CN101535340B

CN101535340B - 促红细胞生成素组合物

Info

Publication number: CN101535340B
Application number: CN200780027322.3A
Authority: CN
Inventors: N·塞舒拉曼; J·内特; R·戴维森
Original assignee: Glycofi Inc
Current assignee: Glycofi Inc
Priority date: 2006-05-19
Filing date: 2007-05-18
Publication date: 2013-05-01
Anticipated expiration: 2027-05-18
Also published as: WO2007136865A3; BRPI0711898A2; JP5424871B2; EP2027271A2; WO2007136865A2; JP2009537144A; CN101535340A; CA2651456A1; US20090124000A1; US8741633B2; EP2027271A4

Abstract

本发明提供用于制备促红细胞生成素蛋白组合物的方法和材料，其中所述组合物包含作为主要N-糖形的预选N-联糖基化型。

Description

促红细胞生成素组合物

本申请要求2006年5月19日提交的美国临时申请60/801,688和2007年3月07日提交的美国临时申请60/905,770的权益。

发明领域

本发明涉及分子生物学领域，详细地讲，本发明提供用于制备具有所需N-糖形的PEG基化促红细胞生成素的均质组合物的材料和方法。

发明背景

重组体糖蛋白的生产已经是生物技术工业很活跃的一个领域。重组体糖蛋白的一个缺点已经是通常使用的细胞宿主例如CHO细胞所产生的糖基化的不均一性。相反，本发明提供已经被工程改造成生产包含预选的所需N-聚糖结构的重组促红细胞生成素的低等真核宿主细胞。因此生产的重组促红细胞生成素的组合物在糖形的均匀度方面显著大于在CHO细胞中生产的那些促红细胞生成素。

促红细胞生成素是已经广泛地用于需要增加红细胞生成的治疗适应症包括肾衰或化学治疗引起的贫血的蛋白质激素。因为对安全和有效的促红细胞生成素的巨大需求，重组人促红细胞生成素已经成为销售量最大的重组人蛋白质产品。

天然人促红细胞生成素包含4条糖链(3个N-联的和1个O-联的)。为了使体内效能最大化，蛋白质需要三天线的和四天线的唾液酸化的N-聚糖。然而，体外受体结合和基于细胞的分析测定显示：具有多支化唾液酸化聚糖的促红细胞生成素和具有附加的N-糖基化位点的促红细胞生成素相对于酶促去糖基化的促红细胞生成素呈现减少的结合。该矛盾可以通过认为从循环系统清除解释。四天线唾液酸化促红细胞生成素和达贝泊汀(darbepoetin)呈现比双天线唾液酸化的促红细胞生成素和非糖基化的促红细胞生成素更长的血清半寿期。(促红细胞生成素的主要清除途径是经过肾滤过，通过结合至脱唾液酸糖蛋白受体，内皮细胞摄取和通过促红细胞生成素受体被靶细胞内在化。)

目前推向市场的重组促红细胞生成素形式包括具有三个四天线N-聚糖结构的Epogen、和Aranesp、经工程改造的包含总共五个四天线N-聚糖结构的两个附加N-糖基化位点的促红细胞生成素。添加这些额外的N-聚糖连接位点已经导致更长的血清半寿期，并因此提高激素的体内活性。这些促红细胞生成素由CHO细胞生产并与N-聚糖结构的不均一混合物分泌。工艺过程开发用于富集四天线的唾液酸化的糖形(见图1)。

过去努力改善促红细胞生成素的性质已经包括努力改变糖基化例如通过增加糖基化位点，以及努力使蛋白质与聚合物例如聚乙二醇缀合。参见，例如EP 0640619；WO 00/32772、WO 01/02017和WO03/029291。尽管有这些尝试，仍然需要具有改善的性质的重组促红细胞生成素，例如更易于给药；给药方案严格性更低；改善的药代动力学和生物利用度和更低成本制备重组促红细胞生成素。详细地讲，用于从低等真核细胞产生具有这些性质的促红细胞生成素组合物的增强方法和材料仍是难以捉摸和所需目标。

发明概述

因此，本发明提供用于制备能够表达具有特异定向N-糖基化作用的重组人促红细胞生成素的载体和宿主细胞、以及经化学修饰例如通过PEG基化化学修饰的重组工程改造的糖蛋白组合物的方法和材料。

本发明提供低等真核生物，尤其是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的工程菌株，该工程菌株能够产生具有双天线N-聚糖结构的完全唾液酸化的重组体EPO。

本发明也提供具有双天线聚糖的PEG基化的EPO。这些重组糖蛋白组合物呈现先前在体外所见的增强的体内生物活性，同时维持增加的血清半寿期。

因此，本发明提供用于制备PEG基化的促红细胞生成素蛋白组合物的方法和材料，所述组合物包含多种N-联糖形，所述N-联糖形包含连接至其中的至少一种N-联聚糖。在优选的实施方案中，该组合物包含多种N-联聚糖，其中大于25摩尔百分率的所述多种N-联聚糖基本上由选自以下的所需N-联聚糖结构组成：

GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂Gal₂NANA₂；GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂Gal₂；GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂；

GlcNAc₂Man₃；GlcNAc₂Man₅GlcNAcGalNANA；GlcNAc₂Man₅GlcNAcGal；

GlcNAc₂Man₅GlcNAc；和GlcNAc₂Man₅。

在还优选的实施方案中，所需N-联聚糖结构包含大于50摩尔百分率；75摩尔百分率或80摩尔百分率的所述N-联聚糖结构。

在一个优选的实施方案中，所需N-联聚糖结构基本上由GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂Gal₂NANA₂组成。

在还优选的实施方案中，PEG基化的促红细胞生成素蛋白组合物包含多种糖形，各糖形包含连接至其中的至少一种N-联聚糖，其中糖蛋白组合物因此包含多种N-联聚糖，其中大于25摩尔百分率的所述多种N-联聚糖基本上由GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂Gal₂NANA₂组成。

在还优选的实施方案中，本发明包含组合物，其中大于50摩尔百分率；75摩尔百分率或80摩尔百分率的所述多种N-联聚糖基本上由GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂Gal₂NANA₂组成。

在还优选的实施方案中，本发明包含PEG基化的促红细胞生成素的组合物，其中GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂Gal₂NANA₂ N-联聚糖以多于所述多种N-联聚糖的下一种最主要的N-联聚糖结构约5摩尔百分率-约80摩尔百分率的水平存在。

本发明的另一优选的糖形基本上由GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂Gal₂的结构组成。在优选的实施方案中，PEG基化的促红细胞生成素蛋白组合物包含多种糖形，各糖形包含连接至其中的至少一种N-联聚糖，其中糖蛋白组合物因此包含多种N-联聚糖，其中大于25摩尔百分率的所述多种N-联聚糖基本上由GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂Gal₂组成。

在还优选的实施方案中，本发明包含组合物，其中大于50摩尔百分率、大于75摩尔百分率的所述多种N-联聚糖基本上由GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂Gal₂组成。

在还优选的实施方案中，本发明包含PEG基化的促红细胞生成素的组合物，其中GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂Gal₂ N-联聚糖以多于所述多种N-联聚糖的下一个最主要的N-联聚糖结构约5摩尔百分率-约80摩尔百分率的水平存在。

在本发明的优选的组合物中，聚乙二醇部分和促红细胞生成素蛋白的N-末端氨基酸残基可直接连接或经由接头连接。

在本发明的优选实施方案中，聚乙二醇部分的分子量可为约5-约100kD；更优选约20kD-约60kD；约30kD-约40kD的重量。

本发明还提供利用重组促红细胞生成素的治疗方法。在优选的实施方案中，将重组促红细胞生成素给予需要治疗的病人，以减轻贫血。在还优选的实施方案中，治疗患者的由肾衰、化疗或癌症引起的贫血。

附图简述

图1A-1D表明分泌人重组体EPO的巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)菌株YGLY3159的分步构建，在该人重组体EPO上主要的N-聚糖是表示为：GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂Gal₂NANA₂的完全唾液酸化的聚糖。

图2分图A-O显示用于产生YGLY3159的在图1中涉及的质粒载体的图。

图3表明用于纯化人EPO的三步色谱分离过程。

图4A-4D通过以下显示纯化的EPO的特征，分图4A)：显示样品总纯度的SDS-PAGE；分图4B)：显示一致单峰的分子排阻色谱法(SEC-HPLC)，该一致单峰证明缺乏降解和缺乏聚集；分图4C)：证明EPO的完整性的反相(RP)-HPLC；和分图4D)：证明PNG酶F(PNGase F)处理的EPO的产品质量的LC-MS。

图5显示结合至30kDa、40kDa、或60kDa线型PEG或45kDa支化PEG的纯化hEPO样品的SDS PAGE分析。

图6显示四个不同的PEG基化的EPO产品的分子排阻色谱(SECHPLC)分析。

图7显示从用PNG酶F(PNGase F)处理的和用2-氨基联苯胺(2-AB)标记的非PEG基化的EPO和四个不同的PEG基化的EPO产品释放的N-联聚糖的高效液相色谱。色谱证明双唾液酸化的糖形GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂Gal₂NANA₂的优势。

图8显示：用四种不同模型的PEG-EPO结合物注射的小鼠显示血细胞比容增加，超过市购的Aranesp。C57B6小鼠每周两次给予剂量，共五次注射(在2.5周之后停止给剂量)。将小鼠每周放血，测定血细胞比容值。

图9A-9B显示可以依照本发明生产的促红细胞生成素的优选的N-联的糖形。

图10显示重组体人EPO的纯化方案的概况。

图11显示纯化的重组体人EPO的考马斯染色的凝胶。

图12显示PEG基化化学物的图示。取自Dow Pharmawww.sda.com。

图13显示在小鼠中每周一次PEG-EPO剂量对相对血细胞比容增加的影响。

序列简述

序列ID NO：1编码人促红细胞生成素的DNA序列。

序列ID NO：2编码人促红细胞生成素的氨基酸序列。

发明详述

除非本文另有定义，与本发明联合使用的科学与技术术语和短语将具有通常被本领域的普通技术人员所理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数的术语将包括复数而复数的术语将包括单数。一般来说，与以下技术联合使用的命名是在本领域中熟知的和通常使用的那些命名：生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学和蛋白质与核酸化学的技术和本文所述的杂交技术。通常依照在本领域中熟知的和如在本说明书全文中引用和讨论的各种一般的与更特殊的参考文献中所述的常规方法，来执行本发明的方法和技术，除非另有说明。见，例如，Sambrook等.Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.(1989)；Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing Associates(1992，和2002的增刊)；Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(1990)；Taylor和Drickamer，Introduction to Glycobiology，Oxford Univ.Press(2003)；WorthingtonEnzyme Manual，Worthington Biochemical Corp.，Freehold，NJ；Handbook of Biochemistry：Section A Proteins，第I卷，CRC Press(1976)；Handbook of Biochemistry：Section A Proteins，第II卷，CRC Press(1976)；Essentials of Glycobiology，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1999)。

本文所述的所有公开、专利和其它参考文献均通过整体引用而结合到本文中。

除非另有说明，以下术语将理解为具有以下含义：

本文所用术语术语″N-聚糖″和″糖形″可互换地使用，指N-联寡糖，例如，通过天冬酰胺-N-乙酰葡糖胺连接至多肽的天冬酰胺残基而被连接的N-联寡糖。N-联糖蛋白包含连接至蛋白质中天冬酰胺残基的酰胺氮的N-乙酰葡糖胺残基。在糖蛋白上发现的主要的糖是葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸(例如，N-乙酰神经氨酸(NANA))。糖基的加工与翻译同时发生在ER的内腔中，而对于N-联的糖蛋白而言在高尔基体中继续进行翻译后加工。

N-聚糖具有共同的Man₃GlcNAc₂戊多糖核心(″Man″指甘露糖；″Glc″指葡萄糖；和″NAc″指N-乙酰基；GlcNAc指N-乙酰葡糖胺)。就支化(天线)的数目而论，各N-聚糖有所不同，该支化包含添加至Man₃GlcNAc₂(″Man3″)核心结构的外周糖(例如，GlcNAc、半乳糖、岩藻糖和唾液酸)，所述核心结构也称为″三甘露糖核心″、″五糖核心″或″少甘露糖核心″。N-聚糖根据其支化成份分类(例如，高甘露糖、复杂或杂合)。″高甘露糖″型N-聚糖具有五个或更多个甘露糖残基。″复杂″型N-聚糖通常具有连接至1，3甘露糖臂的至少一个GlcNAc和连接至″三甘露糖″核心1，6甘露糖臂的至少一个GlcNAc。复杂N-聚糖也可以具有任选用唾液酸或衍生物(例如，″NANA″或″NeuAc″，其中″Neu″指神经氨酸而″Ac″指乙酰基)修饰的半乳糖(″Gal″)或N-乙酰半乳糖胺(″GalNAc″)残基。复杂N-聚糖也可以具有包含″二等分″GlcNAc和核心岩藻糖(″Fuc″)的链内取代。复杂N-聚糖也可以在″三甘露糖核心″上具有多个天线，经常被称为″多天线聚糖″。″杂合″N-聚糖在三甘露糖核心1，3甘露糖臂的末端上具有至少一个GlcNAc和在三甘露糖核心的1，6甘露糖臂上具有零或多个甘露糖。各种N-聚糖也被称为″糖形″。

本文使用的缩写是在本领域中常用的缩写，参见，例如，以上的糖的缩写。其它常用的缩写包括″PNG酶″、或″聚糖酶″或″葡萄糖苷酶″，它们均指肽N-糖苷酶F(EC 3.2.2.18)。

″分离的″、″纯化的″或″基本上纯化的″核酸或多核苷酸(例如，RNA、DNA或混合的聚合体)是从其天然宿主细胞中与天然多肽天然相伴的其它细胞成分中基本上分离的核酸或多核苷酸，所述细胞成分例如为与其自然缔合的核糖体、聚合酶和基因组序列。该术语包含以下的核酸或多核苷酸：(1)已经从它的天然存在的环境中移出，(2)在自然界中不与在其中发现″分离的多核苷酸″的所有或部分多核苷酸缔合，(3)可操作地连接至在自然界中不与其连接的多核苷酸，或(4)自然界中不存在。术语″分离的″、″纯化的″或″基本上纯化的″也可以用于指重组体或克隆DNA分离物、化学合成的多核苷酸类似物、或由异源系统生物合成的多核苷酸类似物。

然而，″分离的″不必要求：上述核酸或多核苷酸自身已经从其自然环境中物理上地移出。例如，假如异源序列在邻近内源性核酸序列的位置，致使该内源性核酸序列的表达被改变，则在生物体基因组中的内源性核酸序列在本文中被认为是″分离的″。在该上下文中，异源序列为非天然接近内源性核酸序列的序列，不管该异源序列自身是内源性的(起源于相同的宿主细胞或其后代)或外源性的(起源于不同的宿主细胞或其后代)。经由实施例，启动子序列可以置换宿主细胞基因组中基因的天然启动子(例如，通过同源重组)，致使该基因具有改变的表达方式。该基因现在将变成″分离的″，因为它从其天然侧翼的至少一些序列中分离出来。

假如核酸包含对基因组中相应核酸而言非天然的任何修饰，那么它也被认为是″分离的″。例如，假如内源性编码序列包含人工导入的插入、缺失或点突变(例如通过人为介入)，那么它被认为是″分离的″。″分离的核酸″也包括在异源位点整合入宿主细胞染色体中的核酸和作为附加体存在的核酸结构。此外，″分离的核酸″当由重组技术产生时，可以基本上不含其它细胞物质或基本上不含培养基，或当被化学合成时，基本上不含化学前体或其它化学试剂。

指核酸序列的本文所用短语″简并变体″包括以下核酸序列：可以依照遗传密码翻译，以提供与从所指核酸序列翻译的氨基酸序列同一的氨基酸序列的核酸序列。术语″简并寡核苷酸″或″简并引物″用于表示能够与以下靶核酸序列杂交的寡核苷酸：在序列中不必同一，但与一个或多个特定区段内彼此同源的靶核苷酸序列。

在核酸序列的上下文中，术语″百分比序列同一性″或″同一的″指：当按最大对应性进行比对时相同的两个序列中的残基。序列同一性比较的长度可以是至少约9个核苷酸，通常至少约20个核苷酸，更通常至少约24个核苷酸，典型地至少约28个核苷酸，更典型地至少约32个核苷酸，和优选至少约36个或更多个核苷酸。有本领域已知的许多不同的算法可以用于测量核苷酸序列的同一性。例如，可以使用FASTA、Gap或Bestfit(是在Wisconsin Package第10.0版，Genetics ComputerGroup(GCG)，Madison，Wisconsin中的程序)来比较多核苷酸序列。FASTA提供查询序列(query sequence)和查找序列(search sequence)之间最佳重叠区域的比对和百分比序列同一性。Pearson，MethodsEnzymol.183：63-98(1990)(通过整体引用结合到本文中)。例如，可以使用FASTA用其缺省参数(字长(Word size)为6和用于计分矩阵的NOPAM因子)或使用Gap用如在GCG第6.1版中所提供的其缺省参数，来测定核酸序列之间的百分比序列同一性，该FASTA和Gap通过引用结合到本文中。或者，可以使用以下计算机程序来比较序列：BLAST(Altschul等，J.MoI.Biol.215：403-410(1990)；Gish和States.NatureGenet.3：266-272(1993)；Madden等，Meth.Enzymol.266：131-141(1996)；Altschul等，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997)；Zhang和Madden，Genome Res.7：649-656(1997))，尤其是blastp或tblastn(Altschul等，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997))。

当涉及核酸或其片段时，术语″基本上同源″或″基本上类似″指：当任选用另一核酸(或其互补链)与合适的核苷酸插入或缺失进行比对时，根据任何已知的序列同一性算法进行测量，在至少约50％，更优选60％的核苷酸碱基，通常至少约70％，更通常至少约80％，优选至少约90％，和最优选至少约95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基中存在核苷酸序列同一性，所述算法例如如上所述的FASTA、BLAST或Gap。

或者，当核酸或其片段在严格杂交条件下与另一核酸，与另一核酸的链，或与其互补链杂交时，存在基本上同源或类似。在核酸杂交实验的上下文中，″严格杂交条件″和″严格漂洗条件″取决于许多不同的物理参数。核酸杂交将受这样的条件如盐浓度、温度、溶剂、杂交种类的碱基组成、互补区域的长度、和在杂交的核酸之间核苷酸碱基错配的数量影响，正如本领域的技术人员所容易理解的。本领域的普通技术人员知道如何改变这些参数，以完成特定的杂交严格性。

一般来说，为了在一系列特定条件下实现特异性DNA杂交，″严格杂交″在低于热熔点(T_m)约25℃下进行。为了在一系列特定条件下实现特异性DNA杂交，″严格漂洗″在比T_m低约5℃的温度下进行。T_m为50％的靶序列与完全配对的探针杂交时的温度。见Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)，第9.51页，该文献通过引用结合到本文中。为了本文的目的，对于溶液相的杂交而言，″严格条件″定义为在6X SSC(其中20X SSC包含3.0M NaCl和0.3M柠檬酸钠)，1％SDS中在65℃下持续8-12小时的水性杂交(即，不含甲酰胺)，接着在0.2X SSC，0.1％SDS中在65℃下持续20分钟漂洗两次。为技术人员所了解的是：65℃杂交将以不同的速率进行，取决于许多因素包括杂交序列的长度和百分比同一性。

当应用至核酸序列时，术语″突变的″指：可以与参考核酸序列比较而插入、缺失或改变核酸序列中的核苷酸。可以在基因座进行单个变更(点突变)或可以在单个基因座插入、缺失或改变多个核苷酸。另外，可以在核酸序列内任何数目的基因座中进行一个或多个变更。可以通过本领域已知的任何方法使核酸序列突变，所述方法包括但不限于以下诱变技术：例如″易错PCR″(在低DNA聚合酶拷贝保真度的条件下执行PCR，致使沿着PCR产物全长获得高比例点突变的方法；参见例如，Leung等，Technique，1：11-15(1989)和Caldwell和Joyce，PCRMethods Applic.2：28-33(1992))；和″寡核苷酸定向突变″(能够在任何目标克隆DNA区段中产生位点特异性突变的方法；参见例如，Reidhaar-Olson和Sauer，Science 241：53-57(1988))。

本文所用术语″载体″意指：能够将另一核酸转运至已经连入宿主细胞内的核酸的核酸分子。载体的一个类型是″质粒″，指可以连入另外的DNA区段的环状双链DNA环。其它载体包括粘粒、细菌的人造染色体(BAC)和酵母人造染色体(YAC)。载体的另一个类型是病毒载体，其中附加的DNA片段可以连接入病毒基因组内(在下面更详细地讨论)。某些载体能够在导入该载体的宿主细胞中自主复制(例如，具有在宿主细胞内起作用的复制起始区的载体)。其它载体可以在导入宿主细胞时被整合入宿主细胞的基因组内，并因此连同宿主基因组一起复制。此外，某些优选的载体能够引导它们经操作所连接的基因的表达。这样的载体在本文中称为″重组表达载体″(或简单地称为″表达载体″)。

本文所用术语″目标序列″或″目标基因″指：典型地编码在宿主细胞内非正常表达的目标蛋白或目标多肽的核酸序列。目标序列或目标基因包括与宿主细胞异源的基因和序列。目标蛋白和目标多肽也常常与宿主细胞异源。本文所公开的方法允许一种或多种目标序列或目标基因被稳定地整合入宿主细胞的基因组内。目标序列的非限制性实例包括编码具有酶活性的一种或多种目标多肽，例如影响宿主中N-聚糖合成的酶例如甘露糖基转移酶、N-乙酰葡糖胺基转移酶、UDP-N-乙酰葡糖胺转运蛋白、半乳糖基转移酶、UDP-N-乙酰半乳糖基转移酶、唾液酸转移酶和岩藻糖基转移酶，的序列。

术语″标记序列″或″标记基因″指能够表达以下活性的核酸序列：为序列在宿主细胞中存在或否而允许阳性或阴性选择的活性。例如，巴斯德毕赤酵母URA5基因是标记基因，因为可以通过含该基因的细胞在缺乏尿嘧啶下生长的能力来选择它的存在。也可以通过含该基因的细胞在5-FOA下不能生长来反向选择它的存在。标记序列或基因不必需要显示阳性的和阴性的选择能力。来自巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)的标记序列或基因的非限制性实例包括ADE1、ARG4、HIS4和URA3。对于抗生素抗性标记基因，卡那霉素、新霉素、遗传霉素(或G418)、巴龙霉素和潮霉素抗性基因通常用于允许在这些抗生素的存在下生长。

″操作连接的″表达控制序列指以下连接：其中表达控制序列与目标基因邻接以控制目标基因，以及表达控制序列反向或在一段距离处起作用以控制目标基因的表达控制序列的连接。

本文所用术语″表达控制序列″指影响它们经操作所连接的编码序列表达的多核苷酸序列。表达控制序列是控制核酸序列的转录、转录后事件和翻译的序列。表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子、和增强子序列；有效的RNA加工信号例如剪接和多腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列(例如，核蛋白体结合位点)；提高蛋白质稳定性的序列；和当需要时，提高蛋白质分泌的序列。这样的控制序列的性质根据宿主生物体而不同；在原核生物中，这样的控制序列一般包括启动子、核糖体结合位点、和转录终止序列。术语″控制序列″有意至少包括表达所必需存在的所有成分，和也可以包括其存在是有益的附加成分，例如，前导序列和融合伙伴序列。

本文所用术语″重组宿主细胞″(″表达宿主细胞″、″表达宿主体系″、″表达体系″或简单地″宿主细胞″)意指：重组载体已经被导入其中的细胞。应该理解：这样的术语不仅意指特别的受试细胞而且意指这样的细胞的后代。因为由于突变或环境影响某些修饰可能发生于后代中，所以这样的后代实际上不可能与母细胞同一，但还被包括于如本文所使用的术语″宿主细胞″的范围内。重组宿主细胞可以是生长于培养物中的分离细胞或细胞系，或可以是存在于活组织或活生物体内的细胞。优选的宿主细胞是酵母和真菌。

术语″真核的″指有核细胞或有核生物体，并包括昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞、动物细胞和低等真核细胞。

术语″低等真核细胞″包括酵母、真菌类、领鞭毛虫类、微孢子虫类、囊泡虫类(alveolates)(例如，沟鞭藻类)、原生藻菌类(stramenopiles)(例如，褐藻、原生动物)、红藻植物(例如，红藻)、植物(例如，绿藻、植物细胞、苔藓)和其它的原生生物。

术语″酵母″和″真菌″包括，但不限于：毕赤酵母(Pichia sp.)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、喜海藻糖毕赤酵母(Pichia trehalophila)、Pichia koclamae、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、微小毕赤酵母(Pichia minuta)(Ogataeaminuta、Pichia lindneri)、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、柳毕赤酵母(Pichia salictaria)、Pichia guercuum、皮杰普毕赤酵母(Pichiapijperi)、树干毕赤酵母(Pichia stiptis)、嗜甲毕赤酵母(Pichiamethanolica)、酵母菌(Saccharomyces sp.)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、克鲁维酵母(Kluyveromyces sp.)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、白色念珠菌(Candida albicans)、曲霉(Aspergillus sp.)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、Chrysosporium lucknowense、镰孢(Fusarium sp.)、禾谷镰孢(Fusarium gramineum)、Fusarium venenatum、Physcomitrella patens和粗糙脉胞菌(Neurospora crassa)。

本文所用术语″肽″指短的多肽，例如典型地少于约50个氨基酸长度且更典型地少于约30个氨基酸长度的多肽。本领域的技术人员可以制备衍生物、突变体、类似物和模拟结构并因此模拟生物学功能的模拟物。

术语″多肽″包括天然的和非天然的蛋白质及其片段。多肽可以是单体或聚合体。此外，多肽可以包含各具有一种或多种不同活性的许多不同的域。本领域的技术人员可以制备或分离多肽的突变体、衍生物和类似物。

术语″纯化的″或″分离的″蛋白质或多肽指：由于其衍生的起源或来源(1)不与在其天然状态中伴随它的天然缔合成分缔合，(2)在自然界中未发现以纯化物存在，其中可以就其它细胞成份而论判断纯化物(例如，不含来自同一物种的其它蛋白质)，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)在自然界中不存在(例如，它是在自然界中发现的多肽的片段或它包括在自然界中没有发现的氨基酸类似物或衍生物或不是标准肽键的连接)的蛋白质或多肽。因此，化学合成的多肽或在与多肽所来源的细胞体系不同的细胞体系中合成的多肽将从其天然缔合的成分中“分离”。也可以使用本领域熟知的蛋白纯化技术，通过分离，使多肽或蛋白质基本上不含或纯化天然缔合的成分。如这样所定义的，″分离的″不必要求：这样描述的蛋白质、多肽、肽或寡肽已经从其自然环境中物理地移出。

本文所用术语″多肽片段″指：具有缺失，例如，与全长多肽比较的氨基端和/或羧基端缺失的多肽。在优选的实施方案中，多肽片段是邻接的序列，其中片段的氨基酸序列与在天然存在的序列中的相应位置同一。片段的长度典型地为至少5、6、7、8、9或10个氨基酸，优选至少12、14、16或18个氨基酸，更优选至少20个氨基酸，更优选至少25、30、35、40或45个氨基酸，甚至更优选至少50或60个氨基酸，和甚至更优选至少70个氨基酸。

″修饰的衍生物″指：在一级结构序列中基本上同源的，但包括，例如，在体内的或在体外的化学修饰和生物化学修饰的、或掺入在天然多肽中没有发现的氨基酸的多肽或其片段。这样的修饰包括，例如，乙酰化、羧化、磷酰化、糖基化、泛素化、标记例如用放射性核素、和各种酶的修饰，如将容易被本领域的技术人员所了解的。标记多肽的多种方法和用于此目的的多种取代物或标记物为本领域所熟知，并包括放射性同位素例如¹²⁵I、³²P、³⁵S、和³H，结合至标记的抗配体(例如，抗体)的配体，荧光团，化学发光剂，酶，和可以用作标记的配体的特异性结合配对成员的抗配体。标记物的选择依赖于所需要的灵敏度、与引物结合的容易程度、稳定性要求、和可利用的仪器。用于标记多肽的方法为本领域所熟知。见，例如，Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates(1992，和2002的增刊)(通过引用结合至本文中)。术语″融合蛋白″指：包含与异源氨基酸序列偶联的多肽或片段的多肽。融合蛋白是有用的，因为它们可以被构建以包含来自两个或多个不同蛋白的两个或多个所需功能元件。融合蛋白包含来自多肽的至少10个邻接氨基酸，优选至少20或30个氨基酸，更优选至少40、50或60个氨基酸，和常常更优选至少75、100或125个氨基酸。包括整个目标蛋白的融合体具有特殊的效用。包含于融合蛋白内的异源多肽的长度为至少6个氨基酸，常常至少8个氨基酸，和有用地为至少15、20、和25个氨基酸。融合体还包括较大的多肽、或甚至整个蛋白质，例如绿色荧光蛋白(″GFP″)，具有特殊效用的含发色团的蛋白质。可以通过将编码多肽或其片段的核酸序列在框内与编码不同蛋白质或多肽的核酸序列一起构建，然后表达融合蛋白，来重组产生融合蛋白。或者，可以通过交联多肽或其片段至另一蛋白质，来以化学方法产生融合蛋白。

术语″非肽类似物″指：具有与那些参考多肽类似的性质的化合物。非肽化合物也可以称为″肽模拟物″(“peptide mimetic”or“pepidomimetic”)。见，例如，Jones，Amino Acid and Peptide Synthesis，Oxford University Press(1992)；Jung，Combinatorial Peptide andNonpeptide Libraries：A Handbook，John Wiley(1997)；Bodanszky等，Peptide Chemistry-A Practical Textbook，Springer Verlag(1993)；Synthetic Peptides：A Users Guide，(Grant，编辑，W.H.Freeman and Co.，1992)；Evans等，J.Med.Chem.30：1229(1987)；Fauchere，J.Adv.DrugRes.15：29(1986)；Veber和Freidinger，Trends Neurosci.，8：392-396(1985)；和在以上各出版物中所引用的参考文献，它们通过引用结合到本文中。这样的化合物经常在计算机分子模拟的帮助下开发。在结构上与本发明的有用肽相似的肽模拟物可用于产生同等作用并因此被考虑为本发明的一部分。

氨基酸置换可以包括以下的那些置换：(1)降低对蛋白质水解的敏感性，(2)降低对氧化的敏感性，(3)改变形成蛋白复合体的亲和力，(4)改变结合亲和力或酶活性，和(5)赋予或修饰这样的类似物的其它物理化学或功能性质。

本文所用术语二十种常规氨基酸及其缩写遵循常规用途。见Immunology-A Synthesis(Golub和Gren编辑，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.，第2版，1991)，该文献通过引用结合到本文中。这20种常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)、非天然氨基酸例如α-，α-二置换的氨基酸、N-烷基氨基酸、和其它非常规氨基酸也可能是适合于本发明的多肽的成分。非常规氨基酸的实例包括：4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、N-甲基精氨酸、和其它相似的氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟基脯氨酸)。依照标准用途和惯例，在本文使用的多肽符号中，左手末端对应氨基末端而右手末端对应羧基末端。

假如编码蛋白质的核酸序列具有与编码第二蛋白质的核酸序列相似的序列，那么蛋白质与第二蛋白质具有″同源性″或是″同源的″，。或者，如果两种蛋白质具有″相似的″氨基酸序列，那么该蛋白质与第二蛋白质具有同源性。(因此，术语″同源性蛋白质″定义为指：两种蛋白质具有相似的氨基酸序列)。在优选的实施方案中，同源性蛋白质是对野生型蛋白质呈现至少65％的序列同源性，更优选至少70％的序列同源性的蛋白质。甚至更优选是对野生型蛋白质呈现至少75％、80％、85％或90％序列同源性的同源性蛋白质。在最优选的实施方案中，同源性蛋白质呈现至少95％、98％、99％或99.9％的序列同一性。如在本文中所使用的，在氨基酸序列的两个区域之间的同源性(尤其是就预测的结构相似性而论)解释为意味着功能相似性。

当″同源的″用于指蛋白质或肽时，认为：不具同一性残基位置常常随保守的氨基酸取代而不同。″保守的氨基酸取代″是其中氨基酸残基被具有相似的化学性质(例如，电荷或疏水性)的带侧链(R基团)的另一氨基酸残基取代。一般而言，保守的氨基酸取代将基本上不改变蛋白质的功能性质。在两个或多个氨基酸序列由于保守取代而互不相同的情况下，百分比序列同一性或同源性的程度可向上调节以校正取代的保守性。进行该调节的方法为本领域的技术人员所熟知。见，例如，Pearson，1994，Methods MoI.Biol.24：307-31和25：365-89(通过引用结合到本文中)。

以下6组各包含互相保守取代的氨基酸：1)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)门冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

多肽的序列同源性，也被称为百分比序列同一性，典型地使用序列分析软件测量。见，例如，Genetics Computer Group(GCG)的SequenceAnalysis Software Package，University of Wisconsin BiotechnologyCenter，910 University Avenue，Madison，Wisconsin 53705。蛋白质分析软件使用定位各种取代、缺失和其它修饰，包括保守的氨基酸取代的同源性的测量，来匹配相似的序列。例如，GCG包含程序例如″Gap″和″Bestfit″，该程序可以按缺省参数使用，以测定在接近相关的多肽例如不同种生物体的同源多肽之间的或在野生型蛋白和其突变型蛋白之间的序列同源性或序列同一性。见，例如，GCG第6.1版。

当使特定的多肽序列与含大量来自不同生物体的序列的数据库比较时，优选的算法是计算机程序BLAST(Altschul等，J.MoI.Biol.215：403-410(1990)；Gish和States，Nature Genet.3：266-272(1993)；Madden等，Meth.Enzymol.266：131-141(1996)；Altschul等，NucleicAcids Res.25：3389-3402(1997)；Zhang和Madden，Genome Res.7：649-656(1997))，尤其是blastp或tblastn(Altschul等，Nucleic AcidsRes.25：3389-3402(1997))。

BLASTp的优选参数是：期望值：10(缺省)；过滤器：seg(缺省)；空位开放罚分：11(缺省)；空位扩展罚分：1(缺省)；最大比对：100(缺省)；字长：11(缺省)；描述的序号：100(缺省)；罚分矩阵：BLOWSUM62。

用于同源性比较的多肽序列长度将一般是至少约16个氨基酸残基，通常至少约20个残基，更通常至少约24个残基，典型地至少约28个残基，和优选多于约35个残基。当搜索包含来自大量不同生物体的序列的数据库时，优选比较氨基酸序列。可以通过除blastp以外的本领域已知算法来测量使用氨基酸序列数据库搜索。例如，可以使用GCG第6.1版中的程序FASTA，来比较多肽序列。FASTA提供查询序列和搜索序列之间最佳重叠区域的比对和百分比序列同一性。Pearson，Methods Enzymol.183：63-98(1990)(通过引用结合到本文中)。例如，可以使用如在GCG第6.1版中所提供的FASTA用其缺省参数(字长为2和PAM250计分矩阵)测定氨基酸序列之间的百分比序列同一性，该GCG第6.1版通过引用结合到本文中。

本文所用术语″区域″指：生物分子的一级结构的在物理上的邻接部分。对于蛋白质而言，区域被定义为该蛋白质的氨基酸序列邻接部分。

本文所用术语″结构域″指：提供生物分子已知或未知功能的生物分子结构。结构域可与区域或其部分共延伸；结构域也可以包括生物分子的不同的、非连续的区域。

本文所用术语″分子″指任何化合物，包括但不限于：小分子、肽、蛋白质、糖、核苷酸、核酸、脂质、等，并且这样的化合物可以是天然的或合成的。

本文所用术语″包含″或变体例如″包括″或″含有约″，将被理解为指：包含规定的整体或成组的整体但不排除任何其它的整体或成组的整体。

当提及存在于糖蛋白制剂中的聚糖的″摩尔百分率″时，该术语指：当蛋白质制剂用PNG酶处理时释放的，然后通过不受糖形组合影响的方法定量的，存在于N联寡糖合并中的特定聚糖的摩尔百分率(例如，用荧光标记例如2-氨基苯甲酰胺标记PNG酶释放的聚糖库(pool)，然后用高效液相色谱或毛细管电泳分离，再通过荧光强度定量聚糖)。例如，50摩尔百分率GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂Gal₂NANA₂指：50％的释放的聚糖是GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂Gal₂NANA₂，且其余的50％由其它N-联寡糖组成。在实施方案中，特定聚糖在糖蛋白制剂中的摩尔百分率将是20％-100％，优选大于25％、30％、35％、40％或45％，更优选大于50％、55％、60％、65％或70％，和最优选大于75％、80％、85％、90％或95％。

本文所用术语″主要地″或变体例如″主要″或″是主要的″将被理解为指：在已经用PNG酶处理糖蛋白并由质谱例如MALDI-TOF MS分析释放的聚糖之后具有最高摩尔百分率(％)的总N-聚糖的聚糖种类。换句话说，短语″主要地″定义为个体实体，例如特定糖形，以比任何其它个体实体更大的摩尔百分率存在。例如，假如组合物由40摩尔百分率的种类A、35摩尔百分率的种类B和25摩尔百分率的种类C组成，则组合物主要包含种类A。

术语″有效治疗量″指本发明的重组促红细胞生成素的量，其给与提供患者益处的血细胞比容增加。所述量将在个体之间改变，并将依赖于许多因素，包括患者的整体身体状况和贫血的潜在原因。例如，用于慢性肾衰患者的本发明促红细胞生成素的有效治疗量可以为基于治疗适应症的20-300单位/kg或0.5ug/kg-500ug/kg。术语″单位″指用于评估促红细胞生成素组合物活性的本领域通常已知的单位。1毫克的纯促红细胞生成素约等价于150,000单位。给药时间表可以为约3次/周-约1次/4或6周。实际的时间表将取决于许多因素包括给予患者的促红细胞生成素的类型(EPO或PEG基化的EPO)和个体患者的反应。较高的剂量范围通常不用于贫血应用但可以用在其它治疗应用上。达到和确立用于患者的促红细胞生成素的合适剂量的方法为本领域所熟知并通常在本领域中实践。

在患者之间给予的量和给药时间表的变更包括参考术语″约″与量或时间表相结合。用于治疗的促红细胞生成素的量给予可接受的血细胞比容增加速率和使血细胞比容维持在有益的水平(例如，通常至少约30％和典型地为30％-36％)。由本领域的技术人员使用公众可利用的材料和方法，可容易地确定本发明组合物的有效治疗量。另外，可在治疗期间给予患者铁，以维持增加的红细胞生成。通过本领域的技术人员通常使用的方法，可能容易地确定给予的量。

因此本发明的促红细胞生成素可以用于刺激红细胞产生和矫正降低的红细胞水平。促红细胞生成素的最通常的治疗应用是矫正由于贫血而降低的红细胞水平。可由本发明治疗的病症包括与肾功能的减退或丧失(慢性肾衰竭)有关的贫血，与骨髓抑制治疗例如化学治疗药物或抗病毒药物(例如AZT)有关的贫血，与非骨髓癌症的进展有关的贫血，和与病毒感染(例如HTV)有关的贫血。另外，本发明的促红细胞生成素可以用于预防或减少以下中风的神经元损伤(尤其是非唾液酸化的epo(促红细胞生成素))，充血性心力衰竭、用于脊髓损伤的治疗，即，抗炎、抗凋亡和除红细胞生成之外干细胞的募集。也可治疗可在其他健康个体中导致贫血的病症，例如在手术期间预期的失血。一般而言，可用促红细胞生成素治疗的任何病症一般可以用本发明的促红细胞生成素治疗。

I.糖基化

本发明提供：在已经经过遗传工程改造以产生具有作为主要种类特定所需N-聚糖的糖蛋白的低等真核宿主细胞中，用于转化、表达和选择重组蛋白尤其是促红细胞生成素的方法和材料。在某些实施方案中，真核宿主细胞已经经过遗传工程以产生具有作为主要种类的特定所需N-聚糖的促红细胞生成素、或促红细胞生成素的变体。在优选的实施方案中，主要的N-聚糖是对哺乳动物尤其是人不致免疫的N-聚糖，或与超甘露糖化的糖蛋白相比具有降低的免疫原性的N-聚糖。例示性的糖基化模式显示于图9A-9B中。

在特别优选的实施方案中，主要的N-聚糖为完全唾液酸化的聚糖，表示为：GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂Gal₂NANA₂。在其它优选的实施方案中，主要的N-聚糖可以是部分唾液酸化的或脱唾液酸化的聚糖；完全半乳糖基化的聚糖；部分半乳糖基化的聚糖；或脱半乳糖基化的聚糖。因此，优选的实施方案包括其中主要的N-聚糖为以下的那些实施方案：GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂Gal₂NANA；GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂GalNANA；GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂Gal₂；GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂Gal；GlcNAc₂Man₃GlcNAcGal；GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、GlcNAc₂Man₃GlcNAcr或GlcNAc₂Man₃。在其它优选的实施方案中，主要的N-聚糖为部分半乳糖基化的聚糖，表示为GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂Gal_n，其中n可以是1或2。

在本发明的其它实施方案中，主要的N-聚糖可以为杂合糖形，由下式表示：GlcNAc₂Man_(4-5)GlcNAc_(0-1)Gal_(0-1)NANA_(0-1)。优选的实施方案包括其中主要的N-聚糖为以下的那些实施方案：GlcNAc₂Man₅GlcNAcGalNANA、GlcNAc₂Man₅GlcNAcGal；和GlcNAc₂Man₅GlcNAc和GlcNAc₂Man₅。

许多野生型低等真核细胞，包括酵母和真菌，例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，产生无任何核心岩藻糖的糖蛋白。因此，在以上实施方案中，依照本发明产生的重组糖蛋白可以缺乏岩藻糖，或基本上不含岩藻糖。或者，在某些实施方案中，重组低等真核宿主细胞可经遗传修饰以包括岩藻糖基化途径，因此致使产生重组糖蛋白组合物，在该组合物中主要的N-聚糖被岩藻糖基化。除非特别地指明，可以以脱岩藻糖基化的形式，或呈现核心岩藻糖基化，来产生本发明的糖蛋白组合物。

在本发明中，依照上面所述所生产的重组糖蛋白然后被化学修饰，以改善其物理特征，特别是血清半寿期和药代动力学。在优选的实施方案中，通过连接一个或多个聚乙二醇(PEG)部分至所述重组糖蛋白，产生PEG基化的糖蛋白，来实现该化学修饰。在某些优选的实施方案中，通过连接一个或多个PEG部分至重组糖蛋白的N-末端氨基酸，产生N-末端PEG基化的糖蛋白，来修饰重组糖蛋白。

II.促红细胞生成素

促红细胞生成素(EPO)为在肾脏中产生的刺激晚期祖红细胞分化成成熟红细胞的造血糖蛋白。促红细胞生成素通过结合至红细胞前提上的受体而发挥其生物活性。促红细胞生成素基因不是人类特有的。类似的基因已经在其它物种，包括许多哺乳动物中发现(见Wen等，Blood(1993)；82：1507-16)。因此，人类基因和非人类基因都可以如本文所述表达，而促红细胞生成素的变体也可用于本发明的方法中。

天然存在的人促红细胞生成素首先被翻译成包含在166位有精氨酸的166个氨基酸多肽链。在翻译后修饰中，用羧肽酶切割精氨酸166。165个氨基酸的人促红细胞生成素的一级结构显示于SEQ ID NO：2中，而该EPO的核酸显示于SEQ ID NO：1中。促红细胞生成素的二级结构包括Cys7-Cys161和Cys29-Cys33之间的两个二硫键。以分子量计，完全糖基化的EPO包含约40％的糖基(Sasaki，H.，等，J.Biol.Chem.262(1987)12059-12076)。没有聚糖部分的人促红细胞生成素的多肽链的分子量为18,236Da。

因为促红细胞生成素是在红细胞形成中所必需的，所以它用于治疗特征在于红细胞生成低或有缺陷的血液病症。在临床上，促红细胞生成素用于治疗各种疾病，例如，在慢性肾衰患者(CRF)中的和在接受化疗的AIDS和癌症患者中的贫血(Danna，R.P.，等，In：M B，Garnick，编辑.Erythropoietin in Clinical Applications-An InternationalPerspective.New York，N.Y.：Marcel Dekker；1990，第301-324页)。然而，目前可用的蛋白质疗法如促红细胞生成素的生物利用度受限于它们的短血浆半衰期和对蛋白酶降解的敏感性。这些缺点阻止它们达到最大的临床效能。例如，在许多参考文献包括美国专利第4,835,260号；WO 94/25055；WO 94/24160；WO 94/02611；WO 95/05465中，已经公开了EPO的氨基酸序列的修饰。

已经使用重组体DNA技术生物合成制备促红细胞生成素(Egrie，J.C，等，Immunobiol.72(1986)213-224)。目前用于人类治疗的促红细胞生成素为插入中国仓鼠卵巢组织细胞(CHO细胞)中并在其中表达的克隆的人EPO基因的产物。人尿来源促红细胞生成素和重组促红细胞生成素(在哺乳动物细胞中表达)都包含三个N-联的和一个O-联的寡糖链，该寡糖链共包含糖蛋白的总分子量的约40％。N-联糖基化发生在位于24、38和83位的天冬酰胺残基处，而O-联糖基化发生在位于126位的丝氨酸残基处(Lai，等，J.Biol.Chem.261(1986)3116；Broudy，V.C，等，Arch.Biochem.Biophys.265(1988)329)。已显示用末端唾液酸残基来修饰寡糖链。酶处理糖基化的促红细胞生成素以去除所有的唾液酸残基，致使体内活性的损失但不影响体外活性(Lowy等，Nature 185(1960)102；Goldwasser，E.，等J.Biol.Chem.249(1974)4202-4206)。该行为已被解释为：在与肝脏的脱唾液酸糖蛋白结合蛋白相互作用时，脱唾液酸促红细胞生成素从循环中快速清除(Morrell等，J.Biol.Chem.243(1968)155；Briggs，D.W.，等，Am.J.Physiol.227(1974)1385-1388；Ashwell，G.，和Kawasaki，T.，Methods Enzymol.50(1978)287-288)。因此，促红细胞生成素仅当它被唾液酸化以避免与脱唾液酸糖蛋白结合蛋白结合时，才具有体内生物活性。

在促红细胞生成素的寡糖链中其它成分的作用还没有被充分确定。已经显示：部分二糖基化促红细胞生成素的体内活性与糖基化形式相比大大地降低，但保持体外活性(Dordal，M.S.，等，Endocrinology116(1985)2293-2299)。然而，在另一研究中，通过诱变糖基化位点的天冬酰胺或丝氨酸残基而单独地或一起去除N-联寡糖链或O-联寡糖链，急剧地降低哺乳动物细胞中所产生经过改变的促红细胞生成素的生物活性(Dube，S.，等，J.Biol.Chem.263(1988)17516-17521)。

寡核苷酸定向突变已被用于制备缺乏糖基化所特有位点的EPO结构突变体(Yamaguchi，K.，等，J.Biol.Chem.266(1991)20434-20439；和Higuchi，M.，等，J.Biol.Chem.267(1992)7703-7709)。在以下中描述了非糖基化EPO在大肠杆菌(E.coli)中的克隆和表达：Lee-Huang，S.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 61(1984)2708-2712；和美国专利第5,641,663号。

欧洲专利0 640 619涉及包含有至少一个附加糖基化位点的氨基酸序列的人促红细胞生成素类似物。该增加的糖基化位点可致使比人促红细胞生成素更多的糖链，和更高的唾液酸含量。也提供包含有至少一个糖基化位点重排的氨基酸序列的促红细胞生成素类似物。包含添加一个或多个氨基酸至促红细胞生成素羧基末端的类似物也被包括，其中该添加提供至少一个糖基化位点。

与CHO细胞产生的促红细胞生成素相比，毕赤酵母(Pichia)产生的具有人源化的糖基化的促红细胞生成素在包含N-和O-糖基化的连接的寡糖结构方面更具多很多的一致性。用糖形混合物，包括具有不同量的唾液酸化的二、三和四天线型式，产生CHO来源的rhEPO。工艺过程开发用于富集四天线的唾液酸化的糖形，该糖形包含小部分的N-聚糖预富集(Restelli等，2006 Biotechnology and Bioengineering 94(3)第481-494页)。另外，虽然在人源化的酵母中的唾液酸化不包括N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)，但是CHO细胞产生的唾液酸化的促红细胞生成素包含NANA(N-乙酰神经氨酸)和NGNA的混合物。

哺乳动物细胞系，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生的促红细胞生成素富集包含唾液酸化的N-联聚糖的糖。富集四天线的糖形在促红细胞生成素的N-聚糖上增加乳糖胺重复的比率。包含这些重复的促红细胞生成素分子可能具有受损的体内效能，因为聚乳糖胺重复的存在已经与经肝脏从循环快速清除有关(Fukuta等，(1989)Blood，第73卷，84)。

乳糖胺部分也被报道与凝集素的半乳凝素家族结合，糖类结合蛋白在不同细胞和组织类型的细胞表面上不同地表达。具体地讲，半乳凝素-3特异地识别乳糖胺。已发现半乳凝素-3在许多不同肿瘤细胞类型的细胞表面上过量表达，并涉及细胞生长、转化和转移(Deininger等，(2002)Anticancer Research，第22卷，1585)。

因此，包含乳糖胺重复的糖蛋白可以潜在地靶向在细胞表面上表达半乳凝素-3的细胞。此外，这还呈现以下潜在的风险：含乳糖胺的糖蛋白可选择性地靶向可能碰巧负有糖蛋白同源受体的肿瘤细胞。就促红细胞生成素而言，包含乳糖胺的部分促红细胞生成素可优先靶向肿瘤细胞，且如果存在促红细胞生成素受体，则可出现异常的促细胞分裂信号，促使具有转移潜力的肿瘤细胞生长。

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)产生的促红细胞生成素缺乏不必要的糖形如乳糖胺重复。这将可能减缓关于EPO和其它糖蛋白的致瘤潜在性的忧虑。

其它差异包括在毕赤酵母(Pichia)产生的促红细胞生成素中完全缺乏连接的核心岩藻糖和聚乳糖胺，而在CHO细胞模型(version)中两者都存在，且在O-聚糖组合物上有变化，与可在毕赤酵母(Pichia)产生的促红细胞生成素上发现的O-甘露糖相比，在CHO产生的促红细胞生成素上具有O-GalNAc结构的异质混合物。在CHO产生的促红细胞生成素中，唾液酸连接主要为α2，3，并存在一些α2，6，而赤酵母(Pichia)产生的促红细胞生成素仅包含α2，6(Hamilton，Science第313卷，第1441-1443页)，与主要包含α2，6连接的唾液酸的人尿促红细胞生成素相似。

促红细胞生成素(EPO)是组织保护性细胞因子，已经显示预防血管性痉挛、细胞凋亡和炎症应答。虽然以其在血细胞生成上的活性著称，EPO也影响其它组织，包括神经系统。动物模型已经证明：单剂量的rhEPO对急性损伤(4-6，19)的治疗有效。例如，将EPO注入遭受颈总动脉闭塞的沙鼠的侧脑室，防止局部缺血诱导的学习病废和使海马神经元从退化中恢复(Bernaudin等(1999)J Cereb Blood Flow Metab19，643)。

体内研究已证明EPO对各种形式的神经元损伤的保护作用(Brines等.(2000)，PNAS，97，10526；Celik等.(2002)，PNAS，99，2258；Junk等.(2002)，PNAS，99，10659)。然而，许多临床状况可能需要多剂量的rhEPO，多剂量的rhEPO很可能导致血细胞比容潜在性地受损增加，因此对将重组人促红细胞生成素(rhEPO)作用潜在的神经保护性治疗的积极性作出了控制。该论点被动物模型支持，后者清楚地显示血细胞比容的EPO-依赖式增加可以引起和放大脑损伤。该矛盾的潜在解决方案可以是通过使用具有双天线的糖基化EPO，该EPO对动物模型中的血细胞比容具有最小的影响(Hamilton等.(2006)Science 313，1441)。因此，用于炎症治疗的具有双天线糖基化的多次高剂量的EPO可对总血细胞比容影响很小。

可用于炎症治疗的另一受到关注的糖形为没有末端唾液酸化的双天线的EPO。这也作为不显著增加血细胞比容的抗炎剂可用作有效的治疗。该分子的附加优点将是：相对于脱唾液酸糖蛋白受体的优选底物即三天线和四天线的末端半乳糖基化的糖形，它降低与该肝脏受体的亲和力。因此，具有双天线的唾液酸化的糖基化的EPO的优点是肝脏清除率降低、对血细胞比容和优选的神经组织分布影响小。可以根据本发明，通过在缺乏本文显示的糖基化途径的唾液酸化部分的酵母细胞中表达EPO，来制备脱唾液酸EPO。

III.编码糖蛋白的核酸

本发明的促红细胞生成素由核酸编码。该核酸可以为DNA或RNA，典型地为DNA。编码糖蛋白的核酸可操作连接至允许糖蛋白表达的调控序列。这样的调控序列包括启动子和任选包括上游增强子，或5′至编码融合蛋白的核酸和转录终止位点3′或从编码糖蛋白的核酸开始的下游区。该核酸也典型地编码具有核糖体结合位点的5′UTR区和3′非翻译区。该核酸通常为将该核酸转移至宿主细胞中的载体的成分，所述宿主细胞表达糖蛋白。该载体也可包含标记物以允许识别已转化的细胞。然而，一些宿主细胞类型，特别是酵母，可用缺乏外来载体序列的核酸成功地转化。

编码本发明的所需促红细胞生成素的核酸可从几个来源获得。可以使用保守区域引物，从已知表达该糖蛋白的细胞系扩增cDNA序列(见，例如，Marks等，J.MoI.Biol.581-596(1991))。也可根据科学文献中的序列从头合成核酸。也可以通过延伸跨越较大核酸(例如基因组DNA)的所需序列的重叠寡核苷酸来合成核酸(见，例如，Caldas等，Protein Engineering，13，353-360(2000))。

本发明优选使用编码哺乳动物促红细胞生成素的核酸，最优选使用编码人促红细胞生成素的核酸。人促红细胞生成素为本领域所熟知，为165个或166个氨基酸的蛋白。

以下核苷酸序列和氨基酸序列是例示性的优选序列，可以用于本发明。

EPO核苷酸序列[SEQ ID NO：1]

ATGAGATTTC CTTCAATTTT TACTGCTGTT TTATTCGCAG CATCCTCCGC

ATTAGCTGCT CCACCAAGAT TGATTTGTGA CTCCAGAGTT TTGGAGAGAT

ACTTGTTGGA GGCTAAAGAG GCTGAGAACA TCACTACTGG TTGTGCTGAA

CACTGTTCCT TGAACGAGAA CATCACAGTT CCAGACACTA AGGTTAACTT

CTACGCTTGG AAGAGAATGG AAGTTGGACA ACAGGCTGTT GAAGTTTGGC

AAGGATTGGC TTTGTTGTCC GAGGCTGTTT TGAGAGGTCA AGCTTTGTTG

GTTAACTCCT CCCAACCATG GGAACCATTG CAATTGCACG TTGACAAGGC

TGTTTCTGGA TTGAGATCCT TGACTACTTT GTTGAGAGCT TTGGGTGCTC

AGAAAGAGGC TATTTCTCCA CCAGATGCTG CTTCAGCTGC TCCATTGAGA

ACTATCACTG CTGACACTTT CAGAAAGTTG TTCAGAGTTT ACTCCAACTT

CTTGAGAGGA AAGTTGAAGT TGTACACTGG TGAAGCTTGT AGAACTGGTG

ACTAGTAA

EPO氨基酸序列[SEQ ID NO：2]

APPRLICDSR VLERYLLEAK EAENITTGCA EHCSLNENIT VPDTKVNFYA

WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL LVNSSQPWEP LQLHVDKAVS

GLRSLTTLLR ALGAQKEAIS PPDAASAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR

GKLKLYTGEA CRTGD

IV.宿主细胞

低等真核细胞，例如酵母和真菌，优选用于本发明的促红细胞生成素的表达，因为它们可经济地培养、得到高产率、和当适当修饰时能够合适地糖基化。特别地，酵母提供建立的遗传学，允许快速转化、试验蛋白定位策略和简易的基因敲除技术。合适的载体具有表达控制序列，例如启动子，包括3-磷酸甘油酸酯激酶或其它的糖解酶，和复制起始区、终止序列和所需的等等。

各种酵母，例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、嗜甲毕赤酵母(Pichia methanolica)和多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)优选用于细胞培养，因为它们能够生长至高细胞密度并分泌大量的重组蛋白。同样地，丝状真菌，例如里氏木霉(Trichoderma reesei)、黑曲霉(Aspergillus niger)、镰孢(Fusarium sp)、粗糙脉胞菌(Neurospora crassa)和其它的丝状真菌可用于制备本发明的糖蛋白。

低等真核生物，尤其是酵母和真菌，可以被遗传修饰，致使它们表达其中糖基化方式为与人类相似的或人源化的糖蛋白。这可以通过消除所选择的内源性糖基化酶和/或提供外源性酶而获得，如Gerngross等，美国20040018590和7,029,872所述，该公开通过引用结合到本文中。例如，可选择或工程改造宿主细胞以使1，6-甘露糖基转移酶活性缺失，该转移酶将另外添加甘露糖残基至糖蛋白的N-聚糖上。

使用本发明的方法和材料，可能生产包含多种糖形的糖蛋白组合物，各种糖形包含至少一种与其连接的N-聚糖，其中该糖蛋白组合物因此包含多种N-聚糖，其中主要的糖形包含所需N-聚糖。利用在Gemgross等，美国20040018590和7,029,872中所述的，加上本发明的工具，有可能产生许多不同的N-联糖形。取决于特定的需要，本发明的方法可用于获得糖蛋白组合物，其中主要的N-糖形以比下一种最主要的N-糖形多5-80摩尔百分率的量存在；在优选的实施方案中，主要的N-糖形可以以比下一种最主要的N-糖形多以下摩尔百分比的量存在：10-40摩尔百分率；20-50摩尔百分率；30-60摩尔百分率；40-70摩尔百分率；50-80摩尔百分率。在其它优选的实施方案中，主要的N-糖形为所需N-糖形，以N-聚糖总数的大于25摩尔百分率；大于35摩尔百分率；大于50摩尔百分率；大于60摩尔百分率；大于75摩尔百分率；或大于80摩尔百分率的量存在。

在优选的实施方案中，载体可用一个或多个选择标记基因，和编码转化入合适宿主细胞的促红细胞生成素的一个或多个所需基因来构建。例如，一个或多个基因选择标记基因可与一个或多个基因物理连接，后者表达用于分离的所需促红细胞生成素肽或蛋白或具有所需活性的所述促红细胞生成素肽或蛋白的片段，可与载体内的选择基因联合。所述选择标记基因和促红细胞生成素基因可排列在一个或多个转化载体上，致使促红细胞生成素基因在转化宿主细胞中的存在与选择标记基因在转化细胞中的表达有关。例如，两种基因可以插入同一物理质粒内，受单个启动子的控制，或受两个分开的启动子的控制。也可能需要将基因插入不同的质粒内并共转化入细胞中。

在本发明中可用作宿主细胞的其它细胞包括原核细胞，例如大肠杆菌(E.coli)，和细胞培养中的真核宿主细胞，包括哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

V.化学修饰的促红细胞生成素

如上所述，为了增强性质，可以使聚合物载体与蛋白质如促红细胞生成素结合。用于连接用作载体的化学部分的各种方法都是当前可利用的，见，例如，专利合作条约(″PCT″)国际公开号WO 96/11953，标题为″N-Terminally Chemically Modified Protein Compositions andMethods ″，该文献通过整体引用结合到本文中。该PCT说明书除了其他内容以外还公开了使水溶性聚合物与蛋白质的N-末端选择性连接。

化学修饰的促红细胞生成素组合物(即，″衍生物″)，其中蛋白质或多肽与聚合物连接，包括在本发明的范围内。所选择的聚合物典型地为水溶性的，致使它所连接的蛋白质在水性环境如生理环境中不沉淀。所选择的聚合物通常经过修饰，以具有单个反应基团，例如用于酰化的活性酯或用于烷基化的醛，致使聚合度可经过控制提供用于本方法。包括在修饰的促红细胞生成素组合物的范围内的有聚合物的混合物。优选，为了最终产物制剂的治疗用途，该聚合物将是药学上可接受的。

上述水溶性的聚合物或其混合物可选自：例如，聚乙二醇(PEG)、单甲氧基聚乙二醇、葡糖聚、纤维素、或其它基于糖类的聚合物、聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇同聚物、氧化丙烯/环氧乙烯共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如，甘油)、和聚乙烯醇。对于酰化反应而言，所选择的聚合物应具有单个反应性酯基。对于还原性烷化作用而言，所选择的聚合物应具有单个反应性醛基。该聚合物可具有任何分子量，可为支化支化的或不支化支化的。本文使用的特别优选的水溶性聚合物为聚乙二醇，缩写为PEG。本文所用的聚乙二醇指包含已用于衍生其它蛋白质的任何形式PEG，如单(C₁-C₁₀)烷氧基或芳氧基-聚乙二醇。

PAL的PEG基化(即通过添加PEG或PEG衍生物的修饰)可通过本领域已知的任何PEG基化反应进行，例如在以下参考文献中所描述的：Focus on Growth Factors 3：4-10(1992)；EP 0 154316；和EP 0401 384。优选，PEG基化经与反应性聚乙二醇分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷化反应进行，如下所述。

一般而言，化学衍生作用可在用于使生物活性物质与活化的聚合物分子反应的任何合适的条件下进行。用于制备PEG基化的促红细胞生成素的方法将一般包括步骤：(a)在使促红细胞生成素变得可与一个或多个PEG基团连接的条件下，使促红细胞生成素多肽与聚乙二醇(如PEG的反应性酯或醛衍生物)反应，和(b)获得反应产物。一般而言，用于酰化反应的最佳反应条件将基于已知的参数和所需结果来确定。例如，PEG∶蛋白质的比值越大，聚-PEG基化的产物的百分率越大。

本发明还提供使用还原性烷化作用选择性地获得N-末端化学修饰的促红细胞生成素的方法。在该方法中，可因不同的主要氨基有差别的反应性来靶向连接至促红细胞生成素的N-末端。对pH进行选择，其中在蛋白质中赖氨酸的ε-氨基和N-末端的α-氨基之间的pKa，通过与羰基或PEG或另一聚合物反应，致使在N-末端蛋白质的接近选择性的衍生。优选单聚物修饰的促红细胞生成素。本发明的制剂将优选为大于50％、55％、60％、65％、70％或75％的单聚合物促红细胞生成素，更优选为大于80％、85％或90％的单聚合物：蛋白质缀合物，最优选为大于95％的单聚合物-促红细胞生成素缀合物。

获得单聚合物衍生的促红细胞生成素制剂的方法可为在缀合之后从非衍生的促红细胞生成素分子群中纯化衍生的材料。例如，下面呈现的是其中使用色谱法分离单PEG基化的促红细胞生成素的实施例。可使用大小排阻色层析、离子交换层析或两者的组合和可能的其它常用的纯化方法。这些方法可用作分析工具以鉴定纯化产物或用作制备型纯化工具。

优选的聚合物载体为聚乙二醇(PEG)。PEG基团可为任何合宜的分子量，可为线型线型的或支化支化的。PEG的平均分子量将优选为约2千道尔顿(″kDa″)-约100kDa，更优选约5kDa-约60kDa，更优选约20kDa-约50kDa；最优选约30kDa-约40kDa。这些PEG可由任何供应商供应，这些供应商包括NOF Corporation(Tokyo，Japan)、DowPharma(Chiro Tech Technology，Cambridge，UK)、Nektar(San Carlos，CA)和SunBio(Anyang City，South Korea)。合适的PEG部分包括，例如，40kDa甲氧基聚(乙二醇)丙醛；60kDa甲氧基聚(乙二醇)丙醛；31kDaα-甲基-ω-(3-氧代丙氧基)、聚氧乙烯；30kDa PEG：30kDa甲氧基聚(乙二醇)丙醛和45kDa 2，3-二(甲基聚氧乙烯-氧)-1-[(3-氧代丙基)聚氧乙烯-氧]-丙烷。PEG基团一般将通过PEG部分上的反应基团(例如，醛基、氨基、巯基、或酯基)与蛋目标白或多肽上的反应基团(例如，醛基、氨基、或酯基)经酰化作用或还原胺化作用，而连接至本发明的化合物。例如，PEG部分可直接或通过接头连接至促红细胞生成素的N-末端氨基酸残基。

使合成肽PEG基化的有用策略包括通过在溶液中形成缀合连接来使肽和PEG部分结合，该肽和PEG部分各负有对彼此有互相反应的特异性官能度。该肽可用常规的固相合成法(见，例如，图5和图6及其附文)容易地制备。该肽用合适的官能团在特异位点被″预活化″。在与PEG部分反应之前使前体纯化并完全鉴定。肽与PEG的连接通常发生于水相中，并可以通过反相分析性HPLC容易地监测。经PEG基化的肽可以用制备型HPLC容易地纯化，并用分析型HPLC、氨基酸分析和激光解吸质谱分析法来鉴定。

多糖聚合物为可用于蛋白修饰的另一类水溶性聚合物。葡糖聚为由主要通过α1-6键合而连接的葡萄糖的个体亚基组成的多糖聚合物。葡糖聚本身在许多分子量范围内可利用，并可在约1kD-约70kD的分子量内容易地利用。葡糖聚是合适的水溶性聚合物，在本发明中单独或与另一载体(例如，Fc)组合用作载体。见，例如，WO 96/11953和WO 96/05309。与治疗性的或诊断性的免疫球蛋白缀合的葡糖聚的用途已被报导；见，例如，欧洲专利公开第0315 456号，该公开通过引用结合到本文中。当葡糖聚用作本发明的载体时，优选约1kD-约20kD的葡糖聚。

如上所述，″接头″基团的存在为任选的。当存在时，它的化学结构不是关键性的，因为它主要用作间隔物。接头优选由通过肽键连接在一起的氨基酸构成。因此，在优选的实施方案中，接头由通过肽键连接的1-20个氨基酸构成，其中这些氨基酸选自20种天然氨基酸。这些氨基酸中的一些可被糖基化，如本领域的技术人员所很好地理解的。在更优选的实施方案中，所述1-20个氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。甚至更优选，接头由大多数无空间位阻的氨基酸，如甘氨酸和丙氨酸构成。因此，优选的接头为聚甘氨酸(尤其是(Gly)₄、(Gly)₅、聚(Gly-Ala)、和聚丙氨酸。接头的其它特别的实例为：

(Gly)₃Lys(Gly)₄；

(Gly)₃AsnGlySer(Gly)₂；

(Gly)₃Cys(Gly)₄；和

GlyProAsnGlyGly。

为了解释上述命名法，例如，(Gly)₃Lys(Gly)₄指Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly。也优选Gly和Ala的组合。本文显示的接头为例示性的；在本发明范围内的接头可更长很多并可包括其它的残基。

也可能为非肽接头。例如，可使用烷基接头如-NH-(CH₂)_s-C(O)-，其中s＝2-20。这些烷基接头还可被任何非空间位阻的基团取代，这些基团例如低级烷基(例如，C₁-C₆)、低级酰基、卤素(例如，Cl、Br)、CN、NH₂、苯基等。例示性的非肽接头为PEG接头，其中n使接头的分子量为100-5000kD，优选100-500kD。可以以如上所述的同样方式改变肽接头以形成衍生物。

在WO 01/02017中描述了糖基化EPO的PEG基化。这样的分子显示提高的生物活性。WO 00/32772和Francis，E.，等，Int.J.Hem.68(1988)1-18，描述了经聚乙二醇修饰的非糖基化的EPO。WO 00/32772的该分子另外在166位被修饰。这样的分子被描述为不引起血细胞比容的显著增加。该PEG-聚合物部分由1-5个聚合物链组成。WO00/32772建议通过降低pH和减少PEG∶胺的比值，来控制PEG基化的程度和位点。以pH 7和1.5∶1摩尔比的PEG-醛∶胺基时进行的反应，优先与N-末端α-氨基反应。

一些有用的PEG基化连接显示于表1中而一些有用的PEG基化反应显示于图12中。在优选的方法中，N-末端的PEG基化通过使用mPEG-丙醛及经还原胺化作用使其与rhEPO的N-末端共价缀合来实现。通过利用赖氨酸的ε-氨基(pKa～10)和N-末端氨基(pKa～7.6-8.0)之间的pKa值差异，来实现选择性。在典型的衍生化反应中，30％-50％的rhEPO被PEG基化。在最优化的条件下可达到更高程度的衍生化。然后使用阳离子交换层析步骤纯化单-PEG基化的rhEPO。优选地，经色谱之后纯化的单-PEG基化的rhEPO为大于80％、85％、90％或最优选大于95％的rhEPO。

表1 PEG基化：试剂选择、PEG-缀合连接和缀合物的稳定性

胺PEG基化mPEG-p-硝基苯基碳酸酯mPEG-丙醛和还原剂mPEG-NHS酯	缀合物连接形成氨基甲酸酯仲胺(稳定的)酰胺
		硫醇PEG基化mPEG-马来酰亚胺	硫醚

羧基PEG基化mPEG-胺和偶联剂

酰胺(稳定的)

一般地，可通过给予本聚合物/促红细胞生成素衍生物而减轻或调节的病症包括一般而言用于促红细胞生成素分子的本文所述的那些病症。然而，本文所公开的聚合物/促红细胞生成素和促红细胞生成素衍生物分子与非衍生的分子相比，可具有附加的活性、增强的或降低的活性、或其它的特征。

实施例

实施例1.基因工程改造的毕赤酵母(Pichia)6.0细胞系的构建

遵循在Gemgross美国7,029,872和Gemgross美国20040018590中公开的方法，可以构建用于基因工程改造低等真核宿主细胞的载体，致使前者能够表达具有作为主要种类的所需N-糖形的所需多肽。从巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的野生型菌株NRRL-11430开始，依照图1中描述的系列逐步进行基因的导入。本文使用的菌株YGLY3159的基因型为ura5Δ::MET16 ochlΔ::lacZ bmt2Δ::lacZ/K1MNN2-2，mnn4LlΔ::lacZ/MmSLC35A3 ΔpnolΔmnn4Δ::lacZ metl6Δ::lacZ，his1Δ::lacZ/ScGAL10/XB33/DmUGT，arg1Δ::HIS1/KD53/TC54，ADE1::lacZ/NA10/MmSLC35A3/FB8，PRO1::lacZ-URA5-lacZ/TrMDS1，AOX1:Sh ble/AOX1p/ScαMFpre-GFI800，TRP2::ARG1/MmCST/HsGNE/HsCSS/HsSPS/MmST6-33。

在图2中的分图A至分图O中阐述了用来构建菌株YGLY3159的质粒。依照标准技术，将质粒转化成所需细胞。Hamilton等，Science313：1441：1443(2006)也指明了用于构建细胞系的合适技术，该公开通过引用结合到本文中。

实施例2用于产生重组EPO的载体的构建。

将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)α交配因子前序列的寡核苷酸磷酸化和退火，以产生5′末端的EcoRI突出端和3′末端的平端。然后如图2所示，将该寡核苷酸对连接至编码人促红细胞生成素的编码DNA序列，以形成pGLY2088，如图1所示，将pGLY2088转化入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中。

实施例3.6.0细胞系的转化和发酵

A.转化

通过电穿孔术(使用电穿孔仪制造商BioRad所推荐的标准技术)转化酵母菌株。

B.发酵过程描述

在Applikon的15L(12L工作容积)可高压灭菌的玻璃生物反应器中进行发酵过程。用由冷冻原种瓶生长起来的指数生长期摇瓶培养液接种入(0.04％v/v)反应器。在24-36小时内当初始装料的甘油耗尽时结束分批发酵阶段。在分批发酵阶段之后细胞湿重(WCW)典型地为120±25g/L WCW。在此刻，将包含12mL/L PTM1盐的50％w/w甘油溶液单脉冲(pulse)补料至发酵罐，致使在甘油补料分批发酵阶段开始时最终的甘油浓度为30g/L。按1mL/L添加包含2.6mg/mL真菌O-糖基化的合成抑制剂(PMTi-3)的甲醇溶液。按0.6mL/L添加蛋白酶抑制剂混合液(45mg/mL胃蛋白酶抑制剂A和15mM的胰凝乳蛋白酶抑制素的DMSO溶液)。在4小时内甘油被耗尽，湿细胞重量已达到225±25g/LWCW。然后通过按2.3g/h/L的包含12mL/L PTM1盐的甲醇补料为开始，诱导基因表达。在甲醇补料分批发酵阶段开始时以及诱导的每隔24小时，添加1ml/L的2.6mg/mL PMTi-3甲醇溶液和0.6mL/L的蛋白酶抑制剂混合液。当最终的细胞湿重预期达约300±25g/L时，诱导继续40小时。(L^*为在接种之前的初始装料体积)。

通过离心进行发酵罐培养基的初步澄清。将全部细胞培养基转移入1000mL离心瓶中并在13,000xg，4℃下离心15分钟。

实施例4：纯化：

如下所述通过三级色层分离产生用于PEG基化的人EPO(hEPO)，其中达到95％的纯度(图3)。首先，通过0.2μm膜滤器过滤无细胞的发酵悬浮液，浓缩和使用具有空心纤维膜的MiniKross切向流分离模块(separation module)进行缓冲液更换。

在第一步中使用Q sepharose Big Beads以捕获流通的宿主细胞蛋白和hEPO。用醋酸将流通池和来自Q sepharose Big Beads柱的洗脱样品调整到pH 5.0。测量电导率以保证其值为约4.5mS/cm。

接着，使样品通过0.2μm膜滤器过滤，加样到已用三倍柱容积的pH 5.0的50mM醋酸钠预平衡的SP sepharose Fast Flow柱上。应用十倍柱容积的从pH 5.0的50mM醋酸钠至pH 5.0的20mM醋酸钠的梯度；500mM NaCl洗脱蛋白质，接着用0.5倍柱容积的pH 5.0的20mM醋酸钠；750mM NaCl洗脱。收集(pool)包含hEPO的流分，在pH值7.0的50mM TRIS中透析。

将包含hEPO的流分加样至用三倍柱体积的pH 7.0的50mM TRIS预平衡的Blue Sepharose 6 FF柱上。应用十倍柱容积的从pH 7.0的50mM TRIS至pH 8的50mM TRIS的线性梯度；3M NaCl，接着用2倍柱容积的pH 8的50mM TRIS；3M NaCl洗脱。

收集显示EPO带(平均分子量～25kDa)的流分，通过0.2μm膜滤器过滤，4℃下在pH 6.0的20mM MES中透析，在4℃下贮存。然后将样品收集液(pool)浓缩，在pH 5.2的50mM醋酸钠缓冲液中透析至1mg/ml的蛋白浓度。

已见到：使发酵悬浮液暴露至pH 5会增加hEPO的损失。因此将捕获和hEPO纯化的中间步骤维持在中性pH是重要的。

在图10中显示了第二种一般纯化方案的概述。在图11中显示了通过SDS-PAGE来分析使用该方案所制备的纯化的样品。

通过离心进行初步澄清。将全部细胞培养基转移入1000mL离心瓶，并在13,000×g，4℃下离心15分钟。对于较大的发酵罐(10L-40L和更大)可使用超滤步骤。可利用具有10K孔径大小的Sartoriuos平板进行该步骤至5倍浓度。用pH 7的50mM Tris-HCl/100mM NaCl平衡的Blue Sepharose 6 fast flow(GE healthcare)进行捕获步骤。在加样到柱之前，将悬浮液调节至含100mM NaCl并通过死端过滤器(Whatman，Polycap TC)。在加样之后，滞留时间维持到10分钟，用3倍柱体积(CV)清洗。在用250mM NaCl 2CV和1M NaCl 3CV的步骤中进行洗脱。在1M NaCl中洗脱EPO。

在捕获步骤之后使用Macro-prep陶瓷羟基磷灰石I型40μm(Bio-Rad)。用包含1M NaCl和10mM CaCl₂的pH 7的50mMMOPS平衡该柱。在加样之前，添加10mM CaCl₂至从蓝色柱收集的EPO。用3CV的平衡溶液接着由pH 7的0-200mM磷酸钠的10CV线性梯度，来对柱进行清洗。在60mM-100mM磷酸钠之间洗脱EPO。

Source 30S(GE Healthcare)可用作任选的纯化步骤。假如是这种情况，那么在羟基磷灰石层析之后，在4℃下通过pH 5的50mM醋酸钠过夜透析所收集的样品，用同样的缓冲液平衡该柱。应用10CV 0-750mM NaCl的线性梯度连同350-500mM NaCl之间的EPO洗脱。

纯化的EPO分析

用PNG酶F处理使N-聚糖从纯化的EPO释放(Choi PNAS，Hamilton2003 Science)，依照Laemmli(Laemrnli 1970)由通过SDS-PAGE分析(图4)。

使用配有以下组件的Hitachi D7000仪，通过大小排阻层析(SEC-HPLC)测定纯化的EPO的完整性和聚集存在情况：在280nm处监测的L7420UV检测器、在690nm处检测的Wyatt miniDAWN三角光散射检测器、在690nm处检测的Wyatt Optilab rEx示差折光率检测器、GE Healthcare Superdex 200 10/300 GL柱(#17-5175-01)、和WyattASTRA V 5.3.1.5软件(图4A-4D)。

将90微升的样品(＞0.1mg/ml)放入样品瓶中，封盖，然后注入柱中。HPLC的梯度由以下组成：使用100mM磷酸钠(pH值6.8)、150mMNaCl、和0.05％叠氮化钠的缓冲液，以0.45ml/min的流速，在室温下等度运行60分钟。

使用ASTRA软件的蛋白质缀合分析组件(module)计算分子量。将示差折光率检测器设置到浓度检测器。0.185ml/g的dn/dc用于蛋白质，0.136ml/g用于PEG和聚糖。

使用配有以下组件的Hitachi D7000 HPLC仪，通过RP-HPLC对纯化的EPO的纯度定量：L-7455二极管阵列检测器和Jupiter 5μ C4 300

150mm×4.6mm ID柱(#00F-4167-E0，Phenomenex)(图4)。注射90微升，样品在280nm处监测，用以下缓冲液依照下面的梯度(使柱温箱预热至80℃)分离：

缓冲液A：0.1％三氟醋酸(TFA)的HPLC级水溶液，用氦气喷射(sparge)

缓冲液B：0.08％TFA的HPLC级乙腈溶液，用氦气喷射

表2

时间(min)	流速(ml/min)	缓冲液A(％)	缓冲液B(％)
				0	1	95	5
1	1	95	5
				58	1	0	100
64.9	1	0	100
				65	1	95	5
70	1	95	5

使用以下仪器，通过作肽图(LC-MS)评估hEPO蛋白的质量和评价翻译后的修饰情况：Advion Triversa Nanomate、Thermo ElectronFinnigan LTQ质谱仪、Thermo Electron Finnigan Surveyor HPLC系统、Jupiter 4μPeoteo 90A柱、250×4.60mm(#00G-4396-E0，Phenomenex)、和具有10kDa分子量截断的离心柱(spin column)(VS0101，Vivascience)(图7)。

将100μl样品(＞1mg/ml)置于1.5ml Eppendorf管中，添加150μl 10MGuHCl和2.5μl 1M二硫苏糖醇(DTT)。将样品内容物混合，并使样品在37℃下温育1小时。允许样品在室温下冷却，并添加10μl 1M碘醋酸(IAA)。通过用铝箔包裹样品管来避光，并使样品在室温下温育45min。使样品缓冲液交换到pH 7.8的25mM碳酸氢铵(NH4HCO3)(6次，每次10倍稀释)，最终的体积减少至～30μL。添加1μg胰蛋白酶母液(组成：1μg/μl冻干的胰蛋白酶的50mM醋酸溶液，等分2μl/管，贮藏于-20℃)和乙腈至5％(v/v)。将反应溶液置于37℃，温育过夜(～16小时)。进行MALDI-TOF分析以确定胰蛋白酶消化完成和胰蛋白酶的活性被灭活。然后添加甲酸至0.1％(v/v)的最终浓度以降低pH。将15微升的消化液与15μl HPLC缓冲液A(0.1％甲酸(FA)的HPLC级水溶液)混合，装入样品瓶中。

HPLC设置如下：

1)样品盘温度：4℃；

2)柱温箱温度：30℃；

3)部分环注射；

4)UV检测：215nm和280nm；

5)HPLC梯度：

表3

时间(min)	流速(ml/min)	缓冲液A(％)	缓冲液B(％)
				0	1	98	2
70	1	65	35
				80	1	2	98
85	1	2	98
				86	1	98	2
90	1	98	2

质谱仪设置如下：

1)流过Advion Triversa Nanomate至LTQ～400nl/min；

2)毛细管温度：115℃，毛细管电压：5v；管透镜电压：77v

3)扫描设置为中性丢失前3至MS4，持续90min。

通过考虑从质量检测器监视基峰轨迹，来绘制色谱图。通过使用Sequest软件以及手动检查搜索hEPO序列，来鉴定存在于每一峰值中的肽。

实施例5.用于PEG基化的PEG分子和方法的描述

以下PEG分子用于hEPO的PEG基化：

来自Dow(Cambridge，UK)的40kDa线型线型甲氧基聚(乙二醇)丙醛

来自Dow(Cambridge，UK)的60kDa线型线型甲氧基聚(乙二醇)丙醛

来自NOF公司(Tokyo，Japan)的30kDa线型线型α-甲基-ω-(3-氧代丙氧基)，聚氧乙烯

来自NOF公司的45kDa支化支化的2，3-二(甲基聚氧乙烯-氧)-1-[(3-氧代丙基)聚氧乙烯-氧]-丙烷

将不同的活化的PEG(30kDa、40kDa、或60kDa线型PEGs或45kDa支化PEG)，添加至hEPO样品(浓度1mg/mL)的pH 5.2的50mM醋酸钠缓冲液中，使蛋白质∶PEG比值为1∶10。通过将10mM氰基硼氢化钠添加至反应混合物并整夜搅拌，在还原的条件下，在室温下进行反应。通过添加10mM TRIS停止反应。使用SP sepharose Fast Flow柱纯化单PEG基化的hEPO，并用SDS-PAGE分析(图5)。

如果期望进一步优化，可以检验以下参数：

1)不同的pH范围(pH值4.0、4.5、5.2和6.0)

2)hEPO∶mPEG-醛的不同摩尔比(1∶5、1∶10、1∶20)

3)室温对4℃

4)不同类型的PEG

实施例6.PEG基化的Epo产物的特征

通过如实施例4所述的SEC HPLC(图6)，来分析四种不同的PEG基化的EPO产品。为了对N-联聚糖结构进行定量(图7)，使N-联聚糖通过用PNG酶F(Choi PNAS，Hamilton 2003 Science)处理，从PEG基化的EPO中释放，并使用市售的2-AB标记试剂盒，用2-氨基联苯胺(2-AB)标记。使用Prevail CHO ES、5微米珠、维持在30℃的连接氨基的二氧化硅柱，进行HPLC。洗脱概况如下(溶剂A：100％乙腈，溶剂B：50mM甲酸铵pH值4.4)：

表4

时间/min	流速(ml/min)	％A	％B
				0	1	80	20
30	1	40	60
				60	1	0	100
65	1	0	100
				70	1	80	20
80	1	80	20

图7显示：在试验样品中约70-74％的PEG基化的EPO产物被双唾液酸化(见分图中的最后的峰)。

实施例7.制剂

PEG-EPO的代表性制剂可为20mM磷酸钠、140mM氯化钠、0.005％聚山梨酯80，pH 6.0，该代表性制剂基于类似的市售促红细胞生成素产品。可将PEG-EPO配制为无菌、澄清液体的注射剂，具有多重效能，分配在单剂量玻璃瓶(vialsranging)中，浓度为25-500μg/mL。因为这些浓度处于低范围，所以存在关于蛋白质吸附至小瓶，可致使剂量损失的忧虑。为了使吸附情况最小化，通常按受限的浓度将表面活性剂添加至制剂(即，聚山梨酯20、聚山梨酯80)。对表面活性剂的需要将基于在制剂开发期间进行的材料相容性研究。

市售EPO的其它制剂

已了解促红细胞生成素的市售制剂，它们可经修改与本发明的促红细胞生成素一起使用。市售的EPO制剂的一些实例如下：

ARANESP

：聚山梨醇酯溶液：每1mL包含0.05mg聚山梨酯80，并在pH 6.2±0.2时用2.12mg一水合磷酸二氢钠、0.66mg无水磷酸二钠、和8.18mg氯化钠，在注射用水USP(美国药典)中配制(至1mL)。

白蛋白溶液：每1mL包含2.5mg白蛋白(人)，并在pH 6.0±0.3时用2.23mg一水合磷酸二氢钠、0.53mg无水磷酸氢二钠、和8.18mg氯化钠，在注射用水USP中配制(至1mL)。

在等渗氯化钠/柠檬酸钠缓冲溶液或氯化钠/磷酸钠缓冲溶液中，将EPOGEN

配制为用于静脉内(IV)或皮下(SC)给药的无菌、无色液体。

单剂量，不含防腐剂的瓶：每1mL的溶液包含2000、3000、4000或10,000单位的阿法依泊汀(Epoetinα)、2.5mg白蛋白(人)、5.8mg柠檬酸钠、5.8mg氯化钠、和0.06mg柠檬酸，在注射用水USP(pH 6.9±0.3)中。该制剂不含防腐剂。贮存瓶包含1％苯甲醇。

实施例8 PEG-EPO的体内分析

在小鼠中的体内试验：

小鼠的效能研究：将在经工程改造以产生双天线的末端唾液酸化的(＞70％)人EPO的巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)菌株YGLY3159中产生的四个不同模型的PEG-EPO，与市售的Aranesp比较它们的增加血细胞比容的能力。获得C57B6小鼠(在研究开始时为7周龄，重量18-20g，每处理组3个雄性/3个雌性)，适应一周。在给药之前测定血细胞比容值以获得各动物的基线。将动物分成六组：

(1)载体(盐水+100μg/ml rHSA)；

(2)ARANESP2.5μg/kg/剂量(达贝泊汀(darbepoetin)，不含白蛋白)；

(3)PEG-EPO[40kDa线型DOW]2.5μg/kg/剂量；

(4)PEG-EPO[60kDa线型DOW]2.5μg/kg/剂量；

(5)PEG-EPO[30kDa线型NOF]2.5μg/kg/剂量；

(6)PEG-EPO[45kDa支化NOF]2.5μg/kg/剂量。

通过每周两次(星期一和星期四)腹膜内注射给药给动物，总共注射五次(在2.5周之后停止给药)。每周从小鼠取血(星期一)并测定血细胞比容值。用本发明的PEG-EPO缀合物注射的小鼠显示比市售的Aranesp增加的血细胞比容。数据呈现于图8中。

进行第二项研究，其中动物：每周一次给予C57小黑鼠(7周龄；～20g；每组3个雄性/3个雌性)2.5μg/kg/剂量的重组人EPO。在研究期间，星期四注射，星期一从动物取血。该研究评估每周一次腹膜内给予四种PEG-EPO结合物和Aranesp(NESP)对血细胞比容水平的影响。数据呈现于图13中。

免疫原性研究：

为了确定(address)PEG-EPO的免疫原性，可以两次/周，持续2周皮下注射来给药给恒河猴。可明确地鉴定基于ELISA方法，并测定在恒河猴血中和接着测定在人血中重组促红细胞生成素的抗体。在皮下给予PEG-EPO之后，可随时间监测血清样品的抗促红细胞生成素抗体的产生。另外，潜在的抗体应答可以与可以同时监测的药代动力学参数和药效参数相关。

序列表

<110>格利科菲公司

<120>促红细胞生成素组合物

<130>22376Y PCT

<150>60/905,770

<151>2007-03-07

<160>2

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>558

<212>DNA

<213>人

<400>1

atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60

ccaccaagat tgatttgtga ctccagagtt ttggagagat acttgttgga ggctaaagag 120

gctgagaaca tcactactgg ttgtgctgaa cactgttcct tgaacgagaa catcacagtt 180

ccagacacta aggttaactt ctacgcttgg aagagaatgg aagttggaca acaggctgtt 240

gaagtttggc aaggattggc tttgttgtcc gaggctgttt tgagaggtca agctttgttg 300

gttaactcct cccaaccatg ggaaccattg caattgcacg ttgacaaggc tgtttctgga 360

ttgagatcct tgactacttt gttgagagct ttgggtgctc agaaagaggc tatttctcca 420

ccagatgctg cttcagctgc tccattgaga actatcactg ctgacacttt cagaaagttg 480

ttcagagttt actccaactt cttgagagga aagttgaagt tgtacactgg tgaagcttgt 540

agaactggtg actagtaa 558

<210>2

<211>165

<212>PRT

<213>人

<400>2

Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu

1 5 10 15

Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His

20 25 30

Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe

35 40 45

Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp

50 55 60

Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu

65 70 75 80

Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp

85 90 95

Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu

100 105 110

Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala

115 120 125

Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val

130 135 140

Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala

145 150 155 160

Cys Arg Thr Gly Asp

165

Claims

1.促红细胞生成素蛋白组合物，所述组合物包含连接至促红细胞生成素的多种双天线N-联聚糖，所述多种N-联聚糖包含大于25摩尔百分率的具有N-乙酰葡糖胺₂甘露糖₃N-乙酰葡糖胺₂半乳糖₂N-乙酰神经氨酸₂，即GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂Gal₂NANA₂的结构的N-联聚糖，其中聚乙二醇连接至至少50％的促红细胞生成素蛋白的N-末端氨基酸残基，所述连接为胺连接。

2.权利要求1的组合物，其中大于50摩尔百分率的所述多种N-联聚糖由GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂Gal₂NANA₂组成。

3.权利要求1的组合物，其中大于75摩尔百分率的所述多种N-联聚糖由GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂Gal₂NANA₂组成。

4.权利要求1的组合物，其中所述具有GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂Gal₂NANA₂的结构的N-联聚糖以比所述多种N-联聚糖的下一种最主要N-联聚糖结构多5摩尔百分率-80摩尔百分率的水平存在。

5.权利要求1的组合物，其中所述聚乙二醇的分子量为20kD-60kD。

6.权利要求1的组合物，其中所述聚乙二醇的分子量为30kD-40kD。

7.权利要求1的组合物，其中所述聚乙二醇为线型。

8.权利要求1的组合物，其中所述促红细胞生成素不含乳糖胺。

9.药用组合物，该药用组合物包含权利要求1、2、3、5、6或7中任一项的组合物和药学上可接受的稀释剂。

10.权利要求2、3、4、5、6或7中任一项的组合物在制备用于治疗有需要的哺乳动物的贫血的药物中的用途。

11.权利要求10的用途，其中所述药物每4-6周给药一次。

12.权利要求11的用途，其中所述药物按0.05-500μg/kg的剂量给药。