DE69724241T2

DE69724241T2 - Gdnf-rezeptor und dessen verwendung

Info

Publication number: DE69724241T2
Application number: DE69724241T
Authority: DE
Inventors: D. Robert KLEIN; W. Mark MOORE; Arnon Rosenthal; M. Anne RYAN
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1996-03-14
Filing date: 1997-03-13
Publication date: 2004-06-09
Anticipated expiration: 2017-03-14
Also published as: EP0888385B1; ES2206695T3; WO1997033912A3; US20100313283A1; EP0888385A2; WO1997033912A2; US7105484B2; AU719482B2; IL125839A0; AU2217297A; DK0888385T3; CA2246768A1; US20030022284A1; US20060142196A1; JP4301347B2; US7691606B2; JP2000511402A; DE69724241D1; US6504007B1; PT888385E

Description

Diese Anmeldung bezieht sich auf und beansprucht die Vorteile gemäß 35 U.S.C. §120 der ebenfalls anhängigen US-Seriennr. 08/615.902, eingereicht am 14. März 1996, und 08/618.236, eingereicht am 14. März 1996, deren vollständige Offenbarungen hierin durch Verweis aufgenommen sind.
Einführung Technisches Gebiet
Die vorliegenden Erfindung betrifft neue Verwendungen des von Gliazellen hergeleiteten neurotrophen Faktors („GDNF") und seines GDNFRα genannten Rezeptors und stellt für GDNFRα kodierende Nucleinsäure- und Aminosäuresequenzen bereit. Insbesondere betrifft die Erfindung Nativsequenz-GDNFRα, GDNFRα-Varianten, lösliche GDNFRα-Varianten, einschließlich extrazelluläre GDNFRα-Domäne, chimäres GDNFRα sowie Antikörper, die an das GDNFRα binden (einschließlich agonistische und neutralisierende Antikörper), sowie verschiedene Verwendungen für diese Moleküle. Sie betrifft ferner Testsysteme zum Detektieren von GDNFRα-Liganden, Systeme zum Untersuchen der physiologischen Rolle von GDNF, Diagnosetechniken zum Identifizieren GDNF-bezogener Leiden, Verfahren zum Identifizieren von zu GDNFRα homologen Molekülen und therapeutische Techniken zur Behandlung von Leiden, die mit GDNF und GDNFRα in Verbindung stehen, insbesondere Nierenerkrankungen.
Hintergrund
Erkrankungen des Nervensystems sind für gewöhnlich verheerend und führen häufig zum Tod. Neurologische Erkrankungen sind häufig chronisch, was eine große soziale und finanzielle Last auferlegt. Beispielsweise ist Hirnschlag nach Herzerkrankung und Krebs die dritte Haupttodesursache in den Vereinigten Staaten. Neurotrophe Faktoren, die natürlich auftretende Proteine sind, wie z. B. Insulin-artige Wachstumsfaktoren, Nervenwachstumsfaktor, Gehirn-hergeleiteter neurotropher Faktor, Neurotrophin-3, –4/5 und –6, ziliarer neurotropher Faktor, GDNF und kürzlich Neunturin, sind als potentielle Mittel zur Erhöhung der Überlebenszeit spezifischer neuronaler Zellen vorgeschlagen worden, um neuronale Erkrankungen, wie z. B. amyotrophe Lateralsklerose, Alzheimererkrankung, Hirnschlag, Epilepsie, Huntington'sche Erkrankung, Parkinsonsche Erkrankung und periphere Neuropathie zu behandeln. Von neurotrophen Faktoren oder Neurotrophinen, die Wachstum und Entwicklung des Wirbeltiernervensystems beeinflussen, wird angenommen, dass sie eine bedeutende Rolle beim Vorantreiben von Differenzierung, Überleben und Funktion verschiedener Gruppen von Neuronen im Gehirn und in der Peripherie einnehmen. Von neurotrophen Faktoren wird angenommen, dass sie wichtige Signalfunktionen in Nervengeweben aufweisen, zum Teil auf Basis des mit Nervenwachstumsfaktor (NGF) etablierten Präzedenzfalles. NGF unterstützt das Überleben von sympathischen, sensorischen und basalen Vorderhirnneuronen in vitro sowie in vivo. Verabreichung von exogenem NGF verhindert den Zelltod von Neuronen während der Entwicklung. Im Gegensatz dazu fördert Entfernen oder Absondern von endogenem NGF durch Verabreichung von Anti-NGF-Antikörpern einen solchen Zelltod (Heumann, J. Exp. Biol. 132, 133–150 (1987); Hefti, J. Neurosci. 6, 2155–2162 (1986); Thoenen et al., Annu. Rev. Physiol. 60, 284–335 (1980)).
Weitere neurotrophe Faktoren, die mit NGF in Verbindung stehen, sind seither identifiziert worden. Diese umfassen Gehirn-hergeleiteten neurotrophen Faktor (BDNF) (Leibrock et al., Nature 341, 149–152 (1989)), Neurotrophin-3 (NT-3) (Kaisho et al., FEBS Lett. 266, 187 (1990); Maisonpierre et al., Science 247, 1446 (1990); Rosenthal et al., Neuron 4, 767 (1990)) und Neurotrophin 4/5 (NT-4/5) (Berkmeier et al., Neuron 7, 857– 866 (1991)). GDNF, ein entferntes Mitglied der TGF-β-Überfamilie, und Neurturin („NTN") sind zwei kürzlich identifizierte, strukturell verwandte, potente Überlebensfaktoren für Neuronen des sympathischen, sensorischen und zentralen Nervensystems (Lin et al., Science 260, 1130–1132 (1993); Henderson et al., Science 266, 1062–1064 (1994); Buj-Bello et al., Neuron 15, 821–828 (1995); Kotzbauer et al., Nature 384, 467– 470 (1996)). GDNF ist als potentielles therapeutisches Mittel für Parkinsonsche Erkran kung, ALS und Alzheimerkrankheit betrachtet worden. Der Mechanismus, durch den GDNF- und NTN-Signale übertragen werden, ist nicht aufgeklärt worden.
Neurotrophine wie NGF beeinflussen ihre Target-Zellen über Wechselwirkungen mit Zelloberflächenrezeptoren. Nach derzeitigem Verständnis agieren zwei Arten von Transmembranglykoproteinen als Rezeptoren für die bekannten Neurotrophine. Gleichgewichtsbindungsstudien haben gezeigt, dass Neurotrophin-reaktive Nervenzellen einen gemeinsamen niedermolekularen (65.000–80.000 Dalton), niedrigaffinen Rezeptor, der typischerweise als p75^LNGFR oder p75 bezeichnet wird, und einen hochmolekularen (130.000–150.000 Dalton) Rezeptor besitzen. Die hochaffinen Rezeptoren (trkA, trkB und trkC) sind Mitglieder der trk-Familie von Rezeptor-Tyrosinkinasen.
Rezeptor-Tyrosinkinasen dienen bekanntermaßen als Rezeptoren für eine Reihe von Proteinfaktoren, die Proliferation, Differenzierung und Überleben von Zellen fördern. Zusätzlich zu den trk-Rezeptoren umfassen Beispiele anderer bekannter Rezeptor-Tyrosinkinasen die Rezeptoren für epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) und Blutplättchen-hergeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF). Typischerweise überspannen diese Rezeptoren die Zellmembran, wobei ein Teil des Rezeptors intrazellulär ist und mit dem Zytoplasma in Kontakt steht, und ein anderer Teil des Rezeptors extrazellulär ist. Die Bindung eines Liganden an den extrazellulären Teil des Rezeptors induziert Tyrosinkinase-Aktivität im intrazellulären Teil des Rezeptors, worauf die Phosphorylierung verschiedener intrazellulärer Proteine folgt, die an Zellsignalwegen beteiligt sind.
Die anomale Expression von Rezeptor-Tyrosinkinasen („RTK") korreliert mit der Transformierungsfähigkeit. Beispielsweise zeigen Karzinome der Leber, Lunge, Brust und des Darms eine erhöhte Expression von Eph RTK. Im Gegensatz zu vielen anderen Tyrosinkinasen kann diese erhöhte Expression in Abwesenheit von Genamplifikation oder Umordnung auftreten. Darüber hinaus ist Hek, eine Human-RTK, als ein Leukämie-spezifischer Marken identifiziert worden, der an der Oberfläche einer Prä-B-Zellenleukämie- Zelllinie vorhanden ist. Wie bei Eph wurde Hek ebenfalls in Abwesenheit von Genamplifikation oder Umordnungen beispielsweise in hämopoetischen Tumoren und Lymphtumor-Zelllinien überexprimiert. Überexpression von Myk-1 (ein Maus-Homolog von Human-Htk (Bennett et al., J. Biol. Chem. 269(19), 14211–14218 (1994))) hat sich in undifferenzierten und invasiven Mammatumoren transgener Mäuse gefunden, die das Ha-ras-Onkogen exprimierten. (Andres et al., Oncogene 9(5), 1461–1467 (1994) und Andres et al., Oncogene 9(8), 2431 (1994)). Ret, das Produkt des c-ret-Proto-Onkogens, ist ein Mitglied der Rezeptor-Tyrosinkinase-Überfamilie.
Zusätzlich zu ihrer Rolle in der Karzinogenese ist von einer Reihe von Transmembran-Tyrosinkinasen berichtet worden, dass sie Schlüsselrollen während der Entwicklung spielen. Einige Rezeptor-Tyrosinkinasen sind entwicklungsmäßig reguliert und werden vorwiegend in Embryogeweben exprimiert. Beispiele umfassen Cek1, das zur FGF-Untergruppe gehört, und die Cek4- und Cek5-Tyrosinkinasen (Pasquale et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 5449–5453 (1989); Sajjadi et al., New Biol. 3(8), 769–778 (1991); und Pasquale, Cell Regulation 2, 523–534 (1991)). Mitglieder der Eph-Familie werden in zahlreichen verschiedenen adulten Geweben exprimiert, wobei mehrere Familienmitglieder im Nervensystem oder speziell in Neuronen exprimiert werden (Maisonpierre et al., Oncogene 8, 3277–3288 (1993); Lai et al., Neuron 6, 691–704 (1991)).
Die anomale Expression oder unkontrollierte Regulation irgendeiner dieser Rezeptor-Tyrosinkinasen kann verschiedene Malignitäten und pathologische Störungen bewirken. Daher besteht ein Bedarf, Wege zu identifizieren, um Rezeptor-Tyrosinkinasen („RTK") und ihre assoziierten Liganden oder GPI-gebundene Rezeptoren zu regulieren, zu kontrollieren und zu manipulieren, um neue und zusätzliche Mittel für die Diagnose und Therapie von Störungen und Zellprozessen bereitzustellen, die mit dem Rezeptor-Tyrosinkinase-Stoffwechselweg in Verbindung stehen. Die vorliegende Anmeldung versorgt den Kliniker und Forscher mit solchen Mitteln, indem ein neues Neurotrophin bindendes Molekül bereitgestellt wird, das auch für die Wechselwirkung mit einem bestimmten RTK-Rezeptor spezifisch ist. Neue Krankheitszustände werden identifiziert, die mit diesem Molekül und dessen Neurotrophin-Liganden in Verbindung stehen. Diese Verbindungen und ihre Verwendungsverfahren ermöglichen, wie hierin bereitgestellt, eine neue und ausgezeichnete therapeutische Kontrolle und Spezifität. Demgemäß ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine verbesserte Therapie zur Prävention und/oder Behandlung von neurologischen Konditionen und anderen Konditionen bereitzustellen, bei der neurotrophe Signalwege eine Rolle spielen, die mit diesem neuen Rezeptor und seinem Liganden in Verbindung stehen.
Diese und andere Ziele der Erfindung werden dem gewöhnlich Fachkundigen bei Betrachtung der Patentbeschreibung in ihrer Gesamtheit offensichtlich.
Zusammenfassung
Die vorliegenden Erfindung basiert zum Teil auf der vorliegenden Entdeckung, dass GDNF-defizienten Mäusen Darmnervensystem und Nieren vollständig fehlen und dass sie einen teilweisen Verlust von Dorsalwurzelganglien- (<23%) und sympathischen Ganglien- (<35%) und sensorischen Knoten-Ganglienneuronen aufweisen. GDNF-Heterozygote zeigen schwere Nierenerkrankung im Endstadium im frühen Alter. Folglich spielt GDNF eine essentielle Rolle bei der Entwicklung oder dem Überleben der Nachniere und von Darmneuronen. Demgemäß werden Verfahren der Behandlung dieser und anderer Krankheiten unter Verwendung von GDNF und GDNF-artigen Verbindungen im Komplex oder in Kombination mit GDNF-Rezeptor bereitgestellt.
Hierin bereitgestellt wird ein neuer, als GDNFRα bezeichneter GDNF-Rezeptor, lösliche Formen des Rezeptors und eine extrazelluläre GDNFRα-Domäne („ECD"). Ebenfalls offenbart sind GDNFRα-Polypeptide, die gegebenenfalls mit Molekülen konjugiert oder fusioniert sind, welche deren Serumhalbwertszeit erhöhen, und gegebenenfalls als pharmazeutische Zusammensetzungen mit einem physiologisch annehmbaren Träger formuliert sind.
Lösliches GDNFRα, das sowohl GDNF-Bindung, als auch Rezeptorsignalfunktion beibehält (über Ret-Rezeptor-Tyrosinkinase), kann dazu verwendet werden, Zellen GDNFRα-Liganden- (vorzugsweise GDNF) Reaktionsfähigkeit zu verleihen oder diese wiederherzustellen oder zu verstärken. Diese Reaktionsfähigkeit umfasst Ligandenbindung, Ret-Tyrosin-Phosphorylierung und Ret-vermittlete Stromab-Aktivität, die eine Modulation der Zellaktivität, wie z. B. Überleben oder Wachstum bewirken kann. Die Ausführungsformen finden Verwendung in vivo, in vitro oder ex vivo. Die Verbindungen der Erfindung finden Verwendung beim Behandeln von Konditionen, die bekanntermaßen mit GDNF sowie den hierin offenbarten neuen Konditionen in Verbindung stehen. GDNF-Rα-ECD, das GDNF bindet, jedoch nicht ein GDNF-Signal übermittelt, kann als Antagonist verwendet werden, um den GDNF-Liganden abzufangen und die Aktivierung von endogenem GDNFRα herabzusetzen. Dies ist bei Konditionen zweckdienlich, die durch überschüssige GDNF-Ligandenspiegel und/oder überschüssige GDNFRα-Aktivierung in einem Säugetier charakterisiert sind.
Pharmazeutische Zusammensetzungen von löslichem GDNFRα, vorzugsweise ECD, umfassen ferner einen GDNFRα-Liganden, vorzugsweise GDNF. Solche Zusammensetzungen, die einen Ligand/GDNFRα-Komplex umfassen, sind zweckdienlich, wenn gewünscht wird, die Halbwertszeit des Liganden zu verlängern, langsame, verzögerte Liganden-Freisetzung bereitzustellen, GDNFRα-Liganden-Reaktionsfähigkeit auf eine Zielzelle zu übertragen und/oder endogenes, zelluläres GDNFRα oder Ret-Aktivität direkt zu aktivieren oder zu erhöhen. Gegebenenfalls enthält die Zusammensetzung ferner ein oder mehrere Zytokine, neurotrophe Faktoren oder ihre antagonistischen Antikörper.
Chimäre GDNFRα-Moleküle, wie z. B. GDNFRα-Immunoadhäsine (die lange Serumhalbwertszeiten aufweisen) und Epitop-markierte GDNFRα sind offenbart. Diese finden besondere Verwendung als lösliche Formen von GDNFRα, insbesondere in Komplexen, um GDNF zuzuführen oder Zellen GDNF-Reaktionsfähigkeit zu verleihen. Bispezifische Immunoadhäsine (beispielsweise das Kombinieren einer GDNFRα-Ligandenbindungs aktivität mit einer Ligandenbindungsdomäne eines anderen Zytokin- oder neurotropher Faktor-Rezeptors) können hochaffine Bindungskomplexe für GDNFRα-Liganden in Kombination mit anderen Faktoren oder für zielgerichtete Zufuhr bilden.
Ebenfalls bereitgestellt werden Verfahren zum Identifizieren eines Moleküls, das an GDNFRα bindet und/oder dieses aktiviert. Folglich werden Tests bereitgestellt, um GDNFRα-Ligandenmoleküle (wie z. B. Peptide, Antikörper und kleine Moleküle) zu screenen oder zu identifizieren, die Agonisten oder Antagonisten von GDNFRα sind. Solche Verfahren umfassen im Allgemeinen das Einwirkenlassen eines immobilisierten GDNFRα auf ein Molekül, von dem vermutet wird, dass es daran bindet, und das Bestimmen der Bindung des Moleküls an das immobilisierte GDNFRα und/oder das Beurteilen, ob das Molekül GDNFRα aktiviert (oder dessen Aktivierung blockiert) oder nicht. Um solche GDNFRα-Liganden zu identifizieren, kann GDNFRα an der Oberfläche einer Zelle exprimiert und verwendet werden, um Bibliotheken synthetischer Kandidatenverbindungen oder natürlich auftretender Verbindungen (z. B. aus exogenen Quellen, wie z. B. Serum oder Zellen) zu screenen. GDNFRα kann auch als diagnostisches Werkzeug zum Messen der Serumspiegel von endogenem oder exogenem GDNFRα-Liganden verwendet werden.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren zur Reinigen eines GDNFRα-Liganden bereitgestellt. Diese findet Verwendung bei der industriellen Produktion und Reinigung therapeutisch aktiver Moleküle, die an diesen Rezeptor binden. In einer der Ausführungsformen wird das Molekül von Interesse (im Allgemeinen in einer Zusammensetzung, die eine oder mehrere Verunreinigungen umfasst) an immobilisiertes GDNFRα adsorbiert (z. B. an ein Protein A-Harz immobilisiertes GDNFRα-Immunoadhäsin). Die Verunreinigungen werden aufgrund ihren Unfähigkeit, and GDNFRα zu binden, im Allgemeinen das Harz nicht binden. Demgemäß ist es dann möglich, das Molekül von Interesse durch Änderung der Elutionsbedingungen, so dass das Ligandenmolekül vom immobilisierten Rezeptor freigesetzt wird, aus dem Harz zu gewinnen.
Es werden Antikörper bereitgestellt, die spezifisch an GDNFRα binden. Bevorzugte Antikörper sind monoklonale Antikörper, die in einem Menschen nicht immunogen sind und an ein Epitop in der extrazellulären Domäne des Rezeptors binden. Bevorzugte Antikörper binden das GDNFRα mit einer Affinität von zumindest ungefähr 10⁶ l/Mol, bevorzugter 10⁷ l/Mol. Bevorzugte Antikörper sind agonistische Antikörper.
Antiköper, die an GDNFRα binden, können gegebenenfalls an ein heterologes Polypeptid fusioniert sein. Der Antikörper oder die Fusion findet besondere Anwendung zur Isolierung und Reinigung von GDNFRα aus einer Rezeptorquelle.
In einem weiteren Aspekt wird ein Verfahren zum Detektieren von GDNFRα in vitro oder in vivo bereitgestellt, dass die Schritte des Kontaktierens eines GDNFRα-Antikörpers mit einer Probe umfasst, von der vermutet wird, dass sie den Rezeptor enthält, und das Detektieren, falls eine Bindung aufgetreten ist.
Für bestimmte Anwendungen ist es wünschenswert, einen agonistischen Antikörper zu besitzen. Solche agonistischen Antikörper sind zum Aktivieren von GDNFRα zweckdienlich, wie für GDNFRα-Liganden wie GDNF beschrieben wird. Darüber hinaus sind diese Antikörper zweckdienlich, um Konditionen zu behandeln, bei denen eine therapeutisch wirksame Menge von GDNFRα-Aktivierung einen therapeutischen Nutzen im Säugetier bewirkt. Beispielsweise kann der agonistische Antikörper verwendet werden, um eine GDNF-Reaktion in einer Zelle hervorzurufen und umfasst GDNFRα und vorzugsweise Ret. Für therapeutische Anwendungen ist es wünschenswert, eine Zusammensetzung herzustellen, die einen agonistischen Antikörper und einen physiologisch annehmbaren Träger aufweist. Gegebenenfalls enthält die Zusammensetzung weiters ein oder mehrere Zytokine, neurotrophe Faktoren oder ihre agonistischen Antikörper.
In anderen Ausführungsformen ist der Antikörper ein neutralisierender Antikörper. Solche Moleküle können verwendet werden, um unerwünschte oder überschüssige GDNFRα-Aktivierung zu behandeln.
Zusätzlich zu Obigem stellt die Erfindung isolierte Nucleinsäuremoleküle, Expressionsvektoren und Wirtszellen bereit, die für GDNFRα, GDNF oder Agonisten davon kodieren, die bei der rekombinanten Produktion von GDNFRα, GDNF oder Agonisten davon wie hierin beschrieben verwendet werden können. Die isolierten Nucleinsäuremoleküle und Vektoren sind ferner zweckdienlich, um transgene Tiere für Gentherapieanwendungen herzustellen, um Patienten mit GDNFRα- oder GDNF-Defekten zu behandeln, um die Reaktionsfähigkeit von Zellen auf GDNFRα-Liganden zu erhöhen oder um alternativ dazu die GDNFRα- oder GDNF-Aktivität zu vermindern (wie durch Verwendung von Antisense-Nucleinsäure).
Kurzbeschreibung der Abbildungen
Die 1A–1E stellen die Nucleinsäuresequenz des Sinn-Strangs der cDNA, die für Volllängen-GDNFRα kodiert, und die abgeleitete Aminosäuresequenz des Volllängen-GDNFRα dar. Nucleotide sind am Beginn des Sinn-Strangs nummeriert. Aminosäurereste sind am Beginn der Aminosäuresequenz nummeriert.
2 stellt die Aminosäuresequenz von GDNFRα und ihre Eigenschaften dar. Das Signalpeptid ist unterstrichen; die mutmaßliche Signalspaltstelle ist mit einem Pfeil markiert; potentielle Glykosylierungsstellen sind eingerahmt; das hydrophobe Domänenelement der GPI-Anbindungsstelle ist doppelt unterstrichen; die drei unterstrichenen Aminosäuren (A-S-S) bilden die GPI-Anker-Spalt/Anbindungsstelle; die Cysteine sind fett gedruckt dargestellt. Die extrazelluläre Domäne („ECD") wird vom Signalpeptid und der GPI-Anbindungsstelle flankiert.
3 stellt PAGE-Ergebnisse von Vernetzungsexperimenten dar. Dargestellt sind Vernetzung von ¹²⁵I-GDNF mit Zellen, die GDNFRα exprimieren (Spuren 1, 2), oder mit Kontrollzellen (Spuren 3, 4) in Abwesenheit (Spuren 1, 3) oder Gegenwart (Spuren 2, 4) von überschüssigem, unmarkiertem GDNF. Vernetzte Proteine (^–85 kD, ^–180 kD, ^–200 kD), die durch unmarkiertes GDNF verdrängbar sind, finden sich in GDNFRα-exprimierenden Zellen, nicht jedoch in Kontrollzellen.
4 stellt die Bindung von ¹²⁵I-GDNF an GDNFRα exprimierende Zellen und die Verdrängung durch unmarkierten GDNF dar. Die Scatchard-Darstellung (Nebenbild) ergab einen mit dem IGOR-Programm bestimmten Kd-Wert von 63 pM.
5 stellt eine Fax-Sortierungs-Analyse von GDNFRα exprimierenden Zellen im Anschluss an PIPLC-Behandlung dar. Kurven sind gemäß der Probe markiert. „Kontrolle" repräsentiert Zellen, die ein Kontroll-Zelloberflächenprotein exprimieren. Gestrichelte Linien („GDNF + PIPLC") repräsentieren GDNFRα exprimierende Zellen, die für 1 Stunde bei 37°C mit 2 μg/ml PIPLC behandelt wurden. Kreise („GDNF") repräsentieren GDNFRα exprimierende Zellen, die nicht mit PIPLC behandelt wurden. Eine Verschiebung nach rechts zeigt Bindung an GDNF an. Behandlung von GDNFRα exprimierenden Zellen mit PIPLC bewirkt eine Verminderung des GDNF-Bindungsausmaßes um mehr als 90%.
6 stellt die Reaktion von E6-Küken-Knotenganglienneuronen auf GDNF vor und nach PIPLC-Behandlung dar. Behandlung mit PIPLC vermindert die Zellüberlebensfähigkeit in Gegenwart von GDNF um über 50%. Im Gegensatz dazu verändert PIPLC die Reaktion auf BDNF nicht. E6-Küken-Knotenganglienneuronen wurden isoliert, aufbereitet, ausplattiert und in Näpfen in dreifacher Ausführung wie früher beschrieben gezüchtet (Buj-Bello et al., Neuron 15, 821–828 (1995)). PIPLC (4 μg/ml) wurde den bezeichneten Proben 1 Stunde vor sowie 12 und 24 Stunden nach der Zugabe zugesetzt. GDNF (10 ng/ml oder wie angegeben) und BDNF (1 ng/ml).
7 stellt die Reaktion von E14-Spinalmotoneuronen auf GDNF von und nach PIPLC-Behandlung dar. Behandlung mit PIPLC vermindert die Motoneuronen-Überlebensfähigkeit in Gegenwart von GDNF um über 90%, ohne die Reaktion auf BDNF zu beeinflussen. Rattenembryo-Motoneuronen wurden wie früher beschrieben (Bloch-Gallego et al., Development 111, 221–232 (1991); Camu et al., J. Neurosci. Meth. 44, 59–70 (1992); Henderson et al., Nature 363, 266–270 (1993)) hergestellt, kultiviert und gezählt. Experimente wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt und die Anzahl überlebender Motoneuronen je cm² nach Kultivierung für 50 Stunden ist dargestellt. Motoneuronen wurden mit der angegebenen Menge PIPLC 1 Stunde vor, mit und 15 Stunden nach Zugabe von GDNF (bei den angegebenen Konzentrationen) behandelt. CNTF (10 ng/ml), Leukämie-Hemmfaktor (LIF) (10 mg/ml) oder BDNF (1 ng/ml).
8 stellt die Reaktion einer NGF-reaktiven standardmäßigen Primärneuronenkultur auf GDNF vor und nach PIPLC-Behandlung dar. Behandlung mit PIPLC vermindert die Neuronen-Überlebensfähigkeit in Gegenwart von GDNF um über 50% ohne Beeinflussung der Reaktion auf NGF.
Die 9A, 9B und 9C stellen GDNFRα-abhängiges GDNF-induziertes Überleben spezifischer Neuronenpopulationen dar. 9A stellt die Überlebensreaktion von Knoten-, trigeminalen, sensorischen und sympathischen Embryo-Küken-Neuronen, Ratten-Spinalmotoneuronen und dopaminergen Ratten-Neuronen auf GDNF oder auf andere Wachstumsfaktoren nach Behandlung mit PIPLC dar. PIPLC vermindert die Zellüberlebensfähigkeit in Gegenwart von GDNF oder CNTF um 50–90% ohne Änderung der Reaktion auf BDNF, NGF oder TGFβ. 9B stellt erhöhte Überlebensfähigkeit von PIPLC-behandelten Motoneuronen in Gegenwart von löslichem GDNFRα („sRα") dar, das die Reaktion der PIPLC-behandelten Motoneuronen auf GDNF wiederherstellt. Es wird angenommen, dass die trophische Aktivität von GDNFRα alleine in diesen Experimenten auf den niedrigen GDNF-Spiegeln beruht, die mit diesem Präparat assoziiert sind. 9C stellt die die Neuriten-Auswuchsreaktion von PC12-Zellen auf die Kombination von löslichem GDNFRα (sRα) und GDNF dar. Lösliches GDNFRα verleiht PC12-Zellen GDNF-Reaktionsfähigkeit. Die Anzahl von Neuriten ist dargestellt, die lebende Zellen je Mikroskopfeld tragen.
Die 10A, 10B, 10C und 10D stellen die Beteiligung von Ret bei der Reaktion auf GDNF dar. 10A stellt dar, dass GDNF-induzierte Tyrosin-Autophosphorylierung von Ret von GDNFRα abhängt. Mäßige Stimulierung der Ret-Tyrosin-Phosphorylierung wurde bei Neuro-2a und SK-N-SH- (SK-) Zellen beobachtet, die nach dem Einwirkenlassen von GDNF alleine nicht mit PIPLC behandelt wurden (linke 2 Spuren). Phosphorylierung von Ret wurde in Gegenwart von löslichem GDNFRα („+ sRα") weiter verstärkt. Keine Stimulierung der Ret-Phosphorylierung wurde bei PIPLC-behandelten (+ PIPLC) Zellen beobachtet, außer wenn GDNF gemeinsam mit GDNFRα („+ PIPLC + sRα") zugegeben wurde. 10B stellt die Konkurrenzbindung von ¹²⁵I-GDNF an Zellen dar, die GDNFRα oder Ret exprimieren. GDNF bindet Ret nicht mit hoher Affinität. 10C stellt die Immunpräzipitation von GDNF, GDNFRα und Ret-Komplex dar, der an der Zelloberfläche gebildet wurde. (Co) nicht transfizierte Zellen. (Ret) mit Ret alleine transfizierte Zellen. (Rα + Ret) mit Ret und GDNFRα transfizierte Zellen. In allen Fällen wurden die Zellen GDNF exponiert (100 ng/ml) und dann für die Immunpräzipitation mit GDNF-Antiseren verarbeitet. Die Gegenwart von Immunkomplexen zwischen GDNF und Ret wurde dann an einem Western-Blot mit Ret-Antiseren ermittelt. GDNF/Ret-Komplex wurde nur in Gegenwart von GDNFRα gebildet. 10D stellt die Immunpräzipitation eines GDNFRα/Ret-Komplexes dar. Komplexbildung wird durch GDNF stimuliert. (Rα) = mit einem Epitop-markierten GDNFRα alleine transfizierte Zellen. (Ret) = mit Ret alleine transfizierte Zellen. (Rα + Ret) = mit Ret und einem Epitop-markierten GDNFRα transfizierte Zellen. Nach Transfektion wurden die Zellen entweder mit GDNF (+) gehandelt oder unbehandelt belassen (–) und dann für die Immunpräzipitation mit Ret-Antiseren verarbeitet. Die Gegenwart von Immunkomplexen zwischen Ret und GDNFRα wurde dann an einem Western-Blot mit Antiseren gegen die Epitop-Markierung von GDNFRα ermittelt. Immunkomplexe zwischen GDNFRα und Ret wurden in Gegenwart von GDNF gebildet.
Ausführliche Beschreibung
Im Zuge der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Ausdrücke verwendet, die wie unten angegeben definiert sind.
Die Ausdrücke „GDNFRα" oder „GDNFRα-Polypeptid" umfassen wenn hierin verwendet Nativsequenz-GDNFRα, GDNFRα-Varianten, extrazelluläre GDNFRα-Domäne und chimäres GDNFRα (wobei alle davon hierin definiert sind). Gegebenenfalls ist das GDNFRα nicht mit nativer Glykosylierung assoziiert. „Native Glykosylierung" bezieht sich auf Kohlenhydratgruppierungen, die kovalent an GDNFRα gebunden werden, wenn es in der Säugetierzelle produziert wird, von der es in der Natur hergeleitet ist. Demgemäß ist in einer Nicht-Human-Zelle produziertes Human-GDNFRα ein Beispiel eines GDNFRα, dass möglicherweise „nicht mit nativer Glykosylierung assoziiert" ist. Gelegentlich ist das GDNFRα nicht glykosyliert (z. B. als Ergebnis der rekombinanten Produktion in einem Prokaryoten).
Ein „Nativsequenz-GDNFRα" umfasst ein Polypeptid, das dieselbe Aminosäuresequenz wie ein aus der Natur hergeleitetes GDNFRα aufweist. Folglich kann ein Nativsequenz-GDNFRα eine Sequenz von natürlich auftretendem Ratten-GDNFRα, Maus-GDNFRα, Human-GDNFRα oder GDNFRα aus jeder anderen Säugetierspezies aufweisen. Solche Nativsequenz-GDNFRα-Polypeptide können aus der Natur isoliert oder durch rekombinante oder synthetische Mittel produziert werden. Der Ausdruck „Nativsequenz-GDNF-Rα" umfasst ausdrücklich natürlich auftretende, trunkierte Formen des GDNFRα, natürlich auftretende Variantenformen (z. B. alternativ gespleißte Formen) und natürlich auftretende allelische Varianten des GDNFRα. Das bevorzugte Nativsequenz-GDNFRα ist ein reifes Nativsequenz-GDNFRα. Die GDNFRα-Sequenz für die Ratte ist in 1A–1E gezeigt. Bevorzugte Moleküle sind jene, die ein Nucleinsäuremolekül umfassen, dass zur Hybridisierung unter mäßigen und bevorzugter unter stringenten Hybridisierungsbedingungen fähig ist, wobei die DNA-Sequenz für den in 1A–1E gezeigten Ratten- GDNF-Rezeptor kodiert. In einer der Ausführungsformen hybridisiert die GDNFR-Nucleinsäure bei 42°C in 20% Formamid mit der DNA-Sequenz, die für den in 1A–1E gezeigten GDNF-Rezeptor kodiert. In einer weiteren Ausführungsform ist ein GDNFR-Nucleinsäuremolekül dazu fähig, bei 42°C in 20% Formamid mit einer DNA-Sequenz von zumindest 10 zusammenhängenden Basen und vorzugsweise zumindest 20 zusammenhängenden Basen, bevorzugter mit zumindest 45 Basen und noch bevorzugter mit zumindest 60 Basen zu hybridisieren, die für einen Abschnitt des in 1A–1E gezeigten, vollständigen GDNF-Rezeptors zu hybridisieren. Bevorzugte Sequenzen hybridisieren unter ähnlichen Bedingungen nicht mit anderen bekannten Neurotrophin-Rezeptorsequenzen.
In gleicher Weise umfasst „GDNF" Nativsequenz-GDNF, GDNF-Varianten, Prä-Pro-GDNF, reifes GDNF und chimäres GDNF. Gegebenenfalls ist das GDNF nicht mit nativer Glykosylierung assoziiert. GDNF kann unglykosyliert sein (z. B. als Ergebnis der rekombinanten Produktion in einem Prokaryoten). Ein „Nativsequenz-GDNF" umfasst ein Polypeptid, das dieselbe Aminosäuresequenz aufweist wie ein aus der Natur hergeleitetes GDNF (siehe Lin et al., Science 260, 1130–1132 (1993) und WO 93/06116, die hierin in ihrer Gesamtheit aufgenommen sind). Folglich kann ein Nativsequenz-GDNF die Aminosäuresequenz von natürlich auftretendem Ratten-GDNF, Maus-GDNF, Human-GDNF oder GDNF aus jeder anderen Säugetierspezies aufweisen. Solche Nativsequenz-GDNF-Polypeptide können aus der Natur isoliert oder durch rekombinante oder synthetische Mittel produziert werden. Der Ausdruck „Nativsequenz-GDNFRα" umfasst speziell natürlich auftretende, trunkierte GDNF-Formen, natürlich auftretende Variantenformen (z. B. alternativ gespleißte Formen) und natürlich auftretende allelische Varianten des GDNF. Das bevorzugte Nativsequenz-GDNF ist reifes Nativsequenz-Human-GDNF.
Die „extrazelluläre GDNFRα-Domäne" (ECD) ist eine Form das GDNFRα, die im Wesentlichen frei von Transmembran- und zytoplasmatischen Domänen des GDNFRα ist, d. h. weniger als 1% solcher Domänen aufweist, vorzugsweise 0,5 bis 0% solcher Domänen und bevorzugter 0,1 bis 0% solcher Domänen aufweist. Für gewöhnlich die GDNFRα-ECD eine Sequenz mit zumindest ungefähr 60% Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz der ECD eines GDNFRα, wie sie beispielsweise in den 1A–1E für GDNFRα oder den entsprechenden, hierin bereitgestellten Sequenzen, z. B. Maus-Sequenzen, Human-Sequenzen, angegeben ist, aufweisen und wird vorzugsweise eine Aminosäuresequenzidentität von zumindest ungefähr 65%, bevorzugter zumindest ungefähr 75%, noch bevorzugter zumindest ungefähr 80%, noch bevorzugter zumindest ungefähr 90% mit ansteigender Bevorzugung von 95% bis zumindest 99% und schließlich 100% aufweisen und umfasst folglich die wie oben definierten GDNFRα-Varianten. Bevorzugte Sequenzen werden zumindest 16 Aminosäuren lang sein und sind vorzugsweise zumindest 20 Aminosäuren und noch bevorzugter zumindest 40 Aminosäuren lang.
„GDNFRα-Variante" (oder "GDNF-Variante") meint ein wie oben definiertes, biologisch aktives GDNFRα (oder GDNF), das weniger als ungefähr 100% Sequenzidentität (jedoch zumindest 60% Identität) mit einem GDNFRα (oder Human-GDNF; siehe Line et al., Science 260, 1130–1132 (1993); WO 93/06116), das beispielsweise die in 1A– 1E für GDNFRα gezeigte abgeleitete Aminosäuresequenz aufweist, oder mit den hierin bereitgestellten Sequenzen aufweist. Solche Varianten umfassen Polypeptide, worin ein oder mehrere Aminosäurereste am N- oder C-Terminus einer GDNFRα- oder GDNF-Sequenz angefügt oder innerhalb derselben eingefügt sind; ungefähr eine bis dreißig Aminosäurereste sind deletiert und gegebenenfalls durch einen oder mehrere Aminosäurereste substituiert; und Derivate der obigen Polypeptide, worin ein Aminosäurerest kovalent modifiziert worden ist, so dass das resultierende Produkt eine nicht natürlich auftretende Aminosäure aufweist. Für gewöhnlich wird eine biologisch aktive Variante eine Aminosäuresequenz mit ungefähr 60% Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz eines natürlich auftretenden GDNFRα (z. B. wie in 1A–1E gezeigt oder die entsprechenden, hierin bereitgestellten Sequenzen) oder Human-GDNF aufweisen und wird vorzugsweise zumindest ungefähr 65%, bevorzugter zumindest ungefähr 75%, noch bevorzugter zumindest ungefähr 80%, noch bevorzugter zumindest ungefähr 90%, mit ansteigender Bevorzugung 95% bis zumindest ungefähr 99% Sequenz identität und schließlich 100% Identität aufweisen. Ein „chimäres GDNFRα" ist ein Polypeptid, dass Volllängen-GDNFRα oder eine oder mehrere Domänen davon (z. B. die extrazelluläre Domäne) umfasst, die an ein heterologes Polypeptid fusioniert oder gebunden sind. Das chimäre GDNFRα wird im Allgemeinen zumindest eine biologische Eigenschaft mit GDNFRα gemeinsam haben. Beispiele chimärer GDNFRαs umfassen Immunoadhäsine und Epitop-markiertes GDNFRα. Ein „chimäres GDNF" ist ein Polypeptid, das reifes GDNF umfasst, das an ein heterologes Polypeptid, vorzugsweise einen anderen neurotrophen Faktor oder Zytokin fusioniert oder gebundenen ist.
Der Ausdruck „Immunoadhäsin" wird wechselseitig mit dem Ausdruck „GDNFRα-Immunglobulin-Chimäre" verwendet und bezieht sich auf ein chimäres Molekül, das einen Teil des GDNFRα (im Allgemeinen die extrazelluläre Domäne davon) mit einer Immunglobulinsequenz vereint. Die Immunglobulinsequenz ist vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise eine Immunglobulin-Konstantdomäne. Der Immunglobulin-Teil in den Chimären der vorliegenden Erfindung kann aus IgG1-, IgG2-, IgG3- oder IgG4-Untergruppen, IgA, IgE, IgD oder IgM, vorzugsweise jedoch IgG1 oder IgG3 erhalten werden.
Der Ausdruck „Epitop-markiert" bezieht sich, wenn hierin verwendet, auf ein chimäres Polypeptid, das an ein „Marker-Polypeptid" fusioniertes GDNFRα (oder GDNF) umfasst. Das Marker-Polypeptid weist eine ausreichende Zahl von Resten auf, um ein Epitop bereitzustellen, gegen das ein Antikörper hergestellt werden kann, ist jedoch ausreichend kurz, so dass es nicht die biologische Aktivität von GDNFRα oder GDNF stört. Das Marker-Polypeptid ist ferner ziemlich einzigartig, so dass der Antikörper dagegen nicht wesentlich mit anderen Epitopen kreuzreagiert. Geeignete Marker-Polypeptide weisen im Allgemeinen zumindest sechs Aminosäurereste und für gewöhnlich zwischen ungefähr 8–50 Aminosäurereste (vorzugsweise zwischen ungefähr 9–30 Reste) auf. Bevorzugt sind Poly-Histidin-Sequenzen, die Nickel binden, was die Isolierung des markierten Proteins beispielsweise mittels Ni-NTA-Chromatographie wie beschrieben (Lindsay et al., Neuron 17, 571–574 (1996)) ermöglicht.
„Isoliertes GDNFRα" oder „isoliertes GDNF" meint Material, das aus einer natürlichen Quelle gereinigt oder durch rekombinante oder synthetische Verfahren hergestellt worden und hinreichend frei von anderen Peptiden oder Proteinen ist (1) um zumindest 15 und vorzugsweise 20 Aminosäurereste der N-terminalen oder einer internen Aminosäuresequenz zu erhalten, indem ein Drehbecher-Sequenzierer ("spinning cup sequenator") oder der beste im Handel erhältliche oder durch ein mit Einreichdatum dieser Anmeldung publiziertes Verfahren modifizierte Sequenzierer verwendet wird oder (2) zur Homogenität mittels SDS-PAGE unter nicht reduzierenden Bedingungen oder reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Coomassie-Blau oder vorzugsweise Silberfärbung. Homogenität bedeutet hier weniger als ungefähr 5% Verunreinigung mit anderen Proteinen der Quelle.
„Im Wesentlichen reines" Protein meint eine Zusammensetzung, die zumindest ungefähr 90 Gewichts-%, vorzugsweise zumindest ungefähr 95 Gewichts-% des Proteins auf Basis des Gesamtgewichts der Zusammensetzung umfasst. „Im Wesentlichen homogenes" Protein meint eine Zusammensetzung, die zumindest ungefähr 99 Gewichts-% auf Basis des Gesamtgewichts der Zusammensetzung umfasst.
„Biologische Eigenschaft" bedeutet, wenn in Verbindung mit entweder „GDNF", „GDNFRα" oder „isoliertem GDNFRα" verwendet, das Aufweisen einer Effektor- oder antigenen Funktion oder Aktivität, die direkt oder indirekt von Nativsequenz-GDNF oder GDNFRα (ob in nativer oder denaturierter Konformation) verursacht wird. Effektorfunktionen umfassen Ligandenbindung oder Rezeptorbindung, und Erhöhung der Überlebensfähigkeit, Differenzierung und/oder Proliferation von Zellen (insbesondere die Proliferation von Zellen). Jedoch umfassen Effektorfunktionen nicht den Besitz eines Epitops oder einer antigenen Stelle, die zur Kreuzreaktion mit gegen Nativsequenz-GDNF oder GDNFRα hergestellten Antikörpern fähig ist.
Eine „antigene Funktion" meint den Besitz eines Epitops oder einer antigenen Stelle, die zur Kreuzreaktion mit gegen Nativsequenz-GDNF oder GDNFRα hergestellten Antikör pern fähig ist. Die hauptsächlich antigene Funktion eines Polypeptids ist, dass es mit einer Affinität von zumindest ungefähr 10⁶ l/Mol an einen Antikörper bindet, der gegen Nativsequenz-GDNF oder GDNFRα hergestellt worden ist. Für gewöhnlich bindet das Polypeptid mit einer Affinität von zumindest ungefähr 10⁷ l/Mol. Die zur Definition der „antigenen Funktion" verwendeten Antikörper sind polyklonale Kaninchen-Antikörper, die durch Formulieren des Antigens in Freund'schem inkompletten Adjuvans, subkutanes Injizieren der Formulierung und Boosten der Immunantwort durch intraperitoneale Injektion der Formulierung, bis der Antikörpertiter sein Plateau erreicht, hergestellt werden.
„Biologisch aktiv" meint, wenn in Verbindung mit „GDNF" oder „GDNFRα" oder isoliertem GDNFRα" verwendet, ein Polypeptid, das eine Effektorfunktion von Nativsequenz-GDNF oder GDNFRα aufweist oder diese mit ihnen gemeinsam hat, und das zusätzlich eine antigene Funktion aufweisen kann (aber nicht muss). Eine hauptsächliche Effektorfunktion von GDNFRα ist das Aktivieren von Ret-Tyrosinkinase (die Autophosphorylierung von Ret bewirkend), um durch Ret-Signalfunktion vermittelte Stromab-Stoffwechselwege zu aktivieren.
„Antigenisch aktiv" ist als ein Polypeptid definiert, das eine antigene Funktion von GDNF oder GDNFRα aufweist und das zusätzlich eine Effektorfunktion besitzt (aber nicht muss).
„Prozent Aminosäureidentität" ist hierin als der Prozentsatz von Aminosäureresten in der Kandidatsequenz definiert, der mit den Resten in der GDNF- oder GDNFRα-Sequenz identisch ist, nachdem, falls erforderlich, die Sequenzen angeglichen und Lücken eingefügt worden sind, um die maximale prozentuelle Sequenzidentität zu erzielen, wobei jegliche konservative Substitutionen als Teil der Sequenzidentität nicht berücksichtigt werden. Keine der N-terminalen, C-terminalen oder internen Extensionen, Deletionen oder Insertionen in die Kandidat-GDNF- oder GDNFRα-Sequenz darf dahingehend ausgelegt werden, dass sie die Sequenzidentität oder Homologie beeinflussen.
„GDNF-Ligand" ist ein Molekül, dass an Nativsequenz-GDNFRα bindet und dieses vorzugsweise aktiviert. Die Fähigkeit des Moleküls, an GDNFRα zu binden, kann beispielsweise durch die Fähigkeit des mutmaßlichen Liganden bestimmt werden, an GDNFRα-Immunoadhäsin, beispielsweise an einer damit beschichteten Testplatte zu binden. Die Spezifität der Bindung kann durch Vergleich der Bindung an andere Neutrophischer-Faktor- oder Zytokin-Rezeptoren, insbesondere jene der TGF-β-Überfamilie, bestimmt werden. Es sollte eine unterschiedliche Bindung zumindest um den Faktor zwei zu beobachten sein. Der Thymidin-Inkorporationstest stellt ein weiteres Mittel zum Screening auf Liganden bereit, welche die GDNFRα-Funktion aktivieren.
Ein „Thymidin-Inkorporationstest" kann verwendet werden, um auf Moleküle zu screenen, die GDNFRα aktivieren. Um diesen Test durchzuführen, werden IL-3-abhängige Baf3-Zellen (Palacios et al., Cell 41, 727–734 (1985)) stabil mit Volllängen-Nativsequenz-GDNFRα wie hierin beschrieben und Ret transfiziert. Die so erzeugten GDNF-Rα/Ret/Baf3-Zellen werden für 24 Stunden in einem befeuchteten Inkubator bei 37°C in 5% CO₂ und Luft an IL-3 ausgehungert. Nach der IL-3-Aushungerung werden die Zellen in 96-Napf-Kulturplatten mit oder ohne Testprobe, die einen potentiellen Agonisten enthält (solche Testproben werden gegebenenfalls verdünnt), ausplattiert und für 24 Stunden in einem Zellkulturinkubator kultiviert. 20 μl serumfreies, 1 μCi ³H-Thymidin enthaltendes RPMI-Medium wird jedem Napf für die letzten 6–8 Stunden zugegeben. Die Zellen werden dann in 96-Napf-Filterplatten gesammelt und dann mit Wasser gewaschen. Die Filter werden dann beispielsweise unter Verwendung eines Packard Top Count Microplate Scintillation Counter gezählt. Von Agonisten wird erwartet, dass sie eine statistisch signifikante Erhöhung (auf einen P-Wert von 0,05) der ³H-Aufnahme relativ zur Kontrolle induzieren. Bevorzugte Agonisten bewirken eine Erhöhung der ³H-Aufnahme, die zumindest die Zweifache derjenigen der Kontrolle beträgt. Andere Tests werden hierin beschrieben.
Ein „isoliertes" Nucleinsäuremolekül ist ein Nucleinsäuremolekül, dass aus zumindest einem verunreinigendem Nucleinsäuremolekül identifiziert und getrennt ist, mit dem es für gewöhnlich in der natürlichen Quelle der GDNF- oder GDNFRα-Nucleinsäure assoziiert ist. Ein isoliertes Nucleinsäuremolekül befindet sich nicht in der Form oder im Milieu, in dem es sich in der Natur findet. Isolierte Nucleinsäuremoleküle werden daher vom Nucleinsäuremolekül, wie es in natürlichen Zellen existiert, unterschieden. Ein isoliertes GDNFRα- (oder GDNF-) Nucleinsäuremolekül umfasst GDNFRα- (oder GDNF-) Nucleinsäuremoleküle, die in Zellen enthalten sind, die für gewöhnlich GDNFRα (oder GDNF) exprimieren, wo beispielsweise das Nucleinsäuremolekül sich an einem chromosomalen Ort befindet, der sich von dem natürlicher Zellen unterscheidet.
Der Ausdruck „Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die zur Expression einer operativ gebundenen, kodierenden Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus notwendig sind. Die Kontrollsequenzen, die beispielsweise für Prokaryoten geeignet sind, umfassen einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, eine Ribosombindungsstelle und möglicherweise bisher noch kaum verstandene Sequenzen. Eukaryotische Zellen nützen bekanntermaßen Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer.
Eine Nucleinsäure ist „operativ gebunden", wenn sie in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz gebracht wird. Beispielsweise ist DNA für eine Präsequenz oder einen sekretorischen Leader operativ an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn sie als Preprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist; ein Promotor oder Enhancer ist operativ an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosombindungsstelle ist operativ an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn sie so positioniert ist, dass die Translation erleichtert wird. Im Allgemeinen bedeutet „operativ gebunden", dass die zu bindenden DNA-Sequenzen zusammenhängend sind und um Falle eines Sekretionsleaders zusammenhängend und in Lesephase sind. Jedoch müssen Enhancer nicht zusammenhängend sein. Das Binden wird durch Ligation an zweckdienlichen Restriktionsstellen erzielt. Wenn solche Stellen nicht vorliegen, werden synthetische Oligonucleotidadaptoren gemäß herkömmlicher Praxis verwendet.
Wie hierin verwendet, werden die Ausdrücke „Zelle", „Zelllinie" und „Zellkultur" austauschbar verwendet und alle solchen Bezeichnungen umfassen die Nachkommenschaft. Folglich umfassen die Ausdrücke „Transformanten" und „transformierte Zellen" die primäre gegenständliche Zelle und davon abgeleitete Kulturen ohne Rücksicht auf die Anzahl der Transfers. Es versteht sich ferner, dass nicht alle Nachkommen im DNA-Gehalt genau identisch sein müssen, und zwar wegen beabsichtigter oder unbeabsichtigter Mutationen. Mutierte Nachkommen, die dieselbe Funktion oder biologische Aktivität aufweisen, auf die in der ursprünglich transformierten Zelle gescreent worden ist, sind ebenfalls umfasst. Wo unterschiedliche Bezeichnungen beabsichtigt sind, geht das aus dem Kontext hervor.
Der Begriff „Antikörper" bezieht sich, wie hierin verwendet, auf einen Antikörper, der aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern erhalten wurde, d. h., dass die einzelnen, die Population umfassenden Antikörper identisch sind mit der Ausnahme möglicher natürlich auftretender Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können. Monoklonale Antikörper sind höchst spezifisch und richten sich gegen eine einzige antigene Stelle. Darüber hinaus richtet sich jeder monoklonale Antikörper, im Gegensatz zu herkömmlichen (polyklonalen) Antikörperpräparaten, die typischerweise verschiedene Antikörper enthalten, die gegen verschiedene Determinanten (Epitope) gerichtet sind, gegen eine einzige Determinante am Antigen. Zusätzlich zu ihrer Spezifität sind die monoklonalen Antikörper dahingehend vorteilhaft, als dass sie von der Hybridomkultur und nicht mit anderen Immunglobulinen verunreinigt synthetisiert werden. Der Modifikator „monoklonal" weist auf den Charakter des Antikörpers dahingehend hin, dass er aus einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern erhalten wurde und ist nicht dahingehend auszulegen, dass er die Produktion des Antikörpers durch irgendein bestimmtes Verfahren erfordert. Beispielsweise können die gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendenden monoklonalen Antikörper mit dem Hybridom-Verfahren hergestellt werden, das erstmals von Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), beschrieben wurde oder können durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt werden (siehe z. B. US-Patent Nr. 4.816.567 (Cabilly et al.)). Die „monoklo nalen Antikörper" können ferner aus Phagen-Antikörper-Bibliotheken beispielsweise unter Anwendung der in Clackson et al., 624–628 (1991) und Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581–597 (1991) beschriebenen Techniken isoliert werden.
Die monoklonalen Antikörper hierin umfassen speziell „chimäre" Antikörper (Immunglobuline), in denen ein teil der Schwer- und/oder Leichtkette mit entsprechenden Sequenzen in Antikörpern identisch oder dazu homolog ist, die von einer bestimmten Spezies hergeleitet sind oder einer bestimmten Antikörperklasse oder Unterklasse angehören, während der Rest der Kette(n) mit entsprechenden Sequenzen in Antikörper identisch oder dazu homolog ist, die von einer anderen Spezies hergeleitet sind oder einer anderen Antikörperklasse oder Unterklasse angehören, sowie Fragmente solcher Antikörper, so lange sie die gewünschte biologische Aktivität zeigen (Cabilly et al., siehe oben; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851–6855 (1984)).
„Humanisierte" Formen nicht-humaner (z. B. Maus) Antikörper sind chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (z. B. Fv, Fab, Fab', F(ab')₂), die eine von Nicht-Human-Immunglobulin hergeleitete Minimalsequenz enthalten. Humanisierte Antikörper sind größtenteils Human-Immunglobuline (Rezipienten-Antikörper), in denen Reste einer Complementary-Determining-Region (CDR) des Rezipienten durch Reste einer CDR einer nicht-humanen Spezies (Donor-Antikörper), wie z. B. Maus, Ratte oder Kaninchen mit der gewünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt sind. In manchen Fällen werden Fv-Gerüstregion- (FR-) Reste des Human-Immunglobulins durch entsprechende nicht-humane Reste ersetzt. Darüber hinaus können humanisierte Antikörper Reste umfassen, die sich weder im Rezipienten-Antikörper, noch in den importierten CDR- oder Gerüst-Sequenzen finden. Diese Modifizierungen werden durchgeführt, um die Leistungsfähigkeit des Antikörpers weiter zu verfeinern und zu optimieren. Im Allgemeinen wird der humanisierte Antikörper im Wesentlichen alle von zumindest einer und typischerweise zwei variablen Domänen umfassen, in denen alle oder im Wesentlichen alle CDR-Regionen jenen eines Nicht-Human-Immunglobulins entsprechen und in denen alle oder im Wesentlichen alle FR-Regionen jene einer Human-Immunglo bulinsequenz sind. Der humanisierte Antikörper wird im Optimalfall auch zumindest einen Teil einer Immunglobulin-Konstantregion (Fc), typischerweise die eines Human-Immunglobulins umfassen. Für weitere Einzelheiten siehe Jones et al., Nature 321, 522– 525 (1986); Reichmann et al., Nature 332, 323–329 (1988); und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593–596 (1992). Der humanisierte Antikörper umfasst einen Primatized^TM-Antikörper, worin die Antigenbindungsregion des Antikörpers von einem Antiköper hergeleitet ist, der durch Immunisierung von Macaque-Affen mit dem Antigen von Interesse hergestellt wurde.
„Nicht immunogen in einem Menschen" meint, dass beim Kontaktieren des Polypeptids von Interesse in einem physiologisch annehmbaren Träger und in einer therapeutisch wirksamen Menge mit dem geeigneten Gewebe eines Menschen kein Zustand von Empfindlichkeit oder Widerstand gegen das Polypeptid von Interesse bei der zweiten Verabreichung des Polypeptids von Interesse nach einer angemessenen Latenzzeit (z. B. 8 bis 14 Tage) feststellbar ist.
Mit „Agonist-Antikörper" ist ein Antikörper gemeint, der ein zur Aktivierung von Nativsequenz-GDNFRα fähiger GDNFRα-Ligand ist.
Ein „neutralisierender Antikörper" ist einer, der fähig ist, eine Effektorfunktion von Nativsequenz-GDNF oder GDNFRα zu blockieren oder signifikant zu vermindern. Beispielsweise kann ein neutralisierender Antikörper die GDNFRα-Aktivierung durch einen GDNF-Liganden hemmen oder vermindern, wie beispielsweise in einem Neuriten-Überlebenstest, GDNF-Bindungstest oder anderen hierin gelehrten oder fachbekannten Tests bestimmt werden kann.
Der Ausdruck „Verstärkung der Proliferation einer Zelle" umfasst den Schritt des Erhöhens des Ausmaßes des Wachstums und/oder der Reproduktion der Zelle im Vergleich zu einer unbehandelten Zelle entweder in vitro oder in vivo. Eine Verstärkung der Zellproliferation in Zellkultur kann durch Zählen der Anzahl von Zellen vor und nach Ein wirkenlassen eines Moleküls von Interesse detektiert werden. Das Ausmaß der Proliferation kann über mikroskopische Untersuchung des Ausmaßes der Konfluenz quantifiziert werden. Zellproliferation kann auch unter Anwendung des hierin beschriebenen Thymidin-Inkorporationstests quantifiziert werden.
Mit „Erhöhen der Differenzierung einer Zelle" ist der Vorgang des Erhöhens des Umfangs des Erwerbs oder Besitzes einer oder mehreren Eigenschaften oder Funktionen gemeint, die sich von denen der ursprünglichen Zelle unterscheiden (d. h. Zellspezialisierung). Dies kann durch Screenen auf eine Veränderung des Phänotyps der Zelle (z. B. Identifizieren morphologischer Veränderungen in der Zelle) detektiert werden.
„Physiologisch annehmbare" Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind jene, die für die/das damit exponierte Zelle oder Säugetier bei den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch sind. Häufig ist der physiologisch annehmbare Träger eine wässrige, pH-gepufferte Lösung. Beispiele physiologisch annehmbarer Träger umfassen Puffer, wie z. B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidantien, einschließlich Ascorbinsäure; niedermolekulare (weniger als ungefähr 10 Reste) Polypeptide; Proteine, wie z. B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie z. B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie z. B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; komplexbildende Mittel, wie z. B. EDTA; Zuckeralkohole, wie z. B. Mannitol oder Sorbitol; salzbildende Gegenionen, wie z. B. Natrium; und/oder nichtionische Tenside, Wie z. B. Tween, Pluronics oder Polyethylenglykol (PEG).
Wie hierin verwendet bezieht sich der Ausdruck „Salvage-Rezeptorbindungsepitop" auf ein Epitop der Fc-Region eines IgG-Moleküls (z. B. IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4), welches für das Erhöhen der In-vivo-Serumhalbwertszeit des IgG-Moleküls verantwortlich ist. Beispielhafte Salvage-Rezeptorbindungsepitop-Sequenzen umfassen HQNLSDGK; HQNISDGK; HQSLGTQ; VISSHLGQ; und PKNSSMISNTP.
Der Begriff „Zytokin" ist ein allgemeiner Ausdruck für Proteine, die von einer Zellpopulation freigesetzt werden, die auf eine andere Zelle als intrazelluläre Vermittler agieren. Beispiele solcher Zytokine sind Lymphokine, Monokine und herkömmliche Polypeptidhormone. Umfasst unter Zytokinen sind Wachstumshormone, wie z. B. Human-Wachstumshormon, N-Methionly-Human-Wachstumshormon und Rinder-Wachstumshormon; Parathyroidhormon; Thyroxin; Insulin; Proinsulin; Relaxin; Prorelaxin; Glykoproteinhormone, wie z. B. Follikel-stimulierendes Hormon (FSH), Thyroid-stimulierendes Hormon (TSH) und Luteinisierunghormon (LH); Leber-Wachstumsfaktor, Fibroblasten-Wachstumsfaktor; Prolactin; Plazentalactogen; Tumornekrosefaktor-α und -β; Mullerian-inhibierende Substanz; Maus-Gonadotropin-assoziiertes Peptid; Inhibin; Activin; Gefäßendothel-Wachstumsfaktor; Integrin; Thrombopoietin (TPO); neurotrophe Faktoren oder Nerven-Wachstumsfaktoren, wie z. B. NGF-β, NT-3, NT-4, NT-6, BDNF, CNTF, GDNF, AL-1 und andere eph-Rezeptorfamilienliganden; Blutplättchen-Wachstumsfaktor; transformierende Wachstumsfaktoren /TGFs), wie z. B. TGF-α und TGF-β; Insulin-artiger Wachstumsfaktor-I und -II; Erythropoletin (EPO); osteoinduktive Faktoren; Interferone, wie z. B. Interferon-α, -β und -γ; koloriestimulierende Faktoren (CFSs), wie z. B. Makrophagen-CSF (M-CSF); Granulozyten-Makrophagen-CSF (GM-CSF); und Granulozyten-CSF (G-CSF); Interleukine (ILs), wie z. B. IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; und andere Polypeptidfaktoren, einschließlich LIF und Kit-Ligand (KL). Wie hierin verwendet, umfasst der Begriff Zytokin Proteine aus natürlichen Quellen und aus rekombinanter Zellkultur und biologisch aktive Äquivalente der Nativsequenz-Zytokine. Ebenfalls umfasst sind genetisch manipulierte Moleküle mit Zytokin-Aktivität, wie z. B. TrkA-IgG oder andere lösliche Rezeptor-Chimären.
„Behandlung" bezieht sich auf therapeutische Behandlung sowie auf prophylaktische oder präventive Maßnahmen. Jene, die einer Behandlung bedürfen, umfassen jene, die die Störung bereits aufweisen, sowie jene, in denen die Störung zu verhindern ist.
„Säugetier" zum Zwecke der Behandlung bezieht sich auf jegliches als Säugetier klassifiziertes Tier, einschließlich Menschen Haus- oder Nutztiere sowie Zoo- und Sporttiere, wie z. B. Hunde, Pferde, Katzen, Rinder usw. Vorzugsweise ist das Säugetier der Mensch.
Mit „Festphase" ist eine nicht-wässrige Matrix gemeint, an die ein Reagens von Interesse (z. B. GDNFRα oder ein Antikörper dagegen) anhaften kann. Beispiele von Festphasen, die hierin vorgesehen sind, umfassen jene, die teilweise oder vollständig aus Glas gebildet werden (z. B. Controlled-Pore-Glass), Polysaccharide (z. B. Agarose), Polyacrylamide, Polystyrol, Polyvinylalkohol und Silikone. In bestimmten Ausführungsformen kann die Festphase abhängig vom Kontext den Napf einer Testplatte umfassen; in anderen ist sie eine Reinigungssäule (z. B. eine Affinitätschromatographiesäule). Dieser Begriff umfasst auch eine diskontinuierliche Festphase diskreter Partikel, wie z. B. jene, die in US-Patent Nr. 4.275.149 beschrieben sind.
Ausführungsweisen der Erfindung werden hierin präsentiert. GDNF (Lin et al., Science 260, 1130–1132 (1993); WO 93/06116, die hierin in ihrer Gesamtheit aufgenommen sind) ist ein potenter Überlebensfaktor für dopaminerge (Lin et al., Science 260, 1130– 1132 (1993); Strömberg et al., Exp. Neurol. 124, 401–412 (1993)), spinalmotorische (Henderson et al., Science 266, 1062–1064 (1994)) und noradrenerge Neuronen (Arenas et al., Neuron 15, 1465–1473 (1995)) des Mittelhirns, welche bei der Parkinsonschen Krankheit degenerieren (Hirsch et al., Nature 334, 345–348 (1988); Hornykiewicz, Mt. Sinai J. Med. 55, 11–20 (1988)), amyotrophe Lateralsklerose (Hirano, Amyotrophic Lateral Sclerosis and Other Motor Neuron Diseases, P. Rowland (Hrsg.), New York, Raven Press Inc., S. 91–101 (1991)) bzw. Alzheimerkrankheit (Marcynuik et al., J. Neur. Sci. 76, 335–345 (1986); Cash et al., Neurology 37, 42–46 (1987); Chan-Palay et al., Comp. Neurol. 287, 373–392 (1989)). Teilweise auf Basis von genetisch manipulierten Mäusen, denen GDNF fehlt, werden hierin zusätzliche biologische Rollen für GDNF berichtet: die Entwicklung und/oder das Überleben enterischer, sympathischer und sensorischer Neuronen und Zellen des Darmsystems. Die in den Beispielen präsentierten Ergebnisse zeigen ferner, dass GDNF für die Entwicklung catecholaminerger Neuronen im Zentralnervensystem (ZNS) nicht notwendig ist.
Ebenfalls hierin beschrieben ist die Isolierung, Sequenz und Gewebeverteilung eines neuen GPI-gebundenen Proteins und seines Gens, GDNFRα genannt, und es wird gezeigt, dass es die Zellreaktion auf GDNF moduliert. Ligandengebundenes GDNFRα induziert die Phosphorylierung des Tyrosinkinase-Rezeptors Ret. Diese Erkenntnisse identifizieren Ret bzw. GDNFRα als Signalisierungs- und Ligandenbindungskomponenten eines Rezeptorkomplexes für GDNF.
Zytokinrezeptoren assemblieren sich häufig in Mehrfach-Untereinheiten-Komplexen. Gelegentlich ist die α-Untereinheit dieses Komplexes an der Bindung des zugehörigen Wachstumsfaktors beteiligt und die β-Untereinheit kann eine Fähigkeit enthalten, ein Signal auf in die Zelle zu übertragen. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, sind diese Rezeptoren drei Unterklassen in Abhängigkeit von den gebildeten Komplexen zugeordnet worden. Unterfamilie 1 umfasst Rezeptoren für EPO, Granulozyten-koloniestimulierender-Faktor (G-CSF), Interleukin-4 (IL-4), Interleukin-7 (IL-7), Wachstumshormon (GH) und Prolactin (PRL). Es wird angenommen, dass Ligandenbindung an zu dieser Unterfamilie gehörende Rezeptoren die Homodimerisierung des Rezeptors bewirkt. Unterfamilie 2 umfasst Rezeptoren für IL-3, Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierender-Faktor (GM-CSF), Interleukin-5 (IL-5), Interleukin-6 (IL-6), Leukämie-inhibierender Faktor (LIF), Oncostatin M (OSM) und Zilien-neurotropher-Faktor (CNTF). Rezeptoren der Unterfamilie 2 sind Heterodimere, die eine α-Untereinheit für Ligandenbindung und die β-Untereinheit (entweder die gemeinsame β-Untereinheit der IL-3-, GM-CSF- und IL-5-Rezeptoren oder die gp130-Untereinheit der IL-6-, LIF-, OSM- und CNTF-Rezeptoren) für die Signalübertragung aufweisen. Unterfamilie 3 enthält nur den Interleukin-2- (IL-2-) Rezeptor. Die β- und γ-Untereinheiten des IL-2-Rezeptorkomplexes sind Zytokinrezeptor-Polypeptide, die mit der α-Untereinheit des nicht verwandten Tac-Antigens assoziieren.
In einem ihrer Aspekte basiert die vorliegende Erfindung auf der Entdeckung des GDNFRα, einem Protein, das GDNF mit hoher Affinität bindet. Die hierin beschriebenen Experimente beweisen, dass dieses Molekül ein Rezeptor ist, der eine Rolle beim Vermit teln von Reaktionen auf GDNF zu spielen scheint. Insbesondere erwies sich, dass dieser Rezeptor in einer Vielzahl von Gewebe- und Zellpopulationen vorhanden ist, einschließlich in Neuronen, was folglich darauf hinweist, dass GDNF-Liganden, wie z. B. Agonist-Antikörper, verwendet werden können, um Proliferation, Wachstum, Überleben, Differenzierung, Metabolismus oder Regeneration von GDNFRα- und Ret-enthaltenden Zellen zu stimulieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird GDNF durch rekombinante DNA-Verfahren produziert, wobei die für GDNF kodierenden Gene nutzbar gemacht werden (siehe WO 93/06116 für Human- und Ratten-GDNF-Sequenzen, Expression und Testverfahren). Die vorliegende Erfindung umfasst einen Vektor zur Verwendung beim Produzieren von biologisch aktivem GDNF, der Expressionsregulationselemente umfasst, die operativ an eine Nucleinsäuresequenz gebunden sind, die für reifes oder Prä-Pro-GDNF kodiert, sowie eine durch einen solchen Vektor transformierte Wirtszelle, die regulatorische Elemente enthält, die zur Expression der DNA-Sequenz notwendig sind; Transformieren einer Wirtszelle mit dem besagten Vektor; Kultivieren der Wirtszellen unter Bedingungen zur Amplifikation des Vektors und Expression von GDNF; und Gewinnen von GDNF.
Ein rekombinantes DNA-Verfahren wird für die Produktion von GDNF beschrieben und umfasst: Kultivieren der Wirtszellen dieser Erfindung unter Bedingungen zur Amplifikation des Vektors und Expression von GDNF; und Gewinnen des GDNF.
Das nach der Expression isolierte Material ist im Wesentlichen biologisch inaktiv und besteht als Monomer. Nach der Neufaltung besteht GDNF als ein biologisch aktives, Disulfid-gebundenes Dimer. GDNF ist daher ein Disulfid-gebundenes Dimer in seiner natürlichen, biologisch aktiven Form. Diese Erfindung umfasst jedoch GDNF in monomerer sowie dimerer Form und in biologisch inaktiven und biologisch aktiven Formen.
In der Patentbeschreibung sollte jede Bezugnahme auf Glia-hergeleiteten neurotrophen Faktor durchwegs dahingehend ausgelegt werden, dass auf neurotrophe Faktoren jeden Ursprungs Bezug genommen wird, die im Wesentlichen homolog und biologisch äquivalent dem hierin charakterisierten und beschriebenen GDNF sind. Der Grad an Homologie zwischen Ratten- und Human-Proteinen beträgt ungefähr 93%, und alle Säugetier-GDNF werden einen ähnlich hohen Grad an Homologie aufweisen. Solche GDNFs können als Dimere in ihrer biologisch aktiven Form vorliegen.
Die vorliegende Erfindung sieht glykosylierte und nicht glykosylierte Formen von GDNF sowie trunkierte Formen des natürlich auftretenden und rekombinanten GDNF wie hierin beschrieben vor. In einer weiteren Ausführungsform wird GDNF durch Anbindung einer oder mehrerer Polyethylenglykol- (PEG-) oder anderer sich wiederholender polymerer Gruppierungen modifiziert. Die vorliegende Erfindung sieht ferner rekombinant in Bakterienexpressionssystemen produziertes GDNF vor, das einen aminoterminalen Methioninrest enthält.
Ebenfalls umfasst sind Verfahren zur Prävention oder Behandlung der hierin erörterten Störungen. Eine der Ausführungsformen enthält ein Verfahren des Implantierens GDNF-sekretierender Zellen in den Körper von Patienten, die der GDNF-Therapie bedürfen. Das Implantat kann gegebenenfalls lösliches GDNFα sekretierende Zellen enthalten. Die vorliegende Erfindung umfasst ferner ein Implantationsgerät zur Prävention oder Behandlung der hierin erörterten Störungen, das eine semipermeable Membran und eine in diese Membran eingekapselte GDNF sekretierende Zelle umfasst, wobei die Membran für GDNF permeabel und für Faktoren vom Patienten impermeabel ist, die für die Zellen schädlich sind.
Die Beschreibung hierin für Vektoren, Wirtszellen, Fusionsproteine, Modifizierungen und Verabreichungsverfahren und Wege usw. für das Herstellen, Exprimieren und Verwenden von GDNFR gilt für GDNF und dessen Varianten, wie dem gewöhnlich Fachkundigen bekannt ist.
Geeignete Techniken für die Produktion von GDNFRα sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt und umfassen das Isolieren von GDNFRα aus einer endogenen Quelle des Polypeptids, Polypeptidsynthese (mittels Peptidsynthesizer) und rekombinante Techniken (oder jede Kombination dieser Techniken). Die bevorzugte Technik zur Produktion von GDNFRα ist eine unten zu beschreibende rekombinante Technik.
Der Großteil der untenstehenden Diskussion betrifft die rekombinante Produktion von GDNFRα durch Kultivieren von mit einem GDNFRα enthaltenden Vektor transformierten Zellen und das Gewinnen des Polypeptids aus der Zellkultur. Es ist weiters beabsichtigt, dass das GDNFRα dieser Erfindung durch homologe Rekombination produziert wird, wie sie in WO 91/06667, publiziert am 16. Mai 1991, bereitgestellt wird.
Kurz gesagt umfasst das Verfahren das Transformieren primärer Human-Zellen, die ein für GDNFRα kodierendes Gen mit einem Konstrukt (d. h. Vektor) enthalten, das ein amplifizierbares Gen (wie z. B. Dihydrofolatreduktase (DHFR) oder andere unten diskutierte) und zumindest eine flankierende Region einer Länge von zumindest ungefähr 150 bp umfasst, die homolog zu einer DNA-Sequenz am Locus der kodierenden Region des GDNFRα-Gens ist, um für die Amplifikation des GDNFRα-Gens zu sorgen. Das amplifizierbare Gen muss sich an einer Stelle befinden, die die Expression des GDNFRα-Gens nicht stört. Die Transformation wird so durchgeführt, dass das Konstrukt homolog in das Genom der Primärzellen integriert wird, um eine amplifizierbare Region zu definieren.
Das Konstrukt umfassende Primärzellen werden dann mithilfe des amplifizierbaren Gens oder eines andern im Konstrukt vorhanden Markers selektiert. Die Gegenwart des Markergens weist die Gegenwart und Integration des Konstrukts in das Wirtsgenom nach. Es muss keine weitere Selektion des Primärzellen durchgeführt werden, da die Selektion im zweiten Wirt durchgeführt wird. Wenn gewünscht, kann das Auftreten des homologen Rekombinationsereignisses bestimmt werden, indem PCR eingesetzt und entweder die resultierenden amplifizierten DNA-Sequenzen sequenziert werden oder die richtige Länge des PCR Fragments bestimmt wird, wenn DNA aus den korrekten ho mologen Integranten vorhanden ist, und nur jene Zellen, die solche Fragmente enthalten, vermehrt werden. Ferner können, wenn gewünscht, die selektierten Zellen zu diesem Zeitpunkt amplifiziert werden, indem die Zellen mit dem geeigneten Amplifikationsmittel (wie z. B. Methotrexat, wenn das amplifizierbare Gen DHFR ist) gestresst werden, so dass Vielfachkopien des Zielgens erhalten werden. Vorzugsweise wird jedoch der Amplifikationsschritt bis nach der unten beschriebenen zweiten Transformation nicht durchgeführt.
Nach dem Selektionsschritt werden DNA-Abschnitte des Genoms, die ausreichend groß sind, um die gesamte amplifizierbare Region zu umfassen, von den selektierten Primärzellen isoliert. Sekundäre Säugetier-Expressionswirtzellen werden dann mit diesen genomischen DNA-Abschnitten transformiert und geklont und es werden Klone selektiert, die die amplifizierbare Region enthalten. Die amplifizierbare Region wird dann mithilfe eines Amplifikationsmittels amplifiziert, wenn sie nicht bereits in den Primärzellen amplifiziert wird. Schließlich werden die sekundären Expressionswirtzellen, die nun Vielfachkopien der GDNFRα enthaltenden amplifizierbaren Region umfassen, gezüchtet, so dass das Gen exprimiert und das Protein produziert wird.
Die konservierte Struktur und Sequenz des Säugetier-GDNFRα und die Ermittlung der cDNA-Sequenz, die für den Ratten- und Maus-Rezeptor kodiert, sowie hierin offenbarte Human-Sequenzen ermöglichen es, Gensequenzen aus anderen Säugetieren, die für GDNFRα kodieren, zu klonieren. Von besonderem Interesse für die vorliegende Erfindung ist das Vermögen, die Human-GDNFRα-Moleküle unter Verwendung der hierin offenbarten Sequenzen zu klonieren. Die für GDNFRα kodierende DNA kann aus einer beliebigen cDNA-Bibliothek erhalten werden, die aus Gewebe hergestellt wurde, von dem angenommen wird, dass es die GDNFRα-mRNA enthält und diese in nachweisbarer Menge exprimiert, wie hierin in den Beispielen gezeigt wird. Demgemäß kann GDNFRα-DNA bequem aus einer cDNA-Bibliothek erhalten werden, die beispielsweise aus Säugetier-Fötalleber, Hirn, Muskel, Darm und Periphernerven hergestellt wurde.
Das für GDNFRα kodierende Gen kann auch aus einer Genom-Bibliothek oder durch Oligonucleotidsynthese erhalten werden.
Bibliotheken werden mit Sonden (wie z. B. Antikörpern gegen GDNFRα oder Oligonucleotiden von ungefähr 20–80 Basen) gescreent, die zum Identifizieren des Gens von Interesse oder des von ihm kodierten Proteins entworfen sind. Das Screening der cDNA- oder Genom-Bibliothek mit der gewählten Sonde kann unter Anwendung von Standardverfahren durchgeführt werden, wie sie in Kapiteln 10–12 in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989) beschrieben sind. Ein alternatives Mittel zur Isolierung des für GDNFRα kodierenden Gens ist die Anwendung der PCR-Technologie, wie sie in Abschnitt 14 in Sambrook et al., siehe oben, beschrieben wird.
Ein bevorzugtes Verfahren der praktischen Umsetzung dieser Erfindung ist die Verwendung sorgfältig ausgewählter Nucleotidsequenzen, um cDNA-Bibliotheken aus verschiedenen Humangeweben, vorzugsweise Human-Fötalleber, zu screenen. Die als Sonden gewählten Oligonucleotidsequenzen sollten hinreichend lang und hinreichend eindeutig sein, so dass falsch-positive Ergebnisse minimiert werden. Bevorzugte Sequenzen werden aus dem hierin offenbarten, natürlich auftretenden GDNFRα erhalten.
Das Oligonucleotid muss so markiert sein, dass es bei Hybridisierung an DNA in der gescreenten Bibliothek detektiert werden kann. Das bevorzugte Markierungsverfahren ist es, ³²P-markiertes ATP mit Polynucleotidkinase zu verwenden, wie auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt, um die Oligonucleotide radioaktiv zu markieren. Es können jedoch andere Verfahren verwendet werden, um die Oligonucleotide zu markieren, einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf Biotinylierung und Enzymmarkierung.
Aminosäuresequenzvarianten von GDNFRα werden durch Einführen geeigneter Nucleotidveränderungen in die GDNFRα-DNA oder durch Synthese des gewünschten GDNFRα-Polypeptids hergestellt. Solche Varianten repräsentieren Insertionen, Substitu tionen und/oder bestimmte Deletionen von Resten innerhalb oder an einem oder beiden der Enden der Aminosäuresequenz eines natürlich auftretenden GDNFRα, wie z. B. das in 1A–1E gezeigte GDNFRα oder hierin offenbarte Sequenzen. Vorzugsweise stellen diese Varianten Insertionen und/oder Substitutionen innerhalb oder an einem oder beiden der Enden der reifen Sequenz, und/oder Insertionen, Substitutionen und/oder bestimmten Deletionen innerhalb oder an einem oder beiden der Enden der Signalsequenz von GDNFRα dar. Jede Kombination von Insertion, Substitution und/oder bestimmter Deletion wird durchgeführt, um zum letztlichen Konstrukt zu gelangen, unter der Voraussetzung, dass das letztliche Konstrukt die wie hierin definierte biologische Aktivität aufweist. Die Aminosäureänderungen können auch posttranslationelle Prozesse des GDNFRα verändern, wie z. B. das Verändern der Anzahl oder Position von Glykosylierungsstellen, Verändern der Membranverankerungseigenschaften und/oder Verändern der intrazellulären Lokalisation von GDNFRα durch Insertieren, Deletieren oder anderweitiges Beeinflussen der Leadersequenz von GDNFRα. Bevorzugter sind Substitutionen, Deletionen oder Insertionen von 1 bis 3 Aminosäuren. Insbesondere bevorzugt sind Substitutionen, Deletionen oder Insertionen von 1 Aminosäure. Bevorzugte Veränderungen sind in ihrer Natur typischerweise konservativ.
Die oben beschriebenen Variationen der Nativsequenz können unter Anwendung beliebiger der Techniken und Richtlinien für konservative und nicht-konservative Mutationen durchgeführt werden, wie sie in US-Patent Nr. 5.364.934, das durch Verweis speziell aufgenommen ist, dargelegt sind. Diese umfassen Oligonucleotid-vermittelte (ortsgerichtete) Mutagenese, Alanin-Scanning und PCR-Mutagenese. Siehe auch beispielsweise Tabelle 1 hierin und die dieser Tabelle umliegende Diskussion als Leitfaden zum Auswählen von zu ändernden, addierenden oder deletierenden Aminosäuren.
Die für GDNFRα kodierende Nucleinsäure (z. B. cDNA oder genomische DNA) wird in einen replizierbaren Vektor zur weiteren Klonierung (Amplifikation der DNA) oder zur Expression insertiert. Es sind zahlreiche Vektoren verfügbar. Die Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf eine der folgenden: eine Signalsequenz, ein Replikationsstartpunkt, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancerelement, ein Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz.
Die GDNFRαs dieser Erfindung können rekombinant nicht nur direkt, sondern auch als Fusionspolypeptid mit einem heterologen Polypeptid, das vorzugsweise eine Signalsequenz ist, oder einem anderen Polypeptid hergestellt werden, das eine spezifische Spaltstelle am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids aufweist. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors sein, oder kann Teil der GDNFRα-DNA sein, die in den Vektor insertiert wird. Die gewählt heterologe Signalsequenz ist vorzugsweise eine, die von der Wirtszelle erkannt und prozessiert (d. h. durch eine Signalpeptidase gespalten) wird. Für prokaryotische Zellen, die die native GDNFRα-Signalsequenz nicht erkennen und prozessieren, wird die Signalsequenz durch eine gewählte prokaryotische Signalsequenz substituiert, beispielsweise aus der Gruppe der Alkalische Phosphatase-, Penicillinase-, Ipp- oder hitzestabiles Enterotoxin II-Leader. Für Hefesekretion kann die native Signalsequenz z. B. durch Hefe-Invertase-Leader, α-Faktor-Leader (einschließlich α-Faktor-Leader aus Saccharomyces und Kluyveromyces, letzterer beschrieben in US-Patent Nr. 5.010.182, erteilt am 23. April 1991) oder Saure Phosphatase-Leader, den Glucoamylase-Leader aus C. albicans ( EP 362.179 , publiziert am 4. April 1990) oder das Signal substituiert werden, das in WO 90/13646, publiziert am 15. November 1990, beschrieben wird. Bei der Säugetierzellexpression ist die native Signalsequenz (z. B. die GDNFRα-Präsequenz, die normalerweise die Sekretion von GDNFRα aus Human- oder Rattenzellen in vivo steuert) ausreichend, obgleich andere Säugetier-Signalsequenzen geeignet sein können, wie z. B. Signalsequenzen aus anderen Tier-GDNFRαs und Signalsequenzen aus sekretierten Polypeptiden derselben oder einer verwandten Spezies, sowie virale Sekretionsleader, beispielsweise das Herpex-simplex-gD-Signal.
Die DNA für eine solche Perkursor-Region wird im Leseraster zur DNA ligiert, die für reifes GDNFRα oder eine lösliche Variante davon kodiert.
Sowohl Expressions-, als auch Klonierungsvektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die es dem Vektor ermöglicht, in einer oder mehreren gewählten Wirtszellen zu replizieren. Im Allgemeinen ist in Klonierungsvektoren diese Sequenz eine, die es dem Vektor ermöglicht, sich unabhängig von der chromosomalen Wirts-DNA zu replizieren und umfasst Replikationsstartpunkte oder autonom replizierende Sequenzen. Solche Sequenzen sind für eine Reihe von Bakterien, Hefe und Viren wohlbekannt. Der Replikationsstartpunkt aus dem Plasmid pBR322 ist für die meisten Gram-negativen Bakterien geeignet, der 2 μ-Plasmid-Startpunkt ist für Hefe geeignet und zahlreiche Virus-Startpunkte (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind für Klonierungsvektoren in Säugetierzellen zweckdienlich. Im Allgemeinen Replikationsstartpunktkomponente für Säugetier-Expressionsvektoren nicht erforderlich (der SV40-Startpunkt wird typischerweise nur deshalb verwendet, weil er den frühen Promotor enthält).
Die meisten Expressionsvektoren sind „Shuttle"-Vektoren, d. h. sie sind zur Replikation in zumindest einer Organismenklasse fähig, können jedoch in einen anderen Organismus zur Expression transfiziert werden. Beispielsweise wird ein Vektor in E. coli kloniert und derselbe Vektor dann in Hefe- oder Säugetierzellen zur Expression transfiziert, obwohl er nicht fähig ist, sich unabhängig vom Wirtschromosom zu replizieren.
DNA kann auch durch Insertion in das Wirtsgenom amplifiziert werden. Dies kann leicht unter Verwendung von Bacillus-Spezies als Wirte erzielt werden, indem beispielsweise in den Vektor eine DNA-Sequenz aufgenommen wird, die zu einer in Bacillus-Genom-DNA vorhandenen Sequenz komplementär ist. Die Transfektion von Bacillus mit diesem Vektor resultiert in der homologer Rekombination mit dem Genom und Insertion von GDNFRα-DNA. Jedoch ist die Gewinnung genomischer DNA, die für GDNFRα kodiert, komplexer als jene eines exogen replizierten Vektors, das Restriktionsenzymverdau erforderlich ist, um die GDNFRα-DNA herauszuschneiden.
Expressions- und Klonierungsvektoren sollten ein Selektionsgen enthalten, das auch selektierbarer Marker genannt wird. Dieses Gen kodiert für ein Protein, das für das Über leben und Wachstum transformierter Wirtszellen notwendig ist, die in einem Selektivmedium gezüchtet werden. Nicht mit dem das Selektionsgen enthaltenden Vektor transformierte Wirtszellen werden im Kulturmedium nicht überleben. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegen Antibiotika oder anderen Toxine, z. B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin verleihen, (b) auxotrophe Defizienzen komplementieren oder (3) entscheidende Nährstoffe bereitstellen, die aus komplexen Nährmedien nicht verfügbar sind, z. B. für Bacilli das Gen, das für D-Alaninracemase kodiert.
Eines der Beispiele eines Selektionsschemas nützt ein Medikament, um das Wachstum einer Wirtszelle zum Stillstand zu bringen. Jene Zellen, die erfolgreich mit einem heterologen Gen transformiert sind, produzieren ein Protein, das Medikamentenresistenz verleiht und überleben folglich das Selektionsregime. Beispiele solch dominanter Selektion verwenden die Medikamente Neomycin, Mycophenolsäure und Hygromycin.
Ein weiteres Beispiel geeigneter selektierbarer Marker für Säugetierzellen sind jene, welche die Identifizierung von für die Aufnahme von GDNFRα-Nucleinsäure kompetenten Zellen ermöglichen, wie z. B. DHFR oder Thymidinkinase. Die Säugetier-Transformanten werden einem Selektionsdruck ausgesetzt, gegen den ausschließlich Transformanten adaptiert sind, da sie den Marker aufgenommen haben, so dass sie überleben. Selektionsdruck wird ausgeübt, indem die Transformanten unter Bedingungen kultiviert werden, bei denen die Konzentration des Selektionsmittels im Medium schrittweise verändert wird, was die Amplifikation des Selektionsgens sowie der DNA, die für GDNFRα kodiert, bewirkt. Amplifikation ist der Prozess, durch den Gene, für die für die Produktion eines für das Wachstum entscheidenden Proteins ein größerer Bedarf besteht, innerhalb des Chromosoms aufeinander folgender Generationen rekombinanter Zellen hintereinander wiederholt werden. Erhöhte GDNFRα-Mengen werden aus der amplifizierten DNA synthetisiert. Andere Beispiele amplifizierbarer Gene umfassen Metallothionein-I und -II, vorzugsweise Primaten-Metallothionein-Gene, Adenosindeaminase, Orthi nindecarboxylase usw. Ein bevorzugtes Vektorsystem wird in US-Patent Nr. 5.561.053 bereitgestellt.
Beispielsweise werden mit dem DHFR-Selektionsgen transformierte Zellen zuerst durch Kultivieren aller Transformanten in einem Kulturmedium identifiziert, das Methotrexat (Mtx), einem kompetitiven Antagonisten von DHFR, enthält. Eine geeignete Wirtszelle bei Anwendung von DHFR der Wildform ist die Chinahamster-Eierstockzellen- (CHO-) Zelllinie, der DHFR-Aktivität fehlt, die wie in Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980), beschrieben hergestellt und vermehrt wird. Die transformierten Zellen werden dann ansteigenden Methotrexat-Konzentrationen ausgesetzt. Dies führt zur Synthese von Vielfachkopien des DHFR-Gens und, gleichzeitig, Vielfachkopien anderer DNA, welche die Expressionsvektoren, wie z. B. die für GDNFRα kodierende DNA, umfasst. Diese Amplifikationstechnik kann mit jeglichem ansonsten geeigneten Wirt, z. B. ATCC-Nr. CCL61 CHO-K1, verwendet werden, und zwar ungeachtet der Gegenwart von endogenem DHFR, falls beispielsweise ein mutiertes DHFR-Gen, das gegen Mtx höchst resistent ist, eingesetzt wird ( EP 117.060 ).
Alternativ dazu können Wirtszellen (insbesondere Wirte der Wildform, die endogenes DHFR enthalten), die mit für GDNFRα kodierenden DNA-Sequenzen, DHFR-Protein der Wildform und einem anderen selektierbaren Marker, wie z. B. Aminoglykosid-3'-phosphotransferase (APH) transformiert oder cotransformiert sind, durch Zellwachstum im Medium selektiert werden, das ein Selektionsmittel für den selektierbaren Marker, wie z. B. einem aminoglykosidischen Antibiotikum, z. B. Kanamycin, Neomycin oder G418 enthält. Siehe US-Patent Nr. 4.965.199.
Ein geeignetes Selektionsgen für die Verwendung in Hefe ist das im Hefeplasmid YRp7 vorhandene trp1-Gen (Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979)). Das trp1-Gen stellt einen Selektionsmarker für einen Mutantenstamm der Hefe bereit, dem die Fähigkeit fehlt, in Tryptophan zu wachsen, beispielsweise ATCC-Nr. 44076 oder PEP4-1. Jones, Genetics 85, 12 (1977). Die Gegenwart der trp1-Läsion im Hefewirtszellengenom stellt dann eine wirksame Umgebung zum Detektieren der Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan bereit. Auf ähnliche Weise werden Leu2-defiziente Hefestämme (ATCC-Nr. 20.622 oder 38.626) durch bekannte, das Leu2-Gen tragende Plasmide komplementiert.
Zusätzlich können Vektoren, die vom zirkulären 1,6 μ-Plasmid pKD1 hergeleitet sind, für die Transformation von Kluyveromyces-Hefen verwendet werden. Bianchi et al., Curr. Genet. 12, 185 (1987). Vor kurzem wurde ein Expressionssystem zur Produktion von rekombinantem Kälber-Chymosin im Großmaßstab für K. lactis beschrieben. Van den Berg, Bio/Technology 8, 135 (1990). Stabile Vielfachkopie-Expressionsvektoren zur Sekretion von reifem, rekombinantem Human-Serumalbumin durch industrielle Kluyveromyces-Stämme sind ebenfalls offenbart worden. Fleer et al., Bio/Technology 9, 968– 975 (1991).
Expression- und Klonierungsvektoren enthalten für gewöhnlich einen Promotor, der vom Wirtsorganismus erkannt wird und operativ an die GDNFRα-Nucleinsäure gebunden ist. Promotoren sind untranslatierte Sequenzen, die stromauf (5') des Startcodons eines Strukturgens lokalisiert sind (im Allgemeinen zwischen ungefähr 100 bis 1000 bp), die die Transkription und Translation einer bestimmten Nucleinsäuresequenz, wie z. B. der GDNFRα-Nucleinsäuresequenz, kontrollieren, an die sie operativ gebunden sind. Solche Promotoren fallen typischerweise in zwei Klassen, induktive und konstitutive. Induktive Promotoren sind Promotoren, die erhöhte Transkriptionslevel aus DNA unter ihrer Kontrolle als Reaktion auf eine gewisse Änderung der Kulturbedingungen, z. B. die An- oder Abwesenheit eines Nährstoffes oder eine Temperaturänderung, initiieren. Zur Zeit ist eine große Zahl von Promotoren wohlbekannt, die von einer Reihe von potentiellen Wirtszellen erkannt werden. Diese Promotoren werden operativ an für GDNFRα kodierende DNA gebunden, indem der Promotor aus der Quell-DNA durch Restriktionsenzymverdau entfernt und die isolierte Promotorsequenz in den Vektor insertiert wird. Sowohl die native GDNFRα-Promotorsequenz, als auch viele andere heterologen Promotoren können verwendet werden, um die Amplifikation und/oder Expression der GDNFRα-DNA zu steuern. Heterologe Promotoren sind jedoch bevorzugt, da sie im Allgemeinen stärkere Transkription und höhere Ausbeuten von GDNFRα erlauben als im Vergleich dazu der native GDNFRα-Promotor.
Zur Verwendung mit prokaryotischen Wirten geeignete Promotoren umfassen β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., Nature 275, 615 (1978); Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)), Alkalische Phosphatase, ein Tryptophan- (trp-) Promotorsystem (Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980); EP 36.776 ) und Hybridpromotoren, wie z. B. den tac-Promotor, deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21–25 (1983). Jedoch sind andere bekannte bakterielle Promotoren geeignet. Ihre Nucleinsäuresequenzen sind publiziert worden, wodurch dem geübten Fachmann ermöglicht wird, sie operativ an DNA zu binden, die für GDNFRα kodiert (Siebenlist et al., Cell 20, 269 (1980)), und zwar unter Verwendung von Linkern oder Adaptoren, um die erforderlichen Restriktionsstellen bereitzustellen. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen werden ferner eine Shine-Delgarno- (S.D.-) Sequenz enthalten, die operativ an die für GDNFRα kodierende DNA gebunden ist.
Es sind Promotorsequenzen für Eukaryoten bekannt. So gut wie alle eukaryotischen Gene weisen eine AT-reiche Region auf, die sich ungefähr 25 bis 30 Basen stromauf der Stelle befindet, wo die Transkription initiiert wird. Eine weitere Sequenz, die sich 70 bis 80 Basen Stromauf des Transkriptionsstarts vieler Gene befindet, ist eine CXCAAT-Region, wobei X ein beliebiges Nucleotid sein kann. Am 3'-Ende der meisten eukaryotischen Gene befindet sich eine AATAAA-Sequenz, die das Signal für die Addition des Poly-A-Schwanzes an das 3'-Ende der kodierenden Sequenz sein kann. Alle dieser Sequenzen werden in geeigneter Weise in eukaryotische Expressionsvektoren insertiert.
Beispiele geeigneter Promotorsequenzen zur Verwendung in Hefe-Wirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphogyceratkinase (Hitzeuran et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)) oder andere gykolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); Holland, Biochemistry 17, 4900 (1978)), wie z. B. Enolase, Glyceraldehyd-3- phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichen Vorteil der durch Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription sind, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, Saure Phosphatase, abbauende Enzyme, die mit dem Stickstoffmetabolismus verbunden sind, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase und für Maltose- und Galactoseverwertung verantwortliche Enzyme. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei der Hefeexpression werden in EP 73.657 weiter beschrieben. Hefeenhancer werden mit Hefepromotoren ebenfalls vorteilhaft verwendet.
GDNFRα-Transkription aus Vektoren in Säugetierwirtszellen wird beispielsweise von Promotoren kontrolliert, die aus Genomen von Viren, wie z. B. Polyoma-Virus (UK 2.221.504, publiziert am 5. Juli 1989), Adenovirus (wie z. B. Adenovirus 2), Rinder-Papilloma-Virus, Vogel-Sarcoma-Virus, Cytomegalovirus, einem Retrovirus, Hepatitis-B-Virus und insbesondere bevorzugt Simian-Virus 40 (SV 40), aus heterologen Promotoren, z. B. dem Actinpromotor oder einem Immunglobulinpromotor, aus Hitzeschock-Promotoren und aus dem Promotor erhalten werden, der normalerweise mit der GDNFRα-Sequenz assoziiert ist, vorausgesetzt, dass solche Promotoren mit den Wirtszellsystemen kompatibel sind.
Die frühen und späten Promotoren des SV40-Virus werden zweckmäßigerweise als ein SV40-Restriktionsfragment erhalten, das auch den Replikationsstartpunkt des SV40-Virus enthält. Fiers et al., Nature 273, 113 (1978); Mulligan et al., Science 209, 1422–1427 (1980); Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7398–7402 (1981). Der unmittelbar frühe Promotor des Human-Cytomegalovirus wird zweckmäßigerweise als ein HindIII-Restriktionsfragment erhalten. Greenaway et al., Gene 18, 355–360 (1982). Ein System zum Exprimieren von DNA in Säugetier-Wirten unter Verwendung des Rinder-Papilloma-Virus als Vektor ist in US-Patent Nr. 4.419.446 offenbart. Eine Modifikation die ses Systems ist in US-Patent Nr. 4.601.978 beschrieben. Siehe auch Gray et al., Nature 295, 503–508 (1982), über das Exprimieren von cDNA, die für Immuninterferon kodiert, in Affenzellen; Reyes et al., Nature 297, 598–601 (1982), über die Expression von Human-β-Interferon-cDNA in Mauszellen unter der Kontrolle eines Thymidinkinase-Promotors aus Herpes-simplex-Virus; Canaani et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5166–5170 (1982), über die Expression des Human-Interferon-β1-Gens in kultivierten Maus- und Kaninchenzellen; und Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6777–6781 (1982), über die Expression von bakteriellen CAT-Sequenzen in CV-1-Affen-Nierenzellen, Hühnerembryo-Fibroblasten, Chinahamster-Eierstockzellen, HeLa-Zellen und Maus-NIH-3T3-Zellen unter Verwendung der langen terminalen Wiederholung des Rous-Sarcoma-Virus als Promotor.
Die Transkription einer für GDNFRα dieser Erfindung kodierenden DNA durch höhere Eukaryoten wird häufig durch Insertieren einer Enhancersequenz in den Vektor verstärkt. Enhancer sind Cis-agierende DNA-Elemente, die für gewöhnlich ungefähr 10 bis 300 bp lang sind, die an einem Promotor agieren, um seine Transkription zu erhöhen. Enhancer sind relativ orientierungs- und positionsunabhängig, und sind 5' (Laimins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 993 (1981)) und 3' (Lusky et al., Mol. Cell. Bio. 3, 1108 (1983)) der Transkriptionseinheit, innerhalb eines Introns (Banerji et al., Cell 33, 729 (1983)) sowie innerhalb der kodierenden Sequenz selbst gefunden worden. Osborne et al., Mol. Cell Bio. 4, 1293 (1984). Viele Enhancersequenzen sind aus Säugetier-Genen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise wird man jedoch einen Enhancer aus einem eukaryotischen Zellvirus verwenden. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer an der späten Seite des Replikationsstartpunkts (bp 100–270), den frühen Promotor-Enhancer aus Cytomegalovirus, den Polyoma-Enhancer an der späten Seite des Replikationsstartpunkts und Adenovirus-Enhancer. Siehe auch Yaniv, Nature 297, 17–18 (1982), über die Enhancer-Elemente zur Aktivierung eukaryotischer Promotoren. Der Enhancer kann an Position 5' oder 3' zur für GDNFRα kodierenden Sequenz gespleißt werden, ist aber vorzugsweise an einer Stelle 5' des Promotors lokalisiert.
In eukaryotischen Wirtszellen (Hefe, Pilze, Insekt, Pflanze, Tier, Mensch oder kernhaltige Zellen aus anderen multizellulären Organismen) verwendete Expressionsvektoren werden auch Sequenzen enthalten, die für die Termination der Transkription und zum Stabilisieren der mRNA benötigt werden. Solche Sequenzen sind im Allgemeinen aus den 5'- und gelegentlich 3'-untranslatierten Regionen eukaryotischer oder viraler DNAs oder cDNAs verfügbar (Crowley et al., Cell 76, 1001–1011 (1994)). Diese Regionen enthalten Nucleinsäuresequenzen, die als polyadenylierte Fragmente im untranslatierten Abschnitt der für GDNFRα kodierenden mRNA transkribiert werden.
Die Konstruktion geeigneter Vektoren, die eine oder mehrere der oben aufgezählten Komponenten enthalten, setzt standardmäßige Ligationstechniken ein. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, maßgeschneidert und in der Form neu ligiert, die zur Erzeugung des benötigten Plasmids gewünscht ist.
Zur Analyse zur Bestätigung korrekter Sequenzen in konstruierten Plasmiden werden die Ligationsgemische verwendet, um E. coli K12, Stamm 294 (ATCC 31.446) zu transformieren und erfolgreiche Transformanten werden wie angemessen durch Ampicillin- oder Tetracyclin-Resistenz selektiert. Es werden Plasmide aus den Transformanten präpariert, durch Restriktionsendonucleaseverdau analysiert und/oder mit dem Verfahren von Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981) oder mit dem Verfahren von Maxam et al., Methods in Enzymology 65, 499 (1980) sequenziert.
Insbesondere nützlich bei der Ausführung dieser Erfindung sind Expressionsvektoren, die für eine vorübergehende Expression von DNA, die für GDNFRα kodiert, sorgen. Im Allgemeinen umfasst die vorübergehende Expression die Verwendung eines Expressionsvektors, der dazu fähig ist, sich in einer Wirtszelle effizient zu replizieren, so dass die Wirtszelle viele Kopien des Expressionsvektors akkumuliert und dann wieder hohe Level des vom Expressionsvektor kodierten Polypeptids synthetisiert. Sambrook et al., siehe oben, S. 16.17–16.22. Vorübergehende Expressionssysteme, die einen geeigneten Expressionsvektor und eine Wirtzelle umfassen, ermöglichen die bequeme positive Identifizierung von Polypeptiden, die von klonierten cDNAs kodiert werden, sowie das schnelle Screenen solcher Polypeptide auf gewünschte biologische oder physiologische Eigenschaften. Folglich sind vorübergehende Expressionssysteme in der Erfindung insbesondere zum Zwecke des Identifizierens von Analoga und Varianten von GDNFRα nützlich, die biologisch aktive GDNFRα sind.
Andere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die für die Adaptierung für die Synthese von GDNFRα in rekombinanter Wirbeltier-Zellkultur geeignet sind, werden in Gething et al., Nature 293, 620–625 (1981); Mantei et al., Nature 281, 40–46 (1979); EP 117.060 ; und EP 117.058 beschrieben. Ein besonders zweckdienliches Plasmid für die Säugetier-Zellkulturexpression von GDNFRα ist pRK5 ( EP 307.247 ) oder pSVI6B. WO 91/08291, publiziert am 13. Juni 1991.
Geeignete Wirtszellen zum Klonieren und Exprimieren der DNA in Vektoren hierin sind die oben beschriebenen Prokaryoten-, Hefe- oder höheren eukaryotischen Zellen. Zu diesem Zweck geeignete Prokaryoten umfassen Eubakterien, wie z. B. Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, z. B. Salmonella typhimurium, Serratia, z. B. Serratia marcescans und Shigella, sowie Bacilli, wie z. B. B. subtilis und B. licheniformis (z. B. B. licheniformis 4IP, offenbart in DD 266.710, publiziert am 12. April 1989), Pseudomonas, wie z. B. P. aeruginosa, und Streptomyces. Ein bevorzugter E. coli-Klonierungswirt ist E. coli 294 (ATCC 31.446), obwohl andere Stämme, wie z. B. E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) und E. coli W3110 (ATCC 27.325) geeignet sind. Diese Beispiele sind veranschaulichend und nicht einschränkend. Stamm W3110 ist ein besonders bevorzugter Wirt oder Elternwirt, da er ein gebräuchlicher Wirtsstamm für rekombinante DNA-Produktfermentationen ist. Vorzugsweise sollt die Wirtszelle minimale Mengen proteolytischer Enzyme ausscheiden. Beispielsweise kann Stamm W3110 modifiziert werden, um eine genetische Mutation in den für Proteine kodierenden Genen zu bewirken, wobei Beispiele solcher Wirte E. coli W3110, Stamm 27C7 umfassen. Der vollständige Genotyp von 27C7 ist tonAΔ ptr3 pho3 phoAΔE15 Δ(argF-lac)169 ompTΔ degP41kanT. Stamm 27C7 wurde am 30. Oktober 1991 in der American Type Culture Collec tion als ATCC-Nr. 55.244 hinterlegt. Alternativ dazu kann der E. coli-Stamm, der eine in US-Patent Nr. 4.946.783, erteilt am 7. August 1990, offenbarte mutierte periplasmatische Protease aufwiest, eingesetzt werden. Alternativ dazu sind ferner Klonierungsverfahren, z. B. PCR oder andere Nucleinsäurepolymerasereaktionen geeignet.
Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mikroorganismen, wie z. B. Fadenpilze oder Hefe geeignete Klonierungs- oder Expressionswirte für Vektoren, die für GDNFRα kodieren. Saccharomyces cerevisiae oder die gewöhnliche Bäckerhefe wird unter den niederen eukaryotischen Wirtsmikroorganismen am häufigsten verwendet. Jedoch sind eine Reihe anderer Genera, Spezies und Stämme allgemein erhältlich und hierin zweckdienlich, wie z. B. Schizosaccharomyces pombe (Beach et al., Nature 290, 140 (19981); EP 139.383 , publiziert am 2. Mai 1985); Kluyveromyces-Wirte (US-Patent Nr. 4.943.529; Fleer et al., siehe oben), wie z. B. K. Lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol. 737 (1983)), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., siehe oben), K. thermotolerans und K. marxianus; yarrowia ( EP 402.226 ); Pichia pastoris ( EP 183.070 ; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28, 265–278 (1988)); Candida; Trichoderma reesia ( EP 244.234 ); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5259–5263 (1979)); Schwanniomyces, wie z. B. Schwanniomyces occidentalis ( EP 394.538 , publiziert am 31. Oktober 1990); und Fadenpilze, wie z. B. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357, publiziert am 10. Jänner 1991) und Aspergillus-Wirte, wie z. B. A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 284–289 (1983); Tilburn et al., Gene 26, 205– 221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470–1474 (1984)) und A. niger. Kelly et al., EMBO J. 4, 475–479 (1985).
Geeignete Wirtszellen für die Expression von glykosyliertem GDNFRα werden von mehrzelligen Organismen hergeleitet. Solche Wirtszelle sind zu komplexen Prozessierungs- und Glykosylierungsaktivitäten fähig. Im Prinzip ist jegliche höhere eukaryotische Zellkultur brauchbar, ob sie aus einer Vertebraten- oder Invertebratenkultur stammt. Bei spiele von Invertebratenzellen umfassen Pflanzen- und Insektenzellen. Zahlreiche Baculovirusstämme und Varianten und entsprechende permissive Insektenwirtszellen aus Wirten, wie z. B. Spodoptera frugiperda (Raupe), Aedes aegypti (Moskito), Aedes albopictus (Moskito), Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) und Bombyx mori sind identifiziert worden. Siehe z. B. Luckow et al., Bio/Technology 6, 47–55 (1988); Miller et al., in: Genetic Engineering, Setlow et al. (Hrsg.), Bd. 8, Plenum Publishing, S. 277–279 (1986); und Maeda et al., Nature 315, 592–594 (1985). Eine Reihe von Virusstämmen zur Transfektion sind öffentlich zugänglich, z. B. die L-1-Variante von Autographa california NPV und der Bm-5-Stamm von Bombyx mori NPV, und solche Viren können hierin als Virus gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, insbesondere für die Transfektion von Spodoptera frugiperda-Zellen.
Pflanzenzellkulturen von Baumwolle, Mais, Kartoffel, Sojabohne, Petunie, Tomate und Tabak können als Wirte genützt werden. Typischerweise werden Pflanzenzellen durch Inkubation mit bestimmten Stämmen des Bakteriums Agrobacterium tumefaciens transfiziert, der vorher dahingehend manipuliert worden ist, als dass er die für GDNFRα kodierende DNA enthält. Während der Inkubation der Pflanzenzellkultur mit A. tumefaciens wird die für GDNFRα kodierende DNA in den Pflanzenzellwirt transferiert, so dass er transfiziert und unter geeigneten Bedingungen die für GDNFRα kodierende DNA exprimieren wird. Zusätzlich sind mit Pflanzenzellen kompatible Regulations- und Signalsequenzen verfügbar, wie z. B. der Nopalinsynthase-Promotor und Polyadenylierungssignale. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen. 1, 561 (1982). Zusätzlich sind aus der Stromaufregion des T-DNA 780-Gens isolierte DNA-Segmente fähig, die Transkriptionslevel von in Pflanzen exprimierbaren Genen in rekombinante DNA enthaltendem Pflanzengewebe zu aktivieren oder zu erhöhen. EP 321.196 , publiziert am 21. Juni 1989. Jedoch bestand das größte Interesse an Vertebratenzellen und die Vermehrung von Vertebratenzellen in Kultur (Gewebekultur) ist zu einem Routineverfahren geworden. Siehe z. B. Tissue Culture, Academic Press, Kruse und Patterson (Hrsg.) (1973). Beispiele für brauchbare Säugetier-Wirtszelllinien sind die durch SV40 transformierte Affen-Nieren-CV1-Linie (COS-7, ATCC CRL 1651); Human-Embryonieren-Linie (293- oder 293-Zel len, subkloniert zum Wachstum in Suspensionskultur, Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59 (1977)); Babyhamster-Nierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); Chinahamster-Eierstockzellen/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243–251 (1880)); Affen-Nierenzellen (CV1 ATCC CCL 70); Nierenzellen Afrikanischer Grüner Meerkatzen (VERO-76, ATCC CRL-1587); Human-Zervikalkarzinomzellen (HELA, ACC CCL 2); Hunde-Nierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelratten-Leberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); Human-Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); Human-Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Maus-Mammatumor (MMT 060562, ATCC CCL 51); TRI-Zellen (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383, 44–68 (1982)); MRC 5-Zellen; FS4-Zellen; und Human-Hepatomlinie (Hep G2).
Wirtszellen werden transfiziert und vorzugsweise mit den oben beschriebenen Expressions- oder Klonierungsvektoren für die GDNFRα-Produktion transformiert und in herkömmlichen Nährmedien kultiviert, die in geeigneter Weise für das Induzieren von Promotoren, Selektieren von Transformanten oder Amplifizieren von Genen, die für die gewünschten Sequenzen kodieren, modifiziert sind.
Transfektion bezieht sich auf die Aufnahme eines Expressionsvektors durch eine Wirtszelle, ob nun irgendwelche kodierenden Sequenzen tatsächlich exprimiert werden oder nicht. Zahlreiche Verfahren der Transfektion sind dem gewöhnlich Fachkundigen bekannt, beispielsweise CaPO₄ und Elektroporation. Eine erfolgreiche Transfektion wird im Allgemeinen erkannt, wenn irgendein Anzeichen der Tätigkeit dieses Vektors innerhalb der Wirtszelle auftritt.
Transformation bedeutet das Einführen von DNA in einen Organismus, so dass die DNA entweder als extrachromosomales Element oder als chromosomaler Integrant replizierbar ist. Abhängig von der verwendeten Wirtszelle wird die Transformation mittels Standardtechniken durchgeführt, die für solche Zellen geeignet sind. Die Calciumbehandlung setzt Calciumchlorid ein, wie im Abschnitt 1.82 von Sambrook et al., siehe oben, beschrieben wird, oder es wird die Elektroporation im Allgemeinem für Prokaryoten oder andere Zellen verwendet, die feste Zellwände enthalten. Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird für die Transformation bestimmter Pflanzenzellen verwendet, wie von Shaw et al., Gene 23, 315 (1983) und in WO 89/05859, publiziert am 29. Juni 1989, beschrieben wird. Zusätzlich können Pflanzenzellen unter Anwendung von Ultraschallbehandlung, wie beschrieben in WO 91/00358, publiziert am 10. Jänner 1991, transfiziert werden.
Für Säugetierzellen ohne solche Zellwände wird das Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren von Graham et al., Virology 52, 456–457 (1978) bevorzugt. Allgemeine Aspekte von Säugetier-Wirtszellsystem-Transformationen sind in US-Patent Nr. 4.399.216, erteilt am 16. August 1983, beschrieben worden. Transformationen in Hefe werden typischerweise gemäß den Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 3829 (1979), durchgeführt. Jedoch könne andere Verfahren zur Einführung von DNA in Zellen, wie z. B. Kernmikroinjektion, Elektroporation, Bakterienprotoplastenfusion mit intakten Zellen oder Polykationen, z. B. Polybren, Polyorthinin usw. ebenfalls verwendet werden. Zu verschiedenen Techniken zum Transformieren von Säugetierzellen siehe Keown et al., Methods in Enzymology 185, 527–537 (1990) und Mansour et al., Nature 336, 348–352 (1988).
Zur Produktion des GDNFRα-Polypeptids dieser Erfindung verwendete prokaryotische Zellen werden in geeigneten Medien kultiviert, wie sie allgemein in Sambrook et al., siehe oben, beschrieben sind.
Die zur Produktion des GDNFRα dieser Erfindung verwendeten Säugetier-Wirtszellen können in einer Reihe von Medien kultiviert werden. Im Handel erhältliche Medien, wie z. B. Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium (MEM) (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) und Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, (Sigma)) sind für das Kultivieren der Wirtszellen geeignet. Zusätzlich können beliebige der in Ham et al., Meth. Enz. 58, 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102, 255 (1980), US-Patent Nr. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; oder 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; oder US-Patent Re. 30.985 beschriebenen Medien als Kulturmedien für die Wirtszellen verwendet werden. Alle dieser Medien können wie erforderlich mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (Wie z. B. Insulin, Transferrin oder Epidermis-Wachstumsfaktor), Salzen (wie z. B. Natriumchlorid, Calcium, Magnesium und Phosphat), Puffern (wie z. B. HEPES), Nucleosiden (wie z. B. Adenosin und Thymidin), Antibiotika (wie z. B. GENTAMYCIN^TM-Medikament), Spurenelementen (definiert als anorganische Verbindungen, die für gewöhnlich in Endkonzentrationen im mikromolaren Bereich definiert sind) und Glucose oder einer gleichwertigen Energiequelle ergänzt werden. Jegliche anderen notwendigen Ergänzungen können ebenfalls in geeigneten Konzentrationen aufgenommen werden, die dem Fachkundigen für gewöhnlich bekannt sind. Die Kulturbedingungen, wie z. B. Temperatur, pH und dergleichen sind jene, die vorher mit der für die Expression gewählten Wirtszelle verwendet wurden und sind dem gewöhnlich Fachkundigen bekannt.
Im Allgemeinen finden sich Prinzipien, Protokolle und praktische Techniken zur Maximierung der Produktivität der Säugetier-Zellkulturen in Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler (Hrsg.), IRL Press (1991).
Die Wirtzellen auf die in dieser Offenbarung Bezug genommen wird, umfassen Zellen in Kultur sowie Zellen, die innerhalb eines Wirtstiers erhalten werden.
Genamplifikation und/oder Expression kann in der Probe direkt gemessen werden, beispielsweise durch herkömmliches Southern-Blotting, Northern-Blotting, um die Transkription von mRNA zu quantifizieren (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201– 5205 (1980)), Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer geeignet markierten Sonde auf Basis der hierin bereitgestellten Sequenzen. Es können verschiedene Marker eingesetzt werden, am häufigsten Radioisotope, insbesondere ³²P. Jedoch können auch andere Techniken eingesetzt werden, wie z. B. die Verwendung Biotin-modifizierter Nucleotide zur Einführung in ein Polynucleotid. Das Biotin dient dann als die Stelle zur Bindung an Avidin oder Antikörper, die mit einer breiten Vielfalt von Markern, wie z. B. Radionukliden, Fluoreszierern, Enzymen und dergleichen markiert sein können. Alternativ dazu können Antikörper eingesetzt werden, die spezifische Doppelhelices erkennen können, einschließlich DNA-Doppelhelices, RNA-Doppelhelices und DNA-RNA-Hybriddoppelhelices oder DNA-Protein-Doppelhelices. Die Antikörper können ihrerseits markiert sein und der Test kann durchgeführt werden, wobei die Doppelhelix an einer Oberfläche gebunden ist, so dass bei der Bildung der Doppelhelix an der Oberfläche die Gegenwart des an die Doppelhelix gebundenen Antikörpers detektiert werden kann.
Genexpression kann alternativ dazu durch immunologische Verfahren gemessen werden, wie z. B. immunhistochemische Färbung von Gewebeschnitten und Testen von Zellkultur- oder Körperflüssigkeiten, um die Expression des Genprodukts direkt zu quantifizieren. Mit immunhistochemischen Färbetechniken wird eine Zellprobe hergestellt, typischerweise durch Dehydratisierung und Fixierung, gefolgt von Reaktion mit markierten Antikörpern, die für das gekoppelte Genprodukt spezifisch sind, wobei die Marker für gewöhnlich optisch detektierbar sind, wie z. B. Enzymmarker, Fluoreszenzmarker, Lumineszenzmarker und dergleichen. Eine besonders empfindliche Färbetechnik, die zur Verwendung in der vorliegende Erfindung geeignet ist, wird von Hsu et al., Am. J. Clin. Path. 75, 734–738 (1980), beschrieben.
Für immunhistochemische Färbung und/oder Test von Probenflüssigkeiten zweckdienliche Antikörper können entweder polyklonal oder monoklonal sein und können wie hierin beschrieben hergestellt werden.
GDNFRα (z. B. GDNFRα ECD) wird aus dem Kulturmedium vorzugsweise als sekretiertes Polypeptid gewonnen, obgleich es auch aus Wirtszellenlysaten gewonnen werden kann. Wenn das GDNFRα membrangebunden ist, kann es von der Membran unter Verwendung einer Tensidlösung (z. B. Triton-X 100) freigesetzt werden.
Wenn GDNFRα in einer rekombinanten Zelle produziert wird, die nicht humanen Ursprungs ist, ist das GDNFRα vollkommen frei von Proteinen oder Polypeptiden humanen Ursprungs. Es ist jedoch notwendig, GDNFRα aus rekombinanten Zellproteinen oder Polypeptiden zu reinigen, um Präparate zu erhalten, die im Wesentlichen homogen bezüglich GDNFRα sind. Als erster Schritt kann das Kulturmedium oder Lysat zentrifugiert werden, um partikuläre Zelltrümmer zu entfernen. GDNFRα kann dann von verunreinigenden löslichen Proteinen und Polypeptiden mit den folgenden Verfahren gereinigt werden, die beispielgebende geeigneter Reinigungsverfahren sind: durch Fraktionierung an einer Ionentauschersäule; Ethanolpräzipitation; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie an Silika; Chromatofokussierung; Immunaffinität; Epitop-Marker-Bindungsharz; SDS-PAGE; Ammonsulfatpräzipitation; Gelfiltration, beispielsweise unter Verwendung von Sephadex G-75; und Protein A-Sepharosesäulen, um Kontaminanten, wie z. B. IgG zu entfernen.
GDNFRα-Varianten, in denen Reste deletiert, insertiert oder substituiert worden sind, werden in derselben Weise wie Nativsequenz-GDNFRα gewonnen, wobei jegliche wesentlichen Veränderungen der von der Variation hervorgerufenen Eigenschaften berücksichtigt werden. Immunaffinitätsharze, wie z. B. ein monoklonales Anti-GDNFRα-Harz, kann eingesetzt werden, um die GDNFRα-Variante durch dessen Bindung an zumindest einem verbleibenden Epitop zu adsorbieren.
Ein Proteaseinhibitor, wie z. B. Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) kann ebenfalls zweckdienlich sein, um proteolytischen Abbau während der Reinigung zu hemmen und es können Antibiotika aufgenommen werden, um das Wachstum von adventiven Kontaminanten zu verhindern.
Kovalente Modifizierungen der GDNFRα-Polypeptide sind im Schutzumfang dieser Erfindung enthalten. Sowohl Nativsequenz-GDNFRα, als auch Aminosäuresequenzvarianten von GDNFRα können kovalent modifiziert werden. Eine Art der kovalenten Modifi zierung von GDNFRα wird in das Molekül durch Reaktion der Ziel-Aminosäurereste des GDNFRα mit einem organischen Derivatisierungsmittel eingeführt, das dazu fähig ist, mit dem N-terminalen Rest, C-terminalen Rest oder mit ausgewählten Seitenketten zu reagieren.
Cysteinyl-Reste werden am häufigsten mit α-Haloacetaten (und entsprechenden Aminen) zur Reaktion gebracht, wie z. B. Chloressigsäure oder Chloracetamid, um Carboxymethyl- oder Carboxyamidomethylderivate zu liefern. Cysteinyl-Reste werden auch durch Reaktion mit Bromtrifluoraceton, α-Brom-β-(5-imidozoyl)propionsäure, Chloracetylphosphat, N-Alkylmaleimiden, 4-Nitro-2-pyridyldisulfid, Methyl-2-pyridyldisulfid, p-Chlormercuribenzoat, 2-Chlormercuri-4-nitrophenol oder Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazo) derivatisiert.
Histidyl-Reste werden durch Reaktion mit Diethylpyrocarbonat bei pH 5,5–7,0 derivatisiert, da dieses Mittel relativ spezifisch für die Histidyl-Seitenkette ist. p-Bromphenacylbromid ist ebenfalls zweckdienlich; die Reaktion wird vorzugsweise in 0,1 M Natriumcacodylat bei pH 6,0 durchgeführt.
Lysinyl- und aminoterminale Reste werden mit Bernstein- oder anderen Carbonsäureanhydriden zur Reaktion gebracht. Die Derivatisierung mit diesen Mitteln hat die Wirkung, die Ladung der Lysinyl-Reste umzukehren. Andere geeignete Reagenzien zum Derivatisieren von α-Amino-enthaltenden Resten umfassen Imidoester, wie z. B. Methylpicolinimidat, Pyridocalphosphat, Pyridoxal, Chlorborhydrid, Trinitrobenzolsulfonsäure, O-Methyisoharnstoff, 2,4-Pentandion und Transaminase-katalysierte Reaktion mit Glyoxylat.
Arginyl-Reste werden durch Reaktion mit einem oder mehreren herkömmlichen Reagenzien modifiziert und unter diesen sind Phenylglyoxal, 2,3-Butandion, 1,2-Cyclohexandion und Ninhydrin. Derivatisierung von Arginin-Resten erfordert, dass die Reaktion wegen dem hohen pK_a der funktionellen Guanidingruppe unter alkalischen Bedin gungen durchgeführt wird. Darüber hinaus können diese Reagenzien mit den Gruppen von Lysin sowie der Epsilon-Aminogruppe des Arginins reagieren.
Die spezifische Modifizierung von Tyrosyl-Resten kann durchgeführt werden, und zwar mit besonderem Interesse der Einführung spektraler Marker in Tyrosyl-Reste durch Reaktion mit aromatischen Diazoniumverbindungen oder Tetranitromethan. Am häufigsten werden N-Acetylimidizol und Tetranitromethan verwendet, um O-Acetyl-tyrosyl-Spezies bzw. 3-Nitro-Derivate zu bilden. Tyrosyl-Reste werden unter Verwendung von ¹²⁵I oder ¹³¹I iodiniert, um markierte Proteine zur Verwendung im Radioimmuntest herzustellen, wobei das Chloramin T-Verfahren geeignet ist.
Carboxyl-Seitengruppen (Aspartyl und Glutamyl) werden selektiv durch Reaktion mit Carbodiimiden (R-N=C=N-R') modifiziert, wobei R und R' verschiedene Alkylgruppen sind, wie z. B. 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)carbodiimid. Darüber hinaus werden Aspartyl- und Glutamyl-Reste durch Reaktion mit Ammoniumionen in Asparaginyl- und Glutaminyl-Reste umgewandelt.
Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln ist für die Vernetzung von GDNFRα an eine wasserunlösliche Trägermatrix oder Oberfläche zweckdienlich zur Verwendung im Verfahren zur Reinigung von Anti-GDNFRα-Antikörpern und umgekehrt. Im Allgemeinen verwendeten Vernetzungsmittel umfassen z. B. 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, beispielsweise Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester, einschließlich Disuccinimidylester, wie z. B. 3,3'-Dithiobis(succinimidylproprionat) und bifunktionelle Maleimide, wie z. B. Bis-N-maleimido-1,8-octan. Derivatisierungsmittel, wie z. B. Methyl-3-((p-azidophenyl)dithio)propioimidat liefern photoaktivierbare Zwischenprodukte, die zur Bildung von Querverbindungen in Gegenwart von Licht fähig sind. Alternativ dazu werden reaktive wasserunlösliche Matrices, wie z. B. Bromcyan-aktivierte Kohlenhydrate und die in US-Patent Nr. 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537 und 4.330.440 beschriebenen reaktiven Substrate für die Proteinimmobilisierung eingesetzt.
Glutaminyl- und Asparaginyl-Reste werden häufig zu den entsprechenden Glutamyl- bzw. Aspartyl-Resten deamidiert. Dieser Reste werden unter neutralen oder basischen Bedingungen deamidiert. Die deamidierte Form dieser Reste liegt im Schutzumfang dieser Erfindung.
Andere Modifizierungen umfassen Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl- oder Threonyl-Resten, Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidin-Seitenketten (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, S. 79–86 (1983)), Acetylierung des N-terminalen Amins und Amidierung beliebiger C-terminaler Carboxylgruppen.
Eine weitere Art der kovalenten Modifizierung des GDNFRα-Polypeptids, die im Schutzumfang dieser Erfindung enthalten ist, umfasst die Veränderung des nativen Glykosylierungsmusters des Polypeptids. Mit Verändern ist das Deletieren einer oder mehrerer Kohlenhydratgruppierungen gemein, die sich im nativen GDNFRα finden und/oder die Addition einer oder mehrerer Glykosylierungsstellen, die im nativen GDNFRα nicht vorhanden sind.
Die Glykosylierung von Polypeptiden ist typischerweise entweder N-gebunden oder O-gebunden. N-gebunden bezieht sich auf die Anheftung der Kohlenhydratgruppierung an die Seitenkette eines Asparaginrestes. Die Tripeptidsequenzen Asparagin-X-Serin und Asparagin-X-Threonin, wobei X eine beliebige Aminosäure außer Prolin ist, sind die Erkennungssequenzen für die enzymatische Anheftung der Kohlenhydratgruppierung an die Asparaginseitenkette. Folglich erzeugt die Gegenwart von einem dieser Tripeptidsequenzen in einem Polypeptid eine potentielle Glykosylierungsstelle. O-gebundene Glykosylierung bezieht sich auf die Anheftung von einem der Zucker N-Acetylgalactosa min, Galactose oder Xylose an eine Hydroxylaminosäure, am häufigsten Serin oder Threonin, obgleich 5-Hydroxyprolin oder 5-Hydroxylysin auch verwendet werden können.
Die Addition von Glykosylierungsstellen an das GDNFRα-Polypeptid wird zweckdienlicherweise durch Verändern der Aminosäuresequenz erzielt, so dass sie eine oder mehrere der oben beschriebenen Tripeptidsequenzen enthält (für N-gebundene Glykosylierungsstellen). Die Veränderung kann auch durch Addition von oder Substitution durch einen oder mehrere Serin- oder Threoninreste an der nativen GDNFRα-Sequenz durchgeführt werden (für O-gebundene Glykosylierungsstellen). Der Einfachheit halber wird die GDNFRα-Aminosäuresequenz vorzugsweise durch Änderungen am DNA-Niveau, insbesondere durch Mutieren der für das GDNFRα-Polypeptid kodierenden DNA an vorgewählten Basen verändert, so dass Codons erzeugt werden, die in die gewünschten Aminosäuren translatiert werden. Die DNA-Mutationen) kann/können durch die oben und in US-Patent Nr. 5.364.943, siehe oben, beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
Ein weiteres Mittel zum Erhöhen der Anzahl von Kohlenhydratgruppen am GDNFRα-Polypeptid ist die chemische oder enzymatische Kopplung von Glykosiden an das Polypeptid. Diese Verfahren sind vorteilhaft, da sie nicht die Produktion des Polypeptids in einer Wirtszelle erfordern, die Glykosylierungsfähigkeiten für N-gebundene oder O-gebundene Glykosylierung aufweisen. Abhängig von der verwendeten Kopplungsart kann/ können der/die Zucker an (a) Arginin und Histidin, (b) freie Carboxylgruppen, (c) freie Sulfhydrylgruppen, wie z. B. jene des Cysteins, (d) freie Hydroxylgruppen, wie z. B. jene von Serin, Threonin oder Hydroxyprolin, (e) aromatische Reste, wie z. B. jene von Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan oder (f) die Amidgruppe von Glutamin angeheftet werden. Diese Verfahren werden in WO 87/05330, publiziert am 11. September 1987, und in Aplin et al., CRC Crit. Rev. Biochem., 259–306 (1981), beschrieben.
Die Entfernung von Kohlenhydratgruppen, die im GDNFRα-Polypeptid vorhanden sind, kann chemisch oder enzymatisch erzielt werden. Die chemische Deglykosylierung erfordert das Exponieren des Polypeptids mit der Verbindung Trifluormethansulfonsäure oder einer äquivalenten Verbindung. Diese Behandlung resultiert in der Spaltung der meisten oder aller Zucker mit Ausnahme der des Bindungszuckers (N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin), während das Polypeptid intakt belassen wird. Chemische Deglykosylierung wird von Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259, 52 (1987) und von Edge et al., Anal. Biochem. 118, 131 (1981) beschrieben. Die enzymatische Spaltung von Kohlenhydratgruppen an Polypeptiden kann durch Verwendung einer Reihe von Endo- und Exo-Glykosidasen erzielt werden, wie von Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138, 350 (1987) beschrieben wird.
Die Glykosylierung an potentiellen Glykosylierungsstellen kann durch Verwendung der Verbindung Tunimycin verhindert werden, wie von Duskin et al., ). Biol. Chem. 257, 3105 (1982), beschrieben wird. Tunimycin blockiert die Bildung von Protein-N-Glykosid-Bindungen.
Eine weitere Art der kovalenten Modifizierung von GDNFRα umfasst das Binden des GDNFRα-Polypeptids an eines von einer Reihe nicht-proteinischer Polymere, z. B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene in einer Weise, wie sie in US-Patent Nr. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 oder 4.179.337 beschrieben ist.
Varianten können wie hierin gelehrt getestet werden. Eine Änderung der immunologischen Charakters des GDNFRα-Moleküls, wie z. B. Affinität für einen gegebenen Antikörper, kann durch einen Immuntest der kompetitiven Art gemessen werden. Andere potentielle Modifizierungen von Protein- oder Polypeptideigenschaften, wie z. B. Redox- oder Thermostabilität, Hydrophobizität, Anfälligkeit für proteolytischen Abbau oder die Neigung, mit Trägern oder zu Multimeren zu aggregieren, werden durch fachbekannte Verfahren getestet.
Diese Erfindung umfasst chimäre Polypeptide, die an ein heterologes Polypeptid fusioniertes GDNFRα umfassen. Ein chimäres GDNFRα ist eine Art der wie oben beschriebenen GDNFRα-Variante. In einer ihrer Ausführungsformen umfasst das chimäre Polypeptid eine Fusion des GDNFRα mit einem Marker-Polypeptid, das ein Epitop bereitstellt, an das ein Anti-Marker-Antikörper der Molekül selektiv binden kann. Der Epitop-Marker wird im Allgemeinen am Amino- oder Carboxyterminus des GDNFRα bereitgestellt. Solche Epitop-markierte Formen von GDNFRα sind wünschenswert, das die Gegenwart davon unter Verwendung eines markierten Antikörpers gegen das Marker-Polypeptid detektiert werden kann. Ferner ermöglich die Bereitstellung des Epitop-Markers die einfache Reinigung von GDNFRα mittels Affinitätsreinigung unter Verwendung des Anti-Marker-Antikörpers. Affinitätsreinigungstechniken und Antikörper umfassende diagnostische Tests werden hierin später beschrieben.
Marker-Polypeptide und ihre jeweiligen Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt. Beispiele umfassen das Grippe-HA-Marker-Polypeptid und sein Antikörper 12CA5 (Field et al., Mol. Cell. Biol. 8, 2159–2165 (1988)); den c-myc-Marker und die Antikörper 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 und 9E10 dagegen (Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5, 3610–3616 (1985)); und der Herpex-simplex-Virus-Glykoprotein D- (gD-) Marker und sein Antikörper. Paborsky et al., Protein Engineering 3(6), 547–553 (1990). Andere Marker-Polypeptide sind offenbart worden. Beispiele umfassen das Flag-Polypeptid (Hopp et al., BioTechnology 6, 1204–1210 (1988)); das KT3-Epitop-Peptid (Martin et al., Science 255, 192–194 (1992)); ein α-Tubulin-Epitop-Peptid (Skinner et al., J. Biol. Chem. 266, 15163–15166 (1991)); und der T7-Gen 10-Protein-Peptidmarker. Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6393–6397 (1990). Sobald das Markerpolypeptid ausgewählt worden ist, kann unter Anwendung der hierin offenbarten Techniken ein Antikörper dagegen erzeugt werden. Ein C-terminaler Poly-Histidinsequenz-Marker wird bevorzugt. Poly-Histidinsequenzen ermöglichen die Isolierung des markierten Proteins beispielsweise mittels Ni-NTA-Chromatographie, wie beschrieben wurde (Lindsay et al., Neuron 17, 571–574 (1996)).
Die allgemeinen zur Konstruktion und Produktion von Epitop-markiertem GDNFRα geeigneten sind dieselben wie jene, die hierin oben offenbart sind. GDNFRα-Markerpolypeptidfusionen werden am zweckmäßigsten konstruiert, indem die für den GDNFRα-Abschnitt kodierende cDNA-Sequenz im Leseraster zur Markerpolypeptid-DNA-Sequenz fusioniert und das resultierende DNA-Fusionskonstrukt in geeigneten Wirtszellen exprimiert wird. Für gewöhnlich wird beim Herstellen der GDNFRα-Markerpolypeptid-Chimären der vorliegende Erfindung die für GDNFRα kodierende Nucleinsäure an ihrem 3'-Ende an Nucleinsäure fusioniert, die für den N-Terminus des Markerpolypeptids kodiert, jedoch sind 5'-Fusionen ebenfalls möglich.
Epitop-markiertes GDNFRα kann unter Verwendung des Anti-Marker-Antikörpers bequem durch Affinitätschromatographie gereinigt werden. Die Matrix, an die der Affinitätsantikörper gebunden wird, ist am häufigsten Agarose, jedoch sind andere Matrices verfügbar (z. B. Controlled-Pore-Glass oder Poly(styroldivinyl)benzol). Das Epitop-markierte GDNFRα kann aus der Affinitätssäule beispielsweise durch Variieren des Puffer-pH oder der Ionenstärke oder durch Zusatz chaotropischer Mittel eluiert werden.
Chimären, die aus einer an eine geeignete Immunglobulin-Konstantdomänensequenz (Immunadhäsine) gebundenen Rezeptor konstruiert werden, sind fachbekannt. In der Literatur beschriebene Immunadhäsine umfassen Fusionen des T-Zellen-Rezeptors* (Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2936–2940 (1987)); CD4* (Capon et al., Nature 337, 525–531 (1989); Traunecker et al., Nature 339, 68–70 (1989); Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9, 347–353 (1990); Byrn et al., Nature 344, 667–670 (1990)); L-Selectin (Homing-Rezeptor) (Watson et al., J. Cell. Biol. 110, 2221–2229 (1990); Watson et al., Nature 349, 164–167 (1991)); CD44* (Aruffo et al., Cell 61, 1303–1313 (1990)); CD28* und B7* (Linsley et al., J. Exp. Med. 173, 721–730 (1991)); CTLA-4* (Lisley et al., J. Exp. Med. 174, 561–569 (1991)); CD22* (Stamenkovic et al., Cell 66, 1133–1144 (1991)); TNF-Rezeptor (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10535–10539 (1991); Lesslauer et al., J. Immunol. 27, 2883–2886 (1991); Peppel et al., J. Exp. Med. 174, 1483–1489 (1991)); NP-Rezeptoren (Bennett et al., J. Biol. Chem. 266, 23060– 23067 (1991)); und IgE-Rezeptor a* (Ridgway et al., J. Cell. Biol. 115, Abstr. 1448 (1991)), wobei das Sternchen (*) darauf hinweist, dass der Rezeptor ein Mitglied der Immunglobulin-Überfamilie ist.
Der einfachste und unkomplizierteste Immunadhäsin-Entwurf kombiniert die Bindungsregionen) des „Adhäsin"-Proteins mit den Gelenk- und Fc-Regionen einer Immunglobulin-Schwerkette. Für gewöhnlich wird beim Herstellen der GDNFRα-Immunglobulin-Chimären der vorliegenden Erfindung Nucleinsäure, die für die extrazelluläre Domäne des GDNFRα kodiert, C-terminal an Nucleinsäure fusioniert, die für den N-Terminus einer Immunglobulin-Konstantdomänensequenz kodiert, es sind jedoch auch N-terminale Fusionen möglich.
Typischerweise wird in solchen Fusionen das kodierte chimäre Polypeptid zumindest das funktionell aktive Gelenk und die CH2- und CH3-Domänen der Konstantregion einer Immunglobulin-Schwerkette beibehalten. Fusionen werden auch an den C-Terminus des Fc-Abschnitts einer Konstantdomäne oder unmittelbar N-terminal des CH1 der Schwerkette oder der entsprechenden Region der Leichtkette hergestellt.
Die genaue Stelle, an der die Fusion hergestellt wird, ist nicht entscheidend; bestimmte Stellen sind wohlbekannt und können ausgewählt werden, um die biologische Aktivität, Sekretions- oder Bindungseigenschaften der GDNFRα-Immunglobulin-Chimären zu optimieren.
In manchen Ausführungsformen werden die GDNFRα-Immunglobulin-Chimären als Monomere oder als Hetero- oder Homomultimere und insbesondere als Dimere oder Tetramere, im Wesentlichen wie in WO 91/08298 dargestellt assembliert.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die extrazelluläre GDNFRα-Domänensequenz an der N-Terminus des C-terminalen Abschnitts eines Antikörpers (insbesondere die Fc-Domäne) fusioniert, der die Effektorfunktionen eines Immunglobulins, z. B.
Immunglobulin G1 (IgG1) aufweist. Es ist möglich, die gesamte Schwerketten-Konstantregion an die extrazelluläre GDNFRα-Domänensequenz zu fusionieren. Es wird jedoch bevorzugter eine in der Gelenkregion unmittelbar Stromauf der Papain-Spaltstelle (die IgG-Fc- chemisch definiert; Rest 216, wobei der erste Rest der Schwerketten-Konstantregion mit 114 angenommen wird, oder analoge Stellen anderer Immunglobuline) beginnende Sequenz bei der Fusion verwendet. In einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform wird die GDNFRα-Aminosäuresequenz an die Gelenkregion und CH2- und CH3-, oder an die CH1-, Gelenk-, CH2 und CH3-Domänen einer IgG1-, IgG2- oder IgG3-Schwerkette fusioniert. Die genaue Stelle, an der die Fusion durchgeführt wird, ist nicht entscheidend und die optimale Stelle kann mittels Routineexperimenten ermittelt werden.
In manchen Ausführungsformen werden die GDNFRα-Immunglobulin-Chimären als Multimer und insbesondere als Homodimere oder -Tetramere assembliert. Im Allgemeinen werden diese assemblierten Immunglobuline bekannte Einheitenstrukturen aufweisen. Eine grundlegende Vierkettenstruktureinheit ist diejenige Form, in der IgG, IgD und IgE existieren. Eine Vierereinheit wird in hochmolekulareren Immunglobulinen wiederholt; IgM existiert im Allgemeinen als Pentamer von grundlegenden vier Einheiten, die durch Disulfidbrücken zusammen gehalten werden. IgA-Globulin und gelegentlich IgG-Globulin können ebenfalls in multimerer Form im Serum existieren. Im Falle eines Multimers kann jeder der Vierereinheit dieselbe oder verschieden sein.
Alternativ dazu kann die extrazelluläre GDNFRα-Domänensequenz zwischen Immunglobulin-Schwer- und Leichtkettensequenzen insertiert werden, so dass ein Immunglobulin erhalten wird, das eine chimäre Schwerkette umfasst. In dieser Ausführungsform wird die GDNFRα-Sequenz an das 3'-Ende einer Immunglobulin-Schwerkette in jedem Arm eines Immunglobulins fusioniert, entweder zwischen Gelenk- und CH2-Domäne oder zwischen CH2- und CH3-Domäne. Ähnliche Konstrukte sind von Hoogenboom et al., Mol. Immunol. 28, 1027–1037 (1991) beschrieben worden.
Obwohl die Anwesenheit einer Immunglobulin-Leichtkette bei den Immunadhäsinen der vorliegende Erfindung nicht erforderlich ist, kann eine Immunglobulin-Leichtkette vorhanden sein, die entweder kovalent an ein GDNFRα-Immungfobulin-Schwerketten-Fusionspolypeptid assoziiert oder direkt an die extrazelluläre. GDNFRα-Domänensequenz fusioniert ist. Im ersteren Fall wird für eine Immunglobulin-Leichtkette kodierende DNA typischerweise mit der DNA coexprimiert, die für das GDNFRα-Immunglobulin-Schwerketten-Fusionsprotein kodiert. Bei der Sekretion werden Hybrid-Schwerkette und die Leichtkette kovalent assoziiert, um eine Immunglobulin-artige Struktur bereitzustellen, die zwei über Disulfid gebundene Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paare umfasst. Geeignete Verfahren zur Herstellung solcher Strukturen sind beispielsweise in US-Patent Nr. 4.816.567, erteilt am 28. März 1989, offenbart.
In einer bevorzugten Ausführungsform stammen die bei der Konstruktion der Immunadhäsine der vorliegende Erfindung verwendeten Immunglobulinsequenzen aus einer IgG-Immunglobulin-Schwerketten-Konstantdomäne. Für Human-Immunadhäsine ist die Verwendung von Human-IgG1- und IgG3-Immunglobulinsequenzen bevorzugt. Ein Hauptvorteil der Verwendung von IgG1 ist es, dass IgG1-Immunadhäsine effizient auf immobilisiertem Protein A gereinigt werden können. Im Gegensatz dazu erfordert IgG3 Protein G, ein wesentlich weniger vielseitiges Medium. Jedoch sollten andere strukturelle und funktionelle Eigenschaften von Immunglobulinen in Betracht gezogen werden, wenn der Ig-Fusionspartner für eine bestimmte Immunadhäsin-Konstruktion ausgewählt wird. Beispielsweise ist das IgG3-Gelenk länger und flexibler, so dass es größere Adhäsindomänen beherbergen kann, die möglicherweise nicht richtig falten oder funktionieren, wenn sie an IgG1 fusioniert sind. Eine andere Erwägung wäre die Valenz; IgG-Immunadhäsine sind bivalente Homodimere, wogegen Ig-Unterarten wie IgA und IgM dimere bzw. pentamere Strukturen des grundlegenden Ig-Homodimers bedingen. Für eine In-vivo-Anwendung entworfene GDNFRα-Adhäsine sind die pharmakokinetischen Eigenschaften und die Effektorfunktionen, die von der Fc-Region bestimmt werden, ebenso von Bedeutung. Obwohl IgG1, IgG2 und IgG4 alle In-vivo-Halbwertszeiten von 21 Tagen aufweisen, sind ihre relativen Wirksamkeiten beim Aktivieren des Komple mentsystems verschieden. IgG4 aktiviert nicht das Komplement und IgG2 ist bei der Komplementaktivierung signifikant schwächer als IgG1. Darüber hinaus bindet IgG2 im Gegensatz zu IgG1 nicht an Fc-Rezeptoren an einkernigen Zellen oder Neutrophilen. Während IgG3 für die Komplementaktivierung optimal ist, beträgt seine In-vivo-Halbwertszeit ungefähr ein Drittel der anderen IgG-Isotypen. Eine weitere wichtige Erwägung für Immunadhäsine, die als Human-Therapeutika zu verwenden sind, ist die Anzahl allotypischer Varianten des speziellen Isotyps. Im Allgemeinen sind IgG-Isotypen mit weniger serologisch definierten Allotypen bevorzugt. Beispielsweise weist IgG1 nur vier serologisch definierte allotypische Stellen auf, wovon zwei (G1m und 2) in der FC-Region lokalisiert sind; und eine dieser Stellen, G1 ml, ist nicht immunogen. Im Gegensatz dazu bestehen 12 serologisch definierte Allotypen in IgG3, wovon alle sich in der Fc-Region befinden; nur drei dieser Steilen (G3m5, 11 und 21) haben einen Allotyp, der nicht immunogen ist. Folglich ist die potentielle Immunogenität eines γ3-Immunadhäsins größer als die eines γ1-Immunadhäsins.
In Bezug auf das parentale Immunglobulin befindet sich ein zweckdienlicher Verbindungspunkt unmittelbar stromauf der Cysteine des Gelenks, das die Disulfidbrücken zwischen den beiden Schwerketten bildet. In einem häufig verwendeten Design wird das Codon für den N-terminalen Rest des GDNFRα-Teils des Moleküls direkt stromauf der Codons für die Sequenz DKTHTCPPCP der IgG1-Gelenkregion platziert.
Die zur Konstruktion und Expression von Immunadhäsinen geeigneten, allgemeinen Verfahren sind dieselben wie jene, die hierin oben in Bezug auf GDNFRα offenbart sind. GDNFRα-Immunadhäsine werden am zweckdienlichsten konstruiert, indem die für den GDNFRα-Teil kodierende cDNA im Leseraster an eine Ig-cDNA-Sequenz fusioniert wird. Jedoch kann die Fusion an genomische Ig-Fragmente ebenfalls verwendet werden (siehe z. B. Gascoigne et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2936–2940 (1987); Aruffo et al., Cell 61, 1303–1313 (1990); Stamenkovic et al., Cell 66, 1133–1144 (1991)). Der letztere Fusionstyp erfordert die Anwesenheit von Ig-Regulationssequenzen zur Expression. Für IgG-Schwerketten-Konstantregionen kodierende cDNAs können auf Basis der publizierten Sequenz aus cDNA-Bibliotheken, die von Milz oder Peripherblut-Lymphozyten hergeleitet sind, durch Hybridisierung oder durch Polymerasekettenreaktion (PCR)-Techniken isoliert werden. Die für GDNFRα und Ig-Teile des Immunadhäsins kodierende cDNAs werden hintereinander in einen Plasmidvektor insertiert, der die effiziente Expression in den gewählten Wirtszellen steuert. Zur Expression in Säugetierzellen können pRK5-basierte Vektoren (Schall et al., Cell 61, 361–370 (1990)) und CDM8-basierte Vektoren (Seed, Nature 329, 840 (1989)) verwendet werden. Die exakte Verbindung kann durch Entfernen der überschüssigen Sequenzen zwischen den entworfenen Verbindungscodons unter Anwendung Oligonucleotid-gerichteter Deletionsmutagenese (Zoller et al., Nucleic Acids Res. 10, 6487 (1982); Capon et al., Nature 337, 525– 531 (1989)) erzeugt werden. Es können synthetische Oligonucleotide verwendet werden, in denen beide Hälften komplementär zur Sequenz an beiden Seiten der gewünschten Verbindung ist; im Idealfall sind dies 36- bis 48-mere. Alternativ dazu können PCR-Techniken verwendet werden, um die beiden Teile des Moleküls im Leseraster mit einem geeigneten Vektor zu verbinden.
Die Wahl der Wirtszelllinie zur Expression von GDNFRα-Immunadhäsinen hängt hauptsächlich vom Expressionsvektor ab. Eine weitere Erwägung ist die erforderliche Proteinmenge. Milligramm-Mengen können häufig durch vorübergehende Expression produziert werden. Beispielsweise kann die Adenovirus EIA-transformierte 293 Human-Embryonierenzelllinie vorübergehend mit pRK5-basierten Vektoren durch eine Modifizierung des Calciumphosphatverfahrens transfiziert werden, um für eine effiziente Immunadhäsin-Expression zu sorgen. CDM8-basierte Vektoren können verwendet werden, um COS-Zellen mittels DEAE-Dextran-Verfahren zu transfektieren (Aruffo et al., Cell 61, 1303–1313 (1990); Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. US 9, 347-353 (1990)). Wenn größere Proteinmengen erwünscht sind, kann das Immunadhäsin nach stabiler Transfektion in eine Wirtzelllinie exprimiert werden. Beispielsweise kann ein pRK5-basierter Vektor in Chinahamster-Eierstock- (CHO-) Zellen in Gegenwart eines zusätzlichen, für Dihydrofolatreduktase (DHFR) kodierenden Plasmids eingeführt werden, das Resistenz gegen G418 verleiht. Gegen G418 resistente Klone können in Kultur selektiert werden; diese Klone werden in Gegenwart ansteigender Konzentrationen des DHFR-Inhibitors Methotrexat gezüchtet; es werden Klone selektiert, in denen die Anzahl von Genkopien, die für die DHFR- und Immunadhäsin-Sequenzen kodieren, coamplifiziert. Wenn das Immunadhäsin eine hydrophobe Leadersequenz an seinem N-Terminus enthält, wird es wahrscheinlich von den transfizierten Zellen prozessiert und sekretiert werden. Die Expression von Immunadhäsinen mit komplexeren Strukturen kann einzigartig geeignete Wirtszellen erfordern; beispielsweise können Komponenten, wie z. B. Leichtkette oder J-Kette von bestimmten Myelom- oder Hybridomzellwirten bereitgestellt werden (Gascoigne et al. (1987), siehe oben, Martin et al., J. Virol. 67, 3561–3568 (1993)).
Immunadhäsine können mittels Affinitätschromatographie bequem gereinigt werden. Die Eignung von Protein A als Ligand hängt von der Spezies und vom Isotyp der Immunglobulin-Fc-Domäne ab, die in den Chimären verwendet wird. Protein A kann verwendet werden, um Immunadhäsine zu reinigen, die auf Human-γ1-, -γ2- oder γ4-Schwerketten basieren (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62, 1–13 (1983)). Protein G wird für alle Maus-isotypen und für Human-γ3 empfohlen (Guss et al., EMBO J. 5, 1567–1575 (1986)). Die Matrix, an die der Affinitätsligand gebunden ist, ist häufig Agarose, jedoch sind andere Matrices verfügbar. Mechanisch stabile Matrices, wie z. B. Controlled-Pore-Glass oder Poly(styroldivinyl)benzol ermöglichen höhere Flussraten und kürzere Verarbeitungszeiten als sie mit Agarose erzielt werden können. Die Bedingungen zum Binden eines Immunadhäsins an die Protein A- oder Protein G-Affinitätssäule werden völlig von den Eigenschaften der Fc-Domäne bestimmt, d. h. von Spezies und Isotyp. Im Allgemeinen tritt die effiziente Bindung, wenn der geeignete Ligand gewählt wird, direkt aus der unkonditionierten Kulturflüssigkeit auf. Eine unterscheidende Eigenschaft von Immunadhäsin ist, dass für Human-γ1-Moleküle die Bindungskapazität für Protein A relativ zu einem Antikörper desselben Fc-Typs etwas herabgesetzt ist. Gebundenes Immunadhäsin kann effizient entweder bei saurem pH (bei oder über 3,0) oder in einem Puffer mit neutralem pH, der ein mildes chaotropisches Salz enthält, eluiert werden. Dieser Affinitätschromatographieschritt kann ein Immunadhäsin-Präparat liefern, das zu >95% rein ist.
Andere fachbekannte Verfahren können anstatt oder zusätzlich zur Affinitätschromatographie an Protein A oder G verwendet werden, um Immunadhäsine zu reinigen. Immunadhäsine verhalten sich ähnlich wie Antikörper in der thiophilen Gelchromatographie (Hutchens et al., Anal. Biochem. 159, 217–226 (1986)) und immobilisierten Metallchelat-Chromatographie (AI-Mashikiki et al., J. Dairy Sci. 71, 1756–1763 (1988)). Im Gegensatz zu Antikörpern ist ihr Verhalten an Ionentauschersäulen nicht nur von ihren isoelektrischen Punkten bestimmt, sondern auch von einem Ladungsdipol, der im Molekül wegen ihrer Chimären Natur vorhanden sein kann.
Wenn gewünscht, können die Immunadhäsine bispezifisch hergestellt werden. Folglich können die Immunadhäsine der vorliegenden Erfindung eine extrazelluläre GDNFRα-Domäne und eine Domäne, wie z. B. die extrazelluläre Domänen einer anderen Zytokin-Rezeptoruntereinheit oder der eines neurotrophen Faktors kombinieren. Beispielhafte Zytokinrezeptoren, aus denen solche bispezifischen Immunadhäsin-Moleküle hergestellt werden können, umfassen TPO- (oder mpl-Ligand), EPO-, G-CSF-, IL-4-, GH-, PRL-, IL-3-, GM-CSF-, IL-5-, IL-6-, LIF-, OSM-, CNTF- und IL-2-Rezeptoren. Für bispezifische Moleküle sind trimere Moleküle, die aus einer chimären Antikörper-Schwerkette in einem Arm und einer chimären Antikörper-Leichtkette im anderen Arm ihrer Antikörperartigen Struktur zusammengesetzt sind, wegen der einfachen Reinigung vorteilhaft. Im Gegensatz zu Antikörper produzierenden Quadroma, die üblicherweise zur Produktion bispezifischer Immunadhäsine verwendet werden, die ein Gemisch von zehn Tetrameren produzieren, produzieren Zellen, die mit Nucleinsäure transfiziert sind, die für die drei Seitenketten einer trimeren Immunadhäsin-Struktur kodieren, nur drei Moleküle und die Reinigung des gewünschten Produkts aus diesem Gemisch ist dementsprechend einfacher.
Vom GDNFRα-Protein und GDNFRα-Gen (und GDNF und GDNF-Gen) wird angenommen, dass sie therapeutische Verwendungen ex vivo und in vivo zur Verabreichung an ein Säugetier, insbesondere Menschen, bei der Behandlung von Krankheiten oder Störungen finden, die mit GDNF-Aktivität in Verbindung stehen oder durch GDNF-Reak tionsfähigkeit begünstigt werden. Der Behandlung mit den Ausführungsformen der Erfindung besonders zugängliche Konditionen sind jene, die mit Ret-Expression in Verbindung stehen oder die durch Ret-Aktivierung, insbesondere des von Ret vermittelten Stromab-Stoffwechselwegs, begünstigt werden. Insbesondere bevorzugt sind neurologische Störungen, vorzugsweise Störungen des Zentralnervensystems, Störungen der Niere, mit der Milz in Verbindung stehende hämatopoetische Störungen und Störungen des Darmnervensystems. In einer der Ausführungsformen wird dem Patienten eine wirksame Menge GDNFRα, GDNF oder eines Agonisten davon, oder eines aktiven Peptidfragments oder einer Variante davon verabreicht. Die vorliegende Erfindung stellt ferner pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die GDNFRα, GDNF oder einen Agonisten davon, oder eine aktives Peptidfragment oder Derivat in einem geeigneten pharmazeutischen Träger umfassen. Das Material kann systemisch oder lokal verabreicht werden. Anwendbar auf die hierin gelehrten Verfahren kann das Rezeptorprotein gegebenenfalls vor, nach oder vorzugsweise gemeinsam mit (oder im Komplex mit) GDNF oder einem anderen GDNFRα-Liganden verabreicht werden. Wie hierin gelehrt, kann GDNFRα den Zielzellen in Abwesenheit von GDNF bereitgestellt werden, um die Reaktionsfähigkeit dieser Zellen auf anschließend verabreichtesln GDNF oder GDNF-Agonist zu steigern.
Es kann vorteilhaft sein, die trophische Wirkung von endogenem GDNF zu vermindern. Daher kann es in Regionen eines Nervensystemtraumas wünschenswert sein, GDNF-Antagonisten bereitzustellen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf zellfreies, hinsichtlich Ret-Aktivierung defektes GDNFRα, das mit dem endogenen zellulären Rezeptor für GDNF-Bindung konkurrieren kann. Unter solchen Umständen kann es wünschenswert sein, den GDNF-Antagonisten lokal am Verletzungsort und nicht systemisch zu verabreichen. Die Verwendung eines GDNFR-bereitstellenden Implantats kann für lokale Verabreichung wünschenswert sein.
Alternativ dazu können gewisse Konditionen aus einem Anstieg der GDNF-Reaktionsfähigkeit (oder der eines anderen GDNFRα-Liganden) Nutzen ziehen. Es kann daher vorteilhaft sein, die Anzahl oder die Bindungsaffinität von GDNFRα in Zellen von Patienten zu erhöhen, die an solchen Konditionen leiden. Dies kann über die Verabreichung von löslichem GDNFRα erzielt werden, das gegebenenfalls mit GDNFRα-Liganden, vorzugsweise GDNF komplexiert ist oder durch Gentherapie unter Verwendung von für GDNFRα kodierender Nucleinsäure. Die selektive Expression von rekombinantem GDNFR in geeigneten Zellen kann unter Verwendung von GDNFR-Genen erzielt werden, die von gewebespezifischen oder induzierbaren Promotoren kontrolliert werden, oder durch Herbeiführen lokalisierter Infektion mit replikationsdefekten Viren, die eine rekombinantes GDNFR-Gen tragen. Konditionen, die von einer erhöhten Empfindlichkeit gegen GDNF einen Vorteil ziehen können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Motoneuronen-Störungen, einschließlich amyotropher Lateralsklerose, Werdnig-Hoffmann-Krankheit, proximal progressive spinale Muskelatrophie und Guillan-Barre-Syndrom. Zusätzliche Leiden umfassen jene, an denen sympathische Neuronen beteiligt sind, insbesondere wo erhöhte Überlebensfähigkeit oder GDNF-Reaktionsfähigkeit erwünscht ist. Konditionen, wo erhöhte Überlebensfähigkeit oder GDNF-Reaktionsfähigkeit von sensorischen Neuronen, einschließlich peripheren sensorischen Neuronen und Neuronen des Zentralnervensystems, einschließlich dopaminergen Neuronen wünschenswert ist, werden ebenfalls in geeigneter Weise mit Ausführungsformen der Erfindung behandelt. Demgemäß wird hierin die Behandlung von neurologischen Störungen, die mit Diabetes, Parkinsonscher Krankheit, Alzheimerkrankheit und Huntington Chorea verbunden sind, bereitgestellt. Die vorliegenden Zusammensetzungen und Verfahren können auch auf Leiden angewendet werden, die mit nicht-neuronalen Zellen in Beziehung stehen, die GDNFRα exprimieren. In der Tat können Leiden, die mit Ret-aktivierten Stoffwechselwegen in Ret exprimierenden Zellen assoziiert sind, mit den Ausführungsformen der Erfindung behandelt werden, da GDNFRα der Ret-Aktivierung dient.
Eine Krankheit oder medizinische Störung wird als Nervenschaden betrachtet, wenn das Überleben oder die Funktion von Nervenzellen und/oder ihrer Axonprozesse beeinträchtigt ist. Ein solcher Nervenschaden tritt als Resultat von Leiden auf, die Folgende umfassen: (a) physische Verletzung, die eine Degenerierung der Axonprozesse und/oder Nervenzellkörperchen nahe der Verletzungsstelle verursachen; (b) Ischämie als Schlaganfall; (c) Einwirkung von Neurotoxinen, wie z. B. die chemotherapeutischen Krebs- und AIDS-Mittel, wie z. B. Cisplatin bzw. Didesoxycytidin (ddC); (d) chronische metabolische Krankheiten, wie z. B. Diabetes oder Nierendysfunktion; und (e) neurodegenerative Krankheiten, wie z. B. Parkinsonsche Krankheit, Alzheimerkrankheit und amyotrophe Lateralsklerose (ALS), welche die Degeneration spezieller Neuronenpopulationen verursachen: Nervenschädigung verursachende Konditionen umfassen Parkinsonsche Krankheit, Alzheimerkrankheit, amyotrophe Lateralsklerose, Schlaganfall, diabetische Polyneuropathie, toxische Neuropathie und physischer Schaden des Nervensystems, wie z. B. jener, der durch physische Verletzung des Hirns oder Rückenmarks oder Quetschungen oder Schnittverletzungen des Arms oder der Hand oder Teilen des Körpers verursacht werden, einschließlich temporäre oder permanente Unterbrechung des Blutflusses zu Teilen des Nervensystems, wie bei Schlaganfall.
Das GDNFRα-Gen wird in Muskelzellen und assoziierten Neuronen exprimiert. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung Verfahren der Behandlung von Störungen GDNFR-exprimierender Muskelzellen bereit, die das Verabreichen der Verbindungen der Erfindung an einen Patienten umfassen, der einer solchen Behandlung bedarf. Störungen der Muskelzellen, die von einer solchen Behandlung profitieren können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf die folgenden progressiven Muskeldystrophien: Duchenne, Becker, Emery-Dreifuss, Landouzy-Dejerine, skapulohumeral, Schulter- und Beckengürtel, Von Graefe-Fuchs, oculopharygeal, myotonisch und angeboren. Zusätzlich können solche Moleküle bei der Behandlung angeborener (Zentralfibrillen-, Nemalin-, zentronuclear und angeborene faserartige Disproportion) und erworbener (toxischer, entzündlicher) Myopathien zweckdienlich sein.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können Patienten, die an GDNFR-Überschuss, Hyperempfindlichkeit gegen GDNF, überschüssigem GDNF usw. leiden, durch Verabreichen einer wirksamen Menge Anti-Sense-RNA oder Anti-Sense-Oligodes oxyribonucleotiden, die der für das GDNFR-Region kodierenden Region entsprechen, behandelt werden, wodurch die Expression von GDNFR vermindert wird.
Die Verbindungen und Verfahren der Erfindung können Verwendungen bei Konditionen haben, die mit einer Abnahme hämopoetischer Zellen verbunden sind. Beispiele dieser Krankheiten umfassen: Anämie (einschließlich makrozytische und aplastische Anämie); Thrombozytopenie; Hypoplasie; disseminierte intravaskuläre Koagulation (DIC); Myelodysplasie; Immun- (Autoimmun-) thrombozytopenische Purpura (ITP); und HIV-induzierte ITP. Zusätzlich können GDNF- und GDNFRα-Moleküle zweckdienlich bei der Behandlung myeloproliferativer Thrombozytosekrankheiten sowie Thrombozytose aus entzündlichen Konditionen und bei Eisenmangel sein. GDNF und GDNFRα, die zu einer Erhöhung der hämatopoetischen Zellproliferation führen, können ferner verwendet werden, um die Wiederbesiedelung reifer Blutzellklone in Zellen zu verstärken, die Chemo- oder Strahlentherapie oder Rückenmarkstransplantationstherapie unterzogen wurden. Im Allgemeinen wird von den GDNF- und GDNFRα-Molekülen erwartet, dass sie eine Verstärkung der Proliferation und/oder Differenzierung (jedoch speziell Proliferation) hämatopoetischen Zellen bewirken. Bevorzugte Ausführungsformen stellen eine Behandlung bereit, um die in der Milz auftretende Hämatopoese zu verstärken.
Andere potentielle therapeutische Anwendungen für GDNF und GDNFRα und ihrer Gene umfassen Behandlung zur Unterstützung von Wachstum, Überleben und Reparatur von Nieren- und Leberzellen, einschließlich Behandlung von Nierenerkrankungen und Störungen. Beispielsweise bezieht sich akutes Nierenversagen auf die abrupte Unterbrechung der vorher normalen Nierenfunktion. Diese ernsthafte klinische Kondition kann aus einer breiten Vielfalt von Mechanismen resultieren, einschließlich Kreislaufversagen (Schock), Gefäßblockade Glomerulonephritis und Verschluss des Urinflusses. Akutes Nierenversagen entsteht häufig als Komplikation von Gefäß- und Abdominalchirurgie. Auch können Risiko-Neugeborene mit geringem Geburtsgewicht, die nun wegen den dauernden Fortschritten bei der Brutfürsorge Lungen- und Herzprobleme überleben, aufgrund von Komplikationen des akuten Nierenversagens sterben, das durch Infektionen und Medikamententoxizität verursacht wird. Von besonderer klinischer Bedeutung sind Fälle akuten Nierenversagens, die mit Trauma, Sepsis, postoperativen Komplikationen oder Medikationen, insbesondere Antibiotika verbunden sind. Im Speziellen finden die Verbindungen der Erfindung Verwendung in Ätiologien, die direkt oder indirekt zur Dysfunktion des Darmnervensystems oder Nierensystems in Beziehung stehen. Spezielle Konditionen, welche GI (Magen-Darm) beeinträchtigen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Achalsie, Speiseröhrenspasmus, Sklerodermie (mit Muskelatrophie des Glattmuskelanteils der Speiseröhre, Kontraktionsschwäche der unteren zwei Drittel des Speiseröhrenkörpers und Insuffizienz des unteren Speiseröhrenschließmuskels in Verbindung stehend, jedoch auch durch Behandlung mit immunosuppressiven Mitteln verursacht), Störungen, wie z. B. Zwölffingerdarmgeschwür, Zollinger-Ellison-Syndrom (Säurehypersekretion, verursacht von Faktoren, die genetischen Faktoren, Rauchen, neurale Einflüsse umfassen), Hypersekretion von Magensäure, Malabsorptionsstörungen, beispielsweise bei Diabetes (und Hypoparathyreoidismus, Hyperthyreoidismus und Nebenniereninsuffizienz), wobei Magenatonie, Nausea, Erbrechen usw. zumindest zum Teil mit Dysfunktion des sympathischen/parasympathischen Nervensystems in Verbindung stehen. Weitere Störungen umfassen Störungen der Darmmotorik, einschließlich: Divertikulose/Divertikulitis; Hirschsprung-Krankheit (eine angeborene, durch Fehlen von Ganglienzellen (Meissner'scher und Auerbach'scher Plexus) in einem kleinen Abschnitt des distalen Dickdarms, für gewöhnlich nahe dem Anus verursachte Störung, die typischerweise bei Säuglingen vorkommt, jedoch in weniger schweren Fällen bis zur Adoleszenz oder bis zum frühen Erwachsenenalter nicht diagnostiziert wird); Megakolon anderen Typs (Hirschsprung-Krankheit ist ein Megakolon-Typ); Darm-Pseudoobstruktion, akut oder chronisch, die wegen Abnormalitäten der sympathischen Innervation der Muskelschichten des Darms eine schwere Dysmotilität ist oder sekundär aus Sklerodermie, Diabetes, Amyloidose, anderen neurologischen Krankheiten, Medikamenten oder Sepsis resultieren kann; und chronische Konstipation, die ein ernsthaftes Problem bei Patienten mit geistiger Unterentwicklung oder neurologischen Erkrankungen ist, worin die gestörte Darmmotilität ein beitragender Faktor ist. Weitere Konditionen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf: Rückenmarksdysfunktion wegen einer offensichtlichen Unterbre chung des Darmnervensystems; Guillain-Barre-Syndrom; multiple Sklerose; Pandysautonomie (Dysfunktion des autonomen Nervensystems); Parkinsonismus (häufig mit gestörter Magen-Darm-Motilität verbunden); multiple System-Atrophie (Shy-Drager-Syndrom), bei der gestörte Darmmotilität als Merkmal dokumentiert worden ist; und Porphyrie und Amyloidose, die diffuse Krankheiten sind, die sich durch Neuropathie und häufig mit begleitenden G1-Motilitätsstörungen manifestieren.
Die Nekrose oder Schädigung von GDNFR-exprimierendem oder GDNF-reaktionsfähigem Gewebe, die mit den hierin bereitgestellten Zusammensetzungen und Verfahren behandelbar sind, umfasst Nekrose aufgrund mikrobieller oder viraler Infektion, wie z. B. virale Hepatitis, Tuberkulose, Typhus, Tularämie, Brucellosis, Gelbfieber und dergleichen, oder Nekrose aufgrund ischämischer Verletzung, die aus Schock, Herzversagen und dergleichen resultiert, oder Nekrose aufgrund akuter oder chronischer Reaktion mit Medikamenten und toxischen Substanzen, wie z. B. Chemotherapeutika, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Phosphorvergiftung und dergleichen. Wie hierin gelehrt wird, sind die Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung zweckdienlich, um Nierenkrankheiten zu behandeln, indem für eine Verstärkung des Zellwachstums gesorgt wird, einschließlich jenes von Nierenzellen, wie z. B. Nierenepithelzellen und die Niere innervierenden Neuronen. Die Verbindungen und Verfahren der Erfindung sorgen für die Reparatur von Nierenschädigung. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein wird angenommen, dass diese entweder direkt oder indirekt durch Stimulieren des Wachstums und der Teilung von Nierenzellen, einschließlich innervierenden Neuronen erzielt werden kann. Demgemäß wird eine Verfahren zur Regenerierung von Nierenzellen bereitgestellt, das die Schritte des Herstellens eines wie hierin offenbarten GDNFR-Agonisten (z. B. lösliches GDNFRα, gegebenenfalls mit GDNF komplexiert), gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder einem zusätzlichen Wachstumsfaktor oder Zytokin, und das Kontaktieren des Nierengewebes mit der Zusammensetzung umfasst. Eine therapeutische Menge der Zusammensetzung wird verabreicht. Lokale Injektionen oder Implantate sind ein bevorzugtes Zufuhrverfahren. Alter nativ dazu können geschädigte Nieren entfernt, ex vivo behandelt und dem Wirt rückgeführt werden, nachdem die Niere wiederhergestellt worden ist.
GDNFR-Agonisten einschließlich GDNF können während der Hämodialyse verabreicht werden. Hämodialyse ist als temporäre Entfernung des Bluts aus einem Patienten zum Zwecke des Extrahierens oder Abtrennens von Toxinen daraus und der Rückführung des gereinigten Bluts in denselben Patienten definiert. Hämodialyse ist bei Patienten indiziert, wo eine Beeinträchtigung oder ein Versagen der Niere vorliegt, d. h., in Fällen, wo das Blut von den Nieren nicht richtig oder ausreichend gereinigt wird (insbesondere, um Wasser zu entfernen). Im Falle chronischer/n Nierenbeeinträchtigung oder Versagens muss die Hämodialyse wiederholt durchgeführt werden. Beispielsweise muss der Patient im Endstadium der Nierenerkrankung, wo eine Transplantation von Nieren nicht möglich oder kontraindikativ ist, ungefähr 100 bis 150 Mal im Jahr dialysiert werden.
Diese Erfindung findet Verwendung bei Störungen und Konditionen, die zu Nierenschädigung führen können. Diese Erfindung findet Verwendung in einigen immunosuppressiven Therapien, wo die Nebenwirkung der Nierenschädigung besteht, z. B. bei der Therapie von IDDM in Menschen durch Verfahren, die zur Suppression der Autoimmunreaktion entworfen sind. Therapie unter Verwendung von Cyclosporin A bei Diabetes kann zu Nierenschädigung führen. Diabetes kann zu den typischen Spätschäden von Blutgefäßen der Nieren führen. Andere Beispiele umfassen immunologisch oder nicht immunologisch verursachte Nierenkrankheiten, wie z. B. Glomerulonephritis, akutes Nierenversagen, Transplantatabstoßung und Nierenschädigung, die durch nephrotische Substanzen verursacht werden, Nierentransplantate, toxischer Schaden an Nieren. Darüber hinaus findet die vorliegende Erfindung Verwendung bei der Organtransplantation, einschließlich Organtransport zur Lagerung eines beliebigen Organs, das von einem Spender entkernt wurde, um den Schutz des Organs zum Zeitpunkt der Transplantation sicherzustellen, wobei jegliche Schwierigkeiten zu minimieren, die bis zur Transplantationsoperation auftreten und um die Erhaltung des Organs in einem guten Zustand zu gewährleisten. Das Organ ist eines, das GDNFR-beherbergende oder GDNF-reaktive Zellen aufweist. In einer der speziellen Ausführungsformen ist das Organ die Niere. Die Verwendung mit GDNFR-Agonist, einschließlich GDNF verspricht Erfolg bezüglich der Erhaltung der Nierenfunktion.
Wie hierin erörtert, ist ein Ziel der Erfindung die Bereitstellung von Verfahren zur Behandlung von Säugetieren mit dysfunktioneller Magen-Darm-Muskulatur oder Störungen der glatten Muskulatur anderswo im Körper. Der Magen-Darm-Muskel ist ganz anders organisiert und reguliert als Muskel anderswo im Körper. Skelett- und Glattmuskel im Magen-Darm-Trakt stehen unter der Kontrolle des Darmnervensystems, das ein höchst komplexes Netzwerk von Nerven und Muskeln ist, das sich innerhalb der Magen-Darm-Wand befindet und den gesamten Verdauungsprozess, einschließlich Motilität, Sekretion und Absorption ordnet. Die Darmnerven sind auch in zusammengeschalteten Netzwerken organisiert, die Plexus genannt werden. Von diesen ist der zwischen den zirkulären und longitudinalen Muskelschichten gelegene Plexus myentericus der Hauptmodulator der Magen-Darm-Motilität. Er erhält Eingangssignale vom Zentralnervensystem (über Vagus- und sympathische Wege) sowie von lokalen Reflexwegen. Sein Ausgangssignal besteht aus inhibitorischen sowie exzitatorischen Signalen an den benachbarten Muskel. Der letztliche neurale Weg, der die Muskelaktivität im Magen-Darm-Trakt reguliert, wird daher von den Neuronen des Plexus myentericus verkörpert. Ein zweckdienliches, wenn auch etwas vereinfachtes Konzept ist es, sich den Netto-Muskeltonus im Magen-Darm-Trakt als denjenigen vorzustellen, der aus dem Gleichgewicht zwischen den entgegen gesetzten Wirkungen zweier Nervensysteme im Plexus myetericus resultiert: eines, das die Kontraktion (hauptsächlich über Acetylcholin) des Muskels verursacht und ein anderes, das die Entspannung des Muskels verursacht. Beide Neuronenarten werden jedoch von Acetylcholin innerhalb des Plexus myetericus aktiviert. Die Rolle von Acetylcholin bei der Regulation des Magen-Darm-Muskeltonus ist daher komplex. Von Effektornerven nahe dem Muskel freigesetztes Acetylcholin verursacht Kontraktion; innerhalb des Plexus jedoch kann es Hemmung oder Anregung bewirken. Dies steht im Gegensatz zu Skelettmuskel außerhalb des Magen-Darm-Traktes, der direkt von Nerven innerviert wird, die vom Zentralnervensystem ausgehen. Die Wechsel wirkung zwischen Nerv und Muskel in Skelettmuskel außerhalb des Magen-Darm-Trakts ist viel, einfacher: Nerven setzen Acetylcholin frei, was die Kontraktion des Muskels verursacht. Schließlich ist der Plexus myetericus wahrscheinlich der wichtigste, jedoch nicht der einzige bestimmende Faktor des Muskeltonus im Magen-Darm-Trakt. In der Tat kann man den basalen Glattmuskeltonus als das Ergebnis der Summe vieler verschiedener Faktoren vorstellen, einschließlich intrinsischer (myogener) Tonus und zirkulierende Hormone, zusätzlich zu Nervenaktivität. Wie in den Beispielen angegeben, findet sich GDNFR in GI-Muskeln und innervierenden Neuronen. Folglich stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen, Verfahren und Geräte zur Behandlung von Magen-Darm-Störungen, einschließlich Achalasie, anderen Störungen des unteren Speiseröhrenschließmuskels, Musculus-sphincter-Oddi-Dysfunkion, irritablem Darm-Syndrom und anderen hierin erörterten Störungen bereit.
Beispielsweise wird ein Verfahren bereitgestellt, um Irritable-Bowel-Syndrom (IBS) zu behandeln, die eine motorische Störung ist, die aus veränderter Darmaktivität, Bauchschmerzen und die Abwesenheit feststellbarer Pathologie besteht. IBS wird an seinen Symptomen erkannt, die deutlich von psychologische Faktoren und stressigen Lebenssituationen beeinflusst wird. IBS ist eine der am häufigsten angetroffenen Magen-Darm-Störungen. Zwischen 20% und 50% der Patienten, die Magen-Darm-Trakt-Spezialisten zugewiesen werden, leiden an IBS. IBS-Symptome treten in ungefähr 14% von ansonsten gesunden Leuten auf. Es ist ein Syndrom, das aus einer Reihe von Konditionen mit ähnlichen Manifestationen zusammengesetzt ist. Die Hauptsymptome von IBS (veränderte Darmaktivität, Bauchschmerzen und Blähungen) sind Manifestationen erhöhter Motilität im Darm und Hypersekretion von Magensäure. Aktivität des GI-Trakts wird neuronal durch das Zentralnervensystem (CNS) über parasympathische und sympathische Innervation und durch das peripher lokalisierte Darmnervensystem (ENS) moduliert, das sich innerhalb des GI-Trakts selbst befindet und GDNFR exprimiert.
In einem anderen Aspekt wird die Verabreichung von GDNFRα an ein Säugetier bereitgestellt, das verringerte Spiegel von endogenem GDNFRα oder ein defektes GDNFRα- Gen aufweist, vorzugsweise in einer Situation, wo solch verringerte Spiegel zu einer pathologischen Störung führen oder wo die Aktivierung von GDNFRα und Ret fehlt. In diesen Ausführungsformen, wo das Volllängen-GDNFRα dem Patienten zu verabreichen ist, ist vorgesehen, dass das für den Rezeptor kodierende Gen dem Patienten über Gentherapie-Technologie verabreicht wird.
Bei Gentherapien-Anwendungen werden Gene in die Zellen eingeführt, um die In-vivo-Synthese eines therapeutisch wirksamen Genprodukts zu erzielen, beispielsweise zum Ersatz eines defekten Gens. „Gentherapie" umfasst sowohl herkömmliche Gentherapie, wo eine andauernde Wirkung durch eine einzige Behandlung erzielt wird, als auch die Verabreichung gentherapeutischen Mitteln, welche die einzelne oder wiederholte Verabreichung einer therapeutisch wirksamen DNA oder mRNA umfasst. Antisense-RNAs und DNAs können als therapeutische Mittel zum Blockieren der Expression gewisser Gene in vivo verwendet werden. Es ist bereit gezeigt worden, dass kurze Antisense-Oligonucleotide in Zellen importiert werden können, wo sie als Hemmstoffe agieren, und zwar trotz ihrer niedrigen intrazellulären Konzentrationen, die von ihrer beschränkten Aufnahme durch die Zellmembran verursacht sind. (Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4143–4146 (1986)). Die Oligonucleotide können modifiziert werden, um ihre Aufnahme zu erhöhen, z. B. durch Substituieren ihrer negativ geladenen Phosphodiestergruppen durch ungeladene Gruppen.
Es sind eine Reihe von Techniken zum Einführen von Nucleinsäuren in lebensfähige Zellen verfügbar. Die Techniken variieren in Abhängigkeit davon, ob die Nucleinsäure in kultivierte Zellen in vitro transferiert werden, oder in vivo in die Zellen des vorgesehenen Wirts. Für den Transfer von Nucleinsäure in Säugetierzellen in vivo geeignete Techniken umfassen die Verwendung von Liposomen, Elektroporation, Mikroinjektion, Zellfusion, DEAE-Dextran, das Calciumphosphatverfahren usw. Die zur Zeit bevorzugten In-vivo-Gentransfertechniken umfassen Transfektion mit viralen (typischerweise retroviralen) Vektoren und Virushüllprotein-Liposom-vermittelte Transfektion (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205–210 (1993)). In einigen Situationen ist es wün schenswert, die Nucleinsäurequelle mit einem Mittel bereitzustellen, das auf die Zielzellen abzielt, wie z. B. einem Antikörper, der für ein Zelloberflächen-Membranprotein oder die Zielzelle, einen Liganden für einen Rezeptor an der Zielzelle usw. spezifisch ist. Wo Liposomen eingesetzt werden, können Proteine, die an ein mit Endozytose assoziiertes Zelloberflächen-Membranprotein binden, zum Targeting verwendet werden und/oder um die Aufnahme zu erleichtern, z. B. Capsidproteine oder Fragmente davon, die für einen bestimmten Zelltyp tropisch sind, Antikörper für Proteine, die bei Zyklisierung Internalisierung erfahren, und Proteine, welche auf intrazelluläre Lokalisierung abzielen und die intrazelluläre Halbwertszeit erhöhen. Die Technik der Rezeptor-vermittelten Endozytose wird beispielsweise von Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429–4432 (1987); und Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 87, 3410–3414 (1990), beschrieben. Für einen Überblick über die gegenwärtig bekannten Genmarkierungs- und Gentherapie-Protokolle siehe et al., Science 256, 808–813 (1992).
Die Erfindung stellt ferner Antagonisten der GDNFRα-Aktivierung bereit (z. B. GDNFRα-Antisense-Nucleinsäure, neutralisierende Antikörper). Die Verabreichung von GDNFRα-Antagonist an ein Säugetier mit erhöhten oder überschüssigen Spiegeln der endogenen GDNFRα-Aktivierung ist vorgesehen, vorzugsweise in der Situation, wo solche erhöhten Spiegel der GDNFRα- oder Ret-Aktivierung zu einer pathologischen Störung führen.
In einer der Ausführungsformen können GDNFRα-Antagonist-Moleküle verwendet werden, um endogenen Liganden im Körper zu binden, wodurch desensibilisiertes GDNFRα gebildet wird, um für den GDNF-Liganden reaktiv zu werden, insbesondere wenn die Siegel des GDNF-Liganden im Serum normale physiologische Spiegel überschreiten. Es kann ferner vorteilhaft sein, den endogenen GDNF-Liganden zu binden, der unerwünschte Zellreaktionen aktiviert (wie z. B. Proliferation von GDNFR-exprimierenden Tumorzellen).
Pharmazeutische Zusammensetzungen von löslichem GDNFRα können weiters ein GDNF oder einen anderen GDNFRa-bindenden Agonisten enthalten. Solche Doppel zusammensetzungen, die z. B. einen GDNF/GDNFRα-Komplex enthalten, können vorteilhaft sein, wo es therapeutisch sinnvoll ist, die Halbwertszeit von GDNF zu verlängern, ein Retard-Reservoir für GDNF bereitzustellen, endogenes GDNFRα oder Ret zu aktivieren und/oder das Fehlen von GDNFRα in einer Ret-exprimierenden Zielzelle zu ergänzen, wodurch die Zelle für GDNF reaktiv gemacht wird.
Therapeutische Formulierungen von GDNFRα, GDNF oder eines Agonisten davon, werden zur Lagerung durch Mischen von GDNFRα, GDNF oder einem Agonisten davon mit dem gewünschten Reinheitsgrad, gegebenenfalls mit physiologisch annehmbaren Trägern, Exzipienten und Stabilisatoren (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl., A. Osol (Hrsg.) (1980)) in Form eines lyophilisierten Kuchens oder in Form wässriger Lösungen hergestellt. Annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind für Rezipienten bei den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch und umfassen Puffer, wie z. B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidantien, einschließlich Ascorbinsäure; niedermolekulare (weniger als ungefähr 10 Aminosäuren) Polypeptide; Proteine, wie z. B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie z. B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie z. B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; komplexbildende Mittel, wie z. B. EDTA; Zuckeralkohole, wie z. B. Mannitol oder Sorbitol; salzbildende Gegenionen, wie z. B. Natrium; und/oder nichtionische Tenside, wie z. B. Tween, Pluronics oder Polylethylenglykol (PEG).
GDNFRα, GDNF oder ein Agonist davon können auch in Mikrokapseln eingeschlossen werden, die beispielsweise durch Koazervierungstechniken oder durch Grenzflächenpolymerisation (beispielsweise Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly-(methylmethacrylat)-Mikrokapseln), in kolloidalen Medikament-Zufuhrsystemen (beispielsweise Liposomen, Albumin-Mikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanopartikeln und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen hergestellt werden. Solche Techniken sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, siehe oben, offenbart.
GDNFRα, GDNF oder ein Agonist davon, die für In-vivo-Verabreichung zu verwenden sind, müssen steril sein. Dies kann leicht durch Filtration durch sterile Filtrationsmembranen, vor oder nach Lyophilisierung und Rekonstitution erzielt werden. GDNFRα, GDNF oder ein Agonist davon werden für gewöhnlich in lyophilisierter Form oder in Lösung gelagert.
Therapeutische Zusammensetzungen von GDNFRα, GDNF oder eines Agonisten davon werden im Allgemeinen in einen Behälter gegeben, der eine sterile Auslassöffnung aufweist, beispielsweise in eine(n) intravenöse(n) Infusionsbeutel oder Flasche mit einem Stopfen, der von einer subkutanen Injektionsnadel durchstechbar ist.
Der Verabreichungsweg für GDNFRα, GDNF oder einen Agonisten davon steht im Einklang mit bekannten Verfahren., z. B. jenen Wegen, die oben für spezielle Indikationen dargelegt sind, sowie den allgemeinen Injektions- oder Infusionswegen durch intravenöse, intraperitoneale, intrazerebrale, intramuskuläre, intraokuläre, intraarterielle oder intraläsionale Mittel, oder durch Retard-Systeme, wie sie unten vermerkt sind. Im Allgemeinen sollte man, wenn es die Störung erlaubt, GDNFRα, GDNF oder einen Agonisten davon für ortsspezifische Zufuhr formulieren oder dosieren. Die Verabreichung kann durch eine implantierbare Pumpe mit konstantem oder programmierbarem Fluss oder durch regelmäßig wiederkehrende Injektionen erzielt werden.
Geeignete Beispiele von Retard-Präparaten umfassen semipermeable Matrices fester hydrophober Polymere, die das Protein enthalten, wobei die Matrices als Formteile, wie z. B. Filme, oder als Mikrokapseln vorliegen. Beispiele von Retard-Matrices umfassen Polyester, Hydrogele (z. B. Poly(2-hydroxyethylmethacrylat), wie beschrieben von Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15, 167–277 (1981) und Langer, Chem. Tech. 12, 98– 105 (1982) oder Poly(vinylalkohol)), Polylactide (US-Patent Nr. 3.773.919, EP 58.481 ), Copolymere von L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-glutamat (Sidman et al., Biopolymers 22, 547–556 (1983)), nicht abbaubares Ethylen-Vinylacetat (Langer et al., siehe oben), abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere, wie z. B. Luron Depot^TM (injizierbare Mikrokügelchen, die aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer und Leuprolidacetat bestehen) und Poly-D-(–)-3-hydroxybuttersäure ( EP 133.988 ).
Während Polymere, wie z. B. Ethylen-Vinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure die Freisetzung von Molekülen für über 100 Tage ermöglichen, setzen Hydrogele Proteine für kürzere Zeiträume frei. Wenn eingekapselte für lange Zeit im Körper verbleiben, können sie aus Ergebnis der Einwirkung von Feuchte bei 37°C denaturieren oder aggregieren, was in einem Verlust der biologischen Aktivität und möglichen Veränderungen der Immunogenität resultiert. Zweckmäßige Strategien können für die Proteinstabilisierung in Abhängigkeit vom beteiligten Mechanismus entwickelt werden. Wenn beispielsweise der Aggregationsmechanismus als intermolekulare S-S-Bindungsbildung durch Thio-Disulfid-Austausch erkannt wird, kann eine Stabilisierung durch Modifizieren von Sulfhydrylresten, Lyophilisieren aus sauren Lösungen, Kontrollieren des Feuchtegehalts, Verwenden geeigneter Zusätze und Entwickeln spezieller Polymermatrix-Zusammensetzungen erzielt werden.
Retard-Zusammensetzungen von GDNFRα, GDNF oder eines Agonisten davon umfassen auch GDNFRα, GDNF oder einen Agonisten davon, das/der in Liposomen eingeschlossen ist. GDNFRα, GDNF oder einen Agonisten davon enthaltende Liposomen werden durch an sich bekannte Verfahren hergestellt: DE 3.218.121 ; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688–3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030–4034 (1980); EP 52.322 ; EP 36.676 ; EP 88.046 ; EP 143.949 ; EP 142.641 ; Japanische Patentanmeldung 83–118008; US-Patent Nr. 4.485.045 und 4.544.545; und EP 102.324 . Für gewöhnlich sind Liposomen vom kleinen (ungefähr 200–800 Angström) Typ, in dem der Lipidgehalt höher als ungefähr 30 Mol-% Cholesterin beträgt, wobei der gewählte Anteil auf die geeignete Therapie eingestellt wird.
Bei topischer Anwendung wird GDNFRα, GDNF oder ein Agonist davon zweckmäßigerweise mit anderen Inhaltsstoffen kombiniert, wie z. B. Trägern und/oder Adjuvantien. Es bestehen keine Beschränkungen bezüglich der Beschaffenheit solcher anderer In haltsstoffe mit der Ausnahme, dass sie für ihre beabsichtigte Verabreichung physiologisch annehmbar und effizient sein müssen und die Aktivität der aktiven Inhaltsstoffe der Zusammensetzung nicht abbauen können. Beispiele geeigneter Vehikel umfassen Salben, Cremes, Gele oder Suspensionen mit oder ohne gereinigtem Collagen. Die Zusammensetzungen können ferner in Hautpflaster, Wundpflaster und Bandagen, vorzugsweise in flüssiger oder halbflüssiger Form imprägniert werden.
Zum Erlangen einer Gelformulierung kann GDNFRα, GDNF oder ein Agonist davon, der/das in eine flüssige Zusammensetzung formuliert ist, mit einer wirksamen Menge eines wasserlöslichen Polysaccharids oder synthetischen Polymers, wie z. B. PEG, gemischt werden, um ein topisch zu applizierendes Gel der richtigen Viskosität zu bilden. Das Polysaccharid, das verwendet werden kann, umfasst beispielsweise Cellulosederivate, wie z. B. veretherte Cellulosederivate, einschließlich Alkylcellulosen, Hydroxyalkylcelluiose und Alkylhydroxyalkylcellulosen, z. B. Methylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Carboxymethylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose und Hydroxypropylcellulose; Stärke und fraktionierte Stärke; Agar; Alginsäure und Alginate; Gummiarabicum; Pullulan; Agarose; Carrageenan; Dextrane; Dextrine; Fructane; Inulin; Mannane; Xylane; Arabinane; Chitosane; Gykogene; Glucane; und synthetische Biopolymere; sowie Kautschukarten, wie z. B. Guargummi, Johannisbrotgummi, Gummiarabicum, Tragnatgummi; und Karayagummi; und Derivate und Gemische davon. Das bevorzugte Geliermittel hierin ist eines, das gegenüber biologischen Systemen inert, nicht toxisch, einfach herzustellen und nicht zu fließend oder viskos ist und GDNFRα, GDNF oder einen Agonisten davon, das/der darin festgehalten wird, nicht destabilisiert.
Vorzugsweise ist das Polysaccharid ein verethertes Cellulosederivat, bevorzugter eines, das wohldefiniert, gereinigt und im USP verzeichnet ist, z. B. Methylcellulose und die Hydroxyalkylcellulosederivate, wie z. B. Hydroxypropylcellulose, Hydroxyethylcellulose und Hydroxypropylmethylcellulose. Insbesondre bevorzugt ist Methylcellulose.
Das zur Gelierung zweckdienliche Polyethylenglykol ist typischerweise ein Gemisch aus nieder- und hochmolekularen PEGs, um die richtige Viskosität zu erhalten. Beispielsweise wäre ein Gemisch aus PEG eins Molekulargewichts von 400–600 mit einem eines Molekulargewichts von 1500 für diesen Zweck effektiv, wenn es im richtigen Verhältnis gemischt wird, um eine Paste zu erhalten.
Der Ausdruck „wasserlöslich" umfasst bei Anwendung auf Polysaccharide und PEGs kolloidale Lösungen und Dispersionen. Im Allgemeinen wird die Löslichkeit der Cellulosederivate durch den Substitutionsgrad an Ethergruppe bestimmt und die hierin zweckdienlichen stabilisierenden Derivate sollten eine ausreichende Menge solcher Ethergruppen je Anhydroglucoseeinheit in der Cellulosekette aufweisen, um die Derivate wasserlöslich zu machen. Ein Ether-Substitutionsgrad von zumindest 0,35 Ethergruppen je Anhydroglucoseeinheit ist im Allgemeinen ausreichend. Zusätzlich können die Cellulosederivate in Form von Alkalimetallsalzen, z. B. als Li-, Na-, K- oder Cs-Salze vorliegen.
Wenn Methylcellulose im Gel angewendet wird, umfasst es vorzugsweise ungefähr 2– 5%, bevorzugter ungefähr 3% des Gels und GDNFRα, GDNF oder ein Agonist davon ist in einer Menge von ungefähr 300–1000 mg je ml des Gels zugegen.
Semipermeable, implantierbare Membraneinheiten sind als Mittel zum Zuführen von Medikamenten in manchen Fällen zweckdienlich. Beispielsweise können Zellen, die lösliches GDNFR, GDNF oder einen Agonisten davon oder Chimären sekretieren, eingekapselt werden, und solche Einheiten können in einen Patienten implantiert werden, beispielsweise in das Gehirn von Patienten, die an Parkinsonschen Krankheit leiden. Siehe US-Patent Nr. 4.892.538 von Aebischer et al.; US-Patent Nr. 5.011.472 von Aebischer et al., US-Patent Nr. 5.106.627 von Aebischer et al.; PCT-Anmeldung WO 91/10425; PCT-Anmeldung WO 91/10470; Winn et al., Exper. Neurology 113, 322–329 (1991); Aebischer et al., Exper. Neurology 111, 269–275 (1991); und Tresco et al., ASAIO 38, 17–23 (1992). Demgemäß ist auch ein Verfahren zur Prävention oder Be handlung eines Schadens an einem Nerv oder eines Schadens an anderen GDNFR-exprimierenden oder GDNF-reaktiven Zellen, z. B. Nierenzellen, wie hierin gelehrt umfasst, wobei das Verfahren das Implantieren von Zellen, die GDNFRα, GDNF oder einen Agonisten davon oder einen Antagonisten exprimieren, wie es für die spezielle Kondition erforderlich ist, in den Körper von Patienten umfasst, die dieses Behandlung benötigen. Schließlich umfasst die vorliegende Erfindung ein Implantationsgerät zur Prävention oder Behandlung von Nervenschaden oder Schaden an anderen Zellen, wie hierin gelehrt wird, das eine semipermeable Membran und eine Zelle enthält, die GDNFR, GDFN oder einen Agonisten davon sekretiert (oder einen Antagonisten, wie er für die spezielle Kondition benötigt wird) und in die Membran eingekapselt ist, wobei die Membran für GDNFRα, GDNF oder einen Agonisten davon permeabel und für Faktoren aus dem Patienten impermeabel ist, die für die Zellen schädlich sind. Die eigenen Zellen des Patienten, die zur Produktion von GDNF oder GDNFR es vivo transformiert worden sind, können in den Patienten, gegebenenfalls ohne eine solche Einkapselung, direkt implantiert werden. Die Verfahrensweise für die Membraneinkapselung lebender Zellen ist dem gewöhnlich Fachkundigen vertraut und die Herstellung eingekapselter Zeilen und ihre Implantation in Patienten kann auf fachbekannte Weise leicht erzielt werden. Die vorliegende Erfindung umfasst daher ein Verfahren zur Prävention oder Behandlung von Zellschaden, vorzugsweise Nervenschaden, durch Implantieren von Zellen in den Körper eines Patienten, der dies benötigt, wobei die Zellen entweder wegen ihrer natürlichen Fähigkeit, GDNFRα, GDNF oder einen Agonisten davon zu erzeugen, ausgewählt oder gentechnisch manipuliert werden, so dass sie GDNFRα, GDNF oder eine Agonisten davon sekretieren. Vorzugsweise ist das sekretierte GDNFRα lösliches, reifes Human-GDNFRα, wenn der Patient ein Mensch ist. reifes Human-GDNFRα (WO 93106116) ist die bevorzugte GDNF-Form. Die Implantate sind vorzugsweise nicht immunogen und/oder verhindern, dass immunogene implantierte Zellen von Immunsystem erkannt werden. Für die CNS-Zufuhr ist die Zerebrospinalsflüssigkeit des Rückenmarks eine bevorzugte Stelle für das Implantat.
Eine wirksame, therapeutisch einzusetzende Menge GDNFRα, GDNF oder eines Agonisten davon wird beispielsweise von den therapeutischen Zielen, dem Verabreichungsweg und der Kondition des Patienten abhängen. Demgemäß wird es für den Therapeuten notwendig sein, die Dosis zu titrieren und den Verabreichungsweg wie erforderlich zu modifizieren, um eine optimale therapeutische Wirkung zu erhalten. Typischerweise wird der Kliniker das GDNFRα, GDNF oder einen Agonisten davon verabreichen, bis diejenige Dosis erreicht ist, die die gewünschte Wirkung erzielt. Eine typische Tagesdosis für systemische Verabreichung kann im Bereich von ungefähr 1 μg/kg bis zu 10 mg/ kg oder mehr liegen, vorzugsweise sind es 1 μg/kg bis 2 mg/kg und bevorzugter 1 μg/kg bis 1 mg/kg in Abhängigkeit von den oben erwähnten Faktoren. Als ein alternativer allgemeiner Vorschlag wird GDNFRα, GDNF oder eine Agonist davon an die Zielstelle oder an das Zielgewebe in einer Dosis formuliert oder zugeführt, die in der Lage ist, im Gewebe eine Konzentration von GDNFRα-, GDNF- oder. eines Agonisten davon von mehr als ungefähr 0,1 ng/ml bis zu einer Maximaldosis, die wirksam, jedoch nicht unzulässig toxisch ist, bereitzustellen. Diese Konzentration innerhalb des Gewebes sollte, wenn möglich, durch kontinuierliche Infusion, verzögerte Freisetzung, typische Applikation, ein GDNFRα- (oder GDNF- oder einen Agonisten davon) exprimierendes Zellimplantat oder Injektion mit empirisch ermittelter Häufigkeit aufrecht erhalten werden. Der Fortschritt dieser Therapie kann leicht durch herkömmliche Tests für die zu behandelnde Störung beobachtet werden. Wenn GDNFRα im Komplex oder gemeinsam mit GDNF verabreicht wird, ist ein Verhältnis von GDNFRα zu GDNF von 100 : 1 bis 1 : 100 zweckdienlich. Vorzugsweise beträgt das Verhältnis 10 : 1 bis 1 : 10, bevorzugter 1 : 1 und noch bevorzugter 2 : 1, was das natürliche Bindungsverhältnis von GDNFRα zu GDNF widerspiegeln könnte.
GDNFRα-Nucleinsäure ist zweckdienlich zur Herstellung von GDNFRα-Polypeptid durch rekombinante Techniken, die hier beispielhaft dargestellt sind, die dann zur Produktion von Anti-GDNFRα-Antikörpern mit zahlreichen, unten beschriebenen Nutzungsmöglichkeiten verwendet werden können.
Das GDNFRα (Polypeptid oder Nucleinsäure) kann verwendet werden, um die GDNF-Reaktionsfähigkeit zu steigern (und folglich die Überlebensfähigkeit von Zellen zu erhöhen und Ret-vermittelte Stromab-Stoffwechselwege zu modulieren). Solche Zellen müssen Zelloberflächen-Ret enthalten oder so modifiziert sein, dass sie dieses enthalten. Ex vivo kultiviert können diese Zellen gleichzeitig anderen bekannten neurotrophen Faktoren oder Zytokinen, wie z. B. jenen hierin beschriebenen exponiert werden.
In noch einem weiteren Aspekt der Erfindung kann GDNFRα zur Affinitätsreinigung von entweder natürlich auftretenden oder synthetischen Liganden verwendet werden, die an GDNFRα binden. GDNF ist ein bevorzugter Ligand zur Reinigung. Kurz gesagt umfasst diese Technik: (a) Kontaktieren einer GDNF-Ligandenquelle mit einem immobilisierten GDNFRα unter Bedingungen, wodurch der zu reinigende GDNF-Ligand selektiv an den immobilisierten Rezeptor gebunden wird; (b) Waschen des immobilisierten GDNFRα und seines Trägers, um nicht adsorbiertes Material zu entfernen; und (c) Eluieren der GDNF-Ligandenmoleküle vom immobilisierten GDNFRα, an die sie gebunden sind, mit einem Elutionspuffer. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Affinitätsreinigung wird GDNFRα kovalent an ein(e) inerte(s) und poröses) Matrix oder Harz gebunden (z. B. mit Bromcyan umgesetzte Agarose). Speziell bevorzugt ist ein an eine Protein A-Säule immobilisiertes GDNFRα-Immunadhäsin. Eine den GDNF-Liganden enthaltende Lösung wird dann durch das Chromatographiematerial geschickt. Der GDNF-Ligand adsorbiert an die Säule und wird anschließend durch Ändern der Elutionsbedingungen (z. B. Ändern des pH-Wertes oder der Ionenstärke) freigesetzt. Neue Liganden können durch Messen der Verdrängung eines markierten GDNF-Liganden, wie z. B. ¹²⁵I- oder biotinyliertes GDNF, detektiert werden.
GDNFRα kann für kompetitives Screening potentieller Agonisten oder Antagonisten auf Bindung an GDNFRα verwendet werden. Solche Agonisten oder Antagonisten können potentielle Therapeutika zum Behandeln von Konditionen darstellen, die durch ungenügende oder überschüssige GDNFRα-Aktivierung charakterisiert sind.
Die bevorzugte Technik zum Identifizieren von Molekülen, die GDNFRα binden, wendet einen an eine Festphase, wie z. B. den Napf einer Testplatte gebundenen chimären Rezeptor an (z. B. Epitop-markiertes GDNFRα oder GDNFRα-Immunadhäsin). Das Binden der Kandidatmoleküle, die gegebenenfalls markiert (z. B. radiomarkiert) sind, an den immobilisierten Rezeptor kann gemessen werden. Alternativ dazu kann die Konkurrenz um Bindung eines bekannten, markierte GDNFRα-Liganden, wie z. B. ¹²⁵I-GDNFR, gemessen werden. Zum Screening von Antagonisten kann das GDNFRα mit einem GDNF-Liganden, gefolgt vom mutmaßlichen Antagonisten exponiert werden, oder es können GDNF-Ligand und Antagonist dem GDNFRα gleichzeitig zu gesetzt und die Fähigkeit des Antagonisten, die Rezeptoraktivierung zu blockieren, beurteilt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Testsysteme zum Detektieren der GDNF-Aktivität bereit, die Zellen umfassen, die hohe GDNFRα-Spiegel exprimieren und die daher sogar gegen sehr niedrige Konzentrationen von GDNF oder GDNF-artigen Molekülen äußerst empfindlich sind. Die vorliegende Erfindung stellt Testsysteme bereit, in denen GDNF-Aktivität oder Aktivitäten detektiert werden können, die denen der GDNF-Aktivität ähnlich sind, die aus der Exposition mit einem Peptid oder einer Nicht-Peptid-Verbindung resultieren, und zwar durch Messen einer physiologischen Reaktion auf GDNF in einer Zelle oder Zelllinie, die auf GDNF reaktiv ist und GDNFR-Moleküle der Erfindung exprimiert. Eine physiologische Reaktion kann jede der biologischen Wirkungen von GDNF umfassen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf jene, die hierin beschrieben werden, sowie die transkriptionelle Aktivierung bestimmter Nucleinsäuresequenzen (z. B. Promotor-/Enhancer-Elemente sowie Strukturgene), GDNF-bezogene Prozessierung, Translation oder Phosphorylierung, die Induktion sekundärer Prozesse als Reaktion auf Prozesse, die direkt oder indirekt von GDNF induziert werden, einschließlich Ret-vermittelte Wirkungen und morphologische Veränderungen, wie z. B. Neuriten-Aussprossung oder die Fähigkeit, das Überleben von Zellen, zum Beispiel Knoten- oder Spinalganglienzellen, Motoneuronen, dopaminergen Neuronen, sensorischen Neuronen, Purkinje-Zellen oder Hippokamp-Zellen zu fördern.
In einer der Ausführungsformen der Erfindung kann die funktionelle Wechselwirkung zwischen GDNF und dem GDNFRα durch Detektieren einer Erhöhung der Produktion von autophosphoryliertem Ret-Protein oder alternativ dazu phosphorylierten ERK-1- oder ERK-2-Homologen beobachtet werden (siehe Kotzbauer et al., siehe oben).
Die vorliegende Erfindung sorgt für die Entwicklung neuer Testsysteme, die beim Screening von Verbindungen für GDNF- oder GDNF-artige Aktivität angewendet werden können. Zielzellen, die GDNF binden, können durch Transfektion mit für GDNFRα kodierender Nucleinsäure produziert oder können beispielsweise durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung, Sedimentation von Rosetten oder Grenzverdünnung identifiziert und abgesondert werden. Sobald die Zielzellelinien produziert oder identifiziert sind, kann es wünschenswert sein, auf Zellen zu selektieren, die außergewöhnlich empfindlich auf GDNF sind. Solche Zielzellen können eine höhere Anzahl von GDNFRα-Molekülen beherbergen; Zielzellen, die eine relativ große Menge GDNFRα beherbergen, können durch Selektieren von Zielzellen identifiziert werden, die an hohe GDNF-Konzentrationen binden, beispielsweise durch Markieren von Hochexprimierern mit Fluorophormarkiertem GDNF, gefolgt von Immunfluoreszenzdetektion und Zellsortierung. Alternativ dazu können Zellen, die außergewöhnlich empfindlich auf GDNF sind, eine relativ starke biologische Reaktion als Reaktion auf GDNF-Bindung zeigen, wie z. B. einen plötzlichen Anstieg Ret-vermittleter Wirkungen oder von unmittelbar frühen Genprodukten, wie z. B. c-fos oder c-jun. Durch Entwicklung von Testsystemen unter Anwendung von Zielzellen, die äußerst empfindlich auf GDNF sind, stellt die vorliegende Erfindung Screeningverfahren auf GDNF oder GDNF-artige Aktivität bereit, die zur Detektion niedriger Spiegel an GDNF-Aktivität fähig sind.
Insbesondere unter Anwendung rekombinanter DNA-Techniken stellt die vorliegende Erfindung GDNF-Zielzellen bereit, die genetisch so manipuliert sind, dass sie auf GDNF höchst empfindlich sind. Beispielsweise kann das GDNF-Rezeptorgen in Zellen insertiert werden, die natürlicherweise GDNF-reaktiv sind, so dass das rekombinante GDNFR-Gen in hohen Mengen exprimiert wird und die resultierenden, genetisch manipulier ten Zielzellen eine hohe Anzahl von GDNFRs an ihrer Zelloberfläche exprimieren. Alternativ dazu oder zusätzlich können die Zielzellen genetisch so manipuliert werden, dass sie ein rekombinantes Gen umfassen, das in hohen Mengen als Reaktion auf GDNF/Rezeptor-Bindung exprimieren. Ein solches rekombinantes Gen kann vorzugsweise mit einem leicht detektierbaren Produkt assoziiert sein. Beispielsweise und nicht einschränkend können Transkriptionskontrollregionen (d. h. Promotor/Enhancer-Regionen) aus einem unmittelbar frühen Gen verwendet werden, um die Expression eines Reportergens in einem Konstrukt zu kontrollieren, das in die Zielzelle eingeführt werden kann. Das unmittelbar frühe Gen/Reportergen-Konstrukt kann, wenn es in Zielzellen aufgrund von eines starken Promotors/Enhancers oder einer hohen Kopiezahl in hohen Mengen exprimiert wird, verwendet werden, um eine amplifizierte Reaktion auf GDNFR-Bindung zu produzieren. Beispielsweise und nicht einschränkend kann ein GDNF-reaktiver Promotor verwendet werden, um die Expression detektierbarer Reportergene, einschließlich β-Galactosidase, Wachstumshormon, Chloramphenicol-Acetyltransferase, Neomycin-Phosphotransferase, Luciferase oder β-Glucuronidase zu kontrollieren. Die Detektion der Produkte dieser Reportergene, die dem Fachkundigen wohlbekannt ist, kann als empfindlicher Indikator für GDNF- oder GDNF-artige Aktivität pharmazeutischer Verbindungen dienen.
Die hierin erörterten, für GDNF- oder GDNFRα kodierenden Genkonstrukte (z. B. lösliches ECD) können unter Anwendung irgendeines fachbekannten Verfahrens, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Transfektion, Elektroporation, Calciumphosphat/DEAE-Dextran-Verfahren und Zellkanone in Zielzellen insertiert werden. Die Konstrukte und genetisch manipulierten Zielzellen können zur Produktion transgener Tiere verwendet werden, welche die oben erwähnten Konstrukte als Transgene beherbergen, aus denen GDNF oder GDNFRα exprimierende Zielzellen unter Anwendung der erörterten Verfahren selektiert werden können.
Nucleinsäuren, die für GDNFR, vorzugsweise aus Nicht-Human-Spezies, wie z. B. Maus oder Ratte kodieren, können verwendet werden, um entweder transgene Tiere oder „Knocknut"-Tiere zu erzeugen, die ihrerseits für Entwicklung und Screening therapeutisch nützlicher Reagenzien zweckdienlich sind. Ein transgenes Tier (z. B. eine Maus) ist ein Tier, das Zellen aufweist, die ein Transgen enthalten, wobei dieses Transgen in das Tier oder einen Vorfahren des Tieres in einem pränatalen, z. B. embryonalen Stadium eingeführt wurde. Ein Transgen ist eine DNA, die in das Genom einer Zelle, aus dem sich das transgene Tier entwickelt, integriert wird. In einer der Ausführungsformen kann die für GDNFRα kodierende Human- und/oder Ratten-cDNA oder eine geeignete Sequenz davon verwendet werden, um für GDNFR kodierende genomische DNA nach etablierten Techniken zu klonieren und die genomischen Sequenzen können verwendet werden, um transgene Tiere zu erzeugen, die Zellen enthalten, die für GDNFR kodierende DNA exprimieren. Verfahren zur Erzeugung transgener Tiere, insbesondere von Tieren wie die Maus, sind auf dem Gebiet der Erfindung üblich geworden und werden zum Beispiel in US-Patenten Nr. 4.736.866 und 4.870.009 beschrieben. Typischerweise wird auf bestimmte Zellen für die GDNFR-Transgeninkorporation mit gewebespezifischen Enhancern abgezielt, was die gewünschte Behandlungswirkung bewirken kann. Transgene Tiere, die eine Kopie eines im Embryonalstadium in die Keimbahn des Tieres eingeführten, für GDNFR kodierenden Transgens umfassen, können dazu verwendet werden, um die Wirkung erhöhter Expression der für GDNFR kodierenden DNA zu untersuchen. Solche Tiere können als Versuchstiere für Reagenzien verwendet werden, von denen angenommen wird, dass sie Schutz, beispielsweise vor Krankheiten, die mit GDNF in Verbindung stehen, verleihen. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung wird ein Tier mit dem Reagens behandelt und ein vermindertes Auftreten der Krankheit im Vergleich zu unbehandelten, das Transgen beherbergenden Tieren, würde auf eine potentielle therapeutische Intervention für die Krankheit hinweisen.
Minigene beherbergende transgene Mäuse sind zur Zeit bevorzugt. Zuerst wird ein Fusionsenzym-Expressionskonstrukt erzeugt und auf Basis der Expression in Zellkultur wie in den Beispielen beschrieben selektiert. Danach wird unter Anwendung bekannter Techniken ein Minigen konstruiert, das zur Expression dieses Fusionsenzyms fähig ist.
Speziell bevorzugte Wirte sind jene, die Minigen-Konstrukte beherbergen, die ein Transkriptionsregulationselement umfassen, das gewebespezifisch für die Expression ist.
Das GDNFR-Minigen exprimierende transgene Mäuse werden unter Anwendung bekannten Techniken hergestellt, die beispielsweise Wiedergewinnung befruchteter Eizellen, Mikroinjektion des DNA-Konstrukts in männliche Vorkerne und Wiedereinbringung der befruchteten transgenen Eizellen in die Uteri hormonal manipulierter pseudoschwangerer Ziehmütter umfassen. Alternativ dazu können unter Anwendung bekannter Techniken Chimären hergestellt werden, wobei beispielsweise embryonale Stammzellen (Rossant et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. Biol. 339, 207–215 (1993)) oder Urkeimzellen (Vick et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. Biol. 251, 179–182 (1993)) der Wirtspezies eingesetzt werden. Die Insertion des Transgens kann durch Southern-Blotting von DNA evaluiert werden, die aus den Schwänzen der Nachkommen hergestellt wurden. Solche transgenen Mäuse werden dann rückgekreuzt, um Homozygoten zu liefern.
Es ist nunmehr wohl etabliert, dass Transgene effizienter exprimiert werden, wenn sie Introns am 5'-Ende enthalten und wenn diese natürlich auftretende Introns sind (Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 836 (1988); Yokode et al., Science 250, 1273 (1990)).
Das GDNFR-Minigen exprimierende transgene Mäuse werden unter Anwendung etablierter Verfahren zur Erzeugung transgener Mäuse erzeugt. Transgene Mäuse werden unter Anwendung von nunmehr standardmäßigen Verfahren konstruiert (et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 434 (1991); Rubin et al., Nature 353, 265 (1991)). Befruchtete Eier aus zeitlich festgelegten Paarungen werden aus dem Eileiter durch sanftes Spülen mit PBS gewonnen und mit bis zu 100 Nanolitern DNA-Lösung mikroinjiziert, wobei ungefähr 10⁴ DNA-Moleküle in den männlichen Vorkern eingebracht werden. Erfolgreich injizierte Eier werden dann wieder in pseudo-schwangere Ziehmütter durch Eileitertransfer implantiert. Weniger als 5% der mikroinjizierten Eier liefern transgene Nachkommen, und nur ungefähr 1/3 von diesen exprimieren aktiv das Transgen: Diese An zahl ist wahrscheinlich von der Stelle abhängig, an der das Transgen in das Genom eintritt.
Transgene Nachkommen werden identifiziert, indem die Inkorporation des mikroinjizierten Transgens in ihre Genome nachgewiesen wird, vorzugsweise indem DNA aus kurzen Schwanzabschnitten präpariert und durch Southern-Blotting auf die Anwesenheit des Transgens analysiert wird („Tail-Blots"). Eine bevorzugte Sonde ist ein Segment eines Minigen-Fusionskonstrukts, das im Transgen einzigartig vorhanden ist, nicht jedoch im Maus-Genom. Alternativ dazu liefert die Substitution einer natürlichen Sequenz von Codons im Transgen mit einer anderen Sequenz, die nach wie vor für dasselbe Peptid kodiert, eine einzigartige Region, die bei der DNA- und RNA-Analyse identifizierbar ist. Transgene „Gründer"-Mäuse, die auf diese Weise identifiziert werden, werden mit normalen Mäusen vermehrt, um Heterozygoten zu liefern, die rückgekreuzt werden, um eine Linie transgener Mäuse zu erzeugen. Tail-Blots jeder Maus aus jeder Generation werden untersucht, bis der Stamm etabliert und homozygot ist. Jede erfolgreich erzeugte Gründer-Maus und ihr Stamm weicht von anderen Stämmen bezüglich der Stelle und Kopieanzahl in das Mausgenom insertierter Transgene ab und weisen daher breit variierende Spiegel der Transgen-Expression auf. Aus jeder etablierten Linie ausgewählte Tiere werden im Alter von 2 Monaten getötet und die Expression des Transgens mittels Northern-Blotting von RNA aus Leber, Muskel, Fett, Niere, Hirn, Lunge, Herz, Milz, Gonaden, Nebennieren und Darm analysiert.
Alternativ dazu können die nicht-humanen Homologe von GDNFR verwendet werden, um ein GDNFR-„Knockout"-Tier zu erzeugen, d. h. mit einem defekten oder veränderten für GDNFR kodierenden Gen als Resultat der homologen Rekombination zwischen dem endogenen GDNFR-Gen und einer veränderten genomischen, in eine embryonale Zelle des Tiers eingeführte GDNFR-DNA. Beispielsweise kann Maus-GDNFR-cDNA verwendet werden, um genomische GDNFR-DNA nach etablierten Techniken zu klonieren. Ein Abschnitt der genomischen GDNFR-DNA (wie z. B. ein Exon, das z. B. für eine extrazelluläre Domäne kodiert) kann deletiert oder durch ein anderes Gen ersetzt werden, wie z. B. durch ein Gen, das für einen selektierbaren Marker kodiert, der zur Detektion der Integration verwendet werden kann. Typischerweise werden mehrere Kilobasen unveränderter flankierender DNA (an 5'- sowie 3'-Enden) in den Vektor aufgenommen (siehe z. B. Thomas und Capecchi, Cell 51, 503 (1987) für eine Beschreibung von homologen Rekombinationsvektoren). Der Vektor wird in eine embryonale Stammzelllinie eingeführt (z. B. durch Elektroporation) und Zellen, in denen die eingeführte DNA mit der endogenen DNA homolog rekombiniert hat, werden selektiert (siehe z. B. Li et al., Cell 69, 915 (1992)). Die selektierten Zellen werden dann in eine Blastozyte eines Tieres (z. B. einer Maus) injiziert, um Aggregations-Chimären zu bilden (siehe z. B. Bradley, in: Teracarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson (Hrsg.), IRL, Oxford, S. 113–152 (1987)). Ein chimärer Embryo kann dann in ein geeignetes pseudoschwangeres, weibliches Ziehtier implantiert und der Embryo ausgetragen werden, um ein „Knockout"-Tier zu erzeugen. Nachkommen, welche die homolog rekombinierte DNA in ihren Keimzellen beherbergen, können mittels Standardtechniken identifiziert und verwendet werden, um Tiere zu züchten, in denen alle Zellen des Tieres die homolog rekombinierte DNA enthalten. Knockout-Tiere können auf ihre Fähigkeit hin charakterisiert werden, Transplantate zu akzeptieren, Tumoren abzustoßen und sich gegen Infektionskrankheiten zu wehren, und können bei der Untersuchung grundlegender Immunbiologie verwendet werden.
Zusätzlich zu den obigen Verfahren, die zum Herstellen rekombinanter DNA-Moleküle und transformierter Wirtstiere gemäß der praktischen Ausführung dieser Erfindung verwendet werden können, können andere bekannte Techniken und deren Modifizierungen bei der praktischen Ausführung der Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel offenbart US-Patent Nr. 4.736.866 Vektoren und Verfahren zur Produktion eines transgenen, nicht-humanen, eukaryotischen Tiers, dessen Keimzellen und somatische Zellen eine in das Tier, oder in einen Vorfahren des Tiers im Embryonalstadium eingeführte Gensequenz enthalten. US-Patent Nr. 5.087.571 offenbart ein Verfahren zur Bereitstellung einer Zellkultur, die (1) das Bereitstellen eines transgenen, nicht-humanen Säugetiers, dessen Keimzellen und somatische Zellen alle eine im Embryonalstadium einge führte rekombinante Gensequenz enthalten; und (2) das Kultivieren einer oder mehrerer der besagten somatischen Zellen umfasst. US-Patent Nr. 5.175.385 offenbart Vektoren und Verfahren zur Produktion einer transgenen Maus, dessen somatische Zellen und Keimzellen ein Gen in ausreichenden mengen enthält und exprimiert, um für den gewünschten Phänotyp in der Maus zu sorgen, wobei das Gen in die Maus oder einen Vorfahren in einem Embryonalstadium, vorzugsweise durch Mikroinjektion eingeführt worden ist. Ein teilweise konstitutiver Promotor, der Metallothionein-Promotor, wurde verwendet, um die heterologe Expression anzutreiben. US-Patent Nr. 5.175.384 offenbart ein Verfahren der Einführung eines Transgens in einen Embryo durch Infizieren des Embryos mit einem das Transgen enthaltendem Retrovirus. US-Patent Nr. 5.175.383 offenbart DNA-Konstrukte, die ein zur Wirtszelle homologes Gen aufweisen, das operativ an einen heterologen und induzierbaren Promotor gebunden ist, der zur Expression des Gens in den urogenitalen Geweben der Maus wirksam ist, wobei das Transgen in einem Embryonalstadium in die Maus eingeführt wird, um eine transgene Maus zu produzieren. Obwohl ein homologes Gen eingeführt wird, kann das Gen an einer Stelle in ein Chromosom der Maus integrieren, die vom Ort der endogenen kodierenden Sequenz verschieden ist. Der lebenswichtige MMTV-Promotor wurde als geeigneter induzierbaren Promotor offenbart. US-Patent Nr. 5.162.215 offenbart Verfahren und Vektoren zum Transfer von Genen in Vogelspezies, einschließlich Nutztierspezies, wie z. B. Hühner, Truthähne, Wachteln oder Enten, wobei pluripotente Stammzellen von Embryos genützt wurden, um transgene Tiere zu erzeugen. US-Patent Nr. 5.082.779 offenbart Hypophysen-spezifische Expressionspromotoren zur Verwendung bei der Produktion transgener Tiere, die zur gewebespezifischen Expression eines Gens fähig sind. US-Patent Nr. 5.075.229. offenbart Vektoren und Verfahren zur Produktion transgener, chimärer Tiere, deren hämopoetische Leberzellen ein funktionelles Gen enthalten und exprimieren, das von einem Leber-spezifischen Promotor angetrieben wird, und zwar durch Injizieren der offenbarten Vektoren in die Peritonealhöhle eines Wirtsfötus, so dass der Vektor sich in das Genom der fötalen hämopoetischen Leberzellen integriert.
Obgleich einige der oben erwähnten Patente und Publikationen die Produktion oder Verwendung eines speziellen Genprodukts oder Materials betreffen, die nicht im Schutzumfang der vorliegende Erfindung liegen, können die darin beschriebenen Verfahren leicht für die praktische Anwendung der in dieser Patentbeschreibung beschriebenen Erfindung von jenen modifiziert werden, die auf dem Gebiet der Fermentation und Gentechnik fachkundig sind.
Testsysteme der vorliegende Erfindung ermöglichen das effiziente Screening pharmazeutischer Verbindungen zur Verwendung bei der Behandlung GDNF-assoziierter Krankheiten. Zum Beispiel und nicht einschränkend kann es wünschenswert sein, ein pharmazeutisches Mittel auf GDNF-Aktivität und therapeutische Wirksamkeit bei Nieren- oder Zerebellum-Degeneration zu screenen. In einer der Ausführungsformen der Erfindung können auf GDNF reaktive Zellen identifiziert und isoliert und dann in Mikronäpfen einer Multinapf-Kulturplatte kultiviert werden. Kulturmedium mit zugesetztem Testmittel oder zugesetztem GDNF in zahlreichen Verdünnungen können den Näpfen gemeinsam mit geeigneten Kontrollen zugegeben werden. Die Zellen können dann auf verbesserte Überlebensfähigkeit, Neuriten-Sprossung und dergleichen untersucht werden und es kann die Aktivität des Testmittels und GDNF sowie ihre relativen Aktivitäten ermittelt werden. Zum Beispiel kann man nunmehr GDNF-artige Verbindungen identifizieren, die beispielsweise wie GDNF Motoneuronen-Zelltod als Reaktion auf toxischen Angriff oder Abschneiden von Axons verhindern. GDNF-reaktive Motoneuronen oder Darmneuronen könnten in Testsystemen genutzt werden, um Verbindungen zu identifizieren, die bei der Behandlung von Motoneuronen- oder Darmnervensystem-Krankheiten zweckdienlich sind. Wenn eine bestimmte Krankheit mit einer defekten GDNF-Reaktion in einem bestimmten Gewebe assoziiert ist, wäre eine zweckmäßige Behandlung für die Krankheit das Versorgen des Patienten mit exogenem GDNF. Jedoch kann es wünschenswert sein, Moleküle zu entwickeln, die höhere Halbwertszeiten als endogenes GDNF aufweisen oder die als GDNF-Agonisten agieren oder die auf ein bestimmtes Gewebe abzielen. Demgemäß können die Verfahren der Erfindung dazu verwendet werden, effiziente und empfindliche Screeningsysteme herzustellen, die zur Identifizie rung von Molekülen mit den gewünschten Eigenschaften verwendet werden können. Ähnliche Testsysteme könnten zur Identifizierung von GDNF-Antagonisten verwendet werden.
Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung experimentelle Modellsysteme zur Untersuchung der physiologischen Rolle von GDNF und seinen Rezeptor bereit. Solche Systeme umfassen Tiermodelle, wie z. B. (i) Tiere, die zirkulierenden GDNFRα-Peptiden exponiert werden, das mit dem zellulären Rezeptor für GDNF-Bindung konkurriert und dadurch einen GDNF-verarmten Zustand hervorruft; (ii) mit GDNFR immunisierte Tiere; (iii) transgene Tiere, die hohe mengen GDNFR exprimieren und daher hypersensitiv gegen GDNF sind; und (iv) unter Anwendung embryonaler Stammzellentechnologie hergeleitete Tiere, in denen die endogenen GDNFR-Gene aus dem Genom deletiert worden sind.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner experimentelle Modellsysteme zur Untersuchung der physiologischen Rolle von GDNF und seinen Rezeptor bereit. In diesen Modellsystemen kann GDNFR-Protein, Peptidfragment oder ein Derivat davon entweder dem System zugeführt oder im System produziert werden. Solche Modellsysteme könnten verwendet werden, um die Wirkungen von GDNF-Überschuss oder GDNF-Mangel zu untersuchen. Die experimentellen Modellsysteme könnten verwendet werden, um die Wirkungen erhöhter oder verminderter Reaktion auf GDNF in Zell- oder Gewebekulturen, in vollständigen Tieren, insbesondere Zellen oder Geweben im Inneren vollständiger Tiere oder Gewebekultursysteme oder über festgelegte Zeitintervalle (einschließlich während der Embryogenese) in Ausführungsformen zu untersuchen, in denen die GDNFR-Expression von einem induzierbaren oder entwicklungsmäßig kontrollierten Promotor reguliert ist. In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung können die CMV-Promotoren verwendet werden, um die Expression von GDNFRα in transgenen Tieren zu kontrollieren. Transgene Tiere werden wie hierin erörtert durch ein beliebiges fachbekanntes Verfahren produziert, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Mikroinjektion, Zellfusion, Transfektion und Elektroporation.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Modellsysteme für die Autoimmunkrankheit bereit, in denen eine Autoimmunreaktion sich gegen GDNFRα richtet. Solche Modelle umfassen Tiere, die mit immunogenen Mengen von GDNFR immunisiert worden sind und vorzugsweise Anti-GDNFR-Antikörper und/oder zellvermittelte Immunität produzieren. Um ein solches Modellsystem herzustellen, kann es wünschenswert sein, das GDNFR in Verbindung mit einem Adjuvans zu verabreichen.
Beispielsweise kann ein nicht einschränkendes Modellsystem erzeugt werden, das dazu verwendet werden kann, die Wirkungen überschüssiger GDNF-Aktivität zu untersuchen. In einem solchen System könnte die Reaktion auf GDNF durch gentechnisches Aufbringen einer erhöhten Anzahl von GDNFRs auf Zellen des Modellsystems im Vergleich zu Zellen, die nicht auf diese Weise gentechnisch manipuliert worden sind, gesteigert werden. Die Zellen sollten auch Ret oder ein anderes Signalmolekül exprimieren, das zur Wechselwirkung mit GDNFRα und Vermittlung eines GDNF-Signals fähig ist. Es kann bevorzugt sein, eine erhöhte Anzahl von GDNFRs selektiv an Zellen bereitzustellen, die normalerweise GDNFRs exprimieren. Zellen könnten gentechnisch manipuliert werden, um eine erhöhte Anzahl von GDNFR durch Infektion mit einem Virus zu produzieren, der ein GDNFR-Gen der Erfindung trägt. Alternativ dazu könnte das GDNFR-Gen den Zellen durch Transfektion bereitgestellt werden. Wenn das Modellsystem ein Tier ist, könnte ein rekombinantes GDNFR-Gen in die Zellen des Tieres durch Infektion mit einem Virus eingeführt werden, der das GDNFR-Gen oder andere wie hierin erörterte Mittel beherbergt. Zum Beispiel kann ein transgenes Tier erzeugt werden, welches das GDNFR-Gen als Transgen beherbergt. Um die Expression von GDNFR zu gewährleisten, sollte das GDNFR-Gen unter die Kontrolle einer geeigneten Promotorsequenz gestellt werden. Es könnte wünschenswert sein, das GDNFR-Gen unter die Kontrolle eines konstitutiven und/oder gewebespezifischen Promotors zu stellen. Durch Erhöhen der Anzahl zellulärer GDNFRs könnte die Reaktion auf endogenes GDNF erhöht werden. Wenn das Modellsystem wenig oder kein GDNF enthält, könnte GDNF dem System zugegeben werden. Es könnte ferner wünschenswert sein, zusätzliches GDNF dem Modellsystem zuzufügen, um die Wirkungen überschüssiger GDNF-Aktivi tät zu beurteilen. Überexprimieren von GDNF (oder sekretiertem GDNF) könnte das bevorzugte Verfahren zum Untersuchen der Wirkungen erhöhter GDNF-Mengen an Zellen sein, die bereits GDNF exprimieren. Bevorzugter wäre es, GDNFR in allen Zellen zu exprimieren (generelle Expression) und zu ermitteln, welche Zellen dann mit funktioneller Reaktivität auf GDNF ausgestattet sind, was folglich die potentielle Identifizierung einer zweiten Rezeptorkomponente ermöglicht, falls eine existiert.
Es könnte ein experimentelles Modellsystem erzeugt werden, das dazu verwendet werden kann, um die Wirkungen verminderter GDNF-Aktivität zu untersuchen. Dieses System kann die Identifizierung von Prozessen oder Neuronen erlauben, die GDNF benötigen und die potentielle therapeutische Ziele darstellen. In einem solchen System kann die Reaktion auf GDNF erniedrigt werden, indem rekombinante GDNFRs bereitgestellt werden, die nicht mit einer Zelloberfläche assoziiert sind oder die genetisch manipuliert sind, so dass sie bei der Übertragung einer Reaktion auf GDNF unwirksam sind. Beispielsweise kann das System mit GDNFR-Protein, Peptid oder einem Derivat davon versorgt werden, so dass der bereitgestellte Rezeptor mit endogenem GDNFR um GDNF-Bindung konkurrieren kann, wodurch die Reaktion auf GDNF vermindert wird. Das GDNFR kann ein zellfreier Rezeptor sein, der entweder dem System zugesetzt oder vom System produziert wird. Zum Beispiel kann ein GDNFR-Protein, dem die Transmembrandomäne fehlt, von Zellen innerhalb des Systems produziert werden, z. B. als ankerstellenfreies GDNFR, das von der produzierenden Zelle sekretiert wird. Alternativ dazu kann GDNFR-Protein, Peptid oder ein Derivat davon einem extrazellulären Raum innerhalb des Systems zugesetzt werden. In weiteren Ausführungsformen der Erfindung kann ein rekombinantes GDNFR-Gen verwendet werden, um das endogene Gen durch homologe Rekombination zu inaktivieren oder dessen „Knockout" zu bewirken und folglich eine) GDNFR-defiziente(s) Zelle, Gewebe oder Tier zu erzeugen. Beispielsweise und nicht einschränkend kann ein rekombinantes GDNFR-Gen gentechnisch hergestellt werden, so dass es eine Insertionsmutation enthält, beispielsweise das Neo-Gen, das GDNFR inaktiviert. Ein solches Konstrukt kann unter Kontrolle eines geeigneten Promotors unter Anwendung einer Technik, wie z. B. Transfektion, Transduktion, Injektion usw. in eine Zelle, wie z. B. in eine embryonale Stammzelle eingeführt werden. Das Konstrukt enthaltende Zellen können dann mittels G418-Resistenz selektiert werden. Zellen, denen ein intaktes GDNFR-Gen fehlt, können dann z. B. durch Southern-Blotting oder Northern-Blotting oder Testen der Expression identifiziert werden. Zellen, denen ein intaktes GDNFR-Gen fehlt, können dann an frühe Embryonalzellen fusioniert werden, um transgene Tiere zu erzeugen, die GDNFR-defizient sind. Ein Vergleich eines solchen Tieres mit einem Tier, das kein endogenes GDNF exprimiert, würde zeigen, dass entweder die beiden Phänotypen vollkommen übereinstimmen oder dass sie das nicht tun, was bedeutet, was auf die Gegenwart zusätzlicher GDNF-artiger Faktoren oder Rezeptoren schließen lässt. Ein solches Tier kann verwendet werden, um spezielle Zellpopulationen, z. B. Neuronenpopulationen oder beliebige andere In-vivo-Prozesse zu definieren, die normalerweise von GDNF und seinem Rezeptor abhängen. Folglich kann von diesen Populationen oder Prozessen erwartet werden, dass sie beeinflusst werden, wenn das Tier GDNFR nicht exprimierte und daher nicht auf GDNF reagieren konnte. Alternativ dazu kann ein rekombinantes GDNFR-Protein, Peptid oder Derivat davon, das mit dem endogenen Rezeptor für GDNF konkurriert, an der Oberfläche von Zellen innerhalb des Systems exprimiert werden, jedoch gentechnisch so konstruiert sein, dass keine Reaktion auf GDNF-Bindung übertragen kann. Die oben beschriebenen rekombinanten GDNFR-Proteine, Peptide oder Derivate davon könnten mit einer Affinität an GDNF binden, die ähnlich der Affinität von endogenem GDNFR für GDNF oder davon verschieden ist. Um die Reaktion auf GDNF effizienter zu vermindern, sollte das GDNFR-Protein, Peptid oder Derivat davon wünschenswerterweise mit einer höheren Affinität als der native Rezeptor an GDNF binden. Wenn das GDNFR-Protein, Peptid oder Derivat davon innerhalb des Modellsystems produziert wird, kann für GDNFR-Protein, Peptid oder ein Derivat davon kodierende Nucleinsäure dem System durch Infektion, Transduktion usw. oder als Transgen zu geführt werden. Wie oben erörtert, kann das GDNFR-Gen unter die Kontrolle eines geeigneten Promotors gestellt werden, der beispielsweise ein gewebespezifischer Promotor oder ein induzierbarer Promotor oder ein entwicklungsmäßig regulierter Promotor sein kann. In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung kann das endogene GDNFR-Gen einer Zelle durch ein mutiertes GDNFR-Gen durch homologe Rekombination ersetzt werden. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann die GDNFR-Expression durch Bereitstellen GDNFR-exprimierender Zellen mit einer Menge GDNFR-Antisense-RNA oder DNA, die zur Verminderung der Expression von GDNFR-Protein wirksam ist, vermindert werden.
Die GDNFRα-Polypeptide sind auch als Molekulargewichtsmarker zweckdienlich. Um ein GDNFRα-Polypeptid als Molekulargewichtsmarker zu verwenden, wird beispielsweise Gelfiltrationschromatographie oder SDS-PAGE angewendet, um Proteine) zu trennen, für die es erwünscht ist, ihre) Molekulargewicht(e) auf im Wesentlichen normale Weise zu bestimmen. GDNFRα, vorzugsweise lösliches GDNFR und andere Molekulargewichtsmarker werden als Standards verwendet, um einen Bereich von Molekulargewichten bereitzustellen. Beispielsweise können Phosphorylase b (MG = 97.000), Rinderserumalbumin (MG = 68.000), Ovalbumin (MG = 46.000), Trypsininhibitor (MG = 20.100) und Lysozym (MG = 14.000) als MG-Marken verwendet werden. Die anderen hier erwähnten Molekulargewichtsmarker können im Handel von Amersham Corporation, Arlington Heights, IL, bezogen werden. Die Molekulargewichtsmarker werden im Allgemeinen markiert, um ihre Detektion zu erleichtern. Beispielsweise können die Marker biotinyliert und nach der Trennung mit Streptavidin-Meerrettichperoxidase inkubiert werden, so dass die verschiedenen Marker mittels Lichtdetektion detektiert werden können. Die Polypeptide der Erfindung finden ferner als Futterzusätze für Tiere Verwendung. Die Nucleinsäuren der Erfindung finden beim Herstellen dieser Polypeptide Verwendung.
Das gereinigte GDNFRα und die dafür kodierende Nucleinsäure können auch als Reagenzien für mechanistische Untersuchungen von GDNFRα und dessen Liganden in den Handel gebracht werden, um die Rolle von GDNFRα und GDNF-Liganden bei normalem/r Wachstum und Entwicklung sowie abnormalem/r Wachstum und Entwicklung, z. B. bei Malignitäten zu untersuchen. GDNFR-Sonden können verwendet werden, um Zellen und Gewebe zu identifizieren, die bei normalen und erkrankten Zuständen auf GDNF reaktiv sind. Beispielsweise kann ein Patient, der an einer GDNF-bezogenen Krankheit leidet, eine Abweichung der GDNFR-Expression zeigen. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Identifizieren von Zellen bereit, die auf GDNF reaktiv sind, indem die GDNFR-Expression in solchen Zellen detektiert wird. GDNFR-Expression kann unter Anwendung von Sonden detektiert werden, die GDNFR-Nucleinsäure und Protein identifizieren. Eine Art der Sonde, die verwendete werden kann, um GDNFR-Expression zu detektieren, ist eine Nucleinsäuresonde, die verwendet werden kann, um für GDNFR kodierende RNA mit einem beliebigen fachbekannten Verfahren, beispielsweise, jedoch nicht beschränkt auf In-situ-Hybridisierung, Northern-Blot-Analyse oder PCR-bezogenen Techniken zu detektieren. Eine weitere Art von Sonde, die verwendet werden kann, ist das hierin erörterte, markierte GDNF.
Gemäß der Erfindung kann markiertes GDNF mit Zellen unter Bedingungen inkubiert werden, die für gewöhnlich die Bindung oder Anheftung von GDNF an GDNFR in oder an die Zellen fördern. In den meisten Fällen kann dies unter standardmäßigen Kultivierungsbedingungen erzielt werden. Zum Beispiel können in einer der Ausführungsforrnen der Erfindung die Zellen für ungefähr 30 Minuten in Gegenwart von markiertem GDNF inkubiert werden. Wenn der Marker ein Antikörpermolekül ist, kann es bevorzugt sein, zuerst die Bindung von GDNF an Zellen zu ermöglichen und anschließend die Zellen zu waschen, um ungebundenen Liganden zu entfernen, gefolgt von der Zugabe des Anti-GDNF-Antikörper-Markers. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann markiertes GDNF an der Oberfläche GDNF-reaktiver Zellen, hiernach Zielzellen genannt, durch Rosettentests detektiert werden, in denen Indikatorzellen, die zur Bindung des Markers fähig sind, mit Zellen inkubiert werden, die markiertes GDNF beherbergen, so dass sie an markiertes GDNF an den Zielzellen anhaften und die gebundenen Indikatorzellen rosettenartige Haufen um GDNF-Marker-tragende Zellen bilden. Diese Rosetten können mit standardmäßigen mikroskopischen Techniken an ausplattierten Zellen sichtbar gemacht werden oder ermöglichen die Trennung von Rosetten- und Nicht-Rosetten-Zellen mittels Dichtezentrifugation. In einer bevorzugten speziellen Ausführungsform der Erfindung, Zielzellen, wie z. B. Neuronenzellen. In alternativen Ausführungsformen der Erfindung kann markiertes GDNF an der Oberfläche von Zielzellen mittels Immunfluoreszenztechniken detektiert werden, bei denen ein Molekül, das mit dem Marker, vorzugsweise einem Antikörper reagiert, direkt oder indirekt Licht produziert. Die Fluoreszenz kann entweder unter einem Mikroskop beobachtet oder dazu verwendet werden, um markiertes GDNF tragende Zellen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierungstechniken abzusondern. Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren zum Detektieren anderer Marker, wie z. B. chromogenen Markern und katalytischen Markern bereit. Ein Anti-GDNF-Antikörper kann ebenfalls als Sonde verwendet werden. Die Detektionsverfahren für einen beliebigen Marker werden von den Bedingungen zum Produzieren eines Signals aus dem Marker abhängen, sollten jedoch von einem Fachkundigen erkennbar sein.
GDNFRα-Varianten sind als Standards oder Kontrollen in Tests für GDNFRα, zum Beispiel ELISA, RIA oder RRA unter der Voraussetzung zweckdienlich, dass sie vom eingesetzten analytischen System erkannt werden, z. B. ein Anti-GDNFRα-Antikörper.
Polyklonale Antikörper werden im Allgemeinen in Tieren durch multiple subkutane (sc) oder intraperitoneale (ip) Injektionen des relevanten Antigens und eines Adjuvans hergestellt. Da ECD das bevorzugte Epitop von GDNFRα ist, ist es wünschenswert, GDNFRα-ECD oder ein ECD umfassendes Molekül (z. B. GDNFRα-Immunadhäsin) als Antigen zur Erzeugung polyklonaler und monoklonaler Antikörper zu verwenden. Es kann zweckdienlich sein, das relevante Antigen an ein Protein zu koppeln, das in der zu immunisierenden Spezies immunogen ist, z. B. Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinderthyroglobulin oder Sojabohnen-Trypsininhibitor unter Verwendung eines bifunktionellen oder derivatisierenden Mittels, z. B. Maleimidobenzoylsulfosuccinimidester (Konjugation über Cysteinreste), N-Hydroxysuccinimid (über Lysinreste), Glutaraldehyd, Bernsteinsäureanhydrid, SOCl₂ oder R¹N=C=NR, wobei R und R¹ verschiedene Alkylgruppen sind.
Tiere werden gegen Antigen, immunogene Konjugate oder Derivate immunisiert, indem durch 1 mg oder 1 μg des Peptids oder Konjugats (für Kaninchen bzw. Mäuse) mit drei Volumenanteilen Freund'schem komplettem Adjuvans kombiniert und die Lösung intradermal an mehreren Stellen injiziert wird. Einen Monat später werden die Tiere mit 1/5 bis 1/10 der ursprünglichen Menge Peptid oder Konjugat in inkomplettem Freund'schem Adjuvans durch subkutane Injektion an mehreren Stellen geboostet. Sieben bis 14 Tage später wird den Tieren Blut abgenommen und das Serum auf Antikörpertiter getestet. Die Tiere werden geboostet, bis der Titer sein Maximum erreicht hat. Vorzugsweise wird das Tiere mit dem Konjugat desselben Antigens geboostet, das jedoch an ein anderes Protein und/oder durch ein anderes Vernetzungsmittel konjugiert ist. Konjugate können auch in rekombinanter Zellkultur als Fusionsproteine hergestellt werden. Ferner werden aggregierende Mittel, wie z. B. Alaun zweckdienlich verwendet, um die Immunantwort zu steigern.
Monoklonale Antiköper werden aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern erhalten, d. h., die einzelnen Antikörper, welche die Population umfassen, sind identisch mit Ausnahme möglicher natürlich auftretender Mutationen, die in geringfügigen Mengen vorhanden sein können. Folglich kennzeichnet der Modifikator „monoklonal" den Charakter des Antikörpers dahingehend, das er nicht ein Gemisch diskreter Antikörper ist.
Beispielsweise können die monoklonalen Antikörper unter Anwendung des erstmals von Kohlen et al., Nature 256, 495 (1975), beschriebenen Hybridom-Verfahrens hergestellt werden oder können durch rekombinante DNA-Verfahren (Cabilly et al., siehe oben) hergestellt werden.
Beim Hybridom-Verfahren wird eine Maus oder ein anderes geeignetes Wirtstier, wie z. B. ein Hamster wie hierin oben beschrieben immunisiert, um Lymphozyten hervorzurufen, die Antikörper produzieren oder dazu fähig sind, die spezifisch an das für die Immunisierung verwendete Protein binden. Alternativ dazu können Lymphozyten in vitro immunisiert werden. Lymphozyten werden dann unter Verwendung eines geeigneten Fusionsmittels, wie z. B. Polyethylenglykol, mit Myelomzellen fusioniert, um eine Hybridomzelle zu bilden (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, S. 59–103 (1986)).
Die demgemäß hergestellten Zellen werden in ein geeignetes Kulturmedium, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder Überleben nicht fusionierter Eltern-Myelomzellen hemmen, geimpft und darin gezüchtet. Zum Beispiel wird das Kulturmedium für die Hybridomzellen, wenn den elterlichen Myelomzellen das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HGPRT oder HPRT) fehlt, typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT-Medium) enthalten, wobei diese Substanzen das Wachstum HGPRT-defizienter Zellen verhindert.
Bevorzugte Myelomzellen sind jene, die effizient fusionieren, stabile High-level-Produktion von Antikörper durch die die selektierten Antikörper produzierenden Zellen fördern und gegen ein Medium wie HAT-Medium empfindlich sind. Unter diesen sind Maus-Myelom-Linien bevorzugte Myelom-Zelllinien, wie z. B. jene, die sich von MOPC-21- und MPC-11 Maustumoren, die vom Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, USA, erhältlich sind und von SP-2-Zellen herleiten, die von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, erhältlich sind. Human-Myelom- und Maus-Human-Heteromyelom-Zelllinien sind ebenfalls für die Produktion von monoklonalen Human-Antikörpern beschrieben worden (Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker Inc., New York, S. 51–63 (1987)).
Kulturmedium, in dem Hybridomzellen wachsen, wird auf Produktion gegen das Antigen gerichteter monoklonaler Antikörper getestet. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität der von Hybridomzellen produzierten monoklonalen Antikörper durch Immunpräzipitation oder durch einen In-vitro-Bindungstest, wie z. B. Radioimmuntest (RIA) oder Enzyme-Linked-Immunoabsorbent-Assay (ELISA) bestimmt.
Die Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers kann beispielsweise mittels Scatchard-Analyse von Munson et al., Anal. Biochem. 107, 220 (1980), bestimmt werden.
Nach der Identifizierung von Hybridomzellen, die Antikörper der gewünschten Spezifität, Affinität und/oder Aktivität produzieren, können die Klone durch Grenzverdünnungsverfahren subkloniert und mittels Standardverfahren gezüchtet werden (Goding, sieh oben). Geeignete Kulturmedien für diesen Zweck umfassen zum Beispiel D-MEM- oder RPMI-1640-Medium. Zusätzlich können die Hybridomzellen in vivo als Aszitestumoren in einem Tier gezüchtet werden.
Die von den Subklonen sekretierten monoklonalen Antikörper werden in geeigneter Weise von Kulturmedium, Aszitesflüssigkeit oder Serum durch herkömmliche Immunglobulinreinigungsverfahren, wie z. B. Protein A-Sepharose, Hydroxylapatitchromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie getrennt.
Die Fähigkeit der MAbs, die Bindung von GDNF an seinen Rezeptor zu blockieren, kann mittels ELISA und Biotest unter Anwendung verfügbarer Reagenzien (rhGDNFRrIgG; eine GDNFRα exprimierende, stabil transfizierte CHO-Zelllinie) beurteilt werden. Neutralisierende Aktivitäten können durch Neuronen-Überlebenstests) ebenfalls beurteilt werden.
GDNFR-spezifische MAbs können wie hierin oben erörtert entwickelt werden, zum Beispiel unter Verwendung des Rezeptors Immunadhäsin und einer transfizierten Zelllinie, um neue Immunisierungsprotokolle einzuführen, um GDNFR-spezifische MAbs zur Verwendung als potentielle Agonisten oder Antagonisten, sowie für die Immunhistochemie, Immunzytochemie und Testentwicklung zu erzeugen. Die aus der Fusion der immunisierten Tiere erzeugten MAbs können mittels Biotest (z. B. Neuronen-Überlebenstests, Signaltransduktion/Phosphorylierung, Nierenzellen-Überlebenstest) sowie durch ELISA und FACS (funktionelles Blockieren der GDNF-GDNFR-Bindung) auf Agonist- und Antagonist-Aktivitäten gescreent werden. Geeignete Techniken werden zum Beispiel in Lu cas et al., J. Immunol. 145, 1415–1422 (1990); Hoogenraad et al., J. Immunol. Methods 6, 317–320 (1983); Moks et al., Eur. J. Biochem. 85, 1205–1210 (1986); Laemmli, Nature (London) 277, 680–685 (1970); und Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350–4354 (1979), bereitgestellt.
Für die monoklonalen Antikörper kodierende DNA kann unter Anwendung herkömmlicher Verfahren leicht isoliert und sequenziert werden (z. B. durch Verwenden von Oligonucleotidsonden, die zur spezifischen Bindung an Gene fähig sind, die für die Leicht- und Schwerketten von Maus-Antikörpern kodieren). Die Hybridomzellen dienen als bevorzugte Quelle solcher DNA. Wenn einmal isoliert, kann die DNA in Expressionsvektoren eingeführt werden, die dann in Wirtszellen, wie z. B. E. coli-Zellen, Simian-COS-Zellen, Chinahamster-Eierstock- (CHO-) Zellen oder Myelomzellen transfiziert werden, die ansonsten kein Immunglobulinprotein produzieren, um die Synthese monoklonaler Antikörper in den rekombinanten Wirtszellen zu erlangen. Überblicksartikel über rekombinante Expression von für Antikörper kodierender DNA in Bakterien umfassen Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol. 5, 256–262 (1993) und Plückthun, Immunol. Revs. 130, 151–188 (1992).
In einer weiteren Ausführungsform können Antikörper und Antikörperfragmente aus Antikörper-Phagenbibliotheken unter Anwendung der in McCafferty et al., Nature 348, 552–554 (1990) beschriebenen Techniken isoliert werden. Clackson et al., Nature 352, 624–628 (1991), und Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581–597 (1991), beschreiben die Isolierung von Maus- bzw. Human-Antikörpern unter Verwendung von Phagenbibliotheken. Nachfolgende Publikationen beschreiben die Produktion hochaffiner (nM-Bereich) Human-Antikörper durch Chain-Shuffling (Mark et al., Bio/Technology 10, 779–783 (1992)) sowie kombinatorische Infektion und In-vivo-Rekombination als Strategie zur Konstruktion sehr großer Phagenbibliotheken (Waterhouse et al., Nuc. Acids Res. 21, 2265–2266 (1993)). Folglich sind diese Techniken entwicklungsfähige Alternativen zu herkömmlichen Hybridom-Techniken für monoklonale Antikörper zur Isolierung monoklonaler Antikörper.
Die DNA kann auch modifiziert werden, zum Beispiel durch Substituieren der für Schwer- und Leichtketten-Konstantdomänen kodierenden Sequenz anstelle der homologen Maussequenzen (Cabilly et al., siehe oben; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851 (1984)) oder durch kovalentes Verbinden der gesamten eines Teils der für ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid kodierenden Sequenz an das Immunglobulin.
Typischerweise werden die Konstantdomänen eines Antikörpers durch solche Nicht-Immunglobulin-Polypeptide substituiert oder es werden die variablen Domänen einer der Antigen-kombinierenden Stelle eines Antikörpers substituiert, um einen chimären bifunktionellen Antikörper zu erzeugen, der eine Antigen-kombinierende Stelle mit Spezifität Für ein Antigen und einer andere Antigen-kombinierende Stelle mit Spezifität für ein anderes Antigen umfasst.
Chimäre oder hybride Antikörper können auch in vitro unter Anwendung bekannter Verfahren der synthetischen Proteinchemie, einschließlich jenen, die Vernetzungsmittel umfassen, hergestellt werden. Zum Beispiel können Immunotoxine mittels einer Disulfid-Austauschreaktion oder durch Bildung einer Thioetherbindung konstruiert werden. Beispiele geeigneter Reagenzien für diesen Zweck umfassen Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimidat.
Verfahren zum Humanisieren nicht-humaner Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt. Im Allgemeinen sind in einem humanisierten Antikörper eine oder mehrere Aminosäuren aus einer Quelle eingeführt, die nicht human ist. Diese nicht-humanen Aminosäurereste werden häufig als „Import"-Reste bezeichnet, die typischerweise einer variablen „Import"-Domäne entnommen sind. Die Humanisierung kann im Wesentlichen nach dem Verfahren von Winter und Mitarbeitern (Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534–1536 (1988)) durch Substituieren der entsprechenden Sequenzen eines Human-Antikörpers durch Nager-CDRs oder CDR-Sequenzen durchgeführt werden. demgemäß sind solche „humanisierten" Antikörper chimäre Antikörper (Cabilly et al. siehe oben), worin im Wesentlichen weniger als eine intakte variable Human-Domäne durch die entsprechende Sequenz aus einer nicht-humanen Spezies substituiert worden ist. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise Human-Antikörper, in denen einige CDR-Reste und möglicherweise einige FR-Reste durch Reste aus analogen Stellen in Nager-Antikörpern substituiert sind.
Die Wahl variabler Human-Domänen der Leicht- sowie Schwerkette, die beim Herstellen der humanisierten Antikörper zu verwenden sind, ist von großer Bedeutung, um die Antigenität zu vermindern. Gemäß dem so genannten „Best-Fit"-Verfahren wird die Sequenz der variablen Domäne eines Nager-Antikörpers gegen die gesamte Bibliothek bekannter variabler Human-Domänensequenzen gescreent. Die Humansequenz, die der des Nagers am nächsten kommt, wird dann als das Human-Gerüst (FR) für den humanisierten Antikörper akzeptiert (Sims et al., J. Immunol. 151, 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196, 901 (1987)). Ein weiteres Verfahren verwendet ein spezielles Gerüst, das von der Konsensussequenz aller Human-Antikörper einer speziellen Untergruppe von Leicht- und Schwerketten hergeleitet ist. Dasselbe Gerüst kann für mehrere verschiedene humanisierte Antikörper verwendet werden (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151, 2623 (1993)).
Es ist weiters von Bedeutung, dass Antikörper mit Beibehaltung hoher Affinität für das Antigen und anderer vorteilhafter Eigenschaften humanisiert werden. Um dieses Ziel zu erreichen, werden humanisierte Antikörper gemäß einem bevorzugten Verfahren durch einen Prozess der Analyse der elterlichen Sequenzen und verschiedener konzeptueller humanisierter Produkte unter Anwendung dreidimensionaler Modelle hergestellt, die allgemein erhältlich und dem Fachkundigen geläufig sind. Es sind Computerprogramme verfügbar, die wahrscheinliche dreidimensionale Konformationsstrukturen der gewählten Kandidat-Immunglobulinsequenzen veranschaulichen und darstellen. Die Untersuchung dieser Darstellungen erlaubt die Analyse der wahrscheinlichen Rolle der Reste in der Funktionalität der Kandidat-Immunglobulinsequenz, d. h., die Analyse von Resten welche die Fähigkeit des Kandidat-Immunglobulins beeinflussen, an sein Antigen zu binden. Auf diese Wiese können FR-Reste aus den Konsensus- und Importsequenzen ausgewählt werden, so dass die gewünschte Antikörpereigenschaft, wie z. B. erhöhte Affinität für das/die Zielantigene erzielt wird. Im Allgemeinen sind CDR-Reste direkt und in hohem Maße an der Beeinflussung der Antigenbindung beteiligt.
Alternativ dazu ist es nunmehr möglich, transgene Tiere (z. B. Mäuse) zu produzieren, die bei Immunisierung zur Produktion eines vollständigen Repertoires humaner Antikörper in Abwesenheit endogener Immunglobulinproduktion zu produzieren. Beispielsweise ist beschrieben worden, dass die homozygote Deletion der Antikörper-Schwerketten-Verbindungsregion- (J_H-) Gens in chimären und Keimbahn-mutierten Mäusen die vollständige Hemmung endogener Antikörperproduktion bewirkt. Transfer der humanen Keimbahn-Immunglobulin-Gengruppierung in solche Keimbahn-mutierten Mäuse resultiert üblicherweise in der Produktion von Human-Antikörpern bei Antigenexposition. Siehe z. B. Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362, 255–258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno. 7, 33 (1993). Human-Antikörper können auch in Phagen-Display-Bibliotheken hergestellt werden (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227, 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991)).
Bispezifische Antikörper (BsAbs) sind Antikörper, die Bindungsspezifitäten für zumindest zwei verschiedene Antigene aufweisen. BsAbs können als Tumor-Targeting- oder Abbildungs-Mittel verwendet werden, um Enzyme oder Toxine an eine Zelle zu adressieren, die GDNFRα besitzt. Solche Antikörper können von Volllängen-Antikörpern oder Antikörperfragmenten (z. B. F(ab)'₂-bispezifische Antikörper) hergeleitet sein. Gemäß der vorliegenden Erfindung können BsAb einen Arm aufweisen, der GDNFRα bindet, und einen anderen Arm, der an ein Zytokin oder an einen anderen Zytokinrezeptor (oder einen Untereinheit davon) bindet, wie z. B. die Rezeptoren für TPO, EPO, G-CSF, IL-4, IL-7, GH, PRL; die α- oder β-Untereinheiten der IL-3-, GM-CSF-, IL-5- IL-6-, LIF-, OSM- und CNTF-Rezeptoren; oder die α-, β- oder γ-Untereinheiten des IL-2-Rezeptorkomplexes. Zum Beispiel können die BsAb sowohl GDNFRα, als auch gp130 binden.
Verfahren zum Herstellen bispezifischer Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Die herkömmliche Produktion bispezifischer Volllängen-Antikörper basiert auf der Coexpression von zwei Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paaren, wobei die beiden Ketten verschiedene Spezifitäten aufweisen (Millstein et al., Nature 305, 537–539 (1983)). Wegen der Zufallsverteilung von Immunglobulin-Schwer- und Leichtketten produzieren diese Hybridomzellen (Quadromzellen) ein mögliches Gemisch von 10 verschiedenen Antikörpermolekülen, von denen nur eine die korrekte bispezifische Struktur aufweist. Die Reinigung des korrekten Moleküls, die für gewöhnlich durch affinitätschromatographische Schritte durchgeführt wird, ist ziemlich aufwendig und die Produktausbeuten sind niedrig. Ähnliche Verfahren sind in WO 93/08829, publiziert am 13. Mai 1993, und in Traunecker et al., EMBO J. 10, 3659 (1991), offenbart.
Nach einem anderen und bevorzugteren Ansatz werden variable Antikörperdomänen mit den gewünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-Kombinierungsstellen) an Sequenzen von Immunglobulin-Konstantdomänen fusioniert. Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer Immunglobulin-Schwerketten-Konstantdomäne, die zumindest einen Teil der Gelenk-, CH2- und CH3-Regionen umfasst. Es wird bevorzugt, dass die erste Schwerketten-Konstantregion (CH1), welche die zur Leichtkettenbindung erforderliche Stelle enthält, zumindest in einer der Fusionen vorhanden ist. DNAs, die für die Immunglobulin-Schwerkettenfusionen und, wenn erwünscht, für die Immunglobulin-Leichtkette kodiert, werden in gesonderte Expressionsvektoren insertiert und in einen geeigneten Wirtorganismus cotransfiziert. Dies sorgt für hohe Flexibilität bei der Einstellung der wechselseitigen Anteile der drei Polypeptidfragmente in Ausführungsformen, wenn ungleiche Verhältnisse der bei der Konstruktion verwendeten drei Polypeptidketten optimale Ausbeuten bereitstellen. Es ist jedoch möglich, die kodierende Sequenz für zwei oder alle drei Polypeptidketten in einen einzigen Vektor zu insertieren, wenn die Expression von zumindest zwei Polypeptidketten im gleichen Verhältnis hohe Ausbeuten liefert oder wenn die Verhältnisse von keiner besonderen Bedeutung sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Ansatzes bestehen die bispezifischen Antikörper aus einer Immunglobulin-Schwerkette mit einer ersten Bindungsspezifität in einem Arm und einem Hybrid-Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paar (welche die zweite Bindungsspezifität bereitstellt) im anderen Arm. Es wurde gefunden, dass diese asymmetrische Struktur die Trennung der gewünschten bispezifischen Verbindung von unerwünschten Immunglobulin-Kettenkombinationen erleichtert, da die Gegenwart einer Immunglobulin-Leichtkette in nur einer Hälfte des bispezifischen Moleküls für eine einfache Art der Trennung sorgt. Dieser Ansatz ist in WO 94/04690, publiziert am 3. März 1994, offenbart. Für weitere Einzelheiten der Erzeugung bispezifischer Antikörper siehe beispielsweise Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986).
Bispezifische Antikörper umfassen vernetzte oder „Heterokonjugat"-Antikörper. Zum Beispiel kann einer der Antikörper im Heterokonjugat an Avidin, der andere an Biotin gekoppelt werden. Solche Antikörper sind beispielsweise vorgeschlagen worden, um Immunsystemzellen gegen unerwünschte Zellen zu adressieren (US-Patent Nr. 4.676.980) und für die Behandlung von HIV-Infektion (WO 91/00360, WO 92/200373 und EP 03089 ). Heterokonjugat-Antikörper können unter Anwendung beliebiger Vernetzungsverfahren hergestellt werden. Geeignete Vernetzungsmittel sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt und sind in US-Patent Nr. 4.676.980 gemeinsam mit einer Reihe von Vernetzungstechniken offenbart.
Techniken zum Erzeugen bispezifischer Antikörper aus Antikörperfragmenten sind in der Literatur ebenfalls beschrieben worden. Die folgenden Techniken können auch zur Produktion bivalenter Antikörperfragmente verwendet werden, die nicht notwendigerweise bispezifisch sind. Gemäß diesen Techniken können Fab'-SH-Fragmente aus E. coli gewonnen werden, die chemisch gekoppelt werden können, um bivalente Antikörper zu bilden. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175, 217–225 (1992), beschreiben die Produktion eines vollständig humanisierten BsAb-F(ab')₂-Moleküls. Jedes Fab'-Fragment wurde gesondert aus E. coli sekretiert und gerichteter chemischer Kopplung in vitro unterzogen, um die BsAb zu bilden. So gebildete BsAb waren fähig, an HER2-Rezeptor überexpri mierende Zellen und normale Human-T-Zellen zu binden sowie die lytische Aktivität zytotoxischer Human-Lymphozyten gegen Human-Brustkrebs-Ziele auszulösen. Siehe auch Rodrigues et al., Int. J. Cancers (Suppl.) 7, 45–50 (1992).
Zahlreiche Techniken zum Herstellen und Isolieren bivalenter Antikörperfragmente direkt aus rekombinanter Zellkultur sind ebenfalls beschrieben worden. Zum Beispiel sind bivalente Heterodimere unter Verwendung von Leucin-Zippern produziert worden. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5), 1547–1553 (1992). Die Leucin-Zipper-Peptide aus den Fos- und Jun-Proteinen wurden an die Fab'-Abschnitte zweier verschiedener Antikörper durch Genfusion gebunden. Die Antikörper-Homodimere wurden an der Gelenkregion reduziert, um Monomere zu bilden und dann wieder oxidiert, um die Antikörper-Heterodimere zu bilden. Die von Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444– 6448 (1993) beschriebene „Diakörper"-Technologie hat einen alternativen Mechanismus zum Herstellen von BsAb-Fragmenten bereitgestellt. Die Fragmente umfassen eine variable Schwerketten-Domäne (V_H), die an eine variable Leichtketten-Domäne (V_H) durch einen Linker gebunden ist, der zu kurz ist, um die Paarung zwischen den beiden Ketten an derselben Kette zu erlauben. Demgemäß werden die V_H- und V_H-Domänen eines Fragments gezwungen, sich mit den komplementären V_H- und V_H-Domänen des anderen Fragments zu paaren, wodurch zwei Antigenbindungsstellen gebildet werden. Eine weitere Strategie zum Herstellen von BsAb-Antikörpern durch Verwendung von Einzelketten-Fv- (sFv-) Dimeren ist ebenfalls beschrieben worden. Siehe Gruber et al., J. Immunol. 152, 5368 (1994).
Die GDNFRα-Agonisten (einschließlich GDNF und GDNF/lösliches-GDNFRα-Komplex) und Agonist-GDNFRα-Antikörper der vorliegende Erfindung können verwendet werden, um Milzhämatopoese zu verstärken, was eine gewisse Neupopulation von Blutzellklonen in Patienten ermöglicht, die Chemo- oder Strahlentherapie und Transplantation unterzogen wurden. Im Allgemeinen agieren die Agonisten und Antikörper so, dass sie die Proliferation und/oder Differenzierung (jedoch besonders die Proliferation) hämatopoetischer Zellen in der Milz verstärken. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, kön nen GDNFR-Agonisten direkt als Wachstums, Überlebens- und Differenzierungsfaktor für hämopoetische Zellen in der Milz agieren und/oder können indirekt an der Milzstroma-Umgebung agieren (möglicherweise Neuronen, die an der Milz-Innervation beteiligt sind), um einen anderen Faktor zu produzieren, der für die Erhaltung hämopoetischer Klone verantwortlich ist. In jedem Fall haben GDNFR-Agonist, einschließlich GDNF einen therapeutischen Vorteil bei der Erleichterung der Aufpfropfung von Rückenmarkstransplantaten auf die Milz nach Bestrahlung oder Chemotherapie oder für die Stimulierung extramedullärer Hämatopoese in der Milz (die in Nagern normal ist, jedoch im Menschen nicht beobachtet wird) bei jenen Konditionen, wo ein erhöhter Bedarf an Blutzellenproduktion wegen Anämie (rote Blutzellen), chronischer Infektion (Neutrophile), Rückenmarksversagen (alle Klone) und Immundefizienz (Lymphozyten) besteht. Die Agonisten können auf ähnliche Weise zum Behandeln von Krankheiten zweckdienlich sein, die durch eine Abnahme an Blutzellen gekennzeichnet ist. Beispiele dieser Krankheiten umfassen: Anämie (einschließlich makrozytische und aplastische Anämie); Thrombozytopönie; Hypoplasie; Immun- (Autoimmun-) thrombozytopenische Purpura (ITP); und HIV-induzierte ITP. Die Agonisten können ferner verwendet werden, um einen Patienten zu behandeln, der eine Hämorrhagie erlitten hat.
Therapeutische Anwendungen für GDNF- oder GDNFRα-neutralisierende Antikörper umfassen die Behandlung von Stoffwechselstörungen und Zelltumoren an Stellen der GDNFRα-Expression, insbesondere jener Tumoren, die durch Überexprimierung von GDNFRα gekennzeichnet sind.
Für therapeutische Anwendungen werden die GDNF- oder GDNFRα-Antikörper der Erfindung einem Säugetier, vorzugsweise einem Menschen in einer physiologisch annehmbaren Dosisform, einschließlich jenen verabreicht, die einem Menschen intravenös als Bolus- oder kontinuierliche Infusion über einen Zeitraum verabreicht werden, und zwar über intramuskuläre, intraperitoneale, intra-zerebrospinale, subkutane, intraartikuläre, intrasynoviale, intrathecale, orale, topische oder Wege oder Inhalation. Die Antikörper werden ebenfalls zweckmäßig durch intratumorale, peritumorale, interläsio nale oder periläsionale Wegen oder zur Lymphe verabreicht, um lokale sowie systemische therapeutische Wirkungen hervorzurufen.
Solche Dosisformen umfassen physiologisch annehmbare Träger, die schon an sich nicht toxisch und nicht therapeutisch sind. Beispiele solcher Träger umfassen Ionentauscher, Aluminiumoxid, Aluminiumstearat, Lezithin, Serumproteine, wie z. B. Humanserumalbumin, Puffersubstanzen, wie z. B. Phosphate, Glycin, Sorbinsäure, Kaliumsorbat, Partialgyceridmischungen gesättigter Pflanzenfettsäuren, Wasser, Salze oder Elektrolyte, wie z. B. Protaminsulfat, Dinatriumhydrogenphosphat, Kaliumhydrogenphosphat, Natriumchlorid, Zinksalze, kolloidales Silika, Magnesiumtrisilikat, Polyvinylpyrrolidon, Cellulose-basierte Substanzen und PEG. Träger für topische oder auf Gel basierende Formen von GDNF- oder GDNFRα-Antikörpern umfassen Polysaccharide, wie z. B. Natriumcarboxymethylcellulose oder Methylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Polyacrylate, Polyoxyethylenpolyoxypropylen-Blockpolymere, PEG und Holzwachsalkohole. Für alle Verabreichungen können herkömmliche Depotformen zweckdienlich verwendet werden. Solche Formen umfassen beispielsweise Mikrokapseln, Nanokapseln, Liposomen, Pflaster, Inhalationsformen, Nasensprays, Sublingualtabletten und Retard-Präparate. Der Antikörper wird typischerweise in solchen Vehikeln in einer Konzentration von ungefähr 0,1 mg/ml bis 100 mg/ml formuliert.
Geeignete Beispiele von Retard-Präparaten umfassen semipermeable Matrices fester hydrophober Polymere, die GDNF- oder GDNFRα-Antikörper einhalten, wobei die Matrices sich in Form von Formteilchen, z. B. Filmen oder Mikrokapseln befinden. Beispiele von Retard-Matrices umfassen Polyester, Hydrogele (z. B. Poly(2-hydroxyethylmethacrylat), wie beschrieben von Langer et al., siehe oben, oder Poly(vinylalkohol), Polylaktide (US-Patent Nr. 3.773.919), Copolymere von L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-Glutamat (Sidman et al., siehe oben); nicht abbaubares Ethylenvinylacetat (Langer et al., siehe oben), abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere, wie z. B. Lupron Depot^TM (injizierbare Mikrokügelchen, die aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer und Leuprolidacetat bestehen) und Poly-D-(–)-3-hydroxybuttersäure. Während Polymere, wie Ethylen- Vinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure die Freisetzung von Molekülen für über 100 Tage ermöglichen, setzen bestimmte Hydrogele Proteine für kürzere Zeiträume frei. Wenn eingekapselte Antikörper für lange Zeit im Körper verbleiben, können sie als Ergebnis der Einwirkung von Feuchte bei 37°C denaturieren oder aggregieren, was einen Verlust der biologischen Aktivität und mögliche Veränderungen der Immunogenität bewirkt. Zweckmäßige Strategien können für die Stabilisierung in Abhängigkeit vom beteiligten Mechanismus entwickelt werden. Wenn beispielsweise der Aggregationsmechanismus als intermolekulare S-S-Bindungsbildung durch Thio-Disulfid-Austausch erkannt wird, kann eine Stabilisierung durch Modifizieren von Sulfhydrylresten, Lyophilisieren aus sauren Lösungen, Kontrollieren des Feuchtegehalts, Verwenden geeigneter Zusätze und Entwickeln spezieller Polymermatrix-Zusammensetzungen erzielt werden.
Retard-Zusammensetzungen von GDNF- und GDNFRα-Antikörpern umfassen auch in Liposomen eingeschlossene Antikörper. Antikörper enthaltende Liposomen werden durch fachbekannte Verfahren hergestellt, wie sie in Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030 (1980); und US-Patenten Nr. 4.485.045 und 4.544.545 beschrieben sind. Für gewöhnlich sind die Liposomen vom kleinen (ungefähr 200–800 Angstrom) unilamellaren Typ, in denen der Lipidgehalt mehr als ungefähr 30 Mol-% Cholesterin beträgt, wobei der gewählte Anteil für die optimale Antikörpertherapie eingestellt wird. Liposomen mit erhöhter Zirkulationszeit sind in US-Patent Nr. 5.013.556 offenbart.
Für die Prävention oder Behandlung einer Krankheit, hängt die geeignete Dosis von GDNF- oder GDNFRα-Antikörper üblicherweise von der wie oben definierte Art der zu behandelnden Krankheit, der Schwere und dem Verlauf der Krankheit, davon, ob die Antikörper für präventive oder therapeutische Zwecke verabreicht wird, der vorhergehenden Therapie, der Krankengeschichte des Patienten und der Reaktion auf den Antikörper, und dem Ermessen des behandelnden Arztes ab. Der Antikörper wird zweckmäßig auf einmal oder über eine Reihe von Behandlungen an den Patienten verabreicht.
Abhängig von der Art und Schwere der Krankheit sind ungefähr 1 μg/kg bis 15 μg/kg GDNF- oder GDNFRα-Antikörper anfängliche Kandidat-Dosierungen zur Verabreichung an den Patienten, ob beispielsweise durch eine oder mehrere Verabreichungen oder durch kontinuierlichen Infusion. Eine typische tägliche Dosis könnte in Abhängigkeit von den oben erwähnten Faktoren im Bereich von ungefähr 1 μg/kg bis 100 mg/kg oder mehr liegen. Für wiederholte Verabreichung über mehrere Tage oder länger wird die Behandlung abhängig von der Kondition aufrechterhalten, bis eine gewünschte Unterdrückung von Krankheitssymptomen auftritt. Jedoch können auch andere Dosisregime zweckdienlich sein. Der Forschritt dieser Therapie kann durch herkömmliche Techniken und Test leicht verfolgt werden.
Es sind Tiermodelle verfügbar, um die Wirkungen der Verbindungen und Verfahren der Erfindung zu bewerten. Um beispielsweise die Wirkungen der Behandlung geschädigter Nieren mit Zusammensetzungen, die das Wachstum beeinflussen (Toback (1977); Toback et al. (1977)), zu bewerten, wird eine intravenöse Injektion von 1,0 bis 1,1 mg Quecksilber pro kg Körpergewicht als HgCl₂ an Ratten verabreicht, um ein reversibles Syndrom akuten nichtoligurischen Nierenversagens zu induzieren. Nach einem Tag treten deutliche Erhöhungen der Serum-Harnstoffstickstoffkonzentration (SUN), Harnausscheidung von Natrium und Protein und Nekrose proximaler Schlauchzellen auf. Mit Tag Zwei zeigen Erhöhungen der Phospholipid-, DNA- und RNA-Synthese und Mitoseindex an, das die Zellregeneration in Gang kommt. Mit Tag Drei erreicht die SUN ein Maximum und es erscheinen Schuppenepithelzellen an der Tubulus-Basalmembran. Mit Tag Fünf kehrt die SUN zu Normalwerten zurück, es wird die Maximalrate der Phospholipidsynthese erreicht und die Tubulen werden von mehr reifen Zellen besiedelt. Die Wirkungen der Infusion einer Zusammensetzung von autokrinen Wachstumsfaktoren auf die Nierenstruktur wird mit unbehandelten Ratten und Tieren verglichen, die mit Vehikel alleine im Verlauf des oben erörterten, Quecksilberchlorid-induzierten Tubulus-Nekrosesyndroms infundiert wurden.
Die Antikörper der Erfindung sind ferner als Affinitätsreinigungsmittel zweckdienlich. In diesem Prozess werden die Antikörper gegen GDNFRα an einem geeigneten Träger, wie z. B. Sephadex-Harz oder Filterpapier unter Anwendung fachbekannter Verfahren immobilisiert. Der immobilisierte Antikörper wird dann mit Probe kontaktiert, die das zu reinigende GDNFRα enthält, und danach wird der Träger mit einem geeigneten Lösungsmittel gewaschen, das üblicherweise im Wesentlichen das gesamte Material in der Probe mit Ausnahme des GDNFRα, das an den immobilisierten Antikörper gebunden ist, entfernt. Schließlich wird der Träger mit einem anderen geeigneten Lösungsmittel, wie z. B. Glycinpuffer, pH 5,0, gewaschen, der üblicherweise das GDNFRα vom Antikörper freisetzt.
GDNFRα-Antikörper sind ferner in diagnostischen Tests für GDNFRα zweckdienlich, wobei dessen Expression in speziellen Zellen, Geweben oder Serum detektiert wird. Für diagnostische Anwendungen werden die Antikörper typischerweise mit einer detektierbaren Gruppierung markiert. Die detektierbare Gruppierung kann eine beliebige sein, die fähig ist, entweder direkt oder indirekt ein detektierbares Signal zu produzieren. Beispielsweise kann die detektierbare Gruppierung ein Radioisotop, wie z. B. ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S oder ¹²⁵I; eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Verbindung, wie z. B. Isothiocyanat, Rhodamin oder Luciferin; ein Radioisotopmarker, z. B. ¹²⁵I, ³²P, ¹⁴C oder ³H; oder ein Enzym, wie z. B. Alkalische Phosphatase, β-Galactosidase oder Meerrettichperoxidase sein.
Es kann ein beliebiges fachbekanntes Verfahren zur gesonderten Konjugation der Polypeptidvariante an die detektierbare Gruppierung eingesetzt werden, einschließlich jene Verfahren, die von Hunter et al., Nature 144, 945 (1962); David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981); und Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982), beschrieben sind.
Die Antikörper der vorliegende Erfindung können in jedem bekannten Testverfahren eingesetzt werden, wie z. B. in kompetitiven Bindungstests, direkten und indirekten Sandwich-Tests und Immunpräzipitationstests. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press Inc., S. 147–158 (1987).
Kompetitive Bindungstests beruhen auf der Fähigkeit eines markierten Standards, mit dem Analyten der Testprobe um Bindung mit einer begrenzten Menge Antikörper zu konkurrieren. Zum Beispiel ist die Menge GDNFRα in der Testprobe umgekehrt proportional der Menge des Standards, der sich an die Antikörper bindet. Um das Ermitteln der sich bindenden Menge Standard zu erleichtern, werden die Antikörper im Allgemeinen vor oder nach der Konkurrenzreaktion unlöslich gemacht, so dass Standard und Analyt, die an die Antikörper gebunden sind, leicht ungebunden verbliebenen Standard und Analyt abgetrennt werden können.
Sandwich-Tests umfassen die Verwendung zweier Antikörper, wobei jeder davon an einen anderen immunogenen Teil oder an ein anderes immunogenes Epitop des zu detektierenden Proteins bindet. In einem Sandwich-Test wird der Analyt in der Testprobe von einem ersten Antikörper gebunden, der an einem festen Träger immobilisiert ist, und danach bindet ein zweiter Antikörper an den Analysten, wodurch ein unlöslicher dreiteiliger Komplex gebildet wird. Siehe z. B. US-Patent Nr. 4.376.110. Der zweite Antikörper kann selbst mit einer detektierbaren Gruppierung markiert sein (direkter Sandwich-Test) oder kann unter Verwendung eines Anti-Immunglobulin-Antikörpers, der mit einer detektierbaren Gruppierung markiert ist (indirekter Sandwich-Test), gemessen werden. Zum Beispiel ist ein ELISA-Test eine Art von Sandwich-Test, wobei in diesem Fall die detektierbare Gruppierung ein Enzym ist.
Die folgenden Beispiele spezieller Ausführungsformen zur Ausführung der Erfindung werden ausschließlich zu illustrativen Zwecken bereitgestellt und beabsichtigen nicht, den Schutzumfang der vorliegende Erfindung in irgendeiner Weise einzuschränken.
Beispiele
Beispiel 1
Klonierung von GDNFRα
Ventralmittlehirngewebe von E14-Rattenembryos, das GDNF-reaktive dopaminerge Neuronen enthält, wurde verwendet, um eine cDNA-Bibliothek in einem auf Cytomega-Iovirus basierenden Expressionsvektor zu erzeugen (Holmes et al., Science 253, 1278– 1280 (1991)). Pools von 1500 cDNA-Klonen wurden in COS 7-Zellen transfiziert und die Expression von mutmaßlichen GDNF-Rezeptorproteinen durch Binden von iodiertem GDNF an die Zellen, gefolgt von Autoradiographie oder Färbung von gebundenem unmarkierten GDNF mit GDNF-Antikörpern detektiert (Gearing et al., EMBO J. 8, 3667– 3676 (1989)). Dreihundertdreißig cDNA-Pools wurden gescreent. Ein einziger positiver Pool wurde identifiziert. Dieser Pool wurde wiederholt in kleinere Pools unterteilt und jeder Pool gescreent, bis ein einziger cDNA-Klon isoliert worden ist.
Es wurde gefunden, dass die cDNA (Nucleinsäuresequenz in 1A–1E gezeigt) für ein neues, an Cystein reiches Protein von 468 Aminosäuren kodiert (als Volllängen-„GDNFRα" bezeichnet), die ein Signalpeptid an ihrem Aminoterminus und einen Abschnitt von 23 hydrophoben Aminosäuren an ihrem Carboxyterminus enthält (siehe 2). Drei potentielle Glykosylierungsstellen sind bezeichnet (2). Der carboxyterminalen hydrophoben Sequenz geht eine Gruppe kleiner Aminosäuren (Ala Ser Ser) voraus, die eine Spalt/Anbindungsstelle für GPI-gebundenes definiert (Micanovic et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 157–161 (1990); Moran et al., J. Biol. Chem. 266, 1250–1257 (1991)). Die 30 Cysteine sind auf eine Weise angeordnet, welche dem Cystein-Abstand in der Zytokinrezeptorfamilie ähnlich ist (Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6934– 6938 (1990)). Die extrazelluläre Domäne („ECD") wird von Signalpeptid und der GPI-Anbindungsstelle flankiert.
Zusätzlich zu der durch Expressionsklonierung isolierten cDNA wurde neun weitere cDNAs aus Ratten- (4) und Maus- (5) cDNA-Bibliotheken unter Verwendung von GDNFRα-cDNA als Sonde isoliert; von diesen enthielten 8 ein mit GDNFRα identisches offenes Leseraster, wogegen eine Ratten-cDNA für ein kürzeres offenes Leseraster von 158 Aminosäuren kodierte, das eine fehlerhafte oder sekretierte Form dieses Proteins darstellen könnte.
Ein unabhängiger, als Klon 26 bezeichneter cDNA-Klon, der ein Volllängen-GDNFRα-orf umfasst, wurde aus einer Maus-cDNA-Bibliothek unter Verwendung von Ratten-GDNFRα-cDNA als Sonde isoliert. Die Sequenz des 5'-Endes des/der Maus-GDNFRα-Klone(s) wird mit dem unterstrichenen Translations-Methionin-Startcodon bereitgestellt:
Und die Sequenz, die für das C-terminate Ende der Maus-GDNFRα-Sequenz kodiert, wird mit dem unterstrichenen C-terminalen Serin-Codon bereitgestellt:
Die Sequenzen sind sowohl auf der Aminosäure-, als auch auf der Nucleinsäure-Ebene höchst homolog zu jenen in den 1A–1E.
Andere Sequenzen, die in der Erfindung Verwendung finden, insbesondere als Sonden zur Identifizierung weiterer GDNFR-Sequenzen, einschließlich Human-Varianten, umfassen die als ye83h05.r1 bezeichnete, von Human-EST hergeleitete Sequenz oder Fragmente davon:
A-3'; und die Human-EST-hergeleitete, als y170a10.r1 bezeichnete Sequenz oder Fragmente davon:
Ebenfalls von Interesse sind von den obigen beiden Sequenzen hergeleitete Sequenzfragmente und Nucleinsäuren, welche diese Fragmente umfassen, oder Proteine, welche die von diesen Fragmenten kodierte Aminosäuresequenz umfassen, zum Beispiel:
Beispiel 2
GDNFRα bindet GDNF
Um die Wechselwirkung zwischen GDNF und GDNFRα zu charakterisieren, wurden Vernetzungs- und Konkurrenzbindungsexperimente unter Verwendung von Chinahamster-Eierstockzellen durchgeführt, die GDNFRα stabil exprimieren. Für die Vernetzung wurden GDNFRα oder ein irrelevantes Protein stabil exprimierende Chinahamster-Eierstockzellen für 1 Stunde bei 37°C entweder in Gegenwart oder Abwesenheit von PIPLC (2 μg/ml) inkubiert und dann in einer Dichte von 1–2 × 10⁶/ml in eiskaltem L15-Medium mit 1 mM Phenylmethylsulfonfluorid und 50 pM ¹²⁵I-markiertes GDNF resuspendiert und bei 4°C für 2 Stunden inkubiert. Formaldehyd wurde in eine Endkonzentration von 4% bei Raumtemperatur für 30 Minuten zugesetzt. Die Zellen wurden 3 Mal mit 1 ml phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen. Die Zellen wurden dann in Probenpuffer (80 mM Tris-NCl (pH 6,8), 10% (v/v) Glycerin, 1% (w/v) SDS, 0,025% Bromphenolblau) lysiert und auf SDS-Polyacrylamidgele geladen. Drei Proteine von ungefähr 85 kD, 180 kD und 200 kD wurden als an ¹²⁵I-GDNF vernetzt in Zellen detektiert, die GDNFRα exprimierten (3). Diese Proteine fehlten, wenn die Vernetzungsreaktion in Gegenwart von überschüssigem markierten GDNF erfolgte oder wenn ¹²⁵I-GDNF an Zellen vernetzt war, die ein irrelevantes Zelloberflächenprotein exprimierten (3). Die ^–80–85 kDa-Proteinbande stellt wahrscheinlich einen Komplex von 58 kDa-GDNFRα und 15 kDa-GDNF-Monomer dar, wogegen die hochmulekulareren Banden die Wechselwirkung zwischen ¹²⁵I-GDNF, GDNFRα und mutmaßlichen Signalmolekülen wie Ret (siehe unten) oder Dimerisierung des ¹²⁵I-GDNF/GDNFRα-Komplexes darstellen könnten. Die Vernetzung von ¹²⁵I-GDNF wurde nach Behandlung mit Phosphoinositid-spezifischer Phospholipase C (PIPLC), einem Enzym, das spezifisch die GPI-Bindung spaltet, praktisch aufgehoben (3), was die Auffassung unterstützt, dass GDNFRα tatsächlich ein hochaffines, GPI-gebundenes, GDNF-Bindungsprotein ist.
Konkurrenzbindungsexperimente zeigen darüber hinaus an, dass GDNF spezifisch und reversibel an GDNFRα-exprimierende Zellen bindet. Zur Gleichgewichtsbindungsanalyse wurden Zellen wie vorhin verarbeitet und mit 50 pM ¹²⁵I-markiertem GDNF und variierenden Konzentrationen von unmarkiertem GDNF inkubiert. Das IGOR-Programm wurde verwendet, um K_d zu bestimmen. Die Konkurrenzbindung von ¹²⁵I-GDNF an GDNFRα stabil exprimierende Chinahamster-Eierstockzellen bewies, das GDNF spezifisch und reversibel an GDNFRα bindet und dass die beiden Proteine mit einem ungefähren K_d von 63 pM wechselwirken (4; Scatchard-Analysen-Einfügung).
Wie aus der Anwesenheit der Konsensussequenz für die GPI-Bindung vorhergesagt, verminderte die PIPLC-Behandlung von fax-sortierten, GDNFRα exprimierenden Zellen die GDNF-Bindung (5). Für die fax-Sortierung wurden Chinahamster-Eierstock- (CHO-) Zellen, die rekombinantes GDNFRα oder ein nicht damit in Beziehung stehendes Protein unter der Kontrolle eines SV40-Promotors stabil exprimierten, für 1 Stunde bei 37°C entweder in Gegenwart oder Abwesenheit von PIPLC (2 μg/ml) inkubiert (Koke et al., Prot. Exp. Purification 2, 51–58 (1991)). GDNF (100 ng/ml) und monoklonale Anti-GDNF-Antikörper (60/c; 100 μg/ml) wurden dann zugesetzt und die Zellen für weitere 30 Minuten imkubiert. Fluoreszente monoklonale Anti-IgG-Antikörper (Vector Inc.) wurden dann zugesetzt und die Zellen mit einem Durchfluss-Zellsortierer Fax-sortiert. Die Gleichgewichtsbindung von ¹²⁵I-GDNF an GDNFRα-exprimierende Zellen wurde nach Behandlung mit PIPLC um mehr als 90% vermindert. Diese Ergebnisse zeigen an, dass GDNFRα ein hochaffines GDNF-Bindungsprotein ist.
Beispiel 3
Gewebeverteilung von GDNFRα
Die Gewebeverteilung der GDNFRα-mRNA wurde unter Verwendung von Northern-Blots sowie In-situ-Hybridisierungsanalyse untersucht. Es wurde Northern-Blot-Analyse von GDNFRα-Transkripten in adulten Rattengeweben durchgeführt. Northern-Blots wurden unter Verwendung des im Handel erhältlichen Multiplen-Gewebe-Blots (Clontech, Palo Alto, CA) durchgeführt. Ein Transkript von ungefähr 3,7 kb wurde in adultem/r Hirn, Leber und Niere unter stringenten Bedingungen detektiert.
Es wurde In-situ-Hybridisierung der GDNFRα-Sonde an E14-Rattenembryogeweben, einschließlich Mittelsaggitalschnitt, Ventralmittelhirn, Rückenmark und Nierenregionen durchgeführt. Für In-situ-Hybridisierungen wurde Gewebe durch Eintauchen in kalten, in 20% Saccharose äquilibrierten 4% Formaldehyd fixiert, mit 20 um geschnitten und wie vorher beschrieben verarbeitet (Fonnum, J. Neurochem. 24, 407–409 (1975)), wobei die gesamte kodierende Region von GDNFRα als Sonde verwendet wurde. Zusätzlich wurde die In-situ-Hybridisierung von E15.5-Rattenembryos durchgeführt. Embryos wurden über Nacht bei 4°C in 4% Formaldehyd immersionsfixiert, dann über Nacht in 15% Saccharose gefriergeschützt. Adulte Rattenhirne und Rückenmark wurde frisch eingefroren. Die Gewebe wurden mit 16 μm geschnitten und für die In-situ-Hybridisierung unter Verwendung von ³³P-UTP-markierten RNA-Sonden wie beschrieben weiterverarbeitet (Henderson et al., Science 266, 1062–1064 (1994)). Sense- und Antisense-Sonden wurden von der N-terminalen Region von GDNFRα unter Verwendung von T7-Polymerase hergeleitet. Reverse-Transkriptase-Polymerasekettenreaktionsanalyse wurde wie beschrieben durchgeführt (Hernderson et al., Science 266, 1062–1064 (1994)).
GDNFRα-Transkripte waren in Regionen vorhanden, wo sich GDNF-reaktive Neuronen befinden, einschließlich in Ventralmittelhirn (dopaminerge Neuronen), Ventralrückenmark (spinale Neuronen) und in Unterpopulationen von GDNF-abhängigen Dorsalwurzelganglien- (DRG-) Neuronen. Im Nervensystem von E14-Rattenembryos wurde mRNA für GDNFRα in Regionen wie Ventralmittelhirn und Ventralrückenmark gefunden, wo sich GDNF-reaktive dopaminerge Neuronen und Motoneuronen befinden, sowie in Pons, Medulla oblongata, Choroidplexus, Cerebellum primordium, Dienzephalon und Retina. GDNFRα-Transkripte wurden auch in Schnurrhaar-Follikeln, Hautmuskeln, Zunge, Niere, Speiseröhre, Mitteldarm, Magen, Hoden, Genitaltuberkel und Analkanal gefunden. GDNFRα-Transkripte finden sich in der E15.5-Ratten-Außenschicht des Mittelhirndachs, im Choroidplexus, Kleinhirn-Primordium, dem Riechepithel, Schnurrhaar-Böden, Genitaltuberkel, Urigenitalsinus, Hoden, in Zwischenwirbelscheiben und Luftröhre. Im Nervensystem adulter Ratten wurde GDNFRα-mRNA in Dorsalwurzelganglien, Vorderhorn des Rückenmarks, Retina, Lateralseptum, Pyramiden- und Körnerzellen in inneren Schichten des Cortex, Genikulumkern, Ventralmittelhirn, dem oben liegenden Kleinhirn, Thalamus, Pons und Medulla oblongata detektiert. Im Einklang mit der Erkenntnis, dass die Nieren und das Darmnervensystem sich in GDNF-defizienten Mäusen nicht entwickeln (siehe Beispiel unten), sind hohe Mengen GDNFRα-mRNA in sich entwickelnden Nephronen und in embryonalen glatten und gestreiften Muskeln um das Darmnervensystem in der Speiseröhre, im Darm und Magen vorhanden. Im adulten Tier wurden GDNFRα-Transkripte auch in der Pars-compacta-Region der Substantia nigra, der ventrollateralen Zellsäule des Rückenmarks, der Hippocampus-Formation, den inneren Schichten der Hirnrinde, im lateralen Genikulumkern, Colliculus superior, äußeren Rand der Cerebellum-Körnerzellen, Lateralseptum, Endopiriformkern und Bandkern gefunden. GDNFRα-Transkripte wurden auch in nicht-neuronalen Geweben, einschließlich Hypophyse, Urogenitaltrakt, und Pankreas-Primordium gefunden Motoneuronen ex primieren sowohl GDNFRα, als auch Ret. Die immunhistochemische Färbung mit Ret-Antiserum enthüllte die Gegenwart von Ret in einem sich entwickelnden Nephron. In der Niere werden sowohl Ret, als auch GDNFRα in den sich entwickelnden Nephronen in Nachbarschaft zum GDNF exprimiert. Im Darm sind GDNF und GDNFRα zwischen innerem zirkulären und äußerem longitudinalen Glattmuskel nahe und möglicherweise innerhalb des Darmnervensystems zugegen, wogegen Ret nur im Darmnervensystem zugegen ist.
Beispiel 4
GDNFRα vermittelt Reaktion auf GDNF
Um zu ermitteln, dass GDNFRα-Protein ein essentieller physiologischer Vermittler von GDNF ist, wurden primäre embryonale hirnsensorische und motorische Neuronen mit PIPLC (Phosphoinositid-spezifische Phospholipase C(PIPLC)), die spezifisch GPI-gebundene Proteine spaltet (Shukla, Life Sci. 10, 1323–1335 (1982); Rhee et al., Science 224, 546–50 (1989)), behandelt und ihre Überleben in Gegenwart von GDNF und anderen Faktoren beobachtet. Embryonale knötchenförmige, trigeminale und sympathische Ganglienneuronen aus Küken (Buj-Bello, Neuron 15, 821–828 (1995)), E14-Ratten-Motoneuronen (Henderson et al., Science 266, 1062–1064 (1994)) und dopaminerge E14-Ratten-Neuronen (Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6934–6938 (1990)) wurde isoliert, ausplattiert und in dreifacher Ausfertigung in Näpfen gezüchtet. PIPLC (2–4 μg/ml) wurde den bezeichneten Proben 1–2 Stunden vor sowie 12 und 24 Stunden nach Zugabe der bezeichneten Wachstumsfaktoren zugesetzt und die Anzahl überlebender Neuronen 30 bis 72 Stunden später bestimmt. Die Anzahl embryonaler knötchenförmiger und trigeminaler sensorischer Ganglienneuronen oder sympathischer Neuronen, die in Gegenwart gesättigter Konzentrationen von GDNF überlebten, wurde nach PIPLC-Behandlung um 50–70% vermindert. Keine Veränderungen der Reaktion dieser Neuronen auf Hirnhergeleiteten neurotrophen Faktor (BDNF) oder Nervenwachstumsfaktor (NGF) wurde in Gegenwart von PIPLC beobachtet (6 und 9A). Dergleichen verminderte die PIPLC-Behandlung die Anzahl von E14-Spinalneuronen oder dopaminergen Neuronen, die in Gegenwart von GDNF überlebten, um 50–90% ohne das Überleben dieser Neuronen in Gegenwart von BDNF oder TGFβ3 zu beeinflussen (7 und 9A). In diesen unterschiedlichen Systemen verminderte PIPLC die das Überleben fördernden Wirkungen von GDNF bei GDNF-Konzentrationen bis hinunter auf 10 pg/ml, was darauf hinweist, dass das GPI-gebundene Rezeptormolekül für die hochaffine Reaktion auf GDNF notwendig ist. Zusätzlich war PIPLC sogar dann wirksam, wenn GDNF mit 1 μg/ml (2 × 10⁸-fach über EC₅₀) für knötchenförmige sensorische Neuronen (EC₅₀ für knötchenförmige Küken-Neuronen beträgt 6,1 ng/ml; Buj-Bello et al. Neuron 15, 821–828 (1995)) und mit 0,1 pg/ml für Motoneuronen (Henderson et al., Science 266, 1062–1064 (1994)) angewendet wurde. Diese hohen Konzentrationen kehrten die Wirkung der PIPLC-Behandlung nicht um (6, 7 und 9A), was die Möglichkeit ausschließt, dass das GPI-gebundene Protein nach seiner Freisetzung aus der Zellmembran GDNF bindet und dessen wirksame Konzentration vermindert (9A).
Antisense-Oligonucleotide gegen GDNFRα wurden verwendet, um die GDNFRα-Expression in primären embryonalen motorischen und hirnsensorischen Neuronen zu blockieren. Oligodesoxynucleotide wurden gegen Regionen des in 1 gezeigten GDNFRα synthetisiert. GDNF förderte das Überleben dieser Neuronen in Kontrollkulturen und in Kulturen, die Sense-Oligonucleotide enthielten, wogegen keine Reaktion auf GDNF in Kulturen beobacht wurde, die Antisense-Oligonucleotide enthielten. Im Gegensatz dazu war die das Überleben fördernde Wirkung von BDNF in GDNFRα-Antisense-Oligonucleotide enthaltenden Kulturen und Kontrollkulturen dieselbe.
Ein lösliches GDNFRα-Protein wurde erzeigt und verwendet, um die GDNF-Reaktion in PIPLC-behandelten motorischen und sensorischen Neuronen wiederherzustellen. Vorhergehende Untersuchungen haben gezeigt, dass die Zugabe einer löslichen Form des GPI-gebundenen CNTF-Rezeptors (CNTFRα) den Erwerb einer Reaktion auf CNTF bewirkte (Davis et al., Science 259, 1736–1739 (1993); Panayotatos et al., Biochem. 33, 5813–5818 (1994)). Im vorliegenden Fall konnte GDNF alleine wie oben das Absterben vieler PIPLC-behandelter Motoneuronen nicht verhindern, jedoch stellte die Zugabe von löslichem GDNFRα mit 100 ng/ml die das Überleben fördernden Wirkungen von GDNF in PIPLC-behandelten, primären motorischen und sensorischen Neuronen vollständig wieder her (9B). Folglich wird GDNFRα an GDNF-reaktiven Neuronen exprimiert und ist wie die Rezeptoren für CNTF (Davis et al., Science 253, 59–63 (1991); Ip et al., Neuron 10, 89–102 (1993)) und Endotoxin (LPS) (Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 9930–9934 (1993)) an der Zellmembran durch eine Glykosyl-Phosphatidyl-Inositol- („GPI"-) Bindung verankert (Low et al., Science 239, 268–275 (1988)).
Neuritensprossungsaktivität wurde mit PC12-Zellen bestimmt. Ratten-Pheochromocytoma-PC12-Zellen, die von neurotrophen Faktoren für das Überleben in serumfreien Medien abhängen und niedrige Ret-Spiegel exprimieren (Daten nicht gezeigt), wurden ohne Serum in Gegenwart von GDNF, löslichem GDNFRα oder beidem gezüchtet und 7 Tage später untersucht. Lösliches GDNFRα, das als Carboxyterminus-His-markiertes Protein in 293-Human-Embryonierenzellen produziert wurde, wurde mittels Ni-NTA-Chromatographie wie beschrieben gereinigt (Moran et al., J. Biol. Chem. 266, 1250–1257 (1991)). PC12-Zellen wurden in Collagen-Polyorthinin-beschichteten 35 mm-Platten in RPMI-Medium geimpft, das mit 19% Pferdeserum und 5% Fötalkälberserum ergänzt war. Nach der Anheftung wurden die Zellen auf serumfreies Medium umgestellt und dann GDNF (100 ng/ml) und löslichem GDNFRα (sRα) wie bezeichnet exponiert ( 9C). Die Anzahl lebender Neuriten tragender phasenhellen Zellen pro Mikroskopfeld wurde 7 Tage später wie beschrieben bestimmt (Micanovic et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 157–161 (1990)). Mit GDNF oder löslichem GDNFRα alleine wurden nur wenige Neuriten tragende, phasenhelle lebende Zellen gefunden. Im Gegensatz dazu wurde eine Erhöhung der Anzahl lebender Zellen mit Neuriten beobachtet, wenn PC12-Zellen GDNF und löslichem GDNFRα gemeinsam exponiert wurden (9C). Die Kombination von löslichem GDNFRα (sRα) und GDNF induzierte die Neuritensprossungsreaktion von PC12-Zellen. Lösliches GDNFRα verlieh PC12-Zellen GDNF-Reaktivität. GDNFRα ist daher eine wichtige Komponente der GDNF-Signalkaskade und weise die jenigen Eigenschaften auf, die von einer ligandenbindenden Untereinheit eines funktionellen GDNF-Rezeptors zu erwarten ist.
Beispiel 5
GDNFRα und Ret bilden einen GDNF-Rezeptorkomplex
Da GDNFRα an der äußeren Oberfläche der Zelle verankert ist, muss die Übertragung von GDNF-Signalen nach Bindung an GDNFRα ein zusätzliches Transmembranprotein involvieren. Andere Mitglieder der TGFβ-Protein-Überfamilie, zu der GDNF gehört, die ein GPI-gebundenes Bindungsprotein aufweisen, weisen auch einen Transmembran-Serin-Threuninkinase-Rezeptor auf (für einen Überblick siehe Massague et al., J. Biol. Chem. 266, 20767–20772 (1992); Cheifetz et al., J. Biol. Chem. 266, 20767–20772 (1991)). Die Struktur von GDNFRα weist darauf hin, dass ein Rezeptorkomplex für GDNF, wie die Rezeptorkomplexe für CNTF (Davis et al., Science 260, 1805–1089 (1993)) und für Endotoxin (LPS) (CD14; Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 9930– 9934 (1993)) üblicherweise aus Multiuntereinheiten, einschließlich einer ligandenbindenden Komponente (hierin offenbartes GDNFRα) und eines signalübertragenden Transmembranmoleküls, wie z. B. gp130, zusammengesetzt ist. Der Phänotyp von Mäusen, denen der Orphan-Tyrosinkinase-Rezeptor c-ret (Schuchardt et al., Nature 367, 380–383 (1994); neulich bestätigt von Durbec et al., Nature 381, 789–793 (1996)) fehlt, weisen eine auffällige Ähnlichkeit zum Phänotyp der GDNF-defizienten Mäuse auf, die erstmals hierin produziert und untersucht wurden (siehe unten). Zusätzlich war die Gewebeverteilung von Ret (Pachnis et al., Development 119, 1005–1017 (1993); Avantaggiato et al., Cell Growth Diff. 5, 305–311 (1994); Tsuzuki et al., Oncogene 10, 191–198 (1995); Davis et al., Science 259, 1736–1739 (1993)) ähnlich der für GDNFRα (Daten nicht gezeigt). Um zu bestätigen, dass GDNF einen Transmembranrezeptor, nämlich Ret aufweist, der mit GDNFRα einen komplex bildet, um einer GDNF-Reaktion zu signalisieren und zu vermitteln, wurde die physiologische Wechselwirkung von GDNFRα und Ret ermittelt. Das Human-Neurublastom SK-N-SH und das Maus-Neuroblastom Neuro-2a, Zelllinien, die endogenes c-ret exprimieren, wurden GDNF alleine oder GDNF in Kombination mit löslichem GDNFRα für 5 Minuten exponiert und das Ausmaß der Ret-Tyrosinphosphorylierung bestimmt. Um auf Tyrosinphosphorylierung von Ret zu testen, wurden die Zellen für 1 Stunde bei 37°C mit und ohne PIPLC inkubiert und dann verschiedenen Konzentrationen von GDNF und löslichem GDNFRα für 5–10 Minuten bei 37°C exponiert. Die Zellen wurden dann aus den Platten mit 2 mM EDTA in PBS entfernt und mit eiskaltem Puffer (10 mM Natriumphosphat (pH 7,0), 100 mM NaCl, 1 NP40, 5 mM EDTA, 10 mM Natriumvanadat, 2 mM PMSF und 0,2 Units Aprotinin) lysiert und zur Immunpräzipitation mit Antiseren gegen den 19-Aminosäuren-Carboxyterminus von Ret, gefolgt von Bindung an Protein A-Sepharose verwendet. Die immunpräzipitierten Proteine wurden durch Aufkochen in SDS-Probenpuffer freigesetzt, an einem 8% SDS-Polyacrylamidgel getrennt, auf eine Nitrocellulosemembran übertragen und mit Anti-Phosphotyrosin-Antikörper (Upstate Biotechnology Inc.) zur Reaktion gebracht. Um den Ret-Spiegel zu erhöhen, wurden SK-N-SH-Zellen 12 Stunden vor GDNF-Zugabe mit 10 nM Retinoesäure gehandelt.
GDNF induzierte eine mäßige Phosphorylierung von Ret in diesen beiden Zelllinien (10A), nicht jedoch in Human-Ret stabil exprimierenden NIH3T3-Zellen (Daten nicht gezeigt). Die Ret-Phosphorylierung wurde weiter erhöht, wenn GDNF gemeinsam mit GDNFRα zugesetzt wurde, nicht jedoch, wenn GDNFRα alleine zugesetzt wurde (10A und nicht gezeigte Daten). Um zu ermitteln, ob die Induktion der Ret-Tyrosinphosphorylierung von der Gegenwart von GDNFRα abhängt, wurden Neuro-2a-Zellen und SK-N-SH-Zellen mit PIPLC behandelt und die Reaktion von Ret auf GDNF untersucht. Im Einklang mit der Erkenntnis, dass Überlebensreaktionen auf GDNF die Gegenwart von GDNFRα erfordern, wurde keine Induktion der Tyrosinphosphorylierung an Ret in diesen PIPLC-behandelten Zellen in Gegenwart von GDNF alleine detektiert. Im Gegensatz dazu konnte die Stimulierung der Tyrosinphosphorylierung des 170 kDa-Ret-Proteins in PIPLC-behandelten Neuro-2a- und SK-N-SH-Zellen leicht beobachtet wer den, wenn GDNF gemeinsam mit einem löslichen GDNFRα zugegeben wurde ( 10A und nicht gezeigte Daten).
Obgleich GDNF die Tyrosinphosphorylierung von Ret stimulierte, konnte keine hochaffine Bindung von GDNF an Ret in Neuro-2a-Zellen, die hohe Mengen eines endogenen Ret exprimierten, oder in Zellen. die rekombinantes Ret exprimierten, detektiert werden (10B und nicht gezeigte Daten). Die physische Wechselwirkung zwischen Ret und GDNF, wie sie durch Bildung eines immunpräzipitierbaren Ret/GDNF-Komplexes definiert ist, die üblicherweise von GDNFRα vermittelt wird, wurde ermittelt. Embryonale Human-Nieren-293-Zellen wurden vorübergehend mit einem Expressionsvektor, der c-ret enthielt, oder einer Kombination von Expressionsvektoren für c-ret und GDNFRα transfiziert, GDNF exponiert und dann mit einem milden Tensid lysiert (Davis et al., Science 259, 1736–1739 (1993)). Proteine, die Komplexe mit GDNF bildeten, wurden mit polyklonalem Antikörper gegen GDNF immunpräzipitiert und an einem Western-Blot unter Verwendung eines polyklonalen Antikörpers gegen Ret analysiert. In Zellen, die Ret alleine oder GDNFRα alleine exprimierten, konnte kein copräzipitiertes Ret-Protein detektiert werden. Im Gegensatz dazu wurde Ret aus Zellen, die Ret sowie GDNFRα exprimierten, leicht mit GDNF-Antikörpern copräzipitiert (10C). Um den Komplex zwischen GDNFRα und Ret weiter zu charakterisieren, wurden 293-Zellen vorübergehend mit Expressionsvektoren für c-ret und mit einem Epitop-markierten GDNFRα transfiziert und dann auf Anwesenheit von GDNFRA/Ret-Proteinkomplexen in Gegenwart und Abwesenheit von GDNF analysiert. Die Zellen wurden mit GDNF wie angegeben stimuliert und mit Brij 96-Tensid (Sigma) wie beschrieben (Davis et al., Science 259, 1736–1739 (1993)) lysiert. Mutmaßliche Immunkomplexe wurden mit einem polyklonalen Antikörper gegen GDNF (10C) oder Ret (10D) immunpräzipitiert, auf ein Nitrocellulosemembranfilter übertragen und dann mit polyklonalem Antikörper gegen Ret (10C) oder Epitop-markiertes GDNFRα (10D) analysiert. In Zellen, die Ret alleine oder das Epitop-markierte GDNFRα alleine exprimierten, konnte keine signifikante Menge von Proteinkomplexen detektiert werden, und zwar entweder in Gegenwart oder in Abwesenheit von GDNF (10D). Im Gegensatz dazu wurde in Zellen, die Epitop-markiertes GDNFRA sowie Ret exprimierten, ein Proteinknmplex, der beide Proteine enthielt, nach Exposition mit GDNF leicht detektiert (10D). Diese Erkenntnisse stehen im Einklang mit der Vorstellung, dass GDNF, GDNFRα und Ret in Gegenwart von GDNF einen Komplex an der Zelloberfläche bilden können, dass Ret eine Komponente eines funktionellen GDNF-Rezeptor ist und dass GDNFRα vermittelnd bei der Wechselwirkung zwischen GDNF und Ret erforderlich ist.
Beispiel 6
Das Maus-GDNF-Gen wurde durch homologe Rekombination ein embryonalen Stamm-(„ES"-) zellen zerstört und es wurde ein adressierter Klon in Blastozyten injiziert, um GDNF-mutierte Mäuse zu erzeugen. Die dem adressierenden Konstrukt fehlenden Aminosäuren 103–211 des reifen, biologisch aktiven Abschnitts von GDNF (siehe 1) produzierte das zerstörte Allel. Das adressierende Konstrukt wurde wie folgt konstruiert. Ein genomisches SphI-EcoRI-Fragment von 3 Kb, das für die Aminosäuren 52–102 von GDNF kodiert, wurde im Leseraster an das lacZ-Gen fusioniert. Ein neo-Gen unter Kontrolle des PGK-Promotors und ein BgIII-BamHI-Fragment vom 3'-Ende des GDNF-Gens wurden unmittelbar Stromab des LacZ-Gens insertiert. GDNF-Genfragmente wurden aus einer Maus-129-Lambda-Bibliothek erhalten. Das adressierende Konstrukt wurde in ES-D3-Zellen elektroporiert. G418- (400 Mikrogramm(ml) resistente Klone wurden isoliert. ES-adressierte Klone wurden in BALB/c-Blastozyten injiziert und ein einzelner Klon durch die Keimbahn übertragen. Das homologe Rekombinationsereignis in einem einzelnen ES-Klon wurde mittels Southern-Hybridisierung ermittelt. Southern-Blots wurde verwendet, um die Zerstörung zu bestätigen. Die Genotyp-Analyse von Tieren der Wildform (+/+), heterozygoten (+/–) und homozygoten mutierten (–/–) Tieren wurde mittels PCR durchgeführt. Bei der Analyse war eine beobachtete obere Bande für das neo^γ-Gen spezifisch und eine untere Bande war für das GDNF-Gen der Wildform spezifisch.
Mutierte Mäuse wurden untersucht. Während GDNF-mRNA in Niere, Darm, Vetralmittelhirn und Skelettmuskel normaler E15.5-Mäuse gefunden wurde, konnten keine GDNF-Transkripte in für das mutierte Allel (GDNF^–/–) homozygoten "Geschwistern" (desselben Wurfs; "litter mates") detektiert werden. Heterozygote Mäuse waren hinsichtlich Größe normal und waren von ihren Geschwistern der Wildform (WT) nicht unterscheidbar. Im Gegensatz dazu starben GDNF^–/–-Mäuse 1–1,5 Tage nach der Geburt, obwohl sie in der Lage waren, zu säugen und normale Extremitäten- und Körperbewegungen zeigten.
GDNF wurde erstmals aufgrund seiner Fähigkeit, das Absterben embryonaler dopaminerger Neuronen in Kultur (Lin et al., Science 260, 1130–1132 (1993)) und in Läsionsmodellen in vivo (Beck et al., Nature 373, 339–341 (1995); Kearns et al., Brain Res. 672, 104–111 (1995); Tomac et al., Nature 373, 335–339 (1995)) zu verhindern, identifiziert und es wurde darauf hin von ihm gezeigt, das es im embryonalen Striatum, einem hauptsächlichen Innervations-Ziel für dopaminerge Neuronen, exprimiert wird (Schaar et al., Exp. Neurol. 124, 1252 (1994)). Ob GDNF ein essentieller Überlebensfaktor in verschiedenen dopaminergen (DA-) Neuronen während der normalen Entwicklung ist, wurde untersucht. Die Anzahl von Neuronen in verschiedenen Ganglien in p1-WT- und GDNF^–/–-Mäusen wurde untersucht. Untersuchte Neuronentypen umfassten dopaminerge, gesichtsmotorische, spinalmotorische, noradrenergische, trigeminale, knötchenförmige, DRG-, petrosale, vestibuläre und SCG-Neuronen. Tiere wurden aufbereitet und die Zählung der Neuronen wie in Jones et al., Cell 76, 989–999 (1994), durchgeführt. Die Anzahl von Ganglien wurde aufgezeichnet. Striatum-, Vetralmittelhirn-, Substantia nigra-, Locus coeruleus- und Gesichtsmotonuclei in GDNF^–/–-Mäusen wurde nach Tyrosinhydroxylase- (TH-) Färbung untersucht und mit P1-WT- und GDNF^+/–-Mäusen verglichen. TH ist das geschwindigkeitslimitierende Enzym der Dopaminsynthese. Eine Verminderung der Dichte von TH-Fibrillen im Striatum der GDNF^–/–-Mäuse wurde beobachtet. Die Tiere wurden narkotisiert und durch Perfusion mit 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer fixiert, geschnitten, gefärbt und wie beschrieben analysiert (Jones et al., Cell 76, 989–999 (1994)). Überraschenderweise waren die Anzahl von Tyrosin hydroxylase-positiven (TH+) dopaminergen Neuronen im Ventralmittelhirn und die Dichte dopaminerger Fortsätze zum Striatum in GDNF^–/–- und WT-Tieren identisch.
Da die Entwicklung von DA-Neuronen in Säugetieren postnatal hinhält und andauert (Coyle et al., J. Neurochem. 27, 673–678 (1976); Specht et al., Comp. Neurol. 199, 255– 276 (1981)), wurde die Anzahl von TH+-Zellen im Mittelhirn von heterozygoten P42-GDNF^+/–-Mäusen verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1 Anzahl von Neuronen in verschiedenen Ganglien von P42-WT- und GDNF^+/–-Mäusen
Tabellenlegende: Die Aufarbeitung der Tiere und Auszählen von TH-immunreaktiven Zellen in der gesamten Pars compacta-Region der Substantia nigra wurde wie früher beschrieben durchgeführt (Sauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 8935–8939 (1995)). Die Anzahl der Zellen ist als Mittelwert von Zellen pro Schnitt pro Tier dargestellt. Das Auszählen von TH-IR-Zellen im Locus coeruleus wurde durch Zählen der Anzahl von TH-IR-Zellprofilen durchgeführt, die in jedem Rautenhirn-Schnitt vorhanden waren, die den Locus coeruleus enthielten. Die Anzahl von Zellen ist als kumulative Anzahl an beide Seiten jedes Tieres dargestellt. Das Auszählen im Gesichtsmotor-Nucleus wurde an Cresylviolett-gefärbten Schnitten von einem unbefangenen Beobachter durchgeführt. Die Gesamtzahl gefärbter Neuronen-Perikaryen in allen Unterkernen des Gesichtsmotor-Kern wurde in jedem dritten Schnitt an beiden Seiten des Hirnstamms gezählt. Die Anzahl von Zellen ist als Gesamtzahl +/– SEM je Tier dargestellt. Alle mikroskopischen Untersuchungen wurden unter Hellfeldbeleuchtung bei 200-facher Vergrößerung durchgeführt. N stellt die Anzahl analysierter Ganglien dar.
Überraschenderweise wurde kein Mangel der Anzahl dopaminerger Neuronen (Table 1) oder in der Vielschichtigkeit von TH+-Fibrillen im Striatum in GDNF^+/–-Mäusen detektiert. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass GDNF kein erforderlicher Überlebensfaktor für embryonale dopaminerge Neuronen und kein limitierender Überlebensfaktor für dopaminerge Neuronen im adulten Tier ist, wie früher behauptet worden ist (Lin et al., Science 260, 1130–1132 (1993); Beck et al., Nature 373, 339–341 (1995); Kearns et al., Brain Res. 672, 104–111 (1995); Tomac et al., Nature 373, 335–339 (1995)).
GDNF ist ein potenter neurotropher Faktor für embryonale Spinalmotoneuronen in Kultur und verhindert das Absterben verletzter Gesichts-Motoneuronen in vivo (Henderson et al., Science 266, 1062–1064 (1994); Yan et al., Nature 373, 341–344 (1995); Oppenheim et al., Nature 373, 344–346 (1995)). Ob GDNF, das im Skelettmuskel exprimiert wird, für das Überleben von Motoneuronen während der Embryogenese notwendig ist, wurde ermittelt. Geringfügige Defizite wurde in lumbalen, spinalen und trigeminalen (<20%) nicht jedoch in Gesichts-Kernen von P1-GDNF^+/–-Mäusen detektiert. Zusätzlich wurde kein Mangel an Gesichts-Motoneuronen in P42-GDNF^+/–-Tieren beobachtet (Tabelle 1). Diese Erkenntnisse sprechen gegen die Möglichkeit, dass GDNF ein bedeutender neurotropher Faktor für willkürliche Motoneuronen während der Zeitspanne des natürlich auftretenden Zelltods ist (Henderson et al., Science 266, 1062–1064 (1994); Yan et al., Nature 373, 341–344 (1995); Oppenheim et al., Nature 373, 344–346 (1995)).
Von GDNF wurde kürzlich gezeigt, dass es den chemisch induzierten Tod noradrenergischer Neuronen im Locus coeruleus verhindert und ihre Faszikulation und Sprossung in ganzen Tieren fördert (Arenas et al., Neuron 15, 1465–1473 (1995)). Diese Erkenntnisse wiesen darauf hin, dass GDNF ein natürlicher neurotropher Faktor und potentielles therapeutisches Mittel für noradrenergische Neuronen sein könnte, die bei Alzheimerkrankheit und Parkinsonscher Krankheit degenerieren. Bei ihrer Untersuchung erwiesen sich noradrenergische Neuronen des Locus coeruleus als normal hinsichtlich der Größe und Anzahl sowohl in P1-GDNF^–/–-, als auch in P42-GDNF^+/–- (Tabelle 1) Mäusen. Dergleichen wurden keine krassen Mängel in Cerebellum, Basal-Vorderhirn, Hippocampus-For mation, Striatum und Neocortex von P1-GDNF^–/–-Mäusen identifiziert, obwohl GDNF in Hippocampus, Cortes und Striatum nach chemisch induziertem epileptischem Anfall oder Injektion von Erregungs-Neurotransmittern upreguliert wird (Schmidt-Kastner et al., Brain Res. Mol. Brain Res. 26, 325–330 (1994); Numpel et al., Neuroscience 59, 791– 795 (1994)). Nur geringfügige Defizite an Spinalmotoneuronen (>20%) und keine Defizite an noradrenergischen und dopaminergen Neuronen am Tag 1 nach der Geburt (P1) wurden beobachtet. Diese Erkenntnisse weisen darauf hin, dass die Gegenwart von GDNF im embryonalen CNS und in Innervationszielen zumindest teilweise die Beteiligung an der Differenzierung, Regulation der Axonsprossung, Synaptogenese, Wahl von Neurotransmittern, Leitgeschwindigkeit oder synaptischer Effizienz widerspiegelt.
Im Einklang mit der Beobachtung, dass GDNF das Überleben embryonaler sympathischer und knötchenförmiger sensorischer Neuronen von Küken in Kultur fördert (Buj-Bello et al., Neuron 15, 821–828 (1995)), wurde eine Verminderung der Anzahl sympathischer oberer Zervikalganglien- (<35%), knötchenförmiger Neuronen (<40%) sowie Dorsalwurzelganglien- (<40%) Neuronen detektiert. Im Gegensatz dazu wurde kein Mangel der Anzahl trigeminaler oder vestibulärer Gangleinneuronen bemerkt.
Das Darmnervensystem in WT- und GDNF^–/–-Mäusen wurde untersucht. Dünndarm aus ET- und GDNF^–/–-Mäusen wurde mit H&E oder mit Antikörpern gegen das neuronenspezifische Protein Peripherin gefärbt. P1-Mäuse, E13.5-Mäuse wurden untersucht. Myenterische (Myn) und submukosale (Sub) Neuronen in WT-Tieren waren in GDNF^–/–-Mäusen abwesend. Tiere wurden durch Perfusion mit 10% neutral gepuffertem Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und mit 5 μm für die lichtmikroskopische Analyse geschnitten. Die Antikörperfärbung wurde wie bei Jones et al., Cell 76, 989–999 (1994), durchgeführt, wobei polyklonale Anti-Peripherin-Antikörper (Chemicon Inc.) in 1 : 300-Verdünnung verwendet wurden. Die myenterischen (Auerbach) und submukosalen (Meissner) Plexi wurden auf Neuronenmängel untersucht. Neuronen des Darmnervensystems (ENS), die zu diesen beiden Plexi gehören, waren über die Länge des Magen-Darm-Trakts in E13.5-, E15.5- und P1-WT- und GDNF^–/–-Mäusen mittels Lichtmikroskopie so wie nach Färbung mit einem Antikörper gegen den neuronenspezifischen Marker Peripherin leicht zu sehen. Im Gegensatz dazu fehlten diese Neuronen völlig in gealterten, passenden GDNF^–/–-Geschwistern. Darüber hinaus war die Muskelwand des Darms in GDNF^+/–- im Vergleich zu ihren WT- oder GDNF^+/–-Geschwistern dünner. Obwohl des ENS vorwiegend aus Neuralleistenzellen der Hinterhirnregion stammt, wurde eine signifikante Wirkung auf andere Neuralleisten-hergeleitete Neuronen nicht beobachtet. Diese vereinten Erkenntnisse weisen darauf hin, dass GDNF für Überleben und/oder Entwicklung von Darmneuronen, kurz nachdem sie in den Embryonaldarm eintreten, essentiell ist (Gershon et al., J. Neurobiol. 2, 199–214 (1993)), und dass GDNF-induzierte Innervation für die Entwicklung und/oder den Erhalt von glatten Muskeln im Darm notwendig sein könnte. Die Abwesenheit des ENS wurde früher in Mäusen beobachtet, denen der Orphan-Tyrosinkinase-Rezeptor RET fehlt (Schuchardt et al., Nature 367, 380– 383 (1993)). Es ist berichtet worden, dass GDNF in den Glattmuskelschichten des Darms während der Embryogenese reichlich exprimiert wird, und es ist die Gegenwart von GDNF-mRNA im embryonalen Nierenmesenchym beschrieben worden (z. B. Trupp et al., J. Cell Biol. 130, 137–148 (1995)).
Die Nieren in WT-, GDNF^–/+- und GDNF^–/–-Mäusen wurde untersucht. Es wurden Mikrofotografien des Bauchs in P1-WT-, P1-GDNF^–/–-, P1-GDNF^+/–- und P42-GDNF^+/–-Mäusen bei niedriger Energie erhalten. Die Lage der Nieren war nahe der Nebennieren in WT-Mäusen; jedoch fehlten sie in GDNF^+/–-Mäusen und die linke Niere fehlte in P1- und P30-GDNF^+/–-Mäusen. H&E-Färbung von Sagginalschnitten aus E13.5-WT, E13.5-GDNF^–/–-Embryos, E11.5-WT, E11.5-GDNF^–/– wurde durchgeführt. Der Einerstock (Ovr) war in dem Raum vorhanden, der normalerweise von der Niere (Kid) eingenommen wird, unmittelbar kaudat der Nebenniere. WT-, GDNF^–/–- und GDNF^+/–-Mäuse wurden im angegebenen Alter getötet, mit 10% neutral gepuffertem Formalin perfundiert, in Paraffin eingebettet, fortlaufend geschnitten und mit H&E zur mikroskopischen Untersuchung gefärbt. Der GDNF-Genotyp jedes Jungtiers wurde mittels PCR-Analyse bestimmt, es wurde das Geschlecht durch mikroskopische Analyse der Gonaden bestimmt und 2–3 Tiere von jedem Genotyp und in jedem Alter wurden histologisch analysiert.
14/16-GDNF^–/–-Mäuse wiesen vollständige beidseitige Nieren- und Uterusagenesie auf, wobei eine teilweise Entwicklung einer der beiden Nieren und Harnleiter in zwei GDNF^+/–Embryos beobachtet wurde. In heterozygoten Embryos, Jungtieren und adulten Tieren beider Geschlechter bestand eine erhöhte Häufigkeit einseitiger Nierenagenesie (7/26) oder Hypoplasie (4/26) im Vergleich zu WT-Mäusen. Die Analyse von GDNF^–/–-Mäusen in frühen Embryonalstadien zeigte die Abwesenheit von Nachnieren sogar bei E11.5. Andere Abkömmlinge des embryonalen urogenitalen Zwischenmesoderms (Nebennieren und Gonaden), verbleibender Baucheingeweide und aller Brustgewebe waren in GDNF^–/–-, GDNF^+/–- und GDNF^–/–-Mäusen mikroskopisch normal. Bezüglich der Fortpflanzungsorgane war die einzige bemerkte Veränderung in GDNF^–/–-Mäusen eine Umkehrung der Ausrichtung des Eierstocks im Bezug auf die Baucheingeweide. Diese Veränderung könnte eine Vergrößerung des verfügbaren Raumes in der Bauchhöhle nach Nierenagenesie oder Modifizierungen im Mesothel widerspiegeln, das den Eierstock an der Körperwand befestigt.
Zusätzlich zeigten GDFN^–/–-Mäuse eine leichte multifokale Nekrose in der roten Milzpulpa, die Stellen aktiver Hämatopoese sind. Milze aus 1 Tag alten (P1-)GDNF-Wildform- und mutierten GDNF-Knockout- (KO-) Mäusen sowie KO-Embryos der Wildform am Tag 16,5 (E16.5), E15.5, E13.5 und E12.5 der Trächtigkeit wurden untersucht. Alle diese Untersuchungen wurden an 5 Mikrometer dicken Schnitten durchgeführt, die mit 10% neutral gepuffertem Formalin fixiert (14 Stunden), in Paraffin eingebettet, und mit Hämatoxylin und Eosin zur mikroskopischen Beurteilung gefärbt waren, wobei Standardverfahren für die Beurteilung morphologischer Veränderungen in Geweben angewendet wurden. Zu allen untersuchten Zeitpunkten bestand eine Produktion hämatopoetischer Elemente (erythroide Serie roter Blutkörperchen und myeloische Serie weißer Blutkörperchen, einschließlich Neutrophile, Eosinophile, Lymphozyten und Makrophagen) in der Leber. Dies ist ein normaler Vorgang während der Entwicklung, die bei der Geburt in Mäusen nach wie vor stattfindet, und er schien in Mäusen der Wildform sowie KO-Mäusen normal zu sein. Ein ähnliche Produktion von erythroiden und myeloischen Elementen findet auch in der roten Milzpulpa statt und entwickelt sich um E13.5 und hält während der gesamten Lebenszeit der Mäuse an. Jedoch bestanden in den untersuchten E16.5-KO- (1 Tier) und 3 P1-KO-Mäusen vielfach verstreute Nekroseherde in der roten Milzpulpa, häufig nahe den Blutgefäßen. (Die Herde in den E16.5-Embryos waren weniger drastisch als jene, die in P1-Mäusen beobachtet wurden). Diese Herde waren von sich entwickelnden erythroiden und myeloischen Zellen umgeben, was darauf hinweist, dass diese Herde von hämatopoetischen Inseln herrührten, wo aktive Zellproliferation stattfindet. Diese Nekrosebereiche waren häufig, jedoch nicht immer Venen im Parenchym benachbart. Diese Venen befinden sich an Stellen, wo die reifen erythroiden und myeloischen Zellen in den Peripherkreislauf eintreten. Es bestand kein Anhaltspunkt von Thrombose oder Infektion, um auf eine andere Ätiologie für diese nekrotischen Herde hinzuweisen. Die Abwesenheit ähnlicher Herde in allen Entwicklungsstadien von Wildform-Geschwistern weist darauf hin, dass sie nicht auf Infektion oder einer Kondition im Muttertier (eine Art von „Umwelt"-Faktor) zurückzuführen ist, sondern direkt mit dem KO-Genotyp in Verbindung steht. Diese Herde wurden in den E15.5- und E13.5-KO-Mäusen nicht beobachtet, jedoch ist dies deshalb der Fall, weil sich die Milz-Hämatopoese in diesem Trächtigkeitsalter gerade erst zu entwickeln beginnt. Im E16.5-Stadium beginnt die Hämatopoese auch in den Knochenmarkshöhlen, der hauptsächlichen Produktionsstelle nach der Geburt. Ähnliche nekrotische Herde im Knochenmark in E16.5- oder P1-KO-Mäusen oder in der Leber von KO wurde in keinem der untersuchten Trächtigkeitsalter beobachtet. Die Gegenwart nekrotischer Herde in hämatopoetischen Inseln in der roten Milzpulpa von KO-Mäusen weist darauf hin, dass GDNF eine Wirkung auf die Milz-Hämatopoese hat.
Die im Wesentlichen normale Entwicklung von Gonaden in GDNF^–/–-Mäusen zeigt an, dass GDNF für die Organogenese von Vor- und Urnieren (Übergangsstrukturen, die an der Bildung von Dauerniere sowie Gonaden beteiligt sind) (Saxen, Organogenesis of the kidney, P. W. Barlow, P. B. Green und C. C White (Hrsg.), Bd. 19, Cambridge University Press, Cambridge, UK (1987)) nicht notwendig ist. Stattdessen scheinen GDNF während des Zeitraums essentiell zu sein, wenn reziproke induktive Wechselwirkungen zwischen der Harnleiter-Knospe (einer Einstülpung der Urniere/Wolff'scher Gang) und dem Urnieren-Mesenchym (kaudales Zwischen-Mesemchym) die Sammelkanäle (Harnleiter) und das Filtersystem (Nierenkörperchen und proximale und distale Tubulae) der Dauer-Nachniere zur Folge haben. Interessanterweise erwies sich der Knochen-morphogene Faktor 7 (BMP-7), ein weiteres Mitglied der TGF-β-Proteinfamilie, als essentiell für Wachstum und Überleben von Harnleiter und Nephronen, nicht jedoch für ihre Induktion (Dudley et al., Genes & Develop. 9, 2795–2807 (1995)), was darauf hinweist, dass mehrere Mitglieder der TGF-β-Proteinfamilie die verschiedenen Aspekte der Nierenentwicklung regulieren könnten. Zusätzlich wurden Defekte bei der Nierenentwicklung (sowie anderen Organen) in Mäusen beobachtet, denen der Orphan-Tyrosinkinase-Rezeptor RET fehlt (Schuchardt et al., Nature 367, 380–383 (1994)), und in Mäusen, denen der Willms-Tumor-assoziierte, mutmaßliche Transkriptionsfaktor WT-1 fehlt (Kreidberg et al., Cell 74, 679–691 (1993)). Demgemäß ist GDNF, wie hierin nachgewiesen, an der Nieren-Organogenese beteiligt (Patterson und Dressier, Curr. Opin.Genet. Dev. 4(5), 696–702 (1994)), um Wachstum, Zelldifferenzierung und Struktur in diesem Organ zu regulieren.
Eine Reihe relativ junger (5–7 Wochen alt) GDNF-herterozygoter Mäuse waren zerzaust, mit schwachem Fell und wiesen Gewichtsverlust auf. Vier von 8 wiesen schwere Nierenerkrankungen im Endstadium auf. Die Untersuchung der Nieren offenbarte das mikroskopische Erscheinungsbild einer 1 oder 2 Jahre alten Niere (wenn Nierenkrankheit im Endstadium für gewöhnlich in Mäusen beobachtet wird). Die Läsionen schienen in erster Linie glomerulären Ursprungs zu sein, charakterisiert durch geschrumpfte sklerotische Glomerulae und verstärkte glomeruläre Matrix (Membran-Glomerulonephritis). Eines der Tiere hatte eine verstärkte zellfreie Mesangium-Matrix, was auf glomeruläre Amyloidose hinweist, jedoch waren spezielle Stämme negativ für Amyloid. Dieses Material war PAS-positiv, was anzeigt, dass es sich wahrscheinlich um Mesangium-Matrix handelt. Beobachtete sekundäre Veränderungen waren Tubuserweiterungen und Proteinurie. Bei Tieren im Endzustand waren BUN- und Ceratinin-Spiegel erhöht, was im Allgemeinen sehr spät bei Nierenkrankheit auftritt, wenn 70% der Nierenmasse verloren ist. Wie oben gezeigt wurde, besitzen einige GDNF-Heterozygoten nur 1 Niere; jedoch wurde diese schwere Nierenkrankheit in Tieren beobachtet, die 1 oder 2 Nieren (und in beiden Geschlechtern) aufwiesen. Diese Ergebnisse zeigen an, dass die in GDNF-Heterozygoten vorhandene Krankheit eine Membran-Glomerulonephritis ist.
Sieben Paare von altersmäßig zusammenpassenden GDNF-Wildtyp- und GDNF-heterozygoten Mäusen wurden mittels klinischer Pathologie, Hämatologie und Licht- und Elektronenmikroskopie gescreent. Diese Mäuse waren 21–23 Wochen alt und mit Ausnahme einer leichten BUN-Erhöhung (34 versus 25) in den Heterozygoten waren keine Anzeichen von Nierenkrankheit vorhanden. Die Erfinder führten einige elektronenmikroskopische Untersuchungen an den Heterozygoten mit der höchsten BUN (44) durch, jedoch waren sie im Allgemeinen ultrastrukturell normal. Es waren einige Bereiche vorhanden, wo die Epithelstiele fusioniert waren. Da diese Tiere wesentlich älter waren, als die vorher bei Nekropsie untersuchten, waren sie wahrscheinlich nicht für die Nierenkrankheit anfällig.
Zusammenfassend beweist die hierin dargestellte Arbeit, dass GDNF kein essentieller neurotropher Faktor für dopaminerge, motorische oder noradrenergische Neuronen während der Embryogenese ist, wie früher behauptet worden ist. Vielmehr scheint GDNF essentiell für das Überleben und die Entwicklung des Darmnervensystems und für die Differenzierung der Nachniere und des Harnleiters aus dem kaudalen Zwischenmesoderm zu sein.
Beispiel 7
Monoklonale Anti-GDNF-Antikörper
Fünf BALB7c-Mäuse (Charles River Laboratories, Wilmington, DE) wurden mit gereinigtem rhGDNF in RIBI-Adjuvans (RIBI Immunochem Research Inc., Hamilton, MO). Splenozyten aus der Maus, die den höchsten Antikörpertiter gegen immobilisiertes rhGDNF zeigten, wurden mit den Maus-Myelomzellen (SP2/0; American Type Culture Collection, Rockville, MD) fusioniert (Sierra BioSource Inc. Gilroy, CA). Nach 10–14 Tagen wurden die Überstände gesammelt und auf Antikörperproduktion und hGDNF-Spezifität mittels Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) gescreent. Vierzehn positive Klone, welche die höchste Immunreaktivität nach der zweiten Klonierungsrunde zeigten, wurden in Pristane-geprimte Mäuse für die In-vivo-Produktion von MAb injiziert. Die Aszitesflüssigkeiten wurden gepoolt und mittels Affinitätschromatographie (Pharmacia Fast-Protein-Liquid-Chromatography (FPLC); Pharmacia, Uppsala, Schweden) an Protein A aus Staphylococcus gereinigt. Die gereinigten Antikörperpräparate wurden sterilfiltriert (0,2 μm Porengröße; Nalgene, Rochester, NY) und bei 4°C in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gelagert.
Mikrotiterplatten wurden mit 100 μg/Napf rhGDNF oder rhTGF-β₁ (Genentech Inc.; 1 μg/ml) in 0,05 M Carbonatpuffer, pH 9,6, über Nacht bei 4°C beschichtet. Die Platten wurden drei Mal mit ELISA-Waschpuffer (PBS/0,05% Tween 20) gewaschen und für zumindest 1 Stunde mit 0,5% Rinderserumalbumin und 0,05% Tween 20 enthaltendem PBS (PBS/BSA/T20) blockiert. Die Platten wurden wiederum drei Mal mit Waschpuffer gewaschen und es wurden 100 μl der Proben und Kontrollen für 1–2 Stunden bei Raumtemperatur zugegeben. Die Platten wurden drei Mal gewaschen und für 1–2 Stunden bei Raumtemperatur mit HRP-konjugiertem Ziege-Anti-Maus-IgG (Fc-spezifisch) (Sigma), verdünnt in PBS/BSA/T20, inkubiert. Die Platten wurden dann gewaschen und mit Orthophenylendiamin in PBS (Sigma; eine 5 mg-Tablette je 12,5 ml PBS; 100 μl je Napf) für 10–20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde mit 2,5 M H₂SO₄ gestoppt. Die resultierenden Absorptionen (490 nm unter Verwendung eines 405 nm Referenzfilters) wurden mit einem automatischen Plattenlesegerät (UV Max, Molecular Devices, Palo Alto, CA) aufgezeichnet.
Die isoelektrischen Punkte der gereinigten MAbs wurden mittels Phast-System (Pharmacia) nach den Verfahren des Herstellers bestimmt.
SDS-PAGE kann für Reinheitsanalyse und Immunoblotting verwendet werden. Eindimensionale SDS-PAGE wurde gemäß dem Verfahren von Laemmli unter Verwendung von 4–20% Tris-Glycin-Gelen (Novex, Encinitas, CA) durchgeführt. rhGDNF (1 μg je Spur) und 5 μl biotinylierter Molekulargewichtsstandards (Bio-Rad) wurden den geeigneten Gel-Spuren zugegeben und die Elektrophorese bei 125 V (ungefähr 32–35 mA) für 1,5–2 Stunden durchgeführt. Die Gele wurden für Immunoblotting verwendet. rhGDNF wurde in Probenpuffer (8% SDS„ 40% Glycerin, 350 mM Tris-HCl, 273 mM Tris-Base, 0,5% (w/v) Xylolcyanol und 0,5% (w(v) Bromphenolblau) in Gegenwart (5% (v/v) β-Mercaptoethanol) und Abwesenheit von Reduktionsmittel auf 100 μg/ml verdünnt. Reduzierte Proben wurden für 5 Minuten auf 90°C erhitzt.
Es wurde eine Immunoblotting-Analyse durchgeführt. Nach dem Transfer wurden die Membranen mit PBS/BSA/T20 für zumindest 1 Stunde bei Raumtemperatur geblockt und mit affinitätsgereinigten MAbs (verdünnt auf 1 μg/ml in PBS/BSA/T20) für 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert. Die Folien wurden dann mit PBS-0,05%T20 gewaschen und die geeigneten HRP-Konjugate (Ratten-Anti-Maus-IgG-HRP (Boehringer Mannheim), 1 : 5000; oder Streptavidin-HRP (Sigma, St. Louis, MO), 1 : 10.000, beide verdünnt in PBS/ BSA/T20) für 1 Stunde bei Raumtemperatur zugesetzt. Die Folien wurden dann gewaschen und mit Luminol-Substrat (Amersham International, Amersham, UK) für 1 Minute bei Raumtemperatur unter Schütteln exponiert und auf Röntgenfilm (Eastman Kodak, Rochester, NY) für ungefähr 10–60 Sekunden belichtet.
Es wurden vierzehn rGDNF-MAbs verschiedener Isotypen gefunden, die sowohl zur Bindung von immobilisiertem rhGDNF. Als auch von rhGDNF in Lösung fähig waren. Die MAbs kreuzreagierten nicht mit rhTGFβ₁ und binden nicht reduziertes sowie reduziertes GDNF-Protein. Fünf (5) der MAbs waren für immunhistochemische Analyse geeignet. MAbs 1694, 1712, 1717, 1725 und 1731 sind fähig, mit seinem mutmaßlichen Rezeptor komplexiertes GDNF zu binden. Die anderen MAbs wurden mit 1693, 1695, 1696, 1709, 1710, 1711, 1714, 1715 und 1716 bezeichnet. Die Bezeichnungen sind jene, die den Hybridomzellen zugeordnet sind, welche den jeweilige MAb produzie ren. Die Epitop-Spezifität der MAbs kann durch Kreuzblockierungsanalyse bestimmt werden.
Zusammenfassend wird hierin ein einzigartiges Rezeptorsystem für GDNF bereitgestellt, in dem GDNFRα, ein neues GPI-gebundenes Protein, eine ligandenbindende Komponente und der Tyrosinkinase-Rezeptor Ret eine Signalkomponente ist. Der GDNF-Rezeptorkomplex ähnelt teilweise den Rezeptoren für den ziliaren neurotrophen Faktor (Davis et al., Science 259, 1736–1739 (1993)), bakterielles Endotoxin (Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 9930–9934 (1993); Pugin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2744–2748 (1993)) und Rezeptoren im Immunsystem, in denen GPI-gebundene Proteine als Ligandenbindungskomponenten dient und zytoplasmatische Tyrosinkinase als Signalkomponenten dienen (Brown, Curr. Opin. Immunol. 5, 349–354 (1993)). GDNF könnte einen evolutionären Übergang innerhalb der Überfamilie von Cystein-Knotenenthaltenden Proteinen darstellen, und zwar von Wachstumsfaktoren, die Serin-Threonin-Kinase-Rezeptoren (der TGFβ-Zweig dieser Überfamilie) verwenden, zu Wachstumsfaktoren, die Tyrosinkinase-Rezeptoren (die Nervenwachstumsfaktor- und Blutplättchen hergeleiteter Wachstumsfaktor-Zweige dieser Überfamilie; McDonald et al., Cell 73, 421–424 (1993)) verwenden. Die Identifizierung weiterer neuronaler und nicht neuronaler Zellen und Organe, die von GDNF anhängen, und die Entdeckung des Rezeptors und assoziierten Rezeptorsystems für GDNF, die hierin dargestellt sind, stellen das Mittel für die Modulierung und Kontrolle von Zellaktivität und Überleben bereit. Dies stellt zusätzliche und spezifische, dem Kliniker verfügbare Behandlungsverfahren bereit.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes GDNFRα-Polypeptid, das eine extrazelluläre GDNFRα-Domäne umfasst, welche die zwischen den Aminosäuren Asp25 und Gly427 von Seq.-ID Nr. 2 dargelegte Aminosäuresequenz aufweist.
Isoliertes GDNFRα-Polypeptid, das reifes GDNFRα umfasst, das die zwischen den Aminosäuren Asp25 und Ser468 von Seq.-ID Nr. 2 dargelegte Aminosäuresequenz aufweist.
Isoliertes GDNFRα-Polypeptid, das eine allelische Variante oder ein Säugetier-Homolog eines Polypeptids nach Anspruch 1 oder 2 ist.
Isoliertes GDNFRα-Polypeptid, das spezifisch GDNF bindet und für das ein Nucleinsäuremolekül kodiert, das fähig ist, bei 42°C in 20% Formamid mit einer Nucleinsäuresequenz mit zumindest 45 zusammenhängenden Basen zu hybridisieren, die für einen Abschnitt von GDNFRα mit der in Seq.-ID Nr. 1 dargelegten Nucleinsäuresequenz kodiert.
Isoliertes GDNFRα-Polypeptid, das spezifisch GDNF bindet und das ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz umfasst, die zumindest 75% Sequenzidentität mit der extrazellulären GDNFRα-Domäne aufweist, welche die zwischen den Aminosäuren Asp25 und Gly427 von Seq.-ID Nr. 2 dargelegte Aminosäuresequenz aufweist.
GDNFRα-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, das mit einem Molekül, das seine Serum-Halbwertszeit erhöht, konjugiert oder fusioniert ist.
GDNFRα-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 oder 3 bis 5, das löslich ist.
Zusammensetzung, die ein Polypeptid nach einem der vorangegangenen Ansprüche und einen physiologisch annehmbaren Träger umfasst.
Chimäres GDNFRα-Polypeptid, das ein GDNFRα-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 an ein heterologes Polypeptid fusioniert umfasst.
Chimäres GDNFRα-Polypeptid nach Anspruch 9, worin das heterologe Polypeptid eine Immunglobulinsequenz ist.
Chimäres GDNFRα-Polypeptid nach Anspruch 9, worin das heterologe Polypeptid eine Epitop-Marker-Sequenz ist.
Verfahren zum Identifizieren eines Moleküls, das sich an GDNFRα bindet, umfassend das Einwirkenlassen des Moleküls, von dem vermutet wird, dass es sich daran bindet, auf ein GDNFRα nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und das Bestimmen von Bindung des Moleküls an das GDNFRα.
Verfahren nach Anspruch 12, worin das GDNFRα lösliches GDNFRα ist.
Verfahren zum Identifizieren eines Moleküls, das GDNFRα aktiviert, umfassend das Einwirkenlassen eines Moleküls, von dem vermutet wird, dass es fähig ist, GDNFRα zu aktivieren, auf ein GDNFRα nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und das Messen der Aktivierung von GDNFRα.
Verfahren zum Reinigen eines Moleküls, das sich an GDNFRα bindet, umfassend das Adsorbieren des Moleküls an ein an einer Festphase immobilisiertes GDNFRα nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und das Gewinnen des Moleküls vom immobilisierten GDNFRα.
Verfahren nach Anspruch 15, worin das GDNFRα chimäres GNDFRα ist, das eine Fusion einer extrazellulären GDNFRα-Domänensequenz an eine Immunglobulin-Konstantdomänensequenz umfasst.
Antikörper, der sich spezifisch an eine extrazelluläre GDNFRα-Domäne bindet, welche die zwischen den Aminosäuren Asp25 und Gly427 von Seq.-ID Nr. 2 dargelegte Aminosäuresequenz aufweist.
Antikörper, der sich spezifisch an reifes GDNFRα bindet, das die zwischen den Aminosäuren Asp25 und Ser468 von Seq.-ID Nr. 2 dargelegte Aminosäuresequenz aufweist.
Antikörper nach Anspruch 17 oder 18, der ein monoklonaler Antikörper ist.
Zusammensetzung, die einen Antikörper nach einem der Ansprüche 17 bis 19 und einen physiologisch annehmbaren Träger umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 20, die weiters ein Zytokin oder einen neurotrophen Faktor umfasst.
Antikörper nach einem der Ansprüche 17 bis 19, der ein agonistischer Antikörper ist.
Agonistischer GDNFRα-Antikörper nach Anspruch 22 zur Verwendung als Medikament zur Aktivierung von GDNFRα.
In-vitro-Verfahren zum Modulieren einer physiologischen Reaktion einer Zelle auf GDNF, umfassend das Kontaktieren der Zelle mit einer Menge eines GDNFRα nach einem der Ansprüche 1 bis 7, die eine Modulierung der Reaktion der Zelle auf GDNF bewirkt.
Verfahren zum Nachweis der Gegenwart von GDNFRα, umfassend das Einwirkenlassen eines Antikörpers nach Anspruch 17 oder 18 auf eine Testprobe, von der vermutet wird, dass sie das GDNFRα enthält, und das Bestimmen von Bindung des Antikörpers an die Testprobe.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das eine Nucleinsäuresequenz umfasst, die für GDNFRα nach einem der Ansprüche 1 bis 3 kodiert.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 26, das weiters einen Promotor umfasst, der mit dem Nucleinsäuremolekül operabel verbunden ist.
Expressionsvektor, der ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 26 oder 27 operabel an Kontrollsequenzen verbunden umfasst, die von einer mit dem Vektor transformierten Wirtszelle erkannt werden.
Wirtszelle, die einen Vektor nach Anspruch 28 umfasst.
Isolierte Nucleinsäure, die eine Nucleinsäuresequenz aus zumindest 18 zusammenhängenden Nucleotiden von GDNFRα mit der in Seq.-ID Nr. 1 dargelegten Nucleinsäuresequenz umfasst.
Verfahren zur Verwendung eines Nucleinsäuremoleküls, das für GDNFRα kodiert, um die Produktion von GDNFRα zu bewirken, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle nach Anspruch 28 unter Bedingungen, welche die Expression von GDNFRα ermöglichen.
Verfahren nach Anspruch 31, das weiters das Gewinnen des GDNFRα aus der Wirtszellkultur umfasst.
Transgenes Tier, das kein Mensch ist und Zellen enthält, die ein Nucleinsäure-Transgen exprimieren, das für GDNFRα-Polypeptid kodiert.
Knockout-Tier, das kein Mensch ist und Zellen mit einem defekten GDNFRα-Gen enthält.
GDNFRα-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Verwendung in einem medizinischen Behandlungsverfahren.
Verwendung von GDNF oder eines GDNF-Agonisten zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Nierenerkrankung in Kombination mit einem GDNFRα nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
Verwendung nach Anspruch 34, worin die Nierenerkrankung mit Glomerulonephritis verbunden ist.
Verwendung von GDNF oder eines GDNF-Agonisten zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer mit dem Darmnervensystem in Zusammenhang stehenden Störung in Kombination mit einem GDNFRα nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
Verwendung nach einem der Ansprüche 35 bis 37, worin das GDNF Human-GDNF ist.