JP5406710B2 - エリスロポエチン組成物 - Google Patents

Description

本発明は分子生物学の分野に関する。特に、本発明は、所望のＮ−糖形態を有するＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）エリスロポエチンの均一組成物の製造のための物質および方法を提供する。

組換え糖タンパク質の製造はバイオテクノロジー産業の非常に活発な分野である。組換え糖タンパク質の欠点の１つは、一般に使用される細胞宿主、例えばＣＨＯ細胞により産生されるグリコシル化の不均一性である。これとは対照的に、本発明は、予め選択された所望のＮ−グリカン構造を含む組換えエリスロポエチンを産生するよう操作された下等真核宿主細胞を提供する。それから産生される組換えエリスロポエチンの組成物は、糖形態の均一性において、ＣＨＯ細胞において産生されたものより有意に優れている。

エリスロポエチンは、腎不全または化学療法による貧血を含む赤血球形成促進を要する治療適応症に広く使用されているタンパク質ホルモンである。安全で有効なエリスロポエチンに対する需要が高いため、組換えヒトエリスロポエチンは、最もよく売れている組換えヒトタンパク質製品となっている。

天然ヒトエリスロポエチンは４つの糖鎖（３つはＮ結合型、１つはＯ結合型）を含有する。該タンパク質は、最大インビボ効力のためには三分枝（ｔｒｉ−ａｎｔｅｎｎａｒｙ）および四分枝シアル酸化Ｎ−グリカンを要する。しかし、インビトロ受容体結合アッセイおよび細胞に基づくアッセイは、多分枝シアル酸化グリカンを有するエリスロポエチン、および追加的なＮ−グリコシル化部位を有するエリスロポエチンが、酵素的に脱グリコシル化されたエリスロポエチンに比べて低下した結合を示すことを明らかにしている。この逆説は、循環系からのクリアランスを考慮することにより説明されうる。四分枝シアル酸化エリスロポエチンおよびダルベポエチン（ｄａｒｂｅｐｏｅｔｉｎ）は、二分枝シアル酸化および非グリコシル化エリスロポエチンより長い血清半減期を示す（エリスロポエチンのクリアランスの主要経路は、アシアロ糖タンパク質受容体への結合、内皮細胞取り込み、およびエリスロポエチン受容体を介した標的細胞によるインターナリゼーションによる、腎濾過を介したものである）。

組換えエリスロポエチンの現在販売されている形態には、３つの四分枝Ｎ−グリカン構造を有するエポジェン（Ｅｐｏｇｅｎ）、および合計５つの四分枝Ｎ−グリカン構造を含有するよう２つの追加的なＮ−グリコシル化部位を含有するよう操作されたエリスロポエチンであるアラネスプ（Ａｒａｎｅｓｐ）が含まれる。これらの追加的なＮ−グリカン結合部位の付加は、より長い血清半減期、およびその結果として、該ホルモンのインビボ活性の増強をもたらしている。これらのエリスロポエチンはＣＨＯ細胞から産生され、Ｎ−グリカン構造の不均一混合物として分泌される。四分枝シアル酸化糖形態を富化するために、プロセス開発が行われる（図１を参照されたい）。

エリスロポエチンの特性を改善するためのこれまでの試みには、例えばグリコシル化部位を付加することによるグリコシル化を改変する試み、および該タンパク質を高分子、例えばポリエチレングリコールに結合させる試みが含まれる。例えば、ＥＰ ０６４０６１９、ＷＯ ００／３２７７２、ＷＯ ０１／０２０１７およびＷＯ ０３／０２９２９１を参照されたい。これらの試みにもかかわらず、改善された特性、例えば、より容易な投与、それほど厳密でない投与計画、改善された薬物動態およびバイオアベイラビリティ、ならびにより低い製造コストを伴う組換えエリスロポエチンが依然として必要とされている。特に、これらの性質を有するエリスロポエチンの組成物を下等真核細胞から製造するのに有用な確固たる方法および物質を得ることは、依然として、達成しがたいが望ましい目標である。

ＥＰ０６４０６１９ ＷＯ００／３２７７２ ＷＯ０１／０２０１７ ＷＯ０３／０２９２９１ ＵＳ４８３５２６０ ＷＯ９４／２５０５５ ＷＯ９４／２４１６０ ＷＯ９４／０２６１１ ＷＯ９５／０５６４５ ＵＳ５６４１６６３ ＥＰ０６４０６１９ ＵＳ２００４００１８５９０ ＵＳ７０２９８７２ ＷＯ９６／１１９５３ ＥＰ０１５４３１６ ＥＰ０４０１３８４ ＷＯ９６／１１９５３ ＷＯ９６／０５３０９ ＥＰ０３１５４５６

Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄ．，（１９８８） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９２，ａｎｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ ２００２） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０） Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００３） Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍａｎｕａｌ，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ Ｉ（１９７６） Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ ＩＩ（１９７６） Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３−９８（１９９０） Ｊ．Ｍｌｏ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２（１９９３） Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１（１９９６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９−６５６（１９９７） Ｍｏｌｅｌｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄ．（１９８９），ｐ．９．５１ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１：１１−１５（１９８９） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ．２：２８−３３（１９９２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５３−５７（１９８８） Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９９２） Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｎｏｎｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（１９９７） Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ（１９９３） Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ Ｕｓｅｒｓ Ｇｕｉｄｅ（１９９２） Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（１９８７） Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６） Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，８：３９２−３９６（１９８５） Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．２ｎｄ ｅｄ．（１９９１） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３１および２５：３６５−８９（１９９４） Ｂｌｏｏｄ（１９９３）；８２：１５０７−１６ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（１９８７）１２０５９−１２０７６ Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ−Ａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ（１９９０），ｐｐ．３０１−３２４ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ．７２（１９８６）２１３−２２４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（１９８６）３１１６ Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２６５（１９８８）３２９ Ｎａｔｕｒｅ １８５（１９６０）１０２ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９（１９７４）４２０２−４２０６ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４３（１９６８）１５５ Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２２７（１９７４）１３８５−１３８８ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．５０（１９７８）２８７−２８８ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １１６（１９８５）２２９３−２２９９ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３（１９８８）１７５１６−１７５２１ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（１９９１）２０４３４−２０４３９ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（１９９２）７７０３−７７０９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６１（１９８４）２７０８−２７１２ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９４（３）ｐ．４８１−４９４（２００６） Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ７３，８４ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．２２，１５８５（２００２） Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ ３１３，ｐ．１４４１−１４４３（２００６） Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ（１９９９）１９，６４３ ＰＮＡＳ，９７，１０５２６（２０００） ＰＮＡＳ，９９，２２５８（２００２） ＰＮＡＳ，９９，１０６５９（２００２） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５８１−５９６（１９９１） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１３，３５３−３６０（２０００） Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ３：４−１０（１９９２） Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍ．６８（１９８８）１−１８ Ｌａｅｍｍｌｉ １９７０

発明の要約
したがって、本発明は、特異的に導かれたＮ−グリコシル化を有する組換えヒトエリスロポエチンを発現しうるベクターおよび宿主細胞の製造のための方法および物質、ならびに例えばＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）により化学修飾された組換え操作糖タンパク質の組成物を提供する。

本発明は、二分枝（ｂｉ−ａｎｔｅｎｎａｒｙ）Ｎ−グリカン構造を有する完全シアル酸化組換えＥＰＯを産生しうる下等真核生物、特に、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の、操作された株を提供する。

本発明はまた、二分枝グリカンを有するＰＥＧ化ＥＰＯを提供する。これらの組換え糖タンパク質組成物は、増加した血清半減期を維持したまま、従来はインビトロで見られた増強されたインビボ生物活性を示す。

したがって、本発明は、ＰＥＧ化エリスロポエチンタンパク質の組成物（該組成物は、それに結合した少なくとも１つのＮ−結合グリカンを含む複数のＮ−結合糖形態を含む）の製造のための方法および物質を提供する。好ましい実施形態においては、該組成物は、前記の複数のＮ−結合グリカンの２５モル％より多くが、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｇａｌ_２ＮＡＮＡ_２、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｇａｌ_２、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃＧａｌＮＡＮＡ、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃＧａｌ、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃおよびＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_５からなる群から選ばれる所望のＮ−結合グリカン構造から実質的になる複数のＮ−結合グリカンを含む。

他の好ましい実施形態においては、所望のＮ−結合グリカン構造が、該Ｎ−結合グリカン構造の５０モル％より多く、７５モル％より多くまたは８０モル％より多くを構成する。

１つの好ましい実施形態においては、所望のＮ−結合グリカン構造はＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｇａｌ_２ＮＡＮＡ_２から実質的になる。

他の好ましい実施形態においては、該ＰＥＧ化エリスロポエチンタンパク質組成物は、各糖形態が、それに結合した少なくとも１つのＮ−結合グリカンを含む、複数の糖形態を含み、それにより、該糖タンパク質組成物は、前記の複数のＮ−結合グリカンの２５モル％より多くがＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｇａｌ_２ＮＡＮＡ_２から実質的になる、複数のＮ−結合グリカンを含む。

他の好ましい実施形態においては、本発明は、前記の複数のＮ−結合グリカンの５０モル％より多く、７５モル％より多くまたは８０モル％より多くがＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｇａｌ_２ＮＡＮＡ_２から実質的になる組成物を含む。

他の好ましい実施形態においては、本発明は、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｇａｌ_２ＮＡＮＡ_２ Ｎ−結合グリカンが、前記の複数のＮ−結合グリカンのうちの次に最も優勢なＮ−結合グリカン構造より約５モル％〜約８０モル％多いレベルで存在する、ＰＥＧ化エリスロポエチンの組成物を含む。

本発明のもう１つの好ましい糖形態は構造ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｇａｌ_２から実質的になる。好ましい実施形態においては、該ＰＥＧ化エリスロポエチンタンパク質組成物は、各糖形態が、それに結合した少なくとも１つのＮ−結合グリカンを含む、複数の糖形態を含み、それにより、該糖タンパク質組成物は、前記の複数のＮ−結合グリカンの２５モル％より多くがＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｇａｌ_２から実質的になる、複数のＮ−結合グリカンを含む。

他の好ましい実施形態においては、本発明は、前記の複数のＮ−結合グリカンの５０モル％より多くまたは７５モル％より多くがＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｇａｌ_２から実質的になる組成物を含む。

他の好ましい実施形態においては、本発明は、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｇａｌ_２ Ｎ−結合グリカンが、前記の複数のＮ−結合グリカンのうちの次に最も優勢なＮ−結合グリカン構造より約５モル％〜約８０モル％多いレベルで存在する、ＰＥＧ化エリスロポエチンの組成物を含む。

本発明の好ましい実施形態においては、ポリエチレングリコール部分と、エリスロポエチンタンパク質のＮ末端アミノ酸残基とは、直接的に、またはリンカーを介して連結されうる。

本発明の好ましい実施形態においては、該ポリエチレングリコール部分は、約５〜約１００ｋＤ、より好ましくは約２０ｋＤ〜約６０ｋＤの分子量、約３０ｋＤ〜約４０ｋＤの分子量を有しうる。

本発明はまた、該組換えエリスロポエチンを使用する治療方法を提供する。好ましい実施形態においては、該組換えエリスロポエチンを、貧血を改善するための治療を要するヒト患者に投与する。他の好ましい実施形態においては、腎不全、化学療法または癌により誘発された貧血に対して、該患者を治療する。

図１Ａは、主要Ｎ−グリカンが、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｇａｌ_２ＮＡＮＡ_２として表される完全シアル酸化グリカンである、ヒト組換えＥＰＯを分泌するピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ３１５９の逐次的作製を示す。 図１Ｂは、主要Ｎ−グリカンが、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｇａｌ_２ＮＡＮＡ_２として表される完全シアル酸化グリカンである、ヒト組換えＥＰＯを分泌するピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ３１５９の逐次的作製を示す。 図１Ｃは、主要Ｎ−グリカンが、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｇａｌ_２ＮＡＮＡ_２として表される完全シアル酸化グリカンである、ヒト組換えＥＰＯを分泌するピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ３１５９の逐次的作製を示す。 図１Ｄは、主要Ｎ−グリカンが、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｇａｌ_２ＮＡＮＡ_２として表される完全シアル酸化グリカンである、ヒト組換えＥＰＯを分泌するピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ３１５９の逐次的作製を示す。 図２パネルＡは、ＹＧＬＹ３１５９を作製するために使用した、図１において言及されているプラスミドベクターの地図を示す。 図２パネルＢは、ＹＧＬＹ３１５９を作製するために使用した、図１において言及されているプラスミドベクターの地図を示す。 図２パネルＣは、ＹＧＬＹ３１５９を作製するために使用した、図１において言及されているプラスミドベクターの地図を示す。 図２パネルＤは、ＹＧＬＹ３１５９を作製するために使用した、図１において言及されているプラスミドベクターの地図を示す。 図２パネルＥは、ＹＧＬＹ３１５９を作製するために使用した、図１において言及されているプラスミドベクターの地図を示す。 図２パネルＦは、ＹＧＬＹ３１５９を作製するために使用した、図１において言及されているプラスミドベクターの地図を示す。 図２パネルＧは、ＹＧＬＹ３１５９を作製するために使用した、図１において言及されているプラスミドベクターの地図を示す。 図２パネルＨは、ＹＧＬＹ３１５９を作製するために使用した、図１において言及されているプラスミドベクターの地図を示す。 図２パネルＩは、ＹＧＬＹ３１５９を作製するために使用した、図１において言及されているプラスミドベクターの地図を示す。 図２パネルＪは、ＹＧＬＹ３１５９を作製するために使用した、図１において言及されているプラスミドベクターの地図を示す。 図２パネルＫは、ＹＧＬＹ３１５９を作製するために使用した、図１において言及されているプラスミドベクターの地図を示す。 図２パネルＬは、ＹＧＬＹ３１５９を作製するために使用した、図１において言及されているプラスミドベクターの地図を示す。 図２パネルＭは、ＹＧＬＹ３１５９を作製するために使用した、図１において言及されているプラスミドベクターの地図を示す。 図２パネルＮは、ＹＧＬＹ３１５９を作製するために使用した、図１において言及されているプラスミドベクターの地図を示す。 図２パネルＯは、ＹＧＬＹ３１５９を作製するために使用した、図１において言及されているプラスミドベクターの地図を示す。 図３は、ヒトＥＰＯを精製するために用いる３段階クロマトグラフィー分離法を示す。 図４Ａは、サンプルの全体的な純度を示すパネル４Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、分解の欠如および凝集の欠如を示す均一な単一ピークを示すパネル４Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）、ＥＰＯの完全性を示すパネル４Ｃ）逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣ、ならびにＰＮＧアーゼＦで処理されたＥＰＯに関する産物の質を示すパネル４Ｄ）ＬＣ−ＭＳによる、精製ＥＰＯの特徴づけを示す。 図４Ｂは、サンプルの全体的な純度を示すパネル４Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、分解の欠如および凝集の欠如を示す均一な単一ピークを示すパネル４Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）、ＥＰＯの完全性を示すパネル４Ｃ）逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣ、ならびにＰＮＧアーゼＦで処理されたＥＰＯに関する産物の質を示すパネル４Ｄ）ＬＣ−ＭＳによる、精製ＥＰＯの特徴づけを示す。 図４Ｃは、サンプルの全体的な純度を示すパネル４Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、分解の欠如および凝集の欠如を示す均一な単一ピークを示すパネル４Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）、ＥＰＯの完全性を示すパネル４Ｃ）逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣ、ならびにＰＮＧアーゼＦで処理されたＥＰＯに関する産物の質を示すパネル４Ｄ）ＬＣ−ＭＳによる、精製ＥＰＯの特徴づけを示す。 図４Ｄは、サンプルの全体的な純度を示すパネル４Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、分解の欠如および凝集の欠如を示す均一な単一ピークを示すパネル４Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）、ＥＰＯの完全性を示すパネル４Ｃ）逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣ、ならびにＰＮＧアーゼＦで処理されたＥＰＯに関する産物の質を示すパネル４Ｄ）ＬＣ−ＭＳによる、精製ＥＰＯの特徴づけを示す。 図５は、３０ｋＤａ、４０ｋＤａもしくは６０ｋＤａの直鎖状ＰＥＧまたは４５ｋＤａの分枝状ＰＥＧに結合した精製ｈＥＰＯサンプルのＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を示す。 図６は、４つの異なるＰＥＧ化ＥＰＯ産物のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ ＨＰＬＣ）分析を示す。 図７は、ＰＮＧアーゼＦでの処理により未ＰＥＧ化ＥＰＯおよび４つの異なるＰＥＧ化ＥＰＯ産物から遊離した、２−アミノベンジジン（２−ＡＢ）で標識されたＮ−結合グリカンの高速液体クロマトグラフィーを示す。該クロマトグラムは、二シアル酸化糖形態ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｇａｌ_２ＮＡＮＡ_２が優勢であることを示している。 図８は、ＰＥＧ−ＥＰＯコンジュゲートの４つの異なる形態で注射されたマウスが、商業的に販売されているアラネスプ（Ａｒａｎｅｓｐ）との比較において、ヘマトクリットの増加を示すことを示している。Ｃ５７Ｂ６マウスに、週２回、合計５回（投与は２．５週間後に中止した）の注射を行った。該マウスから毎週採血し、ヘマトクリット値を測定した。 図９Ａは、本発明により製造されうるエリスロポエチンの好ましいＮ−結合糖形態を示す。 図９Ｂは、本発明により製造されうるエリスロポエチンの好ましいＮ−結合糖形態を示す。 図１０は、組換えヒトＥＰＯの精製方法の概要を示す。 図１１は、精製組換えヒトＥＰＯのクーマシー染色ゲルを示す。 図１２はＰＥＧ化の化学の概要を示す。Ｄｏｗ Ｐｈａｒｍａ ｗｗｗ．ｓｄａ．ｃｏｍから引用。 図１３は、マウスにおける相対的なヘマトクリットの増加に対する週１回のＰＥＧ−ＥＰＯ投与の効果を示す。

発明の詳細な説明
本明細書中で特に定められていない限り、本発明に関して用いる科学技術用語および表現は、当業者に一般に理解されている意義を有するものとする。さらに、文脈に矛盾しない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載の生化学、酵素学、分子細胞生物学、微生物、遺伝学ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションに関して用いる名称、ならびにそれらの手法は、当技術分野においてよく知られており一般に用いられているものである。一般に、本発明の方法および技術は、特に示さない限り、当技術分野でよく知られている通常の方法に従い、ならびに本明細書中に引用され記載されている種々の全般的およびより具体的な参考文献に記載されているとおりに行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２，ａｎｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ ２００２）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（２００３）；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍａｎｕａｌ，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ Ｉ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９７６）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ ＩＩ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９７６）；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９９）を参照されたい。

本明細書に記載の全ての刊行物、特許および他の参考文献の全体を、参照により本明細書に組み入れることとする。

以下の用語は、特に示さない限り、以下の意義を有すると理解されるものとする。

本明細書中で用いる「Ｎ−グリカン」および「糖形態」なる語は互換的に用いられ、Ｎ−結合オリゴ糖を意味し、例えば、ポリペプチドのアスパラギン残基にアスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合により結合しているＮ−結合オリゴ糖を意味する。Ｎ−結合糖タンパク質は、該タンパク質中のアスパラギン残基のアミド窒素に結合したＮ−アセチルグルコサミン残基を含有する。糖タンパク質上で見出される主な糖としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸（例えば、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（ＮＡＮＡ））が挙げられる。Ｎ−結合糖タンパク質の場合、糖基のプロセシングは翻訳と共に小胞体の内腔（ＥＲルーメン）で生じ、翻訳後にはゴルジ装置内で継続する。

Ｎ−グリカンはＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２の共通の五糖コアを有する（「Ｍａｎ」はマンノースを意味し、「Ｇｌｃ」はグルコースを意味し、「ＮＡｃ」はＮ−アセチルを意味し、「ＧｌｃＮＡｃ」はＮ−アセチルグルコサミンを意味する）。Ｎ−グリカンは、「トリアムノース・コア（ｔｒｉａｍｍｎｏｓｅ ｃｏｒｅ）」、「五糖コア」または「小マンノース（ｐａｕｃｉｍａｎｎｏｓｅ）コア」とも称されるＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２（「Ｍａｎ３」）コア構造に付加される末梢糖（例えば、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、フコースおよびシアル酸）を構成する分枝の数に関して異なる。Ｎ−グリカンは、それらの分枝構成成分に従い分類される（例えば、高マンノース、複合またはハイブリッド）。「高マンノース」型Ｎ−グリカンは５つ以上のマンノース残基を有する。「複合」型Ｎ−グリカンは、典型的には、１，３マンノース・アームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ、および「トリマンノース」コアの１，６マンノース・アームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを有する。複合Ｎ−グリカンはまた、ガラクトース（「Ｇａｌ」）またはＮ−アセチルガラクトサミン（「ＧａｌＮＡｃ」）残基を有することが可能であり、該残基は、場合によっては、シアル酸または誘導体（例えば、「ＮＡＮＡ」または「ＮｅｕＡｃ」；ここで、「Ｎｅｕ」はノイラミン酸を意味し、「Ａｃ」はアセチルを意味する）で修飾されうる。複合Ｎ−グリカンはまた、コア・フコース（「Ｆｕｃ」）および「二分岐（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）」ＧｌｃＮＡｃを含む鎖内置換基を有しうる。複合Ｎ−グリカンはまた、「トリマンノース・コア」上に複数の分枝を有することが可能であり、これは、しばしば、「多分枝グリカン」と称される。「ハイブリッド」Ｎ−グリカンは、トリマンノース・コアの１，３マンノース・アームの末端上に少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを、そしてトリマンノース・コアの１，６マンノース・アーム上に０個以上のマンノースを有する。これらの種々のＮ−グリカンは「糖形態（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）」とも称される。

本明細書中で用いる略語は、当技術分野で一般に用いられているものである。例えば、前記の糖の略語を参照されたい。他の一般的な略語には、「ＰＮＧアーゼ」または「グリカナーゼ」または「グルコシダーゼ」が含まれ、これらは全て、ペプチドであるＮ−グリコシダーゼＦ（ＥＣ３．２．２．１８）を意味する。

「単離」、「精製」または「実質的に精製」された核酸またはポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは混合重合体）は、その天然宿主細胞において天然ポリヌクレオチドに天然で付随する他の細胞成分（例えば、天然でそれに付随するリボソーム、ポリメラーゼおよびゲノム配列）から実質的に分離されているものである。この用語は、（１）その天然に存在する環境から取り出された、あるいは（２）「単離（された）ポリヌクレオチド」が天然で見出されるポリヌクレオチドの全部または一部に付随しない、あるいは（３）天然ではそれに結合していないポリヌクレオチドに機能的に連結されている、あるいは（４）天然で見出されない核酸またはポリヌクレオチドを包含する。「単離（された）」、精製（された）または「実質的に精製（された）」は、組換え若しくはクローン化ＤＮＡ単離物、化学合成ポリヌクレオチド類似体、または異種系により生物学的に合成されたポリヌクレオチド類似体に関しても用いられうる。

しかし、「単離（された）」は、そのように示されている核酸またはポリヌクレオチド自体がその天然環境から物理的に取り出されていることを必ずしも要しない。例えば、生物のゲノム内の内因性核酸配列は、該内因性核酸配列に隣接して異種配列が配置されていて、この内因性核酸配列の発現が改変される場合、該内因性核酸配列は本発明においては「単離」されているとみなされる。この場合、該異種配列自体が内因性である（同じ宿主細胞またはその後代に由来する）か外因性である（異なる宿主細胞またはその後代に由来する）かにかかわらず、該異種配列は、該内因性核酸配列に天然で隣接しない配列である。例えば、宿主細胞のゲノム内の遺伝子の天然プロモーターを（例えば、相同組換えにより）プロモーター配列で置換して、この遺伝子が、改変された発現パターンを有するようにすることが可能である。そうなれば、この遺伝子は、天然でそれに隣接する配列の少なくとも一部から分離されているため、「単離」されたものとなるであろう。

核酸は、それが、ゲノム内の対応核酸において天然で見出されないいずれかの修飾を含有する場合にも、「単離」されているとみなされる。例えば、内因性コード配列は、それが、人工的に（例えば、人的介入により）導入された挿入、欠失または点突然変異を含有する場合、「単離」されているとみなされる。「単離（された）核酸」には、宿主細胞染色体内に非相同部位において組込まれた核酸、およびエピソームとして存在する核酸構築物も含まれる。さらに、「単離（された）核酸」は、他の細胞物質を実質的に含有しないもの、あるいは組換え技術により製造された場合には培地を実質的に含有しないもの、あるいは化学合成された場合には化学前駆体または他の化学物質を実質的に含有しないものでありうる。

本明細書中で用いる、核酸配列に関する「縮重変異体」なる語は、参照核酸配列から翻訳されたものと同じアミノ酸配列を与えるよう遺伝暗号に従い翻訳されうる核酸配列を包含する。「縮重オリゴヌクレオチド」または「縮重プライマー」なる語は、配列においては必ずしも同一ではないが１以上の特定の断片内では互いに相同である標的核酸配列にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドを意味するものとして用いられる。

核酸配列の場合の「配列同一性」または「同一」なる語は、最大の一致が得られるよう整列させた場合に同一である、２つの配列における残基を意味する。配列同一性比較のための長さは、少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約２０ヌクレオチド、より通常は少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６ヌクレオチド以上の伸長にわたるものでありうる。ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用されうる、当技術分野で公知の多種多様なアルゴリズムが存在する。例えば、ポリヌクレオチド配列は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷｉｓｃｏｎｓｉｎにおけるプログラムであるＦＡＳＴＡ、ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔを用いて比較されうる。ＦＡＳＴＡは、問合せ配列と検索配列との間の最良の重なり（オーバーラップ）の領域のアライメントおよび配列同一性（％）を与える（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３−９８（１９９０）（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする））。例えば、核酸配列間の配列同一性（％）は、ＦＡＳＴＡをそのデフォルトパラメーター（６のワード・サイズおよびスコアリング・マトリックスのためのＮＯＰＡＭ因子）と共に用いて、あるいはＧａｐをそのデフォルトパラメーター（参照により本明細書に組み入れるＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１において提供されるもの）と共に用いて決定されうる。あるいは、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）；ＧｉｓｈおよびＳｔａｔｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２（１９９３）；Ｍａｄｄｅｎら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１（１９９６）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７）；ＺｈａｎｇおよびＭａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９−６５６（１９９７））、特にｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））を使用して、配列が比較されうる。

核酸またはその断片に関する「実質的な相同性」または「実質的な類似性」なる語は、適当なヌクレオチド挿入または欠失を伴って別の核酸（またはその相補鎖）に対して最適に整列された場合、いずれかのよく知られた配列同一性アルゴリズム（例えば、前記のＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐ）による測定でヌクレオチド塩基の少なくとも約５０％、より好ましくは６０％、通常は該ヌクレオチド塩基の少なくとも約７０％、より通常は少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％においてヌクレオチド配列同一性が存在することを示す。

あるいは、実質的な相同性または類似性は、核酸またはその断片が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、別の核酸、別の核酸の鎖、またはその相補鎖にハイブリダイズする場合に存在する。核酸ハイブリダイゼーション実験の場合の「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントな洗浄条件」は多数の異なる物理的パラメーターに左右される。当業者により容易に理解されるとおり、核酸のハイブリダイゼーションは、塩の濃度、温度、溶媒、ハイブリダイズする種の塩基組成、相補領域の長さ、およびハイブリダイズする核酸の間のヌクレオチド塩基のミスマッチの数のような条件に影響される。ハイブリダイゼーションの特定のストリンジェンシーを得るためにこれらのパラメーターを変化させる方法は当業者に公知である。

一般に、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、特定の組合せの条件下、特定のＤＮＡハイブリッドに関して、熱融解温度（Ｔ_ｍ）より約２５℃低い温度で行われる。「ストリンジェントな洗浄」は、特定の組合せの条件下、特定のＤＮＡハイブリッドに関して、Ｔ_ｍより約５℃低い温度で行われる。Ｔ_ｍは、完全に一致（マッチ）したプローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），ｐ．９．５１（これを参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。本発明の目的においては、「ストリンジェントな条件」は、液相ハイブリダイゼーションに関しては、６×ＳＳＣ（ここで、２０×ＳＳＣは３．０Ｍ ＮａＣｌおよび０．３Ｍ クエン酸ナトリウムを含有する）、１％ ＳＤＳ中、６５℃で８〜１２時間の水性ハイブリダイゼーション（すなわち、ホルムアミド非含有）、ならびにそれに続く、０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中、６５℃での２０分間の２回の洗浄と定義される。６５℃でのハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズしている配列の長さ及び同一性の割合を含む多数の要因に応じて様々な速度で生じる、と当業者に理解される。

核酸配列に関して用いる「突然変異（している）」なる語は、核酸配列内のヌクレオチドが、参照核酸配列と比較して挿入、欠失または変化を伴うことを意味する。単一の改変が遺伝子座において施されることが可能であり（点突然変異）、あるいは、複数のヌクレオチドが単一の遺伝子座において挿入、欠失または変化に付されることが可能である。また、１以上の改変が核酸配列内の多数の遺伝子座において施されうる。核酸配列は、「変異導入型ＰＣＲ」（ＰＣＲ産物の全長に沿って高率の点突然変異が得られるようＤＮＡポリメラーゼの複製忠実度が低い条件下でＰＣＲを行う方法；例えば、Ｌｅｕｎｇら，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１：１１−１５（１９８９）およびＣａｌｄｗｅｌｌおよびＪｏｙｃｅ，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ．２：２８−３３（１９９２）を参照されたい）および「オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発」（関心のある任意のクローン化ＤＮＡ断片における部位特異的突然変異の生成を可能にする方法；例えば、Ｒｅｉｄｈａａｒ−ＯｌｓｏｎおよびＳａｕｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５３−５７（１９８８）を参照されたい）のような突然変異誘発技術を含む（これらに限定されるものではない）当技術分野で公知任意の方法により突然変異されうる。

本明細書中で用いる「ベクター」なる語は、それに連結された別の核酸を宿主細胞内に運搬しうる核酸分子を意味すると意図される。１つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは、追加的なＤＮＡ断片が連結されうる環状二本鎖ＤＮＡループを意味する。他のベクターには、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）および酵母人工染色体（ＹＡＣ）が含まれる。もう１つのタイプのベクターは、追加的なＤＮＡ断片がウイルスゲノム内に連結されうるウイルスベクターである（後記において更に詳しく説明する）。あるベクターは、それが導入される宿主細胞内で自律複製することが可能である（例えば、該宿主細胞内で機能する複製起点を有するベクター）。他のベクターは宿主細胞内への導入の際に宿主細胞のゲノム内に組込まれることが可能であり、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある好ましいベクターは、それが機能的に連結されている遺伝子の発現を導きうる。そのようなベクターは本明細書中では「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と称される。

本明細書中で用いる「関心のある配列」または「関心のある遺伝子」なる語は、典型的には、宿主細胞内で通常は発現されない関心のあるタンパク質または関心のあるポリペプチドをコードする核酸配列を意味する。関心のある配列または遺伝子には、宿主細胞に対して異種である遺伝子および配列が含まれる。関心のあるタンパク質およびポリペプチドも、しばしば、宿主細胞に対して異種である。本明細書に開示されている方法は、１以上の関心のある配列または関心のある遺伝子が宿主ゲノム内に安定に組込まれることを可能にする。関心のある配列の非限定的な具体例には、酵素活性を有する１以上の関心のあるポリペプチド、例えば、宿主におけるＮ−グリカン合成に影響を及ぼす酵素、例えばマンノシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーター、ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼをコードする配列が含まれる。

「マーカー配列」または「マーカー遺伝子」なる語は、宿主細胞内の配列の存在または非存在に関する正または負の選択を可能にする活性を発現しうる核酸配列を意味する。例えば、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子はマーカー遺伝子である。なぜなら、該遺伝子を含有する細胞がウラシルの非存在下で増殖しうることにより、その存在が選択されうるからである。その存在は、該遺伝子を含有する細胞が５−ＦＯＡの存在下で増殖し得ないことによっても選択されうる。マーカー配列または遺伝子は、正および負の選択性を示すことを必ずしも要しない。ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）由来のマーカー配列または遺伝子の非限定的な具体例には、ＡＤＥ１、ＡＲＧ４、ＨＩＳ４およびＵＲＡ３が含まれる。抗生物質耐性マーカー遺伝子の場合、カナマイシン、ネオマイシン、ゲネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（またはＧ４１８）、パロモマイシンおよびヒグロマイシン耐性遺伝子が、これらの抗生物質の存在下での増殖を可能にするために一般に使用される。

「機能的に連結」された発現制御配列は、該発現制御配列が、関心のある遺伝子を制御するよう、関心のある遺伝子に隣接して連結されていること、ならびに発現制御配列が、関心のある遺伝子を制御するよう、トランスで又は或る距離を隔てて作用することを意味する。

本明細書中で用いる「発現制御配列」なる語は、それが機能的に連結されているコード配列の発現に影響を及ぼすポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列は、核酸配列の転写、転写後事象および翻訳を制御する配列である。発現制御配列には、適当な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセッシングシグナル、例えばスプライシングおよびポリアデニル化シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増強する配列（例えば、リボソーム結合部位）；タンパク質安定性を増強する配列；ならびに望ましい場合には、タンパク質分泌を促進する配列が含まれる。そのような制御配列の性質は宿主生物によって異なり、原核生物においては、そのような制御配列には、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位および転写終結配列が含まれる。「制御配列」なる語は、少なくとも、発現のために存在が必須である全ての成分を含むと意図され、存在することが有利である追加的な成分、例えばリーダー配列および融合相手の配列をも含みうる。

本明細書中で用いる「組換え宿主細胞」（「発現宿主細胞」、「発現宿主系」、「発現系」または単に「宿主細胞」）なる語は、組換えベクターが導入された細胞を意味すると意図される。そのような用語は、その特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の後代をも意味すると意図されると理解されるべきである。突然変異または環境の影響により、後の世代において、ある修飾が生じうるため、そのような後代は実際には親細胞と同一でない可能性があるが、本明細書中で用いる「宿主細胞」なる語の範囲内に尚も含まれる。組換え宿主細胞は、培養内で増殖した単離された細胞または細胞系であることが可能であり、あるいは、生きた組織または生物に存在する細胞でありうる。好ましい宿主細胞は酵母および真菌である。

「真核生物」なる語は有核細胞または生物を意味し、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類細胞、動物細胞および下等真核細胞を意味する。

「下等真核細胞」なる語は、酵母、真菌、カラー（ｃｏｌｌａｒ）有鞭毛類、微胞子虫類、胞状虫類（ａｌｖｅｏｌａｔｅ）（例えば、渦鞭毛虫類）、ストラメノピル（ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅ）（例えば、褐藻類、原虫類）、紅色植物（例えば、紅藻類）、植物（例えば、緑藻類、植物細胞、コケ）および他の原生生物を含む。

「酵母」および「真菌」なる語は、限定的なものではないが、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・テルモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スチプティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クライベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルックノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）を含む。

本明細書中で用いる「ペプチド」なる語は、短いポリペプチド、例えば、典型的には約５０アミノ酸長未満、より典型的には約３０アミノ酸長未満のポリペプチドを意味する。当業者は、構造的機能、ひいては生物学的機能を模倣した誘導体、突然変異体、類似体および模倣体を製造することが可能である。

「ポリペプチド」なる語は、天然で生じるタンパク質および非天然に生じるタンパク質の両方ならびにそれらの断片を含む。ポリペプチドは単量体または重合体でありうる。さらに、ポリペプチドは、１以上の異なる活性をそれぞれが有する多数の異なるドメインを含みうる。当業者はポリペプチドの突然変異体、誘導体および類似体を製造または単離することが可能である。

「精製」または「単離」されたタンパク質またはポリペプチドなる語は、その由来または誘導の起源に基づいて、（１）その天然状態でそれに付随する天然で結合している成分に結合していない、または（２）天然で見出されない純度（純度は他の細胞物質の存在に関して判断されうる）で存在する（例えば、同一種の他のタンパク質を含有しない）、または（３）異なる種の細胞により発現される、または（４）天然に存在しない（例えば、それは、天然で見出されるポリペプチドの断片であるか、あるいはそれは、天然で見出されないアミノ酸類似体もしくは誘導体、または標準的なペプチド結合以外の連結を含む）タンパク質またはポリペプチドを意味する。したがって、化学合成されたポリペプチド、または天然における産生由来細胞とは異なる細胞系内で合成されたポリペプチドは、その天然で付随する成分から「単離」されている。ポリペプチドまたはタンパク質は、当技術分野でよく知られたタンパク質精製技術を用いる単離により、天然で付随する成分を実質的に含有しないものにされることが可能であり、あるいは該成分から精製されることが可能である。このような定義においては、「単離」は、そのように示されているタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはオリゴペプチドがその天然環境から物理的に取り出されていることを必ずしも要さない。

本明細書中で用いる「ポリペプチド断片」なる語は、完全長ポリペプチドと比較した場合に、欠失、例えばアミノ末端および／またはカルボキシ末端欠失を有するポリペプチドを意味する。好ましい実施形態においては、ポリペプチド断片は、該断片のアミノ酸配列が、天然に存在する配列における対応位置と同一である、連続配列である。断片は、典型的には、少なくとも５、６、７、８、９または１０アミノ酸長、好ましくは少なくとも１２、１４、１６または１８アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２５，３０、３５、４０または４５アミノ酸長、より一層好ましくは少なくとも５０または６０アミノ酸長、より一層好ましくは少なくとも７０アミノ酸長である。

「修飾誘導体」は、一次構造配列において実質的に相同であるが例えばインビボもしくはインビトロの化学的および生化学的修飾を含むか又は天然ポリペプチドにおいて見出されないアミノ酸を含むポリペプチドまたはその断片を意味する。当業者に容易に理解されるとおり、そのような修飾には、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、標識（例えば、放射性核種での標識）、および種々の酵素標識が含まれる。ポリペプチド標識するための種々の方法、およびそのような目的に有用な種々の置換基または標識が、当技術分野でよく知られており、それらには、放射性同位元素、例えば^１２５Ｉ、^３２Ｐ、^３５Ｓおよび^３Ｈ、標識された抗リガンド（例えば、抗体）に結合するリガンド、発蛍光団、化学発光物質、酵素、ならびに標識リガンドに対する特異的結合ペアメンバーとして働きうる抗リガンドが含まれる。標識の選択は、要求される感度、プライマーとの結合の容易さ、安定性要件、および利用可能な装置に左右される。ポリペプチドを標識するための方法は当技術分野でよく知られている。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２，およびＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ ２００２）（これを参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。「融合タンパク質」なる語は、異種アミノ酸配列に結合したポリペプチドまたは断片を含むポリペプチドを意味する。融合タンパク質は、２以上の異なるタンパク質からの２以上の所望の機能要素を含有するよう構築されうるため、有用である。融合タンパク質は、ポリペプチドからの少なくとも１０個の連続的アミノ酸、好ましくは少なくとも２０または３０アミノ酸、より好ましくは少なくとも４０、５０または６０アミノ酸、そしてしばしば、より好ましくは少なくとも７５、１００または１２５アミノ酸を含む。関心のあるタンパク質の全体を含む融合体が特に有用である。融合タンパク質内に含まれる異種ポリペプチドは少なくとも６アミノ酸長、しばしば、少なくとも８アミノ酸長、有用なものとしては、少なくとも１５、２０および２５アミノ酸長である。融合体は、より大きなポリペプチド、または更にはタンパク質全体、例えば緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）、特定の有用性を有する発色団含有タンパク質をも含む。融合タンパク質は、異なるタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列とインフレームでポリペプチドまたはその断片をコードする核酸配列を構築し、該融合タンパク質を発現させることにより、組換え的に製造されうる。あるいは、融合タンパク質は、ポリペプチドまたはその断片を別のタンパク質に架橋することにより、化学的に製造されうる。

「非ペプチド類似体」なる語は、参照ポリペプチドのものに類似した特性を有する化合物を意味する。非ペプチド化合物は「ペプチド模倣体」または「ペプチドミメティック」とも称されうる。例えば、Ｊｏｎｅｓ，Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）；Ｊｕｎｇ，Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｎｏｎｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ（１９９７）；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙら，Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９３）；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ Ｕｓｅｒｓ Ｇｕｉｄｅ，（Ｇｒａｎｔ編，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，１９９２）；Ｅｖａｎｓら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（１９８７）；Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６）；ＶｅｂｅｒおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，８：３９２−３９６（１９８５）；および前記のもののそれぞれにおいて引用されている参考文献（それらを参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。そのような化合物は、しばしば、コンピューター化分子モデリングの補助により開発される。本発明の有用なペプチドに構造的に類似したペプチド模倣体は、同等の効果をもたらすよう使用されることが可能であり、したがって、本発明の一部であると想定される。

アミノ酸置換には、（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させるもの、（２）酸化に対する感受性を低下させるもの、（３）タンパク質複合体を形成するための結合アフィニティーを改変するもの、（４）結合アフィニティーまたは酵素活性を改変するもの、および（５）そのような類似体の他の物理化学的または機能的特性を付与または修飾するものが含まれうる。

本明細書中で用いる、２０種の通常のアミノ酸およびそれらの略語は、通常の用法に準拠している。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＧｏｌｕｂおよびＧｒｅｎ編，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．，２^ｎｄｅｄ．１９９１）（これを参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。２０種の通常のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、非天然アミノ酸、例えばα−，α−ジ置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸および他の通常でないアミノ酸も、本発明のポリペプチドのための適当な成分でありうる。通常でないアミノ酸の具体例には、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタマート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、Ｎ−メチルアルギニンならびに他の類似アミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が含まれる。本明細書中で用いるポリペプチド表記においては、標準的な用法および慣例に従い、左側の末端はアミノ末端に対応し、右側の末端はカルボキシ末端に対応する。

タンパク質をコードする核酸配列が、第２のタンパク質をコードする核酸配列に類似した配列を有する場合、該タンパク質は第２のタンパク質に対して「相同性」を有する又は「相同」である。あるいは、それら２つのタンパク質が「類似」アミノ酸配列を有する場合、該タンパク質は第２のタンパク質に対して相同性を有する（したがって、「相同タンパク質」なる語は、それらの２つのタンパク質が類似アミノ酸配列を有することを意味すると定義される）。好ましい実施形態においては、相同タンパク質は、野生型タンパク質に対して少なくとも６５％の配列相同性、より好ましくは少なくとも７０％の配列相同性を示すものである。より一層好ましいのは、野生型タンパク質に対して少なくとも７５％、８０％、８５％または９０％の配列相同性を示す相同タンパク質である。最も好ましい実施形態においては、相同タンパク質は少なくとも９５％、９８％、９９％または９９．９％の配列同一性を示す。本明細書中で用いる、アミノ酸配列の２つの領域の間の相同性（特に推定構造類似性に関するもの）は機能における類似性を示唆するものと解釈される。

タンパク質またはペプチドに関して「相同」が用いられている場合、同一ではない残基位置は、しばしば、保存的アミノ酸置換によって異なっていると認識される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似した化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基により置換されているアミノ酸置換である。一般に、保存的アミノ酸置換はタンパク質の機能特性を実質的に変化させない。２以上のアミノ酸配列が保存的置換により互いに異なる場合、配列同一性（％）または相同性の度合は、該置換の保存的性質に関して補正するために上方修正されうる。この修正を行うための手段は当業者によく知られている。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９４，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３１および２５：３６５−８９（これを参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。

以下の６つのグループのそれぞれは、互いに保存的に置換される複数のアミノ酸を含む：１）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。

ポリペプチドの配列相同性（これは配列同一性とも称される）は、典型的には、配列解析ソフトウェアを使用して測定される。例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ，９１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ５３７０５を参照されたい。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む種々の置換、欠失および他の修飾に割り当てられた相同性の尺度を用いて、類似配列をマッチ（一致）させる。例えば、ＧＣＧは、密接に関連したポリペプチド（例えば、生物の異なる種からの相同ポリペプチド）の間または野生型タンパク質とその突然変異タンパク質との間の配列相同性または配列同一性を決定するためにデフォルトパラメーターで使用されうる「Ｇａｐ」および「Ｂｅｓｔｆｉｔ」のようなプログラムを含有する。例えば、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１を参照されたい。

特定のポリペプチド配列を、種々の生物からの多数の配列を含有するデータベースと比較する場合の好ましいアルゴリズムとしては、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）；ＧｉｓｈおよびＳｔａｔｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２（１９９３）；Ｍａｄｄｅｎら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１（１９９６）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７）；ＺｈａｎｇおよびＭａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９−６５６（１９９７））、特にｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））が挙げられる。

ＢＬＡＳＴｐのための好ましいパラメーターは以下のとおりである：期待値：１０（デフォルト）；フィルター：ｓｅｇ（デフォルト）；ギャップを開くためのコスト（Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ａ ｇａｐ）：１１（デフォルト）；ギャップを伸長させるためのコスト（Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ａ ｇａｐ）：１（デフォルト）；最大アライメント：１００（デフォルト）；ワード・サイズ（Ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ）：１１（デフォルト）；記述数（Ｎｏ．ｏｆ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）：１００（デフォルト）；ペナルティ・マトリックス（Ｐｅｎａｌｔｙ Ｍａｔｒｉｘ）：ＢＬＯＷＳＵＭ６２。

相同性に関して比較されるポリペプチド配列の長さは、一般には少なくとも約１６アミノ酸残基、通常は少なくとも約２０残基、より通常は少なくとも約２４残基、典型的には少なくとも約２８残基、好ましくは約３５残基より多い。多数の異なる生物からの配列を含有するデータベースを検索する場合、アミノ酸配列を比較することが好ましい。アミノ酸配列を使用するデータベース検索は、当技術分野で公知のｂｌａｓｔｐ以外のアルゴリズムにより測定されうる。例えば、ポリペプチド配列は、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１におけるプログラムであるＦＡＳＴＡを使用して比較されうる。ＦＡＳＴＡは、問合せ配列と検索配列との間の最良の重なり（オーバーラップ）の領域のアライメントおよび配列同一性（％）を与える（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３−９８（１９９０）（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする））。例えば、アミノ酸配列間の配列同一性（％）は、ＦＡＳＴＡを、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１（それを参照により本明細書に組み入れることとする）において提供されるそのデフォルトパラメーター（２のワード・サイズおよびＰＡＭ２５０スコアリング・マトリックス）と共に用いて決定されうる。

本明細書中で用いる「領域」なる語は、生体分子の一次構造の物理的に連続した部分を意味する。タンパク質の場合、領域は、そのタンパク質のアミノ酸配列の連続的部分により定められる。

本明細書中で用いる「ドメイン」なる語は、生体分子の公知または推定機能に寄与する生体分子の構造を意味する。ドメインは、領域またはその一部と同じ広がりを有しうる。ドメインは、生体分子の特徴的な不連続的領域をも含みうる。

本明細書中で用いる「分子」なる語は、小分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、核酸、脂質などを含む（これらに限定されるものではない）任意の化合物を意味し、そのような化合物は天然物または合成物でありうる。

本明細書中で用いる「含む」なる語、またはその派生語、例えば「含んでなる」もしくは「含み」は、示されている整数または整数群の包含を示唆するが、いずれの他の整数または整数群の排除をも示唆するものではないと理解される。

糖タンパク質の調製物中に存在するグリカンの「モル％（モル百分率）」に言及する場合、この用語は、該タンパク質調製物をＰＮＧアーゼで処理し、ついで、糖形態組成物により影響されない方法（例えば、ＰＮＧアーゼにより遊離したグリカンプールを２−アミノベンズアミドのような蛍光タグで標識し、ついで高速液体クロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動により分離し、ついで蛍光強度によりグリカンを定量すること）により定量した場合に遊離したＮ−結合オリゴ糖のプール内に存在する特定のグリカンのモル％を意味する。例えば、５０モル％のＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｇａｌ_２ＮＡＮＡ_２は、遊離したグリカンの５０％がＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｇａｌ_２ＮＡＮＡ_２であり、残りの５０％が他のＮ−結合オリゴ糖から構成されることを意味する。いくつかの実施形態においては、糖タンパク質の調製物中の特定のグリカンのモル％は２０％〜１００％、好ましくは２５％より多く、３０％より多く、３５％より多く、４０％より多くまたは４５％より多く、より好ましくは５０％より多く、５５％より多く、６０％より多く、６５％より多くまたは７０％より多く、最も好ましくは７５％より多く、８０％より多く、８５％より多く、９０％より多くまたは９５％より多い。

本明細書中で用いる「優勢に」なる語、またはその派生語、例えば「優勢」または「優勢である」は、糖タンパク質をＰＮＧアーゼで処理し、遊離したグリカンを質量分析、例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析した後で全Ｎ−グリカンの最高モル百分率（％）を有するグリカン種に関して用いられると理解される。言い換えると、「優勢」なる語は、個々の実体、例えば特定の糖形態が、他のいずれの個々の実体より大きなモル％で存在することと定義される。例えば、ある組成物が、４０モル％の種Ａ、３５モル％の種Ｂおよび２５モル％の種Ｃからなる場合、該組成物は種Ａを優勢に含む。

「治療的有効量」なる語は、患者に利益をもたらすヘマトクリットの上昇をもたらす本発明の組換えエリスロポエチンの量を意味する。該量は個体によって異なり、患者の全般的身体状態および貧血の根本原因を含む多数の要因に左右される。例えば、慢性腎不全に罹患している患者に対する本発明のエリスロポエチンの治療的有効量は、治療適応に基づいて、２０〜３００単位／ｋｇまたは０．５ｕｇ／ｋｇ〜５００ｕｇ／ｋｇの範囲でありうる。「単位」なる語は、エリスロポエチン組成物の活性を評価するための、当技術分野において一般に公知の単位を意味する。純粋なエリスロポエチンの１ミリグラムは１５０，０００単位とほぼ同等である。投与計画は、毎週約３回から、４週間または６週間に約１回でありうる。実際の計画は、患者に投与するエリスロポエチンのタイプ（ＥＰＯまたはＰＥＧ化ＥＰＯ）および個々の患者の応答を含む多数の要因に左右される。より高い用量範囲は、典型的には、貧血用途には用いられないが、他の治療用途には有用でありうる。患者に対するエリスロポエチンの適当な用量を達成し確立するための手段は当技術分野でよく知られており、一般に実施されている。

患者ごとの投与量および投与計画における変動は、量または計画に関して「約」なる語を用いて示される。治療に使用するエリスロポエチンの量は、許容されうる率のヘマトクリット上昇をもたらし、ヘマトクリットを有益なレベル（例えば、通常は少なくとも約３０％、典型的には３０％〜３６％の範囲）に維持する。本組成物の治療的有効量は、公に入手・利用可能な材料および方法を用いて当業者により容易に確認されうる。また、治療中のエリスロポエチンの上昇を維持するために、患者に鉄が投与されうる。投与すべき量は、当業者により一般に用いられる方法により容易に決定されうる。

したがって、本発明のエリスロポエチンは、赤血球産生を促進し赤血球レベルの低下を矯正するために使用されうる。エリスロポエチンの最も一般的な治療用途は、貧血により減少した赤血球レベルを矯正することである。本発明により治療可能な状態には、腎機能の低下または喪失（慢性腎不全）に関連した貧血、骨髄抑制療法、例えば化学療法剤または抗ウイルス薬（例えば、ＡＺＴ）に関連した貧血、非骨髄性癌の進行に関連した貧血、およびウイルス感染（例えば、ＨＩＶ）に関連した貧血が含まれる。また、本発明のエリスロポエチンは、脊髄損傷の治療における、うっ血性心不全、卒中後のニューロン損傷（特に非シアル酸化エポ）の予防または軽減、すなわち、抗炎症、抗アポトーシス、および赤血球産生とは別の幹細胞のリクルートメントのために使用されうる。また、その他の点では健康な個体において貧血を招きうる状態、例えば、手術中の予想される失血も治療可能である。一般に、エリスロポエチンで一般に治療可能な任意の状態が本発明のエリスロポエチンで治療されうる。

Ｉ．グリコシル化
本発明は、優勢種として特定の望ましいＮ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するよう遺伝的に操作された下等真核宿主細胞における組換えタンパク質、特にエリスロポエチンの形質転換、発現および選択のための方法および物質を提供する。ある実施形態においては、該真核宿主細胞は、優勢種として特定の望ましいＮ−グリカンを有するエリスロポエチンまたはエリスロポエチンの変異体を産生するよう遺伝的に操作されている。好ましい実施形態においては、優勢なＮ−グリカンは、哺乳類、特にヒトに対して免疫原性ではないもの、または高マンノシル化糖タンパク質の場合と比較して低下した免疫原性を有するものである。典型的なグリコシル化パターンを図９Ａ〜９Ｂに示す。

特定の好ましい実施形態においては、優勢なＮ−グリカンは、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｇａｌ_２ＮＡＮＡ_２として表される完全シアル酸化グリカンである。他の好ましい実施形態においては、優勢なＮ−グリカンは、部分シアル酸化または非シアル酸化グリカン；完全ガラクトシル化、部分ガラクトシル化または非ガラクトシル化グリカンでありうる。したがって、好ましい実施形態には、優勢なＮ−グリカンがＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｇａｌ_２ＮＡＮＡ、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２ＧａｌＮＡＮＡ、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｇａｌ_２、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃＧａｌ、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃｒまたはＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３であるものが含まれる。他の好ましい実施形態においては、優勢なＮ−グリカンは、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｇａｌ_ｎ（ここで、ｎは１または２でありうる）として表される部分ガラクトシル化グリカンである。

本発明の他の実施形態においては、優勢なＮ−グリカンは、式：ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_{（４−５）}ＧｌｃＮＡｃ_{（０−１）}Ｇａｌ_{（０−１）}ＮＡＮＡ_{（０−１）}により表されるハイブリッド糖形態でありうる。好ましい実施形態には、優勢なＮ−グリカンがＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃＧａｌＮＡＮＡ、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃＧａｌ、およびＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃおよびＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_５であるものが含まれる。

酵母および真菌、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）を含む多数の野生型下等真核細胞は、いずれのコア・フコースをも伴わずに糖タンパク質を産生する。したがって、前記実施形態において、本発明により製造される組換え糖タンパク質はフコースを欠くことが可能であり、あるいはフコースを実質的に含有しないことが可能である。あるいは、ある実施形態においては、該組換え下等真核宿主細胞は、優勢なＮ−グリカン種がフコシル化されている組換え糖タンパク質組成物の産生をもたらすよう、フコシル化経路を含むよう遺伝的に修飾されうる。特に示さない限り、本発明の糖タンパク質組成物は、非フコシル化形態で、またはコアフコシル化の存在を伴って製造されうる。

本発明においては、前記の説明に従い製造された組換え糖タンパク質を次いで、その物理的特性、特に血清半減期および薬物動態を改善するために化学修飾する。好ましい実施形態においては、該化学修飾は、１以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を該組換え糖タンパク質に連結してＰＥＧ化糖タンパク質を得ることにより達成される。ある実施形態においては、該組換え糖タンパク質は、１以上のＰＥＧ部分を該組換え糖タンパク質のＮ末端アミノ酸に連結してＮ末端ＰＥＧ化糖タンパク質を得ることにより修飾される。

ＩＩ．エリスロポエチン
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、後期赤芽球前駆細胞の分化を刺激して赤血球を成熟させる、腎臓において産生される造血糖タンパク質である。エリスロポエチンは、赤芽球前駆体上の受容体に結合することにより、その生物活性を発現する。エリスロポエチン遺伝子はヒトに特有のものではない。多数の哺乳動物を含む他の種においても、類似遺伝子が見出されている（Ｗｅｎら，Ｂｌｏｏｄ（１９９３）；８２：１５０７−１６を参照されたい）。したがって、本明細書に記載されているとおりに、ヒトおよび非ヒトの両方の遺伝子が発現されることが可能であり、それらの様々なエリスロポエチンも本発明の方法において有用でありうる。

天然に存在するヒトエリスロポエチンはまず、１６６位にアルギニンを有する１６６アミノ酸含有ポリペプチド鎖に翻訳される。翻訳後修飾において、アルギニン１６６がカルボキシペプチダーゼにより切断される。１６５アミノ酸のヒトエリスロポエチンの一次構造を配列番号２に示し、このＥＰＯの核酸を配列番号１に示す。エリスロポエチンの二次構造は、Ｃｙｓ７−Ｃｙｓ１６１およびＣｙｓ２９−Ｃｙｓ３３間の２つのジスルフィド架橋を含む。完全グリコシル化ＥＰＯは分子量で約４０％の炭水化物基を含む（Ｓａｓａｋｉ，Ｈ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（１９８７）１２０５９−１２０７６）。グリカン部分を含有しないヒトエリスロポエチンのポリペプチド鎖の分子量は１８，２３６Ｄａである。

エリスロポエチンは赤血球形成に必須であるため、それは、赤血球産生の低下または欠損により特徴づけられる血液障害の治療において有用である。臨床的には、エリスロポエチンは、種々の疾患、例えば、慢性腎不全患者（ＣＲＦ）における並びに化学療法を受けているエイズおよび癌患者における貧血の治療において使用される（Ｄａｎｎａ，Ｒ．Ｐ．ら，Ｉｎ：Ｍ Ｂ，Ｇａｒｎｉｃｋ編，Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ−Ａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．：Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ；１９９０，ｐｐ．３０１−３２４）。しかし、エリスロポエチンのような現在利用可能なタンパク質治療剤のバイオアベイラビリティは、そられの血漿半減期が短くプロテアーゼ分解を受け易いことにより制限されている。これらの欠点は、それらが最大限度の臨床的効力を達成することを妨げている。ＥＰＯのアミノ酸配列の修飾は、例えば、米国特許第４，８３５，２６０号、ＷＯ ９４／２５０５５、ＷＯ ９４／２４１６０、ＷＯ ９４／０２６１１、ＷＯ ９５／０５４６５を含む多数の参考文献に開示されている。

エリスロポエチンは、組換えＤＮＡ技術を用いて生合成的に製造されている（Ｅｇｒｉｅ，Ｊ．Ｃら，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ．７２（１９８６）２１３−２２４）。ヒトにおける治療に現在使用されているエリスロポエチンは、チャイニーズハムスター卵巣組織細胞（ＣＨＯ細胞）内に挿入され該細胞内で発現されたクローン化ヒトＥＰＯ遺伝子の産物である。ヒト尿由来エリスロポエチンおよび組換えエリスロポエチン（哺乳類細胞内で発現されたもの）の両方は、一緒になって該糖タンパク質の全分子量の約４０％を構成する３つのＮ−結合オリゴ糖鎖および１つのＯ−結合オリゴ糖鎖を含有する。Ｎ−結合グリコシル化は２４、３８および８３位のアスパラギン残基において生じ、一方、Ｏ−結合グリコシル化は、１２６位に位置するセリン残基において生じる（Ｌａｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（１９８６）３１１６；Ｂｒｏｕｄｙ，Ｖ．Ｃら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２６５（１９８８）３２９）。該オリゴ糖鎖は末端シアル酸残基で修飾されることが示されている。全シアル酸残基を除去するためのグリコシル化エリスロポエチンの酵素処理はインビボ活性の喪失を引き起こすが、インビトロ活性には影響を及ぼさない（Ｌｏｗｙら，Ｎａｔｕｒｅ １８５（１９６０）１０２；Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ，Ｅ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９（１９７４）４２０２−４２０６）。この挙動は、肝アシアロ糖タンパク質結合タンパク質と相互作用した後、アシアロエリスロポエチンが循環から迅速にクリアランスされることにより説明されている（Ｍｏｒｒｅｌｌら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４３（１９６８）１５５；Ｂｒｉｇｇｓ，Ｄ．Ｗ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２２７（１９７４）１３８５−１３８８；Ａｓｈｗｅｌｌ，Ｇ．およびＫａｗａｓａｋｉ，Ｔ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．５０（１９７８）２８７−２８８）。したがって、エリスロポエチンは、アシアロ糖タンパク質結合タンパク質がそれに結合するのを避けるためにそれがシアル酸化されている場合にのみ、インビボ生物活性を有する。

エリスロポエチンのオリゴ糖鎖内のその他の成分の役割は十分には明らかにされていない。部分ジグリコシル化エリスロポエチンは、グリコシル化形態と比較して著しく低下したインビボ活性を有するが、インビトロ活性を保有することが示されている（Ｄｏｒｄａｌ，Ｍ．Ｓ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １１６（１９８５）２２９３−２２９９）。しかし、もう１つの研究において、グリコシル化部位であるアスパラギンまたはセリン残基の突然変異誘発によるＮ−結合オリゴ糖鎖またはＯ−結合オリゴ糖鎖の一方または両方の除去は、哺乳類細胞内で産生された該改変エリスロポエチンの生物活性を著しく低下させている（Ｄｕｂｅ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３（１９８８）１７５１６−１７５２１）。

グリコシル化のための特異的部位を欠くＥＰＯの構造突然変異体を製造するために、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発が用いられている（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｋ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（１９９１）２０４３４−２０４３９；およびＨｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（１９９２）７７０３−７７０９）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における非グリコシル化ＥＰＯのクローニングおよび発現がＬｅｅ−Ｈｕａｎｇ，Ｓ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６１（１９８４）２７０８−２７１２および米国特許第５，６４１，６６３号に記載されている。

ＥＰ ０ ６４０ ６１９は、グリコシル化のための少なくとも１つの付加部位を含むアミノ酸配列を含むヒトエリスロポエチンの類似体に関するものである。グリコシル化のための付加部位は、ヒトエリスロポエチンと比較して炭水化物鎖の数を増加させ、シアル酸含量を増加させうる。グリコシル化のための少なくとも１つの部位の転位を含むアミノ酸配列を含むエリスロポエチン類似体も提供されている。エリスロポエチンのカルボキシ末端への１以上のアミノ酸の付加（該付加は少なくとも１つのグリコシル化部位を与える）を含む類似体も含まれる。

ＣＨＯ細胞において産生されたエリスロポエチンと比較して、ヒト化グリコシル化を伴ってピチア（Ｐｉｃｈｉａ）において産生されたエリスロポエチンは、Ｎ−およびＯ−グリコシル化を含む結合オリゴ糖構造において遥かに均一である。ＣＨＯ由来ｒｈＥＰＯは、種々の量のシアル酸化を伴う二分枝、三分枝および四分枝形態を含む、糖形態の混合物として産生される。僅かなＮ−グリカン前富化を伴う四分枝シアル酸化糖形態を富化するために、プロセス開発が用いられる（Ｒｅｓｔｅｌｌｉら，２００６ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９４（３）ｐ．４８１−４９４）。また、ヒト化酵母におけるシアル酸化はＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）を含まないが、ＣＨＯ細胞内で産生されたシアル酸化エリスロポエチンはＮＡＮＡ（Ｎ−アセチルノイラミン酸）とＮＧＮＡとの混合物を含有する。

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳類細胞系において産生されたエリスロポエチンは、シアル酸化Ｎ−結合グリカンを含有する炭水化物に富む。四分枝糖形態の富化はエリスロポエチンのＮ−グリカン上のラクトサミン反復の比率を増加させる。これらの反復を含有するエリスロポエチン分子は、低下したインビボ効力を有しうる。なぜなら、ポリラクトサミン反復の存在は、肝臓を経由する循環からの迅速なクリアランスに相関されているからである（Ｆｕｋｕｔａら，（１９８９）Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．７３，８４）。

また、ラクトサミン部分は、種々の細胞および組織型の細胞表面上で示差的に発現される炭水化物結合タンパク質であるレクチンのガレクチンファミリーに結合すると報告されている。特に、ガレクチン−３はラクトサミンを特異的に認識する。ガレクチン−３は多種多様な腫瘍細胞型の細胞表面上で過剰発現されることが判明しており、細胞の増殖、トランスフォーメーションおよび転移に関連づけられている（Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒら，（２００２）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．２２，１５８５）。

したがって、ラクトサミン反復を含有する糖タンパク質は、細胞表面上でガレクチン−３を発現する細胞に潜在的に標的化されうる。さらに、これは、ラクトサミン含有糖タンパク質が、該糖タンパク質に対するコグネイト受容体を偶然に含有しうる腫瘍細胞を選択的に標的化しうるという、もう１つの潜在的なリスクを表している。エリスロポエチンの場合、ラクトサミンを含有するエリスロポエチンの一部は腫瘍細胞を優先的に標的化する可能性があり、エリスロポエチン受容体が存在する場合には、異常な有糸分裂シグナルが生じて、転移能を伴った腫瘍細胞の増殖を推進する可能性がある。

ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）において産生されたエリスロポエチンはラクトサミン反復のような望ましくない糖形態を欠いている。これは、ＥＰＯおよび他の糖タンパク質の腫瘍生成能に関する懸念を緩和すると考えられるであろう。

他の相違には、共にＣＨＯ細胞の場合には存在する結合コアフコースおよびポリラクトサミンがピチア（Ｐｉｃｈｉａ）産生エリスロポエチンでは全く存在しないこと、ならびにピチア（Ｐｉｃｈｉａ）産生エリスロポエチン上で見出されうるＯ−マンノースと比較して、ＣＨＯ産生エリスロポエチン上のＯ−ＧａｌＮＡｃ構造は不均一な混合物であり、Ｏ−グリカン組成のばらつきを伴うことが含まれる。シアル酸結合は、ＣＨＯ産生エリスロポエチンにおいては主としてα２，３であり、部分的にα２，６が存在し、一方、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）産生エリスロポエチンは、α２，６結合シアル酸を優勢に含有するヒト尿エリスロポエチンに類似して、専らα２，６を含有する（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ ３１３，ｐ．１４４１−１４４３）。

エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、血管痙縮、アポトーシスおよび炎症応答を予防することが示されている組織防御性サイトカインである。ＥＰＯは、造血に対するその活性が最もよく知られているが、神経系を含む他の組織にも影響を及ぼす。動物モデルは、ｒｈＥＰＯの単一用量が急性損傷の治療に有効であることを示している（４−６，１９）。例えば、総頸動脈の閉塞に付されたアレチネズミの側脳室内へのＥＰＯの注入は虚血誘発性学習不能を予防し、海馬ニューロンを変性から救った（Ｂｅｒｎａｕｄｉｎら，（１９９９）Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ １９，６４３）。

インビボでの研究は、種々の形態のニューロン損傷に対するＥＰＯの防御効果を示している（Ｂｒｉｎｅｓら，（２０００），ＰＮＡＳ，９７，１０５２６；Ｃｅｌｉｋら，（２００２），ＰＮＡＳ，９９，２２５８；Ｊｕｎｋら，（２００２），ＰＮＡＳ，９９，１０６５９）。しかし、多数の臨床状況はｒｈＥＰＯの複数の用量を要する可能性があり、これは、十中八九、ヘマトクリットにおける潜在的に有害な上昇を招いて、潜在的な神経保護療法剤としての組換えヒトエリスロポエチン（ｒｈＥＰＯ）に対する関心を抑制するであろう。これは、ヘマトクリットのＥＰＯ依存的増加が脳損傷を引き起こし増悪させることを明らかに示している動物モデルにより裏付けられている。この逆説に対する考えられうる解決策は、動物モデルにおいてヘマトクリットに対する最低限度の影響を示している、二分枝グリコシル化を含有するＥＰＯの使用によるものでありうるであろう（Ｈａｍｉｌｔｏｎら，（２００６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１３，１４４１）。したがって、炎症の治療のための二分枝グリコシル化を含有するＥＰＯの複数の高用量は全体的なヘマトクリットにほとんど影響を及ぼさない可能性がある。

炎症の治療に使用されうるもう１つの興味深い糖形態は、末端シアル酸化を伴わない二分枝ＥＰＯである。これは、ヘマトクリットの有意な上昇を伴わない抗炎症剤としての有効な治療法としても有用でありうる。この分子の追加的な利点は、肝臓内のアシアロ−糖タンパク質受容体に対するそのアフィニティーが、三分枝および四分枝末端ガラクトシル化糖形態であるこの受容体の好ましい基質と比較して低いことであろう。したがって、二分枝非シアル酸化グリコシル化を伴うＥＰＯの利点は、肝クリアランスの低下、ヘマトクリットに対する影響がほとんどないこと、および好ましいニューロン組織分布である。アシアロ−ＥＰＯは、本明細書中に示すグリコシル化経路のシアル酸化部分を欠く酵母細胞においてＥＰＯを発現させることにより、本発明に従い製造されうる。

ＩＩＩ．糖タンパク質をコードする核酸
本発明のエリスロポエチンは核酸によりコードされる。該核酸はＤＮＡまたはＲＮＡ、典型的にはＤＮＡでありうる。該糖タンパク質をコードする核酸は、該糖タンパク質の発現を可能にする調節配列に機能的に連結されている。そのような調節配列には、該融合タンパク質をコードする核酸の上流（すなわち５’側）のプロモーターおよび場合によってはエンハンサー、ならびに該糖タンパク質をコードする核酸の３’側（すなわち下流）の転写終結部位が含まれる。該核酸は、典型的には、リボソーム結合部位を有する５’ ＵＴＲ領域、および３’非翻訳領域をもコードする。該核酸はしばしば、該糖タンパク質が発現される宿主細胞内に核酸を運搬するベクターの成分である。該ベクターは、形質転換細胞の認識を可能にするマーカーをも含有しうる。しかし、いくつかの宿主細胞型、特に酵母は、外来性ベクター配列を欠く核酸で成功裏に形質転換されうる。

本発明の所望のエリスロポエチンをコードする核酸は幾つかの入手源から入手されうる。保存領域に対するプライマーを使用して、糖タンパク質を発現することが公知の細胞系から、ｃＤＮＡ配列を増幅することが可能である（例えば、Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５８１−５９６（１９９１）を参照されたい）。また、核酸は、科学文献中の配列に基づいてデノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）で合成されうる。核酸は、より大きな核酸、例えばゲノムＤＮＡの所望の配列にわたる重複オリゴヌクレオチドの伸長によっても合成されうる（例えば、Ｃａｌｄａｓら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１３，３５３−３６０（２０００）を参照されたい）。

本発明は、好ましくは、哺乳類エリスロポエチンをコードする核酸を使用し、最も好ましくは、ヒトエリスロポエチンをコードする核酸を使用する。ヒトエリスロポエチンは１６５または１６６アミノ酸のタンパク質として当技術分野で公知である。

以下のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、本発明において使用されうる典型的な好ましい配列である。

ＥＰＯヌクレオチド配列［配列番号１］

ＥＰＯアミノ酸配列［配列番号２］

ＩＶ．宿主細胞
本発明のエリスロポエチンを発現させるためには、下等真核細胞、例えば酵母および真菌が好ましい。なぜなら、それらは経済的に培養され、高い収率を与えることが可能であり、適当に修飾されると、適当なグリコシル化を受けうるからである。酵母は特に、迅速な形質転換、信頼しうるタンパク質局在化法および簡便な遺伝子ノックアウト技術を可能にする確立された遺伝学的特徴を有する。適当なベクターは、必要に応じて、発現制御配列、例えばプロモーター（３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素を含む）、および複製起点、終結配列などを有する。

細胞培養には種々の酵母、例えばクライベロミセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）およびハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）が好ましい。ならなら、それらは、高い細胞密度まで増殖させることが可能であり、大量の組換えタンパク質を分泌しうるからである。同様に、本発明の糖タンパク質を製造するために、糸状菌、例えばトリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）などが使用されうる。

下等真核生物、特に酵母および真菌は、グリコシル化パターンがヒト様である又はヒト化されている糖タンパク質を発現するよう遺伝的に修飾されうる。これは、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓら，ＵＳ ２００４００１８５９０および７，０２９，８７２（それらの開示を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されているとおりに、選択された内因性グリコシル化酵素を排除し及び／又は外因性酵素を供給することにより達成されうる。例えば、マンノース残基を糖タンパク質上のＮ−グリカン上に付加する１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性が枯渇するよう、宿主細胞を選択または操作することが可能である。

本発明の方法および物質を用いて、複数の糖形態を含む糖タンパク質組成物（各糖形態は、それに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、それにより、該糖タンパク質組成物は、優勢な糖形態が所望のＮ−グリカンを含む、複数のＮ−グリカンを含む）を製造することが可能である。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓら，ＵＳ ２００４００１８５９０および７，０２９，８７２に記載されている手段を本発明と共に利用して、多数の異なるＮ−結合糖形態を製造することが可能である。具体的な必要性に応じて、優勢なＮ−糖形態が、次に最も優勢なＮ−糖形態より５〜８０モル％多い量で存在する、糖タンパク質組成物を得るために、本発明の方法を用いることが可能であり、好ましい実施形態においては、優勢なＮ−糖形態は、次に最も優勢なＮ−糖形態より１０〜４０モル％、２０〜５０モル％、３０〜６０モル％、４０〜７０モル％、５０〜８０モル％多い量で存在しうる。他の好ましい実施形態においては、優勢なＮ−糖形態は所望のＮ−糖形態であり、Ｎ−グリカンの総数の２５モル％より多く、３５モル％より多く、５０モル％より多く、６０モル％より多く、７５モル％より多くまたは８０モル％より多くの量で存在する。

好ましい実施形態においては、ベクターは、１以上の選択可能なマーカー遺伝子、および適当な宿主細胞内に形質転換されるエリスロポエチンをコードする１以上の所望の遺伝子で構築されうる。例えば、単離のための１以上の遺伝子選択マーカー遺伝子を、所望のエリスロポエチンペプチドまたはタンパク質を発現する１以上の遺伝子に物理的に連結させることが可能であり、あるいは、所望の活性を有する該エリスロポエチンペプチドまたはタンパク質の断片を該ベクター内の選択可能遺伝子に結合させることが可能である。該選択マーカー遺伝子およびエリスロポエチン遺伝子は、形質転換宿主細胞内の該エリスロポエチン遺伝子の存在が該形質転換細胞内の該選択マーカー遺伝子の発現に相関されるよう、１以上の形質転換ベクター上に配置されうる。例えば、それらの２つの遺伝子は、単一のプロモーターの制御下または２つの別々のプロモーターの制御下、同一の物理的プラスミド内に挿入されうる。これらの遺伝子を異なるプラスミド内に挿入し、該細胞内に同時形質転換することも望ましいかもしれない。

本発明における宿主細胞として有用な他の細胞には、原核細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、および細胞培養内の真核宿主細胞、例えば哺乳類細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）が含まれる。

Ｖ．化学修飾エリスロポエチン
前記のとおり、重合体ビヒクルをエリスロポエチンのようなタンパク質にコンジュゲート化して、その特性を改善することが可能である。ビヒクルとして有用な化学的部分を結合させるための種々の手段が現在利用可能である。例えば、特許協力条約（「ＰＣＴ」）国際公開番号ＷＯ ９６／１１９５３（発明の名称：“Ｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ”）（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。このＰＣＴ公開は、とりわけ、タンパク質のＮ末端への水溶性重合体の選択的結合を開示している。

タンパク質またはポリペプチドが重合体に結合している化学修飾エリスロポエチン組成物（すなわち「誘導体」）は本発明の範囲内に含まれる。選択される重合体は、それが結合するタンパク質が水性環境（例えば、生理的環境）中で析出しないよう、典型的には水溶性である。選択される重合体は通常、本方法において備えられたとおりに重合度が制御されうるよう、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒドのような単一の反応性基を有するよう修飾される。重合体の混合物は修飾エリスロポエチン組成物の範囲内に含まれる。最終産物調製物を治療用に用いる場合には、好ましくは、該重合体は医薬上許容されるものである。

該水溶性重合体またはその混合物は、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロースまたは他の炭水化物に基づく重合体、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコールからなる群から選択されうる。アシル化反応には、選択される重合体は単一の反応性エステル基を有するべきである。還元的アルキル化には、選択される重合体は単一の反応性アルデヒド基を有するべきである。該重合体は任意の分子量のものであることが可能であり、分枝状または非分枝状でありうる。本発明において使用するための特に好ましい水溶性重合体は、ＰＥＧと略称されるポリエチレングリコールである。本明細書中で用いるポリエチレングリコールは、他のタンパク質を誘導体化するために使用されているＰＥＧの任意の形態、例えばモノ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシまたはアリールオキシ−ポリエチレングリコールを包含する意である。

ＰＡＬのＰＥＧ化（すなわち、ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体の付加による修飾）は、例えば以下の参考文献に記載されている当技術分野で公知のＰＥＧ化反応のいずれかにより行われうる：Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ３：４−１０（１９９２）、ＥＰ ０ １５４３１６およびＥＰ ０４０１ ３８４。好ましくは、ＰＥＧ化は、後記のとおり、反応性ポリエチレングリコール分子（または同様の反応性水溶性重合体）でのアシル化反応またはアルキル化反応を介して行われる。

一般に、化学的誘導体化は、生物学的に活性な基質を活性化重合体分子と反応させるために用いる任意の適当な条件下で行われうる。ＰＥＧ化エリスロポエチンを製造するための方法は、一般には、（ａ）エリスロポエチンが１以上のＰＥＧ基に結合する条件下、エリスロポエチンポリペプチドをポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）と反応させ、（ｂ）反応産物を得る工程を含む。一般に、アシル化反応のための最適な反応条件は、公知パラメーターおよび所望の結果に基づいて決定される。例えば、ＰＥＧ：タンパク質の比が大きければ大きいほど、ポリ−ＰＥＧ化産物の比率は大きくなる。

本発明は、Ｎ末端化学修飾エリスロポエチンを選択的に得るために還元的アルキル化を用いる方法をも提供する。この方法においては、エリスロポエチンのＮ末端への連結は、異なる第一級アミノ基の反応性の相違により標的化されうる。該タンパク質中のリシンのε−アミノ基とＮ末端のα−アミノ基とのｐＫａがカルボニル基またはＰＥＧまたは別の重合体との反応により該Ｎ末端における該タンパク質のほぼ選択的な誘導体化をもたらすｐＨが選択される。モノ重合体で修飾されたエリスロポエチンが好ましい。本発明の調製物は、好ましくは、５０％より多く、５５％より多く、６０％より多く、６５％より多く、７０％より多くまたは７５％より多くのモノ重合体エリスロポエチン、より好ましくは、８０％より多く、８５％より多くまたは９０％より多くのモノ重合体：タンパク質コンジュゲート、最も好ましくは、９５％より多くのモノ重合体−エリスロポエチンコンジュゲートである。

モノ重合体で誘導体化されたエリスロポエチン調製物を入手する方法は、該コンジュゲート化後の非誘導体化エリスロポエチン分子の集団からの誘導体化物質の精製によるものでありうる。例えば、クロマトグラフィーを用いてモノ−ＰＥＧ化エリスロポエチンが分離される一例を後記に記載する。サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたはそれらの２つの組合せ、および潜在的には他の一般的な精製方法が用いられうる。これらの方法は、精製された産物を特徴づけるための分析手段として、または分取精製手段として用いられうる。

好ましい重合体ビヒクルはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧ基は、任意の簡便な分子量のものであることが可能であり、直鎖状または分枝状でありうる。ＰＥＧの平均分子量は、好ましくは約２キロダルトン（「ｋＤａ」）〜約１００ｋＤａ、より好ましくは約５ｋＤａ〜約６０ｋＤａ、より好ましくは約２０ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、最も好ましくは約３０ｋＤａ〜約４０ｋＤａの範囲である。これらのＰＥＧは、ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、Ｄｏｗ Ｐｈａｒｍａ（ＣｈｉｒｏＴｅｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）、Ｎｅｋｔａｒ（Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）およびＳｕｎＢｉｏ（Ａｎｙａｎｇ Ｃｉｔｙ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）を含む任意の商業的販売業者から供給されうる。適当なＰＥＧ部分には、例えば、４０ｋＤａ メトキシ ポリ（エチレングリコール）プロピオンアルデヒド；６０ｋＤａ メトキシ ポリ（エチレングリコール）プロピオンアルデヒド；３１ｋＤａ アルファ−メチル−ｗ−（３−オキソプロポキシ）、ポリオキシエチレン；３０ｋＤａ ＰＥＧ：３０ｋＤａ メトキシ ポリ（エチレングリコール）プロピオンアルデヒドおよび４５ｋＤａ ２，３−ビス（メチルポリオキシエチレン−オキシ）−１−［（３−オキソプロピル）ポリオキシエチレン−オキシ］−プロパンが含まれる。ＰＥＧ基は一般に、関心のあるタンパク質またはポリペプチド上の反応性基（例えば、アルデヒド、アミノまたはエステル基）への、ＰＥＧ部分上の反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ、チオールまたはエステル基）を介したアシル化または還元的アミノ化により、本発明の化合物に結合される。例えば、ＰＥＧ部分は、エリスロポエチンのＮ末端アミノ酸残基に、直接的に、またはリンカーを介して連結されうる。

合成ペプチドのＰＥＧ化のための通常の方法は、溶液中でのコンジュゲート連結の形成を介して、ペプチドとＰＥＧ部分（それぞれは、お互いに対して反応性である特別な官能性を含有する）とを合体させることからなる。該ペプチドは、通常の固相合成により容易に製造されうる（例えば、図５および６ならびに本明細書中の本文を参照されたい）。該ペプチドは、特定の部位の適当な官能基で「前活性化」される。該前駆体を精製し、十分に特徴づけした後、ＰＥＧ部分と反応させる。該ペプチドとＰＥＧとの連結は通常、水相中で行われ、逆相分析用ＨＰＬＣにより容易にモニターされうる。該ＰＥＧ化ペプチドは分取ＨＰＬＣにより容易に精製され、分析用ＨＰＬＣ、アミノ酸分析およびレーザー脱着質量分析により特徴づけられうる。

多糖重合体は、タンパク質修飾に使用されうるもう１つのタイプの水溶性重合体である。デキストランは、主としてα１−６結合により結合したグルコースの個々のサブユニットから構成される多糖重合体である。デキストラン自体は多数の分子量範囲のものが入手可能であり、約１ｋＤａ〜約７０ｋＤａの分子量のものが容易に入手可能である。デキストランは、単独で又は別のビヒクル（例えば、Ｆｃ）と組合せて本発明においてビヒクルとして使用するための適当な水溶性重合体である。例えば、ＷＯ ９６／１１９５３およびＷＯ ９６／０５３０９を参照されたい。治療用または診断用免疫グロブリンにコンジュゲート化されたデキストランの使用が報告されている。例えば、欧州特許公開番号０３１５ ４５６（これを参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。本発明においてビヒクルとしてデキストランを使用する場合には、約１ｋＤ〜約２０ｋＤのデキストランが好ましい。

前記のとおり、「リンカー」基の存在は随意的なものである。存在する場合、その化学構造は決定的に重要なわけではない。なぜなら、それは主としてスペーサーとして機能するからである。該リンカーは、好ましくは、ペプチド結合により互いに連結されたアミノ酸から構成される。したがって、好ましい実施形態においては、該リンカーは、ペプチド結合により連結された１〜２０アミノ酸から構成され、該アミノ酸は、２０種の天然に存在するアミノ酸から選ばれる。当業者に十分に理解されているとおり、これらのアミノ酸の幾つかはグリコシル化されうる。より好ましい実施形態においては、前記の１〜２０アミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミンおよびリシンから選ばれる。より一層好ましくは、リンカーは、立体障害を有さないアミノ酸（例えば、グリシンおよびアラニン）から大部分が構成される。したがって、好ましいリンカーはポリグリシン、特に（Ｇｌｙ）_４、（Ｇｌｙ）_５、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）およびポリアラニンである。リンカーの他の具体例としては、以下のものが挙げられる。
（Ｇｌｙ）_３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）_４；
（Ｇｌｙ）_３ＡｓｎＧｌｙＳｅｒ（Ｇｌｙ）_２；
（Ｇｌｙ）_３Ｃｙｓ（Ｇｌｙ）_４；および
ＧｌｙＰｒｏＡｓｎＧｌｙＧｌｙ。

前記の命名法を説明すると、例えば、（Ｇｌｙ）_３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）_４はＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを意味する。ＧｌｙとＡｌａとの組合せも好ましい。ここに示されているリンカーは典型的なものであり、本発明の範囲内のリンカーはそれらより遥かに長くてもよく、他の残基を含むことが可能である。

非ペプチドリンカーも可能である。例えば、アルキルリンカー、例えば、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ここで、ｓ＝２〜２０）が使用されうるであろう。これらのアルキルリンカーは更に、任意の非立体障害基、例えば低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ６）低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニルなどにより置換されうる。典型的な非ペプチドリンカーはＰＥＧリンカーであり、ここで、ｎは、該リンカーが１００〜５０００ｋＤ、好ましくは１００〜５００ｋＤの分子量を有するようになるものである。該ペプチドリンカーは、前記と同様に誘導体を形成するよう改変されうる。

グリコシル化ＥＰＯのＰＥＧ化はＷＯ ０１／０２０１７に記載されている。そのような分子は生物活性の改善を示す。ＷＯ００／３２７７２およびＦｒａｎｃｉｓ，Ｇ．Ｅ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍ．６８（１９８８）１−１８は、ポリエチレングリコール修飾非グリコシル化ＥＰＯを記載している。ＷＯ ００／３２７７２の分子は更に１６６位において修飾されている。そのような分子はヘマトクリットの有意な上昇を引き起こさないと記載されている。該ＰＥＧ−重合体部分は１〜５本の重合体鎖からなる。ＷＯ ００／３２７７２は、ｐＨを低下させＰＥＧ：アミン比を減少させることによりＰＥＧ化の度合および部位を制御することを示唆している。ｐＨ７およびＰＥＧ−アルデヒド：アミン基のモル比１．５：１で行われる反応は優先的にＮ末端αアミノ基と反応する。

いくつかの有用なＰＥＧ化連結を表１に示し、いくつかの有用なＰＥＧ化反応を図１２に示す。好ましい方法においては、Ｎ末端ＰＥＧ化は、ｍＰＥＧ−プロピオンアルデヒドの使用、および還元的アミノ化によるｒｈＥＰＯ Ｎ末端へのその共有結合（共有コンジュゲート化）により達成される。選択性は、リシンのε−アミノ基（ｐＫａ〜１０）とＮ末端アミノ基（ｐＫａ〜７．６−８．０）との間のｐＫａ値における相違を利用することにより達成される。典型的な誘導体化反応においては、ｒｈＥＰＯの３０％〜５０％がＰＥＧ化される。最適条件下、高い度合の誘導体化が達成されうる。ついでモノ−ＰＥＧ化ｒｈＥＰＯを、陽イオン交換クロマトグラフィー工程を用いて精製する。好ましくは、精製されたモノ−ＰＥＧ化ｒｈＥＰＯは、クロマトグラフィー後のｒｈＥＰＯの８０％より多く、８５％より多く、９０％より多くまたは最も好ましくは９５％より多い。

一般に、本重合体／エリスロポエチン−誘導体の投与により改善またはモジュレーションされうる状態には、エリスロポエチン分子全般に関して本明細書に記載されているものが含まれる。しかし、本明細書に開示されている重合体／エリスロポエチンおよびエリスロポエチン−誘導体分子は、該非誘導体化分子と比べて追加的な活性、増強または減弱した活性、あるいは他の特徴を有しうる。

実施例

遺伝的に操作されたピチア６．０細胞系の構築
Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ ＵＳ ７，０２９，８７２およびＧｅｒｎｇｒｏｓｓ ＵＳ ２００４００１８５９０に開示されている方法に従い、下等真核宿主細胞が、優勢な種として所望のＮ−糖形態を有する所望のポリペプチドを発現しうるものとなるよう、該宿主細胞を遺伝的に操作するのに有用なベクターを構築することが可能である。ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＮＲＲＬ−１１４３０の野生型株から出発して、図１に記載の一連の手順に従い、遺伝子の逐次的導入を行う。本発明において使用する株ＹＧＬＹ３１５９の遺伝子型はｕｒａ５Δ：：ＭＥＴ１６ ｏｃｈ１Δ：：ｌａｃＺ ｂｍｔ２Δ：：ｌａｃＺ／ＫｌＭＮＮ２−２、ｍｎｎ４Ｌ１Δ：：ｌａｃＺ／ＭｍＳＬＣ３５Ａ３ Δｐｎｏ１Δｍｎｎ４Δ：：ｌａｃＺ ｍｅｔ１６Δ：：ｌａｃＺ、ｈｉｓ１Δ：：ｌａｃＺ／ＳｃＧＡＬ１０／ＸＢ３３／ＤｍＵＧＴ、ａｒｇ１Δ：：ＨＩＳ１／ＫＤ５３／ＴＣ５４、ＡＤＥ１：：ｌａｃＺ／ＮＡ１０／ＭｍＳＬＣ３５Ａ３／ＦＢ８、ＰＲＯ１：：ｌａｃＺ−ＵＲＡ５−ｌａｃＺ／ＴｒＭＤＳ１、ＡＯＸ１：Ｓｈ ｂｌｅ／ＡＯＸ１ｐ／ＳｃαＭＦｐｒｅ−ＧＦＩ８００、ＴＲＰ２：：ＡＲＧ１／ＭｍＣＳＴ／ＨｓＧＮＥ／ＨｓＣＳＳ／ＨｓＳＰＳ／ＭｍＳＴ６−３３である。

株ＹＧＬＹ３１５９の構築に使用したプラスミドを図２、パネルＡ〜Ｏに示す。標準的な技術に従い、該プラスミドを所望の細胞内に形質転換する。細胞系の構築のための適当な技術はＨａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１３：１４４１：１４４３（２００６）（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）にも示されている。

組換えＥＰＯの製造のためのベクターの構築
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのα接合因子プレ配列に対するオリゴをリン酸化し、アニーリングさせて、５’末端にＥｃｏＲＩ突出部分を、そして３’末端に平滑末端を作製した。ついで、図２に示すとおりに、このオリゴペアを、ヒトエリスロポエチンをコードするコードＤＮＡ配列に連結して、ｐＧＬＹ２０８８を得、図１に示すとおりに、これをピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）内に形質転換した。

６．０細胞系の形質転換および発酵
Ａ．形質転換
酵母株をエレクトロポレーション（エレクトロポレーターの製造業者ＢｉｏＲａｄにより推奨されている標準的な技術を用いるもの）により形質転換した。

Ｂ．発酵方法の説明
発酵の実施は、Ａｐｐｌｉｋｏｎの１５Ｌ（実効容量１２Ｌ）の高圧滅菌可能なガラスバイオリアクター内で行った。凍結ストックバイアルから増殖させた対数期の振とうフラスコ培養を該リアクターに接種（０．０４％ ｖ／ｖ）する。初期仕込みグリセロールが枯渇して、該バッチ相は２４〜３６時間のうちに終了する。バッチ相後の湿潤細胞重量（ＷＣＷ）は典型的には１２０±２５ｇ／Ｌ ＷＣＷである。この時点で、１２ｍＬ／Ｌ ＰＴＭ１塩を含有する５０％ ｗ／ｗのグリセロール溶液を１回の放出（ｐｕｌｓｅ）で発酵槽に供給して、グリセロール流加（フェド・バッチ）相の開始時の最終グリセロール濃度を３０ｇ／Ｌとする。メタノールに２．６ｍｇ／ｍＬで溶解した真菌Ｏ−グリコシル化の合成インヒビター（ＰＭＴｉ−３）を含有する溶液を１ｍＬ／Ｌで加える。プロテアーゼインヒビター混合物（ＤＭＳＯ中の４５ｍｇ／ｍＬ ペプスタチン（Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）Ａおよび１５ｍＭ キモスタチン（Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ））を０．６ｍＬ／Ｌで加える。４時間以内に、該グリセロールは消費され、湿潤細胞重量は２２５±２５ｇ／Ｌ ＷＣＷに達する。ついで、２．３ｇ／ｈ／Ｌでの１２ｍＬ／ＬのＰＭＴ１塩を含有するメタノールの供給の開始により、遺伝子発現を誘導する。該メタノール流加相の開始時および２４時間の誘導のたびに、１ｍＬ／Ｌの２．６ｍｇ／ｍＬ ＰＭＴｉ−３（メタノール中）および０．６ｍＬ／Ｌの該プロテアーゼインヒビター混合物を加える。誘導を４０時間継続し、この時点で、最終湿潤細胞重量は約３００±２５ｇ／Ｌになると予想される（Ｌ^＊は接種前の初期仕込み容量である）。

発酵ブロスの一次清澄化を遠心分離により行う。全細胞ブロスを１０００ｍＬの遠心分離ボトル内に移し、１３，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離する。

精製
ＰＥＧ化のためのヒトＥＰＯ（ｈＥＰＯ）を、９５％の純度が得られた３工程クロマトグラフィー分離（図３）により、以下のとおりに調製した。まず、細胞非含有発酵上清を０．２μｍ濾過膜で濾過し、濃縮し、バッファー交換した（中空糸膜を伴うＭｉｎｉＫｒｏｓｓ接線流動分離モジュールを使用）。

宿主細胞タンパク質およびｈＥＰＯ流液を捕捉するために、第１工程においてＱセファロースＢｉｇ Ｂｅａｄｓを使用した。ＱセファロースＢｉｇ Ｂｅａｄｓカラムからの流液のおよび洗浄サンプルのプールを酢酸でｐＨ５．０に調節した。伝導度を測定して、約４．５ｍＳ／ｃｍの値を確保した。

つぎに、該サンプルを０．２μｍ膜フィルターで濾過し、３カラム容量の５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で予め平衡化されたＳＰセファロースＦａｓｔ Ｆｌｏｗカラム上にローディングした。該タンパク質を溶出させるために、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）から２０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）；５００ｍＭ ＮａＣｌへの１０カラム容量の勾配を適用して、ついで０．５カラム容量の２０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）；７５０ｍＭ ＮａＣｌの段階溶出を行った。ｈＥＰＯを含有する画分をプールし、５０ｍＭ ＴＲＩＳ（ｐＨ７．０）中で透析した。

ｈＥＰＯ含有画分を、３カラム容量の５０ｍＭ ＴＲＩＳ（ｐＨ７．０）で予め平衡化されたＢｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ＦＦカラム上にローディングした。５０ｍＭ ＴＲＩＳ（ｐＨ７．０）から５０ｍＭ ＴＲＩＳ（ｐＨ８）；３Ｍ ＮａＣｌへの１０カラム容量の直線勾配を適用し、ついで２カラム容量の５０ｍＭ ＴＲＩＳ（ｐＨ８）；３Ｍ ＮａＣｌでの段階溶出を行った
ＥＰＯバンド（平均分子量〜２５ｋＤａ）を示した画分をプールし、０．２μｍ膜フィルターで濾過し、２０ｍｍ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）中、４℃で透析し、４℃で保存した。ついで該サンプルプールを濃縮し、５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．２）中で１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度まで透析した。

発酵上清をｐＨ５にさらすと、ｈＥＰＯの喪失が増加することが判明している。したがって、ｈＥＰＯ精製の捕捉および中間工程を中性ｐＨに維持することが重要である。

第２の一般的な精製方法の概要を図１０に示す。この方法を用いて調製された精製サンプルを、図１１に示すＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。

一次清澄化を遠心分離により行う。全細胞ブロスを１０００ｍＬの遠心分離ボトル内に移し、１３，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離する。より大きな発酵槽（１０Ｌ〜４０Ｌ以上）の場合には、限外濾過工程を行うことが可能である。この工程は、５倍濃度まで、１０Ｋの孔径のＳａｒｔｏｒｉｕｏｓ平板を使用して行うことが可能である。

５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）で平衡化されたブルー・セファロース（Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）６ファースト・フロー（ｆａｓｔ ｆｌｏｗ）（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して捕捉工程を行う。上清を１００ｍＭ ＮａＣｌに調節し、デッド・エンド（ｄｅａｄ ｅｎｄ）フィルター（Ｗｈａｔｍａｎ，Ｐｏｌｙｃａｐ ＴＣ）に通過させた後、該カラムにローディングした。ローディング後、滞留時間を３カラム容量（ＣＶ）の洗浄液で１０分に維持する。２５０ｍＭで２ＣＶおよび１Ｍ ＮａＣｌで３ＣＶの段階の溶出を行う。ＥＰＯは１Ｍ ＮａＣｌで溶出する。

該捕捉工程後、マクロ・プレップ（Ｍａｃｒｏ−ｐｒｅｐ）ヒドロキシアパタイトＩ型４０μｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用する。このカラムを、１Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＣａＣｌ２（ｐＨ７）を含有する５０ｍＭ ＭＯＰＳで平衡化する。ローディング前に、該ブルー（青色）カラムから、１０ｍＭ ＣａＣｌ２を、プールしたＥＰＯに加える。カラム洗浄を３ＣＶの平衡化溶液、ついで０〜２００ｍＭ リン酸Ｎａ（ｐＨ７）の１０ＣＶの直線勾配で行う。ＥＰＯは６０ｍＭ〜１００ｍＭ リン酸Ｎａで溶出する。

随意的精製工程として、ソース（Ｓｏｕｒｃｅ）３０Ｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用することが可能である。この場合、ヒドロキシアパタイトの後の、プールしたサンプルを、５０ｍＭ 酢酸Ｎａ（ｐＨ５）に対して４℃で一晩透析し、該カラムを同じバッファーで平衡化する。０〜７５０ｍＭ ＮａＣｌの１０ＣＶの直線勾配を適用する。ＥＰＯは３５０〜５００ｍＭ ＮａＣｌで溶出する。

精製されたＥＰＯの分析
Ｎ−グリカンを、精製されたＥＰＯから、ＰＮＧアーゼＦ（Ｃｈｏｉ ＰＮＡＳ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ ２００３ Ｓｃｉｅｎｃｅ）での処理により遊離させ、Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｌａｅｍｍｌｉ １９７０）に従うＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図４）。

精製されたＥＰＯの完全性および凝集物の存在を、２８０ｎｍをモニターするＬ７４２０ ＵＶ検出器、６９０ｎｍで検出するＷｙａｔｔ ｍｉｎｉＤＡＷＮ ３方向（ｔｈｒｅｅ−ａｎｇｌｅ）光散乱検出器、６９０ｎｍで検出するＷｙａｔｔ Ｏｐｔｉｌａｂ ｒＥｘ示差屈折率検出器、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬカラム（＃１７−５１７５−０１）およびＷｙａｔｔ ＡＳＴＲＡ Ｖ ５．３．１．５ソフトウェア（図４Ａ〜４Ｄ）と共にＨｉｔａｃｈｉ Ｄ７０００装置を使用するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）により判定した。

９０マイクロリットルのサンプル（＞０．１ｍｇ／ｍｌ）をサンプルバイアル内に入れ、キャップを付け、該カラム内に注入する。該ＨＰＬＣ勾配は、１００ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０５％ アジ化ナトリウムのバッファーを使用する、０．４５ｍｌ／分の流量での室温で６０分間のイソクラティック実施からなる。

ＡＳＴＲＡソフトウェアのタンパク質コンジュゲート分析モジュールを使用して、分子量を計算する。該示差屈折率検出器を該濃度検出器にセットする。タンパク質には０．１８５ｍｌ／ｇの、そしてＰＥＧおよびグリカンには０．１３６ｍｌ／ｇのｄｎ／ｄｃを用いる。

精製されたＥＰＯの純度を、Ｌ−７４５５ダイオードアレイ検出器およびＪｕｐｉｔｅｒ ５μ Ｃ４ ３００オングストローム１５０ｍｍ×４．６ｍｍ ＩＤカラム（＃００Ｆ−４１６７−Ｅ０，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）と共にＨｉｔａｃｈｉ Ｄ７０００ ＨＰＬＣ装置を使用するＲＰ−ＨＰＬＣにより定量した（図４）。９０マイクロリットルを注入し、該サンプルを２８０ｎＭでモニターし、以下のバッファーでの以下の勾配に従い分離する（カラムオーブンを予め８０℃に加熱する）：バッファーＡ：ヘリウムガスを分散させたＨＰＬＣ等級の水中の０．１％ トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、バッファーＢ：ヘリウムガスを分散させたＨＰＬＣ等級のアセトニトリル中の０．０８％ ＴＦＡ。

Ａｄｖｉｏｎ Ｔｒｉｖｅｒｓａ Ｎａｎｏｍａｔｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＬＴＱ質量分析計、Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｆｉｎｎｉｇａｎ Ｓｕｒｖｅｙｏｒ ＨＰＬＣ系、Ｊｕｐｉｔｅｒ ４μ Ｐｅｏｔｅｏ ９０Ａカラム、２５０×４．６０ｍｍ（＃００Ｇ−４３９６−Ｅ０，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）、および１０ｋＤａ分子量カットオフを有する遠心カラム（ＶＳ０１０１，Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）を使用するペプチドマッピング（ＬＣ−ＭＳ）により、ｈＥＰＯタンパク質の質を評価し、翻訳後修飾を評価した（図７）。

１００μｌのサンプル（＞１ｍｇ／ｍｌ）を１．５ｍｌ エッペンドルフチューブ内に入れ、１５０μｌの１０Ｍ ＧｕＨＣｌおよび２．５μｌの１Ｍ ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を加える。該サンプル内容物を混合し、３７℃で１時間インキュベートする。該サンプルを室温に冷却し、１０μｌの１Ｍ ヨード酢酸（ＩＡＡ）を加える。該サンプルチューブをアルミホイルで包むことにより遮光し、該サンプルを室温で４５分間インキュベートする。該サンプルバッファーを２５ｍＭ 炭酸水素アンモニウム（ＮＨ_４ＨＣＯ_３）（ｐＨ７．８）と交換し（各回１０倍希釈で６回）、最終容量を〜３０μｌに減少させる。１μｇのトリプシンストック溶液（−２０℃で保存された、１μｇ／μｌの５０ｍＭ 酢酸中の凍結乾燥トリプシンおよびアリコート２μｌ／チューブを構成）および５％（ｖ／ｖ）までのアセトニトリルを加える。該反応溶液を３７℃に配置し、一晩インキュベートする（〜１６時間）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を行って、トリプシン消化の完了を確認し、トリプシン活性を不活性化する。ついでギ酸を最終濃度０．１％（ｖ／ｖ）まで加えてｐＨを低下させる。１５マイクロリットルの該消化物を１５μｌ ＨＰＬＣバッファーＡ（ＨＰＬＣ等級の水中の０．１％ ギ酸（ＦＡ））と混合し、サンプルバイアル内にローディングする。ＨＰＬＣの設定は以下のとおりである。
１）サンプルトレイ温度：４℃；
２）カラムオーブン温度：３０℃；
３）部分ループ注入；
４）ＵＶ検出：２１５ｎｍおよび２８０ｎｍ；
５）ＨＰＬＣ勾配：

質量分析計の設定は以下のとおりである。
１）ＬＴＱへの流動 〜４００ｎｌ／分（Ａｄｖｉｏｎ Ｔｒｉｖｅｒｓａ Ｎａｎｏｍａｔｅを経由）；
２）キャピラリー温度：１１５℃、キャピラリー電圧：５ｖ；チューブレンズ電圧：７７ｖ；
３）中性喪失トップ３〜ＭＳ４（９０分間）にスキャン設定。

質量検出器からの基準ピークトレースを調べることにより、クロマトグラムをプロットする。Ｓｅｑｕｅｓｔソフトウェアおよび手動検査によりｈＥＰＯ配列を検索することにより、各ピークにおいて存在するペプチドを特定する。

ＰＥＧ化に使用したＰＥＧ分子および方法の説明
ｈＥＰＯのＰＥＧ化には、以下のＰＥＧ分子を使用した：Ｄｏｗ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）の４０ｋＤａ 直鎖状メトキシポリ（エチレングリコール）プロプリオンアルデヒド、Ｄｏｗ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）の６０ｋＤａ 直鎖状メトキシポリ（エチレングリコール）プロプリオンアルデヒド、ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）の３０ｋＤａ 直鎖状α−メチル−ω−（３−オキソプロポキシ）、ポリオキシエチレン、ＮＯＦ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの４５ｋＤａ 分枝２，３−ビス（メチルポリオキシエチレン−オキシ）−１−［（３−オキソプロピル）ポリオキシエチレン−オキシ］−プロパン。

種々の活性化ＰＥＧ（３０ｋＤａ、４０ｋＤａもしくは６０ｋＤａ 直鎖状ＰＥＧまたは４５ｋＤａ 分枝ＰＥＧ）を、５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．２）中のｈＥＰＯサンプル（濃度：１ｍｇ／ｍＬ）に、１：１０のタンパク質：ＰＥＧ比で加えた。一晩攪拌しながら１０ｍＭ ナトリウムシアノボロヒドリドを該反応混合物に加えることにより、該反応を還元条件下、室温で行った。１０ｍＭ ＴＲＩＳを加えることにより、該反応を停止した。モノ−ＰＥＧ化ｈＥＰＯを、ＳＰセファロースＦａｓｔ Ｆｌｏｗカラムを使用して精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図５）。

更なる最適化が望ましい場合には、以下のパラメーターを検討することが可能である。
１）種々のｐＨ範囲（ｐＨ４．０、４．５、５．２および６．０）。
２）ｈＥＰＯ：ｍＰＥＧ−アルデヒドの種々のモル比（１：５、１：１０、１：２０）。
３）室温対４℃。
４）種々のタイプのＰＥＧ。

ＰＥＧ化Ｅｐｏ産物の特徴づけ
実施例４に記載されているとおり、４つの異なるＰＥＧ化ＥＰＯ産物をＳＥＣ ＨＰＬＣにより分析した（図６）。Ｎ−結合グリカン構造の定量のために（図７）、ＰＮＧアーゼＦ（Ｃｈｏｉ ＰＮＡＳ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ ２００３ Ｓｃｉｅｎｃｅ）での処理によりＰＥＧ化ＥＰＯからＮ−結合グリカンを遊離させ、市販の２−ＡＢ標識キットを使用して２−アミノベンジジン（２−ＡＢ）で標識した。Ｐｒｅｖａｉｌ ＣＨＯ ＥＳ，５ミクロンビーズ，アミノ結合シリカカラム（３０℃に維持）を使用して、ＨＰＬＣを行った。溶出プロファイルは以下のとおりである（溶媒Ａ：１００％ アセトニトリル、溶媒Ｂ： ５０ｍＭ ギ酸アンモニウム（ｐＨ４．４））。

図７は、試験したサンプル中のＰＥＧ化ＥＰＯ産物の約７０〜７４％がビシアル酸化（二シアル酸化）されていることを示している（各パネルにおける最終ピークを参照されたい）。

製剤
ＰＥＧ−ＥＰＯの代表的な製剤は２０ｍＭ リン酸ナトリウム、１４０ｍＭ 塩化ナトリウム、０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ６．０）（これは同様の市販エリスロポエチン製品に基づく）でありうる。ＰＥＧ−ＥＰＯは、複数の効力の無菌透明液として注射用に製剤化され、２５〜５００μｇ／ｍＬの濃度で単一用量のガラス・バイアル（ｖｉａｌｓｒａｎｇｉｎｇ）に分注されうる。これらの濃度は低い範囲内であるため、用量の減少を引き起こしうる、バイアルへのタンパク質吸着に関する懸念がある。吸着を最小にするために、通常、製剤に界面活性剤（すなわち、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０）を一定濃度で加える。界面活性剤の必要性は、製剤開発中に行った物質の適合性研究に基づくものである。

市販のＥＰＯの他の製剤化
エリスロポエチンの市販製剤が公知であり、本発明のエリスロポエチンでの使用に適合化されうる。市販ＥＰＯ製剤の幾つかの具体例を以下に示す。

ＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標）：ポリソルベート溶液：各１ｍＬは０．０５ｍｇのポリソルベート８０を含有し、注射用水（ＵＳＰ）（１ｍＬに調整）中、２．１２ｍｇのリン酸第一ナトリウム一水和物、０．６６ｍｇのリン酸第二ナトリウム無水物および８．１８ｍｇの塩化ナトリウムと共にｐＨ６．２±０．２で製剤化されている。

アルブミン溶液：各１ｍＬは２．５ｍｇのアルブミン（ヒト）を含有し、注射用水（ＵＳＰ）（１ｍＬに調整）中、２．２３ｍｇのリン酸第一ナトリウム一水和物、０．５３ｍｇのリン酸第二ナトリウム無水物および８．１８ｍｇの塩化ナトリウムと共にｐＨ６．０±０．３で製剤化されている。

ＥＰＯＧＥＮ（登録商標）は、等張塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム緩衝溶液または塩化ナトリウム／リン酸ナトリウム緩衝溶液中の無菌無色液として静脈内（ＩＶ）または皮下（ＳＣ）投与用に製剤化されている。

１回量（単一用量）保存剤非含有バイアル：溶液の各１ｍＬは、注射用水（ＵＳＰ）（ｐＨ６．９±０．３）中、２０００、３０００、４０００または１０，０００単位のエポエチン（Ｅｐｏｅｔｉｎ）アルファ、２．５ｍｇのアルブミン（ヒト）、５．８ｍｇのクエン酸ナトリウム、５．８ｍｇの塩化ナトリウムおよび０．０６ｍｇのクエン酸を含有する。この製剤は保存剤を含有しない。保存処理バイアルは１％ ベンジルアルコールを含有する。

ＰＥＧ−ＥＰＯのインビボ分析
マウスにおけるインビボ研究：
マウス効力研究：二分枝末端シアル酸化（＞７０％）ヒトＥＰＯを産生するよう操作されたピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ３１５９において産生された４つの異なる形態のＰＥＧ−ＥＰＯを市販のＡｒａｎｅｓｐと、それらのヘマトクリット上昇能に関して比較した。Ｃ５７Ｂ６マウス（研究開始時に７週齢、体重１８〜２０ｇ、処理群当たり雄３匹／雌３匹）を入手し、１週間馴化させた。各動物に関してベースラインを得るために、投与前に、ヘマトクリット値を測定した。動物を以下の６つの群に分けた。
（１）ビヒクル（食塩水＋１００μｇ／ｍｌ ｒＨＳＡ）；
（２）２．５μｇ／ｋｇ／用量のＡＲＡＮＥＳＰ（ダルベポエチン、アルブミン非含有）；
（３）２．５μｇ／ｋｇ／用量のＰＥＧ−ＥＰＯ［４０ｋＤａ直鎖状ＤＯＷ］；
（４）２．５μｇ／ｋｇ／用量のＰＥＧ−ＥＰＯ［６０ｋＤａ直鎖状ＤＯＷ］；
（５）２．５μｇ／ｋｇ／用量のＰＥＧ−ＥＰＯ［３０ｋＤａ直鎖状ＮＯＦ］；
（６）２．５μｇ／ｋｇ／用量のＰＥＧ−ＥＰＯ［４５ｋＤａ分枝状ＮＯＦ］。

週２回（月曜および木曜）、合計５回の腹腔内注射を動物に行った（２．５週間後に投与を中止した）。該マウスから毎週（月曜）採血し、ヘマトクリット値を測定した。本発明のＰＥＧ−ＥＰＯコンジュゲートを注射したマウスは、市販のＡｒａｎｅｓｐと比較してヘマトクリットの上昇を示している。データを図８に示す。

動物Ｃ５７ブラック（黒色）マウス（７週齢；〜２０ｇ；１群当たり雄３匹／雌３匹）に２．５μｇ／ｋｇ／用量の組換えヒトエポ（ｅｐｏ）を毎週１回投与する第２の研究を行った。該研究期間中、毎週木曜に注射を行い、毎週月曜に該動物から採血した。該研究は、４種類のＰＥＧ−ＥＰＯコンジュゲートおよびＡｒａｎｅｓｐ（ＮＥＳＰ）の毎週１回の腹腔内投与の、ヘマトクリットレベルに対する効果を評価するものであった。データを図１３に示す。

免疫原性研究：
ＰＥＧ−ＥＰＯの免疫原性を調べるために、週２回、２週間にわたり、アカゲザルを皮下投与することが可能である。ＥＬＩＳＡに基づく方法は、アカゲザルにおける、そして次いでヒト血液における組換えエリスロポエチンに対する抗体を特異的に特定し、測定することが可能である。ＰＥＧ−ＥＰＯの皮下投与の後、血清サンプルを抗エリスロポエチン抗体の生成に関して経時的にモニターすることが可能である。また、潜在的な抗体応答を、同時にモニターされうる薬物動態学的および薬動力学的パラメーターに相関させることが可能である。

配列の簡単な説明
配列番号１：ヒトエリスロポエチンをコードするＤＮＡ配列。
配列番号２：ヒトエリスロポエチンをコードするアミノ酸配列。

Claims (23)

1. エリスロポエチンに結合した複数の二分枝Ｎ−結合グリカンを含んでなる、エリスロポエチンタンパク質の組成物であって、前記の複数のＮ−結合グリカンが、Ｎ−アセチルグルコサミン_２マンノース_３N-アセチルグルコサミン_２ガラクトース_２Ｎ−アセチルノイラミン酸_２（ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｇａｌ_２ＮＡＮＡ_２）の構造を有するＮ−結合グリカンを２５モル％より多く含み、ポリエチレングリコール部分が該エリスロポエチンタンパク質の少なくとも５０％のＮ末端アミノ酸残基に結合しており、当該結合がアミン結合である、前記組成物。
2. 前記の複数のＮ−結合グリカンの５０モル％より多くがＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｇａｌ_２ＮＡＮＡ_２からなる、請求項１に記載の組成物。
3. 前記の複数のＮ−結合グリカンの７５モル％より多くがＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｇａｌ_２ＮＡＮＡ_２からなる、請求項１に記載の組成物。
4. 該ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｇａｌ_２ＮＡＮＡ_２ Ｎ−グリカンが、前記の複数のＮ−結合グリカンのうちの次に最も優勢なＮ−結合グリカン構造より５モル％〜８０モル％多いレベルで存在する、請求項１に記載の組成物。
5. 該ポリエチレングリコール部分が２０ｋＤ〜６０ｋＤの分子量を有する、請求項１に記載の組成物。
6. 該ポリエチレングリコール部分が３０ｋＤ〜４０ｋＤの分子量を有する、請求項１に記載の組成物。
7. 該ポリエチレングリコール部分が直鎖状である、請求項１に記載の組成物。
8. 請求項１、２、３、４、５、６または７のいずれか１項に記載の組成物と医薬上許容される希釈剤とを含んでなる医薬組成物。
9. 請求項１、２、３、４、５、６または７のいずれか１項に記載の組成物を含んでなる、哺乳動物におけるヘマトクリットを増加させるための医薬組成物。
10. ４〜６週間に１回投与される、請求項９に記載の医薬組成物。
11. ０．０５〜５００μｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される、請求項１０に記載の医薬組成物。
12. 該エリスロポエチンがラクトサミンを含有しない、請求項１に記載の組成物。
13. 前記エリスロポエチンがモノーPEG化されている、請求項１に記載の組成物。
14. 前記エリスロポエチンの哺乳動物への投与によって、当該哺乳動物のヘマトクリットが上昇する、請求項１に記載の組成物。
15. Ｎ−アセチルグルコサミン_２マンノース_３N-アセチルグルコサミン_２ガラクトース_２Ｎ−アセチルノイラミン酸_２（ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｇａｌ_２ＮＡＮＡ_２）の構造を有するＮ−結合グリカンを２５モル％より多く含む予め選択されたＮ−結合グリカンをタンパク質に結合させるピチア・パストリス（Pichia pastoris）宿主細胞を構築し、
    該宿主細胞は、該宿主細胞により認識可能な発現制御配列に機能的に連結されているエリスロポエチンをコードする配列を発現し、
    エリスロポエチンの発現に適した条件下、該形質転換細胞を培養し、
    該エリスロポエチンを単離する工程を含んでなり、前記ピチア・パストリス（Pichia pastoris）宿主細胞がｕｒａ５Δ：：ＭＥＴ１６ ｏｃｈ１Δ：：ｌａｃＺ ｂｍｔ２Δ：：ｌａｃＺ／ＫｌＭＮＮ２−２、ｍｎｎ４Ｌ１Δ：：ｌａｃＺ／ＭｍＳＬＣ３５Ａ３ Δｐｎｏ１Δｍｎｎ４Δ：：ｌａｃＺ ｍｅｔ１６Δ：：ｌａｃＺ、ｈｉｓ１Δ：：ｌａｃＺ／ＳｃＧＡＬ１０／ＸＢ３３／ＤｍＵＧＴ、ａｒｇ１Δ：：ＨＩＳ１／ＫＤ５３／ＴＣ５４、ＡＤＥ１：：ｌａｃＺ／ＮＡ１０／ＭｍＳＬＣ３５Ａ３／ＦＢ８、ＰＲＯ１：：ｌａｃＺ−ＵＲＡ５−ｌａｃＺ／ＴｒＭＤＳ１、ＡＯＸ１：Ｓｈ ｂｌｅ／ＡＯＸ１ｐ／ＳｃαＭＦｐｒｅ−ＧＦＩ８００、ＴＲＰ２：：ＡＲＧ１／ＭｍＣＳＴ／ＨｓＧＮＥ／ＨｓＣＳＳ／ＨｓＳＰＳ／ＭｍＳＴ６−３３である、エリスロポエチン組成物の製造方法。
16. 前記ピチア・パストリスが、ｏｃｈ１、ｂｍｔ２、ｍｎｎ４Ｌ１、ｐｎｏ１及びｍｎｎ４の遺伝子又は遺伝子機能を欠失し、マンノシダーゼ I（Mannosidase I）、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ I（GlcNAc Transferase I）、マンノシダーゼ II（Ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ ＩI）、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ II（GlcNAc Transferase II）、ＵＤＰガラクトーストランスポーター(UDP galactose transporter)、UDP-ガラクトース４-エピメラーゼ(UDP-galactose 4-epimerase)、ガラクトシルトランスフェラーゼ(Galactosyl Transferase)、ＣＭＰ-シアル酸トランスポーター(CMP-sialic acid transporter)、ＵＤＰ-ＧｌｃＮＡｃ ２-エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ(UDP-GlcNAc 2-epimerase/N-acetylmannosamine kinase)、ＣＭＰ-シアル酸シンターゼ(CMP-sialic acid synthase)、Ｎ−アセチルノイラミン酸-９-リン酸シンターゼ(N-acetylneuraminate-9-phosphate synthase)及びシアリルトランスフェラーゼ(Sialyl transferase)を発現する、請求項１５に記載の製造方法。
17. 前記の予め選択されたＮ−結合グリカンの５０モル％より多くがＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｇａｌ_２ＮＡＮＡ_２からなる、請求項１５に記載の製造方法。
18. 前記の予め選択されたＮ−結合グリカンの７５モル％より多くがＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｇａｌ_２ＮＡＮＡ_２からなる、請求項１５に記載の製造方法。
19. 該ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｇａｌ_２ＮＡＮＡ_２ Ｎ−グリカンが、前記の予め選択されたＮ−結合グリカンのうちの次に最も優勢なＮ−結合グリカン構造より５モル％〜８０モル％多いレベルで存在する、請求項１５に記載の製造方法。
20. ポリエチレングリコール部分が該エリスロポエチンタンパク質の少なくとも５０％のＮ末端アミノ酸残基に結合しており、当該結合がアミン結合である、請求項１５に記載の製造方法。
21. 該ポリエチレングリコール部分が２０ｋＤ〜６０ｋＤの分子量を有する、請求項２０に記載の製造方法。
22. 該ポリエチレングリコール部分が３０ｋＤ〜４０ｋＤの分子量を有する、請求項２０に記載の製造方法。
23. 該ポリエチレングリコール部分が直鎖状である、請求項２０に記載の製造方法。

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