CN116903738A - 一种低甘露糖型抗人肿瘤坏死因子-α单抗及其用途 - Google Patents
一种低甘露糖型抗人肿瘤坏死因子-α单抗及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116903738A CN116903738A CN202210919694.3A CN202210919694A CN116903738A CN 116903738 A CN116903738 A CN 116903738A CN 202210919694 A CN202210919694 A CN 202210919694A CN 116903738 A CN116903738 A CN 116903738A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- monoclonal antibody
- alpha
- tnf
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 title claims abstract description 81
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 title claims abstract description 74
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 title claims abstract description 68
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 5
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 5
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 4
- 239000012526 feed medium Substances 0.000 claims description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- 206010054094 Tumour necrosis Diseases 0.000 claims description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 claims description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 claims 1
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 claims 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims 1
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 abstract description 29
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 abstract description 12
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 abstract description 5
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 110
- 229960002964 adalimumab Drugs 0.000 description 44
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 34
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 32
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 31
- 239000000047 product Substances 0.000 description 24
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 23
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 23
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 21
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 21
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 13
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 13
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 13
- 229940090044 injection Drugs 0.000 description 13
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 13
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 13
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 12
- 229960003082 galactose Drugs 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 9
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 9
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 9
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 9
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 6,7-dimethyl-3-[[methyl-[2-[methyl-[[1-[3-(trifluoromethyl)phenyl]indol-3-yl]methyl]amino]ethyl]amino]methyl]chromen-4-one;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C=1OC2=CC(C)=C(C)C=C2C(=O)C=1CN(C)CCN(C)CC(C1=CC=CC=C11)=CN1C1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 7
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 7
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 6
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 6
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 6
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical group CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 5
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 5
- 238000013368 capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate analysis Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 4
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 4
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 4
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 4
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 229940048921 humira Drugs 0.000 description 4
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 4
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 4
- 229940125645 monoclonal antibody drug Drugs 0.000 description 4
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 4
- -1 neu5 Gc) Chemical compound 0.000 description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- AQHHHDLHHXJYJD-UHFFFAOYSA-N propranolol Chemical compound C1=CC=C2C(OCC(O)CNC(C)C)=CC=CC2=C1 AQHHHDLHHXJYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 description 3
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 3
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 3
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 2
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 206010016717 Fistula Diseases 0.000 description 2
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 2
- 206010023203 Joint destruction Diseases 0.000 description 2
- FDJKUWYYUZCUJX-UHFFFAOYSA-N N-glycolyl-beta-neuraminic acid Natural products OCC(O)C(O)C1OC(O)(C(O)=O)CC(O)C1NC(=O)CO FDJKUWYYUZCUJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001111421 Pannus Species 0.000 description 2
- 201000001263 Psoriatic Arthritis Diseases 0.000 description 2
- 208000036824 Psoriatic arthropathy Diseases 0.000 description 2
- 206010043189 Telangiectasia Diseases 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 102100033732 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Human genes 0.000 description 2
- LFTYTUAZOPRMMI-UHFFFAOYSA-N UNPD164450 Natural products O1C(CO)C(O)C(O)C(NC(=O)C)C1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 LFTYTUAZOPRMMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 2
- 229940098941 adalimumab injection Drugs 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000010370 cell cloning Methods 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000003890 fistula Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003780 keratinization Effects 0.000 description 2
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 125000000311 mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 210000001595 mastoid Anatomy 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960003712 propranolol Drugs 0.000 description 2
- 229940116176 remicade Drugs 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 230000009450 sialylation Effects 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 208000009056 telangiectasis Diseases 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- KPAIBEKNDBAQDX-AKKDPBBWSA-N (4S,5R,6R)-5-amino-2,4-dihydroxy-3-(2-hydroxyacetyl)-6-[(1R,2R)-1,2,3-trihydroxypropyl]oxane-2-carboxylic acid Chemical compound C(CO)(=O)C1C(C(O)=O)(O)O[C@H]([C@@H]([C@H]1O)N)[C@H](O)[C@H](O)CO KPAIBEKNDBAQDX-AKKDPBBWSA-N 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 102100032487 Beta-mannosidase Human genes 0.000 description 1
- 206010051728 Bone erosion Diseases 0.000 description 1
- 101100013695 Caenorhabditis elegans fut-8 gene Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000000503 Collagen Type II Human genes 0.000 description 1
- 108010041390 Collagen Type II Proteins 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 208000009386 Experimental Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000035519 G0 Phase Effects 0.000 description 1
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 description 1
- 102100039847 Globoside alpha-1,3-N-acetylgalactosaminyltransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 102000051366 Glycosyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000887519 Homo sapiens Globoside alpha-1,3-N-acetylgalactosaminyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N L-methionine (R)-S-oxide Chemical compound C[S@@](=O)CC[C@H]([NH3+])C([O-])=O QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N L-methionine sulphoxide Natural products CS(=O)CCC(N)C(O)=O QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 101710099301 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 102100029193 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Human genes 0.000 description 1
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 1
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010031099 Mannose Receptor Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101100425758 Mus musculus Tnfrsf1b gene Proteins 0.000 description 1
- 241000204003 Mycoplasmatales Species 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-LUWBGTNYSA-N N-acetylneuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)CC(O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-LUWBGTNYSA-N 0.000 description 1
- FDJKUWYYUZCUJX-AJKRCSPLSA-N N-glycoloyl-beta-neuraminic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@](O)(C(O)=O)C[C@H](O)[C@H]1NC(=O)CO FDJKUWYYUZCUJX-AJKRCSPLSA-N 0.000 description 1
- SUHQNCLNRUAGOO-UHFFFAOYSA-N N-glycoloyl-neuraminic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(NC(=O)CO)C(O)CC(=O)C(O)=O SUHQNCLNRUAGOO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FDJKUWYYUZCUJX-KVNVFURPSA-N N-glycolylneuraminic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O[C@](O)(C(O)=O)C[C@H](O)[C@H]1NC(=O)CO FDJKUWYYUZCUJX-KVNVFURPSA-N 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000718529 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) Alpha-galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 101710187743 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Proteins 0.000 description 1
- LFTYTUAZOPRMMI-NESSUJCYSA-N UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosamine Chemical compound O1[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C)[C@H]1O[P@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 LFTYTUAZOPRMMI-NESSUJCYSA-N 0.000 description 1
- LFTYTUAZOPRMMI-CFRASDGPSA-N UDP-N-acetyl-alpha-D-glucosamine Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C)[C@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 LFTYTUAZOPRMMI-CFRASDGPSA-N 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 206010000269 abscess Diseases 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- KBGAYAKRZNYFFG-BOHATCBPSA-N aceneuramic acid Chemical compound OC(=O)C(=O)C[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO KBGAYAKRZNYFFG-BOHATCBPSA-N 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- NNISLDGFPWIBDF-MPRBLYSKSA-N alpha-D-Gal-(1->3)-beta-D-Gal-(1->4)-D-GlcNAc Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC(=O)C)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 NNISLDGFPWIBDF-MPRBLYSKSA-N 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000002917 arthritic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 108010055059 beta-Mannosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000025084 cell cycle arrest Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000013373 clone screening Methods 0.000 description 1
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 210000002777 columnar cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000008094 contradictory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011443 conventional therapy Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000000556 factor analysis Methods 0.000 description 1
- 239000006052 feed supplement Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 239000005338 frosted glass Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000012637 gene transfection Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 108700014210 glycosyltransferase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000002503 granulosa cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000001969 hypertrophic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 229960000598 infliximab Drugs 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 1
- 238000012917 library technology Methods 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001868 liquid chromatography-fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940099607 manganese chloride Drugs 0.000 description 1
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 1
- 150000002704 mannoses Chemical class 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 239000012514 monoclonal antibody product Substances 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000000865 mononuclear phagocyte system Anatomy 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- HNQXDLYBFNWFEE-VHZSLYHRSA-N n-[(2r,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r)-2-acetamido-5-[(2r,3s,4s,5r,6r)-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)-3,4-bis[[(2r,3s,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy]oxan-2-yl]oxy-1-oxo-4-[(2s,3s,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl] Chemical compound O([C@H]([C@H](C=O)NC(=O)C)[C@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H](CO[C@@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](O[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1NC(C)=O HNQXDLYBFNWFEE-VHZSLYHRSA-N 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 210000001316 polygonal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000003291 riboses Chemical class 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
- C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
- C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
Abstract
本发明属于生物领域,涉及一种抗人肿瘤坏死因子‑α抗体的制备方法和用途。本发明是为了提高抗人肿瘤坏死因子‑α单抗的治疗效果,针对市场上单抗药物中存在较高比例的高甘露糖(Man5、Man6)N‑糖基化的事实,筛选出一种较低甘露糖含量的单抗,降低单抗在人体使用后抗药抗体产生的可能性,延长单抗的生物半衰期。
Description
技术领域
本发明属于生物领域,涉及一种抗人肿瘤坏死因子-α抗体的制备方法和用途。
背景技术
自从上世纪末OKT3这种鼠源性单克隆抗体(单抗)制剂被批准用于人体器官移植治疗之后,单克隆抗体药物已成为各国药品生产企业进行新药研究开发的主战场,目前经各国政府主管机构批准上市的单克隆抗体、Fc融合蛋白质药物及其衍生品已接近百种,单克隆抗体药物也从本世纪初的鼠源抗体、嵌合抗体逐渐发展成了包含人源化抗体、人源抗体、双特异性抗体、三特异性抗体、抗体偶联药物等众多成员的大家庭,这其中以来源于人IgG1 亚类的抗体为主。
1998年FDA批准抗TNF-α分子的嵌合体单抗,英夫利西单抗(Infliximab,商品名Remicade,类克)与甲氨喋呤(MTX)联用治疗对MTX治疗反应不佳的中度至重度的活动性类风湿关节炎病人,可减轻体征和症状,抑制结构损伤恶化和改善体力功能。Remicade 还适用于治疗对常规治疗反应不佳的中度至重度的活动性克罗恩氏(Crohn)病,减轻体征和症状并且引起和维持临床的改善。以及治疗瘘管性克罗恩氏病,减少肠-皮肤和直肠-阴道瘘管有分泌物瘘管数,并且保持瘘管闭合。2004年12月FDA批准其治疗活动性强直性脊柱炎(AS)减轻体征和症状。2005年8月批准治疗银屑病关节炎减轻活动性关节炎的体征和症状。2005年9月批准治疗对常规治疗反应不佳的中度至重度的结肠炎,减轻体征和症状,达到临床缓解和粘膜愈合,以及取消皮质激素的使用。2006年5月17日中国SFDA批准类克在中国上市。
2002年12月31日和2003年9月8日美国FDA和欧洲共同体先后批准雅培(Abbott)公司的第一个人单抗Adalimumab(阿达木单抗,商品名Humira,中文译名:修美乐)上市。治疗对一种以上DMARDs反应不佳的成人中度及重度严重活动性类风湿关节炎病人,减轻病人的体征和症状及抑制关节结构损伤的恶化进展。Humira可单独使用或与MTX或其它 DMARDs合用。2005年10月批准治疗患银屑病关节炎的病人,以减轻活动性关节炎的体征和症状。阿达木单抗是首个来源于人源噬箘体库技术获得抗TNF-α单抗,其恒定区部分来源于人IgG1。
IgG1是人体血清中含量最高的一种抗体,也是人体内发挥免疫作用的最重要的抗体类型。抗体的糖基化是抗体发挥生物功能不可缺少的,不同来源的细胞其表达的重组蛋白质的糖基化的类型也不相同,不同的培养条件也会明显的影响抗体的糖基化类型。
人血清IgG的N-糖基化位点位于Fc片段CH2区的通用序列(Asn297-X-Ser/Thr,X是除脯氨酸的任意氨基酸残基),糖基通过酰胺键与抗体共价结合。抗体的糖基化通常为复杂的双天线糖型,有的还可能具有分支N-乙酰葡糖胺结构。经典的单抗通常由两条重链和两条轻链组成,一般在两条重链的297位或邻近的谷氨酰胺残基上具有N-糖修饰,通过酰胺键与N-糖的非还原端N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)连接。两个N-乙酰葡萄糖胺和3个甘露糖(Man)组成N-糖的核心五糖结构,其还原端若再加和两个N-乙酰葡萄糖胺则为G0;G0 基础上非还原端加和一个半乳糖(Gal)则为G1,G1有两种异构体,分别为α-1,6臂和α-1,3- 臂,若加和两个半乳糖则为G2;若加和核心岩藻糖(Fuc)则分别为G0F、G1F、G2F。半乳糖非还原端还可加和唾液酸(Sia)或者半乳糖,其中唾液酸可分为乙酰神经氨酸 (N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac)和羟乙酰神经氨酸(N-glycolylneuraminic acid,Neu5Gc)两种,半乳糖则通过α-1,3键连接,此末端半乳糖简称为α半乳糖(α-gal)。N-糖的复杂型结构如下所示。此外还有高甘露糖型和杂合型结构。
Fc上N-糖末端可能包含0、1或2个末端Gal残基(G0、G1或G2),末端Gal含量通过增加抗体和C1q的结合力增加CDC效应,但不影响抗体和FcγRIIIa的结合,所以对 ADCC活性没有影响。Gramer等[Biotechnol Bioeng,2011,108:1591-1602]通过流加培养方式对GS-CHO进行发酵,通过调节尿嘧啶、氯化锰和半乳糖的浓度,可使单抗的半乳糖末端水平明显升高。另外Fc上含高甘露糖型N-糖单抗的CDC效应也减弱,其机制可能为高甘露糖型N-糖末端不含半乳糖[Zhou Q,Shankara S,Roy A,et al.Biotechnol Bioeng,2008,99: 652-665]。近些年来也有文献报道高唾液酸修饰的糖基可通过影响抗体空间构象而延长半衰期。
甘露糖受体可结合糖蛋白末端的甘露糖,结合后可通过内吞作用介导糖蛋白的降解而降低糖蛋白的半衰期。有文献[Goetze AM,Liu YD,Zhang Z,et al.Glycobiology,2011,21:949-959.Alessandri L,Ouellette D,Acquah A,et al.MAbs,2012, 4:509-52026]证明含高甘露糖型的N-糖单抗的半衰期明显缩短,但是同时有文献[Chen X, LiuYD,Flynn GC,et al.Glycobiology,2009,19:240-249]证明高甘露糖型N-糖由于被血清中的甘露糖酶降解,所幸的是高甘露糖型单抗占比较少,因此一般情况下,它并不是单抗半衰期缩短的主要原因。虽然已发表的文献中有矛盾的表述,但是主流观点仍然是高甘露糖型可缩短单抗的半衰期或具有稍强的免疫原性,所以在制造人用单克隆抗体药物的过程中应注意对单抗高甘露糖型比例的控制,毕竟高甘露糖型的单抗不是大家所喜好的类型。
高甘露糖型对Fc聚糖的异质性程度影响较为显著,常见的末端甘露糖基团包括Man5GlcNAc2、Man6GlcNAc2、Man7GlcNAc2、Man8GlcNAc2、Man9GlcNAc2。研究表明高甘露糖型的单抗分子与C1q的亲和力较低,其CDC活性也较低[Kanda Y,Yamada T, Mori K,etal.Glycobiology,2007,17(1):104-118];高甘露糖型对单抗的药代动力学性质影响较大,大量文献报道高甘露糖型IgG分子在人血循环中具有较短的半衰期。FUT-8突变的CHO细胞生产的高甘露糖型和杂合型的IgG较复合型具有较高的清除速率。高甘露糖型结构在人体中容易引起免疫原性。有文献[Durocher Y,Butler M.Curr Opin Biotechnol,2009, 20(6):700-707]报道酵母、昆虫细胞、植物来源的糖蛋白多为高甘露糖型,在人体中易引起高免疫原性而被清除掉。抗体中带有寡聚甘露糖的较无寡聚甘露糖的具有显著的免疫原性[Lam JS,Mansour MK,Specht CA,et al.J Immunol,2005,175(11):7496-7503]。
虽然多数抗体药物中高甘露糖水平较低(一般低于10%),但仍需要密切关注产品可能引起的免疫原性。细胞株和生产工艺的变化常伴随着甘露糖含量的变化。鉴于高甘露糖型 N-糖对单抗产品的活性、药代动力学性质、免疫原性都具有重要影响,末端甘露糖的糖型和含量一般应被视为单抗产品的关键质量属性之一。在细胞克隆阶段筛选出低甘露糖表达的细胞株可能是生产出低免疫原性长半衰期的单克隆抗体药物提供了较好的基础。在后续的细胞培养阶段,也可以通过对培养条件的调控,来降低高甘露糖型单抗的占比,从而降低单抗的免疫原性。
抗体的糖基化是一种复杂的翻译后修饰,对单抗药物的疗效、稳定性、免疫原性、药代动力学性质等具有重要影响。一般情况下公认的糖基化修饰如核心岩藻糖、唾液酸、高甘露糖水平等均被认为是产品的关键质量属性。
鉴于N-聚糖结构对抗体功能的重要影响,生产工艺中应严格控制糖型种类、比例和含量。细胞株、培养基、培养工艺都可能影响单抗产品的糖基化修饰水平。
不同宿主细胞由于内质网和高尔基体中糖基转移酶和糖苷酶配置不同,其表达的单克隆抗体的糖基化修饰一般都存在差异。单抗生产常用的均为哺乳动物细胞,包括CHO、BHK、HEK 293、PER.C6等细胞,以及鼠骨髓瘤细胞NS0、SP2/0、Y0等。CHO细胞是最常用的宿主细胞,主要是因为其基因组及扩增的稳定性较好,而且糖基化修饰稳定且类似于人的细胞系。NS0细胞则由于可以添加α-1,3半乳糖和Neu5Gc而不是 Neu5Ac,导致其表达产物在人体中引起较高的免疫原性,目前使用的越来越少。宿主细胞对单抗的质量有重要的影响,应选择合适的宿主细胞进行单抗药物的研究开发。
细胞的培养方式可以影响糖基化的种类和水平。有研究表明,从分批培养变更为分批补料式培养,即使补料成分不变,糖基化修饰有明显不同。而培养方式不变,只是规模扩大,一般不会影响糖基化水平。
无血清培养基在单抗产品中已经得到广泛应用,然而与有血清培养相比,培养时间延长,更易造成糖基化的多样性和复杂性。培养基中的糖类等营养成分作为糖基化组成的结构片段或能量的来源,能够显著影响糖基化的异质性,分批补料培养方式可以在一定程度上保持糖含量的稳定,因此有利于糖基化水平的保持。有研究证明培养基中糖含量提高后,CHO等细胞表达的抗体分子中相应的糖基化修饰和唾液酸化水平均得到提高。低糖培养时,细胞将优先利用培养基中的糖满足能量需求,分配到糖基化修饰相应减少,分批补料培养基中去掉糖成分会导致了副产物的积累,减低了目标产物的糖基化水平。Mn2+是高尔基体中β-1,4- 糖基转移酶的辅因子,无血清培养基中Mn2+与氨基酸成分的加入会造成更高的糖基化和唾液酸化[Zhang Y,Wang PG,Brew K.J Biol Chem,2001,276(15):11567-11574]。Mn2+自身并不足以造成最大程度的糖基化,必须与核糖类、半乳糖或尿苷类协同作用。另外有研究发现,当用半乳糖等其他糖类替代培养基中的葡萄糖,且Mn2+含量较高时容易造成高甘露糖型修饰[Surve T,Gadgil M.Biotechnol Prog,2015,31(2):460-467]。单糖在核糖存在时可以促进低聚糖天线形成,且核糖的存在对于糖型种类有重要影响。尿苷可以促进核糖合成,因此单糖、核糖、尿苷都可以影响产品的糖基化,进一步影响产品的质量。
培养温度是影响细胞生长和产物质量的重要因素之一。应该明确的是,对细胞生长最适合的温度不一定适合重组蛋白生产。较低的培养温度(30~35℃)可以导致细胞周期阻滞在G0/G1期,具有最强的细胞活力和最低凋亡,表达产物的mRNA水平也较高。但较低温度时,细胞内的UDP-GlcNAc和UDP-GalNAc降低,糖分支合成酶水平下降,可能造成未成熟的糖基化修饰结构出现[Sou SN,Sellick C,Lee K,et al.Biotechnol Bioeng, 2015,112(6):1165-1176]。
溶氧、pH值、游离氨、渗透压都可以影响抗体糖基化修饰的结构和水平。溶氧可能通过影响糖酵解途径或重链间二硫键的形成造成空间位阻进而影响到糖基化。氨或pH值可能通过影响细胞高尔基体内酶活性进而影响抗体糖基化修饰。渗透压常与培养基成分、pH值等因素联合影响糖基化水平。细胞培养是一个极为复杂的过程,众多因素都可以影响目标产物蛋白质的糖基化修饰,往单因素的变化也会引起多因素的协同作用。
阿达木单抗为全世界第一个抗人TNF-α的全人源单克隆抗体。TNF-α是一种在炎症和免疫应答中自然出现的细胞因子,在RA患者的滑膜液中TNF-水平升高,在病理性炎症和关节破坏方面具有重要作用。阿达木单抗可与TNF-α特异性结合,并阻断其与细胞表面TNF受体p55(TNFR-1)和p75(TNFR-2)的相互作用。体外实验发现在有补体存在的情况下,阿达木单抗也可溶解表面有TNF-α表达的细胞。阿达木单抗不与淋巴毒素(TNF-β)结合或使之失活。阿达木单抗还对由TNF诱导或调节的生物应答起调控作用,使造成白细胞位移的粘连分子水平发生改变。
阿达木单抗是全球第一个人源抗体药物,其抗体的氨基酸序列来源于人源抗体噬菌体库,是非跨种属来源的抗体,其分子结构中不含任何非人类蛋白的结构,是已上市抗体中安全性最好的抗体药物,同时也是目前各种TNF-α拮抗剂中副作用最小的生物制剂,因此研究开发仿制及生产Humira是开发TNF-a抗体药物的最优选择。阿达木单抗(Adalimumab,Humira) 在美国及中国的专利有效期到2016年2月9日(专利号为US6090382,US6509015),在中国的专利申请号为97193635.8(申请日期为1997年2月10日,优先权日期1996年2 月9日),阿达木单抗中N-聚糖中高甘露糖型的抗体占比约5%~10%,尽管与其它已上市的单抗药物相比,这一比例占比不高,但毕竟不是研究人员、医生、患者所喜欢的最佳类型,高甘露糖的单抗的免疫原性较强,容易刺激人体的免疫系统产生抗体,形成免疫复合物后被人体的网状内皮系统主动的清除,导致药物的半衰期变短。
本发明旨在通过在细胞克隆阶段筛选出一些较低高甘露糖N-糖型的单抗,为后续生产较低高甘露糖含量的单克隆抗体药物提供较好的保证。2010年初我们从ATCC购买了CHO K1细胞,以此为基础进行了无血清培养驯化、克隆建立了CHO K1 S4细胞株,该细胞株可在CD CHO培养基中高密度繁殖。CHO K1 S4细胞在CD CHO培养基或CD optiCHO培养基中悬浮培养时的密度可以达到5~9×106cells/ml,补料培养时,细胞密度可以达到 1~3×107cells/ml,显微镜下观察,细胞多为单个细胞存在,圆球形,边缘光滑无凸起,形态大小均一,直径约11微米,细胞之间无聚集。无菌试验合格、支原体检测阴性。CHO K1 S4 细胞株为我们公司进行基因工程抗体和重组蛋白质的研究奠定了坚实的基础。
与阿达木单抗相比,本发明所获得的抗TNF-α单抗的重链N-糖基化位置一致,二者的主要糖基化类型均为G0F,约占70%,次要糖基化类型为G1F(G1F'),占比20%以上,阿达木单抗约为15%,阿达木单抗含M5+M6(容易诱发人体产生抗体的N-聚糖类型),约占 5%~8%,本发明的单抗几乎不含这两种糖型,仅有少部分批次有检出,含量均低于1%;其它各项试验结果均证实二者高度一致。
以下我们将通过具体的实施例说明我们在CHO K1 S4细胞株上开发较低高甘露糖型抗 TNF-α单克隆抗体的获取过程。
发明内容
本发明的目的在于提供一种低甘露糖型抗人肿瘤坏死因子-α单抗。
本发明是为了提高抗人肿瘤坏死因子-α单抗的治疗效果,针对市场上单抗药物中存在较高比例的高甘露糖(Man5、Man6)N-糖基化的事实,筛选出一种较低甘露糖含量的单抗,降低单抗在人体使用后抗药抗体产生的可能性,延长单抗的生物半衰期。
本发明所述的单抗,由含214氨基酸的轻链和451氨基酸的重链构成,该抗体结构如下:
轻链氨基酸的序列为(下划线部分为抗体的可变区氨基酸序列):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLK SGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
重链氨基酸的序列为(下划线部分为抗体的可变区氨基酸序列):
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRF TISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
本发明所述的单抗,该单抗以悬浮培养的CHO K1 S4细胞作为表达载体,该单抗重链CH2的N-聚糖具有极低的高甘露糖糖型。
本发明所述的单抗,当使用商品化的化学成分限定培养基培养时,其N-聚糖中高甘露糖M5+M6的占比不超过到2%。
本发明所述的单抗,当使用商品化的化学成分限定培养基及补料培养基培养时,其N-聚糖中高甘露糖M5+M6的占比不超过到2%
本发明所述的单抗当使用商品化的化学成分限定培养基及特殊补料培养基培养时,其N-聚糖中高甘露糖M5+M6的占比不超过到1%
本发明所述的单抗为液体制剂。
本发明所述的单抗,其药理学作用与阿达木单抗一致,可用于自身免疫学疾病如类风湿关节炎、斑块型银屑病等疾病的治疗。
本发明的另一个目的在于提供低甘露糖型抗人肿瘤坏死因子-α单抗的制备方法。
本发明的单抗的制备方法,包括以下步骤:
本发明将含有抗人肿瘤坏死因子-α单抗轻链、重链基因的表达质粒线性化;将基因电转染到CHO K1 S4细胞,挑选高表达TNF-α单抗且含甘露糖低的克隆,建立稳定的细胞株,选择化学成分限定培养基培养,经多步骤液相层析纯化后,得到抗肿瘤坏死因子-α单抗。
所获得的表达产物TNF-α单抗中高甘露糖糖基的含量低于1%,该单抗与阿达木单抗的结合活性一致,可以阻断TNF-α与TNFR1/TNFR2的结合。
本发明所用CHO K1 S4细胞株来源于美国ATCC的CHO K1细胞。
本发明的目的在于提供低甘露糖型抗人肿瘤坏死因子-α单抗的药物应用。
本发明的单抗在制备治疗自身免疫学疾病的药物中的应用。
本发明的单抗在制备治疗类风湿关节炎、斑块型银屑病等疾病的药物中的应用。
本发明进一步提供含有本发明抗体的药物组合物。所述的药物组合物,可以制成液体制剂,也可以制成冻干制剂,可以使用持续性输液泵持续给药,也可采用脉冲形式的输液泵定时给药,推荐使用静脉内给药,也可以采用皮下注射给药。
本发明的单抗相对于已有的单抗,有益效果主要表现在以下方面:
目前市场上已有抗人肿瘤坏死因子的多种单克隆抗体,如阿达木单抗、类克等,这些单抗的N-聚糖中含有一定比例的高甘露糖糖型,占比一般为5%~10%,高甘露糖型的单抗具有较高的免疫原性,人体使用时容易产生抗药抗体,缩短其在人体的体内半衰期。
本发明从基因转染后的CHO K1 S4细胞的阳性克隆中筛选出了数株可稳定表达低甘露糖含量单抗的细胞株,所获得的两个克隆株表达的抗人TNF-α单抗中高甘露糖Man5、Man6的含量占比均小于1%。这种低甘露糖含量的单抗均有较低的免疫原性,在人体使用后降低抗药抗体的产生率,有利于延长单抗的在人体内的生物半衰期,降低自身免疫性疾病的治疗费用。
对于说明书中出现的英文缩写、简写,在此作进一步解释、说明:
pCZ11-TNFα:为含有TNF-α单抗轻链、重链基因的表达质粒
300ml LB+Amp:为用于大肠杆菌培养含氨苄青霉素的培养基
TE缓冲液:为10mM Tris-EDTANa2缓冲液(pH8.0)
CHO细胞:中国仓鼠卵巢细胞
CHO-K1-S4:中国仓鼠卵巢细胞K1 S4株
CD-CHO:CHO细胞用化学成分限定培养基
MSX:蛋氨酸亚砜
TMB:3,3',5,5'-四甲基联苯胺。
附图说明
图1、抗TNF-α单抗的SEC-HPLC色谱图
图2、TNF-α单抗还原型毛细管电泳(CE-SDS)图谱
图3、TNF-α单抗还原型毛细管电泳(CE-SDS)图谱
图4、TNF-α单克隆抗体和阿达木单抗糖型检测所得色谱图
A为TNF-α单克隆抗体,B为阿达木单抗
图5、抗人TNF-α单抗、阿达木单抗阻断rhTNF-α与TNFR-1受体结合的剂量反应曲线
图6、TNF-a单抗、阿达木单抗阻断rhTNF-α与TNFR-2受体结合的剂量反应曲线
具体实施方式
通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明,但不作为限制使用。
实施例1将目的基因导入CHO细胞
1、目的基因质粒的线性化
pCZ11-TNFα#3质粒为本公司已构建的含抗人TNF-α单克隆抗体轻链、重链基因的表达质粒,将含上述质粒的DH5α大肠杆菌接种在至含有300ml LB+Amp培养基的1000ml的三角瓶(湿热灭菌后),37℃,225rpm振荡培养过夜。将细菌培养物从37℃摇床中取出,置于250ml的离心桶(湿热灭菌)中,13000rpm离心15min,然后根据大提质粒试剂盒(北京博迈德)说明书进行操作,获得质粒pCZ11-TNFα共2ml。用Pvu I内切酶酶切质粒pCZ11-TNFα (37℃,12小时),线性化后进行0.7%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察,回收线性化片段。直线化质粒TNF-α-IgG-1浓度为1470μg/ml,纯度为1.81,使用无菌TE缓冲液将其稀释至 400μg/ml,分装至1.5ml离心管中,-70℃冻存备用。
2、线性质粒电转染CHO K1 S4细胞与稳定表达细胞的筛选
(1)准备细胞:将处于对数生长期的驯化好的悬浮培养的CHO细胞CHO-K1-S4800rpm离心10分钟,丢弃上清,用含2mM Glutamax(GIBCO公司的谷氨酰胺)的CD-CHO培养基重悬,调整密度为5×105cells/ml,置于37度,5%CO2的振摇培养箱中135rpm培养24小时后备用;测定细胞密度保证细胞处于对数生长期(1-1.2×106cells/ml),取足够量的细胞800rpm离心10分钟,丢弃上清,用无Glutamax的CD-CHO培养液清洗一遍,尽可能去除上清;用CD CHO溶液重悬细胞,调整细胞密度为1-2×107cells/ml,在每个电击杯中加入 100μl的细胞重悬液;
(2)电转染:将线性化并乙醇沉淀的表达质粒(TNF-α-IgG-1)取2μg加入3个电击杯中,轻轻振荡混匀;将电击杯放入电转染仪器中,电击结束后立即取出,加入1ml的CD-CHO培养基重悬,并立即转入50ml无菌的离心管中;
(3)培养:在电击后的细胞悬液中加入含1%DFS的CD-CHO培养基,调整细胞密度为1×105cells/ml,按每孔100μl接入2个96孔板中,每个电击杯接种2块板。置于37℃、5% CO2培养箱中静置培养;24小时后,在每孔中加入含1%DFS、100μM MSX的CD-CHO培养基100ul,MSX的终浓度为50μM,置于37℃、5%CO2培养箱中静置培养;
(4)克隆:2周后开始用倒置显微镜观察克隆生长情况,细胞转染后约三周,克隆覆盖面积大多接近1/3,在剔除了明显的多克隆孔后,从两个电击杯转染孔中分别挑出了50和46 个孔。
ELISA检测阳性克隆:用碳酸盐包被液稀释TNF-α抗原溶液至2μg/ml,每孔100μl包被96孔酶标板,1%BSA封闭,将从单克隆细胞孔中取出的培养上清稀释50倍后加入酶标板中,每孔100μl,然后再加入HRP-标记的羊抗人IgG,加入TMB显色剂显色,用MK3 酶标仪读取结果,选择A450值大于0.700的孔,共选择出9各孔,分别将孔内的细胞移入 24孔板继续培养,培养液中含50μM MSX。
备份及扩大培养:细胞在24孔中培养3天后,从孔中吸出100μl细胞悬液转入6孔板或T25培养瓶中,继续保持50μM的MSX选择压力。待细胞生长到足够密度,及时冻存半数体积的细胞,之后根据ELISA的结果及糖型测定的结果决定进行亚克隆的细胞株。将T25 瓶内剩余细胞转到T125摇瓶内,加入30ml CD CHO培养基,培养7天后离心除掉细胞,上清经Mabselect Sure凝胶亲和层析纯化,纯化后的单抗经PBS透析过夜,之后再经DEAE -Sepharose 4FF和Eshmuno S纯化,获得高纯度的抗TNF-α单克隆抗体进行糖型的检测(实施例2、实施例3)
实施例2 SEC-HPLC检测单抗纯度
我们使用的TSK G3000SWxL色谱柱采用分子排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC)对抗TNF-α单克隆抗体的分子大小变异体进行分析。
亲水分子排阻色谱柱,TSK G3000SWxl,7.8×300mm,粒度5μm,流动相为含0.1mol/L Na2SO4的0.1mol/L磷酸盐缓冲液,pH 6.7;将待检品依照蛋白质含量稀释至10mg/ml,加样量20μl,在波长280nm处检测。按面积归一化法(岛津LC solution V1.0)计算抗TNF-α单克隆抗体纯度(单体含量)。图1为抗TNF-α的SEC-HPLC色谱图。
表1是6个克隆的抗TNF-α单克隆抗体的初步纯化产物和3个批次的阿达木单抗的测定结果。
表1、抗TNF-α单抗纯度测定结果(SEC-HPLC)
实施例3、单抗毛细管电泳纯度测定
在还原和非还原条件下,对我们初步纯化的6个克隆株来源的抗TNF-α单克隆抗体与多批次市售阿达木单抗进行纯度测定。
用纯化水分别将待检单抗样品和阿达木单抗样品稀释至蛋白质含量为25mg/ml。分别取稀释后的样品8μl于200μl离心管中,加入5μlβ-巯基乙醇,87μl样品缓冲液(含1%SDS 的100mmol/L Tris-HCl,pH8.3),涡旋混匀,即为还原型电泳样品。分别取稀释后的样品8μl 于200μl离心管中,加入5μl 250mmol/L碘乙酰胺,87μl样品缓冲液(含1%SDS的100mmol/L Tris-HCl,pH8.3),涡旋混匀,即为非还原型电泳样品。在70℃水浴中加热10分钟,常温水浴冷却到室温。分别移取处理后样品90μl,加入250μl样品瓶中待测。采用CE7100型毛细管电泳仪,未涂层熔融毛细管柱(内径50μm),总长33cm,有效长度24.5cm;背景缓冲液为SDS凝胶缓冲液;电动进样,-5KV进样20秒;分离电压为-16.5KV,升压时间为1分钟;220nm(4nm带宽)检测吸光值。采用OpenLAB分析软件按面积归一化法分析图谱。图2为TNF-α单抗还原型毛细管电泳(CE-SDS)图谱,图3为TNF-α单抗还原型毛细管电泳(CE-SDS)图谱。
表2、单抗注射液纯度测定结果(CE-SDS)
实施例4、单抗的N-糖基化测定
应用液相色谱荧光检测与质谱联用(LC/FLR/MS)方法,对2AB标记的抗TNF-α单克隆抗体与阿达木单抗注射液N-多糖进行检测。
通过PNGaseF酶解来释放抗体上的N-多糖糖链,然后对游离的N-多糖进行2-AB荧光标记,再用LC/FLR/MS方法采集数据,并使用GU标准品所得标准曲线对所得各个糖型的GU值进行分析,结合二级质谱对抗体的糖基化修饰进行结构分析及确认。
UPLC参数:
流动相A:100mmol/L甲酸铵溶液(pH 4.5);流动相B:乙腈;
色谱柱:ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide Column,2.1mm×150mm,1.7μm;激发波长: 330nm,发射波长:420nm;柱温:40℃;样品盘温度:10℃;
样品进样体积:5μl,标准品进样体积:2μl;流速:0.200ml/min,运行时间:60min;程序:0-3min 72%B,48min 62%B,49-54min 20%B,55-60min 72%B。
质谱参数:ESI模式:正离子MS(+);
灵敏度模式:毛细管电压:3kV,锥孔电压:30V,offset:40V
脱溶剂气(N2)流速:800L/h,脱溶剂气温度:350℃,源温度:120℃
质量扫描范围(m/z):700~2000。
在MassLynx软件界面上,点击开始按钮,设备自动运行样品队列,采集数据。使用UNIFI Portal软件进行数据分析。将三次采集所得GU标准品保留时间取平均值,选择曲线类型为5次方程得到标准曲线,使用此标准曲线对样品的GU值进行计算,得到各个糖型。
图4是抗TNF-α单克隆抗体、阿达木单抗糖型检测的色谱图。通过对6个克隆来源的单抗的分析结果表明,抗TNF-α单抗和阿达木单抗的主要糖型相似,均为无唾液酸修饰的双天线结构,主要糖型均为G0F,次主要糖型为G1F、G2F。阿达木单抗中造成抗体免疫原性的高甘露糖(M5+M6)糖型比例以及无岩藻糖修饰的糖型比例分别高出5%左右。
将各种糖型分别按照无唾液酸修饰、无岩藻糖修饰、双天线、单天线结构及高甘露糖进行糖型统计,即:Non-Sialylated Glycans、De-Fucosylated Glycans、Antennary1Glycans、 Antennary 2Glycans、High Mannose Glycan。由表3可见,抗TNF-α单抗与阿达木单抗糖型中无唾液酸修饰的糖型结果一致,均大于99.5%;我们克隆的抗TNF-α单抗糖型中无岩藻糖修饰的糖型含量约为5%左右,小于阿达木单抗糖型中无岩藻糖修饰的糖型含量(11%左右);阿达木单抗中的高甘露糖糖型(Man5、Man6)占较高比例,约6%左右,而我们克隆的单抗中高甘露糖型占比多数低于1%,高甘露糖型均为无岩藻糖修饰的,高甘露糖型含量百分比的差别是造成我们的抗TNF-α单抗、阿达木单抗无岩藻糖修饰糖型含量差别的主要因素。抗TNF-α单抗糖型中双天线型核心结构所占比例为95%左右,大于阿达木单抗中双天线型核心结构所占比例(85%左右),此差异是由于阿达木单抗中高甘露糖型和单天线型核心结构以及未统计的M3、M4所占比例较高造成的。我们克隆的6株单抗的糖型中M5所占比例均不到1%,且6个克隆来源的抗TNF-α单抗样品中均未检测到M6;阿达木单抗糖型中失掉一个N-乙酰葡糖胺的G0F-GlcNAc所占比例在4%左右,高于我们的6个克隆的TNF-α单抗中所占比例(1%左右)。
表3抗TNF-α单抗和阿达木单抗N-多糖糖型结果
表4抗TNF-α单克隆抗体和阿达木单抗糖型统计表
实施例5、表达克隆株的亚克隆
对从实施例1至实施例4的检测筛选出的2个相对高表达的克隆(CZ015、CZ502)进行亚克隆。
当两个克隆细胞株在24孔中培养到覆盖约1/3~1/2孔时,取出部分细胞用无MSX的 CD CHO重悬洗涤,显微镜计数,之后取出约100个细胞,用60ml无MSX的CD CHO培养基重悬,均匀加入3个96孔板中。每孔加入200μl细胞悬液,平均每孔1/3个细胞。37℃、 5%CO2静置培养。静置3小时后细胞已经完全沉降,显微镜下仔细逐孔观察,在细胞未分裂前挑选出单克隆孔并标记出编号,每个亚克隆至少挑选出16个单克隆孔,2周后开始在显微镜下观察单克隆孔细胞生长情况,待覆盖面积超过1/3,及时进行ELISA检测和转孔。
稳定高表克隆亚克隆孔的ELISA筛选和转孔:培养3周后,已做标记的单细胞克隆孔内的细胞均覆盖了约1/3以上的孔底面积,取出部分上清并进行100稀释后,用包被有TNF-α的酶标板进行检测,MK-3酶标仪读数。可以看出,所有的单克隆孔均为阳性,而且均达到了较高的A450值(0.571~1.786),根据值的差异,从两株细胞亚克隆中我们分别挑选了一个单克隆孔转入24孔板(0.75ml CD-CHO),并逐步扩大培养评价其真实表达水平。
经过两轮的克隆筛选及传代培养试验,我们筛选出了两株能稳定分泌表达抗TNF-α单克隆抗体的细胞株(SC1302、SC2203),两株细胞均能在长达140天的传代培养期间稳定的表达抗体,传代培养期间细胞的形态、生长特性、抗体基因拷贝数、抗体表达量等基本保持恒定。我们公司使用此类培养基进行克隆、传代建立的细胞株,已经完全适应该培养基中的培养条件,在CD CHO培养基中培养的细胞均可以达到0.7~1.5×107cells/ml。
以上两个亚克隆细胞株经T250摇瓶在36.5℃、5%CO2、135RPM条件下扩大培养,从离心后的上清中经ProteinA亲和层析后获得TNF-α单抗,对单抗的N-糖基化进行测定,所表达的糖型与上代的保持一致。
实施例6抗人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体亲和常数测定
采用ELISA法测定抗人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体对TNF-α的亲和常数。以100ng/ml的重组人TNF-α包被96孔酶标板,封闭后加入预先稀释的参比品(阿达木单抗注射液)和抗人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体供试品,3倍稀释共稀释11个稀释度;反应一定的时间后加入稀释好的羊抗人Fc-HRP结合物,最后TMB显色及终止。用酶标仪读取A450值,选用四参数方程为回归模型得出参比品和供试品的EC50值,计算参比品和供试品的亲和常数。
单克隆抗体亲和常数的计算公式为:K=[Ag·Ab]/[(Ag)·(Ab)]。其中[Ag·Ab]为根据四参数方程计算出的EC50值所对应抗原-抗体复合物的摩尔浓度,在此用EC50对应的抗体浓度代替 (等摩尔浓度);(Ag)为固相包被抗原(重组人TNF-α的浓度);(Ab)为反应体系中抗体浓度接近饱和时的最低浓度(一般按A450≈2.000)进行计算。根据试验结果选择吸光值最接近2.0的对应抗体浓度是能够全部中和包被的TNF-α所需最低浓度;通过四参数方程曲线得到的EC50值表示中和1/2TNF-α的抗人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体结合位点的浓度,即抗原-抗体复合物的浓度。单克隆抗体的亲和常数越小表示抗体与抗原的结合力越强,表5展示的为阿达木单抗和三个批次的抗人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体对TNF-α相对亲和常数,从测定的数据可以看出,其亲和常数是一致的。
表5、三批次抗人TNF-a单抗和阿达木单抗亲和常数测定结果
实施例7、抗人TNF-α单抗阻断rhTNF-α与TNFR-1/TNFR-2的结合活性
抗体具有阻断一定浓度的rhTNF-α与人TNFR-1/TNFR-2结合反应的能力,以往的试验中我们发现100ng/ml浓度的rhTNF-α已经使酶标检测仪的读数达到上限值,本试验即是在酶标板上分别包被500ng/ml的TNFR-1、TNFR-2重组蛋白质,之后用BSA封闭;用于测定100ng/ml的rhTNF-α-biotin与系列浓度稀释后的抗人TNF-α单抗、阿达木单抗反应60分钟之后,再加入到包被有TNFR-1、TNFR-2重组蛋白的酶标板中,反应60分钟之后,加入 HRP-Avidin反应60分钟,之后用TMB显色,终止显色后450nm测定吸光值,采用SPSS19 软件计算抗人TNF-α单抗阻断100ng/ml TNF-α与人TNFR-1/TNFR-2受体结合降低50%的摩尔浓度(IC50)。
抗人TNF-α单抗阻断50%的rhTNF-α与TNFR-1受体结合的浓度为86.5ng/ml(95%CI: 6.7-317.4)、85.3ng/ml(95%CI:6.3-312.1);阿达木阻断50%的rhTNF-α与TNFR-1受体结合的浓度为104.3ng/ml(95%CI:11.9-376.0)、104.9ng/ml(95%CI:12.9-378.9);抗人TNF-α单抗 IC50对应的摩尔浓度为0.58nM/L,阿达木抗体IC50对应的摩尔浓度为0.70nM/L,二者基本一致。
抗人TNF-α单抗阻断50%的rhTNF-α与TNFR-2受体结合的浓度为162.3ng/ml(95%CI: 11.8-621.9)、161.5ng/ml(95%CI:11.5-620.8);阿达木阻断50%的rhTNF-α与TNFR-2受体结合的浓度为193.1ng/ml(95%CI:15.9-708.7)、188.4ng/ml(95%CI:15.7-688.4);抗人TNF-α单抗IC50对应的摩尔浓度为1.09×10-9M/L,阿达木单抗IC50对应的摩尔浓度为1.30×10-9M/L,二者基本一致。
实施例8、抗人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体生物学活性测定
抗人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体生物学活性测定采用体外细胞培养测定法进行测定。
人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对鼠结缔组织L细胞株929克隆(L929细胞) 具有抑制作用,而抗人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体可以特异性中和TNF-α,进而相对L929细胞生长起到间接保护作用。采用一定细胞密度的L929细胞悬液加入至96孔细胞培养板中培养,待其在孔内长成单层细胞后备用;将固定蛋白质浓度的TNF-α与系列稀释的抗人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体共同加入至培养液中进行反应后,再移入长成单层细胞的96孔板中培养;因为系列稀释的抗人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体可以不同程度中和培养液中的TNF-α,故可以观察到不同K3单抗稀释度的孔中L929细胞存活数量不同,加入高剂量TNF-a单抗孔中活细胞数量多,加入低剂量TNF-a单抗孔中活细胞数目少。将孔内细胞培养液弃去,用结晶紫染液对孔内活细胞染色一定时间,加入脱色液后将细胞板置于酶标仪上读取各孔吸光值(630nm),各孔吸光值同孔内染色的细胞数成线性关系,即同加入的TNF-a单抗量呈线性关系,采用四参数方程计算TNF-a单抗ED50值,以判定抗人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体的生物学活性。
1、L929细胞铺板
取L929细胞1瓶,吸出瓶内培养液,加入0.25%胰酶消化细胞,待细胞面呈磨砂玻璃状后,向瓶中加入含5%新生小牛血清的199细胞培养液,用吹打管反复吹打细胞生长附着一面的瓶内壁,使细胞脱落并分散均匀,进行细胞计数。依据细胞数量加入适量的培养液,调整细胞密度为3.5×105细胞/ml,用多道移液器将细胞悬液加入至96孔细胞板中(第1列各孔不加细胞悬液),每孔100μl。盖好板盖将其置于37℃、5%CO2孵箱内培养,记录细胞代次。待各孔内细胞生长为单层后进行测定。
2、供试品测定
2.1溶液配制
2.1.1细胞培养液A配制
取199培养液95ml,向其中加入5.0ml新生牛血清,为细胞培养液A。
2.1.2细胞培养液B配制
取细胞培养液A 20.0ml,向其中加入放线菌素D(2000μg/ml)溶液10μl混匀后备用。溶液中放线菌素D含量为1.0μg/ml。
2.1.3含TNF-α细胞培养液B配制
自-70℃取出冻存的TNF-α(5.0μg/ml)1支,将其同细胞培养液B 650μl混合均匀后,TNF-α浓度为500ng/ml;再用适宜数量的细胞培养液将其稀释至2~5ng/ml备用,本溶液每次实验需现用现配。
2..2供试品稀释
依据供试品蛋白质浓度,用含TNF-α细胞培养液B将其稀释至400ng/ml备用。
2.3参比品稀释自-70℃取出冻存的参比品,用含TNF-α细胞培养液B将其稀释至400ng/ml备用。
2.4抗原-抗体反应
2.4.1加含TNF-α细胞培养液B
取无菌96孔细胞板,向1~10列各孔中加入含TNF-α的细胞培养液B,100μl/孔;
2.4.2加供试品及参比品
向96孔板的A3、A4、A5、A6孔内加入浓度为400ng/ml的参比品100μl/孔,向A7、A8、A9、A10孔内加入待检的K3单抗溶液100μl/孔,用多道移液器将A3~A10孔内液体混匀后,吸出100μl加入至对应的B3~B10孔中,混合均匀后吸出100μl加入至对应的C3~C10孔中,依此方法倍比稀释至H3~H10孔,混合均匀后吸出100μl弃去,参比品及待检的K3 单抗样品均作4个复孔,8个稀释度。
2.4.3加细胞培养液B对照及细胞培养液A对照
向96孔板的第11列各孔中加入细胞培养液B(不含TNF-α)100μl/孔;向第12列各孔中加入细胞培养液A 100μl/孔;
2.4.4抗原-抗体反应
将96孔板盖子盖好,置于振荡器上将孔内液体混匀,置于室温温育30分钟,使溶液中K3 单抗中和溶液中的TNF-α抗原。
2.5 L929细胞培养自孵箱内取出长成单层的L929细胞板,弃去各孔内培养液,将室温温育30分钟后的96 孔板各孔内液体对应移入L929细胞板各孔中。盖好板盖将细胞板置于37℃、5%CO2孵箱内培养。
2.6染色
培养18~24小时后,将96孔细胞板从孵箱中取出,弃去孔内培养液,每孔内加入100μl 0.02mol/L PBS轻轻晃动清洗去除死亡的细胞。然后向每孔内加入0.1%结晶紫染液50μl,置于37℃孵箱中30分钟。弃去孔内染液,并用流水清洗孔内残存染液,注意避免流水直接冲刷细胞表面。向各孔内加入100μl脱色液,待染料溶解完全后酶标仪读数。
2.7读数
开启酶标仪,设定单波长测定,波长630nm;以96孔板第1列未加入L929细胞各孔吸光均值为空白校正后,测定各孔吸光值。
2.8结果判定
2.8.1实验成立条件
采用Ascent Software软件,回归模型为四参数方程,以参比品、供试品浓度的对数为横坐标,同一稀释度复孔吸光值均值为纵坐标求得四参数方程,R2值不低于0.90;
2.8.2结果计算
实验成立条件下,采用Ascent Software软件分别计算参比品、供试品的ED50值(ng/ml),以第11列细胞培养液B(不含TNF-α、不含单抗)培养细胞孔吸光值为ED100值计算。
2.9结果对比
以参比品的ED50值与供试品的ED50值的百分比表示供试品的生物学活性。抗人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体原液及成品的生物学活性应为参比品的80%~125%。表6为5批次的抗人 TNF-a单抗、阿达木单抗生物学活性测定的结果。二者的活性测定结果是一致的。
表6、抗人TNF-a单抗、阿达木单抗生物学活性测定
实施例9、斑块型银屑病动物模型药效学资料
(1)抗人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体注射液对已烯雌酚致小鼠银屑病研究
在本实验室条件下,抗人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体注射液对银屑病实验模型小鼠阴道上皮细胞有丝分裂有明显的抑制作用;对小鼠尾部表皮颗粒细胞生成具有明显的促进作用。
(2)抗人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体注射液对普萘洛尔致豚鼠银屑病的治疗作用
病理组织学检查:空白对照组豚鼠耳廓皮肤可见菲薄的角质层,颗粒层约 1-3层,棘层为多角形细胞,约3-7层,基底层为单层柱状细胞,真表皮交界呈波浪形,真皮内散在少数单个核细胞。模型对照组广泛角化过度及灶状角化不全,并见Munro脓肿,颗粒层变薄或消失,棘层肥厚,表皮突延伸呈棒状,真皮乳突上伸呈杵状改变,毛细血管扩张,血管周围可见较多单一核及多形核细胞浸润。治疗后角化过度减轻,角化不全消失,棘层变薄,表皮突延伸、乳突上伸、毛细血管扩张及炎细胞浸润明显减轻。
耳廓皮肤组织病理学评分,单因素方差分析结果:模型对照组与空白对照组相比有显著性差异,说明豚鼠造模成功;成模后豚鼠皮下注射不同剂量抗人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体注射液后,高(30mg/kg)、中(10mg/kg)剂量组皮肤组织学评分与模型对照组相比明显降低,说明抗人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体注射液皮下注射10~30mg/kg、每周给药2次,对普萘洛尔引起的豚鼠银屑病有一定的治疗作用。
实施例10、抗人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体注射液对DBA/I小鼠Ⅱ型胶原诱发关节炎模型研究
(1)实验药品基本信息
(2)试验动物
(3)观察指标及频率
白细胞(WBC)计数与分类百分比 实验结束时
细胞因子测定 实验结束时
组织病理学检查 实验结束时
(4)结果
1)WBC计数与分类百分比
小鼠处死前高剂量组和甲氨喋呤阳性对照组WBC计数明显高于空白对照组;联合用药组明显低于模型对照组。嗜中性粒细胞(NEU)百分比、淋巴细胞(Ly) 百分比:抗人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体注射液各剂量组、阳性对照组、联合用药组及模型对照组NEU(%)、Ly(%)与空白对照组相比均有明显差异;高剂量组与模型对照组相比有明显差异。单核细胞(Mo)百分比:抗人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体注射液中、低剂量组,联合用药组和模型对照组与空白对照组相比有明显差异。嗜酸性粒细胞(Eos)百分比、嗜碱性粒细胞(Bas)百分比:低剂量组与空白对照组相比有明显差异,但无统计学意义。
小鼠处死前供试品中剂量组、甲氨蝶呤阳性对照组WBC与空白对照组相比有明显差异(p<0.05);供试品各剂量组WBC计数与联合用药组相比有明显差异(p<0.05),但与阳性对照组相比均无明显差异(p>0.05);供试品各剂量组、阳性对照组及联合用药组中性粒细胞(NEU)百分比、淋巴细胞(Ly)百分比与空白对照组相比有明显差异(p<0.05);供试品中剂量组、低剂量组、联合用药组及模型对照组单核细胞(Mo)与空白对照组相比有明显差异(p<0.05)。
2)细胞因子测定
表16-1小鼠关节炎模型给药后细胞因子水平
注:▼联合用药组为甲氨蝶呤+供试品中剂量;
★p<0.05,与模型对照组比较;◆p<0.05,与修美乐组比较;▽p<0.05与高剂量组相比;▼p<0.05, 与联合用药组比较;*p<0.05,与空白对照组比较;□p<0.05,与中剂量组比较;
3)组织病理学检查
表16-2小鼠关节炎模型给药后对小鼠组织病理学改变
注:联合用药组为甲氨蝶呤+供试品中剂量; ★p<0.05,与模型对照组比较;
实验结果显示,抗人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体注射液明显改善小鼠关节炎细胞浸润、血管翳形成、软骨和骨破坏等组织病理学改变。相比之下,作为风湿缓解病情阳性药物的甲氨喋呤,在本实验中虽也能抑制关节炎细胞浸润、血管翳形成,但对小鼠骨和关节的破坏以及关节局部未显示明显的改善作用。
本实验结果表明,抗人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体注射液能在一定程度延缓、阻断胶原诱导型小鼠关节的骨质侵蚀和破坏。
Claims (10)
1.一种低甘露糖型抗人肿瘤坏死因子-α单抗,其特征在于,由含214氨基酸的轻链和451氨基酸的重链构成,该抗体结构如下:
轻链氨基酸的序列为:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
重链氨基酸的序列为:
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISR DNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
2.根据权利要求1所述的抗体,其特征在于,该单抗以悬浮培养的CHO K1 S4细胞作为表达载体,该单抗重链CH2的N-聚糖具有极低的高甘露糖糖型。
3.根据权利要求1所述的抗体,其特征在于,当使用商品化的化学成分限定培养基培养时,其N-聚糖中高甘露糖M5+M6的占比不超过到2%。
4.根据权利要求1所述的抗体,其特征在于,当使用商品化的化学成分限定培养基及补料培养基培养时,其N-聚糖中高甘露糖M5+M6的占比不超过到2%。
5.根据权利要求1所述的抗体,其特征在于,当使用商品化的化学成分限定培养基及特殊补料培养基培养时,其N-聚糖中高甘露糖M5+M6的占比不超过到1%。
6.根据权利要求1所述的抗体,其特征在于,为液体制剂。
7.根据权利要求1所述的抗体在制备治疗自身免疫学疾病的药物中的应用。
8.根据权利要求1所述的抗体在制备治疗类风湿关节炎、斑块型银屑病等疾病的药物中的应用。
9.权利要求1所述的抗体的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
将含有抗人肿瘤坏死因子-α单抗轻链、重链基因的表达质粒线性化;将基因电转染到CHO K1 S4细胞,挑选高表达TNF-α单抗且含甘露糖低的克隆,建立稳定的细胞株,选择化学成分限定培养基培养,经多步骤液相层析纯化后,得到抗肿瘤坏死因子-α单抗。
10.含有权利要求1所述的抗体的药物组合物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210919694.3A CN116903738A (zh) | 2022-08-02 | 2022-08-02 | 一种低甘露糖型抗人肿瘤坏死因子-α单抗及其用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210919694.3A CN116903738A (zh) | 2022-08-02 | 2022-08-02 | 一种低甘露糖型抗人肿瘤坏死因子-α单抗及其用途 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116903738A true CN116903738A (zh) | 2023-10-20 |
Family
ID=88361435
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210919694.3A Pending CN116903738A (zh) | 2022-08-02 | 2022-08-02 | 一种低甘露糖型抗人肿瘤坏死因子-α单抗及其用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN116903738A (zh) |
Citations (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1215407A (zh) * | 1996-02-09 | 1999-04-28 | Basf公司 | 结合人TNFα的人抗体 |
WO2014125374A2 (en) * | 2013-02-13 | 2014-08-21 | Laboratoire Français Du Fractionnement Et Des Biotechnologies | Highly galactosylated anti-tnf-alpha antibodies and uses thereof |
WO2015073884A2 (en) * | 2013-11-15 | 2015-05-21 | Abbvie, Inc. | Glycoengineered binding protein compositions |
US20150344559A1 (en) * | 2014-05-28 | 2015-12-03 | Academia Sinica | Anti-tnf-alpha glycoantibodies and uses thereof |
WO2016019726A1 (zh) * | 2013-08-09 | 2016-02-11 | 北京天成新脉生物技术有限公司 | 低免疫原性抗TNF-α全人源单抗及其应用 |
WO2016110227A1 (zh) * | 2015-01-07 | 2016-07-14 | 上海张江生物技术有限公司 | 一种新型重组抗TNF-α嵌合单克隆抗体制备方法及用途 |
WO2016144773A1 (en) * | 2015-03-06 | 2016-09-15 | Abbvie Inc. | Arabinosylated glycoproteins |
CN107074945A (zh) * | 2014-05-27 | 2017-08-18 | 中央研究院 | 增进抗体功效的通用糖型的组合物及方法 |
CN110494164A (zh) * | 2018-02-11 | 2019-11-22 | 百奥泰生物制药股份有限公司 | 一种靶向治疗TNF-α相关疾病的人抗体制剂 |
WO2020224529A1 (zh) * | 2019-05-07 | 2020-11-12 | 北京天成新脉生物技术有限公司 | 低免疫原性低ADCC/CDC功能抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX060及其应用 |
CN112010970A (zh) * | 2020-10-30 | 2020-12-01 | 迈威(上海)生物科技股份有限公司 | 一种去除重组表达抗体聚体和降解产物的方法 |
-
2022
- 2022-08-02 CN CN202210919694.3A patent/CN116903738A/zh active Pending
Patent Citations (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1215407A (zh) * | 1996-02-09 | 1999-04-28 | Basf公司 | 结合人TNFα的人抗体 |
WO2014125374A2 (en) * | 2013-02-13 | 2014-08-21 | Laboratoire Français Du Fractionnement Et Des Biotechnologies | Highly galactosylated anti-tnf-alpha antibodies and uses thereof |
WO2016019726A1 (zh) * | 2013-08-09 | 2016-02-11 | 北京天成新脉生物技术有限公司 | 低免疫原性抗TNF-α全人源单抗及其应用 |
WO2015073884A2 (en) * | 2013-11-15 | 2015-05-21 | Abbvie, Inc. | Glycoengineered binding protein compositions |
CN107074945A (zh) * | 2014-05-27 | 2017-08-18 | 中央研究院 | 增进抗体功效的通用糖型的组合物及方法 |
US20150344559A1 (en) * | 2014-05-28 | 2015-12-03 | Academia Sinica | Anti-tnf-alpha glycoantibodies and uses thereof |
WO2016110227A1 (zh) * | 2015-01-07 | 2016-07-14 | 上海张江生物技术有限公司 | 一种新型重组抗TNF-α嵌合单克隆抗体制备方法及用途 |
WO2016144773A1 (en) * | 2015-03-06 | 2016-09-15 | Abbvie Inc. | Arabinosylated glycoproteins |
CN110494164A (zh) * | 2018-02-11 | 2019-11-22 | 百奥泰生物制药股份有限公司 | 一种靶向治疗TNF-α相关疾病的人抗体制剂 |
WO2020224529A1 (zh) * | 2019-05-07 | 2020-11-12 | 北京天成新脉生物技术有限公司 | 低免疫原性低ADCC/CDC功能抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX060及其应用 |
CN112010970A (zh) * | 2020-10-30 | 2020-12-01 | 迈威(上海)生物科技股份有限公司 | 一种去除重组表达抗体聚体和降解产物的方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101432301B (zh) | 具有增强的抗炎性和降低的细胞毒性特性的多肽以及相关方法 | |
US9328170B2 (en) | Method for preparing Fc containing polypeptides having improved properties | |
CA2455365C (en) | Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity | |
CA2799595C (en) | Method for preparing antibodies having improved properties | |
TWI408146B (zh) | 用於調節重組蛋白質之甘露糖含量之方法 | |
US20160215061A1 (en) | Fc CONTAINING POLYPEPTIDES HAVING INCREASED BINDING TO FcGammaRIIB | |
US10308970B2 (en) | Methods for controlling fucosylation levels in proteins | |
WO2013074598A1 (en) | Fc CONTAINING POLYPEPTIDES HAVING INCREASED ANTI-INFLAMMATORY PROPERTIES AND INCREASED FcRN BINDING | |
BRPI0716997A2 (pt) | Sistema de produção totalmente humano de rendimento elevado para proteínas e anticorpos melhorados | |
MX2010006537A (es) | Polipeptidos con propiedades antiinflamatorias mejoradas citotoxicas disminuidas y metodos relacionados. | |
JP2014532661A (ja) | 改善された特性を有する抗体を調製するための方法 | |
WO2019029713A1 (zh) | 一种由基因组被编辑的cho宿主细胞产生的具有独特糖谱的重组抗体及其制备方法 | |
US20230287101A1 (en) | Production of Biosimilar Ustekinumab in CHO Cells | |
BR112015007319B1 (pt) | Método de produção de um anticorpo igg1 | |
JP7216806B2 (ja) | アフコシル化抗体およびその製造法 | |
Wang et al. | The interplay of protein engineering and glycoengineering to fine‐tune antibody glycosylation and its impact on effector functions | |
Cruz et al. | Process development of a recombinant antibody/interleukin-2 fusion protein expressed in protein-free medium by BHK cells | |
WO2015073307A2 (en) | Fc CONTAINING POLYPEPTIDES HAVING INCREASED BINDING TO HUMAN DC-SIGN | |
WO2023104128A1 (zh) | 具有改变的糖基化修饰的Fc多肽 | |
CN116903738A (zh) | 一种低甘露糖型抗人肿瘤坏死因子-α单抗及其用途 | |
WO2017162733A1 (en) | Iga antibodies with enhanced stability | |
JP7292377B2 (ja) | アフコシル化抗体およびその製造法 | |
TW202010844A (zh) | 去岩藻醣基化抗體的製造方法 | |
TW202010842A (zh) | 去岩藻醣基化抗體及表現此抗體的細胞株 | |
Berger | Cell line development for and characterization of mono-and bivalent antibody derivatives |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |