CN116391043A - 蛋白质的制造方法 - Google Patents

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Abstract

公开文本提供了一种在生产期间控制蛋白质的糖基化谱的新型方法。本公开文本还提供了一种提高蛋白质产量同时控制蛋白质糖基化谱的新型方法。

Description

蛋白质的制造方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年8月14日提交的美国临时申请号63/066,122的优先权权益，将所述临时申请通过引用以其整体并入本文。
通过EFS-WEB电子提交的序列表的引用
与本申请一起提交的ASCII文本文件(名称3338_188PC01_Seqlisting_ST25.txt；大小：24,720字节；以及创建日期：2021年8月12日)中电子提交的序列表的内容通过引用以其整体并入本文。
背景技术
蛋白质治疗剂的市场显著增长，发展步伐不断加快。然而，对于本行业来说，维持所需质量属性(例如，糖基化)同时维持数量、降低生产成本并提供生产灵活性是一项挑战。为了继续满足市场需求，需要高效生产规模的蛋白质治疗剂的生产。
糖基化是所有蛋白质翻译后修饰(PTM)中最丰富的一种。它是由于将糖残基添加到蛋白质侧链中以形成糖蛋白而产生的。哺乳动物糖蛋白寡糖通常由有限数量的单糖构成，但是它们的结构多样性很大，主要是因为它们经常形成复杂的分支模式。
糖基化在许多特定的生物学功能(包括免疫防御、受精、病毒复制、寄生生物感染、细胞生长、炎症和细胞-细胞粘附)中起着重要作用。对于药物糖蛋白，糖基化会影响蛋白质构象的稳定性、清除率、对蛋白水解的保护，并且改善蛋白质的溶解度。由于不同的糖形可能具有不同的生物学特性，因此在生产过程中监测和控制糖基化的能力对于生物制药分子的质量至关重要。
然而，发酵期间的糖基化天然以一定程度的异质性存在，并且可以受到许多不同因素(如表达系统、过程条件、培养基组成、补料方案、纯化过程或其任何组合)的影响。因此，需要改善包括培养在内的蛋白质制造过程，同时保持蛋白质的糖基化模式一致。
发明内容
本公开文本涉及一种提高细胞的蛋白质产量的方法，所述方法包括在蛋白质诱导阶段中将所述细胞在合适的条件下在生物反应器中培养，其中所述合适的条件包括36℃的初始温度设定点、33℃的第二温度设定点和31℃的第三温度设定点；7.0的初始pH设定点和6.9的第二pH设定点；在0.15X 106个细胞/mL与0.45X 106个细胞/mL之间(例如，0.30X 106个细胞/mL)的初始活细胞密度(VCD)设定点；6.9的初始pH；在10％至40％之间的初始CO2设定点；或其任何组合。在一些方面，所述合适的条件包括36℃的初始温度设定点、33℃的第二温度设定点和31℃的第三温度设定点；7.0的初始pH设定点和6.9的第二pH设定点；0.30X106的初始活细胞密度(VCD)设定点；以及在15％与25％之间的初始CO2设定点。
本公开文本涉及一种控制细胞生长速率、细胞活力、活细胞密度和/或细胞滴度以产生蛋白质的方法，所述方法包括在蛋白质诱导阶段中将所述细胞在36℃的初始温度设定点下在生物反应器中培养，并且将所述细胞在33℃的第二温度设定点和31℃的最终温度设定点下培养。
本公开文本还涉及一种提高细胞的蛋白质产量的方法，所述方法包括将所述细胞在合适的条件下在生物反应器中培养，其中所述合适的条件包括(i)36.0℃的初始温度设定点和低于36.0℃的第二温度设定点；(ii)低于36.5℃的初始温度设定点和31.0℃的最终温度设定点；或(iii)低于36.5℃的初始温度设定点、33.0℃的第二温度设定点和低于33.0℃的最终温度设定点。
在一些方面，所述最终温度设定点发生在约228至约252小时。在一些方面，所述最终温度设定点发生在初始温度设定点之后约228小时、约234小时、约240小时、约246小时或约252小时。在一些方面，所述最终温度设定点为31.0℃并且发生在240小时之后。在一些方面，所述第二温度设定点发生在约120小时至约168小时。在一些方面，所述第二温度设定点发生在约120小时、约126小时、约132小时、约138小时、约144小时、约150小时、约156小时、约162小时或约168小时。在一些方面，在144小时之后所述第二温度设定点为33.0℃。
在一些方面，与不采用所述合适的条件的方法相比，所述条件将所述蛋白质产量提高至少150％、至少约160％、至少约170％、至少约180％、至少约190％、至少约200％、至少约210％、至少约220％、至少约230％、至少约240％、至少约250％、至少约260％、至少约270％、至少约280％、至少约290％、至少约300％、至少约310％、至少约320％、至少约330％、至少约340％、至少约350％、至少约360％、至少约370％、至少约380％、至少约390％或至少约400％。在一些方面，所述方法降低细胞生长速率。在一些方面，所述细胞生长展现出从约30.0小时至约40.0小时的平均第0-5天倍增时间。在一些方面，所述细胞生长展现出约35.1小时的平均第0-5天倍增时间。
在一些方面，所述方法控制细胞活力。在一些方面，所述细胞活力展现出从约10.0x 106个细胞/mL至约15.0x 106个细胞/mL的平均峰值活细胞密度(VCD)。在一些方面，细胞活力展现出约11.2x 106个细胞/mL的平均峰值活细胞密度(VCD)。在一些方面，所述细胞活力展现出从约0.05x 109个细胞/mL至约0.11x 109个细胞/mL的平均第0-14天活细胞密度积分(IVCD)。在一些方面，所述细胞活力展现出约0.10x 109个细胞/mL的平均第0-14天活细胞密度积分(IVCD)。在一些方面，所述方法控制滴度。在一些方面，所述滴度展现出约1.50g/L至约3.5g/L的平均第14天滴度。在一些方面，所述滴度展现出约2.87g/L的平均第14天滴度。在一些方面，所述滴度展现出从约20.0pg/细胞-天至约40.0pg/细胞-天的平均比生产率。在一些方面，所述滴度展现出约38.5pg/细胞-天的平均比生产率。在一些方面，所述方法进一步包括修改上游生物反应器参数，其中所述上游反应器参数选自(i)补料时间，(ii)初始pH，(iii)pH转变，(iv)CO2，(v)初始细胞密度或(vi)其任何组合。
在一些方面，所述方法控制所述蛋白质的糖基化谱。在一些方面，所述糖基化谱包括一种或多种N-连接的聚糖。在一些方面，所述N-连接的聚糖包括：G0F、G1F、G2F、S1G1F、S1G2F和/或S2G2F。在一些方面，所述方法进一步包括在第14天之后测量糖基化谱。在一些方面，所述蛋白质包含CTLA4结构域。在一些方面，所述蛋白质是融合蛋白。在一些方面，所述融合蛋白包含Fc部分。在一些方面，所述蛋白质是阿巴西普。在一些方面，所述蛋白质是如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于选自阿巴西普的Asn76(T5)、Asn108(T7)和/或Asn207(T14)的一个或多个残基处。在一些方面，G0F包括小于或等于约7.0％或约6.5％的相对丰度。在一些方面，G1F包括小于或等于约7.5％或为约7％的相对丰度。在一些方面，G2F包括小于或等于约25％或为约1.5％至约23％的相对丰度。在一些方面，S1G1F包括小于或等于约13.5％或为约12.5％的相对丰度。在一些方面，S1G2F包括大于或等于约33％或为约32％至约49％的相对丰度。在一些方面，S2G2F包括大于或等于约12％或为约14％至约48.5％的相对丰度。在一些方面，G2F包括约1.5％至约23％的相对丰度，S1G2F包括约32％至约49％的相对丰度，和/或S2G2F包括约14％至约48.5％的相对丰度。在一些方面，G2F包括小于或等于约25％的相对丰度，S1G2F包括大于或等于约33％的相对丰度，和/或S2G2F包括大于或等于约12％的相对丰度。在一些方面，G0F包括小于或等于约6.5％的相对丰度，G1F包括小于或等于约7％的相对丰度，G2F包括约1.5％至约23％的相对丰度，S1G1F包括小于或等于约12.5％的相对丰度，S1G2F包括约32％至约49％的相对丰度，和/或S2G2F包括约14％至约48.5％的相对丰度。在一些方面，G0F包括小于或等于约7.0％的相对丰度。在一些方面，G1F包括小于或等于约7.5％的相对丰度，G2F包括小于或等于约25％的相对丰度，S1G1F包括小于或等于约13.5％的相对丰度，S1G2F包括大于或等于约33％的相对丰度，和/或S2G2F包括大于或等于约12％的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约2.0％与约10.0％之间的G0F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约2.5％与约10％、约2.5％与约9.5％、约2.5％与约9％、约2.5％与约8.5％、约2.5％与约8％、约2.5％与约7.5％、约2.5％与约7％、约2.5％与约6.5％、约3.0％与约10％、约3.0％与约9.5％、约3.0％与约9％、约3.0％与约8.5％、约3.0％与约8％、约3.0％与约7.5％、约3.0％与约7％、或约3.0％与约6.5％之间的G0F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约3.2％与6.6％之间、在约3.2％与约4.6％之间或在3.2％与约6.6％之间的G0F的相对丰度。在一些方面，G0F的相对丰度为约4.0％。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约1.0％与约6％之间的G0F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约1.0％与约6％、约1.0％与约5.5％、约1.0％与约5.0％、约1.0％与约4.5％、约1.0％与约4.0％、约1.5％与约6％、约1.5％与约5.5％、约1.5％与约5.0％、约1.5％与约4.5％、约1.5％与约4.0％、约2.0％与约6％、约2.0％与约5.5％、约2.0％与约5.0％、约2.0％与约4.5％、或约2.0％与约4.0％之间的G0F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约2.1％与约4.0％之间、在约1.8％与约3.5％之间或在约1.8％与4.0％之间的G0F的相对丰度。在一些方面，G0F的相对丰度为约3.4％。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约5％与约12％之间的G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约5％与约12％、约5％与约11.5％、约5％与约11％、约5％与约10.5％、约5％与约10％、约5.5％与约12％、约5.5％与约11.5％、约5.5％与约11％、约5.5％与约10.5％、约5.5％与约10％、约6％与约12％、约6％与约11.5％、约6％与约11％、约6％与约10.5％、约6％与约10％、约6.5％与约12％、约6.5％与约11.5％、约6.5％与约11％、约6.5％与约10.5％、约6.5％与约10％、约7％与约12％、约7％与约11.5％、约7％与约11％、约7％与约10.5％、或约7％与约10％之间的G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约7.2％与约9.8％之间、在约6.3％与10.6％之间或约7.2％与约10.6％之间的G2F的相对丰度。在一些方面，G2F的相对丰度为约7.8％。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约5％与约21％之间的G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约5％与约21％、约5％与约20.5％、约5％与约20％、约5％与约19.5％、约5％与约19％、约5.5％与约21％、约5.5％与约20.5％、约5.5％与约20％、约5.5％与约19.5％、约5.5％与约19％、约6％与约21％、约6％与约20.5％、约6％与约20％、约6％与约19.5％、约6％与约19％、约6.5％与约21％、约6.5％与约20.5％、约6.5％与约20％、约6.5％与约19.5％、约6.5％与约19％、约7％与约21％、约7％与约20.5％、约7％与约20％、约7％与约19.5％、约7％与约19％、约7.5％与约21％、约7.5％与约20.5％、约7.5％与约20％、约7.5％与约19.5％、约7.5％与约19％、约8％与约21％、约8％与约20.5％、约8％与约20％、约8％与约19.5％、或约8％与约19％之间的G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约8.2％与约14.1％、约8.0％与约18.6％、或约8.2％与约14.1％之间的G2F的相对丰度。在一些方面，G2F的相对丰度为约12.4％。在一些方面，G2F进一步包含半乳糖-α-1,3-半乳糖部分(G2F-Gal)，其中所述G2F-Gal包括小于或等于约1.4％的相对丰度。在一些方面，G2F-Gal包括在约1.0％至约1.4％之间的相对丰度。在一些方面，G2F-Gal包括在约0.4％至约0.9％之间的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约29％与约38％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约29％与约38％、约29％与约37.5％、约29％与约37％、约29％与约36.5％、约29.5％与约38％、约29.5％与约37.5％、约29.5％与约37％、约29.5％与约36.5％、约30％与约38％、约30％与约37.5％、约30％与约37％、约30％与约36.5％、约31.5％与约38％、约31.5％与约37.5％、约31.5％与约37％、约31.5％与约36.5％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约31.6％与约35.1％、约31.3％与约36.5％、或约31.3％与约36.5％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，S1G2F的相对丰度为约33.3％。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在33％与约45％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约33％与约45％、约33％与约44.5％、约33％与约44％、约33％与约43.5％、约33％与约43％、约33％与约42.5％、约33.5％与约45％、约33.5％与约44.5％、约33.5％与约44％、约33.5％与约43.5％、约33.5％与约43％、约33.5％与约42.5％、约34％与约45％、约34％与约44.5％、约34％与约44％、约34％与约43.5％、约34％与约43％、约34％与约42.5％、约34.5％与约45％、约34.5％与约44.5％、约34.5％与约44％、约34.5％与约43.5％、约34.5％与约43％、或约34.5％与约42.5％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约34.2％与约37.7％、约35.5％与约42.3％、或约34.2％与约42.3％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，S1G2F的相对丰度为约36.5％。在一些方面，S1G2F进一步包含半乳糖-α-1,3-半乳糖部分(S1G2F-Gal)，其中所述S1G2F-Gal包括小于或等于约4.7％的相对丰度。在一些方面，S1G2F-Gal包括在约2.3％至约4.7％之间的相对丰度。在一些方面，其中S1G2F-Gal包括在约1.4％至约1.8％之间的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约13％与约25％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约13％与约25％、约13％与约24.5％、约13％与约24％、约13％与约23.5％、约13％与约23％、约13.5％与约25％、约13.5％与约24.5％、约13.5％与约24％、约13.5％与约23.5％、约13.5％与约23％、约14％与约25％、约14％与约24.5％、约14％与约24％、约14％与约23.5％、约14％与约23％、约14.5％与约25％、约14.5％与约24.5％、约14.5％与约24％、约14.5％与约23.5％、约14.5％与约23％、约15％与约25％、约15％与约24.5％、约15％与约24％、约15％与约23.5％、约15％与约23％、约15.5％与约25％、约15.5％与约24.5％、约15.5％与约24％、约15.5％与约23.5％、或约15.5％与约23％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约18.1％与约22.9％、约15.4％与约20％、约15.4％与约22.9％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，S2G2F的相对丰度为约18.5％。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约18％与约36％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约18％与约36％、约18％与约35.5％、约18％与约35％、约18％与约34.5％、约18％与约34％、约18％与约33.5％、约18.5％与约36％、约18.5％与约35.5％、约18.5％与约35％、约18.5％与约34.5％、约18.5％与约34％、约18.5％与约33.5％、约19％与约36％、约19％与约35.5％、约19％与约35％、约19％与约34.5％、约19％与约34％、约19％与约33.5％、约19.5％与约36％、约19.5％与约35.5％、约19.5％与约35％、约19.5％与约34.5％、约19.5％与约34％、约19.5％与约33.5％、约20％与约36％、约20％与约35.5％、约20％与约35％、约20％与约34.5％、约20％与约34％、约20％与约33.5％、约20.5％与约36％、约20.5％与约35.5％、约20.5％与约35％、约20.5％与约34.5％、约20.5％与约34％、或约20.5％与约33.5％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约23.2％与约33.8％、约20.8％与约32.6％、或约20.8％与33.8％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，S2G2F的相对丰度为约23.5％。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约2％与约8％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约2％与约8％、约2％与约7.5％、约2％与约7％、约2％与约6.5％、约2％与约6％、约2％与约5.5％、约2.5％与约8％、约2.5％与约7.5％、约2.5％与约7％、约2.5％与约6.5％、约2.5％与约6％、约2.5％与约5.5％、约3％与约8％、约3％与约7.5％、约3％与约7％、约3％与约6.5％、约3％与约6％、约3％与约5.5％、约3.5％与约8％、约3.5％与约7.5％、约3.5％与约7％、约3.5％与约6.5％、约3.5％与约6％、约3.5％与约5.5％、约4％与约8％、约4％与约7.5％、约4％与约7％、约4％与约6.5％、约4％与约6％、或约4％与约5.5％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约4.4％与约5.6％、或约4.0％与约5.5％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，S1G3F的相对丰度为约4.6％。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约0.5％与约4％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约0.5％与约4％、约0.5％与约3.5％、约0.5％与约3％、约0.5％与约2.5％、约1％与约4％、约1％与约3.5％、约1％与约3％、或约1％与约2.5％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约1.4％与约2.2％、约1.1％与约1.9％、或约1.1％与约2.2％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，S1G3F的相对丰度为约1.8％。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约0.5％与约4％之间的S2G4F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约0.5％与约4％、约0.5％与约3.5％、约0.5％与约3％、约0.5％与约2.5％、约1％与约4％、约1％与约3.5％、约1％与约3％、或约1％与约2.5％之间的S2G4F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约1.9％与约2.4％、约1.4％与约2.1％、或约1.4％与约2.4％之间的S2G4F的相对丰度。在一些方面，S2G4F的相对丰度为约2.3％。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖是唾液酸，并且具有从约8至约11的NANA的摩尔比。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖是唾液酸，并且具有从约8.3至约11、从约9.5至约10.1、或从约8.3至约10.1的NANA的摩尔比。在一些方面，所述NANA的摩尔比为约10.0。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖是唾液酸，并且具有从约0.1至约2.0的NGNA的摩尔比。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖是唾液酸，并且具有从0.90至约1.20、或从约0.3至约1.2的NGNA的摩尔比。在一些方面，所述NGNA的摩尔比为约1.0。
在一些方面，所述糖基化谱是经由N-连接的碳水化合物谱释放方法分析的。在一些方面，所述糖基化谱包括一种或多种去唾液酸化聚糖(结构域I)、单唾液酸化聚糖(结构域II)、二唾液酸化聚糖(结构域III)和/或三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有从约28至约37、从约29至约32、从约28至约32或从约29至约37的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有约31的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有从约26至约28、从约27至约33、从约26至约33、从约27至约28的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有约27的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有从约27至约28、从约22至约31、从约27至约31或从约22至约28的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有约27.4的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有从约13至约16、从约8至约16或从约8至约16的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有约14.6的摩尔比。
在一些方面，所述糖基化谱包括一种或多种O-连接的聚糖。在一些方面，所述糖基化谱不包括多于一个的半乳糖-α-1,3-半乳糖(α-gal)连接。在一些方面，所述CTLA4包含C末端赖氨酸。在一些方面，所述C末端赖氨酸包括约20％至约25％的相对丰度。在一些方面，所述C末端赖氨酸包括约3％至约10％的相对丰度。在一些方面，所述O-连接的聚糖位于残基Ser129、Ser130、Ser136和/或Ser139处。在一些方面，所述生物反应器包括包含葡萄糖或半乳糖的补料培养基。在一些方面，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些方面，所述细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一些方面，所述细胞是CHO-K1细胞、CHO-DXB11细胞或CHO-DG44细胞。
本公开文本的方法还包括分析CTLA4-Fc融合蛋白的双触角聚糖的方法，所述方法包括测量与所述CTLA4蛋白中的一个或多个天冬酰胺残基附接的一种或多种N-连接的聚糖，其中所述双触角聚糖中的一种是G2F。在一些方面，所述双触角聚糖选自G0F、G1F、G2F、S1G1F、S1G2F和/或S2G2F。在一些方面，经由超高效液相色谱和荧光检测(UPLC-FLR)测量所述双触角聚糖。在一些方面，在所述测量之前切割所述CTLA4-Fc融合蛋白的Fc结构域。在一些方面，所述方法进一步包括从所述生物反应器中收获所述蛋白质。在一些方面，所述方法进一步包括使所述蛋白质运行通过病毒灭活过程。在一些方面，所述病毒灭活过程用0.5％Triton X-100运行。
在一些方面，所述方法进一步包括调整所述蛋白质的浓度。在一些方面，所述方法进一步包括配制所述蛋白质。
附图说明
图1A示出了常见的N-连接的聚糖的通用结构。GlcNAc(方形)是N-乙酰葡糖胺。Man(圆形)是甘露糖。Gal(实心三角形)是半乳糖。NeuAc或Neu5Ac(星形)是N-乙酰神经氨酸。Fuc(子弹形)是岩藻糖。核心结构示于灰色框中。图1B和图1C示出了G0F(甘露糖-3-N-乙酰葡糖胺-4-岩藻糖)、G1F(甘露糖-3-N-乙酰葡糖胺-4-半乳糖-1-岩藻糖)、G2F(甘露糖-3-N-乙酰葡糖胺-4-半乳糖-2-岩藻糖)、S1G1F(单唾液酸化的甘露糖-3-N-乙酰葡糖胺-4-半乳糖-1-岩藻糖)、S1G2F(单唾液酸化的甘露糖-3-N-乙酰葡糖胺-4-半乳糖-2-岩藻糖)、S1G3F(单唾液酸化的甘露糖-3-N-乙酰葡糖胺-4-半乳糖-3-岩藻糖)和S2G2F(二唾液酸化的甘露糖-3-N-乙酰葡糖胺-4-半乳糖-2-岩藻糖)的示例性结构。图1D示出了阿巴西普分子上的特定N-连接的糖基化位点(Asn76上的T5、Asn108上的T7和Asn207上的T14)。还示出了蛋白酶和氨基酸序列。
图2A示出了在5L生物反应器中用各种条件处理后的平均活细胞密度(VCD)谱的图。测试的条件包括：CO2设定点为22.4％，96小时后第一补料，初始pH为6.9，初始活细胞密度为0.15x 106个细胞/mL，初始活细胞密度为0.45x 106个细胞/mL，总体温度转变为-1℃(36℃、33℃和31℃的三个温度设定点)，pH转变时间设定点为72小时，第二设定点的温度转变(37℃、33℃和32℃)，以及第三设定点的温度转变(37℃、34℃和31℃)。
图2B以表格形式示出了用以下各种因素的实验后的平均峰值VCD(106个细胞/mL)、峰值VCD Dunnett检验p值、平均第0-5天倍增时间(h)、倍增时间Dunnett检验p值、平均第0-14天IVCD(109个细胞天/mL)、IVCD Dunnett检验p值和VCD轮廓值(profile value)：高CO2表示CO2设定点为22.4％。晚第一补料是在96小时的第一补料。低初始pH是6.9的诱导pH。低初始VCD是0.15x 106个细胞/mL的诱导密度。高初始VCD是0.45x 106个细胞/mL的诱导密度。低总体温度是使用以下三个设定点的温度转变谱：36℃为初始温度设定点、33℃为第二温度设定点、以及31℃为最终温度设定点。低温度转变1是使用以下三个设定点的温度转变谱：37℃为初始温度设定点、33℃为第二温度设定点、以及32℃为最终温度设定点。低温度转变2是使用以下三个设定点的温度转变谱：37℃为初始温度设定点、34℃为第二温度设定点、以及31℃为最终温度设定点。
图3示出了每个处理组的平均生产生物反应器活力谱。测试的条件包括：CO2设定点为22.4％，96小时后第一补料，初始pH为6.9，初始活细胞密度为0.15x 106个细胞/mL，初始活细胞密度为0.45x 106个细胞/mL，总体温度转变为-1℃，pH转变时间设定点为72小时，第二设定点的温度转变(37℃、33℃和32℃)，以及第三设定点的温度转变(37℃、34℃和31℃)。
图4A-图4H示出了在用于阿巴西普的生物反应器生产运行的第14天收集的各种糖基化数据。图4A示出了第14天唾液酸和N-连接的结构域(结构域I、III和IV+V)的统计比较。图4B示出了测试组之间的滴度和比生产率的比较。高CO2表示22.4％的CO2设定点。晚第一补料是在96小时的第一补料。低初始pH是6.9的诱导pH。低初始VCD是0.15x 106个细胞/mL的诱导密度。高初始VCD是0.45x 106个细胞/mL的诱导密度。低总体温度是使用以下三个设定点的温度转变谱：36℃为初始温度设定点、33℃为第二温度设定点、以及31℃为最终温度设定点。低温度转变1是使用三个设定点(37℃、33℃和32℃)的温度转变谱。低温度转变2是使用三个设定点(37℃、34℃和31℃)的温度转变谱。图4C示出了使用每个测试条件在5L生物反应器制造运行中在第14天对存在于位点T5和T7的G0F聚糖的分析。图4D示出了使用每个测试条件在5L生物反应器制造运行中在第14天对存在于位点T5和T7的G2F聚糖的分析。图4E示出了使用每个测试条件在5L生物反应器制造运行中在第14天对存在于位点T5和T7的S1G2F聚糖的分析。图4F示出了使用每个测试条件在5L生物反应器制造运行中在第14天对存在于位点T5和T7的S2G2F聚糖的分析。图4G示出了使用每个测试条件在5L生物反应器制造运行中在第14天对存在于位点T5和T7的S1G3F聚糖的分析。图4H示出了使用每个测试条件在5L生物反应器制造运行中在第14天对存在于T5位点的S2G4F聚糖的分析。
图5示出了关于N-连接的糖基化(结构域I、II、III和IV+V)、高分子量污染物、宿主细胞蛋白和核糖体DNA(rDNA)污染的第16天收获数据。还提供了第16天收获前N-连接、HMW、HCP和rDNA的Dunnett检验p值结果。
图6A示出了5L规模生物反应器的测试的过程参数的图。图6B-图6C示出了在许多样品生物反应器运行中产生的蛋白质的糖基化谱，连同诸如HMW、HCP和DNA的污染物。
图7示出了受过程参数修改影响的过程属性的总结。
图8A示出了在本公开文本中使用的方法(J)和替代方法(F)中存在于T5糖基化位点上的各种糖型的相对丰度。图8B示出了鉴定代表这些糖型的峰的代表性质谱分析。替代方法意指不采用本发明公开的任何条件的对照方法。
图9A示出了在本公开文本中使用的方法(J)和替代方法(F)中存在于T5糖基化位点上的各种糖型的相对丰度。图9B示出了鉴定代表这些糖型的峰的代表性质谱分析。
图10A-图10F示出了在本公开文本中使用的方法(J)与替代方法(F)之间比较的各种唾液酸化N-连接聚糖的统计比较。聚糖分析包括结构域I(图10A)、结构域II(图10B)、结构域III(图10C)、结构域IV+V(图10D)、NANA(图10E)和NGNA(图10F)。
具体实施方式
本公开文本涉及提高细胞的蛋白质产量同时维持蛋白质的所需特性(例如，糖基化模式)的方法。在一些方面，所述提高产量的方法包括在蛋白质诱导阶段中将细胞在合适的条件下在生物反应器中培养，所述合适的条件包括但不限于调节温度、设定pH、使用特定活细胞密度、设定CO2浓度或其任何组合。
I.定义
术语“和/或”在本文中使用的情况下被视为对两个指定特征或组分中的每一个与或不与另一个一起的具体公开。因此，如在本文中以短语如“A和/或B”使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)、和“B”(单独)。同样，在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。
应当理解，本文中无论用语言“包括/包含(comprising)”描述任何方面，还提供了以“由……组成”和/或“本质上由……组成”描述的其他类似方面。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本公开文本所属技术的本领域技术人员通常所理解的相同的含义。例如，Concise Dictionary ofBiomedicine and Molecular Biology,Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC出版社；TheDictionary of Cell and Molecular Biology,第3版,1999,学术出版社；以及OxfordDictionary of Biochemistry And Molecular Biology,修订版,2000,牛津大学出版社，为本领域技术人员提供本公开文本中所使用的许多术语的一般解释。
单位、前缀和符号均以其国际单位制(SI)可接受的形式表示。数值范围包括定义所述范围的数字。本文提供的标题不是对本公开文本的各个方面的限制，所述各个方面可以通过参考作为整体的说明书而获得。因此，通过从整体上参考说明书，更全面地定义下文紧接着定义的术语。
替代方案(例如，“或”)的使用应理解为意指替代方案中的任一者、两者或其任何组合。如本文中所用，不定冠词“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”应被理解为是指任何所述或列举组分的“一个/一种或多个/多种”。
术语“约”或“基本上由……构成”是指在如通过本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分取决于如何测量或确定所述值或组成，即测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”或“基本上由……构成”可以意指在1个或多于1个标准差内。可替代地，“约”或“基本上由……构成”可以意指高达20％的范围。此外，特别是关于生物系统或过程，所述术语可以意指高达值的一个数量级或高达值的5倍。当在本申请和权利要求中提供特定值或组成时，除非另有说明，否则应假定“约”或“基本上由……构成”的含义在该特定值或组成的可接受误差范围内。
如本文所述，除非另有指示，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所列举范围内的任何整数及(在适当时)其分数(如整数的十分之一和百分之一)的值。
如本文所用，术语“CTLA4细胞外结构域”是指与B7-1(CD80)和/或B7-2(CD86)结合的包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的全部或部分的蛋白质结构域。在一些方面，CTLA4细胞外结构域可以包含具有与SEQ ID NO:1至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽。CTLA4细胞外结构域由以下序列表示：
SEQ ID NO:1:
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFL
DDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPD
SD
如本文所用，术语“CTLA4-Ig”或“CTLA4-Ig分子”或“CTLA4Ig分子”或“CTLA4-Ig蛋白”或“CTLA4Ig蛋白”或“CTLA4-Fc”可互换使用，并且是指至少包含具有CTLA4细胞外结构域和免疫球蛋白恒定区或其部分的CTLA4-Ig多肽的蛋白质分子。在一些方面，例如，CTLA4-Ig多肽至少包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在某些方面，所述CTLA4细胞外结构域和免疫球蛋白恒定区或其部分可以是野生型的或突变的或经修饰的。突变的CTLA4-Ig多肽是包含突变的CTLA4细胞外结构域的CTLA4-Ig多肽。突变的CTLA4Ig分子至少包含突变的CTLA4-Ig多肽。在一些方面，所述CTLA4细胞外结构域和免疫球蛋白恒定区或其部分可以是哺乳动物(包括人或小鼠)的。在一些方面，突变的CTLA4细胞外结构域可以具有与SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7或8中的任何一个或多个所示的CTLA4细胞外结构域至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。所述多肽可以进一步包含另外的蛋白质结构域。CTLA4-Ig分子可以指CTLA4-Ig多肽的单体，并且还可以指所述多肽的多聚体形式，如二聚体、四聚体和六聚体等(或其他高分子量物质)。CTLA4-Ig分子也能够与CD80和/或CD86结合。CTLA4-Ig和片段(例如，阿巴西普)的例子示于SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7和8中。在一些方面，阿巴西普是SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7和8的组合。
SEQ ID NO:2[CTLA4-Ig氨基酸序列]
MGVLLTQRTLLSLVLALLFPSMASMAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVT
VLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVEL
MYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKP
KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV
LHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV
KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE
ALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:3[SEQ ID NO:2的氨基酸25-383]
MAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELT
FLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPC
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SEQ ID NO:4[SEQ ID NO:2的氨基酸26-383]
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SEQ ID NO:5[SEQ ID NO:2的氨基酸27-383]
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SEQ ID NO:6[SEQ ID NO:2的氨基酸25-382]
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SEQ ID NO:7[SEQ ID NO:2的氨基酸26-382]
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SEQ ID NO:8[SEQ ID NO:2的氨基酸27-382]
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如本文所用，术语“可溶性CTLA4”意指可以在体内循环的分子或不与细胞膜结合的CTLA4。例如，可溶性CTLA4可以包括包含与Ig连接的CTLA4胞外区的CTLA4-Ig。
如本文所用，术语“二聚体”是指由连接或接合在一起的两种CTLA4-Ig多肽或单体构成的CTLA4-Ig蛋白或CTLA4-Ig分子。单体或二聚体之间的连接可以是非共价连接或相互作用、共价连接或相互作用(例如，一个或多个二硫键)或两者。由两种相同单体构成的CTLA4-Ig蛋白或CTLA4-Ig分子是同二聚体。CTLA4-Ig同二聚体还涵盖包含序列可能略有不同的两种单体的分子。同二聚体涵盖这样的二聚体，其中连接在一起的单体具有基本上相同的序列。包含在同二聚体中的单体具有可比的结构同源性。例如，序列的差异可能是由于单体的N末端加工修饰所致。
如本文所用，术语“谷氨酸盐”与“谷氨酸”可互换使用。
如本文所用，“T5”、“T7”和“T15”是指存在于阿巴西普分子上的特定糖基化位点。这些标记分别对应于天冬酰胺76、天冬酰胺108和天冬酰胺207，并且对应于SEQ ID NO:5中的残基(加粗)。T5、T7和T14的肽序列列于图1C中。从糖肽的提取离子色谱图计算主要糖型的相对丰度。
关于SEQ ID NO:5，通过用质谱检测进行的LC-MS胰蛋白酶肽图分析，已经在Asn76、Asn108(CTLA4区)和Asn207(Fc区)处鉴定出N-连接的糖基化位点。使用五字符代码来定义碳水化合物结构类别，例如，P2100、P2120、P2121、P3131和P4142。关于此标记方案，代码中的第一个字符(P)将释放的碳水化合物定义为含有三甘露糖基(trimannosyl)核心结构的N-连接的结构。第二个字符表示与核心附接的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)单元的数量。第三个字符(0或1)表示是否具有与核心的第一个GlcNAc附接的岩藻糖(Fuc)。第四个字符表示与核心附接的半乳糖(Gal)的数量。第五个字符表示与碳水化合物附接的SA(N-乙酰神经氨酸或N-羟乙酰神经氨酸)的数量。P2100也可以表示为G0F。P2110也可以表示为G1F。P2120也可以表示为G2F。P2121也可以表示为S1G2F。P2122也可以表示为S2G2F(di。P3131也可以表示为S1G3F。P4142也可以表示为S2G4F。这些聚糖的代表性图可以在图1A和图1B中看到。
如本文所用，“结构域I”是指去唾液酸化聚糖(如G0F、G1F和G2F)，“结构域II”是指单唾液酸化聚糖(如S1G1F和S1G2F)，“结构域III”是指二唾液酸化聚糖(如S2G2F)，以及“结构域IV”和“结构域V”是指三唾液酸化和四唾液酸化聚糖。
如本文所用，术语“纯化的”是指包含这样的CTLA4-Ig分子或选定的CTLA4-Ig分子群体的组合物，所述CTLA4-Ig分子或选定的CTLA4-Ig分子群体被从其自然环境中移取出(例如，被分离)并且是至少90％不含、91％不含、92％不含、93％不含、94％不含、95％不含、96％不含、97％不含、98％不含、99％不含、99.5％不含或99.9％不含天然关联的其他组分，如细胞材料或培养基。“纯化的”也可以指包含这样的CTLA4-Ig分子或选定的CTLA4-Ig分子群体的组合物，所述CTLA4-Ig分子或选定的CTLA4-Ig分子群体被从其自然环境中移取出并且是至少60％不含、65％不含、70％不含、75％不含、80％不含或85％不含天然关联的其他组分，如细胞材料或培养基。例如，关于重组产生的CTLA4-Ig蛋白质分子，术语“纯化的”也可以指包含这样的CTLA4-Ig蛋白质分子的组合物，所述CTLA4-Ig蛋白质分子被从其生产环境中移取出使得所述蛋白质分子至少90％不含、91％不含、92％不含、93％不含、94％不含、95％不含、96％不含、97％不含、98％不含、99％不含、99.5％不含或99.9％不含并非目的SEQ ID NO:2多肽或SEQ ID NO:2突变多肽的蛋白质分子。“纯化的”不排除CTLA4-Ig分子(如二聚体)与其他CTLA4-Ig分子(如四聚体)的混合物。“纯化的”不排除与CTLA4-Ig分子组合的药学上可接受的赋形剂或载体，其中所述CTLA4-Ig分子已经从其天然环境中取出。
如本文所用，术语“大规模过程”与术语“工业规模过程”可互换使用。术语“培养器皿”与“生物反应器”、“反应器”和“罐”可互换使用。以工业规模使用的生物反应器可以是至少2,000L、至少5,000L、至少10,000L、至少15,000L、至少20,000L、至少25,000L或适于生产工业供应量所需的大生产规模的任何尺寸。
“液体培养物”是指在支持物上生长或在液体营养培养基中悬浮生长的细胞(例如，细菌、植物、昆虫、酵母或动物细胞)。
“种子培养物”是指为了用于接种较大体积的培养基而生长的细胞培养物。种子培养物可用于接种较大体积的培养基，以便扩大培养物中生长的细胞(例如，悬浮生长的细胞)的数量。
如本文所用，术语“培养基”和“细胞培养基”以及“补料培养基”和“发酵培养基”是指用于使细胞生长和或维持细胞(尤其是哺乳动物细胞)的营养溶液。不受限制，这些溶液通常提供来自以下类别中的一类或多类的至少一种组分：(1)能量来源，通常以碳水化合物如葡萄糖的形式；(2)所有必需氨基酸，并且通常是二十个氨基酸加半胱氨酸的基本集合；(3)以低浓度需要的维生素和/或其他有机化合物；(4)游离脂肪酸或脂质，例如亚油酸：和(5)微量元素，其中微量元素被定义为通常以非常低浓度(通常在微摩尔范围内)需要的无机化合物或天然存在的元素。营养溶液可以选择性地补充来自以下任何类别的一种或多种组分：(1)激素和其他生长因子，如血清、胰岛素、转铁蛋白和表皮生长因子；(2)盐，例如镁盐、钙盐和磷酸盐；(3)缓冲液，如HEPES；(4)核苷和碱基，如腺苷、胸苷和次黄嘌呤；(5)蛋白质和组织水解物，例如可以从纯化的明胶、植物材料或动物副产物中获得的蛋白胨或蛋白胨混合物；(6)抗生素，如庆大霉素；(7)细胞保护剂，例如普朗尼克多元醇(pluronicpolyol)；和(8)半乳糖。可商购的培养基如Ham's F10(Sigma)、极限必需培养基((MEM)，(Sigma))、RPMI-1640(Sigma)和杜氏改良伊格尔培养基((DMEM)，(Sigma))适于培养宿主细胞。另外，可使用下列文献中所述的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham等人,Meth.Enz.58:44(1979)，Barnes等人,Anal.Biochem.102:255(1980)。也可以以适当的浓度包含任何其他必要的补充剂。
如本文所用，“培养”是指使一种或多种细胞在限定的或受控的条件下体外生长。可以定义的培养条件的例子包括温度、气体混合物、时间和培养基配制品。
如本文所用，“扩增”是指出于在培养物中获得更多数量的细胞的目的，在体外培养一种或多种细胞。
如本文所用，“温度设定点”是指用于使细胞生长和/或产生蛋白质产物的生物反应器或其他上游处理器皿的温度设定。可以在细胞培养开始时确立温度设定点，在这种情况下也可以将其称为“初始温度设定点”。可以使用序列编号(即，第二温度设定点或随后的第三温度设定点)来指代细胞培养期间初始温度设定点之后的后续温度变化。下游处理之前的最后温度设定点也可以称为“最终温度设定点”。在一些情形下，过程可以包括初始温度设定点、第二温度设定点和第三(和最终)温度设定点。
如本文所用，“CO2设定点”或“CO2设定点”是指存在于上游生产过程中的CO2的浓度。CO2设定点表示为按体积计的百分比(％)。
如本文所用，“群体”是指两个或更多个分子(“分子群体”)或细胞(“细胞群体”)的组，其特征在于存在或不存在一种或多种可测量或可检测特性。在同质群体中，群体中的分子或细胞表征为相同或基本相同的特性(例如，克隆细胞系的细胞)。在异质群体中，群体中的分子或细胞表征为至少一种相同或基本相同的特性，其中所述细胞或分子还可以展现出不相同的特性(例如，CTLA4-Ig分子群体，具有基本相似的平均唾液酸含量但是具有不相似的甘露糖含量)。
如本文所用，“高分子量聚集体”与“高分子量物质”或“HMW”可互换使用，是指包含至少三个CTLA4-Ig单体的CTLA4-Ig分子。例如，高分子量聚集体可以是四聚体、五聚体或六聚体。
如本文所用，“蛋白A”是指大约42kDa并且与免疫球蛋白的Fc部分非常强力地结合的蛋白，并且其在抗体纯化中的用途是本领域熟知的。蛋白A已经在本领域中广泛用于纯化。(Boyle等人,1993；Hou等人1991)。当应用于蛋白A时，术语“残留的”或“rPA”是指由于其在制造过程中的进一步上游纯化目的蛋白或抗体中的使用而存在于混合物中的任何剩余蛋白A。
“产量百分比(％)”是指实际产量除以理论产量，值乘以100。实际产量可以作为以克或以摩尔计的重量(例如，摩尔产量)给出。理论产量可以作为理想产量或数学计算的产量给出。
如本文所用，“糖基化含量”是指与蛋白质分子(如糖蛋白，像CTLA4-Ig分子)共价附接的N-连接的或O-连接的糖残基的量。
如本文所用，“糖基化”是指在多肽链内的特定位点处将复杂的寡糖结构添加到蛋白质中。蛋白质的糖基化和添加的碳水化合物的后续加工会影响蛋白质的折叠和结构、蛋白质的稳定性(包括蛋白质的半衰期)以及蛋白质的功能特性。根据发生修饰的序列情境，蛋白质糖基化可以分为两类：O-连接的糖基化和N-连接的糖基化。O-连接的多糖与羟基连接，通常与丝氨酸或苏氨酸残基的羟基连接。不将O-聚糖添加到每个丝氨酸和苏氨酸残基中。O-连接的寡糖通常是单触角或双触角，即它们包含一个或最多两个分支(触角)，并且包含一至四个不同种类的糖残基，所述糖残基被逐个添加。N-连接的多糖与天冬酰胺的酰胺氮附接。只有作为两种三肽序列(天冬酰胺-X-丝氨酸或天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸))之一的一部分的天冬酰胺才是糖基化的靶标。N-连接的寡糖可以具有一至四个分支，称为单触角、二触角、三触角、四触角。在N-连接的寡糖和O-连接的寡糖中发现的糖残基的结构不同。尽管具有该差异，但是N-连接的多糖和O-连接的多糖的每个分支上的末端残基都可以通过唾液酸分子修饰，所述修饰称为唾液酸封端。唾液酸是独特的九碳单糖家族的通用名称，可以与其他寡糖连接。两个家族成员是N-乙酰神经氨酸(缩写为Neu5Ac、NeuAc或NANA)和N-羟乙酰神经氨酸(缩写为Neu5Gc或NGNA)。唾液酸在人类中最常见的形式是NANA。N-乙酰神经氨酸(NANA)是存在于CTLA4-Ig分子中的主要唾液酸种类。然而，应当注意，在CTLA4-Ig分子中也存在少量但可检测水平的N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)。此外，本文所述的方法可用于确定NANA和NGNA两者的唾液酸的摩尔数，因此测定和报告CTLA4-Ig分子的NANA和NGNA两者的水平。N-连接的寡糖和O-连接的寡糖具有不同数量的分支，这些分支提供了唾液酸分子可以附接的不同数量的位置。N-连接的寡糖可以提供多达四个唾液酸附接位置，而O-连接的寡糖可以提供两个唾液酸附接位点。
如本文所用，计算术语“唾液酸与蛋白质的摩尔比”或“MR”，并且以每摩尔蛋白质(CTLA4-Ig分子)或二聚体的唾液酸分子的摩尔数给出。
如本文所用，术语“糖蛋白”是指通过添加一种或多种碳水化合物(包括添加一种或多种糖残基)而被修饰的蛋白质。
如本文所用，术语“唾液酸化”是指将唾液酸残基添加到蛋白质(包括糖蛋白)中。
如本文所用，术语“糖蛋白亚型”是指由其碳水化合物和唾液酸含量表征的分子，如通过等电聚焦(IEF)凝胶电泳或其他合适的方法测定以通过其分子量、电荷和/或其他特征来区分混合物中的不同蛋白质。例如，在IEF凝胶上观察到的每个不同的条带表示具有特定等电点(pI)并因此具有相同的净总电荷的分子。糖蛋白亚型可以是在IEF凝胶上观察到的不同条带，其中每个条带可以是具有特定pI的分子群体。
如本文所用，成像毛细管等电聚焦(iCIEF)是指用于通过其等电点(pI)分离蛋白质的方法。在这种方法中，用水、甲基纤维素、两性电解质和pI标记物将样品制备为约1mg/mL的最终浓度，然后通过自动进样器将其注入成像毛细管等电聚焦系统(iCIEF)中。基于亚型的电荷变化，电泳通过碳氟化合物(FC)包被的毛细管内的pH梯度分离样品。
“免疫耐受性”是指对于人通常有应答的特定抗原或抗原组无应答的状态(例如，T细胞可能不再对抗原有应答的状态)。
“效力”是指响应随配体浓度变化的量度。例如，激动剂效力被量化为产生最大效应一半的配体的浓度(EC50)。效力的非限制性药理学定义包括亲和力和功效的组分，其中，功效是药物一旦结合就引起反应的能力。效力与亲和力相关，但是效力和亲和力是药物作用的不同量度。
如本文所用，“药学上可接受的载体”是指用于药理学活性剂的媒介物。载体有助于将活性剂递送至靶位点，而不会终止所述药剂的功能。合适形式的载体的非限制性例子包括适用于外用施用的溶液、乳膏、凝胶、凝胶乳剂、胶冻剂(jelly)、糊剂、洗剂、药膏、喷雾剂、软膏、散剂、固体混合物、气溶胶、乳剂(例如油包水或水包油)、凝胶水溶液、水溶液、混悬剂、搽剂、酊剂和贴剂。
如本文所用，短语“药学上可接受的组合物”(或“药物组合物”)是指对于药物施用(如，施用于人类)可接受的组合物。除任何一种或多种活性剂外，这种组合物还可以包括作为不超过对于药物施用可接受的水平的水平(这种水平包括不存在此类杂质的情况)的杂质的物质，并且可以包括药学上可接受的赋形剂、媒介物、载体和其他非活性成分，例如，以配制便于施用的这种组合物。例如，药学上可接受的CTLA4-Ig组合物可以包括MCP-1或DNA，只要这些物质处于对于施用于人可接受的水平即可。
“原料药”是包含在药物组合物中的活性药物成分。术语“原料药”包括呈溶液和/或缓冲形式的活性药物成分。“药物产品”是被配制用于药物施用的含有原料药的药物组合物。出于在本文中可提及原料药和/或药物产品的实施例和其他地方中包含的测定的目的，可以测定的示例性原料药和药物产品如下。
CTLA4Ig分子的示例性药物产品包括：
冻干CTLA4-Ig蛋白(250mg/小瓶)药物产品的组成
组分 量(mg/小瓶)
CTLA4-Ig蛋白 262.5
麦芽糖一水合物 525
磷酸二氢钠一水合物 18.1
氯化钠 15.3
盐酸 调节至pH 7.5
氢氧化钠 调节至pH 7.5
如本文所用，术语“接种”是指将细胞添加到培养基中以开始培养。
如本文所用，细胞培养物的术语“诱导”或“诱导阶段”或“生长阶段”是指在上游细胞培养开始时生物反应器的初始接种，并且包括其中细胞主要快速分裂的指数细胞生长期(例如，对数期)。在此阶段期间，活细胞密度的增加速率高于任何其他时间点。
如本文所用，细胞培养物的术语“生产阶段”是指在此期间细胞生长静止或保持在接近恒定水平的时间段。在给定的时间段内，活细胞的密度保持大致恒定。对数细胞生长已终止，并且蛋白质生产是生产阶段期间的主要活动。此时的培养基通常被补充以支持持续的蛋白质生产并获得所需的糖蛋白产物。
如本文所用，术语“表达(expression)”或“表达(expresses)”用于指发生在细胞内的转录和翻译。宿主细胞中产物基因的表达水平可以基于存在于细胞中的相应mRNA的量或由细胞产生的由产物基因编码的蛋白质的量或两者来确定。
如本文所用，“N-连接的聚糖”是指其中聚糖经由氮连接与糖缀合物连接的蛋白质修饰。聚糖的受体是分别进入周质或ER内腔的多肽链的所选择的天冬酰胺残基。寡糖转移酶(N-糖基化途径的中心酶)催化寡糖与通过共有序列N-X-S/T指定的天冬酰胺残基的侧链酰胺形成N-糖苷连接。所有真核生物N-聚糖共享共同的核心序列Manα1-3(Manα1-6)Manβ1-4GlcNAcβ1–4GlcNAcβ1–Asn-X-Ser/Thr，并分为三种类型：(1)寡甘露糖型，其中仅Man残基延伸核心；(2)复合型，其中GlcNAc引发的“触角”延伸核心；和(3)杂合型，其中Man延伸核心的Manα1-6臂，并且一个或两个GlcNAc延伸Manα1-3臂。
如本文所用，“N-连接的糖基化”是指寡糖与氮原子(通常为天冬酰胺残基的N4)的附接。N-糖基化可以发生在分泌的或膜结合的蛋白质上，主要发生在真核生物和古细菌中。用于产生N-连接的聚糖(例如，高甘露糖型寡糖)的生物合成途径和酶的详细综述描述于Stanley等人,"N-Glycans"in Essentials of Glycobiology,编辑Varki,Cummings,和Eskho,Cold Spring Harbor Press,2009。
如本文所用，术语“质谱法”是指用于基于分子的质荷比(m/z)来检测、鉴定和定量分子的灵敏技术。当它们沿着平行且等距的极或杆(如四极，其包含四个极或杆)的中心轴通过时，电场用于根据离子的质荷比(m/z)、质量与电荷的整数比(z)来分离离子。每个杆施加两个电压，其中一个是固定的直流电，并且第二个是以叠加的射频循环的交流电。可以对所施加电场的大小进行排序，使得只有具有特定m/z比的离子才能穿过四极，然后进行检测。具有所有其他m/z值的离子偏转到轨迹上，这将导致它们与四极杆碰撞并放电，或者从质量分析仪场喷射并经由真空去除。四极通常被称为专用检测器，因为在任何时候只有具有特定m/z的离子在四极中是稳定的。那些具有稳定轨迹的离子通常被称为具有非碰撞、共振或稳定轨迹。
通常，对于三重四极质谱仪上的实验，第一四极(Q1)被设定为仅通过样品中预期化学种类的具有指定m/z的离子(先驱离子)。第二四极(即，Q2或碰撞单元)用于碎裂通过Q1的离子。第三四极(Q3)被设定为仅使对应于预期化学种类的预期碎裂产物的具有指定m/z的离子(片段离子)通至检测器。在一些方面，在质谱仪中将样品电离，以生成一种或多种质子化或去质子化的分子离子。在一些方面，一种或多种质子化或去质子化的分子带单电荷、带双电荷、带三电荷或带更高电荷。在一些方面，质谱仪是三重四极质谱仪。在一些方面，用于Q1和Q3的分辨率是单位分辨率。在其他方面，用于Q1和Q3的分辨率是不同的。在其他方面，用于Q1的分辨率高于Q3的单位分辨率。
如本文所用，术语“荧光团”是指可在光激发时再发射光的荧光化合物。荧光团通常含有若干个组合的芳族基团，或含有具有若干个π键的平面或环状分子。两种常用的荧光团是2-AB(2-氨基苯甲酰胺)和2-AA(邻氨基苯甲酸或2-氨基苯甲酸)。其他荧光团包括PA(2-氨基吡啶)、AMAC(2-氨基吖啶酮)、ANDS(7-氨基-1,3-萘二磺酸)、ANTS(8-氨基萘-1,3,6-三磺酸)、APTS(9-氨基芘-1,4,6-三磺酸)和3-(乙酰氨基)-6-氨基吖啶。
如本公开文本中使用的“聚糖谱”应理解为可以用于与源自另一样品或样品组的参考值或谱比较的聚糖的定量结果的值的任何定义集。例如，来自蛋白质样品的样品的聚糖谱可能与来自替代来源的样品的聚糖谱显著不同。聚糖谱可以通过将该谱与参考或标准谱进行比较来帮助预测或预期蛋白质的药效学(PD)或药代动力学(PK)治疗效果。可以通过能够检测聚糖的任何分析仪器(如质谱)来生成参考和样品聚糖谱。所述一种或多种N-聚糖可以是半乳糖(Gal)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、半乳糖胺(GalN)、葡萄糖(Glc)、N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、葡萄糖胺(GlcN)、甘露糖(Man)、N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)、甘露糖胺(ManN)、木糖(Xyl)、N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)、2-酮-3-脱氧壬酸(Kdn)、岩藻糖(Fuc)、葡萄糖醛酸(GlcA)、艾杜糖醛酸(IdoA)、半乳糖醛酸(GalA)、甘露糖醛酸(ManA)或其任何组合。
如本文所用，短语“一种或多种工作溶液”是指在方法中使用的溶液。工作溶液的非限制性例子包括缓冲液。
如本文所用，“参考材料”是指在方法中用作标准品的材料。例如，可以将参考材料用作将实验样品与之比较的标准品。
在不提供关于物质的量的范围的下限的情况下，考虑不存在这种物质。
如本文所用，关于细胞培养所列举的温度是指在调节生物反应器温度的仪器上的温度设定。当然，液体培养物本身的温度将采用在调节生物反应器温度的仪器上设定的温度。在温度提及在培养箱中的架子上维持的细胞培养物的情况下，则温度是指培养箱的架子温度。
II.提高产量的方法
本公开文本提供了提高细胞的蛋白质产量的方法，所述方法包括在蛋白质诱导阶段中将所述细胞在合适的条件下在生物反应器中培养，其中所述合适的条件包括但不限于初始温度设定点的调节、第二温度设定点的调节、最终温度设定点的调节、补料时间的调节、初始pH的调节、pH转变的调节、CO2浓度的调节、初始细胞密度的调节或其任何组合的调节。
本公开文本的方法可用于产生反应器条件，其中所述反应器条件提高蛋白质产量。在一些方面，与不采用合适的条件(例如，初始、第二和最终温度设定点的调节，例如36℃、33℃和31℃的温度设定点)的方法相比，所述条件将所述蛋白质产量提高至少150％、至少约160％、至少约170％、至少约180％、至少约190％、至少约200％、至少约210％、至少约220％、至少约230％、至少约240％、至少约250％、至少约260％、至少约270％、至少约280％、至少约290％、至少约300％、至少约310％、至少约320％、至少约330％、至少约340％、至少约350％、至少约360％、至少约370％、至少约380％、至少约390％或至少约400％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少150％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少160％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少170％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少180％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少190％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少200％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少210％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少220％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少230％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少240％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少250％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少260％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少270％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少280％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少290％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少300％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少310％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少320％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少330％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少340％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少350％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少360％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少370％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少380％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少390％。在一些方面，所述条件将蛋白质产量提高至少400％。
在一些方面，与不采用合适的条件(例如，初始、第二和最终温度设定点的调节，例如36℃、33℃和31℃的温度设定点)的方法相比，本发明方法将蛋白质产量提高至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍。在一些方面，本发明方法将蛋白质产量提高约2倍至约3倍。在一些方面，本发明方法将蛋白质产量提高约3倍至约4倍。在一些方面，本发明方法将蛋白质产量提高约4倍至约5倍。在一些方面，本发明方法将蛋白质产量提高约5倍至约6倍。在一些方面，本发明方法将蛋白质产量提高约6倍至约7倍。在一些方面，本发明方法将蛋白质产量提高约7倍至约8倍。在一些方面，本发明方法将蛋白质产量提高约8倍至约9倍。
本公开文本的方法还可用于增加作为总宿主细胞蛋白质部分的总蛋白质输出，从而实现每批更大的蛋白质产量。在一些方面，本公开文本的方法还可用于基于蛋白质在高尔基体中的驻留时间和向糖基化酶的暴露的改变而增加具有所需糖基化模式的总蛋白质输出。在一些方面，与不采用合适的条件(例如，初始、第二和最终温度设定点的调节，例如36℃、33℃和31℃的温度设定点)的方法相比，所述条件将具有所需糖基化谱的蛋白质的蛋白质产量提高至少150％、至少约160％、至少约170％、至少约180％、至少约190％、至少约200％、至少约210％、至少约220％、至少约230％、至少约240％、至少约250％、至少约260％、至少约270％、至少约280％、至少约290％、至少约300％、至少约310％、至少约320％、至少约330％、至少约340％、至少约350％、至少约360％、至少约370％、至少约380％、至少约390％或至少约400％。
本公开文本的方法可用于降低培养物的生长速率和/或稳态细胞密度，以提高总产量和/或控制蛋白质的糖基化谱。在一些方面，所述方法降低细胞生长速率。在一些方面，所述细胞生长展现出从约30.0小时至约45.0小时、约30.0小时至约40.0小时、约31小时至约44小时、约32小时至约43小时或约33小时至约42小时的平均第0-5天倍增时间。在一些方面，所述细胞生长展现出从约30小时至约42小时，例如30小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、37小时、38小时、39小时、40小时、41小时或42小时的平均第0-5天倍增时间。在一些方面，所述细胞生长展现出从约32小时至约38小时的平均第0-5天倍增时间。在一些方面，所述细胞生长展现出从约33小时至约37小时的平均第0-5天倍增时间。在一些方面，所述细胞生长展现出从约34小时至约36小时的平均第0-5天倍增时间。
在一些方面，所述细胞生长展现出约30小时的平均第0-5天倍增时间。在一些方面，所述细胞生长展现出约32小时的平均第0-5天倍增时间。在一些方面，所述细胞生长展现出约34小时的平均第0-5天倍增时间。在一些方面，所述细胞生长展现出约38小时的平均第0-5天倍增时间。在一些方面，所述细胞生长展现出约40小时的平均第0-5天倍增时间。
本公开文本的方法还可用于在蛋白质生产期间控制活细胞密度或峰值活细胞密度。在一些方面，所述细胞活力展现出从约5x 106个细胞/mL至约21x 106个细胞/mL的平均峰值活细胞密度(VCD)。在一些方面，所述细胞活力展现出从约6x 106个细胞/mL至约20x106个细胞/mL的平均峰值活细胞密度(VCD)。在一些方面，所述细胞活力展现出从约7x 106个细胞/mL至约19x 106个细胞/mL的平均峰值活细胞密度(VCD)。在一些方面，所述细胞活力展现出从约8x 106个细胞/mL至约18x 106个细胞/mL的平均峰值活细胞密度(VCD)。在一些方面，所述细胞活力展现出从约9x 106个细胞/mL至约17x 106个细胞/mL的平均峰值活细胞密度(VCD)。在一些方面，所述细胞活力展现出从约10x106个细胞/mL至约16x 106个细胞/mL的平均峰值活细胞密度(VCD)。在一些方面，所述细胞活力展现出从约11x 106个细胞/mL至约15x 106个细胞/mL的平均峰值活细胞密度(VCD)。在一些方面，所述细胞活力展现出从约12x 106个细胞/mL至约14x 106个细胞/mL的平均峰值活细胞密度(VCD)。
在一些方面，细胞活力展现出约6x 106个细胞/mL的平均峰值活细胞密度(VCD)。在一些方面，细胞活力展现出约6x 106个细胞/mL的平均峰值活细胞密度(VCD)。在一些方面，细胞活力展现出约10x 106个细胞/mL的平均峰值活细胞密度(VCD)。在一些方面，所述细胞活力展现出约10.5x 106个细胞/mL的平均峰值活细胞密度(VCD)。在一些方面，所述细胞活力展现出约11x 106个细胞/mL的平均峰值活细胞密度(VCD)。在一些方面，细胞活力展现出约11.5x 106个细胞/mL的平均峰值活细胞密度(VCD)。在一些方面，细胞活力展现出约12x 106个细胞/mL的平均峰值活细胞密度(VCD)。在一些方面，细胞活力展现出约12.5x 106个细胞/mL的平均峰值活细胞密度(VCD)。在一些方面，细胞活力展现出约13x 106个细胞/mL的平均峰值活细胞密度(VCD)。在一些方面，细胞活力展现出约13.5x 106个细胞/mL的平均峰值活细胞密度(VCD)。在一些方面，细胞活力展现出约14x 106个细胞/mL的平均峰值活细胞密度(VCD)。在一些方面，细胞活力展现出约14.5x 106个细胞/mL的平均峰值活细胞密度(VCD)。在一些方面，细胞活力展现出约15x 106个细胞/mL的平均峰值活细胞密度(VCD)。
本公开文本的方法还可用于改善或控制平均第0-14天活细胞密度积分(IVCD)之后的细胞活力。与活细胞密度的瞬时测量相反，IVCD测量是测量上游过程生产的替代方式。由于每个细胞具有可变的蛋白质生产寿命，并且各种细胞培养条件影响随时间变化的活细胞率，因此IVCD可用于估计整个过程的时间内的蛋白质产物的总产量。在一些方面，所述细胞活力展现出从约0.05x 109个细胞/mL至约0.2x 109个细胞/mL的平均第0-14天活细胞密度积分(IVCD)。在一些方面，所述细胞活力展现出从约0.1x 109个细胞/mL至约0.15x 109个细胞/mL的平均第0-14天活细胞密度积分(IVCD)。在一些方面，所述细胞活力展现出从约0.05x 109个细胞/mL至约0.15x 109个细胞/mL的平均第0-14天活细胞密度积分(IVCD)。在一些方面，所述细胞活力展现出从约0.05x 109个细胞/mL至约0.1x 109个细胞/mL的平均第0-14天活细胞密度积分(IVCD)。在一些方面，所述细胞活力展现出从约0.09x 109个细胞/mL至约0.13x 109个细胞/mL的平均第0-14天活细胞密度积分(IVCD)。在一些方面，所述细胞活力展现出从约0.09x 109个细胞/mL至约0.11x 109个细胞/mL的平均第0-14天活细胞密度积分(IVCD)。
本公开文本的方法还可用于控制蛋白质滴度。在一些方面，在约14天的时间段后测量滴度。在一些方面，所述滴度展现出从约1.5g/L至约3.5g/L的平均第14天滴度。在一些方面，所述滴度展现出从约1.5g/L至约3g/L的平均第14天滴度。在一些方面，所述滴度展现出从约2g/L至约3g/L的平均第14天滴度。在一些方面，所述滴度展现出从约2g/L至约2.5g/L的平均第14天滴度。在一些方面，所述滴度展现出从约2.5g/L至约3g/L的平均第14天滴度。在一些方面，所述滴度展现出约2g/L的平均第14天滴度。在一些方面，所述滴度展现出约2.5g/L的平均第14天滴度。在一些方面，所述滴度展现出约2.8g/L的平均第14天滴度。在一些方面，所述滴度展现出约2.87g/L的平均第14天滴度。在一些方面，所述滴度展现出约2.9g/L的平均第14天滴度。在一些方面，所述滴度展现出约3g/L的平均第14天滴度。在一些方面，所述滴度展现出约3.5g/L的平均第14天滴度。
本公开文本的方法还可用于控制细胞的蛋白质生产，如通过单独细胞输出产量所测量的。经由单独细胞输出产量来测量输出对于根据反应器条件监测细胞健康是有用的。在一些方面，所述滴度展现出从约20pg/细胞-天至约45pg/细胞-天的平均比生产率。在一些方面，所述滴度展现出从约20pg/细胞-天至约40pg/细胞-天的平均比生产率。在一些方面，所述滴度展现出从约30pg/细胞-天至约45pg/细胞-天的平均比生产率。在一些方面，所述滴度展现出从约20pg/细胞-天至约35pg/细胞-天的平均比生产率。在一些方面，所述滴度展现出从约25pg/细胞-天至约35pg/细胞-天的平均比生产率。在一些方面，所述滴度展现出从约25pg/细胞-天至约30pg/细胞-天的平均比生产率。在一些方面，所述滴度展现出从约30pg/细胞-天至约40pg/细胞-天的平均比生产率。在一些方面，所述滴度展现出从约30pg/细胞-天至约35pg/细胞-天的平均比生产率。在一些方面，所述滴度展现出约20pg/细胞-天的平均比生产率。在一些方面，所述滴度展现出约25pg/细胞-天的平均比生产率。在一些方面，所述滴度展现出约30pg/细胞-天的平均比生产率。在一些方面，所述滴度展现出约31pg/细胞-天的平均比生产率。在一些方面，所述滴度展现出约32pg/细胞-天的平均比生产率。在一些方面，所述滴度展现出约33pg/细胞-天的平均比生产率。
在一些方面，所述滴度展现出约34pg/细胞-天的平均比生产率。在一些方面，所述滴度展现出约35pg/细胞-天的平均比生产率。在一些方面，所述滴度展现出约36pg/细胞-天的平均比生产率。在一些方面，所述滴度展现出约37pg/细胞-天的平均比生产率。在一些方面，所述滴度展现出约38pg/细胞-天的平均比生产率。在一些方面，所述滴度展现出约39pg/细胞-天的平均比生产率。在一些方面，所述滴度展现出约40pg/细胞-天的平均比生产率。在一些方面，所述滴度展现出约41pg/细胞-天的平均比生产率。在一些方面，所述滴度展现出约42pg/细胞-天的平均比生产率。在一些方面，所述滴度展现出约45pg/细胞-天的平均比生产率。
可以经由使用能量源使细胞在器皿中生长来利用本公开文本的方法。在一些方面，所述器皿是生物反应器并且包括包含葡萄糖或半乳糖的补料培养基。在一些方面，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些方面，所述细胞是真核细胞。在一些方面，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些方面，所述细胞选自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HEK293细胞、小鼠骨髓瘤(NS0)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、猴肾成纤维细胞(COS-7)、马-达二氏牛肾细胞(Madin-Darbybovine kidney cell，MDBK)及其任何组合。在一方面，所述细胞是中国仓鼠卵巢细胞。在一些方面，所述细胞是昆虫细胞，例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。在其他方面，所述细胞是哺乳动物细胞。此类哺乳动物细胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、Hela、MDCK、HEK 293、NIH 3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O和T47D、NS0、CRL7O3O、COS(例如，COS1或COS)、PER.C6、VERO、HsS78Bst、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20、BMT10和HsS78Bst细胞。在一些方面，所述哺乳动物细胞是CHO细胞。在一些方面，所述CHO细胞是CHO-DG44、CHOZN、CHO/dhfr-、CHOK1SV GS-KO或CHO-S。在一些方面，所述CHO细胞是CHO-DG4。在一些方面，所述CHO细胞是CHOZN。本文公开的其他合适的CHO细胞系包括CHO-K(例如，CHO K1)、CHO pro3-、CHO P12、CHO-K1/SF、DUXB11、CHO DUKX、PA-DUKX、CHO pro5、DUK-BII或其衍生物。
IIA.温度
生产器皿(如生物反应器)的温度可以是生物生产的重要方面，因为生物反应器的温度在细胞内的细胞生长、活细胞密度、细胞寿命和/或糖基化酶的糖基化活性中起作用。温度变化会显著影响细胞内酶促反应的速率、使蛋白质变性和/或对细胞培养物产生其他影响。例如，可以将细胞在初始温度设定点(如37℃)培养，以促进最大活细胞密度，然后可以将温度修改为另一个温度设定点(即，第二温度设定点或最终温度设定点)以延长细胞寿命或增强细胞内所需的糖基化活性。可以在上游生产过程的各个阶段期间使用一个或多个温度设定点，以改善目的蛋白的总体细胞密度、蛋白质产量或蛋白质糖基化谱。在一些方面，所述方法涉及蛋白质生产期间的一次或多次温度调节。温度调节可以是制造过程期间操作温度的降低。温度调节也可以是在制造过程期间的操作温度的升高。在一些方面，本公开文本的方法在制造过程期间使用至少一次、至少两次、至少三次或至少四次温度调节。
本公开文本的方法还涉及控制细胞生长速率、细胞活力、活细胞密度和/或细胞滴度以产生蛋白质。初始温度设定点对于在对数生长期期间创造有利于细胞扩增和细胞生长的反应器条件很重要。在初始对数期之后，使用低于初始设定点的第二温度设定点来降低细胞扩增条件，以防止细胞培养物的将导致不期望的细胞密度和随后的总细胞活力损失的过度生长。在一些方面，本公开文本的方法涉及在诱导阶段中将细胞在生物反应器中在36℃的初始温度设定点下培养，随后将细胞在33℃的第二温度设定点下培养，最后将细胞在31℃的最终温度设定点下培养。在一些方面，本公开文本的方法使用至少两个、至少三个、至少四个或至少五个温度设定点，例如，初始温度设定点、最终设定点或在初始温度设定点之后但在最终设定点之前的更多个设定点。在一些方面，本公开文本的方法使用至少三个温度设定点，即，初始温度设定点、第二温度设定点和最终温度设定点。
在一些方面，本发明方法的初始温度设定点为约37℃并且第二温度设定点低于约36℃。在一些方面，所述初始温度设定点为约36℃并且第二温度设定点低于所述第一温度设定点，例如约35℃、约34℃、约33℃、约32℃或约31℃。在一些方面，所述初始温度设定点为约37℃并且第二温度设定点低于约34℃。在一些方面，所述初始温度设定点为约36℃并且第二温度设定点低于约35℃、约34℃或约33℃。在一些方面，所述初始温度设定点低于约36.5℃并且所述最终温度设定点为约31℃。在一些方面，所述初始温度设定点为约36.0℃并且所述最终温度设定点为约31℃。在一些方面，所述初始温度设定点低于约35.5℃并且所述最终温度设定点为约31℃。在一些方面，所述初始温度设定点低于约35.0℃并且所述最终温度设定点为约31℃。在一些方面，所述初始温度设定点低于约36.5℃，第二温度设定点为约33℃，并且最终温度设定点低于约33℃或约32℃。在一些方面，所述初始温度设定点为约36.0℃，第二温度设定点为约33℃，并且最终温度设定点低于约33℃或约32℃。在一些方面，所述初始温度设定点为约36.0℃，第二温度设定点为约33℃，并且最终温度设定点低于约32℃。在一些方面，所述初始温度设定点为约36.0℃，第二温度设定点为约33℃，并且最终温度设定点为约31℃。
本公开文本的方法可以包括初始温度设定点、第二温度设定点以及第三和/或最终设定点。初始、第二以及第三和/或最终温度设定点用于在制造过程期间进一步控制稳态细胞密度、控制活细胞百分比、管理培养物的细胞周期分裂和/或改变所产生的蛋白质的糖基化速率和糖基化谱。在一些方面，所述第三温度设定点低于所述第二温度设定点。在一些方面，初始温度设定点为37℃与34℃之间的温度，例如，37℃、36℃、35℃或34℃；第二温度设定点为34℃与32℃之间的温度，例如，34℃、33℃或32℃；并且最终温度设定点为32℃与30℃之间的温度，例如，32℃、31℃或30℃，其中所述第二温度设定点低于所述第一温度设定点，并且所述最终温度设定点低于所述第二温度设定点。在一些方面，初始温度设定点为37℃与34℃之间的温度，例如，37℃、36℃、35℃或34℃；第二温度设定点为34℃与32℃之间的温度，例如，34℃、33℃或32℃；并且最终温度设定点为32℃与30℃之间的温度，例如，32℃、31℃或30℃，其中所述第一温度设定点不是37℃，所述第二温度设定点不是34℃，和/或所述最终温度设定点不是32℃。
本公开文本的方法可以包括初始温度设定点、第二温度设定点、第三温度设定点以及任选地第四温度设定点、任选地第五温度设定点和任选地第六温度设定点。这些第四、第五和第六温度设定点用于在制造过程期间进一步控制稳态细胞密度、控制活细胞百分比、管理培养物的细胞周期分裂和/或改变所产生的蛋白质的糖基化速率和糖基化谱。在一些方面，所述方法进一步包括设置任选的第四温度设定点、任选的第五温度设定点、任选的第六温度设定点，其中所述任选的第四温度设定点、所述第五温度设定点和/或所述第六温度设定点低于所述第三温度设定点。在一些方面，所述方法进一步包括设置任选的第四温度设定点、任选的第五温度设定点和任选的第六温度设定点，其中所述任选的第四温度设定点、所述第五温度设定点和/或所述第六温度设定点高于所述第三温度设定点。在一些方面，所述第四、第五或第六温度设定点、所述第五温度设定点和/或所述第六温度设定点为约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃或约40℃。在一些方面中，所述第四、第五或第六温度设定点、所述第五温度设定点和/或所述第六温度设定点为约30℃。在一些方面，所述第四、第五或第六温度设定点为约31℃。在一些方面，所述第四、第五或第六温度设定点为约32℃。在一些方面，所述第四、第五或第六温度设定点为约33℃。在一些方面，所述第四、第五或第六温度设定点为约34℃。在一些方面，所述第四、第五或第六温度设定点为约35℃。在一些方面，所述第四、第五或第六温度设定点为约36℃。在一些方面，所述第四、第五或第六温度设定点为约37℃。在一些方面，所述第四、第五或第六温度设定点为约38℃。在一些方面，所述第四、第五或第六温度设定点为约39℃。在一些方面，所述第四、第五或第六温度设定点为约40℃。
除了温度设定点之外，本公开文本的方法还涉及修改温度设定点的时间设定，以在特定时间窗内进行温度转变。温度转变的时间设定对于控制上游过程期间细胞培养物的细胞密度、细胞生长和蛋白质生产特征很重要。在一些方面，本公开文本的方法涉及一种提高细胞的蛋白质产量的方法，所述方法包括将所述细胞在合适的条件下在生物反应器中培养，其中所述合适的条件包括(i)36.0℃的初始温度设定点和低于36℃的第二温度设定点；(ii)低于36.5℃的初始温度设定点和31℃的最终温度设定点；或(iii)低于36.5℃的初始温度设定点、33℃的第二温度设定点和低于33℃的最终温度设定点。在一些方面，本公开文本的方法涉及一种提高细胞的蛋白质产量的方法，所述方法包括将所述细胞在合适的条件下在生物反应器中培养，其中所述合适的条件包括(i)36.0℃的初始温度设定点和低于34℃的第二温度设定点；(ii)低于36.5℃的初始温度设定点和31℃的最终温度设定点；或(iii)低于36.5℃的初始温度设定点、32℃的第二温度设定点和低于32℃的最终温度设定点。
在一些方面，将细胞在合适的条件下在生物反应器中培养，所述合适的条件包括(i)高于35℃但低于37℃的初始温度设定点和高于32℃但低于34℃的第二温度设定点，(ii)高于35.5℃但低于37.5℃的初始温度设定点和高于32℃但低于34℃的第二温度设定点，以及(iii)高于35℃但低于37℃的初始温度设定点，高于32℃但低于34℃的第二温度设定点，和高于30℃但低于32℃的最终温度设定点。
本公开文本的方法还可用于通过在初始温度设定点之后调节生物反应器中的温度设定点来提高细胞的蛋白质产量。在一些方面，所述初始温度设定点高于约35℃且低于37℃，例如约36℃；所述第二温度设定点高于约32℃且低于约34℃，约33℃；并且所述第三温度设定点高于约30℃且低于约32℃，例如约31℃，其中所述第二温度设定点发生在所述初始温度设定点之后约120小时至约168小时，例如约5天、约6天或约7天。在一些方面，所述初始温度设定点高于约35℃且低于37℃，例如约36℃；所述第二温度设定点高于约32℃且低于约34℃，约33℃；并且所述第三温度设定点高于约30℃且低于约32℃，例如约31℃，其中所述第二温度设定点发生在所述初始温度设定点之后约120小时、约126小时、约132小时、约138小时、约144小时、约150小时、约156小时、约162小时或约168小时。
在一些方面，所述初始温度设定点高于约35℃且低于37℃，例如约36℃；所述第二温度设定点高于约32℃且低于约34℃，约33℃；并且所述第三温度设定点高于约30℃且低于约32℃，例如约31℃，其中所述第二温度设定点发生在所述初始温度设定点之后约120小时，5天。在一些方面，所述初始温度设定点高于约35℃且低于37℃，例如约36℃；所述第二温度设定点高于约32℃且低于约34℃，约33℃；并且所述第三温度设定点高于约30℃且低于约32℃，例如约31℃，其中所述第二温度设定点发生在所述初始温度设定点之后约144小时，6天。在一些方面，所述初始温度设定点高于约35℃且低于37℃，例如约36℃；所述第二温度设定点高于约32℃且低于约34℃，约33℃；并且所述第三温度设定点高于约30℃且低于约32℃，例如约31℃，其中所述第二温度设定点发生在所述初始温度设定点之后约168小时，7天。在一些方面，所述第二温度设定点发生在初始温度设定点之后约192小时，例如8天。
本公开文本的方法还用于控制到最终温度设定点的转变时间设定。在一些方面，所述初始温度设定点高于约35℃且低于37℃，例如约36℃；所述第二温度设定点高于约32℃且低于约34℃，约33℃；并且所述最终温度设定点高于约30℃且低于约32℃，例如约31℃，其中所述最终温度设定点发生在初始温度设定点之后从约168小时至约312小时、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天或约13天、从7天至12天、从8天至13天、从9天至13天、从8天至12天、从8天至11天。在一些方面，所述初始温度设定点高于约35℃且低于37℃，例如约36℃；所述第二温度设定点高于约32℃且低于约34℃，约33℃；并且所述最终温度设定点高于约30℃且低于约32℃，例如约31℃，其中所述最终温度设定点发生在从约192小时至约300小时。在一些方面，所述最终温度设定点发生在从约216小时至约288小时。在一些方面，所述最终温度设定点发生在从约216小时至约264小时。
IIB.pH
在一方面，本公开文本的方法涉及通过改变过程的pH来改善或控制蛋白质生产。细胞内pH的调节是对细胞生长和代谢具有重要意义的基本生理过程。由于细胞内pH对营养物质和激素的运输以及细胞中的酶促反应具有广泛的影响，因此细胞将大量能量用于胞质pH的调节。此外，pH在细胞产生的蛋白质的糖基化速率和糖基化谱方面起作用。
在一些方面，改变pH可以通过在培养过程期间使用多于一个pH设定点、多于两个pH设定点、多于三个pH设定点、多于四个pH设定点或多于五个pH设定点来完成。在一些方面，改变pH使用初始pH设定点和第二pH设定点。在一些方面，改变pH使用初始pH设定点、第二pH设定点和第三pH设定点。在一些方面，改变pH包括在培养过程期间降低pH。在一些方面，改变pH包括将pH降低至少约0.5、至少约1.0、至少约1.5、至少约2.0、至少约0.1、至少约0.2、至少约0.3或至少约0.4。在一些方面，改变pH包括将pH降低至少约0.1。在一些方面，改变pH包括将pH降低至少约0.2。在一些方面，改变pH包括将pH降低至少约0.5。在一些方面，改变pH包括将pH降低至少约1。在一些方面，改变pH包括将pH降低至少约1.5。在一些方面，改变pH包括将pH降低至少约2。
在一些方面，所述初始pH设定点为pH 7.0并且第二pH设定点为6.9。在一些方面，所述初始pH为7.0。在一些方面，所述初始pH设定点为6。在一些方面，所述初始pH设定点为6.1。在一些方面，所述初始pH设定点为6.2。在一些方面，所述初始pH设定点为6.3。在一些方面，所述初始pH设定点为6.4。在一些方面，所述初始pH设定点为6.5。在一些方面，所述初始pH设定点为6.6。在一些方面，所述初始pH设定点为6.7。在一些方面，所述初始pH设定点为6.8。在一些方面，所述初始pH设定点为6.9。在一些方面，所述初始pH设定点为7。在一些方面，所述第二pH设定点为6。在一些方面，所述第二pH设定点为6.1。在一些方面，所述第二pH设定点为6.2。在一些方面，所述第二pH设定点为6.3。在一些方面，所述第二pH设定点为6.4。在一些方面，所述第二pH设定点为6.5。在一些方面，所述第二pH设定点为6.6。在一些方面，所述第二pH设定点为6.7。在一些方面，所述第二pH设定点为6.8。在一些方面，所述第二pH设定点为6.9。在一些方面，所述第二pH设定点为7。在一些方面，所述第三pH设定点为6。在一些方面，所述第三pH设定点为6.1。在一些方面，所述第三pH设定点为6.2。在一些方面，所述第三pH设定点为6.3。在一些方面，所述第三pH设定点为6.4。在一些方面，所述第三pH设定点为6.5。在一些方面，所述第三pH设定点为6.6。在一些方面，所述第三pH设定点为6.7。在一些方面，所述第三pH设定点为6.8。在一些方面，所述第三pH设定点为6.9。在一些方面，所述第三pH设定点为7。在一些方面，所述初始pH为7.0并且所述第二pH为6.9。在一些方面，所述初始pH为7.1并且所述第二pH为6.8。在一些方面，所述初始pH为7.1并且所述第二pH为6.9。在一些方面，所述初始pH为7.1并且所述第二pH为7.0。在一些方面，所述初始pH为6.9并且所述第二pH为6.8。在一些方面，所述初始pH为6.9并且所述第二pH为6.7。
不仅上游生产过程的pH很重要，而且生产期间任何pH转变的时间设定也在过程中起着显著作用。生产期间的pH转变导致过程性能的改变，这主要是由于对细胞生长和代谢的影响。本公开文本的方法涉及在蛋白质生产期间转变pH以控制蛋白质的糖基化。在一些方面，所述pH转变为约6.0的pH。在一些方面，所述pH转变为约6.1的pH。在一些方面，所述pH转变为约6.2的pH。在一些方面，所述pH转变为约6.3的pH。在一些方面，所述pH转变为约6.4的pH。在一些方面，所述pH转变为约6.5的pH。在一些方面，所述pH转变为约6.6的pH。在一些方面，所述pH转变为约6.7的pH。在一些方面，所述pH转变为约6.8的pH。在一些方面，所述pH转变为约6.9的pH。在一些方面，所述pH转变为约7.0的pH。在一些方面，所述pH转变为约7.1的pH。在一些方面，所述pH转变为约7.2的pH。在一些方面，所述pH转变为约7.3的pH。在一些方面，所述pH转变为约7.4的pH。在一些方面，所述pH转变为约7.5的pH。
在生产期间调节pH的在培养诱导后的时间(以下称为“pH转变”或“pH时间设定”)也会由于细胞生长和代谢的影响而导致过程中的改变。本公开文本的方法涉及在蛋白质生产期间转变pH以控制蛋白质的糖基化。在一些方面，所述pH转变为诱导后从约50小时至约150小时。在一些方面，所述pH转变为诱导后从约72小时至约120小时。在一些方面，所述pH转变为诱导后从约80小时至约100小时。在一些方面，所述pH转变为诱导后约90小时。在一些方面，所述pH转变为诱导后约100小时。在一些方面，所述pH转变为诱导后约96小时。
IIC.活细胞密度
在生物反应器过程开始时细胞的初始活细胞密度(VCD)或种子密度可以是上游生长过程的重要方面，因为在生产期间初始活细胞密度(VCD)影响细胞培养物的稳态和/或最大活细胞密度。较高的初始细胞密度可以导致在上游过程的初始生长阶段期间产生的细胞数量高得多，并且最终可以导致更快的细胞死亡和更短的生物反应器运行时间。生物反应器生产过程可以缩短，但是在一些情况下，对所述过程产生的蛋白质进行的翻译后修饰会受到影响，因为较短的生物反应器运行时间可导致蛋白质在高尔基体中的驻留时间改变，因此改变翻译后修饰，如蛋白质的糖基化模式的改变。由于初始细胞密度可能对蛋白质的总体产量和质量输出产生广泛的影响，因此初始活细胞密度是上游蛋白质生产的重要参数。
在一些方面，本公开文本的方法涉及以初始活细胞密度(VCD)接种生物反应器。在一些方面，所述初始活细胞密度(VCD)设定点在约0.05X 106个细胞/mL与约0.95X 106个细胞/mL之间。在一些方面，所述初始活细胞密度(VCD)设定点在约0.05X106个细胞/mL与约0.9X 106个细胞/mL之间。在一些方面，所述初始活细胞密度(VCD)设定点在约0.05X 106个细胞/mL与约0.85X 106个细胞/mL之间。在一些方面，所述初始活细胞密度(VCD)设定点在约0.05X 106个细胞/mL与约0.8X 106个细胞/mL之间。在一些方面，所述初始活细胞密度(VCD)设定点在约0.05X 106个细胞/mL与约0.75X 106个细胞/mL之间。在一些方面，所述初始活细胞密度(VCD)设定点在约0.05X 106个细胞/mL与约0.7X 106个细胞/mL之间。在一些方面，所述初始活细胞密度(VCD)设定点在约0.05X 106个细胞/mL与约0.65X 106个细胞/mL之间。在一些方面，所述初始活细胞密度(VCD)设定点在约0.1X 106个细胞/mL与约0.6X 106个细胞/mL之间。在一些方面，所述初始活细胞密度(VCD)设定点在约0.15X 106个细胞/mL与约0.6X 106个细胞/mL之间。在一些方面，所述初始活细胞密度(VCD)设定点在约0.15X106个细胞/mL与约0.55X 106个细胞/mL之间。在一些方面，所述初始活细胞密度(VCD)设定点在约0.15X 106个细胞/mL与约0.5X 106个细胞/mL之间。在一些方面，所述初始活细胞密度(VCD)设定点在约0.15X 106个细胞/mL与约0.45X 106个细胞/mL之间。在一些方面，所述初始活细胞密度(VCD)设定点在约0.15X 106个细胞/mL与约0.4X 106个细胞/mL之间。在一些方面，所述初始活细胞密度(VCD)设定点在约0.2X 106个细胞/mL与约0.4X 106个细胞/mL之间。在一些方面，所述初始活细胞密度(VCD)设定点在约0.2X 106个细胞/mL与约0.35X106个细胞/mL之间。在一些方面，所述初始活细胞密度(VCD)设定点在约0.25X 106个细胞/mL与约0.35X 106个细胞/mL之间。
IID.细胞补料时间
本公开文本的方法还可以通过改变细胞补料时间以影响或控制细胞的生长条件来实现。补料过程的时间设定对于产生细胞培养物生产过程的所需生长特性(如细胞密度)很重要。生物反应器中的最佳补料策略取决于反应动力学的结构和不同反应(如蛋白质合成和这些蛋白质的翻译后修饰(即糖基化))之间的相互作用。对细胞群体过度补料和补料不足均不利于细胞生长和产物形成，因此补料的时间设定对于确保最大的产物产量可能很重要。培养物的补料不足可导致营养物质耗尽和细胞死亡，而过度补料可导致营养物质过剩、在密集的细胞环境中重量摩尔渗透压浓度和细胞应激增加、以及目的蛋白的不希望的翻译后修饰。
在一些方面，所述细胞补料时间为诱导后从约24小时至约100小时。在一些方面，所述细胞补料时间为诱导后从约48小时至约100小时。在一些方面，所述细胞补料时间为诱导后从约48小时至约72小时。在一些方面，所述细胞补料时间为诱导后从约48小时至约96小时。在一些方面，所述细胞补料时间为诱导后从约72小时至约96小时。在一些方面，所述细胞补料时间为诱导后约24小时。在一些方面，所述细胞补料时间为诱导后约48小时。在一些方面，所述细胞补料时间为诱导后约72小时。在一些方面，所述细胞补料时间为诱导后约96小时。
IIE.CO2
本公开文本的方法还涉及初始CO2设定点。上游生物反应器过程中CO2的浓度是控制细胞生长和pH的重要要素。高浓度的CO2可以导致另外的CO2溶解于细胞培养基中，这将降低细胞培养基的pH。此外，CO2的浓度将可能在上游生物制造过程期间改变，因为二氧化碳是呼吸过程的不可避免的产物，并且因此总是存在于需氧生物过程中。在制造期间高浓度的CO2可以导致细胞培养物的生长速率和/或蛋白质生产输出的降低。蛋白质糖基化模式也受CO2浓度变化的影响，因为蛋白质生产速率的变化可影响蛋白质在高尔基体中的驻留时间。
在一些方面，所述初始CO2设定点在约5％与约50％之间、在约10％与约45％之间、在约10％与约40％之间、在约10％与约35％之间、在约10％与约30％之间、在约15％与约30％之间、在约15％与约25％之间、或在约20％与约25之间。在一些方面，所述初始CO2设定点在约0％与约75％之间。在一些方面，所述初始CO2设定点在约5％与约50％之间。在一些方面，所述初始CO2设定点在约10％与约45％之间。在一些方面，所述初始CO2设定点在约10％与约40％之间。在一些方面，所述初始CO2设定点在约10％与约35％之间。在一些方面，所述初始CO2设定点在约10％与约30％之间。在一些方面，所述初始CO2设定点在约15％与约30％之间。在一些方面，所述初始CO2设定点在约15％与约25％之间。在一些方面，所述初始CO2设定点在约10％与约25％之间。在一些方面，所述初始CO2设定点为约15％、约16％、约17％(例如，16.8％)、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％或约25％。在一些方面，所述初始CO2设定点为约17％(例如，16.8％)。在一些方面，所述初始CO2设定点为约22％，例如，22.4％。在一些方面，所述初始CO2设定点为约23％。
在一些方面，在整个细胞培养过程中监测和维持初始CO2浓度。在其他方面，设定但是在整个细胞培养过程中不监测初始CO2浓度。
IIF.条件的组合
在一些方面，本公开文本的方法包括以上所列条件的任何组合。在一些方面，所述方法包括选自以下的两种或更多种条件：(i)在约35℃与约37℃之间(例如约36℃)的初始温度设定点，在32℃与约34℃之间(例如约33℃)的第二温度设定点，和在约30℃与约32℃之间(例如约31℃)的第三温度设定点；(ii)pH 7.0的初始pH设定点和6.9的第二pH设定点；(iii)在约0.15X 106个细胞/mL与约0.45X 106个细胞/mL之间的初始活细胞密度(VCD)设定点；(iv)6.9的初始pH；(v)在约96小时的pH转变；以及(vi)在约15％与约25％之间(例如约16.8％)的初始CO2设定点。
在一些方面，所述方法包括(i)在约35℃与约37℃之间(例如约36℃)的初始温度设定点，在32℃与约34℃之间(例如约33℃)的第二温度设定点，和在约30℃与约32℃之间(例如约31℃)的第三温度设定点，以及(ii)pH 7.0的初始pH设定点和6.9的第二pH设定点。
在一些方面，所述方法包括(i)36℃的初始温度设定点，33℃的第二温度设定点和31℃的第三温度设定点以及(ii)从约0.15X 106个细胞至约0.45X 106个细胞(例如0.30X106个细胞)的初始活细胞密度(VCD)设定点。
在一些方面，所述方法包括(i)在约35℃与约37℃之间(例如约36℃)的初始温度设定点，在32℃与约34℃之间(例如约33℃)的第二温度设定点，和在约30℃与约32℃之间(例如约31℃)的第三温度设定点，以及(ii)在约15％与约25％之间(例如约15％、约16％、约16.8％、约17％、约22％、或约22.4％)的初始CO2设定点。
在一些方面，所述方法包括(i)在约35℃与约37℃之间(例如约36℃)的初始温度设定点，在32℃与约34℃之间(例如约33℃)的第二温度设定点，和在约30℃与约32℃之间(例如约31℃)的第三温度设定点，(ii)pH 7.0的初始pH设定点和6.9的第二pH设定点，以及(iii)从约0.15X 106个细胞至约0.45X 106个细胞(例如0.30X 106个细胞)的初始活细胞密度(VCD)设定点。
在一些方面，所述方法包括(i)在约35℃与约37℃之间(例如约36℃)的初始温度设定点，在32℃与约34℃之间(例如约33℃)的第二温度设定点，和在约30℃与约32℃之间(例如约31℃)的第三温度设定点，以及(ii)pH 6.9的初始pH设定点。
在一些方面，所述方法包括(i)在约35℃与约37℃之间(例如约36℃)的初始温度设定点，在32℃与约34℃之间(例如约33℃)的第二温度设定点，和在约30℃与约32℃之间(例如约31℃)的第三温度设定点，(ii)pH 6.9的初始pH设定点，以及(iii)从约0.15X 106个细胞至约0.45X 106个细胞之间(例如0.30X 106个细胞)的初始活细胞密度(VCD)设定点。
在一些方面，所述方法包括(i)在约35℃与约37℃之间(例如约36℃)的初始温度设定点，在32℃与约34℃之间(例如约33℃)的第二温度设定点，和在约30℃与约32℃之间(例如约31℃)的第三温度设定点，(ii)pH 7.0的初始pH设定点和pH 6.9的第二pH设定点，或pH 6.9的初始pH设定点，以及(iii)在约15％与约25％之间(例如约15％、约16％、约16.8％、约17％、约22％或约22.4％)的初始CO2设定点。
在一些方面，所述方法包括(i)在约35℃与约37℃之间(例如约36℃)的初始温度设定点，在约32℃与约34℃之间(例如约33℃)的第二温度设定点，和在约30℃与约32℃之间(例如约31℃)的第三温度设定点，(ii)pH 7.0的初始pH设定点和pH 6.9的第二pH设定点，或pH 6.9的初始pH设定点，(iii)从约0.15X 106个细胞至约0.45X 106个细胞(例如0.30X 106个细胞)的初始活细胞密度(VCD)设定点；以及(iv)在约15％与约25％之间(例如约15％、约16％、约16.8％、约17％、约22％或约22.4％)的初始CO2设定点。
在一些方面，所述方法包括(i)在约35℃与约37℃之间(例如约36℃)的初始温度设定点，在32℃与约34℃之间(例如约33℃)的第二温度设定点，和在约30℃与约32℃之间(例如约31℃)的第三温度设定点，(ii)pH 7.0的初始pH设定点和pH 6.9的第二pH设定点，或pH 6.9的初始pH设定点，(iii)在约15％与约25％之间(例如约15％、约16％、约16.8％、约17％、约22％或约22.4％)的初始CO2设定点，以及(iv)从约0.15X 106个细胞至约0.45X106个细胞(例如0.30X 106个细胞)的初始活细胞密度(VCD)设定点。
在一些方面，所述方法包括(i)在约35℃与约37℃之间(例如约36℃)的初始温度设定点，在32℃与约34℃之间(例如约33℃)的第二温度设定点，和在约30℃与约32℃之间(例如约31℃)的第三温度设定点，(ii)pH 7.0的初始pH设定点和pH 6.9的第二pH设定点，或pH 6.9的初始pH设定点，其中从初始pH设定点到第二pH设定点的转变是在约96小时；以及(iii)在约15％与约25％之间(约15％、约16％(例如约16.8％)、约17％、约22％或约22.4％)的初始CO2设定点。
在一些方面，所述方法包括(i)在约35℃与约37℃之间(例如约36℃)的初始温度设定点，在32℃与约34℃之间(例如约33℃)的第二温度设定点，和在约30℃与约32℃之间(例如约31℃)的第三温度设定点，(ii)pH 7.0的初始pH设定点和pH 6.9的第二pH设定点，其中从初始pH设定点到第二pH设定点的转变是在约96小时；以及(iii)在约15％与约25％之间(例如约15％、约16％、约16.8％、约17％、约22％或约22.4％)的初始CO2设定点；以及(iv)从约0.15X 106个细胞至约0.45X 106个细胞(例如0.30X 106个细胞)的初始活细胞密度(VCD)设定点。
III.糖基化谱
本公开文本的方法和条件可用于影响、维持、控制和/或修饰通过本发明方法产生的蛋白质的糖基化谱。在一些方面，所述方法控制所述蛋白质的糖基化谱。在一些方面，所述蛋白质的糖基化谱包含一种或多种N-连接的聚糖。
本公开文本的方法可以经由使用各种方法(包括聚糖释放测定)的聚糖分析来实现或证实。糖缀合物如糖蛋白的聚糖分析中的第一步是从它们所附接的分子中释放糖。糖蛋白上的N-连接的聚糖可以通过酰胺酶如肽-N-糖苷酶F(PNGase F)释放。分析来自生物来源的寡糖的大多数方法都需要聚糖衍生化步骤：可以将聚糖衍生化以引入生色团或荧光团，从而有助于色谱分离或电泳分离后的检测。衍生化也可以用于在还原端连接带电基团或疏水基团，以增强聚糖分离和质谱检测。此外，衍生化步骤(如过甲基化)旨在稳定唾液酸残基、提高质谱灵敏度以及支持通过(串联)质谱的详细结构表征。
质谱法(mass spectrometry)(“MS”或“质谱(mass-spec)”)是用于测量质荷比离子的分析技术。这可以通过以下方式来实现：电离样品并分离不同质量的粒子，并且通过测量离子流的强度来记录其相对丰度。典型的质谱仪包含三个部分：离子源、质量分析器和检测器系统。离子源是质谱仪中电离所分析物质(分析物)的部分。然后通过磁场或电场将离子运输至质量分析器，其根据离子的质荷比(m/z)来分离离子。许多质谱仪使用两个或更多个质量分析器进行串联质谱(MS/MS)。检测器记录离子经过或击中表面时诱导的电荷或产生的电流。质谱图是在用质量分析器扫描m/z离子时测量检测器中产生的信号的结果。
在一些方面，可以通过疏水相互作用液相色谱(HILIC)分析N-连接的聚糖。可以将聚糖从CTLA4中切割，进行荧光标记，并且通过HILIC分离用于分析。将聚糖用荧光标记(例如2-氨基苯甲酰胺)标记允许在飞摩尔(femtomole)水平上检测聚糖。在一些方面，通过HILIC偶联质谱法分析CTLA4 N-连接的聚糖。
蛋白质的糖基化谱中可以存在各种N-连接的聚糖。在一些方面，所述N-连接的聚糖包括G0F、G1F、G2F、S1G1F、S1G2F、S2G2F、S1G3F和/或S2G4F。G0F、G1F、G2F、S1G1F、S2G2F、S1G3F和S2G4F的代表性图可以在图1B-图1C中看到。在一些方面，本公开文本的方法涉及在第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天、第16天、第17天、第18天、第9天、第20天或第21天之后测量糖基化谱。在一些方面，本公开文本的方法涉及在第7天之后测量糖基化谱。在一些方面，本公开文本的方法涉及在第14天之后测量糖基化谱。在一些方面，本公开文本的方法涉及在第21天之后测量糖基化谱。
在一些方面，糖基化蛋白是CTLA4蛋白。CTLA4分子或CTLA4细胞外结构域可以与Fc融合，其中所述分子称为CTLA4-Fc或CTLA4-Ig。“Fc区”(片段可结晶区)、“Fc结构域”或“Fc”是指抗体的重链的C末端区，其介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与位于免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)上的Fc受体的结合或与经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。因此，Fc区包含抗体的除了第一恒定区免疫球蛋白结构域(例如，CH1或CL)之外的恒定区。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，Fc区包含两个相同的蛋白质片段，其衍生自抗体两条重链的第二(CH2)和第三(CH3)恒定结构域；IgM和IgE Fc区在每条多肽链中包含三个重链恒定结构域(CH结构域2-4)。IgG同种型在某些物种中分为如下亚类：人中的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及小鼠中的IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。对于IgG，Fc区包含免疫球蛋白结构域CH2和CH3以及CH1和CH2结构域之间的铰链。如本文所定义的，尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界的定义可能会发生变化，但是人IgG重链的Fc区被定义为从IgG1的氨基酸残基D221、IgG2的氨基酸残基V222、IgG3的氨基酸残基L221和IgG4的氨基酸残基P224延伸到重链的羧基末端，其中编号根据Kabat编号方案。人IgG Fc区的CH2结构域从氨基酸237延伸至氨基酸340，并且CH3结构域位于Fc区中的CH2结构域的C末端侧，即，其从IgG的氨基酸341延伸至氨基酸447或446(如果不存在C末端赖氨酸残基)或445(如果不存在C末端甘氨酸和赖氨酸残基)。如本文所用，Fc区可以是天然序列Fc，包括任何同种异型变体或变体Fc(例如，非天然存在的Fc)。本公开文本的方法还可用于产生包含CTLA4结构域的蛋白质。本公开文本的方法还可用于产生与Fc部分融合的CTLA4结构域。在一些方面，所述蛋白质是融合蛋白。在一些方面，所述融合蛋白包含Fc部分。在一些方面，所述蛋白质是阿巴西普。在一些方面，所述蛋白质包含选自SEQ ID No:1-8的序列。在一些方面，所述蛋白质包含SEQ ID NO:1。在一些方面，所述蛋白质包含SEQ ID NO:2。在一些方面，所述蛋白质包含SEQ ID NO:3。在一些方面，所述蛋白质包含SEQ ID NO:4。在一些方面，所述蛋白质包含SEQ ID NO:5。在一些方面，所述蛋白质包含SEQ ID NO:6。在一些方面，所述蛋白质包含SEQ ID NO:7。在一些方面，所述蛋白质包含SEQ ID NO:8。
CTLA4-Ig融合蛋白可以包含一个或多个突变。在一些方面，所述CTLA4-Ig融合蛋白是(a)具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列(氨基酸位置27处的甲硫氨酸和氨基酸位置382处的甘氨酸)的CTLA4-Ig融合蛋白；(b)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列(氨基酸位置27处的甲硫氨酸和氨基酸位置383处的赖氨酸)的CTLA4-Ig融合蛋白；(c)具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列(氨基酸位置26处的丙氨酸和氨基酸位置382处的甘氨酸)的CTLA4-Ig融合蛋白；(d)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(氨基酸位置26处的丙氨酸和氨基酸位置383处的赖氨酸)的CTLA4-Ig融合蛋白；(e)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列(氨基酸位置25处的甲硫氨酸和氨基酸位置382处的甘氨酸)的CTLA4-Ig融合蛋白：或(f)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列(氨基酸位置25处的甲硫氨酸和氨基酸位置383处的赖氨酸)的CTLA4-Ig融合蛋白。在一些方面，所述CTLA4-Ig融合蛋白是(a)约90％的CTLA4-Ig多肽包含以残基27处的甲硫氨酸开始的SEQ ID NO:2的氨基酸序列；(b)约10％的CTLA4-Ig多肽包含以残基编号26处的丙氨酸开始的SEQ ID NO:2的氨基酸序列；(c)约4％的CTLA4-Ig多肽包含以残基编号383处的赖氨酸结束的SEQ ID NO:2的氨基酸序列；(d)约96％的CTLA4-Ig多肽包含以残基编号382处的甘氨酸结束的SEQ ID NO:2的氨基酸序列；以及任选地(e)约少于1％的CTLA4-Ig多肽包含以残基编号25处的甲硫氨酸开始的SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
本公开文本的蛋白质具有糖基化位点。糖基化是这样的过程，其涉及在多肽链内的特定位点处将复杂的寡糖结构添加到蛋白质中。蛋白质的糖基化和添加的碳水化合物的后续加工会影响蛋白质的折叠和结构、蛋白质的稳定性(包括蛋白质的半衰期)以及蛋白质的功能特性。根据发生修饰的序列情境，蛋白质糖基化可以分为两类：O-连接的糖基化和N-连接的糖基化。O-连接的多糖与羟基连接，通常与丝氨酸或苏氨酸残基的羟基连接。不将O-聚糖添加到每个丝氨酸和苏氨酸残基中。O-连接的寡糖通常是单触角或双触角，即它们包含一个或最多两个分支(触角)，并且包含一个至四个不同种类的糖残基，所述糖残基被逐个添加。N-连接的多糖与天冬酰胺的酰胺氮附接。只有作为两种三肽序列(天冬酰胺-X-丝氨酸或天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸))之一的一部分的天冬酰胺才是糖基化的靶标。N-连接的寡糖可以具有一至四个分支，称为单触角、二触角、三触角、四触角。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于选自阿巴西普的Asn76(T5)、Asn108(T7)和/或Asn207(T14)的一个或多个天冬酰胺残基处。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约2.0％与约10.0％之间的G0F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约2.5％与约10％之间、在约2.5％与约9.5％之间、在约2.5％与约9％之间、在约2.5％与约8.5％之间、在约2.5％与约8％之间、在约2.5％与约7.5％、约2.5％与约7％之间、在约2.5％与约6.5％之间、在约3.0％与约10％之间、在约3.0％与约9.5％之间、在约3.0％与约9％之间、在约3.0％与约8.5％之间、在约3.0％与约8％之间、在约3.0％与约7.5％之间、在约3.0％与约7％之间、或在约3.0％与约6.5％之间的G0F的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约3.2％与约6.6％之间、在约3.2％与约4.6％之间、或在3.2％与约5.6％之间的G0F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约3.2％与约4.6％之间的G0F的相对丰度，在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约3.2％与约6.6％之间的G0F的相对丰度，在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约3.2％与约5.6％之间的G0F的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约1.0％与约6％之间的G0F的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约1.0％与约6％、约1.0％与约5.5％、约1.0％与约5.0％、约1.0％与约4.5％、约1.0％与约4.0％、约1.5％与约6％、约1.5％与约5.5％、约1.5％与约5.0％、约1.5％与约4.5％、约1.5％与约4.0％、约2.0％与约6％、约2.0％与约5.5％、约2.0％与约5.0％、约2.0％与约4.5％、或约2.0％与约4.0％之间的G0F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约2.1％与约4.0％之间、在约1.8％与约3.5％之间或在约1.8％与4.0％之间的G0F的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约1.0％与约6％之间的G0F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约1.0％与约5.5％之间的G0F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约1.0％与约5.0％之间的G0F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约1.0％与约4.5％之间的G0F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约1.0％与约4.0％之间的G0F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约1.5％与约6％之间的G0F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约1.5％与约5.5％之间的G0F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约1.5％与约5.0％之间的G0F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约1.5％与约4.5％之间的G0F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约1.5％与约4.0％之间的G0F的相对丰度。
本公开文本的方法可用于控制或维持蛋白质的G2F含量。蛋白质的G2F含量与蛋白质从人体中消除的速率相关，因此本发明方法还涉及通过控制其聚糖含量(包括G2F含量)来控制蛋白质的消除半衰期。在一些方面，本公开文本的方法可用于通过降低蛋白质的消除速率来增加所述蛋白质的循环半衰期。在一些方面，所述蛋白质是重组的(例如阿巴西普)。在一些方面，所述蛋白质的消除半衰期降低。在一些方面，所述蛋白质的循环半衰期增加。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约5％与约12％之间的G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约5％与约12％、约5％与约11.5％、约5％与约11％、约5％与约10.5％、约5％与约10％、约5.5％与约12％、约5.5％与约11.5％、约5.5％与约11％、约5.5％与约10.5％、约5.5％与约10％、约6％与约12％、约6％与约11.5％、约6％与约11％、约6％与约10.5％、约6％与约10％、约6.5％与约12％、约6.5％与约11.5％、约6.5％与约11％、约6.5％与约10.5％、约6.5％与约10％、约7％与约12％、约7％与约11.5％、约7％与约11％、约7％与约10.5％、或约7％与约10％之间的G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约7.2％与约9.8％之间、在约6.3％与10.6％之间或约7.2％与约10.6％之间的G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约5％与约21％之间的G2F的相对丰度。在一些方面，所述方法包括将蛋白质在本文公开的任一种条件下培养，例如这样的条件，即初始温度设定点在约35℃与约37℃之间，例如约36℃，第二温度设定点在32℃与约34℃之间，例如约33℃，以及第三温度设定点在约30℃与约32℃之间，例如约31℃，其中所述蛋白质在残基Asn76(T5)处具有N-连接的聚糖，例如G2F，并且G2F的相对丰度在约5％与约12％之间。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约5％与约11.5％之间的G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约5％与约11％之间的G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约5％与约10.5％之间的G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约5％与约10％之间的G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约5.5％与约12％之间的G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约5.5％与约11.5％之间的G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约5.5％与约11％之间的G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约5.5％与约10.5％之间的G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约5.5％与约10％之间的G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约7.2％与约9.8％之间的G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约6.3％与约10.6％之间的G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约5％与约21％之间的G2F的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约5％与约21％、约5％与约20.5％、约5％与约20％、约5％与约19.5％、约5％与约19％、约5.5％与约21％、约5.5％与约20.5％、约5.5％与约20％、约5.5％与约19.5％、约5.5％与约19％、约6％与约21％、约6％与约20.5％、约6％与约20％、约6％与约19.5％、约6％与约19％、约6.5％与约21％、约6.5％与约20.5％、约6.5％与约20％、约6.5％与约19.5％、约6.5％与约19％、约7％与约21％、约7％与约20.5％、约7％与约20％、约7％与约19.5％、约7％与约19％、约7.5％与约21％、约7.5％与约20.5％、约7.5％与约20％、约7.5％与约19.5％、约7.5％与约19％、约8％与约21％、约8％与约20.5％、约8％与约20％、约8％与约19.5％、或约8％与约19％之间的G2F的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约8.2％与约14.1％、约8.0％与约18.6％、或约8.2％与约14.1％之间的G2F的相对丰度。在一些方面，G2F进一步包含半乳糖-α-1,3-半乳糖部分(G2F-Gal)，其中所述G2F-Gal包括小于或等于约1.4％的相对丰度。在一些方面，所述G2F-Gal包括在约1.0％至约1.4％之间的相对丰度。在一些方面，所述G2F-Gal包括在约0.4％至约0.9％之间的相对丰度。
在一些方面，所述糖基化谱不包括多于一个的半乳糖-α-1,3-半乳糖(α-gal)连接。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约5％与约21％之间的G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约5％与约20.5％之间的G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约5％与约20％之间的G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约5.5％与约21％之间的G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约5.5％与约21％之间的G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约5.5％与约20.5％之间的G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约8.2％与约14.1％之间的G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约8.0％与约18.6％之间的G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约8.2％与约14.1％之间的G2F的相对丰度。
在一些方面，所述方法包括将蛋白质在本文公开的任一种条件下培养，例如这样的条件，即初始温度设定点在约35℃与约37℃之间，例如约36℃，第二温度设定点在32℃与约34℃之间，例如约33℃，以及第三温度设定点在约30℃与约32℃之间，例如约31℃，其中所述蛋白质在残基Asn108(T7)处具有N-连接的聚糖，例如G2F，并且G2F的相对丰度在约5％与约21％之间。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约29％与约38％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约29％与约38％、约29％与约37.5％、约29％与约37％、约29％与约36.5％、约29.5％与约38％、约29.5％与约37.5％、约29.5％与约37％、约29.5％与约36.5％、约30％与约38％、约30％与约37.5％、约30％与约37％、约30％与约36.5％、约31.5％与约38％、约31.5％与约37.5％、约31.5％与约37％、约31.5％与约36.5％之间的S1G2F的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约29.5％与约38％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约29.5％与约37.5％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约29.5％与约37％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约29.5％与约36.5％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约29％与约38％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约29.5％与约37.5％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约29.5％与约37％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约29.5％与约36.5％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约30％与约38％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约30％与约37.5％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约30％与约37％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约30％与约36.5％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约31.6％与约35.1％、约31.3％与约36.5％、或约31.3％与约36.5％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约31.6％与约35.1％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约31.3％与约36.5％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约31.3％与约36.5％之间的S1G2F的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在33％与约45％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约33％与约45％、约33％与约44.5％、约33％与约44％、约33％与约43.5％、约33％与约43％、约33％与约42.5％、约33.5％与约45％、约33.5％与约44.5％、约33.5％与约44％、约33.5％与约43.5％、约33.5％与约43％、约33.5％与约42.5％、约34％与约45％、约34％与约44.5％、约34％与约44％、约34％与约43.5％、约34％与约43％、约34％与约42.5％、约34.5％与约45％、约34.5％与约44.5％、约34.5％与约44％、约34.5％与约43.5％、约34.5％与约43％、或约34.5％与约42.5％之间的S1G2F的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约33％与约45％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约33％与约44.5％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约33％与约44％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约33％与约43.5％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约33％与约43％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约33％与约43.5％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约33％与约43％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约33％与约42.5％之间的S1G2F的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约33％与约45％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约33.5％与约44.5％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约33.5％与约44％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约33.5％与约43.5％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约33.5％与约43％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约33.5％与约43.5％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约33.5％与约43％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约33.5％与约42.5％之间的S1G2F的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约34％与约45％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约34％与约44.5％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约34％与约44％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约34％与约43.5％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约34％与约43％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约34％与约43.5％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约34％与约43％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约34％与约42.5％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约34.2％与约37.7％、约35.5％与约42.3％、或约34.2％与约42.3％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约34.2％与约42.3％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约35.2％与约42.3％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约34.2％与约37.7％之间的S1G2F的相对丰度。在一些方面，S1G2F进一步包含半乳糖-α-1,3-半乳糖部分(S1G2F-Gal)，其中所述S1G2F-Gal包括小于或等于约4.7％的相对丰度。在一些方面，S1G2F-Gal包括在约2.3％至约4.7％之间的相对丰度。在一些方面，S1G2F-Gal包括在约1.4％至约1.8％之间的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约13％与约25％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约13％与约25％之间、在约13％与约24.5％之间、在约13％与约24％之间、在约13％与约23.5％之间、在约13％与约23％之间、在约13.5％与约25％之间、在约13.5％与约24.5％之间、在约13.5％与约24％之间、在约13.5％与约23.5％之间、在约13.5％与约23％之间、在约14％与约25％之间、在约14％与约24.5％之间、在约14％与约24％之间、在约14％与约23.5％之间、在约14％与约23％之间、在约14.5％与约25％之间、在约14.5％与约24.5％之间、在约14.5％与约24％之间、在约14.5％与约23.5％之间、在约14.5％与约23％之间、在约15％与约25％之间、在约15％与约24.5％之间、在约15％与约24％之间、在约15％与约23.5％之间、在约15％与约23％之间、在约15.5％与约25％之间、在约15.5％与约24.5％之间、在约15.5％与约24％之间、在约15.5％与约23.5％、或约15.5％与约23％之间的S2G2F的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约13％与约25％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约13％与约24.5％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约13％与约24％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约13％与约23.5％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约13％与约23.5％之间的S2G2F的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约13.5％与约25％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约13.5％与约24.5％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约13.5％与约24％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约13.5％与约23.5％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约13.5％与约23.5％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约14％与约25％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约14％与约24.5％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约14％与约24％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约14％与约23.5％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约14％与约23.5％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约15％与约25％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约15％与约24.5％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约15％与约24％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约15％与约23.5％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约15％与约23.5％之间的S2G2F的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约18.1％与约22.9％、约15.4％与约20％、和约15.4％与约22.9％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约18％与约24％之间、在约18％与约23％之间、或在约19％与约23％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约18.1％与约22.9％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约15.4％与约20％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约15.4％与约22.9％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约18％与约24％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约18％与约23％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约19％与约23％之间的S2G2F的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约18％与约36％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约18％与约36％、约18％与约35.5％、约18％与约35％、约18％与约34.5％、约18％与约34％、约18％与约33.5％、约18.5％与约36％、约18.5％与约35.5％、约18.5％与约35％、约18.5％与约34.5％、约18.5％与约34％、约18.5％与约33.5％、约19％与约36％、约19％与约35.5％、约19％与约35％、约19％与约34.5％、约19％与约34％、约19％与约33.5％、约19.5％与约36％、约19.5％与约35.5％、约19.5％与约35％、约19.5％与约34.5％、约19.5％与约34％、约19.5％与约33.5％、约20％与约36％、约20％与约35.5％、约20％与约35％、约20％与约34.5％、约20％与约34％、约20％与约33.5％、约20.5％与约36％、约20.5％与约35.5％、约20.5％与约35％、约20.5％与约34.5％、约20.5％与约34％、或约20.5％与约33.5％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约18％与约36％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约18％与约35.5％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约18％与约35％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约18％与约34.5％之间的S2G2F的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约18％与约34％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约18％与约33.5％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约18.5％与约36％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约18.5％与约35.5％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约18.5％与约35％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约18.5％与约34.5％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约18.5％与约34％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约18.5％与约33.5％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约19％与约36％之间的S2G2F的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约19％与约35.5％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约19％与约35％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约19％与约34.5％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约19％与约34％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约19％与约33.5％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约19.5％与约36％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约19.5％与约35.5％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约19.5％与约35％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约19.5％与约34.5％之间的S2G2F的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约19.5％与约34％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约19.5％与约33.5％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约20％与约36％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约20％与约35.5％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约20％与约35％之间的S2G2F的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约20％与约34.5％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约20％与约34％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约20％与约33.5％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约23.2％与约33.8％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约20.8％与约32.6％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约20.8％与约33.8％之间的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约23.2％与约33.8％、约20.8％与约32.6％、或约20.8％与33.8％之间的S2G2F的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约2％与约8％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约2％与约8％、约2％与约7.5％、约2％与约7％、约2％与约6.5％、约2％与约6％、约2％与约5.5％、约2.5％与约8％、约2.5％与约7.5％、约2.5％与约7％、约2.5％与约6.5％、约2.5％与约6％、约2.5％与约5.5％、约3％与约8％、约3％与约7.5％、约3％与约7％、约3％与约6.5％、约3％与约6％、约3％与约5.5％、约3.5％与约8％、约3.5％与约7.5％、约3.5％与约7％、约3.5％与约6.5％、约3.5％与约6％、约3.5％与约5.5％、约4％与约8％、约4％与约7.5％、约4％与约7％、约4％与约6.5％、约4％与约6％、或约4％与约5.5％之间的S1G3F的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约2％与约8％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约2％与约7.5％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约2％与约7％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约2％与约6.5％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约2％与约6％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约2％与约5.5％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约2.5％与约8％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约2.5％与约7.5％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约2.5％与约7％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约2.5％与约6.5％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约2.5％与约6％之间的S1G3F的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约2.5％与约5.5％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约3％与约8％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约3％与约7.5％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约3％与约7％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约3％与约6.5％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约3％与约6％之间的S1G3F的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约3％与约5.5％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约3.5％与约8％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约3.5％与约7.5％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约3.5％与约7％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约3.5％与约6.5％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约3.5％与约6％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约3.5％与约5.5％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约4％与约8％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约4％与约7.5％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约4％与约7％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约4％与约6.5％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约4％与约6％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约4％与约5.5％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约4.4％与约5.6％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约4％与约5.6％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约4.4％与约5.6％、或约4.0％与约5.5％之间的S1G3F的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约0.5％与约4％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约0.5％与约4％、约0.5％与约3.5％、约0.5％与约3％、约0.5％与约2.5％、约1％与约4％、约1％与约3.5％、约1％与约3％、或约1％与约2.5％之间的S1G3F的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约1.4％与约2.2％、约1.1％与约1.9％、或约1.1％与约2.2％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约1％与约3％、约1％与约2％、或约1％与约1.5％之间的S1G3F的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约0.5％与约4％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约0.5％与约3.5％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约0.5％与约3％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约0.5％与约2.5％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约1％与约4％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约1％与约3.5％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约1％与约3％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约1％与约2.5％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约1.1％与约1.9％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约1.1％与约2.2％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约1.4％与约2.2％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约1％与约3％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约1％与约2％之间的S1G3F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约1％与约1.5％之间的S1G3F的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约0.5％与约4％之间的S2G4F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约0.5％与约4％、约0.5％与约3.5％、约0.5％与约3％、约0.5％与约2.5％、约1％与约4％、约1％与约3.5％、约1％与约3％、或约1％与约2.5％之间的S2G4F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约1.9％与约2.4％、约1.4％与约2.1％、或约1.4％与约2.4％之间的S2G4F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约1％与约2％、约1％与约2％、或约1.5％与约2.5％之间的S2G4F的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约0.5％与约4％之间的S2G4F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约0.5％与约3.4％之间的S2G4F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约0.5％与约3％之间的S2G4F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约0.5％与约2.5％之间的S2G4F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约1％与约4％之间的S2G4F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约1％与约3.5％之间的S2G4F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约1％与约3％之间的S2G4F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约1％与约2.5％之间的S2G4F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约1.9％与约2.4％之间的S2G4F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约1.4％与约2.1％之间的S2G4F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约1.4％与约2.4％之间的S2G4F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约1％与约2％之间的S2G4F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约1.5％与约2.5％之间的S2G4F的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于单独的残基Asn76(T5)、单独的Asn108(T7)、单独的Asn207(T14)或其任何组合处，并且包括小于或等于约7.0％或约6.5％的G0F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于单独的残基Asn76(T5)、单独的Asn108(T7)、单独的Asn207(T14)或其任何组合处，并且包括小于或等于约6.0％、小于或等于约5.5％、小于或等于约5.0％、小于或等于约4.5％、小于或等于约4.0％、小于或等于约3.5％、小于或等于约3.0％、小于或等于约2.5％、小于或等于约2.0％、小于或等于约1.5％、小于或等于约1.0％、小于或等于约0.5％或约0.0％的G0F的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于单独的残基Asn76(T5)、单独的Asn108(T7)、单独的Asn207(T14)或其任何组合处，并且包括小于或等于约7.5％或7.0％的G1F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于单独的残基Asn76(T5)、单独的Asn108(T7)、单独的Asn207(T14)或其任何组合处，并且包括小于或等于约6.5％、小于或等于约6.0％、小于或等于约5.5％、小于或等于约5.0％、小于或等于约4.5％、小于或等于约4.0％、小于或等于约3.5％、小于或等于约3.0％、小于或等于约2.5％、小于或等于约2.0％、小于或等于约1.5％、小于或等于约1.0％、小于或等于约0.5％或约0.0％的G1F的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于单独的残基Asn76(T5)、单独的Asn108(T7)、单独的Asn207(T14)或其任何组合处，并且包括小于或等于约25％或为约1.5％至约23％的G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于单独的残基Asn76(T5)、单独的Asn108(T7)、单独的Asn207(T14)或其任何组合处，并且包括小于或等于约24％、小于或等于约23％、小于或等于约22％、小于或等于约21％、小于或等于约20％、小于或等于约19％、小于或等于约18％、小于或等于约17％、小于或等于约16％、小于或等于约15％、小于或等于约14％、小于或等于约13％、小于或等于约12％、小于或等于约11％、小于或等于约10％、小于或等于约9％、小于或等于约8％、小于或等于约7％、小于或等于约6％、小于或等于约5％、小于或等于约4％、小于或等于约3％、小于或等于约2％、或者小于或等于约1％的G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于单独的残基Asn76(T5)、单独的Asn108(T7)、单独的Asn207(T14)或其任何组合处，并且包括约2.0％至约23％、约3％至约23％、约4％至约23％、约5％至约23％、约6％至约23％、约7％至约23％、约8％至约23％、约9％至约23％、约10％至约23％、约11％至约23％、约12％至约23％、约13％至约23％、约14％至约23％、约15％至约23％、约16％至约23％、约17％至约23％、约18％至约23％、约19％至约23％、约20％至约23％、约21％至约23％、或约22％至约23％的G2F的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于单独的残基Asn76(T5)、单独的Asn108(T7)、单独的Asn207(T14)或其任何组合处，并且包括小于或等于13.5％或为约12.5％的S1G1F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于单独的残基Asn76(T5)、单独的Asn108(T7)、单独的Asn207(T14)或其任何组合处，并且包括小于或等于约12％、小于或等于约11％、小于或等于约10％、小于或等于约9％、小于或等于约8％、小于或等于约7％、小于或等于约6％、小于或等于约5％、小于或等于约4％、小于或等于约3％、小于或等于约2％、小于或等于约1％、或等于约0％的S1G1F的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于单独的残基Asn76(T5)、单独的Asn108(T7)、单独的Asn207(T14)或其任何组合处，并且包括大于或等于约33％或为约32％至约49％的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于单独的残基Asn76(T5)、单独的Asn108(T7)、单独的Asn207(T14)或其任何组合处，并且包括大于或等于约34％、大于或等于约35％、大于或等于约36％、大于或等于约37％、大于或等于约38％、大于或等于约39％、大于或等于约40％、大于或等于约41％、大于或等于约42％、大于或等于约43％、大于或等于约44％、大于或等于约45％、大于或等于约46％、大于或等于约47％、大于或等于约48％、或者大于或等于约49％的S1G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于单独的残基Asn76(T5)、单独的Asn108(T7)、单独的Asn207(T14)或其任何组合处，并且包括约33％至约49％、约34％至约49％、约35％至约49％、约36％至约49％、约37％至约49％、约38％至约49％、约39％至约49％、约40％至约49％、约41％至约49％、约42％至约49％、约43％至约49％、约44％至约49％、约45％至约49％、约46％至约49％、约47％至约49％、或约48％至约49％的S1G2F的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于单独的残基Asn76(T5)、单独的Asn108(T7)、单独的Asn207(T14)或其任何组合处，并且包括大于或等于约12％或为约14％至约48.5％的S2G2F的相对丰度。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于单独的残基Asn76(T5)、单独的Asn108(T7)、单独的Asn207(T14)或其任何组合处，并且包括约15％至约45.5％、约15％至约45.5％、约16％至约45.5％、约16％至约45.5％、约17％至约45.5％、约18％至约45.5％、约19％至约45.5％、约20％至约45.5％、约21％至约45.5％、约22％至约45.5％、约23％至约45.5％、约24％至约45.5％、约25％至约45.5％、约26％至约45.5％、约27％至约45.5％、约28％至约45.5％、约29％至约45.5％、约30％至约45.5％、约31％至约45.5％、约32％至约45.5％、约33％至约45.5％、约34％至约45.5％、约35％至约45.5％、约36％至约45.5％、约37％至约45.5％、约38％至约45.5％、约39％至约45.5％、约40％至约45.5％、约41％至约45.5％、约42％至约45.5％、约43％至约45.5％、约44％至约45.5％、约44％至约45.5％、或约45％至约45.5％的S2G2F的相对丰度。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于单独的残基Asn76(T5)、单独的Asn108(T7)、单独的Asn207(T14)或其任何组合处，并且包括以下项的相对丰度：包括约1.5％至约23％的相对丰度的G2F、包括约32％至约49％的相对丰度的S1G2F、和/或包括约14％至约48.5％的相对丰度的S2G2F。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于单独的残基Asn76(T5)、单独的Asn108(T7)、单独的Asn207(T14)或其任何组合处，并且包括以下项的相对丰度：包括小于或等于约25％的相对丰度的G2F、包括大于或等于约33％的相对丰度的S1G2F、和/或包括大于或等于约12％的相对丰度的S2G2F。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于单独的残基Asn76(T5)、单独的Asn108(T7)、单独的Asn207(T14)或其任何组合处，并且包括以下项的相对丰度：包括小于或等于约6.5％的相对丰度的G0F、包括小于或等于约7％的相对丰度的G1F、包括约1.5％至约23％的相对丰度的G2F、包括小于或等于约12.5％的相对丰度的S1G1F、包括约32％至约49％的相对丰度的S1G2F、和/或包括约14％至约48.5％的相对丰度的S2G2F。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖位于单独的残基Asn76(T5)、单独的Asn108(T7)、单独的Asn207(T14)或其任何组合处，并且包括以下项的相对丰度：包括小于或等于约7.0％的相对丰度的G0F、包括小于或等于约7.5％的相对丰度的G1F、包括小于或等于约25％的相对丰度的G2F、包括小于或等于约13.5％的相对丰度的S1G1F、包括大于或等于约33％的相对丰度的S1G2F、和/或包括大于或等于约12％的相对丰度的S2G2F。
本公开文本的方法还可用于表征、分析或控制蛋白质的唾液酸含量。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖是唾液酸，并且具有从约8至约11的NANA的摩尔比。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖是唾液酸，并且具有从约8.3至约11、从约9.5至约10.1、或从约8.3至约10.1的NANA的摩尔比。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖是唾液酸，并且具有从约8.3至约11的NANA的摩尔比。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖是唾液酸，并且具有从约9.5至约10.1的NANA的摩尔比。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖是唾液酸，并且具有从约8.3至约10.1的NANA的摩尔比。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖是唾液酸，并且具有从约8至约11的NANA的摩尔比。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖是唾液酸，并且具有从约8至约10的NANA的摩尔比。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖是唾液酸，并且具有从约9至约10的NANA的摩尔比。
在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖是唾液酸，并且具有从约0.1至约2.0的NGNA的摩尔比。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖是唾液酸，并且具有从0.90至约1.20、或从约0.3至约1.2的NGNA的摩尔比。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖是唾液酸，并且具有从0.80至约1.20的NGNA的摩尔比。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖是唾液酸，并且具有从0.80至约1.30的NGNA的摩尔比。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖是唾液酸，并且具有从0.80至约1.40的NGNA的摩尔比。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖是唾液酸，并且具有从0.70至约1.40的NGNA的摩尔比。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖是唾液酸，并且具有从0.70至约1.50的NGNA的摩尔比。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖是唾液酸，并且具有从约0.1至约2的NGNA的摩尔比。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖是唾液酸，并且具有从约0.9至约1.2的NGNA的摩尔比。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖是唾液酸，并且具有从约0.3至约1.2的NGNA的摩尔比。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖是唾液酸，并且具有从约0.8至约1.2的NGNA的摩尔比。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖是唾液酸，并且具有从约0.8至约1.3的NGNA的摩尔比。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖是唾液酸，并且具有从约0.8至约1.4的NGNA的摩尔比。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖是唾液酸，并且具有从约0.7至约1.4的NGNA的摩尔比。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖是唾液酸，并且具有从约0.7至约1.5的NGNA的摩尔比。在一些方面，所述一种或多种N-连接的聚糖是唾液酸，并且具有从约0.8至约1.5的NGNA的摩尔比。
本公开文本的方法也可用于分析存在于蛋白质上的聚糖的唾液酸化谱。在一些方面，所述糖基化谱包括一种或多种去唾液酸化聚糖(结构域I)、单唾液酸化聚糖(结构域II)、二唾液酸化聚糖(结构域III)和/或三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)。可以经由成像毛细管等电聚焦(iCIEF)分析这些结构域，所述成像毛细管等电聚焦是指用于通过蛋白质的等电点(pI)分离所述蛋白质的方法。在这种方法中，用水、甲基纤维素、两性电解质和pI标记物将样品制备为约1mg/mL的最终浓度，然后通过自动进样器将其注入成像毛细管等电聚焦系统(iCIEF)中。基于亚型的电荷变化，电泳通过碳氟化合物(FC)包被的毛细管内的pH梯度分离样品。然后将结果与参考分离进行比较，以比较和表征组分组。
在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有从约28至约37、从约29至约32、从约28至约32或从约29至约37的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有从约28至约37的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有从约26至约40的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有从约28至约39的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有从约29至约39的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有从约29至约38的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有从约29至约37的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有从约30至约37的摩尔比。
在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有约25的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有约25.5的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有约26的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有约26.5的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有约27的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有约27.5的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有约28的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有约28.5的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有约29的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有约29.5的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有约30的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有约30.5的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有约31的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有约31.5的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有约32的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有约32.5的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有约33的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有约33.5的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有约34的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有约34.5的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有约35的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有约35.5的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有约36的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有约36.5的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有约37的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有约37.5的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有约38的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有约38.5的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有约39的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有约39.5的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有约40的摩尔比。在一些方面，所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有约31的摩尔比。
在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有从约26至约28、从约27至约33、从约26至约33、从约27至约28的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有从约26至约33的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有从约26至约28的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有从约27至约28的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有从约27至约29的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有从约27至约30的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有从约27至约31的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有从约27至约32的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有从约27至约33的摩尔比。
在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有约20的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有约20.5的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有约21的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有约21.5的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有约22的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有约22.5的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有约23的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有约23.5的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有约24的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有约24.5的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有约25的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有约25.5的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有约26的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有约26.5的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有约27的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有约27.5的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有约28的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有约28.5的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有约29的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有约29.5的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有约30的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有约30.5的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有约31的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有约31.5的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有约32的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有约32.5的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有约33的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有约33.5的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有约34的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有约34.5的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有约35的摩尔比。在一些方面，所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有约27的摩尔比。
在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有从约27至约28、从约22至约31、从约27至约31或从约22至约28的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有从约22至约28的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有从约22至约31的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有从约24至约31的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有从约25至约31的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有从约27至约28的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有从约27至约35的摩尔比。
在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有约20的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有约20.5的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有约21的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有约21.5的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有约22的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有约22.5的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有约23的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有约23.5的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有约24的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有约24.5的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有约25的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有约25.5的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有约26的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有约26.5的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有约27的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有约27.5的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有约28的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有约28.5的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有约29的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有约29.5的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有约30的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有约30.5的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有约31的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有约31.5的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有约32的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有约32.5的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有约33的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有约33.5的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有约34的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有约34.5的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有约35的摩尔比。在一些方面，所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有约27.4的摩尔比。
在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有从约13至约16、从约8至约16或从约8至约16的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有从约8至约20的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有从约8至约16的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有从约10至约16的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有从约12至约16的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有从约13至约20的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有从约13至约18的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有从约13至约16的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有从约13至约16的摩尔比。
在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有约5的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有约5.5的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有约6的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有约6.5的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有约7的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有约7.5的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有约8的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有约8.5的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有约9的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有约9.5的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有约10的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有约10.5的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有约11的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有约11.5的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有约12的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有约12.5的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有约13的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有约13.5的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有约14的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有约14.5的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有约15的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有约15.5的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有约16的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有约16.5的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有约17的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有约17.5的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有约18的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有约18.5的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有约19的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有约19.5的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有约20的摩尔比。在一些方面，所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有约14.6的摩尔比。
本公开文本的方法还可用于分析O-连接的聚糖。在一些方面，所述糖基化谱包括一种或多种O-连接的聚糖。在一些方面，所述O-连接的聚糖位于残基Ser129、Ser130、Ser136和/或Ser139处。
在一些方面，本文所述的CTLA4-Fc融合蛋白包含C末端赖氨酸。在一些方面，所述C末端赖氨酸包括约20％至约25％的相对丰度。在一些方面，其中所述C末端赖氨酸包括约3％至约10％的相对丰度。
本公开文本的方法还可用于分析CTLA4-Fc融合蛋白的双触角聚糖，包括测量与CTLA4蛋白中的一个或多个天冬酰胺残基附接的一种或多种N-连接的聚糖，其中所述双触角聚糖中的一种是G2F。在一些方面，测量与CTLA4蛋白中的一个或多个天冬酰胺残基附接的一种或多种N-连接的聚糖，其中所述双触角聚糖中的一种是G0F。在一些方面，所述双触角聚糖选自G0F、G1F、G2F、S1G1F、S1G2F和/或S2G2F。液相色谱可用于分析本公开文本的聚糖。特定的糖蛋白可以显示碳水化合物的异质性。可以观察到几个水平的异质性：糖基化位点可以从被完全占据到未被占据变化，并且任何特定位点都可以填充有许多不同的寡糖结构，其中每个结构可以通过唾液酸分子(如NANA或NGNA)修饰。
在一些方面，本公开文本提供了一种分析CTLA4-Fc融合蛋白的双触角聚糖的方法，所述方法包括对所述CTLA4-Fc融合蛋白进行等电聚焦。在一些方面，所述等电聚焦是成像毛细管等电聚焦。在一些方面，所述等电聚焦的CTLA4-Fc融合蛋白形成组I、组II和组III。在一些方面，组I小于或等于总量的4％，组II大于或等于总量的87％，和/或组III小于或等于总量的10％。
本公开文本的蛋白质的碳水化合物含量可以通过本领域已知的方法(包括本文实施例中所述的方法)分析。用于糖基化分析的几种方法是本领域中已知的，并且可用于本公开文本的上下文中。这些方法提供了关于与产生的肽附接的寡糖的身份和组成的信息。关于本公开文本可用的碳水化合物分析的方法包括但不限于凝集素色谱；高效阴离子交换色谱结合脉冲安培检测(HPAEC-PAD)，其使用高pH阴离子交换色谱以基于电荷分离寡糖；NMR；质谱；HPLC；多孔石墨化碳(GPC)色谱。
释放寡糖的方法包括：1)酶方法，其通常使用肽-N-糖苷酶F/内切-α-半乳糖苷酶进行：2)β-消除方法，其使用苛刻的碱性环境以释放主要是O-连接的结构；以及3)化学方法，其使用无水肼以释放N-连接的寡糖和O-连接的寡糖二者。分析方法可以包括以下步骤中的一个或多个：1.将样品针对去离子水透析以去除所有缓冲盐，然后冷干：2.用无水肼释放完整的寡糖链；3.将完整的寡糖链用无水甲醇HCl处理，以释放作为O-甲基衍生物的单独单糖；4.对任何伯氨基进行N-乙酰化；5.衍生化以产生全-O-三甲基甲硅烷基甲基糖苷：6.通过在CP-SIL8柱上的毛细管气-液色谱(GLC)分离衍生物；7.与已知标准品相比，通过GLC和质谱的保留时间鉴定单独糖苷衍生物；以及8.通过FID与内部标准品(13-O-甲基-D-葡萄糖)定量单独衍生物。在一些方面，经由超高效液相色谱和荧光检测(UPLC-FLR)测量所述双触角聚糖。在一些方面，在所述测量之前切割所述CTLA4-Fc融合蛋白的Fc结构域。在一些方面，所述蛋白质运行通过病毒灭活过程。在一些方面，所述病毒灭活过程用0.5％Triton X-100运行。
IV.药物组合物
通过本公开文本的方法制备的组合物还考虑药物配制品。可接受用于药物施用的组合物，除任何一种或多种活性剂外，这种组合物还可以包括作为不超过药物施用的可接受水平的水平(这种水平包括不存在此类杂质的情况)的杂质的物质，并且可以包括药学上可接受的赋形剂、媒介物、载体和其他非活性成分，例如，以配制便于施用的这种组合物。例如，药学上可接受的CTLA4-Ig组合物可以包括MCP-1或DNA，只要这些物质处于对于施用于人可接受的水平即可。
本公开文本还提供了作为冻干混合物的任何所述的CTLA4-Ig分子。包含待冻干的CTLA4-Ig的配制品可以进一步包含三种基本组分：(1)一种或多种包含其他蛋白质或小分子的另外的活性成分(如免疫抑制剂)，(2)一种或多种赋形剂和(3)一种或多种溶剂。赋形剂包括药学上可接受的试剂，以提供良好的冻干饼特性(填充剂)以及提供蛋白质的冻干保护和/或冷冻保护(“稳定剂”)、维持pH(缓冲剂)、以及在储存期间蛋白质的适当构象以便维持生物活性(包括活性成分的稳定性，如蛋白质的稳定性)的实质性保留。关于赋形剂，配制品的例子可以包括以下中的一种或多种：一种或多种缓冲剂、一种或多种填充剂、一种或多种蛋白质稳定剂和一种或多种抗微生物剂。糖或多元醇可以用作溶液中以及冻融和冷冻干燥期间的非特异性蛋白质稳定剂。聚合物可用于稳定溶液中以及冻融和冷冻干燥期间的蛋白质。一种流行的聚合物是血清白蛋白，它已经被用作冷冻保护剂和冻干保护剂两者。在一方面，本公开文本提供了无白蛋白的配制品。各种盐可以用作填充剂。说明性盐填充剂包括例如NaCl、MgCl2和CaCl2。
某些氨基酸可以用作冷冻保护剂和/或冻干保护剂和/或填充剂。可以使用的氨基酸包括但不限于甘氨酸、脯氨酸、4-羟脯氨酸、L-丝氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、精氨酸和赖氨酸盐酸盐。在配制品中可以选择许多覆盖宽pH范围的缓冲剂。缓冲剂包括例如乙酸盐、柠檬酸盐、甘氨酸、组氨酸、磷酸盐(钠或钾)、二乙醇胺和Tris。缓冲剂涵盖在冻干之前将溶液的pH维持在可接受的范围内的那些试剂。在一方面，本公开文本提供了冻干CTLA4-Ig混合物，其包含至少90％、95％、99％或99.5％的包括根据SEQ ID No:1-8中任一个的任何序列的CTLA4-Ig二聚体。在一方面，本公开文本提供了冻干CTLA4-Ig混合物，其包含至少90％、95％、99％或99.5％的CTLA4-Ig二聚体和不超过5％、4％、3％、2％或1％的CTLA4-Ig四聚体。在另一方面，本公开文本提供了冻干CTLA4-Ig混合物，其包含至少90％、95％、99％或99.5％的CTLA4-Ig二聚体、和不多于5％、4％、3％、2％或1％的CTLA4-Ig四聚体和不超过2％、1.5％、1.0％、0.8％、0.5％或0.3％的CTLA4-Ig单体。在另外的方面，本公开文本提供了冻干CTLA4-Ig混合物，其包含至少8.0摩尔唾液酸/摩尔CTLA4-Ig二聚体或CTLA4-Ig分子。在另一方面，本公开文本提供了冻干CTLA4-Ig混合物，其包含：从约15至约35摩尔GlcNac/摩尔CTLAIg分子或二聚体；从约1至约5摩尔GalNac/摩尔CTLA4-Ig二聚体或CTLA4-Ig分子；从约5摩尔至约20摩尔半乳糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体或CTLA4-Ig分子；从约2至约10摩尔岩藻糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体或CTLA4-Ig分子；和/或从约5-15摩尔甘露糖/摩尔CTLA4-Ig二聚体或CTLA4-Ig分子。
本公开文本还提供了作为皮下(SC)配制品的任何所述的CTLA4-Ig分子。IV配制品对于需要频繁、长期疗法的受试者来说是不方便的。受试者必须经常出门经由可能持续长达一个小时的IV输注来接受药物。因此，可以在家中自行施用的SC配制品将是非常有益的。对于皮下施用，需要具有高蛋白质浓度的剂型。采用大于1mg/kg(>100mg/剂量)的高剂量的治疗需要开发浓度超过100mg/ml的配制品，因为可以通过SC途径给予的体积较小(<1.5ml)。本公开文本的SC配制品包含在水性载体中的CTLA4Ig分子，所述分子以至少100mg/ml的蛋白质浓度与稳定水平的糖组合，优选至少125mg/ml的蛋白质浓度与稳定水平的糖组合。所述糖优选使得蛋白质与糖的重量比为至少1:1.1。稳定剂优选采用不大于可能导致粘度不理想或不适合经由SC注射器施用的量。糖优选为二糖，最优选蔗糖。SC配制品还可以包含选自缓冲剂、表面活性剂和防腐剂的组分中的一种或多种。
V.治疗方法
通过本公开文本的方法制备的组合物可用于治疗各种疾病。本公开文本提供了一种用于抑制T细胞增殖(或激活)的方法，所述方法包括使T细胞与有效量的本公开文本的CTLA4-Ig组合物接触。本公开文本提供了一种用于抑制受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本公开文本的CTLA4-Ig组合物。本公开文本提供了一种用于诱导受试者中对抗原的免疫耐受性的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本公开文本的CTLA4-Ig组合物。本公开文本提供了一种用于治疗受试者的炎症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本公开文本的CTLA4-Ig组合物。本公开文本提供了一种用于治疗类风湿性关节炎的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本公开文本的CTLA4-Ig组合物。
本公开文本提供了一种用于治疗受试者的银屑病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本公开文本的CTLA4-Ig组合物。本公开文本提供了一种用于治疗或预防受试者的变态反应的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本公开文本的CTLA4-Ig组合物。本公开文本提供了一种用于治疗或预防受试者的移植物抗宿主病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本公开文本的CTLA4-Ig组合物。本公开文本提供了一种用于治疗或预防受试者的移植器官排斥的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本公开文本的CTLA4-Ig组合物。
本公开文本提供了一种用于治疗受试者的克罗恩病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本公开文本的CTLA4-Ig组合物。本公开文本提供了一种用于治疗受试者的I型糖尿病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本公开文本的CTLA4-Ig组合物。
本公开文本提供了一种用于治疗受试者的卵巢炎的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本公开文本的CTLA4-Ig组合物。本公开文本提供了一种用于治疗受试者的肾小球肾炎的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本公开文本的CTLA4-Ig组合物。本公开文本提供了一种用于治疗受试者的变态反应性脑脊髓炎的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本公开文本的CTLA4-Ig组合物。
本公开文本提供了一种用于治疗受试者的重症肌无力的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本公开文本的CTLA4-Ig组合物。因此，在本公开文本的某些方面，本公开文本提供了在本文所述的生产方法中由细胞系产生的CTLA4-Ig分子，以便治疗T细胞相关的疾病或障碍，所述疾病或障碍通常包括但不限于任何T细胞依赖性淋巴增殖性疾病或障碍以及任何T细胞依赖性自身免疫性疾病或障碍，并且更具体地是：T细胞淋巴瘤、T细胞急性淋巴母细胞白血病、睾丸血管中心性T细胞淋巴瘤、良性淋巴细胞性血管炎、移植物抗宿主病(GVHD)、与移植物移植排斥相关的免疫障碍、银屑病、炎症、变态反应、卵巢炎、肾小球肾炎、脑脊髓炎、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、艾迪生病、原发性粘液性水肿、恶性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、类风湿性关节炎、胰岛素依赖型糖尿病、古德帕斯彻综合征(good pasture's syndrome)、重症肌无力、天疱疮、交感性眼炎、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少症、原发性胆汁性肝硬化、慢性行动性肝炎、硬皮病、多肌炎、和混合性结缔组织病。
本公开文本提供了一种用于抑制T细胞增殖(或激活)的方法，所述方法包括使T细胞与有效量的与或不与另一种药剂(如甲氨蝶呤)组合的本公开文本的CTLA4-Ig组合物接触。本公开文本提供了一种用于抑制受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的单独或与甲氨蝶呤组合的本公开文本的CTLA4-Ig组合物。本公开文本提供了一种用于诱导受试者中对抗原的免疫耐受性的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的与甲氨蝶呤组合的本公开文本的CTLA4-Ig组合物。
在以下小节中更详细地描述本公开文本的各个方面。通过以下实施例进一步说明本公开文本，所述实施例不应当被视为进一步限制。将本申请通篇引用的所有参考文献的内容通过引用明确并入本文。
实施例
实施例1
5L小试规模制造
阿巴西普是基因工程化的融合蛋白，其由人细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)的功能结合结构域和IgG1类人单克隆免疫球蛋白的Fc结构域组成。阿巴西普由2条各约46kDa的同源糖基化多肽链构成，它们通过单个二硫键共价连接。
阿巴西普是使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系在大规模细胞培养中作为细胞外蛋白质产生的。制造过程是以解冻工作细胞库(WCB)小瓶开始的。将培养物在一系列挡板摇瓶、细胞袋生物反应器和种子生物反应器中繁殖。将最后阶段的接种物培养物转移到生产生物反应器中。基于目标唾液酸(SA)与阿巴西普蛋白的摩尔比(MR)和细胞培养持续时间来收获生产生物反应器。使用一级回收收获步骤，然后进行灭菌级过滤将细胞培养收获物澄清。调节无细胞收获材料以达到指定的pH，并且添加Triton X-100用于病毒灭活，以准备用于下游处理。
图1A、图1B和图1C示出了可以潜在地存在于位置T5、T7和T14的各种聚糖。图1D示出了在阿巴西普的一级氨基酸序列(也见于SEQ ID NO:5)中N-连接的糖基化位点(T5、T7和T14)的特定位置。图2A示出了各处理组的平均活细胞密度(VCD)谱，并且此生物反应器细胞生长数据按处理组的总结可以在图2B中看到。低初始pH(6.9)和低初始VCD处理组在整个运行过程中趋向于在这些图线的底部，在第11天与第12天之间达到两个最低峰VCD值。到第3天，早期pH转变条件与其他条件的趋势相似，但是在第3天的pH转变后逐渐与对照组不同，并且达到更低的峰值VCD。从第6天开始，与对照处理相比，低总体温度组显示出更慢的生长。这种增长的影响可以在曲线的更平坦形状和相对低的峰值VCD中看到。从第3天开始，高初始VCD处理组和晚第一补料处理组倾向于在这些图线的顶部。在生产生物反应器之前，通过5L种子生物反应器的两个阶段(N-2和N-1)将接种物放大培养并且传代。然后在接种后将生产生物反应器阶段运行14-17天。表1呈现了此研究中使用的中心点5L生产生物反应器的运行参数。关于每个测试条件的细胞活力谱可以在图3中看到。0.45x 106个细胞/mL的初始细胞密度在第14天显示出最大的活力损失，降至约86％细胞活力，这表明细胞密度达到太高的水平而无法维持较高的细胞活力水平。
5L生物反应器聚糖谱分析
经由质谱分析唾液酸含量。第14天收获前NANA、NGNA和N-连接值的平均值，连同将每个处理组的结果与对照进行比较的Dunnett检验的p值示于图4A中。结构域IV+V被定义为N-连接结构域IV和结构域V值的总和。p值≤0.05的处理被认为与对照有显著差异。第14天NANA、NGNA、结构域I、结构域II和结构域III值没有显示出与对照值的显著差异。相对于对照值，大多数结构域IV+V值没有显示出显著差异。然而，相对于对照，低总体温度和低温度转变1处理组产生显著更低的结构域IV+V水平。结构域IV+V的DS释放规格≤16％，因此这种降低对产品质量没有风险。可以在图4B中看到平均第14天滴度和平均比生产率(Qp)值，连同将处理组与对照进行比较的对照Dunnett检验的p值。p值≤0.05被认为是显著差异。相对于对照，低初始pH、低初始VCD和低总体温度显示出显著更低的第14天滴度。发现低初始pH和早期pH转变时间设定条件比对照具有显著更高的比生产率。
表1：5L生产生物反应器中心点运行参数
Figure BDA0004164453230000461
根据下表2以一次一因子(OFAT)方法进行研究，每种条件相对于中心点对照改变单个参数。糖基化数据结果可以在图4A-图4H中看到。如下调整每个设定点：
表2
Figure BDA0004164453230000462
Figure BDA0004164453230000471
实验结果
从生物反应器收获后，进行阿巴西普分子上的N-糖基化的扩展表征。使用制备型蛋白A Waters HPLC系统纯化生物反应器样品。然后将纯化的样品使用10kD截止离心过滤单元(Millipore)浓缩至>4.0g/L的最终浓度。将所得的阿巴西普蛋白还原，烷基化并且通过胰蛋白酶消化，然后通过GluC消化。将胰蛋白酶-GluC消化物通过反相色谱分离，并且通过质谱进行检测。根据该糖肽的提取离子色谱图下的峰面积除以所有目的糖肽的总峰面积，计算每种糖型的百分比。将聚糖释放并且使用荧光标记试剂盒标记，然后在具有荧光检测的超高效液相色谱系统(UPLC-FLR)上分析样品。经由质谱分析聚糖G0F、G2F、S1G2F、S2G2F、S1G3F和S2G4F。这六种聚糖的分析结果可以在图4C-图4H中看到。图4C呈现了G0F糖型的平均液相色谱-质谱(LC-MS)结果，以阿巴西普分子上的T5和T7 N-糖基化位点处的相对丰度报告。图4D呈现了G2F糖型的平均液相色谱-质谱(LC-MS)结果，以阿巴西普分子上的T5和T7 N-糖基化位点处的相对丰度报告。图4E呈现了S1G2F糖型的平均液相色谱-质谱(LC-MS)结果，以阿巴西普分子上的T5和T7 N-糖基化位点处的相对丰度报告。图4F呈现了S2G2F糖型的平均液相色谱-质谱(LC-MS)结果，以阿巴西普分子上的T5和T7 N-糖基化位点处的相对丰度报告。图4G呈现了S1G3F糖型的平均液相色谱-质谱(LC-MS)结果，以阿巴西普分子上的T5和T7 N-糖基化位点处的相对丰度报告。图4H示出了S2G4F糖型的平均LC-MS结果，以阿巴西普分子上T5 N-糖基化位点处的相对丰度报告。
实施例2
细胞年龄对CTLA4-Ig过程生产生物反应器步骤的收获前N-糖型分布的影响
为了了解接种物的代数对在降低的温度设定点下阿巴西普制造过程中的过程属性和质量属性的影响，研究了接种生物反应器的细胞总代数的失败边缘。在5L生物反应器中一式两份地研究所有条件。将细胞小瓶解冻，传代，扩增，最后在第5、10、15和21次传代时储存。在开始此生物反应器研究之前，将细胞库小瓶解冻并且扩增六代，直至3L阶段。每个3L烧瓶用于接种单个n-2种子生物反应器，然后进入到n-1种子生物反应器中。每个n-1种子生物反应器用于接种两个5L生产生物反应器。
每天监测细胞培养物性能，包括VCD、活力、pH、DO、营养物质和代谢物水平。在第10-16天每天测量滴度和唾液酸含量，并且进行分析。在第16天测量高分子量物质(HMW)、残留DNA、宿主细胞蛋白(HCP)和N-连接糖基化(图5)。在第16天通过LC/MC测量糖型分布(图5)。
实施例3
生产生物反应器温度范围
为了评价生产生物反应器步骤中可允许的温度范围，分析了生物反应器接种活细胞密度(VCD)、pH转变设定点、PCO2转变设定点、第一温度设定点、第二温度设定点和第三温度设定点对过程性能和过程质量的影响。过程参数和表征范围示于图6A中。使用5LSartorius和Finesse器皿和控制器进行生产生物反应器表征。生产生物反应器步骤的运行条件遵循表X，图6A所示的六个实验范围除外。评价的过程参数的设定点或中点在22个处理(包括2个对照)中变化，如表Y所示。仅针对对照中心点条件运行重复。
表X.5L生产生物反应器中心点运行参数
参数 设定点 范围
接种活细胞密度(106个细胞/mL) 0.3 0.15-0.45
初始温度(℃) 36 35-37
初始pH 7.0 6.9-7.1
初始工作体积(L) 2.5 2.4-2.6
pH转变设定点 6.9 6.8-7.0
pH转变的时间设定(小时) 96 72-100
第一温度转变设定点(℃) 33 32-34
温度转变设定点的时间设定(小时) 144 120-168
第二温度转变设定点(℃) 31 30-32
第二温度转变设定点的时间设定(小时) 240 228-252
表Y.按器皿ID的生产生物反应器条件
Figure BDA0004164453230000481
过程参数的显著主要影响的总结示于图7。发现过程参数的相互作用和二次效应对过程性能和产品质量是统计学上显著的。研究设计中包括的所有二次效应都会影响过程属性或质量属性。确定以下参数相互作用对过程属性或质量属性有影响：接种VCD x第一温度设定点、接种VCD x第三温度设定点、接种VCD x第二温度设定点、第二温度设定点x pCO2设定点、第二温度设定点x pH转变设定点、以及第三温度转变设定点xpH转变设定点。
实施例4
表达CTLA4-Ig的悬浮哺乳动物细胞的商业规模培养：
此实施例描述了CTLA4-Ig分子的产生。此实施例中描述的方法可以适于和扩展用于其他蛋白质的生产，所述其他蛋白质包括但不限于分泌的蛋白质(如细胞因子和其他激素)、作为Ig超家族的成员或包括Ig超家族蛋白质的一部分在内的分泌的蛋白质、以及通常在CHO细胞中表达的任何蛋白质。
培养瓶(例如，摇瓶和锥形瓶)、转瓶和细胞袋用于CTLA4-Ig培养过程的接种物扩增步骤，以连续繁殖来自冷冻小瓶的细胞，从而提供足够数量的活细胞以接种25,000L生物反应器。
CTLA4-Ig的商业规模生产：本公开文本的生产阶段发生在25,000L生产生物反应器中，生产大量且高质量的CTLA4-Ig蛋白质，这涉及具有两步温度转变的培养。在诱导后大约76小时将生物反应器用补料培养基补充，并且每天将此补料提供给生产反应器。将25,000L培养物在CD-CHO培养基中在36℃下孵育直至诱导后大约144小时，然后在约144小时(对数生长期结束)后使其经受从36℃至33℃的温度转变(T-转变)。从约144小时至约240小时保持33℃的温度。然后在从诱导约240小时后使25,000L培养物经受从33℃至31℃的第二和最终温度转变(T-转变)，并且从约240小时点维持至收获。
每天从生产生物反应器中取样进行分析。例如，将用于细胞计数的样品用台盼蓝(Sigma，圣路易斯，密苏里州)染色。使用血细胞计数器在显微镜下计数活的染色细胞来进行细胞计数和细胞活力测定。为了分析代谢物，将另外的样品等分试样以2000rpm(4℃)离心20分钟以使细胞沉淀。使用本领域常规实施的技术和方案分析上清液的蛋白质滴度、唾液酸、葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸、pH、pO2、pCO2、氨和LDH。
实施例5
25,000L生物反应器中产生的CTLA4-Ig的糖基化分析
进行成像毛细管等电聚焦(iCIEF)以分析聚糖含量。此方法用于通过蛋白质的等电点(pI)分离蛋白质。在这种方法中，用水、甲基纤维素、两性电解质和pI标记物将阿巴西普样品制备为约1mg/mL的最终浓度，然后通过自动进样器将其注入成像毛细管等电聚焦系统(iCIEF)中。基于亚型的电荷变化，电泳通过碳氟化合物(FC)包被的毛细管内的pH梯度分离样品。高电压聚焦后，样品迁移被整个柱CCD相机拍摄，并且使用相关软件进行峰的定量分析。结果报告为样品中存在的总糖型的百分比，并且可以在图8A-图8B和图9A-图9B中看到。
25,000L生物反应器中产生的CTLA4-Ig的糖基化结构域分析
确定了阿巴西普的N-连接的寡糖谱(糖基化模式)。阿巴西普上的寡糖通过用PNGase F进行酶水解而被释放。使用电化学检测通过高效阴离子交换色谱(HPAEC)分析游离寡糖。针对同时运行的参考物质样品评价药物物质的寡糖谱。结果报告为选定结构域的绝对面积百分比或选定结构域与参考标准品中相同结构域的偏差百分比。结构域I、II、III和VI+V结果可以在图10A-图10D中看到。唾液酸分析(NANA和NGNA)的结果可以在图10E和图10F中看到。
实施例6
阿巴西普的体内功效
进行临床研究以比较通过参考方法(例如，方法F，其描述于PCT/US2006/049074中)和本文所述的方法(例如，方法J)制备的阿巴西普的药代动力学。临床研究是开放标签、随机化、平行组、单剂量研究，进行所述研究以比较在健康参与者中单剂量(以30分钟IV输注施用的750mg)后，通过本文所述的方法相对于参考方法制造的阿巴西普的药代动力学(PK)。
临床PK研究的结果表明需要控制阿巴西普的N-聚糖组成。通过HILIC N-连接的聚糖谱分析方法确定N-聚糖组成。此方法旨在定量影响PK的在CTLA4区上的主要双触角糖型的总和。
临床研究表明CTLA4 G2F、S1G2F和S2G2F糖型对总体控制策略和PK影响最大，因此提出了对这些聚糖的两侧限制(表3)。CTLA4 G2F是阿巴西普的关键质量属性，因为它与PK清除率有很强的相关性。S1G2F对PK的影响最小，并且应用2侧限制以用于制造一致性。由于在制造方法和清除率两方面中，S2G2F与G2F具有很强的相关性，因此对S2G2F应用了2侧限制。提出了对于G0F、G1F和S1G1F的单侧限制，因为它们对总体清除率的影响可以忽略不计。其他理由提供于表3中。表3中提出的所有聚糖的限制确保了在接受的PK参数内对聚糖的控制。一个属性的失败会触发批次的拒绝，以维持与临床和制造经验的一致性。
表3.
Figure BDA0004164453230000501
/>
SEQUENCE LISTING
<110> 百时美施贵宝公司
<120> 蛋白质的制造方法
<130> 3338.188PC01
<150> US 63/066,122
<151> 2020-08-14
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CTLA4 Extracellular Domain
<400> 1
Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile
1 5 10 15
Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val
20 25 30
Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys
35 40 45
Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser
50 55 60
Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln
65 70 75 80
Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu
85 90 95
Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile
100 105 110
Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp
115 120
<210> 2
<211> 383
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CTLA4-Ig amino acid sequence
<400> 2
Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala
1 5 10 15
Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gln Pro
20 25 30
Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu
35 40 45
Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg
50 55 60
Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met
65 70 75 80
Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser
85 90 95
Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp
100 105 110
Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr
115 120 125
Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu
130 135 140
Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His
145 150 155 160
Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val
165 170 175
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
180 185 190
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
195 200 205
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
210 215 220
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
225 230 235 240
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
245 250 255
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
260 265 270
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
275 280 285
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
290 295 300
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
305 310 315 320
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
325 330 335
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
340 345 350
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
355 360 365
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375 380
<210> 3
<211> 359
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acids 25-383 of SEQ ID NO:2
<400> 3
Met Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg
1 5 10 15
Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr
20 25 30
Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu
35 40 45
Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp
50 55 60
Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr
65 70 75 80
Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val
85 90 95
Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr
100 105 110
Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu
115 120 125
Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro
130 135 140
Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
145 150 155 160
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
165 170 175
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
180 185 190
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
195 200 205
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
210 215 220
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
225 230 235 240
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
245 250 255
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
260 265 270
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
275 280 285
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
290 295 300
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
305 310 315 320
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
325 330 335
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
340 345 350
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355
<210> 4
<211> 358
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino Acids 26-383 of SEQ ID NO:2
<400> 4
Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly
1 5 10 15
Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu
20 25 30
Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val
35 40 45
Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp
50 55 60
Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile
65 70 75 80
Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu
85 90 95
Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln
100 105 110
Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro
115 120 125
Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu
130 135 140
Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
145 150 155 160
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
165 170 175
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
180 185 190
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
195 200 205
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
210 215 220
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
225 230 235 240
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
245 250 255
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
260 265 270
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
275 280 285
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
290 295 300
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
305 310 315 320
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
325 330 335
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
340 345 350
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355
<210> 5
<211> 357
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino Acids 27-383 of SEQ ID NO:2
<400> 5
Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile
1 5 10 15
Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val
20 25 30
Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys
35 40 45
Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser
50 55 60
Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln
65 70 75 80
Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu
85 90 95
Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile
100 105 110
Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys
115 120 125
Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu
130 135 140
Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
145 150 155 160
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
165 170 175
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
180 185 190
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
195 200 205
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
210 215 220
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
225 230 235 240
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
245 250 255
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
260 265 270
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
275 280 285
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
290 295 300
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
305 310 315 320
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
325 330 335
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
340 345 350
Leu Ser Pro Gly Lys
355
<210> 6
<211> 358
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino Acids 25-382 of SEQ ID NO:2
<400> 6
Met Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg
1 5 10 15
Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr
20 25 30
Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu
35 40 45
Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp
50 55 60
Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr
65 70 75 80
Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val
85 90 95
Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr
100 105 110
Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu
115 120 125
Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro
130 135 140
Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
145 150 155 160
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
165 170 175
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
180 185 190
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
195 200 205
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
210 215 220
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
225 230 235 240
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
245 250 255
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
260 265 270
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
275 280 285
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
290 295 300
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
305 310 315 320
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
325 330 335
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
340 345 350
Leu Ser Leu Ser Pro Gly
355
<210> 7
<211> 357
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino Acids 26-382 of SEQ ID NO:2
<400> 7
Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly
1 5 10 15
Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu
20 25 30
Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val
35 40 45
Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp
50 55 60
Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile
65 70 75 80
Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu
85 90 95
Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln
100 105 110
Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro
115 120 125
Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu
130 135 140
Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
145 150 155 160
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
165 170 175
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
180 185 190
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
195 200 205
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
210 215 220
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
225 230 235 240
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
245 250 255
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
260 265 270
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
275 280 285
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
290 295 300
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
305 310 315 320
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
325 330 335
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
340 345 350
Ser Leu Ser Pro Gly
355
<210> 8
<211> 356
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acids 27-382 of SEQ ID NO:2
<400> 8
Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile
1 5 10 15
Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val
20 25 30
Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys
35 40 45
Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser
50 55 60
Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln
65 70 75 80
Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu
85 90 95
Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile
100 105 110
Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys
115 120 125
Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu
130 135 140
Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
145 150 155 160
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
165 170 175
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
180 185 190
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
195 200 205
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
210 215 220
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
225 230 235 240
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
245 250 255
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
260 265 270
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
275 280 285
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
290 295 300
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
305 310 315 320
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
325 330 335
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
340 345 350
Leu Ser Pro Gly
355
<210> 9
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T5
<400> 9
Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn
1 5 10 15
Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg
20 25
<210> 10
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T7
<400> 10
Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Glu Gly Ile Gly Asn Gly
1 5 10 15
Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln
20 25 30
Glu Pro Lys
35
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T14
<400> 11
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
1 5

Claims (139)

1.一种控制细胞生长速率、细胞活力、活细胞密度和/或细胞滴度以产生蛋白质的方法，所述方法包括在蛋白质诱导阶段中将所述细胞在36℃的初始温度设定点下在生物反应器中培养，并且将所述细胞在33℃的第二温度设定点和31℃的最终温度设定点下培养。
2.一种提高细胞的蛋白质产量的方法，所述方法包括将所述细胞在合适的条件下在生物反应器中培养，其中所述合适的条件包括(i)36.0℃的初始温度设定点和低于36℃的第二温度设定点；(ii)低于36.5℃的初始温度设定点和31℃的最终温度设定点；或(iii)低于36.5℃的初始温度设定点、33℃的第二温度设定点和低于33℃的最终温度设定点。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述合适的条件进一步包括7.0的初始pH设定点和6.9的第二pH设定点或者pH 6.9的初始pH设定点。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述合适的条件进一步包括在约96小时的pH转变。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述合适的条件进一步包括约0.30X106个细胞/mL的初始活细胞密度(VCD)设定点。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述合适的条件进一步包括在15％与25％之间的初始CO2设定点。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述合适的条件进一步包括在约76小时的第一补料时间。
8.一种提高细胞的蛋白质产量的方法，所述方法包括在蛋白质诱导阶段中将所述细胞在合适的条件下在生物反应器中培养，其中所述合适的条件包括：
a.36℃的初始温度设定点、33℃的第二温度设定点和31℃的第三温度设定点；
b.7.0的初始pH设定点和6.9的第二pH设定点或者6.9的初始pH；
c.在0.15X 106个细胞/mL与0.45X 106个细胞/mL之间的初始活细胞密度(VCD)；
d.在10％至40％之间的初始CO2设定点；或
e.其任何组合。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述合适的条件包括：
a.36℃的初始温度设定点、33℃的第二温度设定点和31℃的第三温度设定点；
b.7.0的初始pH设定点和6.9的第二pH设定点；
c.约0.30X 106个细胞/mL的初始活细胞密度(VCD)设定点；和
d.在15％与25％之间的初始CO2设定点。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述最终温度设定点发生在约228小时至约252小时。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述最终温度设定点发生在所述初始温度设定点之后约228小时、约234小时、约240小时、约246小时或约252小时。
12.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述最终温度设定点为31℃并且在240小时之后发生。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述第二温度设定点发生在约120小时至约168小时。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述第二温度设定点发生在约120小时、约126小时、约132小时、约138小时、约144小时、约150小时、约156小时、约162小时或约168小时。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中在144小时后所述第二温度设定点为33℃。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中与不采用所述合适的条件的方法相比，所述条件将所述蛋白质产量提高至少150％、至少约160％、至少约170％、至少约180％、至少约190％、至少约200％、至少约210％、至少约220％、至少约230％、至少约240％、至少约250％、至少约260％、至少约270％、至少约280％、至少约290％、至少约300％、至少约310％、至少约320％、至少约330％、至少约340％、至少约350％、至少约360％、至少约370％、至少约380％、至少约390％或至少约400％。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述方法降低细胞生长速率。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述细胞生长展现出从约30.0小时至约40.0小时的平均第0-5天倍增时间。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述细胞生长展现出约35.1小时的平均第0-5天倍增时间。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述方法控制细胞活力。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述细胞活力展现出从约10.0x 106个细胞/mL至约15.0x 106个细胞/mL的平均峰值活细胞密度(VCD)。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述细胞活力展现出约11.2x 106个细胞/mL的平均峰值活细胞密度(VCD)。
23.根据权利要求20所述的方法，其中所述细胞活力展现出从约0.05x 109个细胞/mL至约0.11x 109个细胞/mL的平均第0-14天活细胞密度积分(IVCD)。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述细胞活力展现出约0.10x 109个细胞/mL的平均第0-14天活细胞密度积分(IVCD)。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述方法控制滴度。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述滴度展现出约1.50g/L至约3.5g/L的平均第14天滴度。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述滴度展现出约2.87g/L的平均第14天滴度。
28.根据权利要求25所述的方法，其中所述滴度展现出从约20.0pg/细胞-天至约40.0pg/细胞-天的平均比生产率。
29.根据权利要求25所述的方法，其中所述滴度展现出约38.5pg/细胞-天的平均比生产率。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括修改上游生物反应器参数，其中所述上游反应器参数选自(i)补料时间，(ii)初始pH，(iii)pH转变，(iv)CO2，(v)初始细胞密度或(vi)其任何组合。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述方法控制所述蛋白质的糖基化谱。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述糖基化谱包括一种或多种N-连接的聚糖。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述N-连接的聚糖包括：G0F、G1F、G2F、S1G1F、S1G2F和/或S2G2F。
34.根据权利要求31至33中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在第14天后测量所述糖基化谱。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的方法，其中所述蛋白质包含CTLA4结构域。
36.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是融合蛋白。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述融合蛋白包含Fc部分。
38.根据权利要求1至37中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是阿巴西普。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述蛋白质是如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
40.根据权利要求33-39中任一项所述的方法，其中G0F包括小于或等于约7.0％或约6.5％的相对丰度。
41.根据权利要求33-40中任一项所述的方法，其中G1F包括小于或等于约7.5％或为约7％的相对丰度。
42.根据权利要求33-41中任一项所述的方法，其中G2F包括小于或等于约25％或为约1.5％至约23％的相对丰度。
43.根据权利要求33-42中任一项所述的方法，其中S1G1F包括小于或等于约13.5％或为约12.5％的相对丰度。
44.根据权利要求33-43中任一项所述的方法，其中S1G2F包括大于或等于约33％或为约32％至约49％的相对丰度。
45.根据权利要求33-44中任一项所述的方法，其中S2G2F包括大于或等于约12％或为约14％至约48.5％的相对丰度。
46.根据权利要求33-45中任一项所述的方法，其中G2F包括约1.5％至约23％的相对丰度，S1G2F包括约32％至约49％的相对丰度，和/或S2G2F包括约14％至约48.5％的相对丰度。
47.根据权利要求33-45中任一项所述的方法，其中G2F包括小于或等于约25％的相对丰度，S1G2F包括大于或等于约33％的相对丰度，和/或S2G2F包括大于或等于约12％的相对丰度。
48.根据权利要求33-45中任一项所述的方法，其中G0F包括小于或等于约6.5％的相对丰度，G1F包括小于或等于约7％的相对丰度，G2F包括约1.5％至约23％的相对丰度，S1G1F包括小于或等于约12.5％的相对丰度，S1G2F包括约32％至约49％的相对丰度，和/或S2G2F包括约14％至约48.5％的相对丰度。
49.根据权利要求33-45中任一项所述的方法，其中G0F包括小于或等于约7.0％的相对丰度，G1F包括小于或等于约7.5％的相对丰度，G2F包括小于或等于约25％的相对丰度，S1G1F包括小于或等于约13.5％的相对丰度，S1G2F包括大于或等于约33％的相对丰度，和/或S2G2F包括大于或等于约12％的相对丰度。
50.根据权利要求39-49中任一项所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖位于选自阿巴西普的Asn76(T5)、Asn108(T7)和/或Asn207(T14)的一个或多个残基处。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约2.0％与约10.0％之间的G0F的相对丰度。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约2.5％与约10％、约2.5％与约9.5％、约2.5％与约9％、约2.5％与约8.5％、约2.5％与约8％、约2.5％与约7.5％、约2.5％与约7％、约2.5％与约6.5％、约3.0％与约10％、约3.0％与约9.5％、约3.0％与约9％、约3.0％与约8.5％、约3.0％与约8％、约3.0％与约7.5％、约3.0％与约7％、或约3.0％与约6.5％之间的G0F的相对丰度。
53.根据权利要求51所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约3.2％与6.6％之间、在约3.2％与约4.6％之间、或在3.2％与约6.6％之间的G0F的相对丰度。
54.根据权利要求51所述的方法，其中所述G0F的相对丰度为约4.0％。
55.根据权利要求50至54中任一项所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约1.0％与约6％之间的G0F的相对丰度。
56.根据权利要求50至54中任一项所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约1.0％与约6％、约1.0％与约5.5％、约1.0％与约5.0％、约1.0％与约4.5％、约1.0％与约4.0％、约1.5％与约6％、约1.5％与约5.5％、约1.5％与约5.0％、约1.5％与约4.5％、约1.5％与约4.0％、约2.0％与约6％、约2.0％与约5.5％、约2.0％与约5.0％、约2.0％与约4.5％、或约2.0％与约4.0％之间的G0F的相对丰度。
57.根据权利要求50至54中任一项所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约2.1％与约4.0％之间、在约1.8％与约3.5％之间、或在约1.8％与4.0％之间的G0F的相对丰度。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述G0F的相对丰度为约3.4％。
59.根据权利要求50至58中任一项所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约5％与约12％之间的G2F的相对丰度。
60.根据权利要求50至58中任一项所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约5％与约12％、约5％与约11.5％、约5％与约11％、约5％与约10.5％、约5％与约10％、约5.5％与约12％、约5.5％与约11.5％、约5.5％与约11％、约5.5％与约10.5％、约5.5％与约10％、约6％与约12％、约6％与约11.5％、约6％与约11％、约6％与约10.5％、约6％与约10％、约6.5％与约12％、约6.5％与约11.5％、约6.5％与约11％、约6.5％与约10.5％、约6.5％与约10％、约7％与约12％、约7％与约11.5％、约7％与约11％、约7％与约10.5％、或约7％与约10％之间的G2F的相对丰度。
61.根据权利要求50至58中任一项所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约7.2％与约9.8％之间、在约6.3％与10.6％之间、或在约7.2％与约10.6％之间的G2F的相对丰度。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述G2F的相对丰度为约7.8％。
63.根据权利要求50至62中任一项所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约5％与约21％之间的G2F的相对丰度。
64.根据权利要求50至62中任一项所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约5％与约21％、约5％与约20.5％、约5％与约20％、约5％与约19.5％、约5％与约19％、约5.5％与约21％、约5.5％与约20.5％、约5.5％与约20％、约5.5％与约19.5％、约5.5％与约19％、约6％与约21％、约6％与约20.5％、约6％与约20％、约6％与约19.5％、约6％与约19％、约6.5％与约21％、约6.5％与约20.5％、约6.5％与约20％、约6.5％与约19.5％、约6.5％与约19％、约7％与约21％、约7％与约20.5％、约7％与约20％、约7％与约19.5％、约7％与约19％、约7.5％与约21％、约7.5％与约20.5％、约7.5％与约20％、约7.5％与约19.5％、约7.5％与约19％、约8％与约21％、约8％与约20.5％、约8％与约20％、约8％与约19.5％、或约8％与约19％之间的G2F的相对丰度。
65.根据权利要求50至62中任一项所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约8.2％与约14.1％、约8.0％与约18.6％、或约8.2％与约14.1％之间的G2F的相对丰度。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述G2F的相对丰度为约12.4％。
67.根据权利要求63-66中任一项所述的方法，其中G2F进一步包含半乳糖-α-1,3-半乳糖部分(G2F-Gal)，其中所述G2F-Gal包括小于或等于约1.4％的相对丰度。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述G2F-Gal包括在约1.0％至约1.4％之间的相对丰度。
69.根据权利要求67所述的方法，其中所述G2F-Gal包括在约0.4％至约0.9％之间的相对丰度。
70.根据权利要求50至69中任一项所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约29％与约38％之间的S1G2F的相对丰度。
71.根据权利要求50至69中任一项所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约29％与约38％、约29％与约37.5％、约29％与约37％、约29％与约36.5％、约29.5％与约38％、约29.5％与约37.5％、约29.5％与约37％、约29.5％与约36.5％、约30％与约38％、约30％与约37.5％、约30％与约37％、约30％与约36.5％、约31.5％与约38％、约31.5％与约37.5％、约31.5％与约37％、约31.5％与约36.5％之间的S1G2F的相对丰度。
72.根据权利要求50至69中任一项所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约31.6％与约35.1％、约31.3％与约36.5％、或约31.3％与约36.5％之间的S1G2F的相对丰度。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述S1G2F的相对丰度为约33.3％。
74.根据权利要求50至73中任一项所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在33％与约45％之间的S1G2F的相对丰度。
75.根据权利要求50至73中任一项所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约33％与约45％、约33％与约44.5％、约33％与约44％、约33％与约43.5％、约33％与约43％、约33％与约42.5％、约33.5％与约45％、约33.5％与约44.5％、约33.5％与约44％、约33.5％与约43.5％、约33.5％与约43％、约33.5％与约42.5％、约34％与约45％、约34％与约44.5％、约34％与约44％、约34％与约43.5％、约34％与约43％、约34％与约42.5％、约34.5％与约45％、约34.5％与约44.5％、约34.5％与约44％、约34.5％与约43.5％、约34.5％与约43％、或约34.5％与约42.5％之间的S1G2F的相对丰度。
76.根据权利要求50至73中任一项所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约34.2％与约37.7％、约35.5％与约42.3％、或约34.2％与约42.3％之间的S1G2F的相对丰度。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述S1G2F的相对丰度为约36.5％。
78.根据权利要求74-77中任一项所述的方法，其中S1G2F进一步包含半乳糖-α-1,3-半乳糖部分(S1G2F-Gal)，其中所述S1G2F-Gal包括小于或等于约4.7％的相对丰度。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述S1G2F-Gal包括在约2.3％至约4.7％之间的相对丰度。
80.根据权利要求78所述的方法，其中所述S1G2F-Gal包括在约1.4％至约1.8％之间的相对丰度。
81.根据权利要求50至80中任一项所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约13％与约25％之间的S2G2F的相对丰度。
82.根据权利要求50至80中任一项所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约13％与约25％、约13％与约24.5％、约13％与约24％、约13％与约23.5％、约13％与约23％、约13.5％与约25％、约13.5％与约24.5％、约13.5％与约24％、约13.5％与约23.5％、约13.5％与约23％、约14％与约25％、约14％与约24.5％、约14％与约24％、约14％与约23.5％、约14％与约23％、约14.5％与约25％、约14.5％与约24.5％、约14.5％与约24％、约14.5％与约23.5％、约14.5％与约23％、约15％与约25％、约15％与约24.5％、约15％与约24％、约15％与约23.5％、约15％与约23％、约15.5％与约25％、约15.5％与约24.5％、约15.5％与约24％、约15.5％与约23.5％、或约15.5％与约23％之间的S2G2F的相对丰度。
83.根据权利要求50至80中任一项所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约18.1％与约22.9％、约15.4％与约20％、约15.4％与约22.9％之间的S2G2F的相对丰度。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述S2G2F的相对丰度为约18.5％。
85.根据权利要求50至84中任一项所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约18％与约36％之间的S2G2F的相对丰度。
86.根据权利要求50至84中任一项所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约18％与约36％、约18％与约35.5％、约18％与约35％、约18％与约34.5％、约18％与约34％、约18％与约33.5％、约18.5％与约36％、约18.5％与约35.5％、约18.5％与约35％、约18.5％与约34.5％、约18.5％与约34％、约18.5％与约33.5％、约19％与约36％、约19％与约35.5％、约19％与约35％、约19％与约34.5％、约19％与约34％、约19％与约33.5％、约19.5％与约36％、约19.5％与约35.5％、约19.5％与约35％、约19.5％与约34.5％、约19.5％与约34％、约19.5％与约33.5％、约20％与约36％、约20％与约35.5％、约20％与约35％、约20％与约34.5％、约20％与约34％、约20％与约33.5％、约20.5％与约36％、约20.5％与约35.5％、约20.5％与约35％、约20.5％与约34.5％、约20.5％与约34％、或约20.5％与约33.5％之间的S2G2F的相对丰度。
87.根据权利要求50至84中任一项所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约23.2％与约33.8％、约20.8％与约32.6％、或约20.8％与33.8％之间的S2G2F的相对丰度。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述S2G2F的相对丰度为约23.5％。
89.根据权利要求50至88中任一项所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约2％与约8％之间的S1G3F的相对丰度。
90.根据权利要求50至88中任一项所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约2％与约8％、约2％与约7.5％、约2％与约7％、约2％与约6.5％、约2％与约6％、约2％与约5.5％、约2.5％与约8％、约2.5％与约7.5％、约2.5％与约7％、约2.5％与约6.5％、约2.5％与约6％、约2.5％与约5.5％、约3％与约8％、约3％与约7.5％、约3％与约7％、约3％与约6.5％、约3％与约6％、约3％与约5.5％、约3.5％与约8％、约3.5％与约7.5％、约3.5％与约7％、约3.5％与约6.5％、约3.5％与约6％、约3.5％与约5.5％、约4％与约8％、约4％与约7.5％、约4％与约7％、约4％与约6.5％、约4％与约6％、或约4％与约5.5％之间的S1G3F的相对丰度。
91.根据权利要求50至88中任一项所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约4.4％与约5.6％、或约4.0％与约5.5％之间的S1G3F的相对丰度。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述S1G3F的相对丰度为约4.6％。
93.根据权利要求50至92中任一项所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约0.5％与约4％之间的S1G3F的相对丰度。
94.根据权利要求50至92中任一项所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约0.5％与约4％、约0.5％与约3.5％、约0.5％与约3％、约0.5％与约2.5％、约1％与约4％、约1％与约3.5％、约1％与约3％、或约1％与约2.5％之间的S1G3F的相对丰度。
95.根据权利要求50至92中任一项所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn108(T7)处，并且包括在约1.4％与约2.2％、约1.1％与约1.9％、或约1.1％与约2.2％之间的S1G3F的相对丰度。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述S1G3F的相对丰度为约1.8％。
97.根据权利要求50至96中任一项所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约0.5％与约4％之间的S2G4F的相对丰度。
98.根据权利要求50至96中任一项所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约0.5％与约4％、约0.5％与约3.5％、约0.5％与约3％、约0.5％与约2.5％、约1％与约4％、约1％与约3.5％、约1％与约3％、或约1％与约2.5％之间的S2G4F的相对丰度。
99.根据权利要求50至96中任一项所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖位于残基Asn76(T5)处，并且包括在约1.9％与约2.4％、约1.4％与约2.1％、或约1.4％与约2.4％之间的S2G4F的相对丰度。
100.根据权利要求99所述的方法，其中所述S2G4F的相对丰度为约2.3％。
101.根据权利要求32-100中任一项所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖是唾液酸，并且具有从约8至约11的NANA的摩尔比。
102.根据权利要求32-100中任一项所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖是唾液酸，并且具有从约8.3至约11、从约9.5至约10.1、或从约8.3至约10.1的NANA的摩尔比。
103.根据权利要求102所述的方法，其中所述NANA的摩尔比为约10.0。
104.根据权利要求32-103中任一项所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖是唾液酸，并且具有从约0.1至约2.0的NGNA的摩尔比。
105.根据权利要求32-103中任一项所述的方法，其中所述一种或多种N-连接的聚糖是唾液酸，并且具有从0.90至约1.20、或从约0.3至约1.2的NGNA的摩尔比。
106.根据权利要求105所述的方法，其中所述NGNA的摩尔比为约1.0。
107.根据权利要求32至106中任一项所述的方法，其中所述糖基化谱是经由N-连接的碳水化合物谱释放方法分析的。
108.根据权利要求107所述的方法，其中所述糖基化谱包括一种或多种去唾液酸化聚糖(结构域I)、单唾液酸化聚糖(结构域II)、二唾液酸化聚糖(结构域III)和/或三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)。
109.根据权利要求108所述的方法，其中所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有从约28至约37、从约29至约32、从约28至约32或从约29至约37的摩尔比。
110.根据权利要求109所述的方法，其中所述去唾液酸化聚糖(结构域I)具有约31的摩尔比。
111.根据权利要求108-110中任一项所述的方法，其中所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有从约26至约28、从约27至约33、从约26至约33、从约27至约28的摩尔比。
112.根据权利要求111所述的方法，其中所述单唾液酸化聚糖(结构域II)具有约27的摩尔比。
113.根据权利要求108-112中任一项所述的方法，其中所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有从约27至约28、从约22至约31、从约27至约31或从约22至约28的摩尔比。
114.根据权利要求113所述的方法，其中所述二唾液酸化聚糖(结构域III)具有约27.4的摩尔比。
115.根据权利要求108-114中任一项所述的方法，其中所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有从约13至约16、从约8至约16或从约8至约16的摩尔比。
116.根据权利要求115所述的方法，其中所述三唾液酸化和四唾液酸化聚糖(结构域IV+V)具有约14.6的摩尔比。
117.根据权利要求31-116中任一项所述的方法，其中所述糖基化谱包括一种或多种O-连接的聚糖。
118.根据权利要求31-117中任一项所述的方法，其中所述糖基化谱不包括多于一个的半乳糖-α-1,3-半乳糖(α-gal)连接。
119.根据权利要求35-118中任一项所述的方法，其中所述CTLA4包含C末端赖氨酸。
120.根据权利要求119所述的方法，其中所述C末端赖氨酸包括约20％至约25％的相对丰度。
121.根据权利要求119所述的方法，其中所述C末端赖氨酸包括约3％至约10％的相对丰度。
122.根据权利要求117所述的方法，其中所述O-连接的聚糖位于残基Ser129、Ser130、Ser136和/或Ser139处。
123.根据权利要求1-122中任一项所述的方法，其中所述生物反应器包括包含葡萄糖或半乳糖的补料培养基。
124.根据权利要求1至123中任一项所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
125.根据权利要求124所述的方法，其中所述细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
126.根据权利要求125所述的方法，其中所述细胞是CHO-K1细胞、CHO-DXB11细胞或CHO-DG44细胞。
127.一种分析CTLA4-Fc融合蛋白的双触角聚糖的方法，所述方法包括测量与所述CTLA4蛋白中的一个或多个天冬酰胺残基附接的一种或多种N-连接的聚糖，其中所述双触角聚糖中的一种是G2F。
128.根据权利要求127所述的方法，其中所述双触角聚糖选自G0F、G1F、G2F、S1G1F、S1G2F和/或S2G2F。
129.根据权利要求127或128所述的方法，其中经由超高效液相色谱-荧光检测(UPLC-FLR)测量所述双触角聚糖。
130.根据权利要求127至129中任一项所述的方法，其中经由HILIC N-连接的聚糖谱分析方法测量所述双触角聚糖。
131.根据权利要求127至129中任一项所述的方法，其中在所述测量之前切割所述CTLA4-Fc融合蛋白的Fc结构域。
132.一种分析CTLA4-Fc融合蛋白的双触角聚糖的方法，所述方法包括对所述CTLA4-Fc融合蛋白进行等电聚焦。
133.根据权利要求132所述的方法，其中所述等电聚焦是成像毛细管等电聚焦。
134.根据权利要求132或133所述的方法，其中所述等电聚焦的CTLA4-Fc融合蛋白形成组I、组II和组III。
135.根据权利要求134所述的方法，其中组I小于或等于总量的4％，组II大于或等于总量的87％，和/或组III小于或等于总量的10％。
136.一种通过根据权利要求1至131中任一项所述的方法产生的细胞。
137.根据权利要求136所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
138.根据权利要求137所述的细胞，其中所述细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
139.根据权利要求138所述的细胞，其中所述细胞是CHO-K1细胞、CHO-DXB11细胞或CHO-DG44细胞。
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