KR20230124971A - 세포 배양 중 분비된 재조합 발현 단백질에서 시스테인잔기의 산화 수준을 감소시키는 방법 - Google Patents

세포 배양 중 분비된 재조합 발현 단백질에서 시스테인잔기의 산화 수준을 감소시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시는 세포 배양 중에, 포유동물 세포에 의해 재조합적으로 생산된 항-IL-17 항체와 같은 재조합 폴리펩티드(예를 들어, 세쿠키누맙 항체 제제)에서 시스테인 잔기의 산화 수준을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 또한 이러한 방법에 의해 생산된 항-IL-17 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 같은 재조합 폴리펩티드의 정제된 제제, 예를 들어 세쿠키누맙의 정제된 제제가 제공된다. 또한 이러한 방법에 의해 생산된 재조합 폴리펩티드의 정제된 제제로서, 제제의 활성 재조합 폴리펩티드의 수준이 높은 제제가 제공된다.

Description

세포 배양 중 분비된 재조합 발현 단백질에서 시스테인 잔기의 산화 수준을 감소시키는 방법
본 개시는 세포 배양 중, 예를 들어 포유동물 세포에 의한 세쿠키누맙과 같은 항-IL-17 항체의 재조합 생산 중에 분비된 재조합 발현 단백질에서 하나 이상의 시스테인 잔기의 산화 수준을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
고전적인 항체는 각각 분자량이 약 25 kD인 2개의 경쇄(L)와 각각 분자량이 약 50 kD인 2개의 중쇄(H)로 구성된다. 경쇄와 중쇄는 이황화 결합(L-S-S-H)에 의해 연결되고 두 개의 LH 단위는 두 개의 이황화 결합에 의해 중쇄 사이에 추가로 연결된다. 고전적 항체의 일반식은 L-SS-H(-SS-)2H-SS-L 또는 간단히 H2L2 (HHLL)이다. 이러한 보존된 사슬간 이황화 결합 외에도 보존된 사슬 내 이황화 결합도 있다. 두 가지 유형의 이황화 결합은 항체의 안정성과 거동(예: 친화도)에 중요하다. 일반적으로, 이황화 결합은 항체 사슬의 보존된 위치에서 발견되는 2개의 시스테인 잔기(Cys-SH)에 의해 생산되며, 이는 자발적으로 이황화 결합(Cys-S-S-Cys)을 형성한다. 이황화 결합 형성은 환경의 산화환원 전위와 티올-이황화 교환에 특화된 효소의 존재에 의해 결정된다. 내부 이황화 결합(Cys-S-S-Cys)은 항체의 3차원 구조를 안정화시킨다.
추가적인 유리 시스테인(즉, 쌍을 이루지 않은 시스테인)을 포함하는 항체가 있다. 일부 경우에, 예를 들어 유리 시스테인이 항체의 상보성 결정 영역에 존재하기 때문에 하나 이상의 유리 시스테인이 항원 인식 및 결합에 관여한다. 이러한 항체의 경우, 유리 시스테인의 변형은 분자의 활성과 안정성에 부정적인 영향을 미칠 수 있고, 면역원성을 증가시킬 수 있다. 그 결과, 최종 생성물이 상당한 양의 불활성, 잘못 접힌 및/또는 쓸모없는 항체 물질을 포함할 수 있기 때문에, 이러한 항체의 처리가 어려울 수 있다. US20090280131(전문이 본원에 참조로 포함됨)은 항-IL-17 항체, 예를 들어 경쇄 상보성 결정 영역(CDR) 3 루프(L-CDR3)에서 시스-프롤린 다음에 유리 시스테인 잔기(즉, 본원에서 이후에 "CysL97"로 지칭되는 서열번호 10으로 제시된 경쇄 가변 영역의 아미노산 97에 해당하는, 서열번호 6으로 제시된 L-CDR3의 아미노산 8)를 갖는 세쿠키누맙(즉, AIN457)을 제공한다. 완전한 활성을 유지하기 위해, 세쿠키누맙의 쌍을 이루지 않은 시스테인 잔기는, 다른 시스테인 잔기와의 산화적 이황화물 쌍 형성 또는 외인성 화합물과의 산화(예: 다른 단백질과의 혼합 이황화물 형성, 세포 대사산물(예: 시스테인 또는 글루타티온)로의 유도체화 및 산소에 의한 설폭사이드 형성)에 의해 마스킹될 수 없다. 불행하게도, 세쿠키누맙은 세쿠키누맙을 세포 배양 배지로 분비하는 포유동물 세포를 사용하여 제조되기 때문에, CysL97의 바람직하지 않은 세포 기반 변형이 발생한다.
유사하게, 유리 시스테인을 항체 서열로 조작하는 것은 화학적 링커, 약물, 라벨 및/또는 기타 모이어티의 부위 지정 접합을 촉진하는 데 유용할 수 있다. 예를 들어, Junutula 등 (Nat. Biotechnol., 2008, 26, 925-932)은 중쇄 알라닌 114의 돌연변이에 의해 조작된 시스테인을 항-MUC16 항체에 도입하였다. 저자들은 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 돌연변이된 항체의 발현이, 시스테인 또는 글루타티온이 있는 이황화물로 캡핑된 조작된 시스테인 잔기를 가진 항체를 생성한다는 것을 발견했다. 따라서, 조작된 시스테인 잔기는 바람직하지 않은 세포 기반 변형을 제거하기 위해 처리되어야 한다.
유리 시스테인 잔기가 산화된 항체를 선택적으로 환원시키는 방법이 보고되었다. 예를 들어, 포유동물 세포에 의해 재조합 생산된 IL-17 항체 제제에서 산화된 CysL97의 환원은 WO2016/103146A1에 개시되어 있다. 특히, 항체를 포함하는 제제를 시스템에서 적어도 하나의 환원제와 접촉시켜 환원 혼합물을 형성하고; 약 0.37 h-1 미만의 시스템에서 부피 산소 물질 전달 계수(kLa*)를 유지하면서 환원 혼합물을 인큐베이션하는 것과 같은 다운스트림 처리 단계가 적용되고, 상기 kLa*는 용존 산소 곡선을 포화 곡선에 적용하여 계산된다. 유사하게, Junutula 등은 강한 환원제(예: 트리스(2카복시에틸)포스핀[TCEP] 또는 디티오트레이톨[DTT]))를 사용하는 절차, 환원된 항체의 정제, Cu2+ 또는 데하이드로-아스코르브산을 사용한 사슬간 이황화 결합의 후속 재산화를 보고했다.
그러나 이러한 다운스트림 방법 단계는 값비싼 장비, 추가 정제 단계를 요구할 수 있고, 공정 리드 타임이 길어질 수 있다. 따라서, 보다 빠르고 및/또는 비용이 덜 드는 전체 제조를 가능하게 하는 개선된 공정이 필요하다. 이와 같이, 재조합 항체 생산의 업스트림 처리 단계의 방법도 최적화를 위해 평가할 수 있다.
재조합 폴리펩티드의 발현과 같은 산업적 적용을 위한 분비된 포유동물 세포의 배양은 성장 및 생산을 뒷받침하는 배지를 필요로 한다. 이러한 배지는 생물 제품의 합성 및 세포외 수송을 자극하는 동시에 높은 생존 세포 밀도를 뒷받침해야 한다. 초기 배지 개발 노력으로, 동물 유래 성분과 회분식 배양 모드에서 사용되는 복잡한 성분을 포함하긴 하지만, 성장, 생존력 및 세포 기능을 유지하는 기본 제형이 만들어졌다. 후속 개선에는 무혈청 및 화학적으로 정의된(CD) 배지의 개발, 중요한 영양소, 성장 인자 및 잠재적 억제 또는 독성 세포 대사산물의 확인, 그리고 원치 않는 폐기물의 축적을 최소화하면서 영양소 전달을 최적화하는 유가식 및 관류 배양 기법의 사용이 포함되었다.
모든 세포 배양 배지는 세포 성장을 뒷받침하기 위해 유사한 기본 영양소를 요구한다. 아미노산은 세포 배양 배지의 핵심 성분으로, 연구 결과에 따르면 세포 배양 배지의 아미노산 조성의 작은 변화는 성장 프로파일과 역가를 변경시킬 수 있는 것으로 나타났다. 예를 들어, Ghaffari 등 (Biotechnol Progress. 2020년; 36:e2946)은 소위 비필수 아미노산 시스테인의 가용성을 유지하는 것이 일반적인 CHO 세포주에서 고수율 재조합 단백질 생산을 위한 중요한 공정 매개변수임을 보고한다. 그러나 시스테인은 일반적인 세포 배양 배지의 pH와 산소 및 금속이 풍부한 조건에서 쉽게 산화된다. 그러나 시스테인은 또한 재조합 단백질의 유리 시스테인 잔기의 바람직하지 않은 산화를 촉진할 수 있다. 따라서, 시스테인 공급 전략은 일반적으로 CHO 세포로부터 재조합 발현된 단백질의 높은 수율을 달성하기 위해 고도의 최적화를 요구한다.
주요 영양소를 공급하기 위해 많은 세포 배양 배지 및 배지 피드가 상업적으로 이용 가능하다. 그러나 생산 중인 감소된 시스테인 잔기를 갖는 분비된 재조합 폴리펩티드의 품질 및 수율을 최적화하기 위해, 재조합 폴리펩티드에 대한 배지 및 피드를 맞춤화할 필요성은 여전히 존재한다. 세포 배양 조건에서 변경될 수 있는 많은 매개변수로 인해 공정 최적화는 복잡하고, 항체와 같은 상업적으로 이용 가능한 재조합 폴리펩티드의 경우에도 여전히 산업적 생산을 위한 최적화된 공정을 제공할 필요가 있다.
세포 배양 배지 분야에서의 광범위한 연구 및 최적화에도 불구하고, 놀랍게도 포유동물 세포 배양 배지에서 첨가된 시스테인의 양을 감소시켜 배양 배지에서 cys 균등물의 농도를 감소시키는 것이 발현된 항체의 유리 시스테인의 바람직하지 않은 변형을 감소시킬 수 있음이 발견되었다. 유리 시스테인의 바람직하지 않은 변형의 이러한 감소된 양은 개선된 항체 활성을 초래할 수 있고/있거나 항체의 후속 환원 및 임의로 재산화에 대한 필요성을 피할 수 있다.
제1 양태에 따르면, 본 개시는 하기 단계를 포함하는 유가식 세포 배양에서 재조합 폴리펩티드의 생산 방법을 제공한다:
a. 기본 배지 및 하나 이상의 피드 배지를 포함하는 세포 배양 배지에서 포유동물 세포를 배양하는 단계, 여기서 기본 배지는 약 0.3 g/L의 cys 균등물의 농도를 포함하고 피드 배지는 약 0.8 g/L 미만의 cys 균등물의 농도를 포함하고 세포 배양 배지에서 누적 cys 균등물의 농도는 약 0.4 g/L 미만인, 단계;
b. 재조합 폴리펩티드를 발현시키는 단계 및
c. 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계.
세포 배양 배지에서 누적 cys 균등물은 기본 배지 및/또는 피드 배지에서 유래된 세포 배양 배지에서 시스테인 및 시스틴의 총 농도이다. 누적 cys 균등물은 예를 들어, 몇 시간 또는 며칠 후와 같이 공정 종료 시와 비교하여 유가식 공정 시작 시 농도가 다를 수 있고, 피드 배지가 세포 배양 배지에 첨가되는 공정 중에 달라질 수 있다. 일 구현예에서, 유가식 공정의 시작 시 세포 배양 배지에서 cys 균등물의 농도는 약 0.6 g/L 미만일 수 있다. 예를 들어, 약 0.5 g/L 미만, 약 0.4 g/L 미만, 바람직하게는 약 0.3 g/L 미만일 수 있다. 유가식 공정 중, cys 균등물의 농도는 약 0.3 g/L 내지 약 0.8 g/L의 세포 배양 배지에 대한 cys 균등물(시스테인 또는 시스틴의 첨가에 의해 기여됨)의 첨가로 인해 변할 수 있다. 이 농도의 cys 균등물을 제공하기 위해, 피드 배지에서 세포 배양 배지에 첨가되는 시스테인의 농도는 약 1 g/L 미만일 수 있다. 예를 들어, 기본 배지는 첨가된 시스테인을 포함하지 않을 수 있고 피드 배지는 약 1.0 g/L 미만, 예를 들어 약 0.9 g/L 미만, 약 0.8 g/L 미만, 바람직하게는 약 0.7 g/L 미만의 시스테인 농도를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 기본 배지는 첨가된 시스테인을 포함하지 않을 수 있고 피드 배지는 약 0.66 g/L의 시스테인 농도를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 기본 배지는 첨가된 시스테인을 포함하지 않을 수 있고 피드 배지는 약 0.33 g/L의 시스테인 농도를 포함할 수 있다. 추가 구현예에서, 기본 배지는 첨가된 시스테인을 포함하지 않을 수 있고 피드 배지는 또한 시스테인을 포함하지 않을 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 유가식 공정의 종료 시, 세포 배양 배지에서 누적 cys 균등물의 농도는 약 0.4 g/L 미만일 수 있다. 기본 배지 및/또는 피드 배지에서 cys 균등물을 감소시키기 위한 변화가 없는 표준 유가식 세포 배양에서, 세포 배양 배지에서 누적 cys 균등물의 농도는 약 0.6 g/L일 수 있다.
일 구현예에서, 유가식 세포 배양에서 생산된 재조합 폴리펩티드는 항체, 바람직하게는 항-IL-17 항체 세쿠키누맙이다.
일 구현예에서, 적색 회분식 세포 배양에 사용되는 포유동물 세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: CHO 세포, HEK 세포 및 SP2/0 세포. 예를 들어, 포유동물 세포는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CHO 세포일 수 있다: CHO-S, CHO Kl, CHO pro3-, CHO DG44, CHO P12, 또는 dhfr- CHO 세포주 DUK-BII, DUXBI 1 또는 CHO-K1SV.
제2 양태에서, 세포 배양 배지에서 cys 균등물의 농도를 감소시키기 위한 상기 기재된 방법은 선택적 환원(여기서 항체는 시스템에서 적어도 하나의 환원제와 함께 인큐베이션되어 환원 혼합물을 생성함) 및 약 0.37 h-1 미만의 시스템에서 부피 산소 물질 전달 계수(kLa*)를 유지하면서 환원 혼합물을 인큐베이션하는 것(상기 kLa*는 용존 산소 곡선을 포화 곡선에 적용하여 계산됨)의 다운스트림 처리 단계와 조합될 수 있다. 바람직하게는 항체는 세쿠키누맙이다. IL-17 항체 제제에서 위치 CysL97의 시스테인 잔기를 선택적으로 환원시키기 위한 이러한 다운스트림 처리 단계는 WO2016/103146A1에 개시되어 있다.
본 개시의 방법에 따라 생산된 재조합 폴리펩티드는 제약 제품을 제조하기 위한 추가 단계를 수행함으로써 인간 환자에게 투여하기 위해 제조될 수 있다. 예를 들어, 재조합 폴리펩티드가 항체인 경우, 항체를 정제하고 다양한 부형제와 함께 항체를 제형화하여 환자에게 투여하기에 적합한 제약 조성물을 제공하는 것이 필요하다. 또한, 항체는 환자에게 투여하기 위한 설명서를 포함하는 리플렛과 함께 포장될 수 있다. 이러한 리플렛은 동봉된 항체와 함께 사용하기 위한 용량, 투여 경로, 요법, 및 총 치료기간을 제공할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 포유동물 세포 배양에 의한 재조합 폴리펩티드의 생산 방법을 제공한다: a) 세포 배양 배지를 포함하는 배양물에서 포유동물 세포(예를 들어, CHO 세포, HEK 세포 및 SP2/0 세포로 이루어진 군으로부터 선택됨)를 배양하는 단계, 여기서 세포 배양 배지는 대조군 기본 배지와 비교하여 감소된 농도의 cys 균등물을 포함하는, 단계; b) 배양물의 세포 배양 배지 전부 또는 일부를 관류에 의해 신선한 세포 배양 배지로 교환하는 단계, 여기서 신선한 세포 배양 배지는 대조군 교환 배지와 비교하여 감소된 농도의 cys 균등물을 포함하는, 단계; c) 재조합 폴리펩티드를 발현시키는 단계 및 d) 배양물로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계.
일부 구현예에서, 관류 세포 배양 배지는 약 0.1 g/L 내지 약 0.6 g/L 미만, 약 0.2 g/L 내지 약 0.5 g/L 미만, 약 0.25 g/L 내지 약 0.4 g/L 미만, 또는 0.3 g/L 내지 약 0.4 g/L의 cys 균등물 농도를 포함한다. 일부 구현예에서, 신선한 관류 세포 배양 배지는 약 0.1 g/L 내지 약 1.1 g/L 미만, 약 0.2 g/L 내지 약 0.9 g/L 미만, 약 0.25 g/L 내지 약 0.6 g/L 미만, 또는 0.3 g/L 내지 약 0.4 g/L의 cys 균등물 농도를 포함한다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 약 0.3 g/L의 cys 균등물 농도를 포함한다. 일부 구현예에서, 신선한 배양 배지는 약 0.3 g/L의 cys 균등물 농도를 포함한다.
일부 구현예에서, 관류 배양에 첨가되는 누적 cys 균등물은 약 11 g/L 미만, 약 9 g/L 미만, 또는 약 7 g/L 미만이다. 일부 구현예에서, 배양물에 첨가되는 누적 cys 균등물은 약 3 g/L 내지 약 11 g/L 미만, 약 4g /L 내지 약 11 g/L 미만, 약 5 g/L 내지 약 11 g/L 미만, 약 3 g/L 내지 약 9 g/L 미만, 약 4 g/L 내지 약 9 g/L 미만, 약 5 g/L 내지 약 9 g/L 미만, 또는 바람직하게는 약 5 g/L 내지 약 7 g/L 미만이다.
일부 구현예에서, 관류 배양에 첨가되는 누적 cys 균등물은 일당 약 1 g/L 미만, 일당 0.9 g/L 미만, 일당 0.7 g/L 미만, 일당 0.6 g/L 미만, 일당 약 0.5 g/L 미만, 일당 약 0.4 g/L 미만 또는 일당 약 0.3 g/L 미만이다. 일부 구현예에서, 관류 배양에 첨가되는 누적 cys 균등물은 일당 약 0.1 g/L 내지 일당 약 1 g/L 미만, 바람직하게는 일당 약 0.2 g/L 내지 일당 약 0.6 g/L 미만, 보다 바람직하게는 일당 약 0.2 g/L 내지 일당 0.5 g/L 미만, 또는 일당 약 0.3 또는 0.4 g/L이다.
도 1은 구현예에 따른 항체 샘플의 활성을 보여주는 그래프이다.
도 2는 일 단위의 시간 경과(x축)에 따른 관류 배지 변화에서 시스테인/시스틴 농도(cys 균등물)를 감소시킴으로써 항체 활성(%)에 미치는 영향을 보여준다. 시스테인/시스틴 농도의 감소가 더 클수록 관류 배지의 기준선과 비교하여 항체 활성 보유가 더 커진다(y축).
도 3은 기본 배지 및/또는 피드 배지에서 시스테인의 양을 감소시키는 것이 시간 경과에 따라(일; x축) 생산된 세쿠키누맙의 농도(mg/ml; y축)에 거의 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다.
도 4는 12일차에 세쿠키누맙의 최종 배양 농도(mg/ml)가 기준선(표준 기본 및 피드 배지를 포함하는 세포 배양 배지)과 테스트한 3개의 변형 기본 배지 및/또는 피드 배지 사이에 거의 변화가 없음을 보여준다.
도 5는 기준선(표준 기본 배지 및 피드 배지를 포함하는 세포 배양 배지)과 비교하여, 테스트한 3개의 변형 기본 배지 및/또는 피드 배지를 사용하여 생산된 항체 샘플의 활성(%)을 보여준다.
도 6은 관류 배지에 시스테인이 없고 따라서 정상 수준의 시스테인 및 cys 균등물을 포함하는 대조군 관류 세포 배양 배지와 비교하여 50% 감소된 cys 균등물을 갖는 시험 관류 배지를 사용한 관류 배양에 의해 생산된 항체 샘플의 활성(%)을 보여준다. 일당 약 1회의 완전한 배지 교환으로 시험 및 대조군 관류 세포 배양에 첨가된 누적 cys 균등물은 각각 약 5.875 g/L(약 0.31 g/L/일) 및 11.642 g/L(0.61 g/L/일)이었다.
본 개시의 목적은 세포 배양 중, 예를 들어, 포유동물 세포에 의한 세쿠키누맙의 재조합 생산 중, 항-IL-17 항체와 같은 재조합 폴리펩티드에서 시스테인 잔기의 산화 수준을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.
"포함하는"이라는 용어는 "이루어진"을 또한 포괄하고, 예를 들어 X를 "포함하는" 조성물은 X만으로 이루어질 수 있거나, 추가의 어떤 것을 포함할 수 있다(예를 들어 X + Y).
수치값 x와 관련된 용어 "약"은, 예를 들어 +/-10%를 의미한다. 수치 범위 또는 숫자 목록의 앞에 사용될 때, "약"이라는 용어는 시리즈의 각각의 숫자에 적용되고, 예를 들어 "약 1 내지 5"라는 어구는 "약 1 내지 약 5"로 해석되어야 하거나, 예를 들어 "약 1, 2, 3, 4"라는 어구는 "약 1, 약 2, 약 3, 약 4"로 해석되어야 한다.
번역 후 아미노산 서열을 기준으로 한 세쿠키누맙의 상대적인 분자량은 147,944 달톤이다. 이 분자량(즉, 147,944 달톤)은 본 개시 전반에 걸쳐 세쿠키누맙 몰농도 값 및 몰비의 계산에 사용된다. 그러나 CHO 세포에서 생산하는 동안 C-말단 리신은 일반적으로 각 중쇄로부터 제거된다. 각 중쇄로부터 C-말단 리신이 결여된 세쿠키누맙의 상대적인 분자량은 147,688 달톤이다. 세쿠키누맙 제제는 중쇄에 C-말단 리신 잔기가 있는 분자와 없는 분자의 혼합물을 함유한다. 따라서, 본 개시에서 사용된 세쿠키누맙 몰농도 값(및 이러한 몰농도 값을 사용하는 비율)은 추정치이며, 이들 수치 값과 관련하여 "약", "대략" 등의 용어는 적어도 상대적인 분자 질량의 이러한 변동 및 그로 인한 결과 계산을 포함한다.
"실질적으로"라는 단어는 "완전히"를 배제하지는 않고, 예를 들어 Y가 "실질적으로 없는" 조성물은 Y가 완전히 없을 수 있다. 필요한 경우, "실질적으로"라는 단어는 본 개시의 정의로부터 생략될 수 있다.
세포의 대규모 배양은 예를 들어 산업용 바이오기술에서 확립된 다양한 발효 공정에 의해 사용될 수 있다. 관류 및 케모스타트(chemostat)와 같은 불연속 및 연속 세포 배양 공정이 본 발명에 따른 세포 배양 배지를 사용하여 이용될 수 있다. 반복된 유가식 및 반복된 회분식을 포함하는 불연속 공정은 바람직한 일 구현예이다. 일반적으로, 본 발명의 방법 및 조성물은 세포 배양에 의한 분비된 폴리펩티드의 생산에 관한 것이다.
회분식 세포 배양은 유가식 배양 또는 단순 회분식 배양을 포함한다. 용어 "유가식 세포 배양"은 세포 및 세포 배양 배지가 처음에 배양 용기에 공급되고 배양 종료 전에 주기적인 세포 및/또는 생성물 수확이 있거나 없이 배양 공정 중에 배양물에 추가 배양 영양소가 연속적으로 또는 불연속 증분으로 공급되는 세포 배양을 지칭한다. "단순 회분식 배양"이란 용어는 배양 공정의 시작 시에 세포 및 세포 배양 배지를 포함한, 세포 배양을 위한 모든 성분이 배양 용기에 공급되는 절차에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 세포 배양 배지에서 배양되는 세포는 CHO 세포이다.
"세포 배양 배지"라는 용어는 장기간에 걸쳐 세포를 성장시키는 데 사용할 수 있는 영양소의 수용액을 지칭한다. 일반적으로 세포 배양 배지에는 다음 성분이 포함된다: 통상적으로 탄수화물 화합물, 바람직하게는 글루코스, 아미노산, 바람직하게는 모든 필수 및 비필수 아미노산을 포함한 기본 아미노산 세트인 에너지원, 비타민 및/또는 저농도에서 요구되는 기타 유기 화합물, 유리 지방산, 그리고 미량 원소, 무기 염을 포함하는 무기 화합물, 완충 화합물 및 뉴클레오시드 및 염기.
"성장 배지"라는 용어는 전체 생산 공정의 확장기 동안 보통 사용되는 세포 배양 배지를 지칭한다. 확장기는 전체 배양/생산 공정의 첫 번째 기간으로, 주로 높은 세포 성장과 적은 폴리펩티드 생산을 특징으로 한다. 확장기는 세포 확장의 목적을 제공하며, 이는 생산 생물 반응기를 접종하기 위해 기하급수적 성장기에 있는 적절한 수의 세포를 생산하는 것을 의미한다.
"생산 배지"라는 용어는 전체 생산 공정의 생산기 동안 보통 사용되는 세포 배양 배지를 지칭한다. 생산기는 전체 배양/생산 공정의 제2 단계로, 많은 양의 생성물 생산의 목적을 제공한다. 생산기 동안 세포는 가능한 한 오랫동안 생존 가능하고 생산적인 모드로 유지되어야 한다.
예를 들어 치료 활성 재조합 폴리펩티드의 생산을 위한 제약 산업 분야에서 세포 배양 배지의 사용은 일반적으로 안전성 및 오염 문제로 인해 동물 기원의 물질 사용을 허용하지 않는다. 따라서, 본 발명에 따른 세포 배양 배지는 바람직하게는 무혈청 및/또는 무단백질 배지이다. "무혈청 및/또는 무단백질 배지"라는 용어는 조직 가수분해물, 소 태아 혈청 등과 같은 동물 기원의 첨가제를 포함하지 않는, 완전히 화학적으로 정의된 배지를 나타낸다. 또한, 단백질, 특히 인슐린, 트랜스페린 등과 같은 성장 인자도 본 발명에 따른 세포 배양물에 첨가되지 않는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 세포 배양 배지는 또한 대두, 밀 또는 쌀 펩톤 또는 효모 가수분해물 등과 같은 가수분해된 단백질 공급원으로 보충되지 않는다.
"기본 배지"란 용어는 세포 배양에 사용되는 배지로서, 그 자체로 세포 배양에 직접 사용되며, 기본 배지에는 다양한 성분이 첨가될 수 있지만 다른 배지에 첨가제로 사용되지는 않는다. 예를 들어, CHO 세포가 잘 알려진 포유동물 세포용 상용 배지인 DMEM에서 배양되고 주기적으로 글루코스 또는 기타 영양소가 공급되는 경우, DMEM이 기본 배지로 간주된다. "피드 배지"는 유가식 세포 배양일 수 있는 세포 배양에서 피드로 사용되는 배지이다. 기본 배지와 같은 피드 배지는 배양되는 특정 세포의 필요에 따라 설계되며, 피드 배지는 기본 배양 배지의 성분 중 전부는 아니지만 대부분의 성분의 농도가 더 높을 수 있다. 예를 들어, 아미노산 또는 탄수화물을 포함하는 영양소와 같은 일부 성분은 기본 배지에서의 보통 농도의 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 100, 200, 400, 600, 800, 또는 심지어 약 1000배일 수 있다. 염과 같은 일부 성분은 피드를 기본 배지와 등장액으로 유지하기 위해 기본 배지 농도와 거의 동일한 농도로 유지될 수 있다. 일부 성분은 피드를 생리학적으로 유지하기 위해 첨가되고 일부는 배양물에 영양소를 보충하기 때문에 첨가된다.
본 발명에 따른 세포 배양 배지는 다양한 세포 배양 공정에 사용될 수 있다. 세포의 배양은 부착 배양, 예를 들어 단층 배양 또는 바람직하게는 현탁 배양으로 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 세포 배양물 및 세포 배양 배지로부터 생산될 수 있는 폴리펩티드는 제한되지 않는다. 폴리펩티드는 재조합이거나 재조합이 아닐 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 연결된 2개 초과의 아미노산 사슬로 구성된 분자; 2개 이상의 이러한 사슬을 포함하는 분자; 예를 들어. 글리코실화에 의해, 추가로 변형되는 하나 이상의 이러한 사슬을 포함하는 분자를 포함한다. 폴리펩티드는 하나 이상의 천연 이황화 결합을 함유할 수 있다. 폴리펩티드는 천연 또는 조작된 유리 시스테인을 함유할 수 있다. 폴리펩티드라는 용어는 단백질을 포함하도록 의도된다.
본 발명에 따른 세포 배양물 및 세포 배양 배지에 의해 생산되는 바람직한 종류의 폴리펩티드는 재조합 항체이다.
본원에서 나타내는 용어 "항체"는 전체 항체 및 이의 임의의 항원 결합 부분 또는 단쇄를 포함한다. 자연 발생 "항체"는 이황화 결합에 의해 상호 연결된 적어도 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, 즉, CH1, CH2 및 CH3으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 이루어진다. VH 및 VL 영역은 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역(CDR)으로 칭해지는 초가변성의 영역들로 더 세분될 수 있으며, 이들 사이에는 프레임워크 영역(FR)으로 칭해지는 더 보존된 영역들이 산재되어 있다. 각각의 VH 및 VL은 하기 순서로 아미노-말단에서 카복시-말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전 보체계의 첫 번째 성분(C1q)을 포함한, 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 항체의 "항원 결합 단편"이라는 용어는 항원(예를 들어 IL-17)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 항체의 "항원 결합 부분"이라는 용어 내에 포괄된 결합 단편의 예는, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab)2 단편; VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(문헌[Ward et al., 1989 Nature 341:544-546]); 및 단리된 CDR을 포함한다. 예시적인 항원 결합 부위는 서열번호 1 내지 6 및 서열번호 11 내지 13(표 1)에 제시된 바와 같은 세쿠키누맙의 CDR, 바람직하게는, 중쇄 CDR3을 포함한다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인, VL 및 VH는 별도의 유전자에 의해 암호화되지만, 이들을 단일 단백질 사슬로 만들 수 있는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 연결될 수 있고, VL 및 VH 영역은 쌍을 이루어 1가 분자(단쇄 Fv(scFv)로 알려짐; 예를 들어, 문헌[Bird et al., (1988) Science, 242: 423-426; Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 5879-5883] 참조). 이러한 단쇄 항체는 또한 "항체"라는 용어 내에 포괄되는 것으로 의도된다. 단쇄 항체 및 항원 결합 부분은 당업자에게 알려진 종래의 기법을 사용하여 얻어진다.
본원에서 사용된 바와 같은, "단리된 항체"는 항원 특이성이 상이한 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 나타낸다(예를 들어, IL-17에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 IL-17 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 본원에서 사용된 바와 같은, "단클론 항체" 또는 "단클론 항체 조성물"이라는 용어는 단일 분자 조성물의 항체 분자 제제를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같은, "인간 항체"라는 용어는 프레임워크 및 CDR 영역 둘 다가 인간 기원의 서열로부터 유래된 가변 영역을 가지는 항체를 포함하도록 의도된다. "인간 항체"는 인간, 인간 조직, 또는 인간 세포에 의해 생성될 필요는 없다. 본 개시의 인간 항체에는 인간 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관 내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이유발에 의해, 항체 유전자의 재조합 동안 생체 내 연접부에서의 N-뉴클레오티드 부가에 의해 또는 생체 내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)가 포함될 수 있다. 개시된 공정 및 조성물의 일부 구현예에서, IL-17 항체는 인간 항체, 단리된 항체, 및/또는 단클론 항체이다.
"IL-17"이라는 용어는 이전에 CTLA8로 알려진 IL-17A를 지칭하고, 다양한 종(예를 들어, 인간, 마우스, 및 원숭이)으로부터의 야생형 IL-17A, IL-17A의 다형성 변이체, 및 IL-17A의 기능적 균등물이 포함된다. 본 개시에 따른 IL-17A의 기능적 균등물은 바람직하게는 야생형 IL-17A(예를 들어 인간 IL-17A)와 적어도 약 65%, 75%, 85%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 심지어 99%의 전체 서열 동일성을 갖고, 인간 진피 섬유아세포에 의한 IL-6 생성을 유도하는 능력을 실질적으로 보유한다.
"KD"라는 용어는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭하도록 의도된다. 본원에서 사용된 용어 "KD"는 해리 상수를 지칭하는 것으로, 이는 Ka에 대한 Kd의 비(즉, Kd/Ka)로부터 얻어지고 몰 농도(M)로서 표현된다. 항체에 대한 KD 값은 당업계의 잘 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 항체의 KD를 결정하는 방법은 표면 플라즈몬 공명을 사용하거나 바이오센서 시스템, 예컨대 Biacore® 시스템을 사용하는 것이다. 일부 구현예에서, IL-17 항체 또는 항원 결합 단편, 예를 들어 세쿠키누맙은 인간 IL-17에 대해 약 100~250 pM의 KD를 갖는다.
"친화도"라는 용어는 단일 항원 부위에서의 항체와 항원 사이의 상호작용의 강도를 나타낸다. 각각의 항원 부위 내에서, 항체 "아암(arm)"의 가변 영역은 여러 부위에서 항원과 약한 비공유 힘을 통해 상호작용하며; 상호작용이 많을수록 친화도는 더 강하다. 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯 및 RIA를 포함하여, 다양한 종의 IL-17에 대한 항체의 결합 친화도를 평가하기 위한 표준 검정은 당분야에 알려져 있다. 항체의 결합 동역학(예를 들어, 결합 친화도)은 또한 당해 분야에 알려진 표준 검정에 의해, 예컨대 Biacore 분석에 의해 평가될 수 있다.
당해 분야에 알려지고 본원에 기재된 방법론에 따라 결정되는 하나 이상의 이러한 IL-17의 기능적 특성(예컨대, 생화학적, 면역화학적, 세포, 생리적, 또는 다른 생물학적 활성 등)을 "억제하는" 항체는 항체의 부재 시(또는 무관한 특이성의 대조군 항체가 존재하는 경우) 나타나는 것에 비해 특정 활성의 통계적으로 유의미한 감소와 관련되는 것으로 이해될 것이다. IL-17 활성을 억제하는 항체는 예를 들어 측정된 파라미터의 적어도 약 10%, 적어도 50%, 80%, 또는 90%만큼 통계적으로 유의미한 감소에 영향을 미치고, 개시된 방법 및 조성물의 특정 구현예에서, 사용된 IL-17 항체는 IL-17 기능적 활성을 95%, 98%, 또는 99% 초과로 억제할 수 있다.
"유도체"라는 용어는, 달리 표시되지 않는 한, IL-17 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예를 들어 본 개시에 따른 세쿠키누맙의, 예를 들어 규정된 서열(예를 들어, 가변 도메인)의, 아미노산 서열 변이체, 및 공유 변형(예를 들어, 페길화, 탈아미드화, 하이드록실화, 인산화, 메틸화 등)을 정의하기 위해 사용된다. "기능적 유도체"에는 개시된 IL-17 항체와 공통인 정량적인 생물학적 활성을 가지는 분자가 포함된다. 기능적 유도체에는 본원에서 개시된 바와 같은 IL-17 항체의 단편 및 펩티드 유사체가 포함된다. 단편은 예를 들어 규정된 서열의 본 개시에 따른 폴리펩티드의 서열 내의 영역을 포함한다. 본원에서 개시된 IL-17 항체의 기능적 유도체(예를 들어, 세쿠키누맙의 기능적 유도체)는 바람직하게는 본원에서 개시된 IL-17 항체 및 이의 항원 결합 단편의 VH 및/또는 VL 서열(예를 들어, 표 1의 VH 및/또는 VL 서열)과 적어도 약 65%, 75%, 85%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 전체 서열 동일성을 갖고, 인간 IL-17에 결합하거나, 예를 들어 IL-17 유도된 인간 진피 섬유아세포의 IL-6 생성을 억제하는 능력을 실질적으로 보유하는 VH 및/또는 VL 도메인을 포함한다.
"실질적으로 동일한"이라는 문구는, 관련 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열(예를 들어, VH 또는 VL 도메인)이 특정 기준 서열과 비교하여(예를 들어, 보존된 아미노산 치환을 통해) 동일하거나 실질적인 차이가 없는 것을 의미한다. 실질적인 차이가 없음은 규정된 부위(예, VH 또는 VL 도메인)의 5개의 아미노산 서열에서의 미미한 아미노산 변화, 예컨대 1개 또는 2개의 치환을 포함한다. 항체의 경우에, 제2 항체는 동일한 특이성을 갖고, 이것의 친화도의 적어도 50%를 갖는다. 본원에서 개시된 서열과 실질적으로 동일한 서열(예를 들어 적어도 약 85%의 서열 동일성)은 또한 본 출원의 일부이다. 일부 구현예에서, 유도체 IL-17 항체(예를 들어, 세쿠키누맙의 유도체, 예를 들어 세쿠키누맙 바이오시밀러 항체)의 서열 동일성은 개시된 서열에 비해 약 90% 이상, 예를 들어 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상일 수 있다.
자연적인 폴리펩티드 및 이의 기능적 유도체와 관련하여 "동일성"은, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않으면서, 최대 동일성 백분율을 달성하도록 서열을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입한 후 상응하는 자연적인 폴리펩티드의 잔기와 동일한 후보 서열에서의 아미노산 잔기의 백분율로서 본원에서 정의된다. N- 또는 C-말단의 연장 및 삽입은 동일성을 감소시키는 것으로 해석되어서는 안 된다. 정렬을 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램은 잘 알려져 있다. 동일성 백분율은 일반적인 정렬 알고리즘, 예를 들어, 문헌[Altshul et al. ((1990) J. Mol. Biol., 215: 403 410)]에 기술된 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool); 문헌[Needleman et al. ((1970) J. Mol. Biol., 48: 444 453)]의 알고리즘; 또는 문헌[Meyers et al. ((1988) Comput. Appl. Biosci., 4: 11 17)]의 알고리즘에 의해 결정될 수 있다. 일련의 파라미터는 갭 페널티 12, 갭 연장 페널티 4, 및 프레임시프트 갭 페널티 5를 갖는 블로섬(Blosum) 62 스코어링 매트릭스일 수 있다. 2개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성 백분율은 또한 PAM120 가중 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하는, ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된 E. Meyers 및 W. Miller((1989) CABIOS, 4:11-17)의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
"아미노산(들)"은 예를 들어, 모든 자연 발생적인 L-α-아미노산을 지칭하고, D-아미노산을 포함한다. "아미노산 서열 변이체"라는 구절은 본 개시에 따른 서열 대비 이의 아미노산 서열에 일부 차이가 있는 분자를 나타낸다. 예를 들어 규정된 서열의, 본 개시에 따른 항체의 아미노산 서열 변이체는 인간 IL-17에 결합하거나, 예를 들어 IL-17 유도된 인간 진피 섬유아세포의 IL-6 생성을 억제하는 능력을 여전히 가진다. 아미노산 서열 변이체는 치환 변이체(본 개시에 따른 폴리펩티드에서 동일한 위치에 적어도 하나의 아미노산 잔기가 제거되고 그 위치에 상이한 아미노산이 삽입된 것), 삽입 변이체(본 개시에 따른 폴리펩티드의 특정 위치의 아미노산에 바로 인접하여 삽입된 하나 이상의 아미노산을 갖는 것) 및 결실 변이체(본 개시에 따른 폴리펩티드에서 하나 이상의 아미노산이 제거된 것)를 포함한다.
"유리 시스테인", "비전통적 시스테인" 및 "쌍을 이루지 않은 시스테인"이라는 어구는 상호 교환적으로 보존된 항체 이황화 결합에 관여하지 않는 시스테인을 의미하거나 비항체 폴리펩티드와 관련하여 폴리펩티드의 야생형 구조에서 쌍을 이루지 않은 또 다른 시스테인과 이황화 결합을 형성하지 않는 시스테인을 의미한다. 유리 시스테인은 항체 프레임워크 영역 또는 가변 영역(예를 들어, CDR 내)에 존재할 수 있다. 세쿠키누맙에서, (본원에서 이후에 CysL97로 지칭되는) 서열번호 10으로 제시된 경쇄 가변 영역의 아미노산 97에 해당하는, 서열번호 6으로 제시된 L-CDR3의 아미노산 8은 유리 시스테인이다. 세쿠키누맙의 각 분자는 각 VL 도메인에 하나씩 2개의 이러한 유리 시스테인 잔기를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "선택적 감소"는 WO2016/103146A1에 개시된 바와 같이 포유동물 세포에 의해 재조합적으로 생산된 IL-17 항체 제제에서 CysL97을 선택적으로 감소시키는 방법을 지칭한다. 특히, 항체를 포함하는 제제를 시스템에서 적어도 하나의 환원제와 접촉시켜 환원 혼합물을 형성하고; 약 0.37 h-1 미만의 시스템에서 부피 산소 물질 전달 계수(kLa*)를 유지하면서 환원 혼합물을 인큐베이션하는 것과 같은 다운스트림 처리 단계가 적용되고, 상기 kLa*는 용존 산소 곡선을 포화 곡선에 적용하여 계산된다.
세포 배양 시스템에서 재조합 폴리펩티드 발현 중에 시스테인은 배양 배지에 포함될 수 있거나, 예를 들어, 용기에 첨가되는 유가식 공정 중에 기본 배지에 포함되고/되거나 배지 피드에서 배양 포함될 수 있다. 시스테인은 D-시스테인이 아닌 L-시스테인을 지칭하며, 시스테인 염산염 일수화물과 같은 염의 형태로 첨가될 수 있다. 전형적으로, 단량체성 시스테인은 세포 배양 배지에 첨가되는 즉시 이량체화되므로 이량체 형태의 시스틴으로만 존재한다. 이 산화환원 반응은 2개의 단량체성 시스테인 분자 사이에 이황화 결합을 형성한다. 본 발명의 기본 또는 피드 배지에서 시스테인의 농도는 약 5.0, 4.0, 3.0, 2.5, 2.0, 1.5, 1.0, 0.90, 0.80, 0.70, 0.60, 0.50, 0.45, 0.40, 0.35, 0.30, 0.25, 0.20, 0.15 또는 0.10 g/L 미만일 수 있다. 대안적으로, 기본 배지 및/또는 피드 배지에는 시스테인이 없을 수 있다.
시스틴은 또한 기본 세포 배양 배지에 존재하거나 배지 피드로서, 예를 들어 티로신 시스틴 모액의 일부로서, 배양 배지에 첨가될 수 있다. 본 발명의 기본 또는 피드 배지에서 시스테인의 농도는 약 5.0, 4.0, 3.0, 2.5, 2.0, 1.5, 1.0, 0.90, 0.80, 0.70, 0.60, 0.50, 0.45, 0.40, 0.35, 0.30, 0.25, 0.20, 0.15 또는 0.10 g/L 미만일 수 있다. 대안적으로, 기본 배지 및/또는 피드 배지에는 시스테인이 없을 수 있다.
배양 배지에 첨가된 시스테인은 일반적으로 산화되어 시스틴을 형성하지만 배지에 첨가된 시스틴 중 일부는 환원되어 시스테인을 형성할 수 있으므로 이러한 농도에 대해 위에 주어진 숫자는 산화 또는 환원되었을 수 있는 비율을 나중에 결정하지 않고 배지에 실제로 첨가되는 시스테인 또는 시스틴의 농도를 지칭한다. 따라서, 배양 용기에서 세포가 이용 가능한 시스테인 및/또는 시스틴의 양과 관련하여, "cys-균등물"이라는 용어가 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 이 용어는 총 세포 배양 배지 또는 배지 피드에서 시스테인 및 시스틴의 양 또는 농도를 지칭한다. Cys-균등물은 기본 배지 및/또는 피드 배지로부터 유래되었는지에 관계 없이 세포 배양 배지, 배양 용기에서 세포에 이용 가능한 시스테인/시스틴일 것이다. 따라서, 배양 용기에서, 예를 들어, 유가식 공정을 위한 세포 배양 배지에서, 총 cys 균등물의 농도는 약 5.0, 4.0, 3.0, 2.5, 2.0, 1.5, 1.0, 0.90, 0.80, 0.75, 0.70, 0.65, 0.60, 0.55, 0.50, 0.45, 0.40, 0.35, 0.30, 0.25, 0.20, 0.15 또는 0.10 g/L 미만일 수 있다.
세포 배양 배지, 특히 유가식 공정에서의 cys 균등물은 기본 배지 및/또는 피드 배지로부터 유래될 수 있기 때문에, "누적 cys 균등물"이라는 용어는 기본 배지 및/또는 피드 배지로부터 유래된 세포 배양 배지에서 cys 균등물의 총량 또는 농도를 지칭하기 위해 사용된다. 누적 cys 균등물은 예를 들어 5일, 8일, 10일, 11일 또는 12일 후와 같이 공정 종료 시와 비교하여 유가식 공정 시작 시 농도가 다를 수 있고, 피드 배지가 세포 배양 배지에 첨가되는 공정 중에 달라질 수 있다. 표준 배양 조건 하의 유가식 세포 배양 공정에서, 세포 배양 배지 내의 cys 균등물의 농도는 약 0.5 g/L 내지 약 0.6 g/L 또는 약 4 mM 내지 약 5 mM의 범위일 수 있다. 본 개시에 따른 공정에서, 유가식 공정의 시작 시 세포 배양 배지의 cys 균등물의 농도는 약 0.6 g/L 미만 또는 약 4.5 mM 미만일 수 있다. 예를 들어, 약 0.5 g/L 미만, 약 0.4 g/L 미만, 바람직하게는 약 0.3 g/L 미만, 또는 약 3.5 mM 미만, 약 3.0 mM 미만, 바람직하게는 약 2.5 mM 미만일 수 있다. 유가식 공정 중, cys 균등물의 농도는 약 0.3 g/L 내지 약 0.8 g/L의 세포 배양 배지에 대한 cys 균등물(시스테인 또는 시스틴, 또는 둘 다의 첨가에 의해 기여됨)의 첨가로 인해 변할 수 있다. 이러한 cys 균등물 농도를 달성하기 위해, 피드 배지에서 세포 배양 배지에 첨가되는 시스테인의 농도는 약 1 g/L 미만일 수 있다. 예를 들어, 기본 배지는 첨가된 시스테인을 포함하지 않을 수 있고 피드 배지는 약 1.0 g/L 미만, 예를 들어 약 0.9 g/L 미만, 약 0.8 g/L 미만, 바람직하게는 약 0.7 g/L 미만의 시스테인 농도를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 기본 배지는 첨가된 시스테인을 포함하지 않고 피드 배지는 약 0.66 g/L의 시스테인 농도를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 기본 배지는 첨가된 시스테인을 포함하지 않고 피드 배지는 약 0.33 g/L의 시스테인 농도를 포함한다. 추가 구현예에서, 기본 배지는 첨가된 시스테인을 포함하지 않고 피드 배지는 시스테인을 포함하지 않는다.
피드 배지는 배양 기간 동안 다양한 시점에서 유가식 세포 배양에 첨가될 수 있다. 예를 들어 피드 배지는 배양 기간 동안 매일 세포 배양 배지에 첨가될 수 있거나, 초기 2일 또는 3일 후에 첨가된 다음, 매일 첨가될 수 있다. 피드 배지는 유가식 세포 배양 공정 중에 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회 등으로 첨가될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 유가식 세포 배양 공정의 종료 시, 세포 배양 배지에서 누적 cys 균등물의 농도는 약 0.4 g/L 미만 또는 약 3 mM 미만일 수 있다. 기본 배지 및/또는 피드 배지에서 cys 균등물을 감소시키기 위한 변화가 없는 표준 유가식 세포 배양에서, 세포 배양 배지에서 누적 cys 균등물의 농도는 약 0.6 g/L 또는 약 5 mM일 수 있다. 표준(예: 유가식, 세포 배양 배지)에서 누적 cys 균등물의 이러한 농도는 또한 기준선으로 지칭될 수 있다.
관류 배양에서 신선한 세포 배양 배지는 관류 매개 배지 교환에 의해 세포 배양물에 첨가될 수 있다. 교환은 연속적이거나 불연속적일 수 있다(예를 들어, 배양 기간 동안 다양한 시점에서 수행됨). 예를 들어, 신선한 배지는 배양 기간 동안 연속적으로 배양액 내의 세포 배양 배지와 교환될 수 있거나, 또는 관류 교환이 2일 또는 3일의 초기 기간 후에 개시된 후 연속적으로 교환될 수 있다. 일부 구현예에서, 관류는 배양 일당 세포 배양 배지의 적어도 50%, 바람직하게는 75%, 보다 바람직하게는 99% 또는 약 100%를 교체하기에 충분한 조건 하에서 수행된다.
따라서, 관류 회분식 배양 중에 소비되는 배지의 총 부피는 유가식 배양보다 훨씬 높을 수 있다. 따라서, 관류 배양에 첨가되는 누적 cys 균등물은 상응하게 더 높을 수 있지만, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 의해 제공되는 유리 시스테인 산화의 더 낮은 수준의 산화를 여전히 달성할 수 있다. 예를 들어, 일당 약 100% 배지 교환을 갖는 1000 L 관류 회분식 배양은 약 19,000 L의 소비된 배지의 총 부피에 대해 19일 동안 배양될 수 있다. 그러나 총 배양 부피는 약 1000 L로 유지될 수 있다. 이러한 일 구현예에서, 대조군 관류 배양에 첨가되는 누적 cys 균등물은 배양 부피 리터당 약 7 g 초과, 약 8 g/L 초과, 약 10 g/L 초과, 또는 약 11 g/L 초과, 또는 약 11 g/L 초과일 수 있다. 일부 구현예에서, 대조군 관류 배양에 첨가되는 누적 cys 균등물은 11 또는 11.5 g/L일 수 있거나 약 11 또는 11.5 g/L일 수 있다. 유사하게, 일당 약 100% 배지를 교환하고 감소된 시스테인 및/또는 감소된 cys 균등물 조건 하에 배양된 19일 1000 L 관류 배양에 첨가되는 누적 cys 균등물은 배양 부피 리터당 약 7 g 미만, 6.5 g/L, 6 g/L, 또는 약 5.8 g/L 누적 cys 균등물일 수 있다.
따라서, 관류 회분식 배양과 관련하여, 감소된 cys 균등물 조건은 배양 일수에 의해 정규화된 감소된 누적 cys 균등물 조건을 특징으로 할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 19일 관류 배양이 시작 및 교환 배지에서 약 0.6 g/L cys 균등물의 대조군 조건 하에 일당 배지 부피의 대략 1회 완전 교환으로 배양되는 경우, 정규화된 누적 cys 균등물은 약 0.6 g/L/일일 수 있다. 유사하게, 19일 관류 배양이 시작 및 교환 배지에서 약 0.3 g/L (이하의) cys 균등물의 시험 조건 하에 일당 배지 부피의 대략 1회 완전 교환으로 배양되는 경우, 정규화된 누적 cys 균등물은 0.6 g/L/일 미만, 예컨대, 약 0.3 g/L/일일 수 있다.
일부 구현예에서, 유리 시스테인을 갖는 분비된 재조합 단백질은 0.62 g/L 미만의 cys 균등물을 함유하는 기본 관류 배지에서 포유동물 세포를 배양하고 세포 배양 배지의 전부 또는 일부를 관류 교환 배지로 (예를 들어, 관류에 의해) 연속적으로 또는 불연속적으로 교환함으로써 배양물에 일당 0.62 g/L 미만의 cys 균등물을 첨가하여 관류 회분식 공정에서 생산된다. 일부 경우에, 방법은 (예를 들어, 관류 교환에 의해) 일당 약 0.2 g/L cys 균등물 내지 1 g/L 미만의 cys 균등물을 배양물에 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 (예를 들어, 관류 교환에 의해) 일당 약 0.2 g/L cys 균등물 내지 0.9 g/L 미만의 cys 균등물을 배양물에 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 (예를 들어, 관류 교환에 의해) 일당 약 0.2 g/L cys 균등물 내지 0.6 g/L 미만의 cys 균등물을 배양물에 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 (예를 들어, 관류 교환에 의해) 일당 약 0.2 g/L cys 균등물 내지 0.5 g/L 미만의 cys 균등물을 배양물에 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 방법은 (예를 들어, 관류 교환에 의해) 일당 약 0.2 g/L cys 균등물 내지 0.4 g/L 미만의 cys 균등물을 배양물에 첨가하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 유리 시스테인을 갖는 분비된 재조합 단백질은 0.62 g/L 미만의 cys 균등물을 함유하는 기본 관류 배지에서 포유동물 세포를 배양하고 세포 배양 배지의 전부 또는 일부를 1.1 g/L 미만의 cys 균등물을 함유하는 교환 배지로 (예를 들어, 관류에 의해) 연속적으로 또는 불연속적으로 교환하여 관류 회분식 공정에서 생산된다. 일부 경우에, 관류 교환 배지는 1 g/L 미만, 0.9 g/L 미만, 0.6 g/L 미만, 0.5 g/L 미만, 약 0.4 g/L 미만 또는 약 0.3 g/L 미만의 cys 균등물을 함유한다. 일부 구현예에서, 기본 관류 배지는 0.6 g/L 미만 또는 약 0.3 g/L의 cys 균등물을 함유한다.
일부 구현예에서, 기본 관류 배지는 약 0.2 g/L의 시스테인 내지 약 0.6 g/L 미만의 cys 균등물을 함유한다. 일부 구현예에서, 기본 관류 배지는 약 0.25 g/L의 시스테인 내지 약 0.5 g/L 미만의 cys 균등물을 함유한다. 일부 구현예에서, 기본 관류 배지는 약 0.3 g/L의 시스테인 내지 약 0.4 g/L 미만의 cys 균등물을 함유한다. 일부 구현예에서, 관류 교환 배지는 약 0.2 g/L의 시스테인 내지 약 1.1 g/L 미만의 cys 균등물을 함유한다. 일부 구현예에서, 관류 교환 배지는 약 0.25 g/L의 시스테인 내지 약 0.9 g/L 미만의 cys 균등물을 함유한다. 일부 구현예에서, 관류 교환 배지는 약 0.3 g/L의 시스테인 내지 약 0.6 g/L 미만의 cys 균등물을 함유한다. 일부 구현예에서, 관류 기본 배지는 시스테인을 함유하지 않거나 실질적으로 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 관류 교환 배지는 시스테인을 함유하지 않거나 실질적으로 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 관류 기본 배지 및/또는 관류 교환 배지는 시스테인을 함유하지 않거나 실질적으로 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 관류 기본 배지 및 관류 교환 배지는 동일하거나 실질적으로 동일하다. 실질적으로 시스테인을 함유하지 않는 생산(예를 들어, 관류 기본 또는 교환 생산 또는 유가식 기본 또는 피드) 배지는 잔류 확장 배양 배지의 존재, 숙주 세포에 의한 시스테인 생산 및/또는 생산 배양 중의 시스틴의 감소로 인해 잔류량의 시스테인이 존재하는 배지를 포함한다. 실질적으로 시스테인을 함유하지 않는 기본, 교환 또는 피드 배지는 0.1 g/L 미만의 시스테인, 바람직하게는 0.05 g/L 미만의 시스테인, 보다 바람직하게는 0.01 g/L 미만의 시스테인을 함유한다.
일부 구현예에서, 활성은 시스타민-CEX(양이온 교환 크로마토그래피) 방법에 의해 측정된다. 시스타민-CEX 방법은 항체를 시스타민(2,2'-디티오비스(에틸아민))으로 유도체화한 후, 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)를 이용한 분석 분리를 포함한다. CysL97이 산화된 형태인 경우 본원에 개시된 항체(예를 들어, 세쿠키누맙)의 활성이 감소되기 때문에, 시스타민에 의한 CysL97의 유도체화는 항체 활성을 측정하기 위한 대용물 역할을 한다. 시스타민에 의한 유도체화는 유리 Cys97 잔기당 하나의 양전하를 추가한다. 생성된 세쿠키누맙의 유도체화된 형태(예를 들어, +2, +1 전하)는 이어서 비유도체화된 형태로부터 분리되고 CEX에 의해 정량화될 수 있다. 양쪽 경쇄에서 쌍을 이루지 않은 Cys97에 결합된 2개의 시스타민을 갖는 시스타민 유도체화된 세쿠키누맙 분자는 이론적으로 100% 생물학적 활성으로 간주될 수 있다. 경쇄 중 하나의 쌍을 이루지 않은 Cys97에 결합된 하나의 시스타민이 추가된 시스타민 유도체화된 세쿠키누맙 분자는 50% 생물학적 활성으로 간주될 수 있다. 분자에 결합된 임의의 시스타민이 없는 시스타민 유도체화된 세쿠키누맙 분자는 생물학적 불활성으로 간주될 수 있다. 그러면 항체 제제(예를 들어, 세쿠키누맙 항체 제제)에서 시스타민 유도체화 수준은 해당 제제에서 시스타민 유도체화의 이론적 최대 수준(예를 들어, 이론적 최대치의 백분율로 표시됨)과 비교하여 제제의 활성의 척도로서 사용될 수 있다.
요약하면, 시스타민-CEX는 다음과 같이 수행될 수 있다. 항체 샘플(50 μg)을 먼저 카복시펩티다제 B(1:40, w:w)로 처리하여 중쇄에서 C-말단 리신을 제거한 후, 실온에서 2시간 동안 5 mM 아세트산나트륨, 0.5 mM EDTA, pH4.7에서 4 mM 시스타민으로 유도체화하였다. 유도체화는 2 μL의 1 M 인산을 첨가하여 중단한다. CEX는 ProPac™ WCX-10 분석 컬럼(4 mm x 250 mm, Dionex)을 사용하여 시스타민 유도체화된 항체 샘플에서 수행된다. 유속 1.0 ml/분에서 pH 6.0의 25 mM 인산나트륨 중 12.5 mM 내지 92.5 mM 염화나트륨 구배를 분리에 사용한다. 220 nm에서의 흡수를 UV 검출기(Agilent HPLC 1200)로 기록한다.
IL-17 항체 및 이의 항원 결합 단편
일 구현예에서, IL-17 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하고, 상기 CDR1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 3의 아미노산 서열을 가진다. 일 구현예에서, IL-17 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 초가변 영역 CDR1', CDR2' 및 CDR3'을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL')을 포함하고, 상기 CDR1'은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2'은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3'은 서열번호 6의 아미노산 서열을 가진다. 일 구현예에서, IL-17 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 초가변 영역 CDR1-x, CDR2-x 및 CDR3-x를 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하고, 상기 CDR1-x는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2-x는 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3-x는 서열번호 13의 아미노산 서열을 가진다.
일 구현예에서, IL-17 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 적어도 하나의 면역글로불린 VH 도메인 및 적어도 하나의 면역글로불린 VL 도메인을 포함하며, a) VH 도메인은 (예를 들어, 서열에서) i) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 3의 아미노산 서열을 가짐); 또는 ii) 초가변 영역 CDR1-x, CDR2-x 및 CDR3-x(상기 CDR1-x는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2-x는 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3-x는 서열번호 13의 아미노산 서열을 가짐)를 포함하고; b) VL 도메인은 (예를 들어, 서열에서) 초가변 영역 CDR1', CDR2' 및 CDR3'(상기 CDR1'은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2'은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3'은 서열번호 6의 아미노산 서열을 가짐)을 포함한다.
일 구현예에서, IL-17 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 a) 서열번호 8로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH); b) 서열번호 10으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL); c) 서열번호 8로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인 및 서열번호 10으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인; d) 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 제시된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인; e) 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 제시된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인; f) 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13으로 제시된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인; g) 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 제시된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 제시된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인; 또는 h) 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13으로 제시된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 제시된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인을 포함한다.
용이한 참조를 위해, Kabat 정의에 기초한, Chothia 및 동료의 접근법을 사용하여 X선 분석에 의해 결정된 바와 같은 세쿠키누맙 단클론 항체의 초가변 영역의 아미노산 서열은 하기 표 1에 제공된다.
[표 1]
세쿠키누맙 항체의 초가변 영역의 아미노산 서열
바람직한 구현예에서, 불변 영역 도메인은 바람직하게는 또한 예를 들어 문헌["Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat E.A. et al, US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institute of Health]에 기술된 바와 같은 적합한 인간 불변 영역 도메인을 포함한다. 세쿠키누맙의 VL을 암호화하는 DNA는 서열번호 9에 제시되어 있다. 세쿠키누맙의 VH를 암호화하는 DNA는 서열번호 7에 제시되어 있다.
일부 구현예에서, IL-17 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어 세쿠키누맙)은 서열번호 10의 3개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, IL-17 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 8의 3개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, IL-17 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 10의 3개의 CDR 및 서열번호 8의 3개의 CDR을 포함한다. 서열번호 8 및 서열번호 10의 CDR은 표 1에서 확인될 수 있다. 경쇄에서의 유리 시스테인(CysL97)은 서열번호 6에서 볼 수 있다.
일부 구현예에서, IL-17 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 14의 경쇄를 포함한다. 다른 구현예에서, IL-17 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (C-말단 리신과 함께 또는 이것 없이) 서열번호 15의 중쇄를 포함한다. 다른 구현예에서, IL-17 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 14의 경쇄 및 (C-말단 리신과 함께 또는 이것 없이) 서열번호 15의 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-17 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 14의 3개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, IL-17 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 15의 3개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, IL-17 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 14의 3개의 CDR 및 서열번호 15의 3개의 CDR을 포함한다. 서열번호 14 및 서열번호 15의 CDR은 표 1에서 확인될 수 있다. 전체 서열 세트는 표에서 찾을 수 있다.
초가변 영역은 임의의 종류의 프레임워크 영역과 회합될 수 있지만, 바람직하게는 인간 기원이다. 적합한 프레임워크 영역은 Kabat E.A 등의 상기 문헌에 기재되어 있다. 바람직한 중쇄 프레임워크는 인간 중쇄 프레임워크, 예를 들어 세쿠키누맙 항체의 것이다. 이는 서열에서 예를 들어 FR1(서열번호 8의 1번 내지 30번 아미노산), FR2(서열번호 8의 36번 내지 49번 아미노산), FR3(서열번호 8의 67번 내지 98번 아미노산), 및 FR4(서열번호 8의 117번 내지 127번 아미노산) 영역으로 이루어진다. X선 분석에 의한 세쿠키누맙의 결정된 초가변 영역을 고려하면, 또 다른 바람직한 중쇄 프레임워크는 서열에서 FR1-x(서열번호 8의 1번 내지 25번 아미노산), FR2-x(서열번호 8의 36번 내지 49번 아미노산), FR3-x(서열번호 8의 61번 내지 95번 아미노산), 및 FR4(서열번호 8의 119번 내지 127번 아미노산) 영역으로 이루어진다. 유사한 방식으로, 경쇄 프레임워크는 서열에서 FR1'(서열번호 10의 1번 내지 23번 아미노산), FR2'(서열번호 10의 36번 내지 50번 아미노산), FR3'(서열번호 10의 58번 내지 89번 아미노산), 및 FR4'(서열번호 10의 99번 내지 109번 아미노산) 영역으로 이루어진다.
일 구현예에서, IL-17 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 세쿠키누맙)은 적어도 하기를 포함하는 인간 IL-17 항체로부터 선택된다: a) 서열에서, 인간 중쇄의 초가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 가변 도메인 및 불변 부분 또는 이의 단편을 포함하는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 단편(상기 CDR1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 3의 아미노산 서열을 가짐); 및 b) 서열에서, 인간 경쇄의 초가변 영역 CDR1', CDR2', 및 CDR3'을 포함하는 가변 도메인 및 불변 부분 또는 이의 단편을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 이의 단편(상기 CDR1'은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2'은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3'은 서열번호 6의 아미노산 서열을 가짐).
일 구현예에서, IL-17 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기를 포함하는 항원 결합 부위를 포함하는 단쇄 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로부터 선택된다: a) 서열에서, 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제1 도메인(상기 CDR1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3은 서열번호 3의 아미노산 서열을 가짐); 및 b) 서열에서, 초가변 영역 CDR1', CDR2' 및 CDR3'을 포함하는 제2 도메인(상기 CDR1'은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR2'은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고, 상기 CDR3'은 서열번호 6의 아미노산 서열을 가짐); 및 c) 제1 도메인의 N-말단 맨 끝과 제2 도메인의 C-말단 맨 끝 또는 제1 도메인의 C-말단 맨 끝과 제2 도메인의 N-말단 맨 끝에 결합되는 펩티드 링커.
대안적으로, 개시된 방법에 사용되는 바와 같은 IL-17 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본원에 서열에 의해 제시된 IL-17 항체의 유도체(예를 들어, 세쿠키누맙의 페길화 버전)를 포함할 수 있다. 대안적으로, 개시된 방법에 사용되는 IL-17 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 VH 또는 VL 도메인은 본원에 제시된 VH 또는 VL 도메인과 실질적으로 동일한 VH 또는 VL 도메인(예를 들어, 서열번호 8 및 서열번호 10에 제시된 것)을 가질 수 있다. 본원에 개시된 인간 IL-17 항체는 (C-말단 리신과 함께 또는 이것 없이) 서열번호 15로 제시된 것과 실질적으로 동일한 중쇄 및/또는 서열번호 14로 제시된 것과 실질적으로 동일한 경쇄를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 인간 IL-17 항체는 (C-말단 리신과 함께 또는 이것 없이) 서열번호 15를 포함하는 중쇄 및 서열번호 14를 포함하는 경쇄를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 인간 IL-17 항체는 a) 인간 중쇄의, 서열번호 8에 기재된 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지는 가변 도메인 및 불변 부분을 포함하는 하나의 중쇄; 및 b) 인간 경쇄의, 서열번호 10에 기재된 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지는 가변 도메인 및 불변 부분을 포함하는 하나의 경쇄를 포함할 수 있다.
대안적으로, 개시된 방법에서 사용된 IL-17 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CysL97을 함유하는 한 본원에 제시된 기준 IL-17 항체의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 본 개시는 또한 IL-17 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 세쿠키누맙)을 포함하고, 여기서 (CysL97이 아니라) 세쿠키누맙의 VH 또는 VL 도메인의 아미노산 잔기들 중 하나 이상, 전형적으로 오직 약간(예를 들어, 1개 내지 10개)은 예를 들어 돌연변이, 예를 들어 상응하는 DNA 서열의 부위 지정 돌연변이유발에 의해 변화된다. 유도체 및 변이체의 모든 이러한 경우에, IL-17 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 분자의 약 50 nM 이하, 약 20 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 5 nM 이하, 약 2 nM 이하, 또는 더 바람직하게는 약 1 nM 이하의 농도에서 약 1 nM(= 30 ng/ml)의 인간 IL-17의 활성을 50%로 억제할 수 있고, 상기 억제 활성은 WO 2006/013107의 실시예 1에 기재된 바와 같은 인간 진피 섬유아세포에서 hu-IL-17에 의해 유도된 IL-6 생성에서 측정된다.
일부 구현예에서, IL-17 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예를 들어 세쿠키누맙은 Leu74, Tyr85, His86, Met87, Asn88, Val124, Thr125, Pro126, Ile127, Val128, His129를 포함하는 성숙 인간 IL-17의 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, IL-17 항체, 예를 들어 세쿠키누맙은 Tyr43, Tyr44, Arg46, Ala79, Asp80을 포함하는 성숙 인간 IL-17의 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, IL-17 항체, 예를 들어 세쿠키누맙은 2개의 성숙 인간 IL-17 사슬을 가지는 IL-17 동종이량체의 에피토프에 결합하고, 상기 에피토프는 하나의 사슬에서 Leu74, Tyr85, His86, Met87, Asn88, Val124, Thr125, Pro126, Ile127, Val128, His129를 포함하고, 다른 사슬에서 Tyr43, Tyr44, Arg46, Ala79, Asp80을 포함한다. 이 에피토프를 정의하기 위해 사용된 잔기 넘버링 체계는 잔기에 기초하는데, 하나는 성숙 단백질의 제1 아미노산(즉, 23개의 아미노산 N-말단 신호 펩티드가 결여되고 글리신으로 시작하는 IL-17A)이다. 미성숙 IL-17A에 대한 서열은 Swiss-Prot 목록 Q16552에 제시되어 있다. 일부 구현예에서, IL-17 항체는 KD가 약 100 내지 200 pM이다. 일부 구현예에서, IL-17 항체는 약 0.67 nM의 인간 IL-17A의 생물학적 활성의 시험관 내 중화에 대해 IC50이 약 0.4 nM이다. 일부 구현예에서, 피하(s.c.) 투여된 IL-17 항체의 절대 생체이용률은 범위가 약 60 내지 약 80%, 예를 들어 약 76%이다. 일부 구현예에서, IL-17 항체, 예컨대 세쿠키누맙은 제거 반감기가 약 4주(예를 들어, 약 23일 내지 약 35일, 약 23일 내지 약 30일, 예를 들어 약 30일)이다. 일부 구현예에서, IL-17 항체(예컨대 세쿠키누맙)는 Tmax가 약 7일 내지 8일이다.
개시된 방법에 사용된 특히 바람직한 IL-17 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 항체, 특히 WO 2006/013107호의 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같은 세쿠키누맙이다. 세쿠키누맙은 현재 면역 매개 염증성 병태의 치료를 위해 임상 시험 중인 IgG1/카파 아이소타입의 재조합 고친화성 완전 인간 단클론 항-인간 인터루킨-17A(IL-17A, IL-17) 항체이다. 세쿠키누맙(예를 들어, WO 2006/013107 및 WO 2007/117749 참고)은 IL-17에 대한 매우 높은 친화도, 즉 약 100 pM 내지 200 pM의 KD 및 약 0.67 nM의 인간 IL-17A의 생물학적 활성의 시험관 내 중화에 대한 약 0.4 nM의 IC50을 가진다. 따라서, 세쿠키누맙은 약 1:1의 몰 비로 항원을 억제한다. 이 높은 결합 친화도는 세쿠키누맙 항체를 치료적 적용에 특히 적합하게 한다. 더욱이, 세쿠키누맙은 매우 긴 반감기(즉, 약 4주)를 갖는 것으로 결정되었는데, 이는 류마티스 관절염과 같은 만성 평생 장애를 치료할 때 예외적인 특성인 투여 사이의 연장된 기간을 가능하게 한다.
위에 언급된 IL-17 항체 및 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 세쿠키누맙)의 제조 방법이 본원에 개시된다. 개시된 방법은 비용을 줄이기 위해 항체(예를 들어, IL-17 항체, 예를 들어, 세쿠키누맙)의 제제에 대해 편리하게 수행될 수 있다. 항체의 "제제"는 복수의 항체 분자를 갖는 조성물(예를 들어, 용액)을 지칭한다. "제제"는 IL-17 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 임의의 액체 조성물을 포함한다. 이와 같이, 제제는 예를 들어, IL-17 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예를 들어 세쿠키누맙을 물 또는 완충액, 컬럼 용출액, 투석 완충액 등에 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체의 초기 제제는 완충액(예: Tris, 예: 1 mM 내지 1 M Tris, pH 6.0~8.0) 또는 WFI에 IL-17 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예를 들어 세쿠키누맙의 풀을 포함한다.
위의 발명의 일부 구현예에서, IL-17 항체 또는 항원 결합 단편은 i) 서열번호 8로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH); ii) 서열번호 10으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL); iii) 서열번호 8로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인 및 서열번호 10으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인; iv) 서열에서, 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 제시된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인; v) 서열에서, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 제시된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인; vi) 서열에서, 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13으로 제시된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인; vii) 서열에서, 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 제시된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인 및 서열에서, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 제시된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인; 및 viii) 서열에서, 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13으로 제시된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VH 도메인 및 서열에서, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 제시된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 VL 도메인을 포함한다. 개시된 방법의 일부 구현예에서, IL-17 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 IgG1 아이소타입의 인간 항체이다. 개시된 방법의 일부 구현예에서, 항체는 세쿠키누맙이다.
재조합 항체 생산
재조합 폴리펩티드의 제조는 전통적으로 두 가지 주요 단계로 나뉜다: 업스트림(세포 배양 및 표적 폴리펩티드의 합성) 및 다운스트림(폴리펩티드의 정제 및 원료 의약품 또는 완제 의약품으로의 제형화).
보다 구체적으로, 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제제는 임의의 포유동물 세포주, 예를 들어 중국 햄스터 난소 세포(CHO) 세포, 마우스 골수종 NS0 세포, 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포, 인간 배아 신장 세포주 HEK-293, 인간 망막 세포주 Per.C6(Crucell, NL), HKB11 세포 클론(HEK 293S와 버킷 림프종 세포주 2B8의 하이브리드 세포 융합체로부터 유래) 등에 의해 재조합적으로 생산될 수 있다. "포유동물 세포에 의해 재조합적으로 생산된"은 재조합 DNA 기술을 사용하여 포유동물 세포에서 항체 생산이 달성되었음을 의미한다.
CHO 세포는 현재 생물학적 및 의학적 연구, 특히 인간 치료 단백질의 발현에 가장 널리 사용되는 포유동물 숙주이며, 재조합 치료 단백질의 약 70%가 CHO 세포 시스템에서 생산되는 것으로 보고되었다. CHO 세포는 고가의 배양 배지를 필요로 하고 대장균 및 효모 발현 시스템에 비해 상대적으로 느리게 성장하지만, 인간 세포와 같이 보다 정확한 단백질 글리코실화, 조립 및 접힘을 가능하게 한다. 따라서, 활성이 번역 후 변형과 밀접한 관련이 있는 일부 단백질의 경우 CHO 세포가 바람직한 생산 숙주이다. CHO 세포는 또한 원핵생물 숙주에서 능동적으로 발현될 수 없는 매우 큰 분자를 효율적으로 합성한다. 적합한 CHO 세포주는 예를 들어, CHO-S(Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재), CHO Kl(ATCC CCL-61), CHO pro3-, CHO DG44, CHO P12 또는 dhfr- CHO 세포주 DUK-BII(Urlaub G & Chasin LA (1980) PNAS 77(7): 4216-4220), DUXBI 1(Simonsen CC & Levinson AD (1983) PNAS 80(9): 2495-2499), 또는 CHO-K1SV(Lonza, 스위스 바젤 소재)를 포함한다. 에리스로포이에틴(Epogen; Amgen), TNFα 수용체 융합체(Enbrel; Amgen), 항-HER2 항체(Herceptin; Genentech), 항-TNFα 항체(Humira; Abbvie) 및 VEGF 항체(Avastin; Genentech)와 같은 많은 CHO 세포 유래 제품들이 규제 승인을 받았다.
재조합 단백질의 산업적 생산을 위해, 생물제조에 사용되는 가장 일반적인 배양 모드는 유가식 및 관류식이다. 하나의 기술 또는 나머지 기술의 사용은 단백질 또는 숙주(Kadouri & Spier, (1997) Cytotechnology 24: 89-98)에 연결된 다양한 인자에 따라 달라지며, 배양된 세포는 담체에 부착되어 있거나 현탁액 중에 있다. 가장 일반적인 공정 중 하나는 접종 후 배지 소비로 인한 한계에 도달하고 세포 밀도가 감소하기 시작할 때까지 세포가 성장하고 생산하는 회분식 생물 반응기이다. 두 번째로 매우 일반적인 공정은 배양하는 동안 상이한 시점에 고농축 피드를 첨가하여 영양소 제한을 방지하는 유가식이다. 따라서, 배양 기간이 회분식 모드보다 길고 최종 생산성은 증가된다. 배지가 연속적으로 공급되고 수확물이 연속적으로 제거되는 연속 공정의 경우, 가장 간단한 것 중 하나는 배지가 일정한 유속으로 첨가되고 생물 반응기 내용물이 세포 보유 없이 동일한 유속으로 제거되는 케모스타트 공정이다(Henry O et al., (2008) Biotechnol. Prog., 921-931). 대안적인 연속 공정은 일정한 흐름이 들어오고 나가지만 세포는 이제 생물 반응기 내부에 보유되는 관류이다. 단클론 항체와 같은 안정적인 단백질 생산을 위한 현재의 산업 표준은 최대 20 kL의 교반 탱크 생물 반응기에서의 유가식 공정이다. 이러한 배양 용기는 매우 높은 혼합 및 물질 전달 속도를 제공할 수 있고, 작업 부피에 대한 높은 유연성을 제공할 수 있으며, 다양한 세포 유형 및 작동 모드에 사용될 수 있다(Rodrigues ME et al., (2010) Biorechnol. Prog. 26: 332-51).
배지 개발은 첫째는 공정 성능 때문이지만, 둘째로, 또한 더욱 중요하게는, 안전상의 이유로, 생물제조 초기부터 세포 배양 개발 및 최적화의 가장 중요한 측면이었다. 최초의 세포 배양 배지는 동물 유래 제품을 사용하여 제조되었다(Yao & Asayama, (2017) Reprod. Med. Biol., 16: 99-117). 환자에 대한 결과는 바이러스 및 프리온과 같은 많은 유해 인자에 대한 노출이었고, 특히 만성 질환의 경우 환자가 지속적으로 약물에 노출되었기 때문에 환자의 감염 위험이 중요했다(Grillberger L et al., (2009) Biotechnol. J., 4: 186-201). 배치 이질성으로 인한 공정 비일관성 또한 동물 또는 심지어 식물 유래 배지 성분을 줄이는 동인이었으며 오늘날에도 세포 성장을 향상시킬 수 있는 화학적으로 정의된 배지를 최적화하는 데 상당한 노력을 기울이고 있다.
화학적으로 정의된 배지는 현재 상업적으로 이용 가능하며 대부분의 대규모 생물제조업체는 자체 제형을 개발했다. 예를 들어 고농축 피드는 용해도 또는 안정성 제약을 유발하는 일부 화합물의 물리적 특성 때문에 어려울 수 있다. 특히 단클론 항체 및 기타 재조합 폴리펩티드의 상업적 제조를 목표로 하는 CHO 세포 배양 배지 및 공정 매개변수의 추가 최적화는 세포 밀도 및 단백질 발현을 극적으로 증가시켰고, 일부 경우 역가가 10 g/L 초과에 달했다(Li F et al., (2010) MAbs, 2(5): 466-479; Lu F et al., (2013) Biotechnol Bioeng., 110(1): 191-205; Xing Z et al., (2011) Process Biochem., 46(7): 1432-9). 세포 배양 배지를 전문으로 하는 몇몇 업체는 특히 재조합 CHO 제조 공정을 위한 기본 및 피드 배지 조합을 개발하고 최적화했다(ThermoFisher(미국 매사추세츠주 월섬 소재), GE Healthcare(미국 위스콘신주 워키쇼 소재), MilliporeSigma(미국 미주리주 세인트루이스 소재), Lonza(스위스 바젤 소재), Irvine Scientific(미국 캘리포니아주 산타아나 소재)).
이러한 상업적으로 이용 가능한 배지의 제형은 일반적으로 독점적이나, 모든 세포 배양 배지는 생명과 세포 성장을 뒷받침하는 데 필수적인 유사한 기본 영양소를 필요로 한다. 탄소, 질소 및 인산염의 공급원과 함께, 물, 특정 아미노산, 지방산, 비타민, 미량 원소 및 염은 모두 세포의 화학적 구성, 원하는 세포 밀도에 도달하는 데 필요한 계산된 양, 그리고 세포 생존력을 유지하고 확장하기 위해 중요한 성분들이 보충될 수 있도록 영양소 고갈률에 대한 지식을 기반으로 한 농도로 공급된다. 특히, 아미노산은 CHO 세포 배양 배지, 특히 화학적으로 정의된 배지의 핵심 성분으로, 연구 결과에 따르면 세포 배양 배지의 아미노산 조성의 작은 변화는 성장 프로파일과 역가를 변경시킬 수 있고, 생성물 글리코실화 패턴에 상당한 영향을 미칠 수도 있는 것으로 나타났다(Fan Y et al., (2015) Biotechnol. Bioeng., 112(3): 521-35).
일반적으로 아미노산은 포유동물 세포에 의해 합성될 수 있는 비필수 아미노산과 세포가 합성할 수 없어 세포 배양 배지의 성분으로 공급되어야 하는 필수 아미노산으로 분류할 수 있다. 비필수 아미노산과 필수 아미노산은 모두 CHO 세포 성장에 상당한 영향을 미칠 수 있고, 배지 제형에서 비필수 아미노산과 필수 아미노산의 상대적 농도 최적화는 재조합 단클론 항체의 생산성을 개선하는 것으로 나타났다(Parampalli A et al., (2007) Cytotechnology, 54(1): 57-68). 필수 아미노산에는 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판 및 발린이 포함되고, 대부분의 경우 모든 필수 아미노산은 CHO 세포 배양 배지에 요구된다.
비필수 아미노산에는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 프롤린, 세린 및 티로신이 포함된다. 비필수 아미노산이 배양 중인 포유동물 세포에 의해 합성될 수 있다는 사실에도 불구하고, 대부분의 세포 배양 배지는 여전히 세포 성장 및 폴리펩티드 생산을 뒷받침하는 이러한 아미노산의 대부분 또는 전부를 함유한다. 대부분의 비필수 아미노산은 세포 배양 공정에 상당한 영향을 미칠 수 있다.
특히, 유일한 티올 함유 아미노산인 시스테인은 단클론항체 생산에 특별한 비필수 아미노산이다. 시스테인 잔기 상의 설프하이드릴 기 사이의 이황화 가교의 형성은 CHO 세포의 구조적 단백질 및 재조합 항체 생성물의 3차 및 4차 구조의 접힘을 뒷받침한다. 시스테인 제한은 CHO 세포 성장에 치명적이고 비가역적일 수 있으며, 세포 생존력 저하로 이어질 수 있다. Ghaffari 등(2020)의 연구에서, 글루타민, 아스파라긴 및 시스테인 제한이 세포 성장, 대사, 항체 생산성 및 생성물 글리코실화에 미치는 영향이 3종의 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주(CHO-DXB11, CHO-K1SV 및 CHO-S)에서 조사되었다. 시스테인 제한은 3종의 CHO 세포주 모두에서 세포 증식과 생산성에 불리했다. 연구한 세 가지 아미노산 제한 중, 시스테인 제한은 배양물 성장 및 생산성뿐만 아니라 mAb 글리코실화에 가장 큰 불리한 영향을 미쳤다. 시스테인은 용해도가 낮고 산업 규모, 특히 높은 세포 농도에서 일반적으로 사용되는 불연속 공급 프로토콜에서 제한적이 될 수 있다. Ghaffari 등은 CHO-DXB11 세포가 시스테인 제한을 견딜 수 있는 기간을 조사하였는데, 이들 세포를 처음에는 시스테인이 없는 BIOGRO 배지에서 성장시켰다. 그런 다음, 시스테인 농도를 농축된 시스테인 용액을 첨가하여 배양 1일 또는 2일에 0.4 mM로 회복시켰다. 시스테인 수준이 1일에 회복되었을 경우, 세포는 추가로 유도기에 머물렀다가 2일에 성장을 재개하였고, 5일까지 이러한 배양물은 대조군과 유사한 농도에 도달했다. 시스테인 제한 배양 2일 후 시스테인 수준을 회복시키는 것은 비효과적인 것으로 증명되었고, 세포는 성장하지 않았다. (Ghaffari N et al., (2020) Biotech. Prog., 36: e2946). 축약하면, 1 mM 초과의 시스테인 농도는 구리 존재 시 더 가속화될 수 있는 지질 과산화 및 하이드록실 라디칼 형성으로 인해 포유동물 세포에 유독할 수 있다(Ritacco FV et al (2018) Biotechnol. Prog., 34(6): 1407-26). 포유동물에서, 시스테인 풀은 간에 의해 조절되는데, CHO 세포에서는 이러한 조절 메커니즘이 없으므로, 배지의 시스테인 농도는 세포 배양 공정을 위해 신중하게 설계되고 제어되어야 한다(Stipanuk MH et al., (2006) J. Nutr., 136(6): 1652S-59S).
예를 들어, 본원에 기재된 방법에서 사용하기 위한 IL-17 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 재조합 폴리펩티드 제제는 임의의 포유동물 세포주를 사용하여 임의의 포유동물 세포에 의해 재조합적으로 생산될 수 있다. 바람직하게는 포유동물 세포주는 CHO 세포이다. 재조합 폴리펩티드, 예를 들어, 항-IL-17 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 연속 제조 시스템에서 또는 배양 배지에 피드를 첨가하는 유가식 시스템을 사용하여 생산될 수 있다. 전술한 바와 같이, 항-IL-17 항체 세쿠키누맙은 항원 인식 및 결합에 관여하는 쌍을 이루지 않은 유리 시스테인을 포함한다. 이 유리 시스테인 잔기는 경쇄 상보성 결정 영역(CDR) 3 루프, 즉 서열번호 6으로 제시된 L-CDR3의 아미노산 8에서 시스-프롤린 다음에 발견되며, 이는 서열번호 10으로 제시된 경쇄 가변 영역의 아미노산 97에 해당하며 "CysL97"로 지칭된다. 완전한 활성을 유지하기 위해, 이 유리 시스테인 잔기는 다른 시스테인 잔기와의 산화적 이황화물 쌍 형성에 의해 또는 외인성 화합물에 의한 산화에 의해 마스킹될 수 없다. 또한, 이 유리 시스테인의 변형은 항체의 활성과 안정성에 부정적인 영향을 미칠 수 있고, 면역원성을 증가시킬 수 있다. 따라서, 최종 생성물이 상당한 양의 불활성 항체 물질을 포함할 수 있으므로, 세쿠키누맙의 처리가 어려울 수 있다. 그러나 세쿠키누맙은 포유동물 세포, 특히 CHO 세포를 사용하여 제조되기 때문에, CysL97의 세포 기반 변형이 발생하며, 이는 수율과 항체 활성에 영향을 미칠 수 있다.
위에서 논의된 바와 같이, "cys-균등물"이라는 용어는 기본 배지 및/또는 피드 배지로부터 유래되었는지에 관계 없이 배양 용기에서 배양 배지에서 세포가 이용 가능한 시스테인 및 시스틴을 지칭한다. 놀랍게도, 세쿠키누맙의 세포 배양 성장 배지에서 cys 균등물의 양을 감소시키자 유리 시스테인 CysL97의 변형이 감소하는 것으로 밝혀졌다. 이는 결국 생산 방법에 의해 생산되는 활성 항체의 증가, 즉, 생성물 품질의 증가로 이어진다. 확립된 연구(예를 들어, Ghaffari 등(위 문헌 참조))와 달리, 생산 배지 및 배지 피드에서 시스테인의 감소는 세쿠키누맙의 수율에 부정적인 영향을 미치지 않았다.
재조합 폴리펩티드의 정제
본원에 기재된 바와 같은 세포 배양 방법에 따라 생산되는 재조합 폴리펩티드의 실질적으로 균질한 제제를 얻기 위해서는 정제 단계가 필요하다. 첫 번째 단계로서, 배양 배지 또는 용해물을 일반적으로 원심분리하여 미립자 세포편을 제거한다. 생산된 폴리펩티드는 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 편리하게 정제할 수 있다. 이온교환 컬럼 상에서의 분별화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 Sepharose 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 상의 크로마토그래피(예컨대, 폴리아스파트산 컬럼), 크로마토포커싱, SDS- PAGE, 및 황산암모늄 침전과 같은 다른 단백질 정제기술도 사용할 수 있다.
제약 조성물, 투여 및 키트
하나 이상의 제약상 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 조합한, 본원에 기재된 바와 같은 재조합 폴리펩티드를 포함하는 제약 조성물이 본원에 제공된다. 본 개시의 분자를 포함하는 제약 또는 멸균 조성물을 제조하기 위해, 분자는 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합된다.
"제약상 허용되는"이란 어구는 연방정부 또는 주정부의 규제기관에 의해 승인되었거나, 동물, 보다 구체적으로는 인간에 사용하기 위한 용도로 미국 약전 또는 일반적으로 인정되는 다른 약전에 등재되었음을 의미한다. "제약 조성물"이라는 용어는 적어도 하나의 활성 성분(예: 본 개시의 항체 또는 단편)과 적어도 하나의 제약상 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체의 혼합물을 지칭한다. "약제"는 의학적 치료에 사용하는 물질을 지칭한다.
치료제 및 진단제의 제약 조성물은 생리적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와, 예를 들어 동결건조 분말, 슬러리, 수성 용액, 로션, 또는 현탁액의 형태로 혼합하여 제조될 수 있다(예를 들어, 문헌[Hardman et al., (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.]; 문헌[Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N.Y.]; 문헌[Avis et al., (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: parenteral Medications, Marcel Dekker, NY]; 문헌[Lieberman, et al., (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY]; 문헌[Lieberman, et al., (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY]; 문헌[Weiner & Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.] 참조).
치료제에 대한 투여 요법의 선택은 개체의 혈청 또는 조직 전환율, 증상의 수준, 개체의 면역원성, 및 생물학적 기질 내 표적 세포의 접근성을 포함한 여러 인자에 따라 다르다. 특정 구현예에서, 투여 요법은 허용가능한 부작용 수준에 맞게 환자에게 전달되는 치료제의 양을 최대화한다. 따라서, 전달되는 생물제제의 양은 부분적으로 특정 개체 및 치료되는 병태의 중증도에 따라 다르다. 항체, 사이토카인 및 소분자의 적절한 용량을 선택하는 데 있어서 지침을 이용할 수 있다(예를 들어, 문헌[Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK]; 문헌[Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, N.Y.]; 문헌[Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, N.Y.]; 문헌[Baert et al., (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608]; 문헌[Milgrom et al., (1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973]; 문헌[Slamon, et al. (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792]; 문헌[Beniaminovitz et al., (2000) New Engl. J. Med. 342:613-619]; 문헌[Ghosh et al., (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32]; 문헌[Lipsky et al., (2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602] 참조).
본 개시는 IL-17에 의해 매개되는 병리학적 장애, 예를 들어 자가면역 질환 또는 염증성 장애 또는 병태를 갖는 환자를 치료하기 위한 키트를 추가로 포함한다. 이러한 키트는 본원에 기재된 방법에 따라 생산된 치료적 유효량의 항체 및 환자를 위한 항-IL-17 항체의 권장 용량 요법을 나타내는 포장 리플렛을 포함한다. 바람직하게는 항체는 세쿠키누맙과 같은 항-IL-17 항체이다. 추가로, 이러한 키트는 항체를 투여하기 위한 수단(예를 들어, 자동주사장치, 시린지 및 바이알, 사전충전형 시린지, 사전충전형 펜) 및 사용 지침을 포함할 수 있다. 키트는 또한 환자를 치료하기 위한 항-IL-17 항체의 투여에 대한 지침을 포함할 수 있다. 이러한 지침은 동봉된 항체와 함께 사용하기 위한 용량, 투여 경로, 요법, 및 총 치료기간을 제공할 수 있다. "투여하기 위한 수단"이라는 구절은 비제한적인 예로서 사전충전형 시린지, 바이알 및 시린지, 주사 펜, 자동주사장치, IV 드립 및 백, 주입 펌프, 패치, 주입 백과 바늘 등을 포함하여 환자에게 약물을 전신으로 투여하기 위한 임의의 이용 가능한 도구를 나타내도록 사용된다. 이러한 물품에 의해, 환자는 약물을 자가 투여(즉, 의사의 보조 없이 약물을 투여)할 수 있거나, 의사가 그 약물을 투여할 수 있다.
본 개시의 하나 이상의 구현예의 상세사항이 상기 첨부된 설명에 제시된다. 본원에서 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 개시의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 이제 기재된다. 본 개시의 다른 특징, 목적 및 이점은 설명 및 청구범위로부터 명확할 것이다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서, 단수 형태는 문맥이 달리 기술하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시가 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서 인용된 모든 특허 및 간행물은 참조로 포함된다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 보다 완전히 예시하기 위해 제시된다. 이러한 실시예는 첨부된 청구범위에 의해 정의된 바와 같은 개시된 요지의 범위를 제한하는 것으로 결코 해석되어서는 안 된다.
실시예
다음의 실험은 본 출원에서 정의된 바와 같은 본 발명을 추가로 설명하기 위한 것이다.
실시예 1
세쿠키누맙의 cys97 산화가 세포외에서 발생하는지 확인하기 위해 일련의 실험을 설계하였다.
정제된 세쿠키누맙 원료 의약품을 표준량의 시스테인/시스틴을 갖는 세포 배양 배지로 정용여과(Amicon Ultracel 튜브)하였다. 그런 다음, 용액을 배지에서 1.5 g/L의 농도로 희석하여 생물 반응기 역가에 맞춰 조정하였다. 이후, 용액을 37℃에서 인큐베이션하였다. 마지막으로, 유리 cys97 백분율에 대한 시스타민-CEX에 대해 24시간 및 48시간 후에 샘플을 채취하였다.
표 2는 세쿠키누맙이 분비된 후 시스테인/시스틴을 함유하는 세포외 환경에서 cys97이 산화될 수 있음을 시사하는 배지 인큐베이션 후 유리 cys97 백분율이 유의미하게 감소함을 보여준다. 이러한 이해는 세포 배양 배지에서 시스테인/시스틴의 존재로 인해 cys97 산화가 발생할 수 있다는 가설로 이어졌다.
[표 2]
세포 배양 배지와 세쿠키누맙 원료 의약품의 인큐베이션
결과는 세포 배양 배지의 시스테인/시스틴이 cys97을 산화시킴을 확인시켜 주었다.
세쿠키누맙 원료 의약품은 다양한 양의 시스테인/시스틴을 함유하는 배지와 함께 인큐베이션되었다. 도 1은 배지의 더 적은 양의 시스테인/시스틴이 cys97의 산화량을 감소시킴을 보여준다. 이 배지 인큐베이션 연구는 시스테인/시스틴이 세쿠키누맙에서 cys97을 산화시킴을 시사한다.
실시예 2
이전 관찰에서는 37℃에서 관류 배지와 같은 배지에서 세쿠키누맙을 인큐베이션하면 시간이 지남에 따라 항체 활성을 감소시키는 것으로 나타났다. 배지에서 시스테인/시스틴의 수준, 즉 cys 균등물이 활성 저하를 감소시킬 수 있는지를 결정하기 위해, 세쿠키누맙 용출액을 표준 관류 배지를 기반으로 한 다양한 배지에서 인큐베이션하여 배지 성분의 효과를 조사하였다.
샘플을 배지에 첨가할 경우의 희석 효과를 최소화하기 위해 시작 용액을 관류 배지에서 정용여과하였다. 얻어진 용액을 관류 배지에 첨가하여 최종 부피 50 ml과 최종 단백질 농도 약 1.5 g/L를 달성하여 전형적인 항체 생물 반응기 역가를 모방하였다. 용액을 37℃(표준 생물 반응기 온도)에서 2일 동안 인큐베이션하였다. 24시간 및 48시간 후, 25 ml 샘플을 취하고 항체를 포획하였다. 모든 샘플의 활성에 대해 시스타민-CEX에 의해 분석하였다. 표준 관류 배지에서 시스테인은 시스테인 염산염 일수화물의 형태로 공급되었고, 시스틴은 티로신과 시스틴을 포함하는 모액으로부터 공급되었다.
배지 조성의 영향을 조사하기 위해 세쿠키누맙을 세 가지 배지 변형에서 인큐베이션하였다.
[표 3]
도 2에 제시된 바와 같이, 기준선 배지에서 인큐베이션한 경우 세쿠키누맙의 활성은 2일 동안 약 98%에서 25%까지 상당히 저하되었다. cys 균등물의 양을 75%만큼 감소시킴으로써, 활성 저하가 감소되어 60%까지 저하되었다. cys 균등물이 없을 경우, 활성 저하가 더욱 감소되어 83%까지 저하되었다. 추가로 미량 원소를 제거하자 활성이 96%에서 84%까지 저하되었기 때문에 상당한 개선이 나타나지 않았다.
실시예 3
유가식 반응기 방법에서 시스테인/시스틴, 즉 cys 균등물의 변화 효과를 결정하기 위해, 세쿠키누맙의 CHO 세포 발현의 표준 원리에 기반하여 실험을 설계하였다. 시스테인의 농도는 기본 배지와 피드 배지에서 다양했다. 티로신/시스틴 모액으로부터 첨가된 시스틴의 농도에는 변화가 없었다. 테스트한 배지 변형은 10일 동안 실행된 유가식 세포 배양과 함께 아래 표 4에 제공된다. 기본 또는 피드 배지로부터 시스테인을 감소시키거나 제거하더라도 시스틴은 여전히 티로신/시스틴 모액으로부터 배지에 존재하였다. 따라서, 기준선 및 배지 변형에 대한 총 cys 균등물도 표 4에 제공되어 있다.
[표 4]
도 3에 제시된 바와 같이, 기본 배지 및 배지 피드에서 cys 균등물의 함량을 변화시키자 기준선을 포함한 모든 변형에 대해 유사한 세쿠키누맙의 발현 역가(mg/ml) 및 세포 성장이 초래되었다. 도 4에 제시된 바와 같이 최종 항체 역가(mg/ml)의 사소한 변화만이 배지 변형으로 검출되었다(변형 1의 경우 약 2.4 mg/ml에서 변형 3의 경우 약 2.6 mg/ml).
도 5는 상이한 배지 변형을 사용하여 발현된 세쿠키누맙의 활성(%)을 보여주는 그래프이다. cys 균등물이 감소된 세포 배양 배지에서 발현된 세쿠키누맙의 활성은 80% 이상이었다. 대조적으로, 기준선 세포 배양 배지에서 발현된 세쿠키누맙의 활성은 약 60%였다.
이 실험에 의해 입증된 바와 같이, 기본 배지 및/또는 피드 배지로부터의 cys 균등물의 감소 및/또는 제거는 유가식 공정에서 세쿠키누맙의 수율에 영향을 미치지 않았고, 나아가 더 높은 활성을 갖는 항체 생성물을 생산하였다. 따라서, 이러한 결과는 세포 배양 배지에서 감소된 농도의 cys 균등물로 발현된 세쿠키누맙이 원하지 않는 CysL97의 세포 기반 변형을 완화시켜 생성물 품질을 개선함을 시사한다.
실시예 4
일당 약 1 반응기 부피의 관류 배지와 함께, 1000 L 규모의 높은 세포 밀도 관류 회분식(HDPB) 배양을 사용하는 통합 원료 의약품 제조 공정은 CHO 세포로부터 세쿠키누맙을 생산하는 데 적합하다. HDPB 생산 공정의 최대 생존 세포 밀도(VCD)는 거의 1600만 개 세포/mL이고, 공정 기간은 약 19일이다. 유가식 생산 배지와 비교하여 HDPB 생산 배지는 성장 강건성과 원하는 생성물 품질을 보장하기 위해 최소한으로 조정된다(망간, 플루로닉 F68, 글루코스, 글루타민, 시스테인, NaCl을 포함한 성분의 농도). 새로운 성분은 도입되지 않았다. HDPB 생물 반응기 부피 생산성은 약 1.2 g/L/일(또는 22.8 g/L 누적 역가)이다.
후보 배지 제형을 평가하는 동안, 시스테인 농도를 감소시키자 시스타민 CEX에 의해 측정된 세쿠키누맙의 생물활성이 증가함이 확인되었다. 표 5와 6 및 도 6에 제시된 바와 같이, 관류 배지에서 시스테인 농도를 50%까지 감소시킴으로써 실험실 규모의 실험 수확 풀에서 생물활성이 대략 6~8% 증가되었다. 업스트림 공정에서 확인된 효과 외에도, 환원 단계에 대한 직접적인 영향으로 인해 다운스트림 관점에서도 이를 평가하였으며, 이는 제시된 시스테인 효과를 확인시켜 준다.
[표 5]
관류 배지
[표 6]
관류 결과
더 낮은 시스테인 농도는 다른 조건과 비교할 때 더 낮은 산성 프로파일을 초래했으며, 이는 또한 유익한 것으로 간주되었다.
[표 7]
서열 표
SEQUENCE LISTING <110> Novartis AG <120> METHODS FOR REDUCING THE OXIDATION LEVEL OF CYSTEINE RESIDUES IN IL-17 ANTIBODIES DURING CELL CULTURE <130> PAT058918-US-PSP <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 Kabat <400> 1 Asn Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 Kabat <400> 2 Ala Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Gly Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 Kabat <400> 3 Asp Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Asp Tyr Tyr Ile His Tyr Trp Tyr Phe 1 5 10 15 Asp Leu <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 <400> 4 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 <400> 5 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 6 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Cys Thr 1 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Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Asp Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Asp Tyr Tyr Ile His Tyr Trp 100 105 110 Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 9 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL DNA <400> 9 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgtg caccttcggc 300 caagggacac gactggagat taaacga 327 <210> 10 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL amino acid <400> 10 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Cys Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1-x Chothia <400> 11 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Met Asn 1 5 10 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2-x Chothia <400> 12 Ala Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr 1 5 10 <210> 13 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3-x Chothia <400> 13 Cys Val Arg Asp Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Asp Tyr Tyr Ile His Tyr 1 5 10 15 Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly 20 <210> 14 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain <400> 14 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Cys Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 15 <211> 457 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Gly Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Asp Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Asp Tyr Tyr Ile His Tyr Trp 100 105 110 Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 125 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 130 135 140 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165 170 175 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 180 185 190 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 195 200 205 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg 210 215 220 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 225 230 235 240 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 245 250 255 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 260 265 270 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 275 280 285 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 290 295 300 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 305 310 315 320 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 325 330 335 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 340 345 350 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 355 360 365 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 370 375 380 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 385 390 395 400 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 405 410 415 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 420 425 430 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 435 440 445 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455

Claims (24)

  1. 유가식 세포 배양에서 재조합 폴리펩티드의 생산 방법으로서,
    a. 기본 배지 및 하나 이상의 피드 배지를 포함하는 세포 배양 배지에서 포유동물 세포를 배양하는 단계, 여기서 기본 배지는 약 0.3 g/L의 cys 균등물의 농도를 포함하고 피드 배지는 약 0.8 g/L 미만의 cys 균등물의 농도를 포함하고 세포 배양 배지에서 누적 cys 균등물의 농도는 약 0.4 g/L 미만인, 단계;
    b. 재조합 폴리펩티드를 발현시키는 단계 및
    c. 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 기본 배지는 첨가된 시스테인을 포함하지 않고 피드 배지는 약 0.66 g/L의 시스테인 농도를 포함하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 기본 배지는 첨가된 시스테인을 포함하지 않고 피드 배지는 약 0.33 g/L의 시스테인 농도를 포함하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 기본 배지는 첨가된 시스테인을 포함하지 않고 피드 배지는 시스테인을 포함하지 않는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 폴리펩티드는 항체인, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 항체는 세쿠키누맙인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 세포는 CHO 세포, HEK 세포 및 SP2/0 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 선택적 환원의 다운스트림 처리 단계를 포함하며, 항체는 시스템에서 적어도 하나의 환원제와 함께 인큐베이션되어 환원 혼합물을 형성하는 것인, 방법.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    d. 항체를 정제하는 단계;
    e. 투여용 항체를 제형화하는 단계
    f. 항체를 리플렛으로 포장하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 폴리펩티드는 적어도 하나의 유리 시스테인을 포함하는 것인, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 재조합 폴리펩티드는 적어도 하나의 이황화 결합 및 적어도 하나의 유리 시스테인을 포함하는 것인, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 재조합 폴리펩티드는 세쿠키누맙과 같은 항체인, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지로부터 회수된 재조합 폴리펩티드 집단은 약 0.4 g/L 초과의 cys 균등물 농도를 갖는 대조군 기본 배지 및/또는 약 0.9 g/L 초과의 cys 균등물 농도를 포함하는 대조군 피드 배지를 포함하는 대조군 배양 배지로부터 회수된 재조합 폴리펩티드 집단과 비교하여 적어도 약 10% 더 높은 수준의 감소된 유리 시스테인을 포함하고/하거나, 대조군 세포 배양물에서 누적 cys 균등물의 농도는 약 0.4 g/L 초과인, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 대조군 기본 배지 및 하나 이상의 대조군 피드 배지를 포함하는 대조군 세포 배양 배지에서 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함하는 대조군 방법과 비교하여 더 높은 수율(배양 배지 L당 재조합 폴리펩티드 mg)의 재조합 폴리펩티드를 생산하는 단계를 포함하고, 대조군 기본 배지는 약 0.4 g/L 초과의 cys 균등물의 농도를 포함하고/하거나, 대조군 피드 배지는 약 0.9 g/L 초과의 cys 균등물의 농도를 포함하고/하거나, 대조군 세포 배양물에서 누적 cys 균등물의 농도는 약 0.4 g/L 초과인, 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 사용된 배양 배지로부터 분석 시 유리 시스테인이 적어도 61% 감소된 재조합 폴리펩티드 집단을 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 포유동물 세포 배양에 의한 재조합 폴리펩티드의 생산 방법으로서,
    a. 세포 배양 배지를 포함하는 배양물에서 포유동물 세포(예를 들어, CHO 세포, HEK 세포 및 SP2/0 세포로 이루어진 군으로부터 선택됨)를 배양하는 단계, 여기서 세포 배양 배지는 약 0.3 g/L의 cys 균등물의 농도를 포함하는, 단계;
    b. 배양물 중 세포 배양 배지의 일부를 신선한 세포 배양 배지로 관류에 의해 교환하는 단계, 여기서 신선한 세포 배양 배지는 약 0.3 g/L의 cys 균등물의 농도를 포함하고/하거나, 배양물에 첨가되는 누적 cys 균등물의 농도는 약 7 g/L 미만, 또는 일당 약 0.4 g/L 미만인, 단계;
    c. 재조합 폴리펩티드를 발현시키는 단계 및
    d. 배양물로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 신선한 배양 배지는 첨가된 시스테인을 포함하지 않는, 방법.
  18. 제16항에 있어서, 배양 일당 관류에 의해 세포 배양 배지의 적어도 50%를 신선한 세포 배양 배지로 교환하는 단계를 포함하는, 방법.
  19. 제16항, 제17항 또는 제18항에 있어서, 재조합 폴리펩티드는 적어도 하나의 유리 시스테인을 포함하는 것인, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 재조합 폴리펩티드는 적어도 하나의 유리 시스테인 및 적어도 하나의 이황화 결합을 포함하는 것인, 방법.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 폴리펩티드는 세쿠키누맙과 같은 항체인, 방법.
  22. 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지로부터 회수된 재조합 폴리펩티드 집단은 약 0.4 g/L 초과의 cys 균등물의 농도를 포함하는 대조군 배양 배지로부터 회수된 재조합 폴리펩티드 집단과 비교하여 적어도 약 10% 더 높은 수준의 감소된 유리 시스테인을 포함하고/하거나, 대조군 배양 배지에 첨가되는 누적 cys 균등물의 농도는 약 7 g/L 초과, 및/또는 일당 약 0.4 g/L 초과인, 방법.
  23. 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 대조군 세포 배양 배지에서 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함하는 대조군 방법과 비교하여 더 높은 수율(배양 배지 L당 재조합 폴리펩티드 mg)의 재조합 폴리펩티드를 생산하는 단계를 포함하고, 대조군 세포 배양 배지는 약 0.4 g/L 초과의 cys 균등물의 농도를 포함하고/하거나, 대조군 세포 배양 배지에서 누적 cys 균등물의 농도는 약 7 g/L 초과, 및/또는 일당 약 0.4 g/L 초과인, 방법.
  24. 제1항 내지 제5항, 제7항 내지 제22항 또는 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 환원된 유리 시스테인을 링커, 라벨 또는 약물로 공유 변형시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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