TWI803946B - 製造重組玻尿酸酶的方法 - Google Patents

Abstract

揭露一種製造玻尿酸酶或其變異體的方法。具體而言，此方法能夠在包含在培養基中受控的葡萄糖濃度以及在特定培養期間降低的溫度之培養條件下改變N-聚醣程度，從而提升比活性10%或更多並改善品質及產率。

Description

製造重組玻尿酸酶的方法

本發明係關於製造玻尿酸酶PH20變異體的方法，所述玻尿酸酶PH20變異體包含一或多個胺基酸殘基取代，並可選地包含於玻尿酸酶的某些胺基端及／或羧基端胺基酸殘基的缺失，尤其是野生型或成熟的野生型PH20或是野生型或成熟的野生型PH20胺基酸序列。

玻尿酸酶（Hyaluronidase）係降解存在於胞外基質的玻尿酸的酵素。玻尿酸酶水解玻尿酸從而降低胞外基質中玻尿酸黏度並增加對組織（皮膚）的滲透性（Bookbinder et al., 2006）。玻尿酸酶已被用於提升由皮下注射（Muchmore et al., 2012）或肌內注射（Krantz et al., 2016）提供之體液的吸收，以及改善局部麻醉的擴散（Clement et al. al., 2003）。以此種方式促進皮下給藥的藥物包含嗎啡（Thomas et al., 2009）、頭孢克松（Ceftriaxone）（Harb et al., 2010）、胰島素（Muchmore et al., 2012）及免疫球蛋白（Wasserman et al., 2014）。玻尿酸酶亦可用於改善由靜脈注射或血腫擴散而滲入組織的藥物或液體的分散。在玻尿酸酶之中，在中性pH下具有活性之重組人類PH20蛋白由Halozyme Therapeutics Inc.開發，並以商標名「Hylenex」販售（Bookbinder et al., 2006）。

已報導重組人類PH20蛋白於酵母菌（ P. pastoris）、DS-2昆蟲細胞及動物細胞中表現。於昆蟲細胞及酵母菌中產生的重組PH20蛋白在轉譯後修飾的過程中N-糖苷化模式方面不同於人類PH20，因此會影響其活性且帶來在體內發生副作用的風險。

對於生物製藥開發而言，產品一致性及長保存期限係提供製造靈活性的重要因素。在製造過程中，因酵素或自發降解及修飾所導致之尺寸及電荷的差異會出現各種類型的微異質性（microheterogeneity）。如去醯胺化（deamidation）及唾液酸化（sialylation）之各種化學及酵素修飾都會增加抗體中的淨負電荷並減少pI值，從而形成酸性變異體（Harris RJ et al., 2004）。此外，羧基端離胺酸裂解會造成淨正電荷的缺失以及酸性變異體的形成。鹼性變異體的形成可由羧基端離胺酸或甘胺酸去醯胺化、琥珀醯亞胺形成、胺基酸氧化或是唾液酸去除而造成，其中唾液酸去除會去除額外的正電荷或負電荷，兩種類型的修飾都會增加pI值（Harris RJ et al., 2004）。

糖苷化（Glycosylation）係細胞（真核生物）中蛋白質的轉譯後過程，並發生於內質網及高基氏體。糖苷化分為N-糖苷化及O-糖苷化，其依據所連接之官能基而不同。將如乳糖或岩藻醣之糖類連接於細胞中所產生之蛋白質的過程被廣泛稱為「糖苷化」。當聚醣透過糖苷化連接於蛋白質時，蛋白質會進行「摺疊」過程以形成三維結構。這賦予蛋白質穩定性，而使得其能長時間保持而不鬆開（展開）。聚醣係用以使細胞間能夠溝通及資訊交換的關鍵過程。

將聚醣添加至蛋白質有兩種類型的反應：N-連接（N-linked）或O-連接（O-linked）糖苷化。這兩種糖苷化過程在聚醣合成及添加機制上不同，在此等之中，N-糖苷化的機制與角色較為人所知。透過N-糖苷化添加的聚醣稱為「N-聚醣」，且形成於內質網中。存在於內質網膜之多萜醇焦磷酸（dolichol pyrophosphate，PP-Dol）上的一系列的天門冬醯胺酸連接糖苷化（asparagine-linked glycosylation，ALG）酶添加有N-乙醯葡萄糖胺（GlcNAc）、甘露糖（Man）、葡萄糖（Glc）等，最終合成Glc3Man9GlcNAc2-PP-Dol，其為一種脂質連接寡糖（lipid-linked oligosaccharide，LLO）形式的複雜聚醣。合成之LLO轉移至包含N-x-S/T之胜肽的N-糖苷化序列，N-x-S/T透過由8或更多個次單元組成之寡糖轉移酶的轉譯中移位機制直接從核糖體轉譯至內質網。連接於蛋白質的N-聚醣由存在於內質網的葡萄糖苷酶（α-葡萄糖苷酶I，Gls1p；α-葡萄糖苷酶II，Glsp II）從聚醣的末端一個個被移除。由於第二及第三個葡萄糖移除得較慢，故會在凝集素伴護蛋白（lectin chaperone）、鈣連伴護蛋白（calnexin）及鈣網伴護蛋白（calreticulin）的幫助下完成摺疊。當所有葡萄糖都被切除時，蛋白質摺疊視為完成，連接於其之Man8GlcNAc2聚醣轉移至高基氏體。在此方面，在其從內質網轉移至高基氏體之前，會有再次驗證醣蛋白之摺疊的品質管制過程。當未達成適當的摺疊時，會重複藉由使一分子之葡萄糖進入鈣連伴護蛋白／鈣網伴護蛋白循環以提供完成摺疊的機會的過程。

上述於內質網中之N-聚醣之生物合成的初始過程在從酵母菌（一種簡單的真核微生物）至動物（即高等生物）之廣泛範圍的生物體中幾乎以相同的方式保守。然而，轉移至高基氏體的聚醣會進行各物種特定的多種聚醣修飾，導致在酵母菌、昆蟲及動物中形成完全不同類型的聚醣。然而，這些多種聚醣通常亦共有一種核心位置，即三個甘露糖及兩個GlcNAc連接於天門冬醯胺酸之氮的結構，其稱為「三甘露糖核（trimannosyl core）」。甘露糖主要連接於三甘露糖核的形式稱為「高甘露糖型（high-mannose type）」，並常見於酵母菌及黴菌中。多個甘露糖連續添加於高基氏體的結構亦發現於釀酒酵母菌（ Saccharomyces cerevisiae），其為一種眾所周知的酵母菌。另一方面，具有缺乏甘露糖型（deficient mannose type）（少甘露糖型（Pauci-mannose type））之聚醣的醣蛋白被發現於昆蟲細胞。這些首先在高基氏體中藉由甘露糖苷酶IA、IB及IC修剪以形成Man5GlcNAc2，N-乙醯葡萄糖胺轉移酶（GNT）I用以將一個GlcNAc添加至Man5GlcNAc2，接著甘露糖苷酶II用以形成一個GlcNAc添加至三甘露糖核之混合結構。接著，所添加之GlcNAc再次被切除，形成缺乏甘露糖型之聚醣結構。在動物細胞中，α(1,6)-岩藻糖常被添加至連結於天門冬醯胺酸殘基的第一個GlcNAc。在動物中，GNT II作用於一個GlcNAc添加至三甘露糖核且另一個GlcNAc添加於其之結構，形成具有二天線結構（two antenna structure）之聚醣。接著，GNT IV及V可用以形成四天線結構，在某些情況下，GNT VI、IX或VB可用以形成六天線結構。在添加GlcNAc以形成天線骨架之後，存在於高基氏體的β-半乳糖轉移酶及α-唾液酸轉移酶用以形成半乳糖及唾液酸添加至GlcNAc之複雜聚醣結構。

N-糖苷化可深深影響蛋白質的摺疊或活性，當在工業應用上使用基因工程方法製造存在於自然界的蛋白質或其變異體時，糖苷化的存在及聚醣的結構或形式很有可能依據宿主細胞、重組操作方法及培養條件而異（Schilling, et al., 2002）。亦即，依據蛋白質生產過程中的生產條件之差異會出現構成聚醣之糖成分或聚醣的結構之量的差異。影響N-糖苷化的培養條件包含培養基中葡萄糖或麩醯胺酸的濃度（Tachibana et al. 1994）、溶氧（dissolved oxygen，DO）的濃度（Restelli et al. 2006）、培養基之pH（Borys et al. 1993）、培養基中氨的濃度（Borys et al. 1994）、培養溫度（Clark et al. 2004）等。

一般而言，酵素會特定結合於受質以形成酵素-受質複合物，其作為催化劑以降低反應的活化能並促進酵素的反應。酵素能夠區分受質以及與受質競爭的分子，並且因酵素結合於受質之位置的互補電荷的分布、互補結構以及親水性及疏水性而能夠特定結合於受質。為了闡明酵素的結合位置，已提出一種酵素和受質彼此互補且具有幾何形狀的鎖鑰模型，但不能滿意地解釋酵素-受質複合物的過渡態。根據為克服此問題而提出之誘導嵌合模型，隨著酵素與受質在酵素-受質複合物中持續相互作用，它們會基於酵素蛋白質的可變性結構而改變其結構。在此過程中，透過由構成活性位置之N-聚醣或胺基酸殘基所致之周圍電荷的分布或是透過親水性／疏水性的分布能夠進一步促進反應。

再者，電荷相互作用對於玻尿酸酶的反應為必需，玻尿酸酶為一種水解作為受質之玻尿酸的酵素。Arming等人揭露在玻尿酸酶PH20中之具有正電荷的精胺酸對於結合玻尿酸的酵素活性而言為必需，其中玻尿酸為一種具有大量負電荷分布於其中的受質（Arming et al. 1997）。因此，可推斷N-聚醣的電荷分布亦會影響此酵素活性。重要的是證明當作為具有大量負電荷之受質的玻尿酸結合至玻尿酸酶時，N-聚醣中之帶負電的唾液酸加帽糖（sialic-acid-capping sugar）的程度（即，唾液酸化程度）會影響酵素-受質複合物的形成或是酵素反應的進行。為了限制唾液酸化程度，應限制唾液酸轉移至半乳糖殘基、應進行去唾液酸化或是應限制半乳糖化程度。

因此，重組玻尿酸酶PH20及其變異體的生產力及活性會受N-聚醣之程度變化影響，故對於在本領域有效大量生產而言，需要研究開發一種製造具有高活性及生產力並透過控制及維持N-聚醣的程度而可用於工業上之玻尿酸酶PH20或其變異體的方法。

因此，本發明係鑑於上述問題而完成，本發明之一目的在於提供一種培養製造重組玻尿酸酶PH20或其變異體之宿主細胞的方法以及藉由此方法製備之玻尿酸酶PH20或其變異體，尤其是一種製造具有改善的酵素活性及生產力之玻尿酸酶PH20或其變異體的方法。

本發明之目的不限於上述內容。本領域具有通常知識者將由以下說明清楚理解於此未描述的其他目的。

在本發明中，當用於製造重組玻尿酸酶PH20或其變異體的宿主細胞在特定培養條件下培養時，所產生之重組玻尿酸酶PH20或其變異體的N-糖苷化特性，進一步而言，所產生之玻尿酸酶PH20或其變異體的酵素活性，會顯著改善。

具體而言，發現藉由控制N-聚醣中之唾液酸化、半乳糖化及／或甘露糖化程度，尤其是唾液酸化程度，會有效提升所產生之玻尿酸酶PH20或其變異體的活性，並發現藉由在改變培養溫度後進行培養特定時間，能夠顯著改善根據本發明之玻尿酸酶PH20或其變異體的酵素活性及生產力。

具體而言，根據本發明之製造玻尿酸酶PH20或其變異體的方法，包含：

（1）於35°C至38°C之培養溫度培養表現重組玻尿酸酶PH20或其變異體的宿主細胞至積分活細胞密度（Integral viable cell density）為20x10 ⁶至120x10 ⁶個細胞x天／毫升；以及

（2）將培養溫度降低至28°C至34°C，接著依據選自以下組成之群組之至少一方法，在維持培養溫度同時將宿主細胞培養2至18天：

（a）培養宿主細胞，同時在培養期間維持培養基中之剩餘葡萄糖的濃度介於0.001克／升（g/L）及4.5 g/L之間；以及

（b）培養宿主細胞，同時維持培養基的pH於6.8至7.2。

由根據本發明之製造方法所製造之PH20或其變異體之特徵在於所產生之PH20或其變異體的N-聚醣的唾液酸化量為1至38%，從而酵素活性會顯著提升，但不限於此，此數值為具有10%之誤差範圍的實驗數值。其原因在於在設定培養條件時，取決於例如使用於培養的設備及試驗者的操作熟練度之條件而會產生差異，故考量這些差異，本發明所設定之數值應被解釋為廣義的意義，而非狹義的意義。宿主細胞可藉由選自由批次培養（batch culture）、重複批次培養（repeated batch culture）、饋料批式培養（fed-batch culture）、重複饋料批式培養（repeated fed-batch culture）、連續培養（continuous culture）及灌注培養（perfusion culture）組成之群組之一或多種方法來進行。

除非另有定義，否則於此所使用之技術及科學術語與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解具有相同意義。一般而言，於此所使用之命名法為眾所周知且常為人所用。

本發明係基於以下發現：唾液酸化、半乳糖化及／或甘露糖化程度，尤其係N-聚醣的唾液酸化程度，對於當在工業應用上使用基因工程方法製造玻尿酸酶PH20或其變異體時之玻尿酸酶PH20或其變異體的酵素活性及生產力而言相當關鍵。

具體而言，發現當PH20或其變異體之N-聚醣的唾液酸化量為1至38%時，較佳為1至30%，更佳為1.5至28%，最佳為2至25%，玻尿酸酶PH20或其變異體的酵素活性及生產力會改善至出乎意料之高的程度。

更具體而言，發現當PH20或其變異體之N-聚醣的半乳糖化程度為1至68%、其唾液酸化量為1至38%且其甘露糖化量為40至63%時，較佳為當其半乳糖化量為5至60%、其唾液酸化為1至30%且其甘露糖化量為42至62%時，更佳為當其半乳糖化量為10至56%、其唾液酸化量為1.5至28%且其甘露糖化量為44至61%時，最佳為當其半乳糖化量為15至50%、其唾液酸化量為2至25%且其甘露糖化量為47至60%時，玻尿酸酶PH20或其變異體的酵素活性及生產力會改善至出乎意料之高的程度。

上述數值來自表1所示之示例的實驗結果，且係以95%信賴區間所獲得之數值，該數值亦可包含10%的誤差。這是因為在蛋白質中之糖（葡萄糖）程度的量測上存在差異，其取決於例如使用於實驗的設備、酵素反應時間、試驗溫度、試驗者的熟練度等之條件，故考量實驗室之間的差異，本發明中所量測之葡萄糖程度應被解釋為廣義的意義，而非受限的意義。

在本發明中，N-聚醣的半乳糖化比例（%）為在N-聚醣之中於其末端含有半乳糖之聚糖的比例（%）的總和，例如G1、G1F、G1F'、G2、G2F、A1、A1F、A2及A2F，唾液酸化比例（%）為在N-聚醣之中於其末端含有唾液酸之N-聚醣的比例（%）的總和，例如A1、A1F、A2及A2F，甘露糖化比例（%）為在N-聚醣之中於其末端含有甘露糖之N-聚醣的總和，例如的M4G0F、M5、M5G0、M6、M7及M8。

更具體而言，根據本發明之製造N-聚醣中的唾液酸化量為1至38%之玻尿酸酶PH20或其變異體的方法包含：

（1）於35°C至38°C之培養溫度培養表現重組玻尿酸酶PH20或其變異體的宿主細胞至積分活細胞密度（integral viable cell density）為20x10 ⁶至120x10 ⁶個細胞x天／毫升；以及

（2）將培養溫度降低至28°C至34°C，接著依據選自以下組成之群組之至少一方法，在維持培養溫度同時將宿主細胞培養2至18天：

（a）培養宿主細胞，同時在培養期間維持培養基中之剩餘葡萄糖的濃度介於0.001克／升（g/L）及4.5 g/L之間；以及

（b）培養宿主細胞，同時維持培養基的pH於6.8至7.2。

上述數值為具有10%之誤差範圍的實驗數值。其原因在於在設定培養條件時，取決於例如使用於培養的設備及試驗者的操作熟練度之條件而會產生差異，故考量這些差異，本發明所設定之數值應被解釋為廣義的意義，而非狹義的意義。

從步驟（1）至步驟（2）之培養溫度的降低在積分活細胞密度達到20x10 ⁶至120x10 ⁶個細胞x天／毫升時進行，較佳為40x10 ⁶至100x10 ⁶個細胞x天／毫升，更佳為60x10 ⁶至80x10 ⁶個細胞x天／毫升，但不限於此。

此外，步驟（2）之培養期間可為2至18天，較佳為3至16天，更佳為4至14天，但不限於此。

舉例而言，在根據本發明之PH20或其變異體的製造中使用饋料批式培養方法的情況下，透過下述方式，PH20或其變異體的生產力能最大化且所產生之PH20或其變異體的酵素活性能顯著改善，方式如下：在主要培養之前立即透過灌注培養或饋料批式培養在35°C至38°C下進行種菌培養直到細胞濃度達到特定程度，接下來在低於35°C之降低的溫度下透過接種進行主要培養2至18天，較佳為3至16天，更佳為4至14天。

主要培養的細胞接種濃度可為1x10 ⁵個細胞／毫升或更高，較佳為5x10 ⁵個細胞／毫升或更高，更佳為1x10 ⁶個細胞／毫升或更高，但不限於此。

藉由在根據本發明之PH20或其變異體的製造中使用饋料批式培養與灌注培養之組合進行培養，PH20或其變異體的生產力能最大化且所產生之PH20或其變異體的酵素活性能顯著提升。

在本發明中，在培養期間中培養基中的剩餘葡萄糖濃度維持於0.001 g/L至4.5 g/L，較佳為0.01至4.0 g/L，更佳為0.1至3.5 g/L，但本發明不限於此。

於此所使用之「在培養過程中培養基中的剩餘葡萄糖濃度維持於0.001 g/L至4.5 g/L，較佳為0.01至4.0 g/L，更佳為0.1至3.5 g/L」之表述，表示當在培養期間以1至36小時，較佳為3至30小時，更佳為6至24小時，或是即時量測之培養基中的剩餘葡萄糖濃度低於0.001 g/L至4.5 g/L之設定參考濃度時，較佳為0.01至4.0 g/L時，更佳為0.1至3.5 g/L時，將葡萄糖原液加入培養基以在培養時獲得對應的參考濃度。

在本發明中，對於本領域具有通常知識者顯而易見的是，培養基中的剩餘葡萄糖濃度的參考濃度可設定於0.001 g/L至4.5 g/L，較佳為0.01至4.0 g/L，更佳為0.1至3.5 g/L，參考濃度在培養期間可適當改變。舉例而言，在培養的第一及第二天培養基中的剩餘葡萄糖的參考濃度為2 g/L，在培養的第三至第五天將參考濃度降低為1.5 g/L，之後將參考濃度設定為低於1.5 g/L之程度，例如1.0 g/L。

由根據本發明之方法製造且於N-聚醣部分具有預定的唾液酸化、半乳糖化及／或甘露糖化程度的玻尿酸酶PH20或其變異體在玻尿酸酶的培養基中的活性為10,000單位／毫升（unit/mL），較佳為11,000 units/mL，或更佳為12,000 units/mL或更高，但不限於此。

此外，由根據本發明之方法製造且於N-聚醣具有預定的唾液酸化、半乳糖化及／或甘露糖化的玻尿酸酶PH20或其變異體為由習知方法製造之野生型人類PH20，且相較於由習知方法製造之野生型人類PH20的活性，酵素活性提升10%或更多，較佳為12%或更多，更佳為15%或更多，但本發明不限於此。

較佳地，在根據本發明之製造玻尿酸酶PH20或其變異體的方法中，在步驟（1）及／或步驟（2）中宿主細胞的培養可在選自由以下組成之群組之一或多個條件下進行：（i）將氨添加至培養基或提高培養基中的氨濃度至5 mM或更多；（ii）將選自由麩醯胺酸、葡萄糖胺、尿苷、葡萄糖胺及丁酸鈉組成之群組之一或多種物質加入培養基；以及（iii）不將半乳糖及manNAc加入至培養基，但本發明不限於此。

更具體而言，在根據本發明之製造玻尿酸酶PH20或其變異體的方法中，在步驟（1）及／或步驟（2）中宿主細胞的培養可藉由以下方式進行：將氨添加至培養基、提升氨濃度至5 mM或更多、將麩醯胺酸加入其中、不將半乳糖及manNAc加入其中、將尿苷或葡萄糖胺加入其中並將丁酸鈉加入其中，但本方法不限於此。

於此所使用之用語「玻尿酸酶PH20或其變異體」係指降解位於胞外基質之玻尿酸的酵素。

於此所使用之用語「玻尿酸酶PH20」或「PH20」被解釋為包含野生型PH20及其成熟型兩者，用語「玻尿酸酶PH20或PH20的變異體」表示包含一或多個胺基酸殘基之取代、缺失或插入並可選地包含於「玻尿酸酶PH20」或「PH20」的胺基酸序列中某些胺基端及／或羧基端胺基酸殘基的缺失之PH變異體，但不限於此。

根據本發明之玻尿酸酶係指源自動物或如鏈黴菌屬（ Streptomyces）之微生物且具有玻尿酸酶活性的玻尿酸酶，其中「玻尿酸酶PH20」或「PH20」源自動物或如鏈黴菌屬之微生物，較佳為源自人類、牛或羊。

根據本發明之源自人類的「玻尿酸酶PH20」或「PH20變異體」示例於國際專利公開第2020/022791號及美國專利第9,447,401號，但不限於此，並被解釋為包含任何包含一或多個胺基酸殘基之取代、缺失及插入並可選地包含於「玻尿酸酶PH20」或「PH20」的胺基酸序列中胺基端及／或羧基端胺基酸殘基的截斷（truncation）且具有玻尿酸酶酵素活性之玻尿酸酶或變異體。

於此所使用之用於表現玻尿酸酶蛋白之宿主細胞的示例可包含動物細胞、酵母菌、放線菌及昆蟲細胞等，但不限於此。

動物細胞較佳為哺乳動物細胞，更佳地，常用的動物培養細胞，例如CHO細胞、HEK細胞、COS細胞、3T3細胞、骨髓瘤細胞、BHK細胞、HeLa細胞及Vero細胞，具體較佳為用於大量表現之CHO細胞。此外，為了製造期望的蛋白質，較佳使用適合用於導入期望的基因的細胞，例如dhfr-CHO細胞（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220）或CHO K-1細胞（其為DHFR基因剔除之CHO細胞）（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275）或CHO K-1細胞（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275）。CHO細胞具體較佳為DG44、DXB-11、K-1或CHO-S細胞株，載體至宿主細胞導入使用如磷酸鈣方法、DEAE右旋糖聚糖方法或脂蛋白方法之方法進行。

酵母菌的示例包含 Saccharomyces sp.、 Hansenula sp.、 Kluyveromyces 、 Pichia sp.等，放線菌包含例如 Streptomyces，但不限於此。

在根據本發明之製造玻尿酸酶PH20或其變異體的方法中，在步驟（1）及／或步驟（2）中宿主細胞的培養可藉由選自由批次培養、重複批次培養、饋料批式培養、重複饋料批式培養、連續培養及灌注培養組成之群組之一或多種方法進行，但不限於此。

批次培養係在培養過程中不添加新鮮培養基或排放培養溶液之用於增殖細胞的培養方法。連續培養係在培養過程中連續添加及排放培養基的培養方法。此外，連續培養包含灌注培養。饋料批式培養介於批次培養及連續培養之間，亦稱為「半批次培養」，涉及在培養過程中連續或依序添加培養基。此培養方法即使連續排放培養溶液亦會防止細胞的排放。在本發明中，可使用任何培養方法，較佳為饋料批式培養或連續培養，具體較佳為饋料批式培養。

如上所述，在由本發明之方法製造之玻尿酸酶PH20或其變異體中，相較於由一般方法製造者，尤其相較於野生型人類PH20的比活性，酵素的比活性可增加10%或更多。此酵素活性的增加係因由根據本發明之方法製造之玻尿酸酶PH20或其變異體之N-糖苷化性質及／或電荷修飾的變化。

尤其，酵素活性依據N-糖苷化模式之中之唾液酸化、半乳糖化及／或甘露糖化的變化而增加。這些N-糖苷化特徵，尤其是唾液酸化、半乳糖化及／或甘露糖化能藉由根據本發明之製造方法來調整。

在本發明中，葡萄糖及蛋白質之間之共價鍵的示例包含N-糖苷鍵及O-糖苷鍵等，在N-糖苷鍵中N-乙醯基-D-葡萄糖胺共價連接於構成蛋白質的天門冬醯胺酸殘基（N-糖苷連接聚醣），在O-糖苷鍵中N-乙醯基-D-半乳糖胺共價連接於絲胺酸或蘇胺酸殘基（O-糖苷連接聚醣），在本發明之醣蛋白中葡萄糖及蛋白質之間的共價鍵類型沒有特別限制，包含N-糖苷連接聚醣及O-糖苷連接聚醣之一或二者的醣蛋白落於根據本發明之醣蛋白。

在此態樣中，本發明係針對玻尿酸酶PH20或其變異體，其在N-聚醣量中之唾液酸化量為1至38%，較佳為1至30%，更佳為1.5至28%，最佳為2至25%。

更具體而言，本發明係針對玻尿酸酶PH20或其變異體，其在N-聚醣量之半乳糖化量為1至68%、在N-聚醣量之唾液酸化量為1至38%且在N-聚醣量之甘露糖化量為40至63%，較佳為在N-聚醣量之半乳糖化量為5至60%、在N-聚醣量之唾液酸化量為1至30%且在N-聚醣量之甘露糖化量為42至62%，更佳為在N-聚醣量之半乳糖化量為10至56%、在N-聚醣量之唾液酸化量為1.5至28%且在N-聚醣量之甘露糖化量為44至61%，最佳為在N-聚醣量之半乳糖化量為15至50%、在N-聚醣量之唾液酸化量為2至25%且在N-聚醣量之甘露糖化量為47至60%。

上述數值來自表1所示之示例實施例的實驗結果，且係由具有95%信賴區間之數值而獲得，該數值亦包含10%的誤差。這是因為在蛋白質中之葡萄糖含量的量測上存在差異，其取決於例如使用於實驗的設備、酵素反應時間、試驗溫度、試驗者的熟練度等之條件，故考量實驗室之間的差異，本發明中所量測之葡萄糖含量應被解釋為廣義的意義，而非受限的意義。此外，PH20或其變異體的電荷修飾可透過等電聚焦（isoelectric focusing）來確定。

根據本發明之在N-聚醣量具有特定的唾液酸化及／或半乳糖化及甘露糖化量的玻尿酸酶PH20或其變異體較佳藉由根據本發明之製造方法來製造，但不限於此，而顯然玻尿酸酶PH20或其變異體能藉由經本領域具有通常知識者修改的其他方法來製造。

在本發明中，用於培養細胞以表現醣蛋白的培養基較佳為但不限於是無血清培養基，可使用DMEM/F12培養基（一種DMEM及F12培養基的組合）作為基礎培養基。此外，可使用市售可用的無血清培養基，例如HycellCHO培養基、ActiPro培養基（HyClone, USA）、CD OptiCHO ^TM培養基、CHO-S-SFM II培養基或CD CHO培養基（Gibco, USA）、IS CHO-V ^TM培養基（Irvine Scientific, USA）、EX-CELL ^®Advanced CHO饋料批式培養基（Sigma-Aldrich, USA）等，作為基礎培養基，但本發明不限於此。

在本發明中，用於培養細胞以表現醣蛋白的供料培養基（feed medium）為無血清培養基，舉例而言，可使用Cell Boost ^TM1、Cell Boost ^TM2、Cell Boost ^TM3、Cell Boost ^TM4、Cell Boost ^TM5、Cell Boost ^TM6、Cell Boost ^TM7a/7b (HyClone, USA)、CD CHO EfficientFeed ^TMA AGTTM、CD CHO EfficientFeed ^TMB AGTTM、CD CHO EfficientFeed ^TMC AGTTM、CD CHO EfficientFeed ^TMA plus AGTTM、CD CHO EfficientFeed ^TMB plus AGTTM、CD CHO EfficientFeed ^TMC plus AGT ^TM（Gibco, USA）、BalanCD ^®CHO Feed 4（Irvine Scientific, USA）、EX-CELL ^®Advanced CHO Feed（Sigma-Aldrich, USA）、CHO-U Feed Mix U1B7/ CHO-U Feed Mix U2B13（Kerry, USA）作為供料培養基，但本發明不限於此。

於此所使用之用語「供料培養基」及「濃縮營養培養基」係指由特定營養物或如胺基酸、維生素、鹽類、微量元素、脂質及葡萄糖之多種營養物組成的培養基，並可為基礎培養基的濃縮產物。所製造之供料培養的成分及濃度可依據所欲培養之細胞而變化。此外，可使用市售可用之供料培養基，例如Cell Boost系列補充培養基（HyClone, USA）、EfficientFeed補充培養基、GlycanTune供料培養基（Gibco, USA）、BalanCD CHO供料培養基（Irvine Scientific, USA）、Cellvento® CHO細胞培養供料培養基（Merck, USA）、EX-CELL® Advanced CHO供料培養基（Sigma-Aldrich, USA）等，作為供料培養基，但本發明不限於此。

於此所使用之用語「源自植物的水解產物」係指從豌豆、棉籽、小麥麩質（wheat glute）、大豆等萃取且不包含源自動物之成分的產品，且係包含大量胺基酸、胜肽、維生素、碳水化合物、核苷酸、礦物質及其他成分的補充物，亦可依據所欲培養之細胞而製造成包含多種成分及成分濃度。此外，可使用市售可用之源自植物的水解產物，例如HyPep™ 7404、UltraPep™ Cotton、HyPep™ 7504、HyPep™ 4601N（Kerry, USA）、Cotton 100、Cotton 200、Phytone™及Soy 100（Gibco, USA），作為補充物，但本發明不限於此。

用於增加或減少本發明中所使用之醣蛋白的N-聚醣量的添加物通常為已知涉及蛋白質糖苷化的成分。尤其，為了限制唾液酸化量，應限制唾液酸至半乳糖殘基的傳遞、應進行去唾液酸化（desialylation）或是應限制半乳糖化量。當培養細胞時，以預定濃度添加至培養基的此種添加物包含作為如N-乙醯基-D-甘露糖胺、葡萄糖、甘露糖、麩醯胺酸及半乳糖之糖苷化前驅物的成分、氨及丁酸。

大部分動物細胞的培養主要使用含有血清的培養基。然而，由於含有血清的培養基為複雜的組合物且其化學組成尚不清楚，故難以設計出適用於蛋白質製造的培養基。由於血清可能在分離或純化上有負面影響以及有成本及再現性相關之問題，故主要使用無血清培養基或含有少量血清的培養基。由於在無血清培養基中作為碳源之葡萄糖的濃度非常低，故會進一步將葡萄糖添加至用於培養的培養基作為主要碳源以維持細胞生長並產生高濃度的目標蛋白質，可進一步將麩醯胺酸添加至其中以用於培養。尤其，在蛋白質製藥的生產上為了增加體內半衰期，唾液酸化程度應提高。為此，培養基中的葡萄糖及麩醯胺酸應維持於特定濃度或更高以免耗盡，且培養基的pH亦應維持於特定程度。培養基中所量測之葡萄糖及麩醯胺酸的濃度係指在被細胞消耗後剩餘的葡萄糖及麩醯胺酸的濃度。此外，可使用改善與唾液酸化程度的提升相關之酵素的活性的啟動子或是抑制去唾液酸化的抑制子。此外，藉由增加N-聚醣的前驅物或控制相關酵素的活性啟動子或培養條件，能增加半乳糖化程度，亦能因此增加唾液酸化程度。

然而，在玻尿酸酶PH20或其變異體的製造中無法藉由上述方法控制N-聚醣程度，而在藉由根據本發明之方法製造時，能夠製造具有期望的聚醣程度及高酵素活性的玻尿酸酶PH20或其變異體。

根據本發明之製造方法可更包含分離及純化所製造之玻尿酸酶PH20或其變異體。

根據本發明之玻尿酸酶PH20或其變異體的分離及純化較佳為不使用親和性結合而是使用玻尿酸酶PH20或其變異體的離子鍵及／或疏水性相互作用特性來進行，但本發明不限於此。

具體而言，根據本發明之玻尿酸酶PH20或其變異體的分離及純化較佳為不使用親和性層析法而是使用疏水性相互作用層析法及離子交換層析法來進行，例如陽離子交換層析法及／或陰離子交換層析法，但本發明不限於此。

此外，根據本發明之玻尿酸酶PH20或其變異體的分離及純化旨在移除具有低酵素活性的酸性玻尿酸酶PH20或其變異體，酸性玻尿酸酶PH20或其變異體的移除較佳為使用離子交換層析法來進行。

需要分析酵素的催化反應速率以確定酵素的工業應用性。酵素反應可分為具有固定反應性之活性位置的酵素反應以及具有不同反應性之多個活性位置的酵素反應。已知具有固定反應性之單一活性位置的酵素的催化反應的速率，例如玻尿酸酶，遵循米氏（Michaelis-Menten）動力學方程式。

米氏（Michaelis-Menten）酵素動力學以下述為前提：假設酵素反應為包含可逆反應及不可逆反應的兩步反應系統，在可逆反應中形成酵素（E）-受質（S）的複合物〔ES〕，在不可逆反應中ES複合物解離並產生產物（P）。在此情況下，k _f、k _r及k _cat為各方向的反應的速率常數（Alan Fersht (1977). Enzyme structure and mechanism）。

對於酵素反應，假設酵素與受質反應而產生ES複合物的過程快速達到平衡或是擬穩態（pseudo-steady state），假設透過藉由進行維持足夠高受質濃度的反應來充分降低酵素的濃度而滿足d[ES]/dt≒0。由於假設快速平衡或擬穩態之動力學公式係以相同方式推導，故在大部分實驗中會假設受質濃度最初高於酵素濃度的擬穩態。

當基於此假設而採用例如「在反應前後酵素的量恆定」及「當化學反應達到化學平衡時，獲得產物時的反應速率等於產物再次分解時的速率」之情況時，最終產物的反應速率可由以下米氏（Michaelis-Menten）動力學方程式表示。在此情況下，K _M= (k _r+ k _cat) / k _f且V _max= k _cat[E] ₀。

賴威佛氏-柏克氏（Lineweaver-Burk）方程式用於實驗分析使用米氏（Michaelis-Menten）動力學方程式的酵素反應速率。此方程式顯示實驗測得之反應速率的倒數1/V與實驗中給定受質濃度的倒數1/[S]之間的關係。此方程式為線性方程式的統計驗證表示酵素反應係遵循米氏（Michaelis-Menten）動力學方程式的反應，且能夠使用此方程式計算出K _M及V _max。

催化化學反應的酵素在於活性位置結合受質後具有過渡態，透過與受質的多重鍵結來降低用於達到具有高能量之過渡態的活化能。用於達到此過渡態的平衡常數正比於k _cat/K _M。於此，1/K _M係結合「由結合酵素與受質而產生酵素-受質複合物」之程度與「維持酵素-受質複合物而不分解」之程度的指數，k _cat係從酵素-受質複合物獲得產物時的平衡常數。因此，k _cat/K _M可說是能夠從受質及酵素獲得多少產物的指標，亦即，酵素的催化效率。

玻尿酸酶的工業可用性正比於其酵素催化效率。尤其，當酵素與聚合藥理活性物質（例如單株抗體）一起皮下注射時，玻尿酸酶的酵素催化效率扮演重要的角色。在根據本發明之變異體相較於野生型PH20具有較高的k _cat/K _M的情況下，當將包含於聚合藥理活性物質的玻尿酸酶皮下給藥時，存在於其中的玻尿酸被快速分解，故能夠獲得快速分散藥理活性物質之優越的效果。此外，當根據本發明之變異體相較於野生型PH20具有較大的k _cat時，在相同下酵素濃度下最大反應速率V _max會增加，從而提供在相同期間分解更大量的玻尿酸以及將藥理活性物質分散於更寬廣區域之優異的效果。

因此，為了確定根據本發明之PH20變異體的酵素性質，分析了各變異體的酵素反應速率，於示例4中比較了其V _max（最大酵素反應速率）、K _m（在50% V _max情況下之受質濃度）、k _cat（受質轉換速率）及k _cat/K _m（酵素催化效率）。這些結果表示根據本發明之PH20變異體優於野生型PH20。

示例

在下文中，參考示例詳細描述本發明。然而，對於本領域具有通常知識者顯而易見的是，這些示例僅供用於說明本發明，且不應被解釋為限制本發明之範圍。

示例1，玻尿酸酶的活性、N-聚醣及等電聚焦模式（isoelectric focusing pattern）之間的關係

野生的人類玻尿酸酶PH20及其變異體HM46的活性、等電聚焦模式及N-聚醣程度揭示於圖1。儘管兩種玻尿酸酶的活性單位的差異大於兩倍，但在等電點範圍或N-聚醣程度上沒有太大差異。

進行實驗以確定玻尿酸酶PH20中N-聚醣、等電聚焦模式及活性之間的關係。在純化玻尿酸酶PH20變異體的過程中，可將鹼性部分（部分1）及酸性部分（部分2）分離，並使用各部分作為樣品。圖2揭示使用PNGase F處理以移除所有N-聚醣之樣品、使用唾液酸酶A處理以移除末端的唾液酸之樣品以及使用唾液酸酶A及半乳糖酶處理以移除末端的唾液酸及半乳糖之樣品的等電聚焦模式及酵素活性之分析的結果。兩個部分在等電點的範圍表現出差異，酸性部分表現出降低的酵素活性。當以PNGase F處理時，兩個部分不具有活性且具有相似的等電聚焦模式。這些結果顯示出N-聚醣程度與酵素活性密切相關。再者，透過當移除位於末端的唾液酸時酸性部分的等電聚焦模式或酵素活性相似於鹼性部分的等電聚焦模式或酵素活性之現象，發現位於末端之唾液酸的含量與酵素活性之間有關係。然而，相較於具有高唾液酸含量的酸性部分，具有末端低唾液酸含量的鹼性部分表現出改善的玻尿酸酶的酵素活性。

基於評估源自不同培養細胞之野生型及多種變異的玻尿酸酶的結果進一步說明酵素活性與N-聚醣量之間的關係。

表1

玻尿酸酶類型	製備	相對 活性	N-聚醣量
半乳糖化 (%)	唾液酸化 (%)	甘露糖化 (%)
野生型人類PH20	暫時表現培養	100%	32.9	15.2	57.2
野生型人類PH20	細胞株培養	100%	42.5	21.7	54.8
HM46	暫時表現培養	167%	37.1	7.4	48.1
HM46	細胞株殖株試驗培養#1	115%	46.9	18.6	48.9
HM46	細胞株殖株試驗培養#2 純化部分#1	161%	40.6	16.4	54.4
HM46	細胞株殖株試驗培養#2 純化部分#2	86%	42.1	28	56.8
HM46	細胞株試驗培養#1	158%	49.6	14.4	48.1
HM46	細胞株試驗培養#2	186%	31.2	5.5	48.3
HM46	細胞株試驗培養#3	152%	30.6	4	48.7
HM46	細胞株試驗培養#4	174%	15.8	4.5	52.8
HM46	細胞株培養#1	170%	14.8	2.8	49.9
HM46	細胞株培養#2	161%	16.4	2.5	47.9
HM46	細胞株培養#3	162%	17.9	4.4	49.1
HM46	細胞株培養#4	158%	18.5	3.8	48.1
羊PH20	暫時表現培養	193%	35.5	7.9	58.3
倭黑猩猩PH20	暫時表現培養	72%	38.7	18.8	55.5

相對活性：以（樣品的活性）／（野生的人類PH20的活性）之百分比表示的活性。

半乳糖化百分比（%）：如G1、G1F、G1F'、G2、G2F、A1、A1F、A2及A2F之於末端含有半乳糖之N-聚醣的含量百分比（%）的總和。

唾液酸化百分比（%）：如A1、A1F、A2及A2F之於末端含有唾液酸之N-聚醣的含量百分比（%）的總和。

甘露糖化百分比（%）：如M4G0F、M5、M5G0、M6、M7、M8及M9之於末端含有甘露糖之N-聚醣的含量百分比（%）的總和。

野生型人類PH20及HM46的序列揭露於國際專利公開第2020/022791號。

藉由於示例10所示之方法製備羊PH20及倭黑猩猩（Bonobo）PH20樣品，序列揭示於表3。

如表1所示，製造了多種類型的玻尿酸酶PH20及變異蛋白並調查了N-聚醣量。為此，進行了使用多種細胞來源的培養，例如藉由在每次培養時使用ExpiFectamine CHO試劑（Gibco，USA）以重組基因轉染ExpiCHO細胞而產生的暫時表現培養（temporary expression culture）、利用使用重組基因所產生之細胞株殖株的細胞株殖株培養（cell line clone culture）以及使用具有高生產力之經篩選的單株的細胞株培養（cell line culture）。於此，細胞株殖株培養係利用使用選擇性標記從轉染有重組基因之哺乳動物細胞殖株選擇出高生產力的細胞株殖株之培養，並使用多株細胞株進行，並旨在產生單株細胞株。細胞株包含研究用細胞庫（research cell bank，RCB、生產用主細胞庫（production master cell bank，MCB）及工作用細胞庫（working cell bank，WCB）。此外，在培養方法中，嘗試試驗培養的多種結合以優化生產，即使於此亦發現在活性及N-聚醣上有差異。

細胞株殖株試驗培養#1係使用HycellCHO培養基（HyClone, USA）不調整培養溫度在37°C下進行之2升（L）批次培養。細胞株殖株試驗培養#2純化部分#1及細胞株殖株試驗培養#2純化部分#2係從所收穫之細胞培養液透過陰離子交換層析法分離並純化的部分，其中所收穫之細胞培養液係使用於8 L批次中含有EX-CELL® Advanced CHO饋料批式培養基（Sigma-Aldrich, USA）與Cotton 100UF（Gibco）及BalanCD® CHO Feed 4（Irvine Scientific, USA）之饋料批式方法在37°C下培養，純化部分#1為低鹽溶析部分，純化部分#2為高鹽溶析部分。細胞株試驗培養#1係藉由使用於2 L批次中含有EX-CELL® Advanced CHO饋料批式培養基（Sigma-Aldrich, USA）與Cotton 100UF（Gibco）及BalanCD® CHO Feed 4（Irvine Scientific, USA）之饋料批式方法在37°C之培養溫度下培養，並接著在積分活細胞密度達到預定程度時將培養溫度調整至32°C而獲得。細胞株試驗培養#2係藉由使用於10 L批次中含有EX-CELL® Advanced CHO饋料批式培養基（Sigma-Aldrich, USA）與Cotton 100UF（Gibco, USA）及CD CHO EfficientFeed ^TMB plus AGTTM（Gibco, USA）之饋料批式方法在37°C之培養溫度下培養，並接著在積分活細胞密度達到預定程度時將培養溫度調整至32°C，隨後進行培養12天而獲得。細胞株試驗培養#3係藉由使用於50 L批次中含有EX-CELL® Advanced CHO饋料批式培養基（Sigma-Aldrich, USA）與Cotton 100UF（Gibco, USA）及CD CHO EfficientFeedTM B plus AGTTM（Gibco, USA）之饋料批式方法在37°C之培養溫度下培養，並接著在積分活細胞密度達到預定程度時將培養溫度調整至32°C而獲得。細胞株試驗培養#4係藉由使用於10 L批次中含有EX-CELL® Advanced CHO 饋料批式培養基（Sigma-Aldrich, USA)）與Cotton 100UF（Gibco, USA）及CD CHO EfficientFeedTM B plus AGTTM（Gibco, USA）之饋料批式方法在37°C之培養溫度下培養，並接著在積分活細胞密度達到預定程度時將培養溫度調整至32°C，並將細胞培養13天而獲得。細胞株培養#1、細胞株培養#2、細胞株培養#3及細胞株培養#4係藉由使用於200 L批次中補充EX-CELL® Advanced CHO饋料批式培養基（Sigma-Aldrich, USA）與Cotton 100UF（Gibco, USA）及CD CHO EfficientFeedTM B plus AGTTM（Gibco, USA）之饋料批式方法在37°C之培養溫度下培養研究用細胞庫（RCB）、生產用主細胞庫（MCB）及工作用細胞庫（WCB），並接著在積分活細胞密度達到預定程度時將培養溫度調整至32°C，並將細胞培養12天而獲得。基於這些條件，進行示例2至5之針對培養條件的實驗以建立用於維持N-聚醣程度的培養方法。

從表1可看出，野生的人類玻尿酸酶PH20及其變異體以及哺乳動物玻尿酸酶PH20在N-聚醣中的半乳糖化程度應為15至50%、唾液酸化程度應為2.5至28%且甘露糖化程度應為47至 60%，並且在對試驗結果應用95%信賴區間時，N-聚醣半中的乳糖化程度應為1至68%、唾液酸化程度應為1至38%且甘露糖化程度應為40至63%，以對其賦予工業上有用的玻尿酸酶活性。此數值亦可包含10%的誤差，因為在蛋白質中之葡萄糖程度的量測上存在差異，其取決於例如使用於實驗的設備、酵素反應時間、試驗溫度、試驗者的熟練度等之條件，故考量實驗室之間的差異，本發明中所量測之葡萄糖程度應被解釋為廣義的意義，而非受限的意義。

再者，尤其，考量活性與唾液酸化之間的關係，可看出僅在唾液酸化限制於約30%或更少時才能製造出具有高於野生的人類PH20之活性的活性而因此可用於工業上的玻尿酸酶。上述數值可源自實驗結果並可包含10%的誤差。

藉由暫時表現培養確定了維持N-聚醣程度之高品質玻尿酸酶，藉由選擇具有高生產力的單株菌株來製造細胞株以用於穩定商業生產。所有的細胞株試驗培養#2、#3、#4及細胞株培養#1、#2、#3、#4揭示於表1，其藉由使用示例2、3、4、5之結果的培養方法來獲得，其表現出10,000單位／毫升或更多之酵素表現程度，從而提出以高效率及低成本製造高品質玻尿酸酶的可能性。

示例2，取決於添加物的培養

將玻尿酸酶PH20變異體以2x10 ⁶個細胞／毫升接種於補充有或沒有Cotton 200UF（Gibco, USA）及20 mM N-乙醯基-D-甘露糖胺（NZP, Netherlands）或50 mM半乳糖（Pfanstiehl, USA）之含有EX-CELL® Advanced CHO饋料批式培養基（Sigma-Aldrich, USA）之三個錐形瓶的每一個中，在37°C及8% CO ₂下於培養箱中藉由批次培養進行培養，並接著在積分活細胞密度（integral viable cell density ，IVCD）到達調整範圍時在32°C之降低的溫度下進行饋料批式培養。CD CHO EfficientFeed ^TMB plus AGTTM 培養基（Gibco，USA）作為供料培養基每日以燒瓶中培養起始體積之1.88%的量供應。每日從細胞培養液收集細胞樣品，量測活細胞密度、細胞生存力、pH及乳酸程度。在培養終止之後，以2,000 rpm進行離心10分鐘以獲得培養上清液。藉由HPLC及濁度分析確定在上述條件下培養之樣品的活性，藉由等電聚焦及糖苷化分析觀察蛋白質模式及N-聚醣程度。相較於未補充有50 mM半乳糖的培養基，補充有50 mM半乳糖的培養基表現出半乳糖化增加24%且活性降低2%，相較於未補充有N-乙醯基-D-甘露糖胺的培養基，補充有20 mM N-乙醯基-D-甘露糖胺的培養基表現出唾液酸化增加35%且活性降低20%（圖3、圖4、圖5、圖6）。

示例3，取決於培養期間的培養

將表現玻尿酸酶PH20變異體的細胞以2x10 ⁶個細胞／毫升接種於Sartorius 200 L生物反應器中的EX-CELL® Advanced CHO饋料批式培養基（Sigma-Aldrich, USA）。在培養的第二天，使用Cotton 200UF（Gibco, USA）及CD CHO EfficientFeedTM B plus AGTTM培養基（Gibco, USA），其為濃縮的營養培養基（Gibco, USA），作為供料培養基，進行饋料批式培養，在47 rpm之速率下pH為7.2±0.4且DO為40%進行培養。在37°C下進行初始培養，當積分活細胞密度達到改變範圍時，將溫度調整至32°C，進行饋料批式培養。CD CHO EfficientFeedTM B plus AGTTM培養基（Gibco，USA）作為供料培養基每日以200 L生物反應器中培養起始體積之1.88%的量供應。對於培養期間，培養在培養後的第19天終止，此時細胞生存力降至40%或更低。每日從細胞培養液收集多個細胞樣品，量測活細胞密度、細胞生存力、積分活細胞密度及銨離子程度，使用深度過濾器（depth filter）收穫所培養之溶液。藉由HPLC及濁度分析確定在上述條件下培養之樣品的活性，藉由等電聚焦及糖苷化分析觀察蛋白質模式及N-聚醣程度。隨著培養天數增加，半乳糖化及唾液酸化程度降低且活性增加（圖7、圖8、圖9、圖10）。

示例4，在培養基中受控的葡萄糖濃度下的培養

將表現玻尿酸酶PH20變異體的細胞以2x10 ⁶個細胞／毫升接種於Sartorius 2 L生物反應器中的EX-CELL® Advanced CHO饋料批式培養基（Sigma-Aldrich，USA）。在培養的第二天，使用Cotton 200UF （Gibco，USA）及CD CHO EfficientFeedTM B plus AGTTM培養基（Gibco，USA），其為濃縮的營養培養基（Gibco，USA），作為供料培養基，進行饋料批式培養，在120 rpm之速率下pH為7.2±0.4且DO為40%進行培養。在37°C下進行初始培養，當積分活細胞密度達到改變範圍時，將溫度調整至32°C，接著進行饋料批式培養。CD CHO EfficientFeed ^TMB plus AGTTM培養基（Gibco, USA）作為供料培養基每日以2 L生物反應器中培養起始體積之1.88%的量供應。每日從細胞培養液收集多個細胞樣品，量測活細胞密度、細胞生存力、pH、滲透壓以及葡萄糖及乳酸濃度。

每日量測培養基中葡萄糖的濃度，並在隨著葡萄糖因細胞生長而消耗時培養上清液中所含葡萄糖的濃度不超過2、4或6 g/L之參考濃度時，從此時點開始控制葡萄糖的濃度。當所量測之葡萄糖濃度為2、4或6 g/L或更低（其為各自的標準濃度）時，以最長時間為3小時加入一定量之200 g/L葡萄糖原液，以達到標準濃度。當所量測之葡萄糖濃度為2、4或6 g/L或更多時，不加入原液以維持標準濃度。一般而言，在哺乳動物細胞培養的過程中，葡萄糖含量變化對細胞生長的影響在3小時內可忽略不計。

在此情況下，將維持2 g/L作為參考濃度之條件稱為1 g/L（±1 g/L）濃度條件，將維持4 g/L作為參考濃度之條件稱為3 g/L（±1 g/L）濃度條件，將維持6 g/L作為參考濃度之條件稱為5 g/L（±1 g/L）濃度條件。舉例而言，維持葡萄糖濃度為1 g/L（±1 g/L）之條件表示葡萄糖濃度之控制範圍的下限設定為0 g/L且葡萄糖濃度之控制範圍的上限設定為2 g/L，並表示在實際培養中，當所量測之培養上清液中的葡萄糖濃度達到0 g/L之下限時，進一步加入200 g/L之葡萄糖原液，而使得最大葡萄糖濃度達到2 g/L，並且，當培養上清液中的葡萄糖濃度達到2 g/L之上限時，不添加200 g/L之葡萄糖原液。因此，在兩種濃度條件下，亦即1 g/L（±1 g/L）濃度及3 g/L（±1 g/L）濃度，2 g/L之濃度條件對應1 g/L（±1 g/L）濃度條件的上限並對應3 g/L （±1 g/L）濃度條件的下限，故此兩種條件為發生完全不同的動作之條件，因此不被認為彼此重疊。

在培養終止後，藉由在4°C及10,000 rpm下離心60分鐘獲得培養上清液。藉由HPLC及濁度分析確定在上述條件下培養之樣品的活性，藉由等電聚焦及糖苷化分析觀察蛋白質模式及N-聚醣程度。結果揭示隨著在培養上清液中葡萄糖濃度增加，半乳糖化及唾液酸化的程度增加且活性降低（圖11、圖12、圖13及圖14）。

示例5，在受控的pH下的培養

將表現玻尿酸酶PH20變異體的細胞以2x10 ⁶個細胞／毫升接種於Sartorius 2 L生物反應器中的 EX-CELL® Advanced CHO饋料批式培養基（Sigma-Aldrich, USA）。在培養的第二天，使用Cotton 200UF（Gibco, USA）及CD CHO EfficientFeed ^TMB plus AGTTM培養基（Gibco, USA），其為濃縮的營養培養基（Gibco, USA），作為供料培養基，進行饋料批式培養，在120 rpm之速率下DO為40%進行培養。在37°C下進行初始培養，當積分活細胞密度達到改變範圍時，將溫度調整至32°C，接著進行饋料批式培養。CD CHO EfficientFeed ^TMB plus AGTTM培養基（Gibco, USA）作為供料培養基每日以2 L生物反應器中培養起始體積之1.88%的量供應。調整培養溫度，並根據四種pH條件將培養分開並進一步培養，亦即pH 6.8±0.1、pH 7.0±0.1、pH 7.2±0.1及pH 7.4±0.1，以找到相較於一般pH 7.2±0.4為改善的條件。使用包含pH控制功能之一般的生物反應器根據這四種條件設定培養的pH控制範圍。舉例而言，pH 7.0±0.1表示pH控制範圍的下限為pH 6.9，pH控制範圍的上限為pH 7.1。在實際培養中，當培養基的pH達到pH 6.9之下限時，加入鹼以提升pH，當培養基的pH達到pH 7.1之上限時，加入二氧化碳以降低pH。因此，在pH 6.8±0.1及pH 7.0±0.1之兩種條件中，pH 6.9之條件對應pH 6.8±0.1的上限以及對應pH 7.0±0.1的下限。因此，兩種條件被認為彼此不重疊。進行培養直到細胞生存力為40%或更低之培養日，每日從細胞培養液收集多個細胞樣品，量測活細胞密度、細胞生存力、pH及積分活細胞密度程度。在培養終止後，藉由在4°C及10,000 rpm下離心60分鐘獲得培養上清液。藉由HPLC及濁度分析確定在上述條件下培養之樣品的活性，藉由等電聚焦確定蛋白質模式。在pH 7.0±0.1下觀察到活性依培養基的pH而變化以及最高的活性及最低的唾液酸化程度，這相較於一般條件為改善的條件（表2、圖15、圖16、圖17）。

表2

N-聚醣模式	pH 7.2±0.4 (一般條件)	pH 6.8±0.1	pH 7.0±0.1	pH 7.2±0.1	pH 7.4±0.1
半乳糖化 (%)	39.6	49.4	37.0	42.1	47.6
唾液酸化 (%)	14.6	12.7	6.3	13.9	20.9
甘露糖化 (%)	48.4	43.3	50.5	50.3	49.3
總去岩藻糖化 (%)	53.4	46.2	51.2	56.2	57.2
去岩藻糖化(%)	7.7	5.9	4,2	8.9	10.7
相對比活性 (%)	100%	92%	115%	104%	98%

示例6，使用動物細胞培養上清液之玻尿酸酶的純化

步驟1：用緩衝液交換／界面活性劑處理上清液

使用30 kDa MWCO膜過濾器透過UF／DF控制導電性及pH，將培養溶液的條件重新調整至第一陰離子交換管柱平衡條件。使用適當濃度之溶劑／界面活性劑處理經重新調整之溶液以使病毒去活性，並在室溫下反應約60分鐘。

步驟2：初級陰離子交換（Q Sepharose Fast Flow）管柱層析

將經過濾的蛋白質溶液通過初級陰離子交換管柱以透過陰離子交換樹脂捕獲玻尿酸酶，並在高鹽濃度下從管柱溶析出。在加載前，使用三羥甲基胺基甲烷（tromethamine）緩衝液（pH為8.0且鹽濃度為30 mM）平衡管柱。在加載後，使用相同緩衝液沖洗管柱（初級沖洗）。在初級沖洗後，使用相同緩衝液（pH為8.0，但鹽濃度為60 mM，且相較於初級沖洗中之導電性具有較高的導電性）第二次沖洗管柱。在第二次沖洗後，使用pH為8.0且鹽濃度為200 mM之適當的緩衝液進行期望蛋白質（玻尿酸酶）的溶析，如圖18所示。

步驟3：二級陰離子交換（Capto Q）管柱層析

將經過濾的蛋白質通過二級陰離子交換管柱以利用陰離子樹脂交換移除酸性之玻尿酸酶的變異體。在加載前，使用Bistris緩衝液（pH為6.0且不含鹽）平衡管柱。在加載後，使用相同. Bistris緩衝液沖洗管柱（初級沖洗）。在初級沖洗後，使用相同Bistris緩衝液（鹽濃度為20 mM，相較於初級沖洗中的鹽濃度之導電性具有較高的導電性）沖洗管柱。在第二次沖洗後，使用具有一定鹽濃度之Bistris緩衝液進行期望蛋白質（玻尿酸酶）的溶析，如圖19所示。

步驟4：陽離子交換（Capto MMC）管柱層析

將經重新調整的蛋白質溶液通過陽離子交換管柱以利用陽離子交換樹脂移除酸性之玻尿酸酶的變異體，並在高鹽濃度下從管柱溶析出。在加載前，使用鹽濃度為80 mM之pH 5.5檸檬酸鹽緩衝液平衡管柱。在加載後，使用相同檸檬酸鹽緩衝液沖洗管柱（初級沖洗）。在初級沖洗後，使用適當的pH 7.5 Bistris緩衝液沖洗管柱。在第二次沖洗後，使用鹽濃度為400 mM之pH 8.0 Bistris緩衝液進行期望蛋白質（玻尿酸酶）的溶析，如圖20所示。

步驟5：奈米過濾／配方

在陽離子交換管柱步驟後，透過1微米過濾器過濾含有期望之玻尿酸酶的蛋白質溶液，並將其進行奈米過濾。將經奈米過濾之蛋白質溶液濃縮至10毫克／毫升（mg/mL）之高濃度，並使用8 kDa MWCO膜過濾器透過UF/DF重新調整以與含有145 mM鹽之pH 7.0組胺酸緩衝液交換。

示例7，玻尿酸酶的酵素活性的分析

使用如下所述之濁度法量測玻尿酸酶PH20及其他玻尿酸酶的酵素活性。

濁度法係使用吸光度量測在混合玻尿酸與白蛋白（BSA）的過程中產生之沉澱物的方法。當玻尿酸被PH20水解時，在與白蛋白混合的過程中吸光度會降低。一般而言，此過程進行如下。將玻尿酸酶PH20（Sigma）稀釋至1、2、5、7.5、10、15、20、30、50或60 units/mL並放置於各管中。將經純化的蛋白質樣品溶解於酵素稀釋緩衝液（20 mM Tris·HCl pH 7.0，77 mM NaCl，0.01% (w/v)牛血清白蛋白）並稀釋100X、300X、600X、1200X或2400X於各管中。將3 mg/mL之玻尿酸溶液稀釋10x至0.3 mg/mL於其他管中以將各管中之體積調整為180微升（μL）。將60 μL之酵素與經稀釋之玻尿酸溶液混合並在37°C下反應45分鐘。在反應後，將50 μL之經反應之酵素及250 μL之酸性白蛋白溶液加入96孔盤的各孔中並搖晃10分鐘，使用分光光度計在600奈米量測吸光度。樣品的活性單位使用活性單位已知的標準品的試驗結果與樣品的試驗結果來獲得。

示例8，玻尿酸酶的等電聚焦分析

使用預凝膠（precast gel）（pH 3-7, Invitrogen）及用於等電聚焦之緩衝溶液分析玻尿酸酶的等電聚焦。將經純化的玻尿酸酶樣品加載於預凝膠，使用Novex Corporation製之電泳儀在100V將凝膠進行電泳1小時，在200V進行1小時，在500V進行30分鐘。在電泳完成後，使用純水沖洗凝膠，將蛋白質以12% TCA溶液固定、以Coomassie Blue R-250染色溶液染色並以乙酸-甲醇溶液漂白，以分析呈現於凝膠上的蛋白質帶。

示例9，玻尿酸酶的N-聚醣程度的分析

玻尿酸酶的N-聚醣程度透過標記N-聚醣樣品來分析，透過以PNGase F（N-醣苷酶F）、2-AB（2-胺基苯甲醯胺）處理玻尿酸酶來分離，接著透過使用ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide管柱（Waters）進行超高效液相層析。將經純化之玻尿酸酶樣品去鹽並以PNGase F在37°C下反應16至18小時，以從其中分離N-聚醣。將N-聚醣以2-AB標記，接著在65°C下反應3小時，並從其中移除過量的2-AB。將經標記的N-聚醣樣品以72%-20%乙腈梯度透過HPLC分離。以用螢光偵測器（FLD）偵測經分離的樣品以分析N-聚醣程度。將各個分離之N-聚醣分類，將於其末端含有半乳糖之N-聚醣（G1、G1F、G1F'、G2、G2F、A1、A1F、A2、A2F等）相加以確定半乳糖化百分比（%）程度，將於其末端含有唾液酸之N-聚醣（A1、A1F、A2、A2F等）相加以確定唾液酸化百分比（%）程度，將於其末端含有甘露糖之N-聚醣（M4G0F、M5、M5G0、M6、M7、M8、M9等）相加以確定甘露糖化百分比（%）程度。

示例10，源自動物之玻尿酸酶的製備及N-聚醣程度的分析

（1）倭黑猩猩（bonobo）及羊玻尿酸酶PH20基因的製造

為了研究源自動物之類人猿（anthropoid）（即倭黑猩猩）及偶蹄目（即羊）的玻尿酸酶PH20之N-聚醣程度及活性，如下製備玻尿酸酶PH20。從野生型基因合成出cDNA，並將其插入pcDNA3.4-TOPO載體的Xho I及Not I限制酶位置。為了在ExpiCHO細胞中表現，使用人類生長激素、人類血清白蛋白或人類Hyal1其中一者的訊息肽作為訊息肽，而不使用PH20的天然訊息肽。為了使用HisTrap管柱進行蛋白質純化，His-tag DNA序列位於PH20 cDNA的3'端。使用DNA定序確定各序列。表3揭示源自動物之玻尿酸酶的序列。

表3

源自動物之玻尿酸酶	胺基酸序列
羊PH20	LDFRAPPLISNTSFLWAWNAPAERCVKIFKLPPDLRLFSVKGSPQKSATGQFITLFYADRLGYYPHIDEKTGNTVYGGIPQLGNLKNHLEKAKKDIAYYIPNDSVGLAVIDWENWRPTWARNWKPKDVYRDESVELVLQKNPQLSFPEASKIAKVDFETAGKSFMQETLKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHNYNQPTYNGNCSDLEKRRNDDLDWLWKESTALFPSVYLNIKLKSTPKAAFYVRNRVQEAIRLSKIASVESPLPVFVYHRPVFTDGSSTYLSQGDLVNSVGEIVALGASGIIMWGSLNLSLTMQSCMNLGNYLNTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCHDEGVCTRKQWNSSDYLHLNPMNFAIQTGKGGKYTVPGKVTLEDLQTFSDKFYCSCYANINCKKRVDIKNVHSVNVCMAEDICIEGPVKLQPSDH
倭黑猩猩PH20	LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINVTGQDVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDIYKNRSIELVQQQNVQLNLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFVYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEESQIFY

（2）倭黑猩猩及羊玻尿酸酶PH20表現

使用ExpiCHO表現系統進行表現。當ExpiCHO細胞的數量達到6x10 ⁶個細胞／毫升時，使用ExpiFectamine CHO試劑以玻尿酸酶PH20 cDNA插入pcDNA3.4-TOPO載體之質體轉染ExpiCHO細胞。於此使用之細胞培養基為ExpiCHO表現培養基（100~500毫升）。在轉染後，培養ExpiCHO細胞同時以130 rpm搖晃共6天。在此期間，將細胞在37°C下培養1天，接著進一步在32°C之降低的溫度下培養5天。當培養完成時，將細胞以10,000 rpm離心30分鐘以獲得細胞上清液。

（3）倭黑猩猩及玻尿酸酶PH20的純化

使用AKTA prime系統（GE Healthcare Systems）透過兩步驟之管柱層析純化在ExpiCHO細胞產生之羧基端連接His-tag之源自動物之玻尿酸酶重組蛋白。倭黑猩猩PH20的pI為6，故使用陰離子交換層析的Q Sepharose，羊PH20的pI為8或更多，故使用陽離子交換層析之Capto S管柱進行一步驟純化。使用His-Tag親和性層析之HisTrap HP管柱對各蛋白質進行兩步驟純化。

為了使用Q Sepharose管柱進行蛋白質純化，製備緩衝液A（20 mM磷酸鈉，pH 7.5）及緩衝液B（20 mM磷酸鈉，pH 7.5，0.5 M NaCl）。蛋白質結合於Q Sepharose管柱，以5管柱體基（CV）之緩衝液A沖洗管柱以移除非特異性結合蛋白，並接著以5 CV之緩衝液B在0至100%之濃度梯度下沖洗以溶析出蛋白質。

為了使用Capto S管柱進行蛋白質純化，製備緩衝液A（20 mM磷酸鈉，15 mM NaCl，pH 6.0）及緩衝液B（20 mM磷酸鈉，500 mM NaCl，pH 6.0）。將培養基的pH及導電性調整為與緩衝液A相同，透過具有0.22 μm之孔徑的膜過濾培養基。蛋白質樣品結合於Capto S管柱，以3 CV之緩衝液A沖洗管柱以移除非特異性結合蛋白。以4CV之緩衝液B沖洗管柱以溶析出蛋白質。

為了使用HisTrap HP管柱進行蛋白質存化，製備緩衝液A（20 mM磷酸鈉，500 mM NaCl，pH 7.5）及緩衝液B（20 mM磷酸鈉，500 mM NaCl，500 mM咪唑pH 7.5）。蛋白質樣品結合於HisTrap HP管柱，以7 CV之7%緩衝液B沖洗管柱以移除非特異性結合蛋白，接著以3 CV之40%緩衝液B沖洗管柱以溶析出目標蛋白。使用透析緩衝液（20 mM磷酸鈉，100 mM NaCl，pH 7.0）將管柱析出液進行透析。

（4）倭黑猩猩及羊PH-20玻尿酸酶分析

以與示例7相同的方式進行活性分析，以與示例9相同的方式進行N-聚醣程度分析。結果揭示於表1。

示例11，取決於N-聚醣程度之變異體的酵素動力學分析

為了分析根據本發明之變異體的酵素動力學，藉由Morgan-Elson方法（Takahashi, T. et al (2003) Anal. Biochem. 322:257-263）量測酵素活性。Morgan-Elson方法係一種比色法，其以對二甲基胺基苯甲醛（DMAB）（即Ehrlich試劑）檢測在玻尿酸被玻尿酸酶水解時所產生之N-乙醯基-D-葡萄糖胺（GlcNAc）的還原端之反應所產生之紅色物質（於545 nm）。在稀釋緩衝溶液（0.1 M NaPi，0.1 M NaCl，1.5 mM 葡萄糖二酸-1,4-內酯，pH 5.35）中經稀釋為0.25、0.50、0.75、1.00或1.25 mM之N-乙醯基-D-葡萄糖胺（GlcNAc, Sigma）在各試驗管中透過四硼酸鹽處理來還原，接著加入DMAB以誘導比色反應。在反應後，於545 nm量測吸光度以製作GlcNAc的標準反應曲線。在各試驗管中於稀釋緩衝溶液中將作為受質之玻尿酸稀釋為0.54、0.65、0.87、1.23或2.17 μM，將玻尿酸酶加入各試驗管，接著在37°C下反應5分鐘並在100°C下加熱5分鐘以完成酵素反應。將產物透過以四硼酸鹽處理來還原，加入DMAB以誘導比色反應。在反應後於545 nm量測吸光度，使用上述之GlcNAc的標準反應曲線量測酵素活性。使用此方法分析SEQ ID NO: 1之野生型PH20及根據本發明之PH20變異體的酵素動力學。結果，發現賴威佛氏-柏克氏（Lineweaver-Burk）曲線為線性，這表示根據本發明之PH20變異體遵循米氏（Michaelis-Menten）酵素動力學公式。

表4揭示在示例1之表1中的樣品之中從細胞株殖株試驗培養#2獲得之部分#1及部分#2的酵素動力學的分析。這些結果顯示當半乳糖化及甘露糖化程度落於相似範圍且唾液酸化程度低時，重組玻尿酸酶的酵素活性會因酵素的高催化效率（kcat/Km）而增加。

實驗結果證實具有相同胺基酸結構之酵素的活性可能受糖苷化改變影響，更具體而言，受唾液酸化程度改變影響。因此，這表示在試圖透過使用重組方法大量製造野生的PH20玻尿酸酶或其變異體來製造工業上有用之玻尿酸酶時，透過控制唾液酸化程度能開發具有更大工業上應用性的酵素。

表4

玻尿酸酶類型	製備	相對活性	N-聚醣量	K M (µM)	k cat (1/sec)	k cat/K M (sec /µM)
半乳糖化 (%)	唾液酸化 (%)	甘露糖化 (%)
HM46	細胞株殖株試驗培養#2 純化部分#1	161%	40.6	16.4	54.4	1.11 ±0.07	47.6 ±3.8	42.7 ±0.7
HM46	細胞株殖株試驗培養#2 純化部分#2	86%	42.1	28.0	56.8	1.05 ±0.15	33.9 ±4.9	32.4 ±0.1

根據本發明之製造重組玻尿酸酶PH20蛋白質或其變異體的方法能夠製造具有高生產力及高酵素活性的重組玻尿酸酶PH20蛋白質或其變異體，故實現重組玻尿酸酶PH20蛋白質或其變異體的大量製造及供應。

儘管已詳細描述本發明之特定組態，但本領域具有通常知識者應理解，實施方式作為較佳實施例僅供說明目的，不應被解釋為限制本發明的範圍。因此，本發明之實質範圍由申請專利範圍及其均等範圍所界定。

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無。

本發明之上述及其他目的、特徵及其他優點，由以下實施方式參考附圖將更清楚理解，其中：

圖1揭示對於野生的人類玻尿酸酶PH20及其變異體之酵素活性、等電聚焦模式（isoelectric focusing pattern）及N-聚醣量的分析結果，其中 圖1A揭示野生的人類玻尿酸酶PH20及其變異體的酵素活性， 圖1B揭示各樣品的等電聚焦的結果，以及 圖1C揭示N-聚醣量。

圖2揭示以PNGase F、唾液酸酶A及唾液酸酶A + 半乳糖酶處理之經純化的玻尿酸酶PH20變異體部分之間的酵素活性及等電聚焦模式之比較分析的結果，其中 圖2A揭示各樣品的等電聚焦的結果， 圖2B揭示酵素活性，以及 圖2C揭示N-聚醣量。

圖3揭示對於製造玻尿酸酶PH20變異體之細胞，取決於添加N-乙醯基-D-甘露糖胺（ManNAc）或半乳糖的培養條件之細胞生長、細胞生存力、pH及乳酸濃度的變化的結果，其中 圖3A揭示細胞生長的變化， 圖3B揭示細胞生存力的變化， 圖3C揭示pH的變化，以及 圖3D揭示乳酸濃度的變化。

圖4為揭示取決於添加N-乙醯基-D-甘露糖胺（ManNAc）或半乳糖的培養條件之所收穫之用於製造玻尿酸酶PH20變異體的細胞培養液之活性的圖式。

圖5揭示取決於添加N-乙醯基-D-甘露糖胺（ManNAc）或半乳糖的培養條件之所收穫之用於製造玻尿酸酶PH20變異體的細胞培養液的等電聚焦分析的結果。

圖6揭示取決於添加N-乙醯基-D-甘露糖胺（ManNAc）或半乳糖的培養條件之所收穫之用於製造玻尿酸酶PH20變異體的細胞培養液的N-聚醣結構分析的結果。

圖7揭示製造玻尿酸酶PH20變異體之細胞的細胞生長、細胞生存力及氨濃度的變化作為培養天數的函數，其中 圖7A揭示細胞生長的變化， 圖7B揭示細胞生存力的變化， 圖7C揭示積分活細胞密度的變化，以及 圖7D揭示氨濃度。

圖8為顯示隨細胞培養天數的所收穫之用於製造玻尿酸酶PH20變異體的細胞培養液的比活性的圖式。

圖9揭示隨細胞培養天數的所收穫之用於製造玻尿酸酶PH20變異體的細胞培養液的等電聚焦的結果。

圖10揭示隨細胞培養天數的所收穫之用於製造玻尿酸酶PH20變異體的細胞培養液的活性分析及N-聚醣結構的結果。

圖11揭示對於製造玻尿酸酶PH20變異體的細胞，取決於葡萄糖濃度條件、細胞生存力、pH、滲透壓、葡萄糖濃度及乳酸濃度之細胞生長的變化，其中 圖11A揭示細胞生長的變化， 圖11B揭示細胞生存力的變化， 圖11C揭示pH的變化， 圖11D揭示滲透壓的變化， 圖11E揭示葡萄糖濃度的變化，以及 圖11F揭示乳酸濃度的變化。

圖12為揭示取決於葡萄糖濃度之所收穫之用於製造玻尿酸酶PH20變異體的細胞培養液的比活性的圖式。

圖13揭示取決於葡萄糖濃度之所收穫之用於製造玻尿酸酶PH20變異體的細胞培養液的等電聚焦的結果。

圖14揭示取決於葡萄糖濃度之所收穫之用於製造玻尿酸酶PH20變異體的細胞培養液的N-聚醣結構分析的結果。

圖15揭示對於製造玻尿酸酶PH20變異體的細胞，取決於pH程度之細胞生長、細胞生存力、pH及積分活細胞密度的變化的結果，其中 圖15A揭示細胞生長的變化， 圖15B揭示細胞生存力的變化， 圖15C揭示pH的變化，以及 圖15D揭示積分活細胞密度的變化。

圖16為揭示所收穫之用於製造玻尿酸酶PH20變異體的細胞的細胞培養液取決於pH程度的比活性的圖式。

圖17揭示所收穫之用於製造玻尿酸酶PH20變異體的細胞培養液取決於pH程度之等電聚焦的結果。

圖18為在玻尿酸酶PH20變異體之純化的過程中透過初級陰離子交換樹脂層析法獲得之純化層析圖。

圖19為在玻尿酸酶PH20變異體之純化的過程中透過二級陰離子交換樹脂層析法獲得之純化層析圖。

圖20為在玻尿酸酶PH20變異體之純化的過程中透過陽離子交換樹脂層析法獲得之純化層析圖。

無。

Claims (15)

1. 一種製造具有玻尿酸酶酵素活性的重組玻尿酸酶PH20或其變異體的方法，包含：(1)於35℃至38℃之一培養溫度培養表現重組玻尿酸酶PH20或其變異體的一宿主細胞，直到該宿主細胞的積分活細胞密度(Integral viable cell density)達到20x10⁶至120x10⁶個細胞x天/毫升，其中該宿主細胞為動物細胞；以及(2)將該培養溫度降低至28℃至34℃，接著在維持該培養溫度的同時將該宿主細胞培養2至18天：(a)其中在培養期間培養基中的剩餘葡萄糖濃度維持於0.001g/L至4.5g/L；及/或(b)其中培養基的pH維持於6.8~7.2；其中所產生之該PH20或其變異體的一N-聚醣的一唾液酸化量為1至38%，並且其中在培養基中玻尿酸酶活性為10,000單位/毫升或更高。
2. 如請求項1所述之方法，其中所產生之該PH20或其變異體的該N-聚醣的一半乳糖化量為1至68%、該唾液酸化量為1至38%，且一甘露糖化量為40至63%。
3. 如請求項1所述之方法，其中所產生之該PH20或其變異體的該N-聚醣的該唾液酸化量為1至30%。
4. 如請求項1所述之方法，其中所產生之該PH20或其變異體的比活性相較於野生的人類PH20的比活性高至少10%。
5. 如請求項1所述之方法，其中在步驟(1)及/或步驟(2)中該宿主細胞的培養藉由選自由批次培養、重複批次培養、饋料批式培養、重複饋料批式培養、連續培養及灌注培養組成之群組之一或多種方法來進行。
6. 如請求項1所述之方法，其中在步驟(1)及/或步驟(2)中該宿主細胞的培養在選自由以下組成之群組之一或多個條件下進行：(i)培養基中的氨濃度維持於5mM或更多之條件；(ii)將選自由麩醯胺酸、葡萄糖胺、尿苷、葡萄糖胺及丁酸鈉組成之群組之一或多種物質加入培養基之條件；以及(iii)不將半乳糖及manNAc加入至培養基之條件。
7. 如請求項1所述之方法，其中該PH20變異體包含在野生的PH20的胺基酸序列中胺基端及/或羧基端的一或多個胺基酸殘基的取代，並可選地包含一或多個胺基酸殘基的截斷(truncation)。
8. 如請求項1所述之方法，更包含分離及純化所產生之該PH20或其變異體。
9. 如請求項1所述之方法，其中該PH20或其變異體的分離及純化係使用該PH20或其變異體的離子鍵及/或疏水性相互作用特性來進行，而不使用親和性結合。
10. 如請求項9所述之方法，其中該PH20或其變異體的分離及純化係使用疏水性相互作用層析法及離子交換層析法來進行，而不使用親和性層析法。
11. 如請求項8所述之方法，其中酸性的PH20或其變異體被移除。
12. 如請求項11所述之方法，其中該酸性的玻尿酸酶PH20或其變異體的移除係使用離子交換層析法來進行。
13. 一種具有玻尿酸酶酵素活性的PH20或其變異體，其中該PH20或其變異體的一N-聚醣的一半乳糖化量為1至68%、一唾液酸化量為1至38%，且一甘露糖化量為40至63%。
14. 如請求項13所述之PH20或其變異體，其中該N-聚醣的該唾液酸化量限制於1至30%。
15. 如請求項13所述之PH20或其變異體，其中該PH20或其變異體係藉由如請求項1至12之任一項所述之方法來製造。

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