TWI408146B - 用於調節重組蛋白質之甘露糖含量之方法 - Google Patents

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Description

用於調節重組蛋白質之甘露糖含量之方法
本發明係關於調節(例如，減少)甘露糖含量，具體而言係重組糖蛋白之高－甘露糖含量的方法。
高級真核生物可進行各種後轉譯修飾，包括甲基化、硫酸化、磷酸化、脂質添加及糖基化。此等修飾對於蛋白質功能具有極為重要的作用。分泌蛋白、膜蛋白及靶向囊泡或某些細胞內細胞器之蛋白可能會受到糖基化。
與N連接之糖基化係一種涉及向發現於蛋白質識別序列(例如，Asn－X－Ser/Thr)中之天冬醯胺殘基中添加寡聚糖的糖基化形式。與N連接之糖蛋白含有由甘露糖(Man)、半乳糖、N－乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)及神經胺酸構成之標準支鏈結構。蛋白質N－糖基化通常始於內質網(ER)中，其中組裝於長醇(一種脂質載體中間體)上之與N連接的寡聚糖(例如，Glc3 Man9 GlcNAc2 )被轉移至新生蛋白質之適宜的天冬醯胺(Asn)。此對於所有真核生物之與N連接的糖蛋白係一普通事件。主要有兩種與N連接之糖類：高－甘露糖寡聚糖及複合寡聚糖。
高－甘露糖寡聚糖通常包括2種具有許多(例如，大於4個)甘露糖殘基之N－乙醯基葡萄糖胺。之所以稱作複合寡聚糖，乃因其幾乎可含有任一數量之其他類別糖類，包括除2種初始N－乙醯基葡萄糖胺外之糖類。藉由兩種寡聚糖皆可在蛋白質之不同部分上糖基化該蛋白質。吾人認為一寡聚糖為高－甘露糖抑或複合體係取決於其至高爾基器(Golgi apparatus)中糖－修飾蛋白質之可達性。倘若該糖係相對難以接近的，則其最有可能保持其初始高－甘露糖形式。倘若該糖係可接近的，則可能情形為，許多甘露糖殘基會被切除並可藉由添加如上所討論其他類別基團來進一步修飾該糖。
在對蛋白質添加寡聚糖鏈後，藉助3種不同的酵素以固定順序移除3個葡萄糖殘基及1個甘露糖殘基。此事件發生於ER中且其係蛋白質可轉運至Golgi以便進一步加工之信號。在ER中加工後，形成高－甘露糖型寡聚糖。藉由ER中之特異性葡糖苷酶及α－1,2－甘露糖酶移除3個葡萄糖殘基及1個特異性α－1,2－連接之甘露糖殘基，此形成核心低聚糖結構Man8 GlcNAc2 。具有此核心糖結構之蛋白質被轉運至高爾基器，在其中對該糖部分進行各種修飾。
在哺乳動物細胞中，視糖鏈被添加至的蛋白質部分而定，可藉由3種不同的路經對糖鏈進行修飾。3種不同的路經係：(1)不改變核心糖鏈；(2)藉由對核心糖鏈中甘露糖之6－位添加存於UDP－N－乙醯基葡萄糖胺(UDP－GlcNAc)中之N－乙醯基葡萄糖胺－1－磷酸酯部分(GlcNAc－1－P)，繼而移除GlcNAc部分以形成糖蛋白之酸性糖鏈來改變該核心糖鏈；或(3)首先，藉由使用甘露糖酶I移除3個甘露糖殘基而將該核心糖鏈轉化成Man5 GlcNAc2 ；藉由添加GlcNAc並移除另外2個甘露糖殘基，繼而依次加入GlcNAc、半乳糖(Gal)及N－乙醯基神經胺酸(亦稱作唾液酸(NeuNAc))進一步修飾Man5 GlcNAc2 以形成各種雜合體或複雜糖鏈(R.Kornfeld及S.Kornfeld,Ann.Rev.Biochem.54：631－664(1985)；Chiba等人，J.Biol.Chem.273：26298－26304(1998))。
重組蛋白質之寡聚糖含量可影響治療用糖蛋白之安全性及功效。因此，用於控制此等糖蛋白之寡聚糖含量，尤其是甘露糖含量之方法係有益的。
糖蛋白組合物(尤其是治療用抗體)之高甘露糖含量可顯著影響此等蛋白質在治療應用期間的安全性及功效。不受限於具體理論，事實表明：因(例如)巨噬細胞及樹突狀細胞上之甘露糖受體之緣故，自循環清除高－甘露糖糖蛋白較清除其低甘露糖對應體更快。另外，預計高甘露糖糖蛋白具有更大免疫原性。因此，人們期望生成具有低甘露糖含量之治療用糖蛋白，例如，治療用抗體。
本發明者藉由提供用於調節(例如，控制或減少)以重組方式生成的蛋白質及肽之甘露糖含量的方法來解決此項技術中之此需要。
本發明至少在一定程度上係基於可影響甘露糖含量，且具體而言係以重組方式表現的糖蛋白的高－甘露糖含量之因素的發現。
因此，在一態樣中，本發明提供一種調節在哺乳動物宿主細胞中生成的重組糖蛋白之甘露糖含量(即，在寡聚糖側鏈上)之方法，其係藉由操控細胞培養條件以便由該細胞生成之糖蛋白具有低甘露糖含量而實現。本文所用術語"低－甘露糖含量"係指糖蛋白組合物，其中該組合物中少於約10%、或少於約8%、或少於約5%(例如，約4%或更少)的糖蛋白具有4個以上甘露糖殘基(即，係M5或更大之種類)。本文所用術語"低－甘露糖含量"亦指糖蛋白組合物，其中少於約10%、少於約9%、少於約8%、少於約7%、少於約6%、少於約5%、少於約4%、少於約3%、少於約2%、少於約1%(或介於任何此等上述範圍之間的任何值)或甚至為0%。
在本發明之一實施例中，藉由將細胞培養環境保持在低滲透壓(例如，少於約600 mOsm/公斤或少於約500 mOsm/公斤或少於約400 mOsm/公斤，例如，介於約380至250 mOsm/公斤之間)下來達成低－甘露糖含量。此有利於具有低甘露糖－含量(即，糖蛋白之寡聚糖側鏈上具有4個或更少甘露糖殘基)之糖蛋白的細胞培養。因此，在一具體實施例中，本發明提供一種用於製備具有低－甘露糖含量之重組糖蛋白的方法，其包括：在一具有約600 mOsm/公斤或更低(例如，介於約200與600 mOsm/公斤之間，例如，約250與550 mOsm/公斤之間、約250與500 mOsm/公斤之間、約250與450 mOsm/公斤之間、約250與400 mOsm/公斤之間、約250與380 mOsm/公斤之間或約250與350 mOsm/公斤之間)之滲透壓的培養基中培養表現該糖蛋白之哺乳動物宿主細胞(例如，在培養之擴展期或生產期)。
可藉由操控許多細胞培養參數來達成上述滲透壓範圍，該等細胞培養參數包括但不限於該細胞培養基之鹽、維他命、糖、蛋白腖及胺基酸中的一或多種之濃度。因此，在一具體實施例中，本發明提供一種藉由下述來製備具有低－甘露糖含量之重組糖蛋白的方法：在一含有濃度為約70 mM或更低(例如，約10 mM至約50 mM)之鉀及/或濃度為約200 mM或更低(例如，約50 mM至約100 mM)之鈉的培養基中培養表現該糖蛋白之宿主細胞並將細胞培養物之滲透壓保持在約600 mOsm/公斤或更低。
在又一實施例中，本發明提供一種藉由下述來製備具有低－甘露糖含量之重組糖蛋白的方法：在一實質不含一或多種選自由丙胺酸、精胺酸、天冬胺酸及穀胺酸組成之群之胺基酸的培養基中培養表現該糖蛋白之宿主細胞並將細胞培養物之滲透壓保持在約600 mOsm/公斤或更低。
此外，在又一實施例中，該培養基可含有一或多種選自由下列組成之群且濃度為約0.00005克/公升至約0.9克/公升之維他命：生物素、D－泛酸鈣、氯化膽鹼、葉酸、i－肌醇、煙醯胺、鹽酸吡哆醛、鹽酸吡哆醇、核黃素、鹽酸硫胺素及氰鈷胺。在再一實施例中，該培養基包含濃度為約1 mM至約90 mM之葡萄糖。在另一實施例中，該培養基包含一或多種選自由下列組成之群且濃度為約0.5克/公升至約60克/公升之蛋白腖：酵母抽提物、酵母水解產物、大豆蛋白腖、大豆水解產物、小麥蛋白腖及小麥水解產物。
在本發明之又一實施例中，該細胞培養基可包含一或多種將滲透壓維持於期望水平(例如，約600 mOsm/公斤或更低)所需數量之滲透保護劑。適宜滲透保護劑為業內所瞭解且包括(例如)甜菜鹼、甘胺酸、L－蘇胺酸及L－脯胺酸及其衍生物(例如，甘胺酸甜菜鹼及甜菜鹼醛)。在一具體實施例中，滲透保護劑(例如，甜菜鹼)係以約20 mM或更大之濃度存於細胞培養基中。在具體實施例中，滲透保護劑(例如，甜菜鹼)係以約1 mM至約100 mM或以約20 mM至約30 mM之濃度存在。
可控制的其他細胞培養參數(單獨或與一或多個本文所述參數之組合)包括(例如)培養該等細胞所用溫度及時程。在某些實施例中，在約31℃至約38℃之溫度下培養表現重組糖蛋白之宿主細胞。在另一些實施例中，將表現重組糖蛋白之宿主細胞培養約5天至約14天。
用於表現本發明之重組糖蛋白的適宜宿主細胞為業內所熟知且包括任一彼等本文所述者，例如CHO細胞、淋巴細胞(例如，NSO細胞)及各種其他哺乳動物細胞。
本發明可用於製備如本文所述各種具有低－甘露糖含量之糖蛋白。在一具體實施例中，本發明用於製備具有低－甘露糖含量之重組單株抗體或其抗原結合片段。適宜抗體可包括(例如)鼠、嵌合、人源化及完全人源化抗體以及此項技術中已知之其他抗體形式。在另一具體實施例中，該抗體結合IL－15，其包括但不限於揭示於美國公開案第2003－0138421號中之抗體，該案件之全文以引用的方式併入本文中。在另一具體實施例中，該抗體係一結合IL－15之完全人源化單株抗體，其具有一包含SEQ ID NO：4中所示胺基酸序列之輕鏈可變區及/或一包含SEQ ID NO：2中所示胺基酸序列之重鏈可變區以及結合IL－15之同源序列(例如，分別具有約80、85、90、95%或更大的與SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：2之一致性的胺基酸序列)。在又一具體實施例中，該抗體係一結合IL－15之人類抗體或其抗原結合片段，其具有一包含一或多個SEQ ID NOs：8－10中所示互補決定區(CDRs)之輕鏈可變區及結合IL－15之同源序列(例如，分別具有約80、85、90、95%或更大的與任一SEQ ID NOs：8－10之一致性的胺基酸序列)；及一包含一或多個SEQ ID NOs：5－7中所示互補決定區(CDRs)之重鏈可變區以及結合IL－15之同源序列(例如，分別具有約80、85、90、95%或更大的與任一SEQ ID NOs：5－7之一致性的胺基酸序列)。在一具體實施例中，結合IL－15之人類單株抗體或其抗原結合片段包括一包含SEQ ID NOs：8－10中所示全部3個CDR之輕鏈可變區、及一包含SEQ ID NOs：5－7中所示全部3個CDR之重鏈可變區、或其保守胺基酸取代物。
在又一態樣中，本發明提供藉由本文所述方法製備的具有低－甘露糖含量之重組糖蛋白。因此，此等糖蛋白可包括任一上述治療用糖蛋白，例如抗體、激素、酵素、肽及其他糖蛋白。
本發明亦涵蓋包含具有低－甘露糖含量之任一上述糖蛋白的組合物。在一具體實施例中，該組合物係一種包含一具有低－甘露糖含量之經分離糖蛋白(例如，結合IL－15之經分離人類單株抗體或其抗原結合片段)及一醫藥上可接受之載劑的醫藥組合物。
因此，在再一態樣中，本發明提供一種藉由對受試者投與具有低－甘露糖含量之經分離IL－15抗體來治療或預防與人類IL－15過度表現有關的及/或其中下調或抑制受人類IL－15誘導之效應係有益之病症的方法。示例病症包括但不限於血管炎、乾癬、多發性硬化、類風濕性關節炎、炎症性腸病(例如，克隆氏病(Crohn's disease)或乳糜瀉)、同種異體移植物排斥、移植物抗宿主病、T－細胞淋巴瘤及T－細胞白血病。
因此，在再一態樣中，本發明提供一種藉由對受試者投與具有低－甘露糖含量之經分離IL－15抗體來治療或預防與人類IL－15過度表現有關的及/或其中下調或抑制受人類IL－15誘導之效應係有益之病症的方法。示例病症包括但不限於關節炎、結締組織疾病、眼科病、神經病、胃腸道及肝臟疾病、過敏性疾病、血液疾病、皮膚病、肺疾病、惡性腫瘤、移植引發的病症、內分泌疾病、血管疾病、婦科病及感染性疾病。
因此，人們期望製備具有低－甘露糖含量之治療用糖蛋白，例如治療用抗體。
為使本揭示內容更易於理解，首先對某些術語進行定義。其他定義於詳細陳述中給出。
I.定義
本文參照寡聚糖之常用命名法闡述碳水化合物部分。關於使用此命名法之碳水化合物化學的綜述參見(例如)Hubbard及Ivatt,Ann.Rev.Biochem.50：555－583(1981)中。此命名法包括(例如)表示甘露糖之Man；表示2－N－乙醯基葡萄糖胺之GlcNAc；表示半乳糖之Gal；及表示葡萄糖之Glc。參照簡化符號NeuNAc(5－N－乙醯基神經胺酸)及NeuNGc(5－乙醇醯基神經胺酸)闡述唾液酸。
本文所用術語"滲透壓"係指水性溶液中所溶解溶質粒子之滲透壓力的量度。該等溶質粒子包括離子型與非離子型分子二者。滲透壓表示為溶於1公斤溶液中之滲透活性粒子(即，滲透壓莫耳)的濃度(38℃下之1 mOsm/公斤H2 O等於19 mm Hg滲透壓力)。本文所用縮寫"mOsm"意指"毫滲透壓莫耳/公斤溶液"。在示例實施例中，係將細胞培養基之滲透壓保持在約600 mOsm/公斤或更低、或約550 mOsm/公斤或更低、或約500 mOsm/公斤或更低、或約450 mOsm/公斤或更低、或約400 mOsm/公斤或更低、或約380 mOsm/公斤或更低、或介於約200 mOsm/公斤與約600 mOsm/公斤之間、或介於約250 mOsm/公斤與約550 mOsm/公斤之間、或介於約250 mOsm/公斤與約500 mOsm/公斤之間、或介於約250 mOsm/公斤與約450 mOsm/公斤之間、或介於約250 mOsm/公斤與約400 mOsm/公斤之間、或介於約250 mOsm/公斤與約380 mOsm/公斤之間、或介於約250 mOsm/公斤與約350 mOsm/公斤之間。
本文所用術語"糖蛋白"係指具有至少一個包含甘露糖殘基之寡聚糖側鏈的肽及蛋白質，包括抗體。糖蛋白可與宿主細胞同源或可與所用宿主細胞異源(即，外源)，例如藉由中國倉鼠卵巢(CHO)宿主細胞生成之人類糖蛋白。此等糖蛋白通常稱作"重組糖蛋白"。在某些實施例中，藉由宿主細胞表現之糖蛋白直接分泌至培養基中。哺乳動物糖蛋白之實例包括下列分子及抵抗該等之抗體：細胞因子(例如，IL－1至IL－15)及其受體；趨化因子(例如TNF、TECK)及其受體(例如，TNFR、CCR9)；生長激素，包括人類生長激素及牛生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白；α－1－抗胰蛋白酶；胰島素A－鏈；胰島素B－鏈；前胰島素；促卵泡激素；降鈣素；黃體生成激素；胰高血糖素；凝血因子，例如VIIIC因子、IX因子、組織因子及血管假性血友病因子(von Willebrands factor)；抗－凝血因子，例如蛋白質C；心房利尿鈉因子；肺表面活性物質；血纖維蛋白溶酶原激活因子，例如尿激酶或人尿或組織型血纖維蛋白溶酶原激活因子(t－PA)；蛙皮素；凝血酶；造血生長因子；腦啡肽酶；RANTES(對正常活化之T－細胞表現及分泌進行調節)；人類巨噬細胞炎性蛋白(MIP－1－α)；血清白蛋白，例如人類血清白蛋白；苗勒氏(mullerian)抑制物；鬆弛素A－鏈；鬆弛素B－鏈；前鬆弛素；鼠絨促性素相關肽；微生物蛋白，例如β－內醯胺酶；去氧核糖核酸酶(DNase)；抑制素；活化素；血管內皮生長因子(VEGF)；激素或生長因子之受體；整合素；蛋白質A或D；類風濕因子；神經營養因子，例如骨源性神經營養因子(BDNF)、神經營養素－3、－4、－5或－6(NT－3、NT－4、NT－5或NT－6)、或神經生長因子(例如NGF－β)；血小板源生長因子(PDGF)；成纖維細胞生長因子，例如aFGF及bFGF；表皮生長因子(EGF)；轉化生長因子(TGF)，例如TGF－α及TGF－β，包括TGF－β1、TGF－β2、TGF－β3、TGF－β4或TGF－β5；胰島素樣生長因子－I及－II(IGF－I及IGF－II)；des(1－3)－IGF－I(腦IGF－I)、胰島素樣生長因子結合蛋白質；CD蛋白質，例如CD－3、CD－4、CD－8及CD－19；紅細胞生成素；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成蛋白(BMP)；干擾素，例如α－、β－及γ－干擾素；集落刺激因子(CSFs)，例如M－CSF、GM－CSF及G－CSF；介白素(ILs)，例如，IL－1至IL－15；超氧化物歧化酶；T－細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒性抗原，例如AIDS包膜之一部分；轉運蛋白；歸巢受體；及調節蛋白。
本文所用術語"細胞培養基"及"培養基"係指哺乳動物細胞生長所用營養素溶液，其通常含有至少一種選自一或多種下列類屬之組份：1)能源，經常呈碳水化合物(例如，葡萄糖)形式；2)所有必需胺基酸中之一或多種，且通常為基本的二十種胺基酸加半胱胺酸；3)所需低濃度維他命及/或其他有機化合物；4)游離脂肪酸；及5)痕量元素，其中痕量元素係定義為通常所需極低濃度之無機化合物或天然生成元素，其經常處於微莫耳範圍內。該營養素溶液視情況可補充有其他組份以使細胞生長達最佳。
本發明之哺乳動物細胞培養物係在適用於所培養具體細胞之培養基中製備。可用於培養具體細胞類別之適宜細胞培養基應為業內普通技術者所瞭解。示例市售培養基包括(例如)Ham's F10(SIGMA)、Minimal Essential Medium (MEM、SIGMA)、RPMI－1640(SIGMA)及Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM、SIGMA)。任一此等或其他適宜培養基可按照所需補充有激素及/或其他生長因子(例如，胰島素、鐵傳遞蛋白或表皮生長因子)、鹽(例如，氯化鈉、鈣鹽、鎂鹽及磷酸鹽)、緩衝液(例如，HEPES)、核苷(例如，腺嘌呤核苷及胸腺嘧啶脫氧核苷)、抗生素(例如，GentamycinTM )、痕量元素(定義為通常以微莫耳範圍之最終濃度存在之無機化合物)、脂質(例如，亞麻油酸或其他脂肪酸)及其適宜載體、及葡萄糖或一等效能源、及/或有利於生成具有低－甘露糖含量之重組糖蛋白的本文所述經改良物質。在一具體實施例中，該細胞培養基不含血清。
在某些實施例中，對細胞培養基進行最優化以便調節(例如，減少)由在該培養基所培養宿主細胞表現的重組糖蛋白之高－甘露糖含量。在一具體實施例中，該哺乳動物宿主細胞係CHO細胞且一適宜培養基含有一基於基礎培養基組份(例如DMEM/HAM F－12)之調配物，該調配物具有改良濃度之一或多種諸如胺基酸、鹽、糖、蛋白腖及維他命等組份，以便調節(例如，減少)由在此培養基中所培養CHO細胞表現的重組糖蛋白的高－甘露糖含量。
術語細胞培養物之"生長期"係指其中大部分細胞迅速分裂之指數細胞生長時期(即，對數增長期)。使細胞保持在生長期約1天、或約2天、或約3天、或約4天、或4天以上的時間。可根據(例如)細胞類別及細胞生長速率及培養條件來改變細胞保持在生長期之時程。
術語"過渡期"係指介於生長期與生產期間之時段。一般而言，過渡期係可控制培養條件以提供自生長期至生產期之轉變的時間。可控制的各種細胞培養參數包括但不限於溫度、滲透壓、維他命、胺基酸、糖類、蛋白腖、銨及鹽中的一或多個。
術語細胞培養物之"生產期"係指其中細胞生長趨於平穩之時間段。對數細胞生長通常在此時期之前或期間終止並開始生成蛋白質。需要補充細胞培養基以便在此階段達成期望蛋白質生成。
術語"哺乳動物宿主細胞"、"宿主細胞"及"哺乳動物細胞"係指源自哺乳動物且在置於含有適宜營養素及生長因子之培養基中進行單層培養或懸液培養時能夠生長並存活的細胞系。通常，此等細胞能夠表現並分泌大量的有用特定糖蛋白至培養基中。適宜哺乳動物宿主細胞之實例包括但不限於中國倉鼠卵巢細胞/－DHFR(Urlaub及Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77：4216(1980))；dp12CHO細胞(EP 307247)；經SV40轉化之猴子腎臟CV1細胞系(ATCC CRL 1651)；人類胚腎細胞系(適於在懸液培養中生長的亞選殖293或293細胞)(Graham等人，J.Gen Virol.,36：59(1977))；幼侖鼠腎細胞(ATCC CCL 10)；小鼠塞爾托利細胞(sertoli)細胞(TM4)(Mather,Bibl.Reprod.,23：243－251(1980))；猴子腎細胞(ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO－76)(ATCC CRL－1587)；人宮頸癌細胞(HeLa)(ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK)(ATCC CCL 34)；水牛鼠肝細胞(BRL 3A)(ATCC CRL 1442)；人肺細胞(W138)(ATCC CCL 75)；人肝細胞(Hep G2 HB 8065)；小鼠乳瘤(MMT 060562,ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.,383：44－68(1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；及人肝癌細胞系(Hep G2)。
本文所用術語"重組宿主細胞"(或簡寫為"宿主細胞")欲指一其中已引入一重組表現載體之細胞。應理解，此等術語不僅欲指特定主體細胞而且亦指此細胞之子代。由於突變或環境影響可使繼代發生某些改變，因此，此子代實際上可能與母細胞不同但其仍涵蓋於本文所用術語"宿主細胞"之範圍內。
術語"表現(expression、express及expresses)"通常指發生於宿主細胞中之轉錄及轉譯。可根據存於宿主細胞中之對應mRNA量或藉由該基因編碼之蛋白質數量來測定該細胞中基因產物之表現水平。舉例而言，可藉由Northern雜交來定量自產物基因轉錄之mRNA。(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,pp.7.3－7.57,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))。可藉由測試蛋白質生物活性或藉由採用不涉及此活性之測試(例如，利用能夠與該蛋白質反應之抗體實施的西方點漬分析或放射免疫測試)來定量藉由基因編碼之蛋白質。(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,pp.18.1－18.88 Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))。在某些實施例中，術語"表現(expression、express及expresses)"用於指示藉由本發明方法所生成的具有低－甘露糖含量之重組蛋白質。
本文所用術語"低－甘露糖"及"低－甘露糖含量"係指一其中不大於約10%之組合物由具有4個以上甘露糖殘基之糖蛋白(即，M5或更大之種類)組成的糖蛋白組合物。相反，"高－甘露糖含量"係指一其中大於約10%之組合物由具有4個以上甘露糖殘基之糖蛋白組成的糖蛋白組合物。術語"低甘露糖"及"低甘露糖含量"亦用於指示一糖蛋白組合物－其包括大於約90%或大於約95%的具有含4個或4個以下甘露糖殘基之糖蛋白的組合物。
術語"具有低－甘露糖含量之糖蛋白"用於指示一如下重組糖蛋白組合物，當藉由培養宿主細胞製備時，該組合物中包括(但不限於)不大於約4%、不大於約5%、不大於介於約4%與約5%間之數量、不大於約6%、不大於介於約5%與6%間之數量、不大於約7%、不大於介於約6%與7%間之數量、不大於約8%、不大於約7%與8%間之數量、不大於約9%、不大於介於8%與9%間之數量、不大於約10%、或不大於介於約9%與10%間之數量的具有4個以上甘露糖殘基(即，M5或更大之種類)的糖蛋白。因此，術語"具有低－甘露糖含量之糖蛋白"係指一如下重組糖蛋白組合物，當藉由培養宿主細胞製備時，該組合物中包括大於約90%、或大於約95%之具有4個或4個以下甘露糖殘基(即，0至4個甘露糖殘基)之糖蛋白。
高－甘露糖含量可藉由一或多種業內熟知方法進行量測，例如，如在Wuhrer等人之Journal of Chromatography B Vol.825：124－133,2005及Dell等人之Science Vol.291：2351－2356中所述，且本文所述彼等包括(例如)用於糖蛋白之N－聚糖比對的分析方法。簡言之，自重組糖蛋白(例如，重組單株抗體)以酶促方式移除N－聚糖並在還原端用螢光標示(2－胺基苯甲醯胺)標記。藉由高pH陰離子交換層析法(HPAEC)分離該螢光N－聚糖並藉助螢光檢測法檢測。通常藉由增加N－聚糖結構之複雜性來分離中性N－聚糖。根據存在的唾液酸、硫酸鹽或其他自其可得到電荷數之修飾物的數量及類別來分離帶電荷的N－聚糖。以目測方式比較測試樣品與適宜標樣之此等聚糖分佈圖。
亦可藉助本文即刻揭示之方法量測高－甘露糖含量：一用於檢測及/或定量糖蛋白(包括但不限於抗體或其片段，例如Fab片段，包含Fc片段之融合蛋白及肽抗體)(當在真核動物宿主細胞中表現時)之高－甘露糖含量的多通量方法。抗體通常具有位於Fc區上之單一與N連接的聚糖。因該聚糖之部分隱蔽的結構，通常僅對其進行部分處理，如此可形成過量的高甘露糖及雜合體類別。細胞系選擇、細胞突變或其他基因操作處理或細胞培養操作處理可改變由該等細胞生成之聚糖類別。由於需探測許多條件/細胞，因此在篩選期間需要許多聚糖測試。傳統聚糖比對慢且費力，需要許多天。本發明之高－甘露糖/雜合體聚糖測試可使作業者以更少付出更快速地獲得各聚糖類別之比例。
特定言之，本發明提供一種用於檢測及/或定量一樣品中糖蛋白或包含該糖蛋白之組合物之高－甘露糖含量的方法，該方法包括對該樣品或包含該糖蛋白之組合物實施內切糖苷酶消化，藉助還原劑還原經消化糖蛋白(若需要)並藉由變性電泳分離該經消化糖蛋白，由此藉由自去糖基化重鏈部分(內切糖苷酶消化後之峰值)減去非糖基化重鏈部分(未經內切糖苷酶處理之峰值部分)來確定高－甘露糖/雜合體型聚糖之比例。藉由使相同樣品或組合物處於相同消化條件(不同之處係其中不存在內切糖苷酶)下而生成未經內切糖苷酶處理之非糖基化重鏈部分或峰值部分。此步驟與內切糖苷酶消化步驟可同時實施或分別實施。
本發明可使用任一可選擇性地切除核心聚糖上GlcNAc1與GlcNAc2間之高甘露糖及雜合體聚糖(或在蛋白質上產生短聚糖)同時保持與N連接之複雜聚糖完整的內切糖苷酶。為了正確定量，不可限制內切糖苷酶之量。實施內切糖苷酶消化之具體條件(包括該酵素之濃度、培育溫度及消化時間)視所用內切糖苷酶之類別而定。本發明之內切糖苷酶的實例包括但不限於內切糖苷酶H及內切糖苷酶F1。在本發明之一實施例中，在37℃下使用內切糖苷酶H對包含該等糖蛋白之樣品實施處理約2小時，用β－巰基乙醇還原並實施CE－SDS分析。
用於自糖基化糖蛋白(例如，糖基化抗體)分離出去糖基化糖蛋白(例如，去糖基化抗體)之實例方法包括但不限於下列兩種方法：1)在還原條件下實施CE－SDS。藉助SDS及還原劑使糖基化糖蛋白(例如，抗體)變性，並藉由毛細管電泳－SDS(CE－SDS)自經切割的HC(去糖基化的HC)分離出其含有聚糖之重鏈(HC)。產生UV信號電泳圖譜。峰下面積與相對數量成比例。因此，可從在初期去糖基化的HC位置洗脫出的部分測定高－甘露糖/雜合體類之量。由於GlcNAc－HC係與去糖基化HC一起移動，因此從經消化樣品之前峰減去未經消化樣品之%去糖基化HC則得出%高甘露糖數值。分離需要15至30分鐘，端視構型而定。
2)基於微流體之CE－SDS。按照1)中所述使糖蛋白變性，但藉助"芯片實驗室"儀器(Caliper之LC90)實施分離。雖然係使用螢光染劑來檢測該蛋白質，但在測試及分離中使用了相同原理。每次測試之分離時間減少至約30秒且其可自微量滴定板取樣。
上文所述本發明方法可在純化蛋白質上實施，但亦可在粗製細胞培養樣品上實施。對於重組抗體而言，該信號足夠強以致於無需純化。
在某些實施例中，具有4個以上甘露糖殘基之糖蛋白包括具有5個至9個甘露糖殘基(即，M5－M9類)之糖蛋白。不希望受限於具體理論，熟識技術者應理解：藉由宿主細胞表現之糖蛋白包括具有不同數量甘露糖殘基之糖蛋白。舉例而言，低－甘露糖糖蛋白係具有4個或4個以下甘露糖殘基(例如，0至4個甘露糖殘基)，而高－甘露糖糖蛋白係具有高於4個甘露糖殘基(例如，M5類或更大之種類)。
在本發明一具體實施例中，具有低－甘露糖含量之糖蛋白係重組抗體或其抗原結合片段。在本發明另一具體實施例中，具有低－甘露糖含量之重組糖蛋白係一結合IL－15之人類單株抗體或其抗原結合片段。
本文所用術語"實質不含"通常指不含有或具有少量(即，相對於未經改良培養基)某些組份之細胞培養基的製品。舉例而言，在一實施例中，用於製備具有低甘露糖含量之重組糖蛋白的培養基實質上不含有某些胺基酸(例如，一或多種選自由丙胺酸、精胺酸、天冬胺酸及穀胺酸組成之群的胺基酸)。在某些實施例中，對實質不含一或多種組份之培養基實施改良以使其包含相對於未經改良培養基少於約1%、或少於約3%、或少於約5%、或少於約10%的一或多種此等組份。
術語"IL－15"、"IL－15抗原"及"介白素15"在本文中交替使用且包括由細胞天然表現的任一變體或同種型。
本文所提及術語"抗體"包括整個抗體及其任一抗原結合片段(即，"抗原結合部分")或單鏈。"抗體"係指包含藉由二硫鍵相互聯接之至少2條重(H)鏈及2條輕(L)鏈的糖蛋白或其抗原結合部分。各條重鏈係由一重鏈可變區(本文縮寫為VH )及一重鏈恆定區構成。該重鏈恆定區包括3個域：CH1、CH2及CH3。各條輕鏈係由一輕鏈可變區(本文縮寫為VL )及一輕鏈恆定區構成。該輕鏈恆定區包括1個域，CL。可將VH 及VL 區進一步細分成間雜有較為保守的區(稱作構架區(FR))之高度可變區(稱作互補決定區(CDR))。各VH 及VL 係由3個CDR及4個FR構成，其自胺基末端至羧基末端之排列順序如下：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。該重鏈及輕鏈之可變區含有與一抗原相互作用之結合域。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子間之結合，該等宿主組織或因子包括免疫系統之各種細胞(例如，效應子細胞)及經典補體系統之第一組份(Clq)。
本文所用術語抗體之"抗原結合部分"及"抗原結合片段"(或簡寫為"抗體部分")係指一或多個選擇性地結合至抗原(例如，IL－15)之抗體片段。現已表明，一抗體之抗原結合功能可藉由一全長抗體之片段實現。術語一抗體之"抗原結合部分"所涵蓋抗原結合片段實例包括：(i)一Fab片段，其係一由VL 、VH 、CL及 CH1域構成之單價片段；(ii)一F(ab')2 片段，其係一包括2個在鉸鏈區經二硫橋鍵連接之Fab片段的二價片段；(iii)一由VH 及CH1域構成之Fd片段；(iv)一由一單臂抗體之VL 及VH 域構成之Fv片段；(V)一dAb片段(Ward等人Nature 341：544－546(1989))，其由一VH 域構成；及(vi)一經分離互補決定區(CDR)或(vii)兩個或多個可視情況藉由合成連接子連接之經分離CDR的組合。此外，儘管Fv片段之兩個域VL 及VH 藉由不同基因編碼，但該等域可用重組方法藉助合成連接子來連接，該合成連接子能夠使其作為其中VL 及VH 區配對形成單價分子(稱作單鏈Fv(scFv))之蛋白質單鏈製備；參見(例如)Bird等人，Science 242：423－426(1988)；及Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879－5883(1988)。亦欲將此等單鏈抗體涵蓋於術語一抗體之"抗原結合部分"及"抗原結合片段"中。藉助彼等熟習此項技術者已知之習用技術可獲得此等抗體片段且以與完整抗體相同之方式篩選有用的片段。
本文所用術語"單株抗體"係指一對具體抗原決定部位呈現單一結合特異性及親和性之抗體。因此，術語"人類單株抗體"係指一呈現單一結合特異性並具有源自人類種系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區的抗體。在一實施例中，人類單株抗體可藉由包含自轉基因非人類動物(例如，轉基因小鼠)獲得之B細胞的融合瘤生成，該轉基因非人類動物具有一包含融合至永生細胞之人類重鏈轉基因及輕鏈轉基因之基因組。
本文所用術語"重組人類抗體"包括藉由重組方法製備、表現、產生或分離之全部人類抗體，例如(a)自人類免疫球蛋白基因之轉基因或轉染色體動物(例如，小鼠)或自其製備之融合瘤分離的抗體，(b)自經轉化可表現該抗體之宿主細胞(例如，自轉染瘤)分離之抗體，(c)自重組組合人類抗體文庫分離之抗體，及(d)藉由任一涉及接合人類免疫球蛋白基因序列與其他DNA序列之其他方法製備、表現、產生或分離之抗體。此等重組人抗體具有衍生自人類種系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區。然而，在某些實施例中，此等重組人類抗體需經受體外誘變(或者，當使用一用於人類Ig序列之轉基因動物時，經受體內體細胞誘變)，因此，重組抗體VH 及VL 區之胺基酸序列係(當衍生自或與人類種系VH 及VL 序列相關時)不可天然存在於人類體內抗體種系譜中之序列。
本文所用"異種抗體"係相關於可產生此抗體之轉基因非人類有機體而進行定義。此術語係指一種具有與於不包括轉基因非人類動物之有機體中所發現者相對應的胺基酸序列或編碼核酸序列，並通常來自除轉基因非人類動物有機體外之物種的抗體。
本文所用"經分離抗體"係指一實質不包括具有不同抗原特異性之其他抗體的抗體，例如，特異性結合至IL－15之經分離抗體實質不包括特異性結合除IL－15外之抗原的抗體。然而，特異性結合至IL－15抗原決定部位之經分離抗體對其他相關細胞因子或對來自不同物種之其他IL－15蛋白質可具有交叉反應性。然而，該抗體較佳總是結合人類IL－15。此外，一經分離抗體通常實質不含其他細胞材料及/或化學品。在一具體實施例中，將一組具有不同IL－15特異性之若干"經分離"單株抗體組合於一經恰當定義之組合物中。
本文所用"特異性結合"、"選擇性結合"及"選擇性地結合"係指抗體或其片段與一預定抗原結合。舉例而言，在一實施例中，當在BIACORE 3000儀器中用重組人類IL－15作為分析物並用該抗體作為配體藉助表面電漿共振(SPR)技術進行測定時，該抗體係以一小於約10－7 M(例如，小於約10－8 M、10－9 M或10－10 M或甚至更低)之親和力(KD )結合，且其以較該抗體與除預定抗原外之非特異性抗原(例如，BSA、酪蛋白)或密切相關抗原結合之親和力大至少兩倍之親和力結合至預定抗原。在本文中，短語"識別一抗原之抗體"及"對一抗原具有特異性之抗體"可與術語"選擇性地結合至一抗原之抗體"互換使用。
本文所用術語"KD "欲指一特定抗體－抗原相互作用之解離平衡常數。
本文所用"同型物"係指藉由重鏈恆定區基因編碼之抗體類(例如，IgM或IgGl)。
本文所用"同型物轉換"係指藉助其一抗體類或同型物可自一Ig類變成另一Ig類之現象。
本文所用"非轉換同型物"係指當未發生同型物轉換時所產生之重鏈同型類；編碼非轉換同型物之CH基因通常為來自功能重排VDJ基因之下游緊鄰第一CH基因。同型物轉換已劃分為經典或非經典同型物轉換。經典同型物轉換藉由涉及轉基因中至少一個轉換序列區之重組事件發生。非經典同型物轉換可藉由(例如)人類σμ 與人類Σμ 間之同源重組(δ－關聯的缺失)發生。另一非經典轉換機制(例如，尤其互轉基因及/或染色體間重組)可能發生，並實現同型物轉換。
本文所用術語"轉換序列"係指彼等可造成轉換重組之DNA序列。"轉換供體"序列(通常為一μ轉換區)為擬在轉換重組期間刪除之構造區的5'(即，上游)部分。"轉換受體"區可介於擬刪除之構造區與置換恆定區(例如，γ、ε等)之間。由於不存在總發生重組之特異性位點，因此，通常不能自構造體預見最終基因序列。
本文所用"糖基化圖案"定義為以共價方式連接至蛋白質(更具體而言，連接至免疫球蛋白)之碳水化合物單元的圖案。異種抗體之糖基化圖案可表徵為實質類似於自然發生在藉由非人類轉基因動物物種生成之抗體上的糖基化圖案，儘管一名普通技術者會將異種抗體之糖基化圖案識別為與自其得到轉基因之CH基因之物種相比較係更類似於非人類轉基因動物物種的該糖基化圖案。
本文所用術語"天然生成"係指一對象可於自然界中被發現之事實。舉例而言，存在於可自自然界來源分離出來的有機體(包括病毒)中、且未在實驗室中經人類特意改良之多肽或多核苷酸序列係天然生成的。
本文所用術語"重排"係指一重鏈或輕鏈免疫球蛋白基因座構型，其中V區段位於緊鄰主要編碼完整VH 或VL 域之構造中的D－J或J區段處。可藉由對照種系DNA來識別重排的免疫球蛋白基因座；重排的基因座應具有至少一種重組七聚體/九聚體同源單元。
當提及V區段時，本文所用術語"未重排的"或"種系構型"係指其中V區段未經重組以使其緊鄰D或J區段之構型。
本文所用術語"核酸分子"係指DNA及RNA分子。核酸分子可為單鏈或雙鏈，但較佳係雙鏈DNA。
當提及可編碼選擇性地結合IL－15之抗體或抗體部分(例如，VH 、VL 、CDR3)之核酸時，本文所用術語"經分離核酸分子"係指下述核酸分子，其中編碼該抗體或抗體部分之核苷酸序列不含可編碼結合除IL－15外之抗原之抗體或抗體部分的其他核苷酸序列，該等其他序列可自然地側接人類基因組DNA中之核酸。SEQ ID NOS：1－4對應包含人類抗－IL－15抗體之重鏈(VH )及輕鏈(VL )可變區的核苷酸及胺基酸序列。特定言之，SEQ ID IO：1及2對應該抗體之VH 且SEQ ID NO：3及4對應該抗體之VL 。
在一具體實施例中，結合IL－15之人類單株抗體或其抗原結合片段包括一包含SEQ ID NOs：8－10中所示一或多個且較佳全部3個CDR之輕鏈可變區及一包含SEQ ID NOs：5－7中所示一或多個且較佳全部3個CDR之重鏈可變區。
在一具體實施例中，本發明亦涵蓋SEQ ID NOs：1－10中所示序列之"保守序列修飾"或"保守序列取代"，即不會顯著影響或改變藉由該核苷酸序列編碼或含有該胺基酸序列之抗體的結合特徵的核苷酸及胺基酸序列修飾。此等保守序列修飾包括核苷酸及胺基酸取代、添加及刪除。可藉由此項技術中已知之標準技術來向SEQ ID NOs：1－10中引入該等修飾作用，例如定點突變及PCR介導的突變。保守胺基酸取代包括其中以具有類似側鏈之胺基酸殘基取代該胺基酸殘基之取代作用。業內已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基家族。此等家族包括具有鹼性側鏈(例如、離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如、天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電荷之極性側鏈(例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、非極性側鏈(例如、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、β－分支側鏈(例如、蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)以及芳香族側鏈(例如、酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)之胺基酸。因此，人類抗－IL－15抗體中預期之非必需胺基酸殘基較佳係用相同側鏈家族中之另一胺基酸殘基取代。
或者，在另一實施例中，可沿全部或一部分編碼抗－IL－15抗體之序列隨意地引入突變，例如藉由飽和誘變並可按照結合活性篩選所得經修飾抗－IL－15抗體。
因此，藉由本文所揭示(重鏈及輕鏈可變區)核苷酸序列編碼及/或含有本文所揭示(重鏈及輕鏈可變區)胺基酸序列(即，SEQ ID NOs：1－4)之抗體實際上包括藉由已經以保守方式修飾之類似序列編碼或含有該等類似序列之類似抗體。而且，下文提供如何根據本文所揭示部分(即，重鏈及輕鏈可變區)序列(如，SEQ ID Nos：1－4)生成此等實質類似抗體的論述。
對於核酸，術語"實質同源"表示當以最佳方式排列及比對時兩種核酸或其指定序列有至少約80%核苷酸、通常為至少約90%至95%、且更佳為至少約98%至99.5%核苷酸係相同的，同時有適當的核苷酸插入或刪除。或者，當該等區段在選擇性雜化條件下發生雜化時，該鏈之補充部分存在實質同源性。
對於胺基酸序列，術語"同源性"表示當以最佳方式排列及比對時，兩個胺基酸序列在適當插入及刪除情況下之等同程度。
兩個序列間之等同性百分比係該等序列共有的等同位置之數目的函數(即，%等同性＝相同位置之#/總位置之#×100)，應考慮用於生成兩個序列最佳排列所需缺口數目及每一缺口長度。序列比較及兩序列間等同百分比測定可用數學算法完成。
兩個核苷酸序列間之等同百分比可使用GCG軟體包(可自http：//www.gcg.com 獲得)中GAP程式測定，使用一NWSgapdna.CMP矩陣及一40、50、60、70或80之空位加權及一1、2、3、4、5或6之長度加權。亦可使用已經併入ALIGN程式(2.0版)中之E.Meyers及W.Miller(CABIOS,4：11－17(1989))的算法測定兩個核苷酸或胺基酸序列之等同性百分比，使用一PAM120加權餘數表、一12之空位長度罰分及一4之空位罰分。此外，2個核苷酸序列間之等同百分比可使用已經併入GCG軟體包(可自http：//www.gcg.com 獲得)中之GAP程式的Needleman及Wunsch(J.Mol.Biol.(48)：444－453(1970))算法測定，使用一Blossum 62矩陣或一PAM250矩陣及一16、14、12、10、8、6或4之空位加權及一1、2、3、4、5或6之長度加權。
可進一步將本發明之核酸及蛋白質序列用作"查詢序列"以實施針對公開數據庫之查找以(例如)識別相關序列。此等搜索可用Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403－10(1990)之NBLAST及XBLAST程式(2.0版)實施。BLAST核苷酸搜索可藉助NBLAST程式(分值＝100，字長＝12)實施以獲得與本發明核酸分子相似之核苷酸序列。BLAST蛋白質搜索可藉助XBLAST程式(分值＝50，字長＝3)實施以獲得與本發明蛋白質分子同源之胺基酸序列。為獲得用於比對目的之有間隙的對準，可使用Gapped BLAST，如在Altschul等人之Nucleic Acids Res.25(17)：3389－3402(1997)中所述。當使用BLAST及Gapped BLAST程式時，可使用各自程式(例如，XBLAST及NBLAST)之缺省參數。(參見http：//www.ncbi.nlm.nih.gov )。
該等核酸可存在於整個細胞、細胞溶解產物中，或以部分純化或實質純淨形式存在。當藉由標準技術(包括鹼/SDS處理、CsCl分離紋帶法、管柱層析法、瓊脂糖凝膠電泳法及其他業內熟知方法)實施純化去除了其他細胞組份或其他污染物(例如其他細胞核酸或蛋白質)時，一核酸係"經分離的"或"實質純淨的"。參見F.Ausubel等人編寫之Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York(1987)。
儘管源自cDNA、基因組或其混合物之本發明之核酸組合物經常以一天然序列(不包括經修飾限制酶切位點及其諸如此類)存在，但亦可按照標準技術使其發生變異以提供基因序列。對於編碼序列，此等變異可按照需要來影響胺基酸序列。特定言之，本發明涵蓋實質同源於或源自於天然V、D、J、恆定區、轉換區及其他本文所述此等序列之DNA序列(其中"源自"指示一序列與另一序列相同或藉由修飾另一序列獲得)。
當將核酸置於與另一核酸序列之功能關系中時，該核酸係"以可操作方式連接的"。舉例而言，倘若一啟動子或增強子可影響一編碼序列轉錄，則其係以可操作方式連接至該編碼序列。對於轉錄調節序列，以可操作方式連接意指所連接DNA序列係連續的且當需要連接2個蛋白質編碼區時，其係連續的並位於閱讀框架中。對於轉換序列，以可操作方式連接表示該等序列能夠影響轉換重組。
本文所用術語"載體"欲指一能夠轉運與其連接之另一核酸的核酸分子。一類載體係"質粒"，其係指一其中可結合額外DNA區段之環狀雙鏈DNA環。另一類載體係病毒載體，其中額外的DNA區段可結合於病毒基因組中。某些載體(例如，具有細菌複製源之細菌載體及附加型哺乳動物載體)能夠在可將此等載體引入其中之宿主細胞內自動複製。其他載體(例如，非附加型哺乳動物載體)可在納入宿主細胞中後整合入宿主細胞之基因組中，藉此與宿主基因組一起複製。進而言之，某些載體能夠引導以可操作方式與其連接之基因的表現。本文將此等載體稱作"重組表現載體"(或簡寫為"表現載體")。一般而言，用於重組DNA技術之表現載體通常呈質粒形式。在本說明書中，由於質粒係最常用的載體形式，因此"質粒"及"載體"可互換使用。然而，本發明欲包括可提供等效功能之其他形式的此等表現載體，例如病毒載體(例如，複製缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。
本文所用術語"受試者"包括任一人或非人類動物。舉例而言，本發明之方法及組合物可用於治療具有諸如關節炎(例如，類風濕性關節炎)等炎症疾病之受試者。術語"非人類動物"包括所有脊椎動物，例如，哺乳動物及非哺乳動物，如非人類靈長類、羊、狗、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。
本發明之各個態樣更詳細地闡述於下列分段中。
II.影響甘露糖含量之因素
(a)滲透壓 各細胞培養參數可影響在哺乳動物細胞培養物中表現之重組糖蛋白的甘露糖含量。特定言之，藉助本發明可發現：細胞培養基之滲透壓愈高，則具有4個以上甘露糖殘基(即，M5或更大之種類)之組合物中的糖蛋白百分比就愈高。因此，在本發明之一實施例中，將細胞培養基之滲透壓保持在少於約600 mOsm/公斤以減少或控制表現糖蛋白之甘露糖含量(例如，約250 mOsm/公斤至約600 mOsm/公斤)。
對於哺乳動物細胞培養而言，將細胞培養基之滲透壓保持在少於約550 mOsm/公斤、或少於約500 mOsm/公斤、或少於約450 mOsm/公斤、或少於約400 mOsm/公斤、或少於約380 mOsm/公斤、或介於約200 mOsm/公斤與約600 mOsm/公斤之間、或介於約250 mOsm/公斤與約550 mOsm/公斤之間、或介於約250 mOsm/公斤與約500 mOsm/公斤之間、或介於約250 mOsm/公斤與約450 mOsm/公斤之間、或介於約250 mOsm/公斤與約400 mOsm/公斤之間、或介於約250 mOsm/公斤與約380 mOsm/公斤之間、或介於約250 mOsm/公斤與約350 mOsm/公斤之間。
為了達成期望範圍之滲透壓，可調整該培養基中各成份之濃度。舉例而言，可加入培養基中以升高其滲透壓之溶質包括蛋白質、肽、胺基酸、水解動物蛋白質(例如，蛋白腖)、非代謝聚合物、維他命、離子、鹽、糖類、代謝產物、有機酸、脂質及諸如此類。然而，應理解：可改良培養基中其他成份之濃度以達成期望滲透壓。
在其他實施例中，可藉由向培養基中加入一或多種滲透保護劑來將滲透壓調整至上述範圍。示例滲透保護劑為此項技術所熟知且包括但不限於甜菜鹼、甘胺酸、L－蘇胺酸、L－脯胺酸及其衍生物(包括但不限於甘胺酸甜菜鹼、甜菜鹼醛)。在一具體實施例中，一細胞培養基含有濃度為約20 mM或更大、或約1 mM至約100 mM且較佳為約20 mM至約30 mM之甜菜鹼。
滲透壓可藉由任一此項技術中熟知之方法及本文所述之彼等加以量測。舉例而言，一諸如由Fisher Scientific,Pittsburgh,PA以商標名OSMETTE出售之滲透壓計可用於量測細胞培養基之滲透壓。或者，可使用2007型Osmette(Precision Systems公司，Natick，MA)。
在本發明之其他實施例中，可藉由改變細胞培養基之鹽、糖類、蛋白腖、胺基酸及銨中的一或多種之濃度來調節滲透壓。
在又一些實施例中，可將調節影響滲透壓之上述參數與控制培養細胞所用溫度及時程來調節(例如，減少)甘露糖－含量。因此，應理解：可以單獨或組合方式調節本文所述各細胞培養參數以調節重組糖蛋白之甘露糖－含量。
(i)鉀及鈉濃度 促成本發明之實驗表明：增加培養基中鉀(K＋)濃度可導致糖蛋白之高－甘露糖含量。因此，在一實施例中，本發明採用一具有約70 mM或更低(例如，約10 mM至約50 mM)之K＋濃度的細胞培養基。
如上文所述，可單獨地控制細胞培養基之鉀濃度，或者可與一或多個可影響滲透壓之本文所述其他因素相結合對其加以控制。在一具體實施例中，培養基進一步包括一約200 mM或更低(例如，約50 mM至約100 mM)之鈉濃度。
(ii)胺基酸類 人們已發現可影響細胞培養基之滲透壓及/或造成以重組方式表現之蛋白質具有高－甘露糖含量之其他因素係該培養基中胺基酸之濃度及類別。舉例而言，在一具體實施例中，加倍培養基中所有20種胺基酸之濃度可導致甘露糖－含量增加。因此，在一本發明之具體實施例中，調節細胞培養基以使其具有較低胺基酸濃度。在一特定培養基中，使該胺基酸濃度減小約一半。
在另一具體實施例中，細胞培養基實質不含一或多種選自由丙胺酸、精胺酸、天冬胺酸及穀胺酸組成之群的胺基酸。
(iii)糖類 人們已發現可影響細胞培養基之滲透壓及/或造成以重組方式表現之蛋白質具有高－甘露糖含量之其他因素係該培養基中糖類之濃度及類別。在一具體實施例中，該細胞培養基包含濃度為約1 mM至約90 mM之葡萄糖。
(iv)銨 可影響細胞培養基之滲透壓及/或造成以重組方式表現之蛋白質具有高－甘露糖含量之另一因素係約30 mM或更低(例如，約0 mM至約10 mM)之銨濃度。在一實施例中，該銨濃度係約10 mM或更低。
(v)蛋白腖 人們已發現可影響細胞培養基之滲透壓及/或造成以重組方式表現之蛋白質具有高－甘露糖含量之其他因素係該培養基中蛋白腖之濃度及類別。蛋白腖係自水解動物蛋白質生成之培養基添加物。蛋白腖來源為此項技術所熟知且包括(例如)動物副產品、明膠及植物材料。示例蛋白腖包括但不限於濃度為約0.5克/公升至約60克/公升之酵母抽提物、酵母水解產物、大豆蛋白腖、大豆水解產物、小麥蛋白腖及小麥水解產物。
(vi)維他命 人們已發現可影響細胞培養基之滲透壓及/或造成以重組方式表現之蛋白質具有高－甘露糖含量之其他因素係該培養基中維他命之濃度及類別。在一具體實施例中，該細胞培養基包括一或多種選自由下列組成之群且濃度為約0.00005克/公升至約0.9克/公升之維他命：生物素、D－鈣、泛酸、氯化膽鹼、葉酸、i－肌醇、煙醯胺、鹽酸吡哆醛、鹽酸吡哆醇、核黃素、鹽酸硫胺素、氰鈷胺素。
(b)溫度 已發現可造成以重組方式表現之蛋白質具有高－甘露糖含量之另一因素係保持細胞培養之溫度。因此，在本發明之另一實施例中，亦可單獨或與上述因素(例如，調整細胞培養時間及影響滲透壓之因素)相結合地調節培養宿主細胞之溫度以調節(例如減少)以重組方式表現之糖蛋白的甘露糖－含量。在某些實施例中，在約31℃、或約32℃、或約33℃、或約34℃、或約35℃、或約36℃、或約37℃或約38℃下培養宿主細胞。
III.細胞培養程序
依照本發明之方法，在一可表現具有低－甘露糖含量之重組糖蛋白的培養基中培養宿主細胞。適宜細胞培養程序及條件為此項技術所熟知。宿主細胞(例如，CHO及NSO細胞)可用各種不同形式及培養容器進行培養。舉例而言，宿主細胞可用經設計用於大規模或小規模生成糖蛋白之形式進行培養。或者，可使宿主細胞依附於培養瓶或培養皿底部或可使其處於攪拌燒瓶、生物反應器之懸浮液中或處於滾瓶培養物中對其進行培養。在某些實施例中，為了製備商業相關數量之重組糖蛋白，宿主細胞可在生物反應器中生長，且較佳為具有約2公升或更大、或約5公升或更大、或約10公升或更大、或約50公升或更大、或約100公升或更大、或約500公升或更大、或約1000公升或更大、或約1500公升或更大、或約2000公升或更大之容量的生物反應器。
在某些實施例中，宿主細胞可在液體培養基中培養(例如，維持及/或生長)且較佳可藉由習知培養方法(例如，靜止培養、試管培養、振盪培養(例如，旋轉振盪培養、搖瓶培養等)、曝氣旋轉培養或發酵)連續或間歇培養。在某些實施例中，宿主細胞係在搖瓶中進行培養。在又一些實施例中，宿主細胞係在發酵罐(例如，在發酵製程)中進行培養。發酵製程包括但不限於批式、補料批式及連續式發酵方法。術語"批式製程"及"批式發酵"係指一閉合系統，其中培養基、營養素、補充添加劑及諸如此類之組成係於發酵開始時設定，且在發酵期間不改變；然而，可嘗試控制諸如pH及氧氣濃度等因素以防止培養基過度酸化及/或微生物死亡。術語"補料批式製程"及"補料批式"發酵係指一批式發酵，不同之處係添加一或多種基質或補料(例如，以遞增或連續方式添加)或細胞培養條件隨發酵製程變化。術語"連續製程"及"連續發酵"係指一如下系統：其中向發酵罐中連續加入指定發酵培養基並同時移除等量用過的或"達到要求的"培養基以(例如)回收期望產物(例如，重組糖蛋白)。當前已開發出多種此類方法且其已為業內所熟知。
在一具體實施例中，表現結合IL－15之重組人類單株抗體的宿主細胞係在滾瓶、2公升旋轉式燒瓶或另一適宜培養系統中生長。
IV.糖蛋白之回收
依據多肽生產階段，可藉助業內已確立之技術自培養基回收有用的重組糖蛋白。有用的糖蛋白較佳係以分泌性多肽自培養基回收，但其亦可從宿主細胞溶胞產物回收。
在某些實施例中，離心該培養基或溶胞產物以移除顆粒狀細胞碎屑。此後，藉助適宜純化程序自污染物可溶性蛋白質及多肽純化出糖蛋白。示例純化程序包括但不限於分餾(使用免疫親和柱或離子交換柱)；乙醇沉澱；反相HPLC；層析法(使用矽石或使用諸如DEAE等陽離子交換樹脂)；層析聚焦；SDS－PAGE；硫酸銨沉澱；使用(例如)Sephadex G－75之凝膠過濾；及蛋白質A瓊脂糖凝膠柱以移除諸如IgG等污染物。亦可使用諸如苯基甲基磺醯氟(PMSF)等蛋白酶抑制劑來抑制純化期間蛋白水解的降解。熟習此項技術者應瞭解：可能需要對適合於有用重組糖蛋白的純化方法進行改良，以解決在重組細胞培養物中表現後該糖蛋白之特性的變化。
在本發明之具體實施例中，利用本發明方法表現之重組糖蛋白係一人類單株抗體或其抗原－結合片段。一般而言，藉由ELISA對該抗體進行初始特徵分析。舉例而言，可用經純化抗原(例如，存於PBS中之IL－15)塗覆微量滴定板且隨後用諸如在PBS中稀釋之牛血清白蛋白(BSA)等不相關蛋白質實施阻斷。向各個孔中加入來自培養細胞之抽提物的稀釋液並將其在37℃下培育1至2小時。用PBS/Tween 20洗滌該等板且隨後在37℃下用共軛鹼性磷酸酶之山羊－抗－人類IgG Fc－特異性多株試劑培育1小時。洗滌後，用ABTS基質顯影該等板並在405之OD下實施分析。
為了測定藉由本發明方法製備之抗體是否可結合至獨特的抗原決定部位，可使用市售試劑(Pierce,Rockford,IL)將各抗體實施生物素化。可用經鏈黴素標記之探針檢測經生物素化之MAb結合。為了測定經純化抗體之同型物，可藉助業內公認技術進行同型物ELISA。舉例而言，可在4℃下用10微克/毫升抗－人類Ig塗佈微量滴定板各孔過夜。用5% BSA阻斷後，使該等板在環境溫度下與10微克/毫升抗體或經純化同型物對照反應2小時。隨後使該等孔與人類IgGl或其他人類同型物特異性結合探針反應。對板實施顯影並按照上文所述分析之。
在一具體實施例中，藉助本發明方法生成之重組糖蛋白係結合IL－15之人類單株抗體或其抗原結合片段。為了測試IL－15單株抗體與表現IL－15之活細胞間之結合，可使用流式細胞儀。簡言之，於4℃下，使細胞系及/或表現結合膜IL－15之人類PBMC(在標準生長條件下生長的)在含有0.1% BSA及0.01% NaN3之PBS中與各濃度單株抗體混合1小時。洗滌後，使該等細胞與經螢光素標記之抗－人類IgG抗體在與一級抗體染色相同之條件下反應。可藉由FACScan儀器(藉助光及側散射性質導通單個細胞)分析該等樣品並測定標記抗體之結合。除流式細胞儀測試外亦可使用藉助螢光顯微鏡檢之一替代測試或者使用該測試代替流式細胞儀測試。可按照上文所述準確地對細胞進行染色並藉由螢光顯微鏡檢查該等細胞。此方法可目測個體細胞但視抗原之密度不同而具有減小的敏感性。
可藉由西方點漬分析進一步測試抗－IL－15人類IgG與IL－15抗原之反應性。簡言之，可製備來自表現IL－15之宿主細胞的細胞抽提物並對其實施十二烷基硫酸鈉丙烯醯胺凝膠電泳。在實施電泳後，將經分離抗原轉移至硝酸纖維膜，用20%小鼠血清進行阻斷並用待測試之單株抗體實施探查。可使用抗－人類IgG鹼性磷酸酶檢測人類IgG結合並用BCIP/NBT基質板(Sigma Chem.Co.,St.Louis,MO)實施顯影。
V.醫藥組合物
在另一態樣中，本發明提供一種含有一種或一組具有低－甘露糖含量之重組糖蛋白的組合物，例如，一醫藥組合物。在一具體實施例中，該醫藥組合物包括至少一種具有低－甘露糖含量之治療性蛋白質，例如具有低－甘露糖含量之治療抗體或其抗原結合片段，例如，結合IL－15之人類單株抗體或其抗原結合片段。在另一具體實施例中，本發明之醫藥組合物包括一或更多種具有低甘露糖含量之重組糖蛋白，其與一醫藥上可接受之載劑一同調配。
亦可以組合療法(即，與其他藥劑組合)投與本發明醫藥組合物。舉例而言，該組合治療可包括一本發明組合物與至少一或多種額外治療藥劑，例如抗炎劑、DMARD(緩和疾病之抗風濕藥)、免疫抑制劑、化療藥物及乾癬藥劑。本發明之醫藥組合物亦可與放射治療聯合投與。本發明亦涵蓋共同投與本發明組合物與諸如CD4特異性抗體及IL－2特異性抗體等其他抗體。與D4特異性抗體或IL－2特異性抗體之此等組合據認為尤其適合用於治療自體免疫性疾病及移植排斥。
本文所用"醫藥上可接受之載劑"意指任一及所有在生理學上適合的溶劑、分散培養基、塗佈劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑、及諸如此類。較佳地，該載劑適於經靜脈內、經肌內、經皮下、非經腸、經脊髓或經表皮施用(例如，經注射或經輸注施用)。視投藥途徑而定，可將重組糖蛋白(例如，抗體、雙特異性及多特異性分子)包裹於一材料中以保護該化合物免受酸作用及其他可使該化合物失活之自然條件的影響。
"醫藥上可接受之鹽"意指可保留母體化合物之期望生物活性且不會傳遞任一不期望毒物學效應之鹽(參見(例如)Berge,S.M.等人，J.Pharm.Sci.66：1－19(1997)。此等鹽之實例包括酸加成鹽及鹼加成鹽。酸加成鹽包括彼等衍生自無毒性無機酸(例如，氫氯酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸及諸如此類)之鹽以及衍生自無毒性有機酸(例如，脂肪族單及二羧酸、經苯基取代之鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳香族酸、脂肪族及芳香族磺酸及諸如此類)之鹽。鹼加成鹽包括彼等衍生自鹼土金屬(例如，鈉、鉀、鎂、鈣及諸如此類)之鹽以及衍生自無毒性有機胺(例如，N,N'－二苄基乙二胺、N－甲基葡萄糖胺、氯普魯卡因、膽鹼、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因及諸如此類)之鹽。
本發明之組合物可藉由此項技術中已知之多種方法投與。如熟習技術者應瞭解，投藥途徑及/或方式應視期望結果而變化。可使用一防止化合物快速釋放之載劑對該等活性化合物進行調配，例如一受控釋放調配物，包括植入體、透皮貼劑及微囊遞送系統。可使用生物可降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯及聚乳酸。用於製備此等調配物之許多方法已獲得專利權或通常已為彼等熟習此項技術者所瞭解。參見(例如)Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R.Robinson,編輯,Marcel Dekker公司,New York,1978。
為用某些投藥路徑投與本發明化合物，可能需要使用一材料塗覆該化合物或將該化合物與該材料共同投與，以避免本發明化合物失去活性。舉例而言，該化合物可於合適載劑(例如，脂質體)或稀釋劑中投與患者。醫藥上可接受之稀釋劑包括鹽水及水性緩衝溶液。脂質體包括水包油包水型CGF乳液以及習用脂質體(Strejan等人，J.Neuroimmunol .7：27(1984))。
醫藥上可接受之載劑包括無菌水溶液或分散液，及臨時配製無菌注射用溶液或分散液製劑所用之無菌粉末。將此等培養基及藥劑用於醫藥上具活性之物質在業內已為人所瞭解。除非任一習用培養基或藥劑與該活性化合物不相容，否則其在本發明醫藥組合物中之用途亦涵蓋於本發明中。該等組合物中亦可包括補充活性化合物。
通常，治療組合物必須為無菌且在生產及儲存條件下穩定。可將該組合物調配成一溶液、微乳劑、脂質體或其他適合高藥物濃度之規定結構。該載劑可為溶劑或分散液培養基，包括(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液體聚乙二醇，及諸如此類)及其適宜混合物。藉由使用(例如)一諸如卵磷脂等包覆層、保持所需粒徑(對於分散劑而言)以及使用表面活性劑可保持適當的流動性。在許多情況下，較佳於該組合物中包括等滲劑，例如，糖類、多元醇(例如，甘露醇、山梨醇)或氯化鈉。藉由向組合物中納入可延遲吸收之藥劑(例如單硬脂酸鹽及明膠)可導致可注射組合物之吸收延長。
無菌可注射溶液可藉由下述來製備：按照需要，將所需量活性化合物納入含有上文例舉的一種或一組成份的適宜溶劑中，隨後進行無菌微量過濾。一般而言，可藉由將活性化合物納入一含有基本分散培養基及所需的選自上文所列舉之彼等的其他成份的無菌媒劑中來製備分散液。倘若係用於製備無菌注射液之無菌粉劑，則較佳製備方法係真空乾燥及冷凍乾燥(凍乾)，如此可生成活性成份外加任一期望額外成份(來自其一先前經無菌過濾之溶液)之粉劑。
可對劑量方案進行調整以提供最佳期望反應(例如，一治療反應)。舉例而言，可投與單次濃注劑、可經一段時間投與數個細分劑量或可根據所指示的治療狀況緊急程度按比例減少或增加劑量。舉例而言，可藉由皮下注射每週一次或兩次或者可藉由皮下注射每月一次或兩次投與本發明之人類抗體。
以劑量單元形式來調配非經腸組合物特別有利於方便施用及達成劑量一致性。本文所用劑量單元形式指適於作為單位劑量供擬治療個體使用的物理分散單元；每一單元包括一預定量之活性化合物，此預定量經計算可與所需醫藥載劑一起產生期望治療效果。本發明劑量單元形式之規格取決於並直接依賴於下列因素：(a)活性化合物之獨特性質及欲達成之特定治療效果，及(b)此項技術中調配此一活性化合物以處理個體敏感性之固有限制條件。
醫藥上可接受之抗氧化劑的實例包括：(1)水溶性抗氧化劑，例如，抗壞血酸、鹽酸半胱胺酸、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉及諸如此類；(2)油溶性抗氧化劑，例如，棕櫚酸抗壞血酯、丁羥茴醚(BHA)、丁羥甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α－生育酚及諸如此類；及(3)金屬螯合劑，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸及諸如此類。
對於治療組合物，本發明之調配物包括彼等適於經口、鼻、局部(包括，口腔及舌下)、直腸、陰道及/或非經腸給藥者。該等調配物可採用方便的單位劑型且可藉由製藥技術中任一已知方法製備。可與載劑材料組合以產生單一劑型之活性成份之數量應端視所治療受試者及特定投藥方式而改變。可與載劑材料組合以形成單一劑型之活性成份之量通常為使該組合物產生治療效果之量。一般而言，以百分比計，活性成份之此數量可介於約0.001%至約90%之間，較佳介於約0.005%至約70%之間，最佳介於約0.01%至約30%之間。
適於陰道投藥之本發明調配物亦包括含有此項技術中已知之此等載劑的陰道栓劑、陰道塞、乳膏、凝膠、膏糊、泡沫或噴霧調配物。本發明組合物之局部或經皮投藥劑型包括粉劑、噴霧劑、油膏、膏糊、乳膏、洗液、凝膠、溶液、貼片及吸入劑。活性化合物可以在無菌狀態下與醫藥上可接受之載劑以及可能需要的任一防腐劑、緩衝劑或推進劑混合。
本文所用短語"非經腸投與"及"以非經腸方式投與"意指除經腸及局部投與以外之投與方式，通常為注射方式，且其包括但不限於經靜脈內、經肌內、經動脈內、經鞘內、經莢膜內、經眼窩內、經心臟內、經皮內、經腹膜腔內、經氣管、經皮下、經表皮下、經關節內、經囊下、經蛛網膜下、經脊柱內、硬膜外及經胸骨內注射及輸注。
可用於本發明醫藥組合物之適宜水性及非水性載劑之實例包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、聚乙二醇及諸如此類)及其適宜混合物、植物油(例如，橄欖油)及注射用有機脂(例如，油酸乙酯)。舉例而言，藉由使用諸如卵磷脂等包覆材料、保持所需粒徑(對於分散劑而言)以及使用表面活性劑可保持適當的流動性。
此等組合物亦可包含佐劑，例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑及分散劑。藉由上述滅菌程序，並藉由引入各種抗細菌劑及抗真菌劑(例如，對羥基苯甲酸、氯丁醇、苯酚山梨酸及諸如此類)可確保防止微生物存在。該組合物中亦可能需要包含等滲劑，例如糖、氯化鈉及類似物。另外，藉由加入可延緩吸收之藥劑(例如，單硬脂酸鋁及明膠)可達成可注射醫藥形式之長效吸收。
當本發明化合物作為藥物投與人類及動物時，其可單獨給與或作為一與醫藥上可接受載劑聯合的含有(例如)0.001%至90%(更佳為0.005%至70%，例如0.01%至30%)活性成份之醫藥組合物給與。
不管選擇何種投與路徑，本發明化合物皆可以適宜之水合形式及/或本發明醫藥組合物形式使用，藉由已為彼等熟習此項技術者已知之習用方法，將其調配成醫藥上可接受之劑型。
本發明醫藥組合物中活性成份之實際劑量水平可有所變化，以獲得針對一特定患者、組合物及投藥方式可有效達到期望治療效果且不使患者中毒之活性成份量。所選劑量水平應端視各種醫藥動力學因素而定，該等因素包括所用本發明特定組合物或其酯、其鹽或其醯胺之活性、投藥路徑、投藥時間、所用特定化合物之排泄速率、治療持續時間、與所用特定組合物一起使用之其他藥物、化合物及/或材料、擬治療患者之年齡、性別、體重、身體狀況、整體健康狀況及先前病史及已為醫學技術領域中所熟知之類似因素。具有一般技術之醫師或獸醫可容易地確定並處方所需醫藥組合物之有效量。舉例而言，為達成期望治療效果，該醫師或獸醫開始可以低於所需水平投與醫藥組合物中所用本發明化合物之劑量，並逐漸增加該劑量直至已達成該期望效果。一般而言，本發明組合物之適宜日劑量應係該化合物有效地產生治療效果之最低劑量之量。此有效劑量通常應視上文所述因素而定。較佳地，靜脈內、肌內、腹膜腔內或皮下投藥較佳在接近靶位處實施。若需要，治療組合物之有效日劑量可在全天中呈分別投與的2、3、4、5、6或更多個小劑量視情況呈單位劑型以適當間隔投與。儘管可能會單獨投與本發明之化合物，但該化合物較佳作為醫藥調配物(組合物)投與。
可使用此項技術中已知之醫療裝置投與治療組合物。舉例而言，在一較佳實施例中，可使用一無針皮下注射裝置(例如，揭示於美國專利第5,399,163號、第5,383,851號、第5,312,335號、第5,064,413號、第4,941,880號、第4,790,824號或第4,596,556號中之裝置)投與本發明之治療組合物。用於本發明之熟知植入體及組件的實例包括：揭示於美國專利第4,487,603號中用於以控制速率分配藥物之可植入微型輸注泵；揭示於美國專利第4,486,194號中用於經皮投與藥物之治療裝置；揭示於美國專利第4,447,233號中用於以精確輸注速率遞送藥物之藥物輸注泵；揭示於美國專利第4,447,224號中用於連續遞送藥物之可改變流量的可植入輸注器；揭示於美國專利第4,439,196中具有多室間隔之滲透藥物遞送系統；及揭示於美國專利第4,475,196號中之滲透藥物遞送系統。許多其他此等植入體、遞送系統及組件為彼等熟習此項技術者所知。
在某些實施例中，可對本發明之治療糖蛋白加以調配以確保其在體內適當地分配。舉例而言，血腦屏障(BBB)可排斥許多高親水性化合物。為了確保本發明之治療化合物可越過BBB(若需要)，可(例如)將其調配於脂質體中。關於製造脂質體之方法，參見(例如)美國專利第4,522,811號、第5,374,548號及第5,399,331號。該等脂質體可包含一或多種可選擇性地轉運至特定細胞或器官進而促進靶向藥物遞送之部份(參見，例如，V.V.RanadeJ.Clin.Pharmacol .29：685(1989))。示例靶向部分包括：葉酸或生物素(參見，例如，頒予Low等人之美國專利第5,416,016號)；甘露糖苷(Umezawa等人，Biochem.Biophys.Res.Commun .153：1038(1988))；抗體(P.G.Bloeman等人，FEBS Lett .357：140(1995)；M.Owais等人，Antimicrob.Agents Chemother .39：180(1995))；表面活性蛋白A受體(Briscoe等人，Am.J.Physiol .1233：134(1995))，可包含本發明調配物以及本發明分子組份之不同類屬；p120(Schreier等人，J.Biol.Chem .269：9090(1994))；亦可參見K.Keinanen；M.L.LaukkanenFEBS Lett .346：123(1994)；J.J.Killion；I.J.FidlerImmunomethods 4：273(1994)。在本發明之一實施例中，將本發明治療化合物調配於脂質體中；在一更佳的實施例中，該等脂質體包含一靶向部分。在一最佳實施例中，藉由單次快速注射對接近腫瘤或感染之位點遞送存於脂質體中之治療化合物。該組合物必須具有可使其易於注射之程度的流動性。其在製造與儲存條件下必須穩定，且必須防止其受到諸如細菌及真菌等微生物之污染作用。
在另一實施例中，可對本發明之重組糖蛋白加以調配以防止或減少越過胎盤轉運。此可藉由此項技術中已知之方法(例如，藉由聚乙二醇化該抗體或藉由使用F(ab)2'片段)實現。亦可參照"Cunningham－Rundles C,Zhuo Z,Griffith B,Keenan J.(1992)Biological activities of polyethylene－glycol immunoglobulin conjugates."Resistance to enzymatic degradation.J Immunol Methods.152：177－190；及Landor M.(1995)Maternal－fetal transfer of immunoglobulins,Ann Allergy Asthma Immunol 74：279－283。當糖蛋白係用於治療或預防反覆自發性流產之抗體時，此點尤其重要。
用於類風濕性關節炎之"治療有效劑量"較佳應導致患者之ACR20 Preliminary Definition of Improvement，更佳應導致ACR50 Preliminary Definition of Improvement且甚至更佳應導致ARCD70 Preliminary Definition of Improvement。
ACR20 Preliminary Definition of Improvement定義如下：敏痛關節計數(TCJ)及腫脹關節計數(SWJ)改善20%
及下列5種評定中有3種改善20%：患者疼痛評價(VAS)、患者整體評價(VAS)、醫師整體評價(VAS)、患者自身評價殘疾(HAQ)、急性期反應(CRP或ESR)。
ACR50及ACR70係分別用50%及70%改善以相同方式進行定義。關於其他詳情，參見Felson等人之American College of Rheumatology Preliminary Definition of Improvement in Rheumatoid Arthritis；Arthritis Rheumatism 38：727－735(1995)。
一化合物抑制癌症之能力可在用於預測對人類腫瘤之功效的動物模型系統中進行評價。或者，可藉由檢測該化合物之抑制能力來評價組合物之此性質，此活體外抑制係藉由熟練從業者已知之測試實施。治療有效量之治療化合物可減小腫瘤尺寸或者緩和受試者之症狀。一個普通技術者應能夠根據諸如受試者個頭、受試者症狀之嚴重性及所投與所選特定組合物或投藥途徑等因素來確定此劑量。
亦可按照此項技術中熟知之方法評定該抗體治療或預防乾癬之能力。
該組合物必須為無菌狀態，且具有使該組合物能以注射器遞送之程度的流動性。除水外，載劑可為等滲緩衝鹽水溶液、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及諸如此類)及其適宜混合物。舉例而言，藉由使用塗佈劑(例如卵磷酯)、在分散之狀況下維持所需粒度及使用表面活性劑可維持適當的流動性。在許多狀況下，較佳在組合物中加入等滲劑(例如，糖類)、多元醇(例如，甘露醇或山梨醇)及氯化鈉。可藉由在組合物中加入一能延緩吸收之藥劑(例如，單硬脂酸鋁或明膠)來達成對可注射組合物之長期吸收。
當如上所述該活性化合物經適當地保護後，則該化合物可經口投與，例如與惰性稀釋劑或可吸收的食用載劑一起。
本發明之其他實施例闡述於下列實例中，不應將該等實例詮釋為對本發明進行進一步限制。在本申請案中所引用之序列表、圖形及所有參考文獻、專利案及公開專利申請案之內容皆以引用的方式清除地併入本申請案中。
實例
在下文所述所有實例中，使用一結合IL－15之完全人源化單株抗體作為示例重組糖蛋白(在實例中稱作"示例重組糖蛋白")，該完全人源化單株抗體具有一包含SEQ ID NO：4中所示胺基酸序列之輕鏈可變區及一包含SEQ ID NO：2中所示胺基酸序列之重鏈可變區。然而，一普通技術者可明瞭：可調節任一重組糖蛋白之甘露糖含量，如本文所述。
實例1：滲透壓影響重組糖蛋白之甘露糖－含量
為了研究滲透壓對糖蛋白甘露糖－含量之影響，在搖動式燒瓶及生物反應器培養物中於不同滲透壓下分析一示例重組糖蛋白之甘露糖－含量。如圖1中所示，當培養基滲透壓自約500增加至約580 mOsmo/公斤時，高－甘露糖含量自約14%增加至約24%。
在另一實驗中，向細胞培養物中加入20 mM滲透保護劑甜菜鹼以提供關於滲透壓與高－甘露糖含量間之關系的另一證據。下表概述了一此實驗之結果。
關於高－甘露糖含量與滲透壓間之關系的又一證據繪示於圖2中。向細胞培養基中加入約20 mM甜菜鹼顯著減少了示例重組糖蛋白之高－甘露糖含量。舉例而言，當滲透壓係約300 mOsm/公斤時，加入20 mM甜菜鹼後，高甘露糖含量自約9.5%(約0 mM甜菜鹼)減少至約4.5%(即，高－甘露糖含量減少約5%)。類似地，當滲透壓係約400 mOsm/公斤時，加入20 mM甜菜鹼後，高甘露糖含量自約16.5%(約0 mM甜菜鹼)減少至約7.5%(即，高－甘露糖含量減少約9%)。而且，當滲透壓係約500 mOsm/公斤時，加入20 mM甜菜鹼後，高甘露糖含量自約25%(約0 mM甜菜鹼)減少至約9.5%(即，高－甘露糖含量減少約15.5%)。
實例2：可控制培養物中K＋濃度以調節重組糖蛋白之甘露糖－含量
在另一實驗中，可控制細胞培養基中一或多種鹽之濃度以調節(例如，減少)示例重組糖蛋白之甘露糖－含量(例如，高－甘露糖含量)。在一示例實驗中，對細胞培養基中K＋濃度加以控制，且據顯示其可影響甘露糖－含量，且具體而言係影響示例重組糖蛋白之高－甘露糖含量。特定言之，在15 mM或45 mM K＋濃度下培養表現該糖蛋白之宿主細胞，並對產生的示例重組糖蛋白之高－甘露糖含量(即，M5或更大之種類)進行測定。
如圖3及圖4中所示，伴隨滲透壓升高，高－甘露糖含量之百分比自約3%升高至約13%。一介於約370與約500 mOsm/公斤間之滲透壓導致糖蛋白組合物之超過10%的高－甘露糖含量增加。
在另一實驗中，如圖5所示，表明細胞培養基中K＋濃度之最佳濃度範圍係約0 mM至約70 mM以保持重組糖蛋白之高－甘露糖含量百分比低於10%。
實例3：可控制細胞培養基中Na＋濃度以調節重組糖蛋白之甘露糖－含量
在另一實驗中，可控制Na＋濃度以調節(例如，降低)示例重組糖蛋白之高－甘露糖含量。在一示例實驗中，顯示細胞培養基中Na＋濃度升高會造成示例重組糖蛋白之高－甘露糖含量百分比升高。
圖6表明：Na＋之最佳濃度範圍係介於約0 mM與約200 mM之間以便保持高－甘露糖含量之百分比低於10%。
實例4：胺基酸可致使重組糖蛋白具有高－甘露糖含量
在另一實驗中，檢測細胞培養基中所存在胺基酸對示例重組糖蛋白之高－甘露糖含量的影響。如圖7所示，藉由使補料培養基中20種胺基酸濃度加倍，重組糖蛋白之高－甘露糖含量百分比可自約4%增加至10%。。此實驗表明：富含胺基酸之培養基可導致藉由在此培養基中培養之宿主細胞表現之糖蛋白的高－甘露糖含量增加。
實例5：補料培養基組合物之總成份可致使重組糖蛋白具有高－甘露糖含量
在此實驗中，檢測不同類別補料培養基對示例重組糖蛋白之高－甘露糖含量的影響。具體而言，檢測實質不含胺基酸L－丙胺酸、L－精胺酸HCL、L－天冬胺酸及L－麩胺酸並亦具有低濃度之CaCl、MgCl、KCl及丙酮酸鈉的經改良補料培養基(與未經改良之基質相比)對示例重組糖蛋白之高－甘露糖含量的影響。如圖8中所示，當使用經改良補料培養基時，高－甘露糖含量係約4%且當使用未經改良補料培養基時，此百分比增加至約13%。
實例6：溫度對高－甘露糖含量之影響
使用兩種不同補料培養基檢測4個不同的溫度對高－甘露糖含量之影響。下列表II中數據表明：隨溫度升高，高－甘露糖含量之百分比增加。
參照以引用方式併入本文之本說明書中所引用參考文獻之教示，可最充分地理解本說明書。本說明書中之實施例用於說明本揭示內容之實施例從而不應將其理解為限制本發明之範圍。熟習此項技術者可容易地理解：許多其他實施例亦涵蓋於本揭示內容中。本揭示內容中所引用全部公開案及專利案以及藉由登錄編號或數據庫參考編號標識之序列全部以引用的方式併入本文中。當以引用方式併入之材料與本說明書相背離或不一致時，將以本說明書替代任一此材料。任一參考文獻在本文中之引用並非承認該等參考文獻係本揭示內容之優先技術。
除非另有說明，否則，本說明書中(包括申請專利範圍中)用於表示成份數量、細胞培養、處理條件等所有數值在所有情況下皆應理解為受詞語"約"的修飾。因此，除非另有說明，否則數值參數係近似值且其可視本發明尋求獲得的期望性質而變化。除非另有說明，否則一系列要素前之詞語"至少"應理解為指該系列中每個要素。彼等熟習此項技術者可使用常規實驗即可識別或能確定本文所述的本發明具體實施例之許多等效形式。此等等效形式均意欲涵蓋在下述申請專利範圍內。
圖1係一繪示結合IL－15之完全人源化單株抗體之滲透壓與高－甘露糖含量間之關系的圖，該結合IL－15之完全人源化單株抗體係藉由在搖動式控制容器(50毫升)及生物反應器(150公升及500公升)中培養表現該抗體之細胞製得。
圖2係一繪示滲透保護劑甜菜鹼之添加量與結合IL－15之完全人源化單株抗體之高甘露糖含量間之關系的圖。
圖3係一繪示培養基之滲透壓與K＋濃度間之關系的圖。
圖4繪示，藉由在含有15 mM或45 mM KCl之培養基中培養細胞，結合IL－15之完全人類單株抗體之高－甘露糖含量與滲透壓間之關系。
圖5係一K＋濃度與高－甘露糖含量間之關系的圖示，其表明保持高－甘露糖含量低於10%之最佳K＋濃度係介於約0與約70 mM之間。
圖6係一表示Na＋濃度與高－甘露糖含量間之關系的圖，其表明保持高－甘露糖含量低於10%之最佳Na＋濃度係介於約0 mM與約200 mM之間。
圖7係一繪示胺基酸濃度與高－甘露糖含量間之關系的圖。
圖8係一繪示所用補料培養基之類別與高－甘露糖含量間之關系的圖。
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Claims (13)

  1. 一種減少組合物中重組製備之糖蛋白的高甘露糖含量之方法，以使在該組合物中少於10%的糖蛋白在每個N-連接的寡聚糖上具有4個以上甘露糖殘基，該方法包括在具有250 mOsm/公斤至600 mOsm/公斤之滲透壓的培養基中培養表現該重組糖蛋白之哺乳動物宿主細胞5天至14天，該培養基包含濃度為20 mM至30 mM之甜菜鹼、濃度為10 mM至70 mM之鉀及濃度為50 mM至200 mM之鈉，其中降低培養基之滲透壓會導致具有4個以上甘露糖殘基之糖蛋白的百分比較低。
  2. 如請求項1之方法，其中該糖蛋白為重組製備之抗體或其抗原結合片段。
  3. 如請求項2之方法，其中該抗體或其抗原結合片段為可結合IL-15之重組製備之人類單株抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包括一包含SEQ ID NO：4中所示胺基酸序列之輕鏈可變區或其保守胺基酸取代物及一SEQ ID NO：2中所示胺基酸序列之重鏈可變區或其保守胺基酸取代物。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該培養基之滲透壓係介於250與500 mOsm/公斤之間。
  5. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該培養基之滲透壓係介於250與380 mOsm/公斤之間。
  6. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該培養基實質上不含一或多種選自由丙胺酸、精胺酸、天冬胺酸及麩胺酸 組成之群的胺基酸。
  7. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該培養基包含一或多種選自由下列組成之群且濃度為0.00005克/公升至0.9克/公升之維他命：生物素、D-泛酸鈣、氯化膽鹼、葉酸、i-肌醇、菸醯胺、氫氯酸吡哆醛、氫氯酸吡哆醇、核黃素、氫氯酸硫胺素及氰鈷胺素。
  8. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該培養基包含濃度為1 mM至90 mM之葡萄糖。
  9. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該培養基包含一或多種選自由下列組成之群且濃度為0.5克/公升至60克/公升的蛋白腖：酵母抽提物、酵母水解產物、大豆蛋白腖、大豆水解產物、小麥蛋白腖及小麥水解產物。
  10. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該培養基包含至少一種將滲透壓保持在250 mOsm/公斤至600 mOsm/公斤所需量之滲透保護劑。
  11. 如請求項10之方法，其中該滲透保護劑中之一者係選自由甘胺酸、L-蘇胺酸、L-脯胺酸及其衍生物組成之群。
  12. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該哺乳動物宿主細胞係經培養於約37℃至約38℃之溫度下。
  13. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該哺乳動物宿主細胞係CHO細胞。
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