettes von 2,25–4,25 cm von der Kathode entfernt, mit der Erythropoietin-Lösung vermischt und zum Gelbett zurückgegeben. Im Anschluß an die isoelektrische Fokussierung wurden die Isoformen 10, 11, 12, 13 und 14 aus dem Gelbett eluiert und von den Ampholyten durch Ultrafiltration unter Verwendung von Centricon-10 (Amicon)-Einheiten abgetrennt.
Die Vorfokussierungs-Modifikation wurde vorgenommen, um die Ultraviolett-Absorptionseigenschaften der Isoform-Präparationen ähnlicher zu denjenigen des rekombinanten Erythropoietin-Ausgangsmaterials zu machen. Diese Verbesserung der spektralen Eigenschaften kann im Verhältnis der Extinktion bei 280 und 260 nm für die isolierten Isoformen gesehen werden. Das mittlere Verhältnis der Extinktion bei 280 nm zu der bei 260 nm (A₂₈₀/A₂₆₀) für Isoformen aus den Präparationen 2 und 3 (nicht-vorfokussiert) beträgt 1,36 ± 0,11, während das mittlere A₂₈₀/A₂₆₀-Verhältnis für die Präparationen 5 und 6 (vorfokussiert) 1,68 ± 0,20 beträgt. Wenn die Isoform 14 von der Berechnung ausgenommen wird, betragen die mittleren A₂₈₀/A₂₆₀-Verhältnisse 1,39 ± 0,11 und 1,74 ± 0,09 für die Präparationen 2 und 3 bzw. 5 und 6 (Isoform 14 könnte das atypischste Spektrum besitzen, weil es in den geringsten Mengen vorliegt, und unterliegt somit stärkeren Interferenzen durch Spurenverunreinigungen durch Ampholyt-Bestandteile, oder weil es während des isoelektrischen Flachbett-Fokussierungsverfahrens am nächsten zur Elektrode liegt). Das mittlere A₂₈₀/A₂₆₀-Verhältnis für rekombinantes Erythropoietin, hergestellt gemäß Beispiel 2 von Lai et al. (modifiziert wie zuvor beschrieben durch Verwendung von Q-Sepharose als dem Anionenaustauscherharz) beträgt 1,91 ± 0,04.
Wie oben beschrieben, war das Ausgangsmaterial für Isoform-Präparation 6 eine rekombinante Erythropoietin-Präparation, die Isoformen 4–13 enthielt. Die Ampholyte wurden im Rotofor-Apparat vorfokussiert wie für die vierte Präparation. Ampholyt-Fraktionen mit gemessenen pHs von zwischen 3,7 und 4,8 wurden für die isoelektrische Flachbett-Fokussierung verwendet. Das Flachbett wurde vorfokussiert wie in Lauf #5 und die Isoformen 9, 10, 11, 12 und 13 wurden nach Ultrafiltration (Centricon-10), um Träger-Ampholyte zu entfernen, erhalten.
Beipiel 2: Sialinsäure-Gehalt von rekombinanten Erythropoietin-Isoformen

Die Isoformen, die isoliert wurden, wie beschrieben in Beispiel 1, und Erythropoietin, das gereinigt wurde gemäß Verfahren, die bei Lai et al., supra, beschrieben sind (Mischung der Isoformen 9 bis 14), werden in 0,10–0,15 M Natriumchlorid puffergetauscht und mit einer Modifikation des Verfahrens von Jourdian et al., J. Biol. Chem. 246, 430, 1971, auf Sialinsäure-Gehalt analysiert. Die Sialinsäure-Reste werden von den Glycoproteinen durch Hydrolyse mit 0,35 M Schwefelsäure bei 80°C für 30 Minuten abgespalten und die Lösungen werden vor der Analyse mit Natriumhydroxid neutralisiert. Um die Menge an vorhandenem Erythropoietin-Protein abzuschätzen, wird ein Bradford-Proteintest (Bradford Anal., Biochem. 72, 248, 1976) unter Verwendung von rekombinantem Erythropoietin mit der Aminosäuresequenz von menschlichem Erythropoietin als Standard unter Verwendung der Testreagenzien und des Mikromethoden-Verfahrens, geliefert von Bio-Rad, durchgeführt. Die Ergebnisse, ausgedrückt als Mol Sialinsäure pro Mol Erythropoietin, sind in Tabelle 1 dargestellt. Isoformen werden entsprechend der Anzahl von Sialinsäuren pro Molekül bezeichnet und liegen im Bereich von am wenigstens sauer (Isoform 9) bis am stärksten sauer (Isoform 13). Die Isoformen 9–13 sind in den Gelspuren 6–10 von 1 gezeigt. Die Mengen an Isoform 14 sind ungenügend, um den Sialinsäure-Gehalt genau zu messen. Der Sialinsäure-Gehalt dieser Isoformen wird aus ihrer Wanderung auf IEF-Gelen relativ zu anderen Isoformen geschlossen. Der Sialinsäure-Gehalt der Isoformen 5–8 (Präparation #4) ist nicht gemessen worden, wird aber in ähnlicher Weise aufgrund ihrer Wanderung aus IEF-Gelen geschlossen. TABELLE 1

Erythropoietin-Isoform	Mole Sialinsäure/Mol Erythropoietin
Isoform 13	12,9 ± 0,5
Isoform 12	11,8 ± 0,2
Isoform 11	11,0 ± 0,2
Isoform 10	9,8 ± 0,3
Isoform 9	8,9 ± 0,6
Isoform-Mischung (9–14)	11,3 ± 0,2

Beispiel 3: Aktivität rekombinanter Erythropoietin-Isoformen
Die Isoformen, die isoliert worden sind, wie beschrieben in Beispiel 1, werden durch Extinktion bei 280 nm, durch den Bradford-Proteintest und durch RIA auf Erythropoietin untersucht, um die Menge an vorhandenem rekombinanten Erythropoietin zu bestimmen. Der Bioassay basierend auf exhypoxischen polycythämischen Mäusen (Cotes et al., Nature 191, 1065, 1961) wird verwendet, um die relative biologische in vivo-Aktivität zu bestimmen. Die Quantifizierung der Menge an vorhandenem Erythropoietin-Protein unter Verwendung eines Radioimmunassays auf Erythropoietin ergab Ergebnisse mit höherer relativer spezifischer an vivo-Aktivität für bestimmte Isoformen wegen einer scheinbaren verringerten Immunreaktivität von Isoformen, die große Mengen an Sialinsäure enthielten, was zu einer Unterschätzung der Erythropoietin-Konzentration und somit einer Überschätzung der relativen spezifischen in vivo-Aktivität für die meisten negativen Isoformen führte. Mäuse-Bioassay-Bestimmungen, ausgedrückt als Einheiten/ml, werden durch die entsprechenden Proteinkonzentrationen geteilt, um spezifische in vivo-Aktivitäten zu ergeben, ausgedrückt als Einheiten/mg Erythropoietin-Polypeptid. Diese spezifischen Aktivitäten sind in Tabelle 2 dargestellt.
In Tabelle 2 ist "n" die Anzahl unabhängiger Isoform-Präparationen, die zum spezifischen Aktivitätswert beitragen. In den meisten Fällen wurden mehrere in vivo-Tests an jeder Isoform-Präparation durchgeführt. Dieselben in vivo-Daten tragen zu den Berechnungen der spezifischen Aktivität für alle drei Spalten bei, Einheiten/mg Erythropoietin-Polypeptid wurden durch die Extinktion bei 280 nm, aus Radioimmunassay-Potenzen und aus Bradford-Protein-Testergebnissen bestimmt. Gereinigtes rekombinantes Erythropoietin, das die Isoformen 9–14 enthielt, wurde als der Standard im Bradford-Proteintest verwendet. "n" kann kleiner sein für die Berechnung, die unter Verwendung des Bradford-Proteintests durchgeführt wird, da einige Präparationen zu dem Zeitpunkt, zu dem Bradford-Tests durchgeführt wurden, nicht mehr verfügbar waren.
Erythropoietin, das gemäß den Verfahren gereinigt worden ist, die bei Lai et al., supra, beschrieben sind, und das eine Mischung der Isoformen 9–14 enthält, wird als ein Standard für die RIAs und in vivo-Tests verwendet.
Die relativen spezifischen Aktivitäten, ausgedrückt als Einheiten/mg Erythropoietin-Polypeptid, können in Einheiten/A₂₈₀ durch Multiplikation mit 0,807 mg Erythropoietin-Polypeptid/A₂₈₀ umgewandelt werden. Der Umwandlungsfaktor ist gewonnen durch Multiplikation des Extinktionskoeffizienten von Erythropoietin (1,345 mg/A₂₈₀) mit dem Proteingehalt des Erythropoietin-Glycoproteins (etwa 60 Gew.-%, Davis et al., Biochemistry 26, 2633, 1987), um mg Erythropoietin-Polypeptid/A₂₈₀ zu erhalten (d. h. 1,345 mg Erythropoietin/A₂₈₀ × 0,60 mg Polypeptid/mg Erythropoietin = 0,807 mg Polypeptid/A₂₈₀). Zusätzlich können spezifische Aktivitäten, ausgedrückt als Einheiten/mg Erythropoietin-Polypeptid, mit dem Faktor 0,60 mg Polypeptid/mg Erythropoietin-Glycoprotein multipliziert werden, um spezifische Aktivitäten zu ergeben, die als Einheiten/mg Erythropoietin-Glycoprotein ausgedrückt sind.
Die Daten in Tabelle 2 sind in den 2A, 2B und 2C graphisch dargestellt. Diese Daten zeigen, daß die relative in vivo-Aktivität von Erythropoietin als eine Fraktion des Sialinsäure-Gehalts bis zu Isoform #11 ansteigt. Die Isoformen 11–14 besitzen im wesentlichen dieselbe relative in vivo-Bioaktivität. (Dies ist besonders offensichtlich, wenn die Konzentration von Isoform 14 unter Verwendung des Bradford-Testwertes ausgedrückt wird. Der Bradford-Wert könnte wegen der allgemein niedrigen Gehalte, die erhalten wurden und der resultierenden Schwierigkeiten bei der Bestimmung durch A₂₈₀ und der offensichtlichsten verringerten Reaktivität im RIA von sehr negativen Formen, die zuvor diskutiert worden sind, für Isoform 14 genauer sein). Die größere relative spezifische in vivo-Aktivität von Erythropoietin-Isoformen mit mehr Sialinsäure beruht höchstwahrscheinlich auf einer längeren Halbwertszeit im Kreislauf dieser Formen. Die Isoformen 9 und 13 wurden mit radioaktivem Iod (¹²⁵I) markiert und ihre Ausscheidungsrate in Ratten wurde bestimmt. Die Halbwertszeit im Kreislauf war signifikant länger für Isoform 13 als für Isoform 9.
Beispiel 4: Selektion von rekombinanten Erythropoietin-Isoform-Mischungen durch O-Sepharose-Chromatographie
Zellkonditionierte Medien aus der Herstellung von rekombinantem Erythropoietin gemäß den Verfahren, die bei Lin, supra, beschrieben sind, werden konzentriert und gegen 10 mM Tris, pH 7,2, diafiltriert. Die Proteinkonzentration wird mit dem Bradford-Mikroproteintest unter Verwendung von Rinderserumalbumin als einem Standard bestimmt. 19,6 ml der Lösung, die 40 mg Gesamtprotein enthalten, werden 20 μM in CuSO₄ gemacht, durch einen Filter mit einem Schnitt von 0,45 μm filtriert und auf eine Säule mit einem Bettvolumen von 4 ml (1,05 cm Höhe × 2,2 cm Durchmesser) geladen, die mit Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) gepackt ist, das mit 10 mM Tris, pH 6,8 bis 7,0 bei 4°C equilibriert worden ist. Nach Aufbringen der Probe wird die Säule mit zwei Säulenvolumina desselben Puffers gewaschen. Der Säulendurchfluß beträgt etwa 1 ml/Minute. Sechs separate Säulen wurden unter Verwendung dieses Verfahrens aufgebaut, um definierte Erythropoietin-Isoform-Mischungen zu selektionieren.
Die Säulen werden mit 6 bis 9 Säulenvolumina eines Puffers mit niedrigem pH gewaschen, bestehend aus: Säule #1, 150 mM Essigsäure, 1 mM Glycin, 20 μM CuSO₄, 6 M Harnstoff, eingestellt auf pH 4,7 mit NaOH; Säule #2, 200 mM Essigsäure, 1 mM Glycin, 20 μM CuSO₄, 6 M Harnstoff, eingestellt auf pH 4,7 mit NaOH; Säule #3, 250 mM Essigsäure, 1 mM Glycin, 20 μM CuSO₄, 6 M Harnstoff, eingestellt auf pH 4,7 mit NaOH; Säule #4, 300 mM Essigsäure, 1 mM Glycin, 20 μM CuSO₄, 6 M Harnstoff, eingestellt auf pH 4,7 mit NaOH; Säule #5, 150 mM Essigsäure, 1 mM Glycin, 20 μM CuSO₄, 6 M Harnstoff; Säule #6, 300 mM Essigsäure, 1 mM Glycin, 20 μM CuSO₄, 6 M Harnstoff. Der pH der Säulen wird auf ungefähr 7 angehoben, indem jede mit 8 bis 11 Säulenvolumina 10 mM Tris-HCl, 55 mM NaCl, 20 μM CuSO₄, pH 7, gewaschen wird. Die definierten Erythropoietin-Isoform-Mischungen werden aus den Säulen durch Waschen mit 10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 20 μM CuSO₄, pH 7,0, eluiert.
Die eluierten Isoform-Pools aus jeder Säule werden konzentriert und unter Verwendung eines Mikrokonzentrators Amicon Centricon-10 in Wasser lösungsmittelgetauscht. Die Ergebnisse der analytischen isoelektrischen Fokussierung dieser konzentrierten Pools sind in 3 dargestellt. Die Gelspuren 1–6 stellen definierte Erythropoietin-Isoform-Mischungen dar, die aus Säulen 1–6 eluiert worden sind. Die "Isoform-Mischung", die in der ganz rechten Gelspur von 3 gezeigt ist, stellt ein Zellmedium dar, das auf eine Q-Sepharose-Säule aufgebracht ist, wie vorstehend beschrieben, wobei die Säule mit 5 mM Essigsäure, 1 mM Glycin, 20 μM CuSO₄, 6 M Harnstoff, gewaschen ist und die Erythropoietin-Isoform-Mischung aus der Säule unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren eluiert ist. Diese eluierte Mischung von Isoformen wird vor der analytischen isoelektrischen Fokussierung weiter gereinigt gemäß den Verfahren, die bei Lai et al., supra, beschrieben sind.
Beispiel 5: Fraktionierung rekombinanter Erythropoietin-Isoformen unter Verwendung eines Gradienten mit niedrigein pH auf Q-Sepharose
In einem anderen Verfahren werden Erythropoietin-Isoformen unter Verwendung eines Gradienten mit abnehmendem pH und ansteigender Ionenstärke getrennt. Das konzentrierte, diafiltrierte Erythropoietin enthaltende Medium wird auf eine Säule aus Q-Sepharose in einem Verhältnis von etwa 40 mg Gesamtprotein/ml Gel geladen. Die Säule wird anschließend mit etwa zwei Säulenvolumina 10 mM Tris-HCl, pH 7,0 und anschließend etwa 10 Säulenvolumina 2 mM Essigsäure/1 mM Glycin/20 μM CuSO₄/6 M Harnstoff (pH etwa 4,8) gewaschen, um verunreinigende Proteine und Erythropoietin-Isoformen, die weniger als etwa 7 Sialinsäure-Reste enthalten, zu entfernen. Isoformen, die etwa 8 bis etwa 12 Sialinsäuren enthalten, werden aus der Säule unter Verwendung eines Gradienten eluiert, der bei etwa 2 mM Essigsäure in 6 M Harnstoff/1 mM Glycin/20 μM CuSO₄ beginnen und bis zu 40 mM Essigsäure/6 M Harnstoff/1 mM Glycin/20 μM CuSO₄ (pH etwa 4) läuft. Das Gesamtvolumen des Gradienten beträgt etwa 40 Säulenvolumina und Fraktionen von etwa jeweils einem Säulenvolumen werden in Behälter gesammelt, die 1 Volumen Tris-Puffer enthalten, was ausreichend ist, um den pH-Wert im Bereich von 6–8,5 zu bringen, um eine Langzeitwirkung des niedrigen pHs auf die gesammelten Fraktionen zu vermeiden. Aliquots der Fraktionen werden einer analytischen isoelektrischen Fokussierung unterzogen, um die Trennung zu überwachen. 4 zeigt die Trennung der Isoformen 8–11, die mit diesem Verfahren erreicht werden kann. Die Isoformen 12–14, die am Ende des Gradienten an die Säule gebunden zurückbleiben, werden durch Waschen mit einem Puffer eluiert, der aus 10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 20 μM CuSO₄ (pH 7,0) besteht. Die Isoformen (während des Gradienten getrennt oder mit der NaCl-Lösung eluiert) werden von verunreinigenden Proteinen durch Umkehrphasenchromatograhie befreit, gefolgt von Gelfiltrationschromatographie, wie beschrieben in Beispiel 2 von Lai et al.
Beispiel 6: Konstruktion von menschlichen Erythropoietin-Analoga
Die Lokalisierung von existierenden Kohlenhydrat-Bindungsstellen innerhalb der menschlichen Erythropoietin-Aminosäuresequenz ist in 5 (SEQ ID NO: 26) gezeigt. Verfahren zur Erzeugung zusätzlicher Glycosylierungstellen für Erythropoietin sind in den 6A–C zusammengefaßt und nachstehend beschrieben.
Die folgenden Oligonucleotid-Primer wurden zur Verwendung für die in vitro-Mutagenese synthetisiert:
Die unterstrichenen Codons zeigen die nicht-gepaarten Regionen, wo die in Klammern angegebenen Aminosäuren die Wildtyp-Aminosäuren ersetzen.
[Asn⁴, Ser⁶] EPO wurde konstruiert, um eine N-Glycosylierungsstelle bei Asn 4 hinzuzufügen. [Asn⁹, Ser¹¹] EPO wurde konstruiert, um eine N-Glycosylierungsstelle bei Asn 9 hinzuzufügen. [Asn⁶⁹] EPO wurde konstruiert, um eine N-Glycosylierungsstelle bei Asn 69 hinzuzufügen. [Asn¹²⁵, Ser¹²⁷] EPO wurde konstruiert, um eine N-Glycosylierungsstelle bei Asn 125 hinzuzufügen. [Thr¹²⁵] EPO und [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] EPO wurde konstruiert, um eine O-Glycosylierungsstelle bei Thr 125 hinzuzufügen.
Die folgenden Oligonucleotid-Primer wurden synthetisiert zur Verwendung für die in vitro-Mutagenese:
Ausgehend von [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] EPO cDNA, der Oligonucleotid-Primer 5' AGATCCGACCACCGCTGCTCCAC 3' (SEQ ID NO: 16) wird verwendet, um [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵, Thr¹²⁶] EPO zu erzeugen. Der Oligonucleotid-Primer 5'-TGCTCCACTCACAACAATCACTG-3' (SEQ ID NO: 17) wird dann verwendet, um [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵, Thr¹²⁶, Thr¹³¹] EPO zu erzeugen.
[Asn⁶⁹, Thr⁷¹] EPO und [Ser⁶⁸, Asn⁶⁹, Thr⁷¹] EPO wurden konstruiert, um eine N-Glycosylierungsstelle bei Asn 69 hinzuzufügen und um die N-Glycosylierung an dieser Stelle zu erhöhen. [Asn¹²⁵, Thr¹²⁷] EPO, [Asn¹²⁵, Thr¹²⁷, Thr¹³¹] EPO, [Pro¹²⁴, Asn¹²⁵, Ser¹²⁷] EPO und [Pro¹²⁴, Asn¹²⁵, Thr¹²⁷] EPO wurden konstruiert, um eine N-Glycosylierungsstelle bei Asn 125 hinzuzufügen und um die Glycosylierung an dieser Stelle zu erhöhen. [Thr¹²⁵, Thr¹²⁶] EPO und [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵, Thr¹²⁶, Ser¹³¹] EPO wurden konstruiert, um eine O-Glycosylierungsstelle bei Thr 125 hinzuzufügen und um die Glycosylierung an dieser Stelle zu erhöhen.
Die Quelle für Erythropoietin-DNA für die in vitro-Mutagenese war das Plasmid Hu13, ein menschlicher Erythropoietin cDNA-Klon in pUC 8 (Law et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83, 6920, 1986). Die Plasmid-DNA, abgeleitet von Hu13, wurde mit BstEII und BglII Restriktionsenzymen verdaut, die resultierenden DNA-Fragmente wurden der Agarosegelelektrophorese unterzogen und das 810-Basenpaar (bp) Erythropoietin-DNA-Fragment wurde aus dem Gel unter Verwendung eines GeneClean^TM-Kit und den Verfahren des Herstellers (BIO 101, Inc.) isoliert. Das Plasmid pBRgHuEPO enthält das genomische Erythropoietin-Gen als BamHI-Fragment, inseriert in ein Derivat von pBR322, wie in beschrieben in dem im gemeinsamen Besitz befindlichen Lin-Patent, supra.
pBRgHuEPO wurde ebenfalls mit BstEII und BglII verdaut und das 6517 bp Vektor-Fragment wurde wiedergewonnen. Die Ligation von zwei Fragmenten resultierte in IGT1. Um pEC-1, pDSVL (beschrieben in dem im gemeinsamen Besitz befindlichen Lin-Patent, supra, und in der 5B gezeigt) wurde mit BamHI verdaut und das isolierte 2,8 Kilobasen (kb) BamHI-Fragment von IGT1, enthaltend die Erythropoietin cDNA, wurde in dieses ligiert.
Um eine einzelsträngige DNA für die in vitro-Mutagenese zu erzeugen, wurde pEC-1 mit BamHI und BglII verdaut und das 820-Basenpaar Erythropoietin cDNA-Fragment wurde isoliert. Es wurde ligiert in die BamHI-Stelle von m13mpl8, um m13-EC-1 zu erzeugen. Einzelsträngige DNA wurde aus den Überständen des E. coli-Stammes RZ1032, infiziert durch m13-EC-1, wie beschrieben bei Kunkel et al., Methods in Enzymol. 154, 367, 1987, und Messing, Methods in Enzymol. 101, 20, 1983, wiedergewonnen. Für die in vitro-Mutagenese wurde etwa 1 μg der einzelsträngigen DNA und 0,2 pmol von einem der syntetischen Primer, wie vorstehend beschrieben, mit 6 μl Puffer (250 mM Tris, pH 7,8, 50 mM MgCl₂ und 50 mM Dithiothreitol) gemischt. Für das Annealing der Primer an das Template wurde das Reaktionsvolumen auf 10 μl mit Wasser gebracht, und das Gemisch wurde auf 65°C für 5 Minuten erhitzt und danach ließ man es auf Raumtemperatur abkühlen. Für die Verlängerungsreaktion wurden 2,5 μl von jeweils dTTP, dATP, dGTP, dCTP und ATP (jeweils 10 μM) hinzugefügt, gefolgt von 1 μl (1 Einheit) von E. coli-DNA-Polymerase (Klenow-Fragment) und 1 μl (1 Einheit) von T4-DNA-Ligase. Das Gemisch wurde über Nacht bei 14°C inkubiert und verwendet, um E. coli JM 109 (Janisch-Perron et al., Gene 33, 103, 1985), wie beschrieben (Messing, supra), zu transformieren.
Um mutierte Klone durch differentielle Hybridisierung zu identifizieren, wurden Plaques von Nährstoff-Agar auf Gene Screen-Filter (New England Nuclear) transferiert. Die Filter wurden unter einer Hitzelampe getrocknet und danach für 1 Stunde in 6 × SSC, enthaltend 1% SDS, bei 60°C inkubiert. Für die Hybridisierung wurde der vorstehende Oligonucleotid-Primer (8 pmol) endmarkiert mit T4-Polynucleotidkinase und γ ³²P-markiertem ATP und inkubiert mit den Filtern über Nacht in 6 × SSC, 0,5% SDS und 100 mg/ml Lachssperma-DNA bei 37°C für die [Asn¹²⁴] Mutation, und 55°C für die [Asn⁴, Ser⁶] Mutation, 65°C für die [Thr¹²⁵] und die [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] Mutationen und bei 70°C für die [Asn⁹, Ser¹¹] und [Asn¹⁶³, Ser¹⁶⁵]] Mutationen. Am nächsten Tag wurden die Filter dreimal mit 6 × SSC bei Raumtemperatur gewaschen und danach der Autoradiographie unterzogen. Falls notwendig, wurden die Filter danach mit 6 × SSC bei ansteigenden Temperaturen gewaschen, bis wenig oder keine Hybridisierung zu den Plaques mit der Wildtyp-Erythropoietin-cDNA-Sequenz nachgewiesen wurde. Klone, die positive Hybridisierungssignale unter diesen Bedingungen zeigten, wurden identifiziert und wieder in JM 109 transferiert, um einen reinen Klon zu isolieren. Die Didesoxykettenterminationsseqenzanalyse zeigte, daß die Mutationen bei den Asparagin-, Serin-, Threonin- und Prolin-Resten vorhanden waren.
Doppelsträngige m13-EC-1 DNAs, die die [Asn⁴, Ser⁶], [Asn⁹, Ser¹¹], [Asn⁶⁹], [Asn¹²⁴], [Asn¹²⁵], [Ser¹²⁷], [Asn¹⁶³, Ser¹⁶⁵], [Thr¹²⁵] und [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] Wechsel trugen, wurden wiedergewonnen aus JM 109-transfizierten Zellen durch das Kochverfahren (Holmes et al., Anal. Biochem. 117, 193, 1981). Die DNAs wurden mit BstEII und XhoII verdaut und die 810 bp Erythropoietin-DNA-Fragmente wurden isoliert, pEC-1 wurde mit BstEII verdaut, gefolgt von einem partiellen Verdau mit BglII und die 5'-Termini der resultierenden Fragmente wurden dephosphoryliert mit bakterieller alkalischer Phosphatase in 10 mM Tris, pH 8 bei 60°C für 60 Minuten. Das 7 kb Vektor-Fragment, das das 810 bp BstEII-BglII-Fragment nicht aufwies, wurde isoliert und zu den vorstehenden Erythropoietin-Fragmenten ligiert. Die resultierenden Plasmide (bezeichnet pEC-X, wobei X die Analogon-Nummer darstellt) enthalten DNA, die Erythropoietin-Analoga codieren mit veränderten Aminosäureresten an den angegebenen Positionen.
Alternativ wurde ein Analogon von Erythropoietin (pEC34) konstruiert durch an vitro-Mutagenese, bei dem die Aminosäurereste 41–55 deletiert waren. Dieses resultierte in einem klei neren (775 bp) EPO, enthaltend das BstEII-BglII-Fragment. Das Fragment wurde in pEC1, wie vorstehend beschrieben, inseriert. Für die Klonierung der Analoga von Erythropoietin wurde pEC34 mit BstEII verdaut, teilweise verdaut mit BglII, dephosphoryliert und der Vektor, isoliert wie vorstehend beschrieben. Das 7 kb Vektor-Fragment wurde danach zu den Erythropoietin-Fragmenten, wie vorstehend beschrieben, ligiert. Klonierung mit pEC34 erlaubt die einfache Unterscheidung zwischen Rekombinanten und Nicht-Rekombinanten. Nicht-rekombinante resultieren in einem kleineren BstEII-BglII-Fragment als Analoga und können auf Agarosegelen leicht unterschieden werden.
Diese allgemeinen Verfahren wurden verwendet, um Erythropoietin-Analoga, gezeigt in den Tabellen 3, 4 und 5, zu konstruieren. Die DNA-Sequenzwechsel für jedes der Analoga sind gezeigt. Ansonsten haben die Oligonucleotid-Primer, verwendet für die Mutagenese, Sequenzen, die komplementär zu denen von menschlichem Erythropoietin sind.
TABELLE 3 ERYTHROPOIETIN-ANALOGA MIT STELLEN FÜR N-VERKNÜPFTE KOHLENHYDRATKETTEN
TABELLE 3 (fortgesetzt) ERYTHROPOIETIN-ANALOGA MIT STELLEN FÜR N-VERKNÜPFTE KOHLENHYDRATKETTEN
TABELLE 3 (fortgesetzt) ERYTHROPOIETIN-ANALOGA MIT STELLEN FÜR N-VERKNÜPFTE KOHLENHYDRATKETTEN
TABELLE 3 (fortgesetzt) ERYTHROPOIETIN-ANALOGA MIT STELLEN FÜR N-VERKNÜPFTE KOHLENHYDRATKETTEN
TABELLE 4 ERYTHROPOIETIN-ANALOGA MIT STELLEN FÜR O-VERKNÜPFTE KOHLENHYDRATKETTEN
TABELLE 4 (fortgesetzt) ERYTHROPOIETIN-ANALOGA MIT STELLEN FÜR O-VERKNÜPFTE KOHLENHYDRATKETTEN
TABELLE 4 (fortgesetzt) ERYTHROPOIETIN-ANALOGA MIT STELLEN FÜR O-VERKNÜPFTE KOHLENHYDRATKETTEN
TABELLE 5 ERYTHROPOIETIN-ANALOGA MIT STELLEN FÜR N- UND O-VERKNÜPFTE KOHLENHYDRATKETTEN
Die Plasmide, bezeichnet als pDEC-X (wobei X die Analogon-Nummer ist), wurden konstruiert durch Inserierung der Erythropoietin-cDNA in pDECΔ, das ein Derivat des Plasmids pDSα2 ist. Der Expressionsvektor pDSα2 ist allgemein beschrieben in der PCT-Anmeldung WO 90/14363. pDECΔ wurde abgeleitet von pDSα2 durch die folgenden Schritte:

(1) Die HindIII-Stelle von pDSα2 wurde deletiert durch Verdau von pDSα2-DNA mit HindIII, Behandlung der HindIII-kohäsiven Enden mit E. coli-DNA-Polymerase (Klenow-Fragment) und dNTPs und Religierung des Vektors mit glatten Enden. Das resultierende Plasmid war pDSα2ΔH.
(2) pDSα2ΔH wurde verdaut mit SalI und ein synthetisches Oligonucleotid mit einer SV40-Splice-Signalstelle mit einem SalI-Linker, angelagert an das 3'-Ende des Splice-Signals wurde zu diesem ligiert. Die synthetischen Oligonucleotide hatten die folgende Sequenz (SEQ ID NO: 18):
Das resultierende Plasmid war pDSα2ΔH-Splice.
(3) pDSα2ΔH-Splice wurde mit SalI gespalten und glatte Enden wurden erzeugt durch Behandlung der kohäsiven Enden mit T4-DNA-Polymerase und dNTPs. Ein 820 bp BamHI-BglII menschlicheS Erythropoietin-cDNA-Fragment wurde mit glatten Enden durch das gleiche Verfahren erzeugt und in das Plasmid ligiert. Das resultierende Plasmid war pDEC-1.
(4) pDEC wurde mit KpnI und PvuII verdaut und glatte Enden wurden durch Behandlung der kohäsiven Enden mit Sojabohnen-Nuclease erzeugt. Das Plasmid wurde religiert, um das ausgeschnittene KpnI-PvuII-Fragment zu deletieren, resultierend in dem Plasmid pDECΔ.

pDEC-X-Plasmide wurden aus pDECΔ durch vollständigen Verdau mit BstEII, gefolgt durch einen partiellen Verdau mit BglII, hergestellt. Das Vektor-Fragment, das die Erythropoietincodierenden Sequenzen nicht aufweist, wurde isoliert und zu dem 810 bp BstEII-BglII-Fragmenten, enthaltend das gewünschte Plasmid, ligiert.
Details der Konstruktion von einigen Analoga mit multiplen Aminosäuren-Wechseln sind nachstehend beschrieben.
Konstruktion von pDEC (N47) und pDEC (N48)
pDEC (N47), das Asn30 Thr32 Val87 Asn88 und Thr90 Mutationen enthält, wurde aus pDEC (N18) und pDEC (N4) konstruiert. pDEC (N18) wurde verdaut mit HindII und BglII und ein 445 bp Fragment wurde isoliert. pDEC (N4) wurde verdaut mit BstEII und HindIII und ein 377 bp Fragment wurde isoliert. Diese zwei Fragmente wurden in pDECΔ, geschnitten mit BstEII und BglII, wie vorstehend beschrieben, ligiert, und das Plasmid pDEC (N47) entstand.
pDEC (N48), das die Mutationen Asn69 Thr71 Ser87 Asn88 und Thr90 enthält, wurde konstruiert aus pDEC (N14) und pDEC (N11). pDEC (N14) wurde verdaut mit HindII und BglII und ein 445 bp Fragment wurde isoliert. pDEC (N11) wurde verdaut mit BstEII und HindII und ein 377 bp Fragment wurde isoliert. Diese zwei Fragmente wurden in pDECΔ, geschnitten mit BstEII und BglII, wie vorstehend beschrieben, ligiert, resultierend in pDEC (N48).
Konstruktion von pDEC (O62) (HCG-Enrythropoietin-Fusion)
pDEC (O62) wurde zusammengesetzt aus pEC1 und einem 107 Basenpaar StuI-BglII synthetischen DNA-Linker, enthaltend die Carboxy-terminalen 28 Aminosäuren von mensch lichem Chorion-Gonadotropin (Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln) (SEQ ID NO: 25) (Pierce et al., Ann. Rev. Biochem. 50, 465, 1981). Die Sequenz der Linker ist folgendermaßen:
pEC1 wurde verdaut mit StuI und BglII und das 610 bp DNA-Fragment wurde isoliert. Der synthetische Linker wurde phosphoryliert mit ATP und Polynucleotidkinase und wurde ligiert mit dem pEC1-Fragment in pDECΔ, zuvor verdaut mit BstEII und partiell verdaut mit BglII, wie vorstehend beschrieben.
Konstruktion von pDEC (NO1)
pDEC (NO1) wurde zusammengesetzt aus pDEC (O62) (HCG-EPO) und pDEC (N14) (Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰). pDEC177 wurde mit StuI und BglII verdaut und das 610 bp DNA-Fragment, enthaltend die Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ Mutationen, wurde isoliert mit Gene-Clean. pDEC (O62) wurde verdaut mit StuI und BglII und das 107 Basenpaar-Fragment wurde isoliert. Diese zwei DNA-Fragmente wurden ligiert in pDECΔ, zuvor verdaut mit BstEII und partiell verdaut mit BglII, wie vorstehend beschrieben.
Konstruktion von pDEC (NO2)
pDEC (NO2) wurde zusammengesetzt aus pDEC (O62) (HCG-EPO) und pDEC (N47) (Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰). pDEC (N47) wurde verdaut mit StuI und BglII und das 610 Basenpaar DNA-Fragment, enthaltend die Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ Mutationen, wurde isoliert mit GeneClean^TM. pDEC (O62) wurde verdaut mit StuI und BglII und das 107 Basenpaar-Fragment wurde isoliert. Diese zwei DNA-Fragmente wurden ligiert in pDECΔ, zuvor verdaut mit BstEII und partiell verdaut mit BglII, wie vorstehend beschrieben.
Konstruktion von pDEC (N16) (Se⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Ala¹⁶²)
pDEC (N16) wurde zusammengesetzt aus pDEC (N14) (Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰) und pDEC258 (Ala¹⁶²). pDEC258 wurde konstruiert unter Verwendung der Verfahren der in vitro-Mutagenese, wie vorstehend beschrieben, und die Austausche des AGG-Codons zu GCG an Position 162. pDEC (N14) wurde verdaut mit StuI und BglII und das 610 bp DNA-Fragment, enthaltend die Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ Mutationen wurde isoliert mit GeneClean^TM. pDEC258 wurde verdaut mit StuI und BglII und ein 210 Basenpaar-Fragment wurde isoliert. Diese zwei DNA-Fragmente wurden ligiert in pDECΔ, zuvor verdaut mit BstEII und partiell verdaut mit BglII, wie vorstehend beschrieben.
Konstruktion von pDEC (R1), (12) und (R3)
Um die Glycosylierungsstellen aus pDEC (N14), m13-EPO (N14), enthaltend Ser87, Asn88 und Thr90 Mutationen, zu entfernen, wurden diese der in vitro-Mutagenese, wie vorstehend beschrieben, unter Verwendung der folgenden Primer, unterzogen:
Die resultierenden Plasmide wurden bezeichnet als pDEC (R1) (Gln²⁴ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰) pDEC (R2) (Gln³⁸ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰) und pDEC (R3) (Gln⁸³ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰), m13-EC-1 wurde ebenfalls der in vitro-Mutagenese mit den vorstehenden Oligonucleotid-Primern unter zogen, resultierend in pEC10 (Gln²⁴) und pEC8 (Gln³⁸). pEC9 (Gln⁸³) wurde konstruiert unter Verwendung des Primers
cDNA-Klone von menschlichem Erythropoietin und Analoga, korrespondierend zu [Asn⁴, Ser⁶] EPO, [Asn⁹, Ser¹¹] EPO, [Asn⁶⁹] EPO, [Asn¹²⁴] EPO, [Asn¹²⁵, Ser¹²⁷] EPO, [Asn¹⁶³, Ser¹⁶⁵] EPO, [Thr¹²⁵] EPO und [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] EPO und cDNA-Klone von Analoga, beschrieben in den Tabellen 3, 4 und 5, wurden in COS-1-Zellen [ATCC Nr. CRL-1650) durch Elektroporation transferiert. COS-1-Zellen wurden gesammelt aus halb-bedeckten Platten, gewaschen mit Medium (Dulbecco modifiziertes essentielles Medium, enthaltend 5% fötales Kälberserum und 1% L-Glutamin/Penicillin/Streptomycin (Irvine Scientific)) und resuspendiert bei 4 × 10⁶ Zellen/ml. 1 ml der Zellen wurde transferiert in eine Elektroporations-Cuvette (Bio-Rad) und die Elektroporation wurde ausgeführt mit einem Bio-Rad Gene Pulser bei 25 μF und 1600 Volt in Gegenwart von 100 bis 200 μg Carrier-DNA und 2 bis 20 μg Plasmid-DNA, die das Erythropoietin-Analogon codiert. Die elektroporierten Zellen wurden plattiert auf 2 × 10⁶ Zellen pro 60 mm Gewebekulturplatten in 5 ml Medium. Zwei bis vier Stunden nach dem Ausplattieren wurde das Medium ersetzt durch 5 ml frisches Medium. Das konditionierte Medium wurde gesammelt 3 bis 5 Tage nach der Elektroporation.
Beispiel 7: Charaktersierung von Erythropoietin-Analoga
A. Bestimmung der Kohlenhydrat-Hinzufügung
Ein Volumen des Überstandes, enthaltend 5–20 Einheiten von COS-Zellen, transfiziert mit Erythropoietin-Analoga cDNAs, wie vorstehend in Beispiel 6 beschrieben, wurde immunpräzipitiert über Nacht bei Raumtemperatur mit einem Kaninchen-anti-Erythropoietin-polyklonalen-Antikörper. 20–80 μl von 1 : 1 Protein-A-Sepharose in Phosphat-gepufferter Saline (PBS) wurde zu dem Immunpräzipitat hinzugefügt und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proben wurden zentrifugiert, gewaschen mit PBS und, wo angezeigt, wurde das Pellet mit N-Glycanase behandelt, um die N-verknüpften Kohlenhydratketten zu entfer nen. Die Proben wurden analysiert durch eine 15% SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, transferiert auf Nitrozellulose und einer Western-Blot-Analyse, wie beschrieben (Burnette et al., Anal. Biochem. 112, 195–203, 1981); Elliott et al., Gene 79, 167–180, 1989) unter Verwendung eines Gemisches von Maus-anti-Erythropoietin-monoklonalen-Antikörpern, unterzogen. Einer dieser Antikörper, 9G8A, ist beschrieben bei Elliott et al., 1989, Blood 74, Supp. 1, A. 1228.
Die Analyse von COS-Zellüberständen, transfiziert mit [Asn⁶⁹] EPO und [Asn¹²⁵, Ser¹²⁷] EPO cDNA, zeigte gesteigerte Proteingrößen verglichen zu Erythropoietin, der menschlichen Sequenz. Diese gesteigerte Größe zeigt eine zusätzliche N-verknüpfte Kohlenhydratkette (7) an. Die Behandlung der Überstände von COS-Zellen, transfiziert mit [Thr¹²⁵] EPO und [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] EPO cDNA mit N-Glycanase, zeigte eine gesteigerte Proteingröße verglichen mit dem Erythropoietin, der menschlichen Sequenz an. Diese gesteigerte Größe zeigt eine zusätzliche O-verknüpfte Kohlenhydratkette (8). Die Western-Blot-Analyse von anderen ausgewählten Analoga ist in 10 gezeigt.
Um die Anzahl der N-verknüpften Kohlenhydratketten, angelagert an EPO, zu bestimmen, wurden Teil-N-Glycanase-Abbaue durchgeführt. Analoga oder rHuEPO wurden exprimiert in CHO-Zellen und konditioniertes Serum-freies Medium wurde gesammelt. Die Röhrchen enthielten 40 Einheiten von EPO (Volumen eingestellt auf 15 μl mit H₂O). Zu jedem Röhrchen wurden 10 μl 0,5% SDS hinzugefügt und jede Probe wurde für 3 Minuten erhitzt. Danach wurden die folgenden Komponenten hinzugefügt, 10,8 μl 0,5 M NaPO₄, pH 8,6, 5 μl 7,5% nonidet P40 und 1,5 μl N-Glycanase (Genzyme) 250 Einheiten/ml. Die Proben wurden für die angegebenen Zeiten bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch das Hinzufügen von SDS-PAGE-Probenpuffer (siehe vorstehend) gestoppt und danach wurden die Proben der SDS-PAGE-Western-Blot-Analyse (10% Acrylamid) unter Verwendung eines anti-EPO-polyklonalen Antikörpers und eines anti-Kaninchen-Vectastain^TM-Kits (Vector Laboratories) mit 4-Chlornaphthol als Substrat unterzogen. Eine Analyse der N-verknüpften Ketten unter Verwendung dieses Verfahrens ist in 11 für menschliches Erythropoietin und Analogon N14 gezeigt.
B. Assays auf Erythropoietin-Analogon-Aktivität
RIAs wurden gemäß Egrie et al., supra, ausgeführt. EIAs wurden durchgeführt mit CLINIGEN^TM EIA-Kit (R- und D-Systems) nach den Angaben des Herstellers. Die in vivo-biologische Aktivität von Erythropoietin-Analoga wurde bestimmt aus Überständen von CHO-Zellen, die ein Erythropoietin-Analogon exprimieren oder von gereinigtem Erythropoietin, erhalten aus CHO-Zell-konditioniertem Medium, wie nachstehend beschrieben unter Verwendung des exhypoxischen polycythämischen Maus-Bioassay (Cotes et al., supra).
In vitro-Erythropoietin-Aktivität wurde bestimmt durch den Erythroid-Koloniebildungs-Assay, beschrieben bei Iscove et al., J. Cell. Physiol. 83, 309–320, 1974, mit Modifikationen. Die mononuclearen Zellen aus menschlichen Knochenmarkszellen wurden teilweise gereinigt auf einem Ficoll-paque-Kissen und in Iscove-Medium gereinigt, vor dem Ausplattieren, um die adhärenten Zellen zu entfernen. Das Kulturmedium enthielt 0,9% Methylzellulose und enthielt kein Rinderserumalbumin. Die Erythroid-Kolonien wurden nach 8 bis 10 Tagen der Kultur gezählt.
Die Erythropoietin-Analoga, transfiziert und exprimiert in COS-Zellen, wie in Beispiel 6 beschrieben und analysiert in rohen COS-Zellüberständen unter Verwendung von RIA, EIA und einem Erythroid-Koloniebildungs-Assay. Gereinigtes Erythropoietin der menschlichen Sequenz hat eine in vitro-Aktivität, die vergleichbar war zu der RIA-Aktivität, wie bestimmt durch die zuvor genannten Tests. Analoga [Asn⁶⁹] EPO, [Thr¹²⁵] EPO und [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] EPO zeigten eine in vitro-Aktivität, die vergleichbar war zu der RIA-Aktivität und zeigten auf, daß sie zusätzliche Kohlenhydratketten (wie bestimmt in Abschnitt A) hatten. [Thr¹²⁵] EPO und die Analoga N4, N11, N14, N16, N18, N47, N48, O62, NO1 und NO2 wurden weiter analysiert durch Transfizieren eines cDNA-Klons, der Erythropoietin-Analoga codiert in CHO-Zellen und die CHO-Zellüberstände wurden RIA oder EIA und an vivo-biologischen Assays unterzogen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. In vivo-Aktivitäten für die Analoga R1, R2 und R3, exprimiert in CHO-Zellüberständen, sind in Tabelle 7 gezeigt.
TABELLE 6 ERYTHROPOIETIN-ANALOGA MIT ZUSÄTZLICHEN KOHLENHYDRATKETTEN
TABELLE 6 Fußnoten

^a Die Anzahl von zusätzlichen N-verknüpften Ketten wurde bestimmt basierend auf der Mobilität der Analoga-Polypeptide in SDS-Gelen, wie beschrieben in Beispiel 7A.
^b Das Verhältnis der in vivo-Aktivität des Analogons zu Menge des Erythropoietin-Analogons. Die Aktivitätsmessungen wurden durchgeführt mit CHO-Zellüberständen der Analoga unter Verwendung des polycythämischen Maus-Bioassays. Die Mengen von Erythropoietin-Analoga in CHO-Zellüberständen wurden bestimmt durch RIA oder EIA, wie im Text beschrieben.
^c Die Bestätigung der Anzahl der zusätzlichen Kohlenhydratketten wurde durchgeführt durch Bestimmung der Glycoproteinwanderung in SDS-Gelen nach teilweisem N-Glycanase-Abbau, wie in Beispiel 7A bestimmt.
^d O-verknüpfte Kette bei Ser¹²⁶ ist vorhanden bei 70% der menschlichen Erythropoietin-Moleküle.
^e Analoga mit reduzierter O-Glycosylierung haben eine Kohlenhydratkette bei Ser¹²⁶ bei weniger als 70% der Moleküle.
^f Thr¹²³ EPO hat zwei O-verknüpfte Ketten an mehr als 60% der Moleküle. Thr¹²⁵ EPO hat zwei O-verknüpfte Ketten an etwa 40% der Moleküle. Pro¹²⁴Thr¹²⁵ EPO hat zwei O-verknüpfte Ketten an mehr als 80% der Moleküle.
^g Diese Analoga haben mindestens drei O-verknüpfte Ketten und können vier oder fünf haben. HCG alleine ist bekannt, vier O-verknüpfte Ketten zu haben.
n. b.: nicht bestimmt

TABELLE 7 AKTIVITÄT VON MENSCHLICHEM ERYTHROPOIETIN UND ANALOGA MIT REARRANGEMENTS DER KOHLENHYDRAT-BINDUNGSSTELLE
Verhältnis der in vivo-Aktivität zu RIA oder EIA wurde bestimmt, wie in der Fußnote a der Tabelle 6 beschrieben.
C. Herstellung von Isoform-Gemischen, abgeleitet von Erythropoietin-Analoga
[Thr¹²⁵] EPO (EPO O50)
Das Erythropoietin-Analogon [Thr¹²⁵] EPO wurde konstruiert wie beschrieben in Abschnitt A des Beispiels 6. Ein 810 pb Erythropoietin-cDNA-Fragment, das die Mutation [Thr¹²⁵] trug, wurde isoliert durch Spalten des Plasmids pEC, das die [Thr¹²⁵] Mutation enthielt, mit BstEII und BglII und Ligation des Fragments mit pDECΔ [ein Derivat von pDSα2] (beschrieben in Beispiel 6).
Plasmid pDECΔ, enthaltend [Thr¹²⁵] Erythropoietin-cDNA, wurde transfiziert in DHFR-defiziente CHO-Zellen. 770 ml von CHO-Zell-konditioniertem Medium wurde konzentriert unter Verwendung einer 10.000 Dalton Molekulargewichts-Ausschluß-Membran und diafiltriert gegen 10 mM Tris-HCl, pH 8,7 zu einem Endvolumen von 34 ml. Ein 17 ml Aliquot des Konzentrats wurde auf einer Q-Sepharose (Schnellfließsäule) (5 ml Bett-Volumen), equilibriert in dem gleichen Puffer und eluiert in einem linearen Gradienten von 0–250 mM NaCl in 10 mM Tris-HCl, pH 8,6, geladen. Aliquots der Säulenfraktionen, entweder unbehandelt oder verdaut mit N-Glycanase, wurden analysiert durch SDS-PAGE oder IEF und Pools (bezeichnet als 2, 3 und 4) wurden hergestellt, basierend auf der Isoform und/oder Kohlenhydratzusammensetzung der Fraktionen. Jeder Pool wurde auf eine Vydac-C4-Säule (214TPB 2030; 1 cm Durchmesser, 1,8–2,5 ml Bett-Volumen; 0,34 ml/Minute) geladen und mit 2 Säulen-Volumen von 20% Ethanol in 10 mM Tris-HCl, pH 7,0 gewaschen. Die Säulen wurden mit einem linearen Gradienten von 20–94% Ethanol, 10 mM Tris, pH 7,0 eluiert. Die Pools wurden hergestellt, verdünnt in 10 mM Tris-HCl, pH 7,0 und auf eine Q-Sepharose (Schnellfließ-Säule) geladen. Nach einem Waschschritt mit 10 mM Tris-HCl, pH 7,0 wurden die Proben mit 20 mM Natriumcitrat, 250 mM NaCl, pH 7,0 eluiert. Die gereinigten [Thr¹²⁵] Pools wurden durch IEF analysiert und sind in 9 gezeigt. Diese Pools wurden ebenfalls auf die in vivo-biologische Aktivität wie vorstehend beschrieben analysiert (Cotes et al., supra) und die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt.
Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ EPO (EPO N14)
Präparation 1
Das EPO N14-Analogon wurde gereinigt unter Verwendung eines Dreischrittverfahrens, bestehend aus einer Ionenaustauschchromatographie, Umkehrphasenchromatographie und Gelfiltrationschromatographie. Während des Ionenaustauschschrittes wurden die Fraktionen vereinigt, um ein Gemisch von Isoformen mit hohen Gehalten von Sialinsäure zu erhalten. Zwei zusätzliche Pools wurden hergestellt während der Umkehrphasenchromatographie, enthaltend die Analoga mit oder ohne Aggregate. Die Details der Reinigung sind nachstehend beschrieben.

1. Konditioniertes Medium aus CHO-Zellen, die das Analogon EPO N14 exprimieren, wurde gesammelt und etwa 2,5fach konzentriert unter Verwendung einer Rührzelle mit einer YM10-Membran (Amicon) und diafiltriert gegen 10 mM Tris, pH 8,5.
2. Das konzentrierte Medium wurde bei ~12 A₂₈₀/ml Harz auf eine Q-Sepharose-FF(Pharmacia)-Säule, equilibriert mit 10 mM Tris, pH 8,5 bei einer Fließrate von 0,2 cm/Minute, aufgetragen.
3. Nach der Ladung wurde die Säule mit 3 Säulenvolumen (CV) von 10 mM Tris, pH 8,5 gewaschen und mit einem Gradienten von 0–0,5 M NaCl/10 mM Tris, pH 8,5 in 50 CV eluiert. 1 CV-Fraktionen wurden gesammelt.
4. Eine Probe von jeder Fraktion wurde auf einem IEF-Gel, pH 3–5, aufgetragen. Basierend auf der Isoform-Verteilung auf IEF wurde eine Fraktionsvereinigung, enthaltend große Isoformen 11–18, hergestellt. EDTA wurde zu dem Pool zu einer Endkonzentration von 1 mM hinzugefügt.
5. Der Isoform-Pool wurde bei ~5 A₂₈₀/ml Harz auf eine Umkehrphasen-C4-Säule (Vydac), equilibriert in 20% Ethanol/10 mM Tris, pH 7,0 bei einer Fließrate von 2,5 cm/Minute, aufgetragen. Die Säule wurde gewaschen mit 1 CV von 20% Ethanol/10 mM Tris, pH 7,0 und eluiert mit einem Gradienten von 20–94% Ethanol/10 mM Tris, pH 7,0 in 30 CV bei einer Fließrate von 1 cm/Minute. 0,2 CV-Fraktionen wurden gesammelt.
6. Eine Probe von jeder Fraktion wurde analysiert durch eine nicht-reduzierende 12%ige SDS-PAGE. Zwei separate Pools wurden hergestellt, basierend auf dem Vorhandensein von Aggregaten, beobachtet auf SDS-Gelen. Pool #1 enthielt EPO-Analogon, aber kein Aggregat. Pool #2 enthielt sowohl EPO-Analogon und Aggregat.
7. Pool #1 wurde konzentriert etwa 65fach und Pool #2 wurde etwa 250fach konzentriert unter Verwendung von Centricon 10's (Amicon). Jeder Pool wurde puffergetauscht in 20 mM Natriumcitrat/100 mM NaCl, pH 7,0.
8. Jeder Pool wurde individuell gereinigt auf einer HPLC-BioSil SEC-250 (BioRad)-Säule, equilibriert mit 20 mM Natriumcitrat/100 mM NaCl, pH 7,0. Die Pools wurden bei < 6 A₂₈₀/ml Harz bei einer Fließrate von 2,26 cm/Minute geladen. Die Peaks, die den monomeren Analoga entsprechen, wurden von jedem Lauf gesammelt.
9. Die Absorption von jedem Pool wurde gemessen und ein Teil jedes Pools wurde für die Analyse durch SDS-PAGE und IEF-Gele konzentriert. Pool #1 hatte eine Verteilung der Isoformen 15–17 und wurde für pharmakokinetische und Rezeptorbindungsstudien verwendet.

Präparation 2
EPO N14-Analogon wurde gereinigt unter Verwendung eines Dreischrittverfahrens, bestehend aus Ionenaustauscherchromatographie, Umkehrphasen-HPLC und Hydroxylapatitchromatographie. Während des Ionenaustauscherschrittes wurde das Analogon in 3 Pools, enthaltend verschiedene Gemische der Isoformen, aufgeteilt. Die Details der Reinigung sind nachstehend beschrieben.

1. Überstand aus CHO-Zellen, exprimierend EPO N14, wurde gesammelt und etwa 10fach unter Verwendung einer Filtron Mini-Ultrasette konzentriert und gegen 10 mM Tris, pH 8,5 diafiltriert.
2. Das konzentrierte Medium wurde bei ~10 A₂₈₀/ml Harz auf Q-Sepharose FF(Pharmacia)-Säule, equilibriert mit 10 mM Tris, pH 8,5 bei einer Fließrate von 0,2 cm/Minute, geladen.
3. Nach der Ladung wurde die Säule mit 3 Säulenvolumen (CV) von 10 mM Tris, pH 8,5 gewaschen und mit einem Gradienten von 0–0,5 M NaCl/10 mM Tris, pH 8,5 in 50 CV eluiert. 1 CV-Fraktionen wurden gesammelt.
4. Eine Probe von jeder Fraktion wurde auf einem IEF-Gel, pH 3–5, aufgetragen. Drei separate Fraktions-Pools wurden hergestellt, basierend auf der Isoform-Verteilung wie bestimmt durch IEF. Ein niedriger Isoform-Pool (Isoformen 4–12), ein mittlerer Isoform-Pool (Isoform 5–15) und ein großer Isoform-Pool (Isoform 6–18) wurde hergestellt.
5. Jeder Isoform-Pool wurde individuell gereinigt auf einer Vydac-C4-Umkehrphasen HPLC-Säule. Die Säule wurde entwickelt mit einem Gradienten aus 0,1% TFA/H₂O bis 0,1% TFA/75% Acetonitril bei einer Rate von 1% Anstieg in Acetonitril pro Minute.
6. Der Analogon-Peak von jedem Pool wurde gesammelt und mit 4 Volumen 80 mM Tris HCl/20 mM Tris-Base verdünnt, danach konzentriert und puffergetauscht mit 10 mM Tris pH 7,2 unter Verwendung von lösungsmittelresistenten Centricon 3's.
7. Jede Probe wurde verdünnt auf 2 A₂₈₀/ml in 10 mM Tris, pH 7,2 und ein gleiche Volumen von 4 M Guanidin/HCl (GuHCl), 10 mM Chaps, 10 mM Tris, pH 7,2 wurden einer End-Proben-Konzentration von 1 A₂₈₀/ml hinzugefügt. Jede Probe wurde auf ein Hydroxylapatit-Mini-Säule, equilibriert mit 2 M GuHCl, 5 mM Chaps, 10 mM Tris, pH 7, geladen. Die Säule wurde mit Equilibrierungspuffer gewaschen und 1 CV-Fraktion de Durchflusses wurde gesammelt.
8. Die Absorption der Fraktionen wurde gemessen und die Pools wurden hergestellt und puffergetauscht mit 10 mM Tris, pH 7,2 unter Verwendung von Centricon 10's. Die Absorption von jedem Pool wurde gemessen.

Die End-Pools wurden durch SDS-PAGE- und IEF-Gele analysiert. Die IEF-Gele sind in 12 gezeigt. Die RIA- und die an vivo-Aktivitätsassays wurden durchgeführt, wie in Beispiel 7A beschrieben. Die in vivo-Aktivität der End-Isoform-Pools ist in Tabelle 8 beschrieben. Der Isoform-Pool mit hoher Sialinsäure wurde in Experimenten zur Bestimmung des Anstiegs des Hämatokrits von Mäusen verwendet.
TABELLE 8 AKTIVITÄT DER ISOFORMEN VON ERYTHROPOIETIN-ANALOGA
Beispiel 8: Biologische Eigenschaften von EPO N14-Analogon
Die Aktivitäten des Isoform-Pools von EPO N14-Analogon, rekombinantem menschlichen Erythropoietin (rHuEPO) und isoliertem rHuEPO Isoform 14 wurde verglichen in i. v. pharmakokinetischen Assays, Rezeptorbindungsassays und Hämatokrit-Studien. EPO N14-Isoform-Pools wurden hergestellt wie in Beispiel 7C beschrieben. rHuEPO wurde hergestellt gemäß Lai et al., supra. rHuEPO Isoform 14 wurde gereinigt wie folgt: rHuEPO, bestehend aus einem Gemisch der Isoformen 10, 11, 12, 13, 14 und 15 wurde auf eine Q-Sepharose Fastflow-Säule (Dimensionen = 2,2 cm Durchmesser × 3,4 cm Höhe), equilibriert in 10 mM Tris, pH 7,2, aufgetragen. Die geladene Säule wurde equilibriert mit 2 mM Essigsäure/6 M Harnstoff ("A"-Puffer), danach wurde ein Multiphasengradient durchgeführt, um die Reinigung der Isoformen 13 und 14 zu optimieren. Der Gradient war 0% bis 7,3% 800 mM Essigsäure/6 M Harnstoff ("B"-Puffer) in 750 ml, 7,3% bis 11,4% "B"-Puffer in 750 ml, 11,4% bis 26,8% "B"-Puffer in 1250 ml, 26,8% bis 62,4% "B"-Puffer in 1250 ml, danach 62,4% bis 100% "B"-Puffer in 700 ml. Die Fraktionen von 12,5 ml wurden gesammelt, neutralisiert mit Ammoniumhydroxid, danach durch isoelektrische Fokussierung in Polyacrylamidgelen untersucht. Solche Fraktionen, die reine Isoform 14 enthielten, wurden vereinigt, konzentriert mit einer Amicon-Rührzelle, ausgestattet mit einer YM-10 Membran, und danach puffergetauscht mit Wasser.
A. IV Pharmakokinetik
Zwei separate Studien wurden durchgeführt, um die pharmakokinetischen Parameter des EPO N14-Analogons (Isoformen 15–17) und der isolierten Isoform 14 mit rHuEPO zu vergleichen.
In jeder Studie wurde 1 μCi von entweder ¹²⁵I-isolierter Isoform 14, ¹²⁵I-EPO N14-Analogon oder ¹²⁵I-rekombinantem menschlichen Erythropoietin (Amersham) intravenös in eine Halsschlagader-Kanüle in männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht zwischen 310–378 g, injiziert. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Verabreichung wurden 0,3 ml Blut gesammelt und Serum wurde durch Zentrifugation hergestellt. Das ¹²⁵I-EPO (entweder rekombinantes menschliches, isolierte Isoform 14 oder EPO N14-Analogon) Konzentration in 0,1 ml von jeder Serumprobe wurde danach bestimmt, gefolgt von einer über Nacht-Inkubation bei 4°C mit 90% Ethanol. Das Ethanol-präzipitierte ¹²⁵I-EPO in jeder Serumprobe wurde in einem Gamma-Zähler gezählt und die resultierenden pharmakokinetischen Kurven sind in 13 gezeigt. Die pharmakokinetischen Parameter wurden bestimmt für jede Ratte unter Verwendung des PCNONLIN 4.0 (nicht-lineare Regressionsanalyse; Statistical Consultants, 1992) und die Ergebnisse für jede Gruppe wurden gemittelt. Die Ergebnisse der pharmakokinetischen Studien für EPO N14-Analoga und der isolierten Isoform 14 sind in Tabelle 9 zusammengefaßt.
Wie in Tabelle 9 gezeigt, gibt es einen signifikanten Unterschied in der Serum-Clearance von EPO N14-Analoga, wenn verglichen mit dem kalkulierten Wert für rekombinantes menschliches Erythropoietin. Das rekombinante menschliche Erythropoietin zeigte die schnellste beta-Halbwertszeit von 3,10 Stunden verglichen mit 3,97 Stunden für die isolierten Isoformen 14 und 4,36 Stunden für das EPO N14-Analogon. Die rekombinante menschliche Erythropoietin-Gruppe hatte ebenfalls die schnellste Clearance Halbwertszeit von 1,78 Stunden verglichen zu 2,40 Stunden für die isolierte Isoform 14 und 3,03 Stunden für das EPO N14-Analogon.
B. Rezeptorbindungs-Assays
Die Interaktion von EPO N14-Analoga (Isoformen 15–17) mit dem Erythropoietin-Rezeptor wurden untersucht durch einen kalten Verdrängungs-Assay unter Verwendung von menschlichen erythroleukämischen OCIM1-Zellen (Papayannopoulou et al., Blood 64 (Supplement 1), 116a, 1984). Ansteigende Konzentrationen von unmarkiertem EPO N14 wurden mit OCIM1-Zellen zusammen mit einer konstanten Konzentration von ¹²⁵I-rHuEPO inkubiert, um die Menge von EPO N14 zu bestimmen, die erforderlich ist, um mit ¹²⁵I-rHuEPO bezüglich der Bindung an den Rezeptor zu konkurieren mit ¹²⁵I-rHuEPO verglichen mit einer konstanten Konzentration von ¹²⁵I-rHuEPO.
Unmarkiertes EPO N14 wurde verdünnt in Assay-Puffer und hinzugefügt in Mengen von 0,03 ng, 0,1 ng, 0,3 ng, 1,0 ng, 3,0 ng, 10,0 ng und 30,0 ng (basierend auf der Peptidmasse). 0,5 ng von ¹²⁵I-rekombinantem menschlichen EPO wurden zu Assay-Röhrchen hinzugefügt, gefolgt von der Zugabe von etwa 0,5 × 10⁶ OCIM1-Zellen. Die Assay-Röhrchen wurden danach bei 37°C in einem Schüttel-Wasserbad für 2 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Lösungen durch eine Dibutylphthalat/Biphthalat-Öllösung zentrifugiert, um ungebundenes ¹²⁵I-rHuEPO von ¹²⁵I-rHuEPO, gebunden an OCIM1-Zellen, zu trennen. Zellpellets wurden isoliert und die Menge von ¹²⁵I-rHuEPO, gebunden an die Zellen, wurde durch Gamma-Zählung bestimmt. Die spezifisch an die Zellen gebundenen Mengen wurden kalkuliert und die Konzentration von unmarkiertem Protein, erforderlich, um 50% der ¹²⁵I-rHuEPO-Bindung bei der Abwesenheit des Kompetitors zu verdrängen, wurden durch lineare Regressionsanalyse bestimmt.
Die Ergebnisse der drei Assays zeigten, daß ein Durchschnitt von 2,67 ± 0,73 ng von unmarkiertem EPO N14-Peptid erforderlich war, um die ¹²⁵I-rHuEPO-Bindung an OCIM1-Zellen um 50% zu reduzieren. In den gleichen drei Assays wurde ein Durchschnitt von 0,51 ± 0,15 ng von unmarkiertem rHuEPO benötigt, um mit der Bindung von 0,5 ng ¹²⁵I-rHuEPO zu konkurrieren. Basierend auf diesen Ergebnissen war ein 5,25facher Überschuß von EPO N14 erforderlich, um die Bindung von ¹²⁵I-rHuEPO an den EPO-Rezeptor, verglichen mit unmarkiertem rHuEPO (p < 0,01) zu verdrängen.
Ein zusätzliches Experiment wurde durchgeführt, um einen direkten Vergleich zwischen EPO N14-Analogon, der isolierten Isoform 14 und rekombinantem Erythropoietin für die Bindung an den Erythropoietin-Rezeptor zu machen. Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen, daß EPO N14-Analogon eine niedrigere Affinität für den Rezeptor hat als die isolierte Isoform 14. Ein etwa 2facher Überschuß von EPO N14-Analogon war erforderlich, um die Bindung von ¹²⁵I-rHuEPO an den Rezeptor verglichen mit der unmarkierten Isoform 14 (14) zu verdrängen.
C. Hämatokrit-Studie
Eine an vivo-Studie wurde durchgeführt, um die Fähigkeit von EPO N14 großen und niedrigen Isoform-Pools (aus der Präparation 2, beschrieben in Beispiel 7C), der isolierten Isoform 14 und rekombinantem menschlichen EPO zu vergleichen hinsichtlich des Anstiegs des Hämatokrits von behandelten Mäusen. Die Isoform-Verteilung von EPO N14 hohen und niedrigen Isoform-Pools, verwendet in dieser Studie, ist in 12 gezeigt.
CD1-Mäuse (etwa 30 g) wurden intraperitoneal dreimal pro Woche für insgesamt 6 Wochen mit einer der vorstehenden Präparationen hergestellt in 0,25% Mausserumalbumin oder mit Placebo (PBS mit 0,25% Mausserumalbumin) injiziert. Die Dosierung der Erythropoietin-Präparationen basiert auf der Peptidmasse, so daß eine 30 g Maus entweder 0,071 μg einer Peptid-Dosierung von EPO N14 hoher Pool, EPO N14 niedriger Pool, Isoform 14 oder r-HuEPO-Standard erhält. Eine zusätzliche Dosierungsgruppe von 0,036 μg Peptid-Dosierung wurde für EPO N14 hoher Pool und Isoform 14 durchgeführt. Die Hämatokrits für alle Mäuse wurden bestimmt am Anfang und zweimal wöchentlich danach durch retroorbitale Blutabnahmen. Am Abschluß des Experiments wurde Serum von allen Tieren gesammelt und bezüglich der Antikörper für das injizierte Produkt untersucht. Daten von Tieren, die negativ für neutralisierende Antikörper waren, wurden für die nachfolgende Analyse verwendet.
Wie in 15 gezeigt, zeigten Tiere, behandelt mit dem EPO N14 hohen Isoform-Pool die höchsten Gruppen Durchschnitts-Hämatokrit-Werte, verglichen mit den anderen Präparatio nen. Isoform 14, rekombinantes menschliches EPO und das EPO N14 niedriger Isoform-Pool führten zu einem niedrigeren Anstieg des Hämatokrits.
Um die verschiedenen Erythropoietin-Präparationen quantitativ zu vergleichen, wurde die durchschnittliche anfängliche Rate des Hämatokrit-Anstiegs (0–11 Tage), die Fläche unter der Kurve (0–39 Tage) und der Gesamthämatokrit-Anstieg kalkuliert (Tabelle 10). Bei allen diesen Kriterien erschien der EPO N14 hohe Isoform-Pool stärker aktiv auf einer Peptidmassenbasis als die anderen getesteten Präparationen. Sowohl der EPO N14 hohe Isoform-Pool als auch Isoform 14 war stärker aktiv als rekombinantes menschliches EPO. Das EPO N14 niedriger Pool hatte die niedrigste Aktivität, wenn irgendeine der Analysen zu Vergleichszwecken verwendet wird.
TABELLE 10 EFFEKT VON EPO N14 (HOHE UND NIEDRIGE ISOFORM-POOLS), ISOFORM 14 UND rHuEPO AUF DEN HÄMATOKRIT DER MAUS
Obgleich die Erfindung beschrieben ist in den bevorzugten Ausführungsformen, ist diese nicht auf die beschriebenen Ausführungsformen beschränkt. Umfaßt werden verschiedene Modifikationen und Äquivalente.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein Analogon von menschlichem Erythropoietin mit mindestens einer zusätzlichen Stelle für die N-Glycosylierung an einem Asparaginrest an irgendeiner der Aminosäurepositionen 30, 51, 57, 88, 89, 136, 138 und wobei mindestens eine zusätzlich N-verknüpfte Kohlenhydratkette verknüpft ist an irgendeiner dieser Aminosäurepositionen.
Das Analogon nach Anspruch 1, das das Produkt der Expression einer exogenen DNA-Sequenz ist.
Ein Analogon von menschlichem Erythropoietin, nämlich: Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ EPO.
Ein Analogon von menschlichem Erythropoietin, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Asn³⁰Thr³² EPO; Asn⁵¹Thr⁵³ EPO; Asn⁵⁷Thr⁵⁹ EPO; Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ EPO; Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ EPO; Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Thr⁹⁰ EPO; Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Thr⁹² EPO; Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Ala¹⁶² EPO; Asn⁶⁹Thr⁷¹Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ EPO; Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹ EPO; Ser⁸⁷Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹ EPO; Asn¹³⁶Thr¹³⁸ EPO; und Asn¹³⁸Thr¹⁴⁰ EPO.
Ein Analogon von menschlichem Erythropoietin, umfassend eine Verlängerung von einer oder mehreren Aminosäuren an dem Carboxyterminus von Erythropoietin, wobei die Verlängerung mindestens eine Glycosylierungsstelle einschließt.
Das Analogon gemäß Anspruch 5, wobei die Verlängerung ein Peptidfragment umfaßt, abgeleitet von dem Carboxyterminus von menschlichem Choriongonadotropin.
Das Analogon gemäß Anspruch 6, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) menschlichem Erythropoietin, das die Aminsosäuresequenz Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln hat, die den Carboxyterminus verlängern; (b) dem Analogon gemäß (a), ferner umfassend Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ EPO; und (c) dem Analogon in (a), ferner umfassend Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ EPO.
Ein Analogon von menschlichem Erythropoietin, umfassend eine Deletion von einer oder mehreren Glycosylierungsstellen in menschlichem Erythropoietin und eine Addition von einer gleichen Anzahl von nicht natürlich vorkommenden Glycosylierungsstellen, wobei die Positionen von Kohlenhydratketten verändert sind.
Das Analogon gemäß Anspruch 8, wobei die nicht natürlich vorkommende Glycosylierungsstelle eine N-verknüpfte Kohlenhydratstelle an der Aminosäureposition 88 des menschlichen Erythropoietins ist.
Das Analogon gemäß Anspruch 9, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Gln²⁴Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ EPO; Gln³⁸Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ EPO; und Gln⁸³Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ EPO.
Ein Analogon von menschlichem Erythropoietin, das eine zusätzliche Stelle für die O-Glycosylierung an der Aminosäureposition 123 hat und wobei eine zusätzliche O-verknüpfte Kohlenhydratkette verknüpft ist an dieser Aminosäureposition.
Eine DNA-Sequenz, die ein Analogon von menschlichem Erythropoietin gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 codiert.
Eine eukaryotische Wirtszelle, transfiziert mit einer DNA-Sequenz gemäß Anspruch 12 in einer Art und Weise, die der Wirtszelle erlaubt, ein Analogon von menschlichem Erythropoietin zu exprimieren.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge eines Erythropoietin-Analogons gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel, Hilfsstoff oder Träger.