JPH07135994A - 抗体、ポリペプチド、その製造法および用途 - Google Patents

抗体、ポリペプチド、その製造法および用途

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JPH07135994A
JPH07135994A JP5323908A JP32390893A JPH07135994A JP H07135994 A JPH07135994 A JP H07135994A JP 5323908 A JP5323908 A JP 5323908A JP 32390893 A JP32390893 A JP 32390893A JP H07135994 A JPH07135994 A JP H07135994A
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leu
arg
glu
ser
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JP5323908A
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Tsutomu Kurokawa
勉 黒川
Kenichi Kuroshima
健一 黒嶋
Sumie Yoshitomi
純枝 吉富
Chisako Seko
智佐子 瀬古
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Takeda Pharmaceutical Co Ltd
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Takeda Chemical Industries Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【目的】グリア活性化因子（ＧＡＦ）を高感度に測定し
得る抗ＧＡＦ抗体を提供すると共に、安定なＧＡＦポリ
ペプチドを提供する。 【構成】グリア活性化因子（ＧＡＦ）を高感度に測定し
得る抗ＧＡＦ抗体、さらにＧＡＦの活性を中和し得る抗
体を作製すると共に、配列番号３のポリペプチドのＮ末
アミノ酸３３および４９個を欠損させたＧＡＦを作製し
た。 【効果】本発明抗体により簡便かつ高感度にＧＡＦおよ
びその生物活性を測定することができる。また、本発明
の中和抗体は、ＧＡＦの過剰作用に起因する疾患におい
て予防、治療効果が期待できる。また本発明のＧＡＦポ
リペプチドは公知のＧＡＦよりも酸や熱に安定でかつ同
様の活性を有するので、血小板増加剤などとして、ＧＡ
Ｆよりも有利に用い得る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はグリア活性化因子（Glia
Activating Factor，ＧＡＦと略称）ポリペプチドを高
感度に認識し、かつ該因子との結合によりその生物活性
を中和する抗体、該抗体を産生するハイブリドーマとそ
れらの製造法及びそれらの用途に関する。また本発明は
特定のアミノ酸配列で特定される優れた性質を有するＧ
ＡＦポリペプチド、その製造法および用途に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】グリ
ア活性化因子は最初にグリオーマ細胞から分離精製によ
り取得された分子量約３０，０００のヘパリン結合性の
ポリペプチドを完全鎖長型とする増殖因子である〔K. N
aruo ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー（J. Biol. Chem.），第２６８巻、２８５７
頁（１９９３）〕。そのアミノ酸配列（図１）から線維
芽細胞成長因子（Fibroblast Growth Factor，ＦＧＦと
略称）のファミリーの一員であることがわかっている。
ＦＧＦファミリーの各因子とアミノ酸配列で約３０％の
相同性を有するＧＡＦはＦＧＦ９と称される〔M. Miyam
oto ら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジ
ー（Mol. Cell. Biol.），第１３巻、４２５１頁（１９
９３）〕。ＧＡＦは中胚葉系の細胞例えば線維芽細胞、
グリア細胞、神経細胞などに作用していると考えられて
いる。また、細胞増殖因子であることから、その発現に
異常が起これば細胞の癌化の原因としても機能しうると
考えられる。従って腫瘍など疾患の治療薬の一つとして
ＧＡＦの活性を阻害する抗体が考えられる。また、それ
らの疾病を診断する手段の一つとして血中ＧＡＦ濃度を
測定する必要が考えられる。また逆にＧＡＦは骨芽細
胞、血管平滑筋細胞をはじめとする広範囲の細胞に増殖
促進作用を示すことから、骨形成促進剤等として広く利
用し得ると考えられる。さらにＧＡＦは巨核芽球に作用
してその増殖を促し血小板数を増加させることが見出さ
れており、血小板増加剤としての応用が期待されてい
る。血中のＧＡＦ濃度を測定することは血小板減少症患
者に対してＧＡＦの投与を行った場合のトレースとして
も必須であり、高感度測定法が渇望されている。
【０００３】一方、ＧＡＦは、既報のｃＤＮＡ配列を基
にして遺伝子組み換え技術を利用して大腸菌をはじめと
する種々の微生物あるいは動物培養細胞等の宿主を用い
て産生させることが可能であり、天然抽出物と同様に用
い得る。しかし、ＧＡＦのＮ末端側には分解を受け易い
部分があり、分解産物の混入が精製を難かしくしている
が、この易分解性部分の領域については明らかになって
いない。またＧＡＦは蛋白としての安定性、たとえば酸
に対する安定性あるいは熱に対する安定性などはあまり
高くはなく、各種医薬への応用において不利な点となっ
ている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】これらの状況に鑑み、本
発明者等は高感度のＧＡＦの測定を可能ならしめ、かつ
ＧＡＦの作用を中和する抗体を作成することに成功し
た。また、種々のＧＡＦポリペプチドについて検討を重
ね、配列番号３で示されるＧＡＦポリペプチドの配列か
らＮ末端アミノ酸残基を３３ないし４９個欠損させるこ
とにより、安定性及び生物活性が向上したＧＡＦポリペ
プチドを作製することに成功した。これらの知見に基づ
いてさらに研究した結果、本発明を完成した。即ち、本
発明は（１）グリア活性化因子ポリペプチドを特異的に
認識し、かつその生物活性を中和しうる抗体、（２）抗
体がモノクローナル抗体である、上記（１）記載の抗
体、（３）生物活性がグリア活性化作用である上記
（１）記載の抗体、（４）マウスモノクローナル抗体Ｇ
ＡＦ１５０−５９である上記（３）記載の抗体、（５）
生物活性が巨核芽球増殖促進作用である上記（１）記載
の抗体、（６）マウスモノクローナル抗体ＧＡＦ４−８
２である上記（５）記載の抗体、 （７）グリア活性化因子ポリペプチドがアミノ酸配列： Leu Asp His Leu Lys Gly Ile Leu Arg Arg Arg Gln Leu Tyr Cys Arg Thr Gly Phe His Leu Glu Ile Phe Pro Asn Gly Thr Ile Gln Gly Thr Arg Lys Asp His Ser Arg Phe Gly Ile Leu Glu Phe Ile Ser Ile Ala Val Gly Leu Val Ser Ile Arg Gly Val Asp Ser Gly Leu Tyr Leu Gly Met Asn Glu Lys Gly Glu Leu Tyr Gly Ser Glu Lys Leu Thr Gln Glu Cys Val Phe Arg Glu Gln Phe Glu Glu Asn Trp Tyr Asn Thr Tyr Ser Ser Asn Leu Tyr Lys His Val Asp Thr Gly Arg Arg Tyr Tyr Val Ala Leu Asn Lys Asp Gly Thr Pro Arg Glu Gly Thr Arg Thr Lys Arg His Gln Lys Phe Thr His Phe Leu Pro Arg Pro Val Asp Pro Asp （配列番号：１）で示されるポリペプチドを含むポリペプチドであ る請求項１記載の抗体、 （８）グリア活性化因子ポリペプチドがアミノ酸配列： (Met)n X1 Val Thr Asp Leu Asp His Leu Lys Gly Ile Leu Arg Arg Arg Gln Leu Tyr Cys Arg Thr Gly Phe His Leu Glu Ile Phe Pro Asn Gly Thr Ile Gln Gly Thr Arg Lys Asp His Ser Arg Phe Gly Ile Leu Glu Phe Ile Ser Ile Ala Val Gly Leu Val Ser Ile Arg Gly Val Asp Ser Gly Leu Tyr Leu Gly Met Asn Glu Lys Gly Glu Leu Tyr Gly Ser Glu Lys Leu Thr Gln Glu Cys Val Phe Arg Glu Gln Phe Glu Glu Asn Trp Tyr Asn Thr Tyr Ser Ser Asn Leu Tyr Lys His Val Asp Thr Gly Arg Arg Tyr Tyr Val Ala Leu Asn Lys Asp Gly Thr Pro Arg Glu Gly Thr Arg Thr Lys Arg His Gln Lys Phe Thr His Phe Leu Pro Arg Pro Val Asp Pro Asp Lys Val Pro Glu Leu Tyr Lys Asp Ile Leu Ser Gln Ser 〔ただしnは０または１を、X1 は Ala Pro Leu Gly Glu
Val Gly Asn Tyr Phe Gly Val Gln Asp Ala Val Pro P
he Gly Asn Val Pro Val Leu Pro Val Asp Ser Pro Val
Leu Leu Ser Asp His Leu Gly Gln Ser Glu Ala Gly G
ly Leu Pro Arg Gly Pro Ala またはその断片を、それ
ぞれ示す。n＝０：配列番号：２；n＝１：配列番号：
３〕で示されるポリペプチドからなる上記（１）記載の
抗体、（９）Ｘ1がLeu Gly Glu Val Gly Asn Tyr Phe G
ly Val Gln Asp Ala Val Pro Phe Gly Asn Val Pro Val
Leu Pro Val Asp Ser Pro Val Leu Leu Ser Asp His L
eu Gly Gln Ser Glu Ala Gly Gly Leu Pro Arg Gly Pro
Ala 〔n＝０：配列番号：４；n＝１：配列番号：５〕
である上記（８）記載の抗体、（１０）Ｘ1が Ser Asp
His Leu Gly Gln Ser Glu Ala Gly Gly Leu Pro Arg Gl
y Pro Ala 〔n＝０：配列番号：６；n＝１：配列番号：
７〕である上記（８）記載の抗体、（１１）Ｘ1が Ala
〔n＝０：配列番号：８；n＝１：配列番号：９〕である
上記（８）記載の抗体、（１２）グリア活性化因子ポリ
ペプチドを特異的に認識し、かつその生物活性を中和し
得る抗体を産生するハイブリドーマ、（１３）マウスハ
イブリッドハイブリドーマＧＡＦ１５０−５９またはマ
ウスハイブリッドハイブリドーマＧＡＦ４−８２である
上記（１２）記載のハイブリドーマ、（１４）グリア活
性化因子ポリペプチドで免疫した哺乳動物の脾臓細胞
と、同種または異種のミエローマとを融合させて得られ
る細胞をクローニングすることを特徴とするハイブリド
ーマの製造法、（１５）上記（１４）記載の方法で得ら
れたハイブリドーマを液体培地中または哺乳動物の腹腔
内で増殖し、モノクローナル抗体を生成、蓄積せしめ、
これを採取することを特徴とする、上記（１）記載のモ
ノクローナル抗体の製造法、（１６）検体中のグリア活
性化因子の存在を測定するために上記（１）ないし（１
１）記載のいずれかの抗体を用いることを特徴とするグ
リア活性化因子ポリペプチドの免疫測定法、（１７）上
記（１）ないし（１１）記載のいずれかの抗体を用いる
ことを特徴とするグリア活性化因子ポリペプチドの精製
法、 （１８）アミノ酸配列： (Met)n X2 Val Thr Asp Leu Asp His Leu Lys Gly Ile Leu Arg Arg Arg Gln Leu Tyr Cys Arg Thr Gly Phe His Leu Glu Ile Phe Pro Asn Gly Thr Ile Gln Gly Thr Arg Lys Asp His Ser Arg Phe Gly Ile Leu Glu Phe Ile Ser Ile Ala Val Gly Leu Val Ser Ile Arg Gly Val Asp Ser Gly Leu Tyr Leu Gly Met Asn Glu Lys Gly Glu Leu Tyr Gly Ser Glu Lys Leu Thr Gln Glu Cys Val Phe Arg Glu Gln Phe Glu Glu Asn Trp Tyr Asn Thr Tyr Ser Ser Asn Leu Tyr Lys His Val Asp Thr Gly Arg Arg Tyr Tyr Val Ala Leu Asn Lys Asp Gly Thr Pro Arg Glu Gly Thr Arg Thr Lys Arg His Gln Lys Phe Thr His Phe Leu Pro Arg Pro Val Asp Pro Asp Lys Val Pro Glu Leu Tyr Lys Asp Ile Leu Ser Gln Ser 〔ただし nは０または１を、X2 は Ser Asp His Leu Gl
y Gln Ser Glu Ala GlyGly Leu Pro Arg Gly Pro Ala
またはそのＣ末端側断片を、それぞれ示す（n＝0：配列
番号６、n＝1：配列番号７）〕を有するポリペプチド、
（１９）Ｘ2が Ser Asp His Leu Gly Gln Ser Glu Ala
Gly Gly Leu Pro Arg Gly Pro Ala 〔（n＝0：配列番
号：６；n＝1：配列番号：７）〕である上記（１８）記
載のポリペプチド、（２０）Ｘ2が Ala 〔（n＝0：配列
番号：８；n＝1：配列番号：９）〕である上記（１８）
記載のポリペプチド、（２１）上記（１８）、（１９）
または（２０）記載のポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ、（２２）上記（２１）記載のＤＮＡを含有するベク
ター、（２３）上記（２２）記載のベクターを含有する
形質転換体、（２４）上記（１８）、（１９）または
（２０）記載のポリペプチドおよび製剤学的に許容し得
る担体を含有することを特徴とする医薬組成物、（２
５）血小板増加剤である上記（２４）記載の医薬組成
物、（２６）他の医薬と組合せて用いられる（２５）記
載の医薬組成物、（２７）他の医薬が制癌剤である上記
（２６）記載の医薬組成物、（２８）制癌剤との混合物
である上記（２７）記載の医薬組成物、（２９）制癌剤
と別個に組合せてなる上記（２７）記載の医薬組成物、
（３０）請求項１８、１９または２０記載のポリペプチ
ドを含有することを特徴とする医薬組成物と制癌剤とを
含有する医薬用キット、（３１）制癌剤がアルキル化
剤、抗代謝薬、抗生物質、植物アルカロイド、プラチナ
協働化合物およびホルモンからなる群から選ばれるもの
である、上記（２７）記載の医薬組成物、および（３
２）制癌剤がナイトロゲン・マスタード・Ｎ−オキサイ
ド(nitrogen mustard N-oxide)、サイクロホスファミド
(cyclophosphamide)、メルファラン(melphalan)、カル
ボクオン(carboquone)、ブスルファン(busulfan)、ニマ
スチン塩酸塩(nimustine hydrochloride)、ラニマスチ
ン(ranimustine)、ダカルバジン(dacarbazine)、フルオ
ロウラシル(fluorouracil)、テガフル(tegaful)、サイ
タラビン(cytarabine)、アンサイタビン塩酸塩(ancitab
ine hydrochloride)、ブロキシウリジン(broxuridin
e)、ドキシフルウリジン(doxifluridine)、メルカプト
プリン(mercaptopurine)、チオイノシン(thioinosin
e)、メトトレキセート(methotrexate)、マイトマイシン
(mitomycin)、ブレオマイシン(bleomycin)、ダウノルビ
シン塩酸塩(daunorubicin hydrochloride)、ドキソルビ
シン塩酸塩(doxorubicin hydrochloride)、ピラルビシ
ン塩酸塩(pirarubicin hydrochloride)、アクラルビシ
ン塩酸塩(aclarubicin hydrochloride)、ネオカルジノ
スタチン(neocarzinostatin)、アクチノマイシン(actin
omycin )Ｄ、ヴィンクリスチン硫酸塩(vincristine sul
fate)、ヴィンデシン硫酸塩(vindesine sulfate)、ヴィ
ンブラスチン硫酸塩(vinblastine sulfate)、エトポサ
イド(etoposide)、タモキシフェンクエン酸塩(tamoxife
n citrate)、プロカルバジン塩酸塩(procarbazine hydr
ochloride)、マイトブロニトール(mitobronitol)、マイ
トキサントン塩酸塩(mitoxanton hydrochloride)、カル
ボプラチン(carboplatin)およびシスプラチン(cisplati
n)からなる群から選ばれるものである、上記（２７）記
載の医薬組成物、に関するものである。
【０００５】本発明において、グリア活性化因子（ＧＡ
Ｆ）ポリペプチドとは、グリア活性化因子作用を有する
ポリペプチドを総称するものである（以下ＧＡＦポリペ
プチドを単にＧＡＦと略記することがある）。本ポリペ
プチドとしては、本明細書に記載の配列番号３のポリペ
プチドおよびそのフラグメントが挙げられる。ＧＡＦの
フラグメントペプチドの例としては、欠失型ムテイン、
たとえば配列番号３のＮ末端側から少なくとも１個のア
ミノ酸残基欠損または／およびＣ末端側から少なくとも
１個のアミノ酸残基欠損ムテインが挙げられる。本発明
の抗体を得るための免疫原であるＧＡＦポリペプチドと
しては、配列番号３で表されるポリペプチドおよびその
フラグメントペプチドであって、ＧＡＦの生物活性を有
するものが挙げられる。通常部分ペプチドを免疫原とし
て用いて得られた抗体はその部分を含む全分子ポリペプ
チドをも認識し得るので部分ペプチドを用いることが好
ましい。本発明のＧＡＦとしては、哺乳動物由来のもの
が挙げられる。該哺乳動物としては、ヒト、サル、ブ
タ、ウシ、ヒツジ、ウマなどが挙げられ、抗体の用途に
合わせて、治療目的の場合は投与対象由来のものを、ト
レースの目的の場合は投用するＧＡＦの動物種に従って
選択すればよい。また該ＧＡＦとして、脳や腎臓などの
既にその存在が明らかにされている各種臓器から抽出さ
れるものが挙げられる。また該ＧＡＦポリペプチドとし
ては、組み換えＤＮＡ技術により製造されたものでもよ
い。また、そのフラグメントは化学合成等公知の合成法
により合成されたものでもよい。
【０００６】ＧＡＦとしては、次のアミノ酸配列を含む
ものがその例として挙げられるが、目的とするＧＡＦの
生物活性を保有するものであれば、これに限定されるも
のではない。 アミノ酸配列： Leu Asp His Leu Lys Gly Ile Leu Arg Arg Arg Gln Leu Tyr Cys Arg Thr Gly Phe His Leu Glu Ile Phe Pro Asn Gly Thr Ile Gln Gly Thr Arg Lys Asp His Ser Arg Phe Gly Ile Leu Glu Phe Ile Ser Ile Ala Val Gly Leu Val Ser Ile Arg Gly Val Asp Ser Gly Leu Tyr Leu Gly Met Asn Glu Lys Gly Glu Leu Tyr Gly Ser Glu Lys Leu Thr Gln Glu Cys Val Phe Arg Glu Gln Phe Glu Glu Asn Trp Tyr Asn Thr Tyr Ser Ser Asn Leu Tyr Lys His Val Asp Thr Gly Arg Arg Tyr Tyr Val Ala Leu Asn Lys Asp Gly Thr Pro Arg Glu Gly Thr Arg Thr Lys Arg His Gln Lys Phe Thr His Phe Leu Pro Arg Pro Val Asp Pro Asp （配列番号：１）、好ましくは アミノ酸配列： (Met)n X1 Val Thr Asp Leu Asp His Leu Lys Gly Ile Leu Arg Arg Arg Gln Leu Tyr Cys Arg Thr Gly Phe His Leu Glu Ile Phe Pro Asn Gly Thr Ile Gln Gly Thr Arg Lys Asp His Ser Arg Phe Gly Ile Leu Glu Phe Ile Ser Ile Ala Val Gly Leu Val Ser Ile Arg Gly Val Asp Ser Gly Leu Tyr Leu Gly Met Asn Glu Lys Gly Glu Leu Tyr Gly Ser Glu Lys Leu Thr Gln Glu Cys Val Phe Arg Glu Gln Phe Glu Glu Asn Trp Tyr Asn Thr Tyr Ser Ser Asn Leu Tyr Lys His Val Asp Thr Gly Arg Arg Tyr Tyr Val Ala Leu Asn Lys Asp Gly Thr Pro Arg Glu Gly Thr Arg Thr Lys Arg His Gln Lys Phe Thr His Phe Leu Pro Arg Pro Val Asp Pro Asp Lys Val Pro Glu Leu Tyr Lys Asp Ile Leu Ser Gln Ser 〔ただしnは０または１を、X1 は Ala Pro Leu Gly Glu
Val Gly Asn Tyr Phe Gly Val Gln Asp Ala Val Pro P
he Gly Asn Val Pro Val Leu Pro Val Asp Ser Pro Val
Leu Leu Ser Asp His Leu Gly Gln Ser Glu Ala Gly G
ly Leu Pro Arg Gly Pro Ala またはその断片、n＝0：
配列番号２、n＝1：配列番号３、好ましくはＸ1が Leu
Gly Glu Val Gly Asn Tyr Phe Gly Val Gln Asp Ala Va
lPro Phe Gly Asn Val Pro Val Leu Pro Val Asp Ser P
ro Val Leu Leu Ser AspHis Leu Gly Gln Ser Glu Ala
Gly Gly Leu Pro Arg Gly Pro Ala （n＝0：配列番号
４、n＝1：配列番号５）、Ｘ1が Ser Asp His Leu Gly
Gln Ser Glu Ala Gly Gly Leu Pro Arg Gly ProAla （n
＝0：配列番号６、n＝1：配列番号７）、またはＸ1が A
la （n＝0：配列番号８、n＝1：配列番号９）〕で示さ
れるポリペプチドからなるＧＡＦである。また、フラグ
メントとしては目的の活性を保持するポリペプチド、好
ましくは上記のアミノ酸配列で示される配列番号３のＧ
ＡＦの部分ポリペプチドが挙げられる。このようなヒト
ＧＡＦの製造法としては、ヨーロッパ特許出願公開第５
０３２９７号公報に記載の方法等が挙げられる。
【０００７】本発明抗体を得るには公知の抗体作製法に
従えばよく、一般に、免疫に用いる哺乳動物としては、
牛、山羊、兎、モルモット、ラット、マウス等の実験動
物が使われる。免疫方法は、例えば兎を免疫する場合、
皮下腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内等のいずれのルート
からでも可能であるが、例えば２週間隔で約２〜６回免
疫し、最終免疫後、約１〜１５日、好ましくは約５〜１
０日後に採血する方法がよく用いられる。免疫量は１回
に蛋白量として、兎当り、好ましくは約１００μｇ〜１
０ｍｇ用いることが望ましい。採取した血液を遠心分離
することにより血清とすることができる。血清中の抗体
価はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法またはエンザイ
ムイムノアッセイ（ＥＩＡ）法等の測定方法で調べるこ
とが出来る。例えばＥＩＡ法では、抗原（ＧＡＦ）を吸
着させた固相（例えばマイクロプレート）に血清を添加
し、よく洗ったあと、例えば西洋ワサビペルオキシダー
ゼ（ＨＲＰ）で標識した抗免疫グロブリン抗体（ウサギ
血清の場合には抗ウサギ免疫グロブリン抗体が用いられ
る。）またはプロテインＡ等を加え、洗浄した後に発色
反応を行って固相に結合した抗原に結合する抗体を検出
することができる。血清中の抗体のＧＡＦポリペプチド
に対する中和活性は血清より、抗体画分を例えばイオン
交換カラムクロマトグラフィー、プロテインＡカラムク
ロマトグラフィー、プロテインＧカラムクロマトグラフ
ィー等の方法によって分画したのちに測定すると好都合
である。このうちプロテインＡカラムあるいはプロテイ
ンＧカラムは特に簡便で好ましい。
【０００８】本発明抗体の中和活性の測定はＧＡＦの活
性測定法を利用すればよく、例えばグリア細胞のトリチ
ウムチミジン（3Ｈ・チミジン）の取り込みあるいは３
Ｔ３細胞の3Ｈ・チミジンの取り込みを指標とし、該反
応系にＧＡＦと共に抗体を添加し、ＧＡＦの3Ｈ・チミ
ジン取り込み促進作用の抑制強度を調べることにより測
定できる。あるいはこれらの細胞のＧＡＦによる細胞数
増加反応を抑制する強度を調べても測定することができ
る。また、ＧＡＦの巨核芽球の増殖を促進し（ＭＫ−Ｃ
ＳＦ活性）、血中の血小板数を増加させる活性に対する
中和抗体では、この活性の抑制作用を調べることにより
測定できる。本発明抗体として、モノクローナル抗体を
得るためには、使用する哺乳動物としては、ラット、マ
ウスが好ましい。免疫方法は、例えばマウスを免疫する
場合、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内等のいずれ
のルートからでも可能であるが、主として皮下、腹腔
内、静脈内に(とりわけ皮下)注入するのが好ましい。ま
た、免疫間隔、免疫量等も可変度は高く、種々の方法が
可能であるが、例えば２週間隔で約２〜６回免疫し、最
終免疫後、約１〜５日、好ましくは約２〜４日後に摘出
した脾臓細胞を用いる方法がよく用いられる。免疫量は
１回にペプチド量として、マウス当り約0.1μｇ以上、
好ましくは約10μｇ〜300μｇ用いられる。又、脾臓を
摘出する前に、部分採血を行い、血中の抗体価の上昇を
確認した上で、脾臓細胞を用いる融合実験を行うことが
望ましい。上記脾臓細胞とミエローマとの細胞融合は例
えば摘出したマウスの脾臓細胞を、ヒポキサンチン−グ
アニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（HGPR
T~）や、チミジンキナーゼ欠損（TK~）の様なマーカー
を持った適切な同種または異種（好ましくは同種）のミ
エローマ〔例、P3-X63-Ag・8UI（市森他ジャーナル・オブ
・イムノロジカル・メソッド 80 55（1985))〕等の、リ
ンパ球様細胞株との間で融合させる。例えばケラーおよ
びミルスタインらの方法〔ネイチャー（Nature）256：4
95（1975)〕に準じて融合させることにより製造され
る。すなわち、たとえばミエローマ細胞と脾細胞とを約
１：５の割合で、たとえばイスコフ培地とハムF-12培地
を１：１に混合した培地（以下IH培地と称する。）に懸
濁させ、センダイウイルス、ポリエチレングリコール
（PEG）等の融合剤が用いられる。もちろんジメチルス
ルホキシド（DMSO）その他の融合促進剤を加えることも
可能である。PEGは通常分子量約1,000〜9,000、濃度は
約10％〜80％等が用いられ、反応時間は約0.5〜30分で
あるが、好ましい条件の一例として、PEG 6,000を約35
〜55％で約4〜10分処理することにより、効率よく融合
させることが出来る。融合細胞は、ヒポキサンチン−ア
ミノプテリン−チミジン培地〔HAT培地；ネイチャー，2
56, 495（1975)〕等を用いて、選択的に増殖させること
が出来る。増殖して来た細胞の培養上清は、目的とする
抗体産生があるか否かについてスクリーニングを行うこ
とができるが、抗体価のスクリーニングは次の様に行う
ことが出来る。即ち、この場合には、まず第１段階とし
て免疫した蛋白質に対する抗体産生の有無を、ＲＩＡ法
（放射性免疫測定法）またはＥＩＡ法（酵素免疫測定
法）等の方法で調べることが出来るが、これらの方法に
ついても種々の変法が可能である。
【０００９】好ましい測定法の一例として、EIAを用い
る一つの方法について述べる。セルロースビーズ等の担
体に、例えばウサギ抗マウスイムノグロブリン抗体を常
法に従ってカプリングさせておき、これに測定したい培
養上清や、マウスの血清を加え、一定時間、定温（約４
〜40℃を示す。以下においても同様。）で反応させる。
この後、反応物をよく洗った後、酵素で標識した抗原蛋
白質（酵素と蛋白質を常法に従いカプリングさせた後精
製したもの）を加え、一定時間、定温で反応させる。反
応物をよく洗った後、酵素基質を加え、一定時間、定温
で反応させ、その後、生成発色物を吸光度または蛍光度
等で測定することが出来る。また、ウサギ血清中の抗体
価の測定方法もそのまま使用され得る。得られた抗ＧＡ
Ｆ抗体産生細胞の培養上清について、ＧＡＦポリペプチ
ドの生物活性に対する抗体の中和活性のスクリーニング
については次の様に行うことができる。即ち、グリア活
性化作用の中和抗体の場合には、ＧＡＦポリペプチドに
よって細胞増殖が誘導される細胞を用いてその細胞数の
経時変化を調べることにより測定することが出来る。該
細胞としてはグリア細胞、繊維芽細胞などを用いること
が可能であるが好ましくはグリア細胞を用いＧＡＦポリ
ペプチドによる増殖促進効果の抑制を、細胞数の経時変
化を測定することによって知ることが望ましい。また、
巨核芽球増殖促進活性の中和抗体については、巨核芽球
数あるいは分化した巨核球数をＧＡＦ共存下で測定し、
ＧＡＦの活性の抑制を測定すればよい。細胞数を測定す
る方法としては直接細胞数を測定する方法、トリチウム
チミジンを用いて放射活性を定量する方法、(4,5-ジメ
チル-２-チアゾリル）-2,5-ジフェニル-２Hテトラゾリ
ウムプロミド（MTT）を用いて比色定量的に測定する方
法（MTT法）がある。
【００１０】選択培地で増殖を示し、免疫に用いたペプ
チドに対する抗体活性、目的の中和活性のみられたウエ
ルの細胞は、限界稀釈法等によりクローニングを行うこ
とができる。クローン化された細胞の上清について同様
にスクリーニングを行い中和活性の高いウエルの細胞を
増やすことにより、免疫したペプチドと反応性を示すモ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマクローンが得られ
る。このようにしてクローン化されたハイブリドーマ
を、液体培地中で増殖させる。具体的には例えば、公知
の液体培地たとえばRPMI-1640〔Moore, G.E., et. al.
ジャーナル・オブ・アメリカン・メディカル・アソシエ
ーション（J. Am. Med. Assoc.) 199, 549 (1967)〕に
約0.1〜40％の牛血清を加えた培地等で約２〜10日間、
好ましくは約３〜５日間培養することにより、培養液か
ら該モノクローナル抗体を得ることができる。また、哺
乳動物の腹腔内に接種し、細胞を増殖させ、腹水を採取
することにより抗体を取得することが出来る。このため
には、例えばマウスの場合、ミネラルオイル等を前もっ
て接種したBALB／c等のマウス腹腔内に約１×104〜１×
107個、好ましくは約５×105〜２×106個のハイブリド
ーマを接種し、約７〜20日後、好ましくは約10〜14日後
に腹水液を採取する。腹水に生成蓄積した抗体は、例え
ば硫安分画、DEAE-セルロースカラムクロマトグラフィ
ー、プロテインＡあるいはプロテインＧカラムクロマト
グラフィー等、公知の分離、精製法により、容易にモノ
クローナル抗体を純粋な免疫グロブリンとして単離する
ことができる。
【００１１】本発明の抗体は、ＧＡＦポリペプチドに高
感度にまた選択的に結合することから、ＧＡＦの検出試
薬、定量試薬、さらにはＧＡＦポリペプチドの精製用担
体として極めて有用である。本発明の抗体を用いたＧＡ
Ｆポリペプチドの検出、定量法としては、たとえば、担
体上に保持された抗ＧＡＦ抗体、および該抗体とは抗原
決定部位を異にする抗ＧＡＦ抗体に標識剤を直接結合さ
せた結合物を用いてＧＡＦポリペプチドを測定する免疫
化学的測定法により行なうことができる。この測定の工
程は抗原を含有する検体を該抗体と接触させて結合体も
しくは複合体を形成し、該結合体もしくは複合体を、放
射性同位元素、酵素もしくは蛍光物質のような標識剤を
有する第二の抗体と接触させ、次いで該標識を検出する
ことにより該抗原と２つの抗体の複合体を検出すること
を含有することができる。測定においては、いずれの抗
体が中和抗体であってもよく、抗原決定部位が重複しな
いものであれば両者が中和抗体であってもよい。また、
検出、定量を目的とする生物活性に対応して、それぞれ
の活性の中和抗体を選択することが好ましい。本発明の
抗体を用いるＧＡＦポリペプチドの精製法は、例えば、
ＧＡＦと特定の抗体とを接触させて結合体を形成し、該
結合体を分離し、次いで該ＧＡＦを活性体に再構成する
ような工程によって行なわれる。該ＧＡＦ−抗体結合体
の分離に当っては担体上に保持された抗ＧＡＦ抗体を用
いるのが便利である。このものは抗体カラムに用いるこ
とができる。
【００１２】上記測定方法において用いられる担体上に
保持された抗体における担体としては、例えば、ゲル粒
子（例、アガロースゲル〔例、セファロース４Ｂ、セフ
ァロース６Ｂ（ファルマシア・ファインケミカル社（ス
ェーデン）製）〕、デキストランゲル〔例、セファデッ
クスＧ−75、セファデックスＧ−100、セファデックス
Ｇ−200（ファルマシア・ファインケミカル社（スェー
デン）製）〕、ポリアクリルアミドゲル〔例、バイオゲ
ルＰ−30、バイオゲルＰ−60、バイオゲルＰ−100（バ
イオラッド・ラボラトリーズ社（米国）製〕、セルロー
ス粒子〔例、アビセル（旭化成製）、イオン交換セルロ
ース（例、ジエチルアミノエチルセルロース、カルボキ
シメチルセルロース）〕、物理的吸着剤〔例、ガラス
（例、ガラス球、ガラスロッド、アミノアルキルガラス
球、アミノアルキルガラスロッド）、シリコン片、スチ
レン系樹脂（例、ポリスチレン球、ポリスチレン粒
子）、イムノアッセイ用プレート（例、ヌンク社（デン
マーク）製）〕、イオン交換樹脂｛例、弱酸性陽イオン
交換樹脂〔例、アンバーライトIRC-50（ローム・アンド
・ハース社（米国）製）、ゼオカープ226（パームチッ
ト社（西ドイツ）製）〕、弱塩基性陰イオン交換樹脂
〔例、アンバーライトIR-4B、ダウエックス３（ダウケ
ミカル社（米国）製）〕｝などが挙げられる。担体に本
発明抗体を保持させるには、公知の常套手段を応用し得
るが、例えば、“代謝”、第８巻（1971年）、第696頁
に記載されているブロムシアン法、グルタールアルデヒ
ド法などが挙げられる。また、より簡便な方法として物
理的に担体表面に吸着させてもよい。
【００１３】標識剤を結合させた抗体結合物における標
識剤としては、例えば放射性同位元素、酵素、蛍光物
質、発光物質などが挙げられるが、酵素を用いるのが好
ましい。酵素としては、安定で比活性の大きなものが好
ましく、一般にペルオキシダーゼ、アルカリホスファタ
ーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダ
ーゼ等を用いることができるが、ペルオキシダーゼが好
ましい。ペルオキシダーゼとしては、種々の起源のもの
を用いることができるが、その例としては、たとえば西
洋わさび、パイナップル、イチジク、甘諸、ソラマメ、
トウモロコシなどから得られるペルオキシダーゼが挙げ
られ、特に西洋わさびから抽出されたホースラディッシ
ュ ペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase)(HRP)
が好ましい。ペルオキシダーゼと抗体を結合するにあた
り、抗体分子としてのＦａｂ’のチオール基を利用する
ために、あらかじめペルオキシダーゼにマレイミド基を
導入したものを用いると好都合である。マレイミド基を
ペルオキシダーゼに導入する方法としては、ペルオキシ
ダーゼのアミノ基を介してマレイミド基を導入すること
ができる。そのためには、Ｎ−サクシニミジル−マレイ
ミド−カルボキシレート誘導体を用いることができ、好
ましくは、Ｎ−（γ−マレイミドブチルオキシ）サクシ
イミド（GMBSと略称することもある）などがよい。従っ
て、マレイミド基とペルオキシダーゼとの間に一定の基
が入っていることとなってもよい。GMBSをペルオキシダ
ーゼに反応させるには、両者をｐＨ約６ないし８の緩衝
液中で約10ないし50℃の温度で約10分ないし24時間反応
させることによって行われる。該緩衝液としては、たと
えば、ｐＨ7.0の0.1Ｍリン酸緩衝液などが挙げられる。
このようにして得られたマレイミド化ペルオキシダーゼ
は、たとえばゲルクロマトグラフィーなどにより精製す
ることができる。該ゲルクロマトグラフィーを行う際に
用いられる担体としては、例えば、セファデックスＧ−
25〔ファルマシア・ファインケミカル社（スエーデン）
製〕、バイオゲルＰ−２〔バイオラッド・ラボラトリー
ズ社（米国）製〕などが挙げられる。マレイミド化ペル
オキシダーゼと抗体分子との反応は、両者を緩衝液中で
約０℃ないし40℃の温度で、約１〜48時間反応させるこ
とにより行うことができる。該緩衝液としては、たとえ
ば、ｐＨ6.0の５ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウ
ム塩を含む0.1Ｍリン酸緩衝液などが挙げられる。この
ようにして得られたペルオキシダーゼ標識抗体は、たと
えばゲルクロマトグラフィーなどにより精製することが
できる。該ゲルクロマトグラフィーを行う際に用いられ
る担体としては、例えば、セファデックスG-25〔ファル
マシア・ファインケミカル社（スエーデン）製〕、バイ
オゲルＰ−２〔バイオラッド・ラボラトリーズ社（米
国）製〕などが挙げられる。さらに、ペルオキシダーゼ
にチオール基を導入し、マレイミド化された抗体分子と
反応させても良い。ペルオキシダーゼ以外の酵素を抗体
に直接結合させるには、ペルオキシダーゼの場合に準じ
て行うことができ、また、自体公知のグルタルアルデヒ
ド法、過ヨウ素酸法、水溶性カルボジイミド法などが用
いられる。
【００１４】本発明の測定系における被検試料として
は、尿、血清、血漿、髄液等の体液、あるいは、動物細
胞や菌体の抽出液またはその培養上清が挙げられる。本
発明の測定方法の一例として、標識剤がペルオキシダー
ゼの場合について以下に具体的に説明するが、特にこれ
に限定されるものではない。 まず、：担体に保持された抗体に、測定すべきＧＡＦ
ポリペプチド含有の分析対象物を加えて抗原抗体反応を
行った後、これに、前記の要領で得られたペルオキシダ
ーゼと抗ＧＡＦポリペプチド抗体との結合物を加えて反
応させる。 ：で得られた反応生成物にペルオキシダーゼの基質
を加え、生じた物質の吸光度もしくは蛍光強度を測定す
ることにより上記の反応生成物の酵素活性を検出する。 ：上記〜の操作を既知量のＧＡＦポリペプチドの
標準溶液に対してあらかじめ行い、ＧＡＦポリペプチド
と吸光度もしくは蛍光強度との関係を標準曲線として作
成しておく。 ：未知量のＧＡＦポリペプチドを含む分析対象物（被
検試料）について得られた吸光度もしくは蛍光強度を標
準曲線にあてはめ、分析対象物中のＧＡＦポリペプチド
の量を測定する。本発明抗体はＧＡＦの生物活性を中和
する作用、すなわちＧＡＦの活性部位周辺に抗原決定基
を有するので、活性なＧＡＦを効率よく測定することが
可能である。また、ＧＡＦポリペプチドの精製のために
用いる場合は、精製した本発明の抗体を例えば活性化し
たアガロースゲルビーズの様な適切な担体に常法に従っ
てカプリングさせた後、カラムに充め、培養上清或いは
破砕した菌体等の粗ＧＡＦポリペプチドを含む試料を抗
体アフィニティカラムにかけ、吸着させた後、洗浄し、
その後例えばKSCN（チオシアン酸カリウム）の様なカオ
トロピック試薬、或いはＧＡＦの失活のない程度の弱酸
性条件で溶出させる方法等により、効率よく精製でき
る。
【００１５】抗体カラムの作製は、例えばハイブリドー
マを接種した腹水等から純粋に精製した本発明のモノク
ローナル抗体を適切な担体とカプリングさせることによ
り、以下の様な方法で実施できる。用いる担体は、カプ
リングの後にＧＡＦポリペプチドが特異的に効率よく吸
着され、その後適切な溶出が可能なものであればどの様
なものでもよく、該担体としては、たとえばアガロー
ス、セルロースまたはアクリルアミドのポリマーが挙げ
られ、その一例としての蛋白の一級アミンが結合し易い
様に活性化されたポリアクリルアミドゲルルビーズ、例
えばアフィゲル−10（バイオラド社製）などが以下に述
べる様な方法で好都合に用いられる。アフィゲル−10と
抗体との反応は、約0.001〜１Ｍ、好ましくは約0.1Ｍの
バイカーボネート等の緩衝液中で反応を行う。反応条件
は約０℃〜20℃、約10分〜24時間、種々のｐＨが可能で
あるが、好ましくは、約４℃、約４時間、ｐＨ約３〜10
の条件が用いられる。混合するアフィゲル−10と抗体の
量比は、アフィゲル１ｍｌに対し抗体量が約50ｍｇ位迄
は多ければ多い程多くの抗体がつくので、この範囲内で
いくらでもよいが、結合効率およびアフィニティーカラ
ムクロマトグラフィーにおける精製効率を考慮して約10
〜30ｍｇの抗体が好都合に用いられる。この様にしてで
きた抗体−担体結合物は、反応に用いた緩衝液でよく洗
った後、数日放置するか、もしくは最終濃度約0.05〜0.
10Ｍのエタノールアミン・塩酸，グリシン等の一級アミ
ンを有する化合物を加え約４℃で約１〜４時間反応させ
る，あるいは１〜５％牛血清アルブミン(BSA)等のタン
パク質を４℃一夜反応させる等の方法により、残存する
未反応の活性基をブロックした後、適切なカラムにつめ
ることにより、抗体カラムとして使用できる。
【００１６】上記した抗体カラムで精製するに際して
は、たとえばＧＡＦポリペプチド含有試料を中性付近の
緩衝液、たとえばリン酸緩衝液やトリス・塩酸緩衝液に
溶解して抗体カラムに吸着させる。次にカラムを同じ緩
衝液で洗浄したのち、ＧＡＦポリペプチドを溶出する。
溶出液としては、弱酸性溶液たとえば酢酸溶液，ポリエ
チレングリコールを含む溶液，試料にくらべ抗体により
結合し易いペプチドを含む溶液、高濃度塩溶液などおよ
びこれらを組合せた溶液などが用いられ、ＧＡＦポリペ
プチドの分解をあまり促進しないものが好ましい。カラ
ム溶出液は、常法により緩衝液で中和する。必要により
再度上記の抗体カラムによる精製操作を行うことができ
る。このようにして、実質的にパイロジェンもエンドト
キシンも含まない、実質的に純粋なＧＡＦポリペプチド
が得られる。本発明の実質的に純粋なＧＡＦポリペプチ
ドとしては、蛋白質含量としてＧＡＦポリペプチドを90
％（ｗ／ｗ）以上であるもの、さらに好ましくは95％
（ｗ／ｗ）以上であるものが挙げられる。
【００１７】細胞は、恒常的に増殖のための刺激を受け
つづけると増殖が止まらなくなり、癌化する可能性があ
ることがしられている。ある増殖因子の受容体を細胞表
面に持つ細胞がその増殖因子を恒常的に産生しつづけ自
己増殖活性を有すると、その細胞は癌化する可能性があ
る。これはオートクラインな形質転換として知られてい
る。ＧＡＦは中胚葉由来の多くの細胞、例えば線維芽細
胞、グリア細胞、また、骨芽細胞、神経細胞等の増殖を
支持する増殖因子である。これらの細胞がＧＮＦを恒常
的に過剰生産する性質を持てばこの細胞は癌化する。ま
た、例えば、ヒトの自然発症癌の中にはＮＭＣ−Ｇ１細
胞のように、ＧＡＦを産生しているものも散見され、こ
の因子が細胞の癌化の一因として働く場合もあると考え
られる。このような症例に対してＧＡＦの増殖因子活性
を中和する抗体は、その症状を改善させることができ
る。即ち、本発明の中和抗体は制癌剤として使用するこ
とができる。該抗体を制癌剤として使用するには、例え
ば、注射剤として例えば静脈内、皮下腹腔内、腫瘍局所
等への投与が考えられる。又、脳腫瘍の場合には、頭蓋
内に直接投与しても良い。これらの際の抗体の投与量と
してはたとえば１μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇであり、他の安
定剤や免疫賦活剤、あるいは化学癌法剤等と併用するこ
ともできる。
【００１８】 本発明の配列番号３のポリペプチドのＮ末欠損フラグメント、すなわち次のア ミノ酸配列： (Met)n X2 Val Thr Asp Leu Asp His Leu Lys Gly Ile Leu Arg Arg Arg Gln Leu Tyr Cys Arg Thr Gly Phe His Leu Glu Ile Phe Pro Asn Gly Thr Ile Gln Gly Thr Arg Lys Asp His Ser Arg Phe Gly Ile Leu Glu Phe Ile Ser Ile Ala Val Gly Leu Val Ser Ile Arg Gly Val Asp Ser Gly Leu Tyr Leu Gly Met Asn Glu Lys Gly Glu Leu Tyr Gly Ser Glu Lys Leu Thr Gln Glu Cys Val Phe Arg Glu Gln Phe Glu Glu Asn Trp Tyr Asn Thr Tyr Ser Ser Asn Leu Tyr Lys His Val Asp Thr Gly Arg Arg Tyr Tyr Val Ala Leu Asn Lys Asp Gly Thr Pro Arg Glu Gly Thr Arg Thr Lys Arg His Gln Lys Phe Thr His Phe Leu Pro Arg Pro Val Asp Pro Asp Lys Val Pro Glu Leu Tyr Lys Asp Ile Leu Ser Gln Ser 〔X2 は Ser Asp His Leu Gly Gln Ser Glu Ala Gly Gl
y Leu Pro Arg Gly ProAla またはその断片を、nは０ま
たは１をそれぞれ示す。n＝0：配列番号６、n＝1：配列
番号７〕を有するポリペプチドにおいて、X2 の断片と
しては Ser Asp His Leu Gly Gln Ser Glu Ala Gly Gly
Leu Pro Arg Gly Pro Ala の配列の少なくとも１個の
アミノ酸残基を有していればよい。通常、この断片とし
ては上記配列のＣ末端のＡｌａを含むものであることが
好ましく、該断片にはＣ末端のＡｌａのみを断片とする
ものも含まれる。これらのポリペプチドは熱および酸に
対して安定である。
【００１９】本発明においてＧＡＦポリペプチドは、例
えば（イ）ヒトグリア活性化因子をコードするｍＲＮＡ
を細胞より抽出し、（ロ）該 ｍＲＮＡ から単鎖の相補
ＤＮＡ(cDNA)を、次いで二重鎖ＤＮＡを合成し、
（ハ）該相補ＤＮＡをファージまたはプラスミドに組み
込み、（ニ）得られた組み換えファージまたはプラスミ
ドで宿主を形質転換し、（ホ）得られた形質転換体を培
養後、形質転換体から適当な方法、例えばＤＮＡプロー
ブを用いたハイブリダイゼーション法により目的とする
ＤＮＡを含有するファージあるいはプラスミドを単離
し、（ヘ）その組み換えＤＮＡから目的とするクローン
化ＤＮＡを切り出し、（ト）該クローン化ＤＮＡまたは
その一部を発現ベクター中のプロモーターの下流に連結
する、ことにより製造することができる。
【００２０】ヒトＧＡＦをコードするｍＲＮＡは、種々
のＧＡＦ産生細胞、例えばヒトグリオーマ細胞、あるい
はヒト線維芽細胞などから得る事ができる。該ヒトグリ
オーマ細胞としてはＮＭＣ−Ｇ１、またヒト線維芽細胞
としてはＷＩ−３８（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−７５）など
が挙げられる。上記細胞ＮＭＣ−Ｇ１は平成２年１０月
３１日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号Ｉ
ＦＯ ５０２８１として、また平成３年２月２１日から
通商産業省工業技術院生命工学研究所（ＮＩＢＨ）に受
託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３２９４としてそれぞれ寄託さ
れており、またＷＩ−３８はジ・アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション（The American Type Cultur
e Collection）発行のカタログ・オブ・セル・ラインズ
・アンド・ハイブリドーマズ 第５版（Catalogueof Cel
l Lines & Hybriddomas， ５th edition），1985に掲載
されている。
【００２１】ＧＡＦ産生細胞からＲＮＡを調製する方法
としては、グアニジンチオシアネート法〔(ジェー・エム
・チルグウィン(J.M..Chirgwin)ら、バイオケミストリー
（Biochemistry)，18，5294(1979)〕などが挙げられ
る。このようにして得られたｍＲＮＡを鋳型とし、逆転
写酵素を用いて、例えば岡山(H.Okayama)らの方法〔モ
レキュラ−・アンド・セルラ−・バイオロジ−(Molecular
and Cellular Biology)2，161(1982)および同誌 3， 28
0(1983)〕に従いcＤＮＡを合成し、得られた cＤＮＡを
プラスミドに組み込む。cＤＮＡを組み込むプラスミド
としては、たとえば大腸菌由来の pＢＲ322〔ジ−ン（g
ene)，2，95(1977)〕，pＢＲ325〔ジーン，4，121(197
8)〕，pＵＣ12〔ジーン,19，259(1982)〕，ｐＵＣ13
〔ジーン，19，259(1982)〕、ｐＵＣ118，ｐＵＣ119，
枯草菌由来の pＵＢ110〔バイオケミカル・バイオフィ
ジカル・リサーチ・コミュニケーョン(Biochemical and
Biophysical Research Communication)，112，678(198
3)〕などが挙げられるが、その他のものであっても、宿
主内で複製増殖されるものであれば、いずれをも用いる
ことができる。
【００２２】プラスミドに組み込む方法としては、たと
えば、ティー・マニアティス（T．Maniatis)ら，モレキ
ュラー・クローニング(Molecular Cloning) コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Ha
rbor Laboratory)，第239頁（1982)に記載の方法などが
挙げられる。またファージベクターにｃＤＮＡを組み込
む方法としては、たとえばヒューン（Hyunh,T.V.）らの
方法〔ディー・エヌ・エー クローニング ア プラクティ
カル アプローチ（DNA Cloning, A PracticalApproach)
１，49(1985)〕などが挙げられる。上記ｃＤＮＡが組み
込まれたプラスミドの例としては、ヒト正常２倍体細胞
ｍＲＮＡより合成したｃＤＮＡをベクター、たとえばｐ
ＣＤベクター〔Okayama ら、モレキュラー・セル・バイ
オロジー（Molecular Cell Biology），３，280(1983)
参照〕を宿主（たとえば、大腸菌ｘ１７７６）に組み込
んで作成してもよい。
【００２３】このようにして得られたプラスミドは、適
当な宿主たとえばエシェリキア（Escherichia）属菌，
バチルス（Bacillus）属菌などに導入する。上記エシェ
リキア属菌の例としては、エシェリキア・コリ(Escheri
chia coli)Ｋ12ＤＨ1〔プロシージング・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A.)60,160(1968)〕，Ｍ103〔ヌクレイ
ック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Research)，
9，309(1981)〕,ＪＡ221〔ジャーナル・オブ・モレキュ
ラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biolog
y)〕,120,517(1978)〕，ＨＢ101〔ジャーナル・オブ・
モレキュラー・バイオロジー41,459(1969)〕，Ｃ600
〔ジェネティックス(Genetics)，39，440(1954)〕など
が挙げられる。上記バチルス属菌としては、たとえばバ
チルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＭＩ114(ジ
ーン，24，255(1983)，207−21〔ジャーナル・オブ・バ
イオケミストリー(Journal of Biochemistry)95，87(19
84)〕などが挙げられる。
【００２４】プラスミドで宿主を形質転換する方法とし
ては、たとえばティー・マニアティス（T．Maniatis）
ら，モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning),
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold
Spring Harbor Laboratory），第249頁（1982）に記載
のカルシウムクロライド法あるいはカルシウムクロライ
ド／ルビジウムクロライド法などが挙げられる。このよ
うにして得られた形質転換体中からＧＡＦのｃＤＮＡ配
列を基に合成したオリゴヌクレオチドをプローブとし
て、自体公知の方法、たとえばコロニー・ハイブリダイ
ゼーション法〔ジーン(Gene) 10，63(1980)〕およびＤ
ＮＡ塩基配列決定法〔プロシージング・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. A
cad. Sci. U.S.A.)74，560(1977)、ヌクレイック・アシ
ッズ・リサーチ(Nucleic Acids Research)，9，309(198
1)〕を用い求めるクローンを選出する。このようにし
て、クローン化されたＧＡＦをコードする塩基配列を含
有するＤＮＡを有するベクターを保持する微生物が得ら
れる。このようにして得られたプラスミドとして、例え
ば公知のプラスミドｐＥＴＧＡＦ１（ＥＰ０５０３２９
７号公報；同プラスミドを保持するＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ
−１／ｐＧＡＦ１はＦＥＲＭ ＢＰ−３５４７として平
成３年９月２日からＮＩＢＨに寄託されている）などを
用いることにより上記の工程を省くことができる。
【００２５】上記クローン化されたＧＡＦをコードする
ｃＤＮＡを有するプラスミドは目的によりそのまま、ま
たは所望により制限酵素で消化して使用することが出来
る。クローン化されたｃＤＮＡから発現させたい領域を
切り出し、発現に適したビークル（ベクター）中のプロ
モーターの下流に連結して発現型ベクターを得ることが
できる。本発明におけるＧＡＦポリペプチドを製造する
ためには、従来の組換えＤＮＡ技術を駆使することで対
応される。オリゴヌクレオチドの化学合成は容易であ
り、翻訳開始コドンＡＴＧを含むオリゴヌクレオチド、
あるいは翻訳停止コドンＴＡＡ，ＴＡＧまたはＴＧＡを
含オリゴヌクレオチドを合成してＧＡＦをコードするｃ
ＤＮＡ配列の適当な位置に挿入することによりペプチド
鎖の開始点および終止点を任意に操作することができ、
目的とするＮ末端側の欠失あるいはＣ末端の欠失、ある
いはその両方を欠失したムテインをコードするＤＮＡを
作成することができる。また目的とするアミノ酸配列を
コードするオリゴヌクレオチドを合成して、これをＧＡ
ＦをコードするＤＮＡに読み取り枠を合せて挿入するこ
とによりアミノ酸配列の付加されたムテインをコードす
るＤＮＡを作製することができる。また、ＧＡＦをコー
ドするＤＮＡの一部を欠失させ、アミノ酸の読み取り枠
を合わせて再結合すれば配列の一部を欠失したムテイン
をコードするＤＮＡを作製することができる。さらに上
記の組換えＤＮＡ技術に加え、特定部位指向性変異誘発
技術（Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅ
ｓｉｓ）が採用される。該技術は周知であり、アール・
エフ・レイサー(Lather, R.F.）及びジェイ・ピー・レ
コック(Lecoq, J.P.)、ジェネティック・エンジニアリ
ング（Genetic Engineering)、アカデミックプレス社
（１９８３年）第３１−５０頁に示されている。オリゴ
ヌクレオチドに指示された変異誘発はエム・スミス（Smi
th, M.）及びエス・ギラム（Gillam, S.)、ジェネティ
ック・エンジニアリング：原理と方法、プレナムプムス
社（１９８１年）３巻 １−３２頁に示されている。本
発明の配列番号３のポリペプチドのＮ末欠損フラグメン
トであるＧＡＦを得る目的の場合における変異ＧＡＦ遺
伝子を作製する方法としては、欠損させようとするアミ
ノ酸配列のカルボキシル末端をコードする遺伝子のコド
ンをＭｅｔをコードするＡＴＧに特定部位指向性変異法
を用いて変更し、さらにそのコドンの５’末端側に適当
な制限酵素の認識部位を生成せしめ、プロモーターとの
連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）を容易にさせるか、あるいは
制限酵素でアミノ末端を欠失させた遺伝子にＡＴＧをも
つオリゴヌクレオチドを読み取り枠を合わせて結合させ
ればよい。これらの手法の組み合わせにより目的とする
ＧＡＦをコードするＤＮＡを作製することができる。
【００２６】上記のようにして得られたＧＡＦポリペプ
チドをコードする遺伝子は、発現に適したビークル（ベ
クター）中のプロモーターの下流に連結して発現型組換
えベクターを得ることができる。組換えベクターを作製
するためのビークル（ベクター）としては、たとえば大
腸菌由来の pＢＲ322〔ジ−ン（gene)，2，95(197
7)〕，pＢＲ325〔ジーン，4，121(1978)〕，pＵＣ12
〔ジーン，19，259(1982)〕，pＵＣ13〔ジーン，19，25
9(1982)〕、ｐＵＣ118，ｐＵＣ119，枯草菌由来の pＵ
Ｂ110〔バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ
・コミュニケーョン(Biochemical and Biophysical Res
earch Communication),112,6678(1983)〕，pTP5，pC19
4，酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１
５）、あるいはλファージなどのバクテリオファージお
よびレトロウイルス、ワクシニアウイルスなどの動物ウ
イルスなどが挙げられる。該遺伝子はその５’末端に翻
訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端には
翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ，ＴＧＡまたはＴＡＧを
有していてもよい。さらに該遺伝子を発現させるにはそ
の上流にプロモーターを接続する。この発現で用いられ
るプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に
対応して適切なプロモーターであればいかなるものでも
よい。形質転換する際の宿主がエシェリキア属菌である
場合は、Ｔ7プロモーター，ｔｒｐプロモーター，ｌａ
ｃプロモーター，ｒｅｃＡプロモーター，λＰＬプロモ
ーター，ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属
菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター，ＳＰＯ２プロ
モーター，ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母であ
る場合は、ＰＨＯ５プロモーター，ＰＧＫプロモータ
ー，ＧＡＰプロモーター，ＡＤＨプロモーターなどが好
ましい。とりわけ宿主がエシェリキア属菌でプロモータ
ーがＴ7プロモーターまたはｔｒｐプロモーターである
ことが好ましい。宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ
４０由来のプロモーター、レトロウィルスのプロモータ
ーなどが挙げられ、とりわけＳＶ４０由来のプロモータ
ーが好ましい。
【００２７】このようにして構築されたＤＮＡを含有す
るベクターを用いて、形質転換体を製造する。宿主とし
ては、たとえばエシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵
母、動物細胞などが挙げられる。上記エシェリヒア属菌
の例としては、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)
Ｋ12ＤＨ1〔プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sc
i. U.S.A.)60，160(1968)〕，Ｍ103〔ヌクレイック・ア
シッズ・リサーチ(Nucleic Acids Research)，9，309(19
81)〕,ＪＡ221〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジー(Journal of Molecular Biology)〕，120，5
17(1978)〕，ＨＢ101〔ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー41，459(1969)〕，Ｃ600〔ジェネティ
ックス(Genetics)，39，440(1954)〕などが挙げられ
る。上記バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サ
ブチリス（Bacillus subtilis）ＭＩ114(ジーン，24，
255(1983)，207−21〔ジャーナル・オブ・バイオケミス
トリー(Journal of Biochemistry)95，87(1984)〕など
が挙げられる。上記酵母としては、たとえばサッカロマ
イセス セレビシエ(Saccaromyces cerevisiae)ＡＨ２２
Ｒ~，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄなどが挙げられ
る。動物細胞としては、株化したもの（ｃｅｌｌ ｌｉ
ｎｅ）が好ましく、たとえばサル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅ
ｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ，マウスＬ細
胞，ヒトＦＬ細胞などが挙げられる。上記エシェリキア
属菌を形質転換するには、たとえばプロシージング・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，69，2110(1972)やジー
ン，17，107(1982)などに記載の方法に従って行なわれ
る。バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキ
ュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス(Molec
ular & General Genetics），168，111(1979)などに記
載の方法に従って行なわれる。酵母を形質転換するに
は、たとえばプロシージング・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA)，75，1929(1978)に記載の方法に従って行なわれ
る。動物細胞を形質転換するには、たとえばヴィロロジ
ー（Virology）52，456(1973)に記載の方法に従って行
なわれる。
【００２８】このようにして、ＧＡＦポリペプチドのｃ
ＤＮＡを含有するベクターで形質転換された形質転換体
が得られる。宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌で
ある形質転換体を培養する際、培養に使用される培地と
しては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体
の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せ
しめられる。炭素源としては、たとえばグルコース、デ
キストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源として
は、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチ
ープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆
粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機
物としてはたとえば塩化カルシウム、リン酸二水素ナト
リウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵
母、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。
培地のｐＨは約５〜８が望ましい。エシェリヒア属菌を
培養する際の培地としては、例えばグルコース、カザミ
ノ酸を含むＭ９培地〔ミラー(Miller)，ジャーナル・オ
ブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティッ
クス(Journal of Experiments in Molecular Genetic
s)，431−433，Cold Spring Harbor Laboratory, New Y
ork 1972〕が好ましい。ここに必要によりプロモーター
を効率よく働かせるために、たとえば３β−インドリル
アクリル酸のような薬剤を加えることができる。
【００２９】宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通
常約１５〜４３℃で約３〜24時間行い、必要により、通
気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の
場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行な
い、必要により通気や攪拌を加えることもできる。宿主
が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、
たとえばバークホールダー(Burkholder)最小培地〔Bost
ian, K. L. ら、「プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.US
A）77，4505(1980)〕が挙げられる。培地のｐＨは約５
〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３
５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌
を加える。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する
際、培地としては、たとえば約５〜２０％の胎児牛血清
を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science）122，501(19
52)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー(Viro-logy)，8，3
96(1959)〕，ＲＰＭＩ１６４０培地〔ジャーナル・オブ
・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Th
e Jounal of the American Medical Association) 19
9，519(1967)〕,１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ
・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディ
スン（Pro-ceeding of the Society for the Biologica
l Medicine）73， 1 (1950)〕などが挙げられる。ｐＨ
は約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜
４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹
拌を加える。
【００３０】上記培養物からＧＡＦポリペプチドを分離
精製するには、例えば下記の方法により行うことができ
る。ＧＡＦを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際し
ては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、
これを緩衝液あるいは塩酸グアニジンなどの蛋白質変性
剤を含む液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／また
は凍結融解によって菌体あるいは細胞を破壊したのち、
遠心分離によりＧＡＦポリペプチドを得る方法などが適
宜用い得る。とりわけ、リゾチームと超音波処理を併用
する方法が好ましい。
【００３１】上記上澄液からＧＡＦポリペプチドを精製
するには、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせ
て行なうことができる。これらの公知の分離、精製法と
しては、塩析や溶媒沈殿法などの溶解度の差を利用する
方法、透折法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分
子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィ
ーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロ
マトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆
相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用
する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用す
る方法などが挙げられる。特に前述の本発明抗体を用い
たアフィニティークロマトグラフィーはＧＡＦポリペプ
チドの精製に好ましく用いられる。
【００３２】さらに具体的には、上記上澄液をＤＥＡＥ
セルロースなどを担体としたイオン交換クロマトグラフ
ィーにかけることにより、夾雑する核酸や酸性蛋白質等
を除くことができる。たとえば、中性付近のトリスなど
の緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセルロースカラムに上澄
液をかけ、素通り画分を集めることは有効である。ま
た、さらにＣＭセルロースなどを担体としたイオン交換
クロマトグラフィーにかけることにより、ＧＡＦポリペ
プチドを担体に吸着させ、塩溶液を用いてこれを溶出さ
せることにより精製することができる。ＣＭセファデッ
クス等の酸性樹脂のカラムクロマトグラフィーにより、
菌体抽出液から直接、ＧＡＦポリペプチドを精製するこ
とができる。たとえば、上清液を、弱酸性緩衝液（例、
リン酸緩衝液）で平衡化したＣＭ−セファデックスカラ
ムにかけることにより、効率良く行なうことができる。
カラムを同じ緩衝液で洗浄後、カラムを、塩（例、Ｎａ
Ｃｌ）をさらに含有する緩衝液を用いて溶出することに
より、ＧＡＦポリペプチドを溶出させることができる。
これらの溶出液は透析後、凍結乾燥することができる。
また、ヘパリン−セファロースを担体としたアフィニテ
ィークロマトグラフィー法を、ＧＡＦポリペプチドの精
製法として、大腸菌抽出液中のＧＡＦポリペプチドにも
適用すると好都合である。たとえば中性付近のトリスあ
るいはリン酸などの緩衝液で平衡化したヘパリン・セフ
ァロースカラムに、溶出液をかけ、十分洗った後、食塩
などの直線勾配溶出を行うことによりＧＡＦポリペプチ
ドを精製することができる。特に、高速液体クロマトグ
ラフィー用に開発されたヘパリンカラム（たとえばＳｈ
ｏｄｅｘ ＡＦ−ｐａｋ ＨＲ・８９４、昭和電工製な
ど）は有効である。上記ヘパリンセファロースカラムと
同様に、中性付近の緩衝液でサンプルをかけ、十分洗っ
たのちＮａＣｌなどの直線勾配溶出を行うと、ＧＡＦポ
リペプチドはほぼ均一な標品として回収することができ
る。この様にして得られた標品は透析、凍結乾燥を行
い、乾燥粉末とすることもできる。さらに、担体として
血清アルブミンなどを添加して保存することは、標品の
容器への吸着を防ぐことができ好適である。また、精製
過程、あるいは保存過程での微量の還元剤の共存は、該
標品の酸化を防ぐのに好適である。還元剤としてはβ−
メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、グルタチ
オンなどが挙げられる。このようにして、実質的にパイ
ロジエンもエンドトキシンも含まない、実質的に純粋な
ＧＡＦポリペプチドが得られる。ここで実質的に純粋な
ＧＡＦポリペプチドとしては、ポリペプチド含量として
ＧＡＦ９５％（ｗ／ｗ）以上であるものが挙げられる。
かくして生成するＧＡＦポリペプチドの生物活性は、例
えばＮａｒｕｏらの方法〔ザ・ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー、第２６８巻、２８５７頁
（１９９３）〕、すなわち、ラット胎児（１９日令）脳
より分離採取した初代培養グリア細胞、あるいは公知の
ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞に対する3Ｈ・チミジンのとり
こみを指標として増殖促進効果などにより測定すること
ができる。またＭＫ−ＣＳＦ活性はマウス骨髄細胞を培
養し、巨核球数を計測することにより測定することがで
きる。本発明の配列番号３で示されるポリペプチドのＮ
末３３ないし４９アミノ酸欠損欠損フラグメントは公知
のＧＡＦ同様、脳神経系疾患治療薬、骨形成促進剤、肝
細胞増殖賦活剤あるいは血小板増加剤として、そのまま
粉末として、または他の薬理学的に許容をされうる担
体，賦形剤（例、ヒト血清アルブミン、ソルビトールな
どの安定化剤など），希釈剤とともに医薬組成物（例、
注射剤，錠剤，カプセル剤，液剤，軟膏）として、温血
哺乳動物（例、ヒト，マウス，ラット，ハムスター，ウ
サギ，犬，ネコ）に対して非経口的または経口的に安全
に投与することができる。とりわけ注射剤として非経口
的に投与するのが好ましい。すなわち、これらの断片は
抗凝固活性を有するヘパリンもしくはシクロデキストラ
ンの共存なしに安定であるので、医薬品としてはより好
ましいものである。本発明のポリペプチドは肝実質細胞
の増殖を促進することから、肝硬変等の肝障害に対する
肝細胞増殖賦活剤として使用することができる。この場
合にも、例えば注射剤として静脈内或いは皮下、腹腔内
への投与が考えられる。この際のポリペプチドの投与量
としては、例えば１００ｎｇ〜１００μｇ／ｋｇであ
り、他の因子、或いは安定化剤と併用することもでき
る。
【００３３】本発明のポリペプチドを血小板増加剤とし
て使用する場合には単独のみならず作用機序の異なる、
他の血小板増加剤や、白血球増加剤（Ｇ−ＣＳＦ，Ｍ−
ＣＳＦ，ＣＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−３など）、あるいは免疫
賦活剤，赤血球増加剤（エリスロポエチンなど）などと
混合、あるいは組み合わせて併用することも可能であ
る。医薬組成物としての製剤化にあたっては、公知の製
剤学的製造法に準じ、所望により製剤学的に許容され得
る添加剤、希釈剤、賦形剤などを用いる。たとえば、注
射用水溶液剤とする場合は、水性溶剤（例、蒸留水），
水溶性溶剤（例、生理食塩水，リンゲル液），油性溶剤
（例、ゴマ油，オリーブ油）等の溶剤，または所望によ
り溶解補助剤（例、サリチル酸ナトリウム，酢酸ナトリ
ウム），緩衝液（例、クエン酸ナトリウム，グリセリ
ン），等張化剤（例、ブドウ糖，転化糖），安定剤
（例、ヒト血清アルブミン，ポリエチレングリコー
ル），保存剤（例、ベンジルアルコール，フェノー
ル），無痛化剤（例、塩化ベンザルコニウム，塩酸プロ
カイン）等の添加剤を用いて、常套手段により製造され
る。また、たとえば固型状注射用製剤とするには希釈剤
（例、蒸留水，生理食塩水，ブドウ糖），賦形剤（例、
カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ），アルギン酸ナ
トリウム），保存剤（例、ベンジンアルコール，塩化ベ
ンザルコニウム，フェノール），無痛化剤（ブドウ糖，
グルコン酸カルシウム，塩酸プロカイン）等を混合し、
常套手段により、固型状注射用製剤に製造することがで
きる。
【００３４】さらに、製剤化にあたっては、ブドウ糖な
どの単糖類や、アミノ酸，各種塩類，ヒト血清アルブミ
ンなどを添加しても良く、その他に等張化剤、ｐＨ調節
剤，無痛化剤，防腐剤などを加えて安定で有効な製剤を
調製することができる。本発明製剤の血小板増加剤とし
ての投与量は、たとえば投与ルート、症状などを考慮し
て、体重あたり１日量約１ｎｇ〜１０００μｇ／ｋｇ、
好ましくは１０ｎｇ〜１００μｇ／ｋｇ、さらに好まし
くは１００ｎｇ〜１００μｇ／ｋｇの中から適当量を選
んで必要に応じ、数回に分けて投与される。本発明製剤
を非経口的に投与するには、たとえば、静脈内投与、皮
下投与、筋肉内投与、骨髄腔内投与および経粘膜投与な
どが挙げられる。経粘膜投与の経路としては、経鼻、口
腔内、直腸などが挙げられる。特に静脈内投与、あるい
は皮下投与が好ましい。投与は１日１回投与でも、数回
に分けてもよく、さらには持続注入でも良い。また間歇
的にたとえば、３日に１回、あるいは１週間に１回程度
投与してもよい。また、徐放製剤に成形して投与しても
よく、該徐放製剤としては、マイクロカプセル、埋め込
み剤などが挙げられる。特に、徐放剤に成形したもの
を、皮下に埋め込むことにより、長時間にわたり主薬の
効果を発揮せしめるようにするのが好ましい。
【００３５】本発明の血小板増加剤の投与により抹梢血
中の血小板数を増加させることができる。癌の化学療法
では、ほとんどの化学療法剤の投与によって血小板減少
が引きおこされ、充分量の化学療法剤の投与をさまたげ
ている。放射線治療も同様である。血小板の減少は薬剤
投与後３〜１５日に観察される。本発明の血小板増加剤
は投与後、５〜１０日に血小板の増加作用を現わすの
で、化学療法剤の投与後すぐに、また血小板の減少を観
察してから投与し、血小板数の回復をはかることができ
る。また、化学療法剤の投与前より本発明の血小板増加
剤を投与しておいて、前もって血小板数を増加させてお
くこともよい効果をもたらす。本発明の血小板増加剤は
血小板を増加させ、化学療法剤処理によって減少した血
小板数を回復させ、治療の効果をあげるとともに患者の
危険な状態を回復させることができる。すなわち本発明
の血小板増加剤は癌の増殖がＧＡＦによって促進されな
い限り制癌補助剤として用いることができる。ＧＡＦに
対する癌細胞の成長性は本発明のＧＡＦポリペプチドも
しくは抗ＧＡＦ抗体を用いた測定法によって検出でき
る。これら制癌剤としては、例えばアルキル化剤（例え
ばナイトロジェンマスタードＮ・オキシド，シクロフォ
スファミド，メルファラン，カルボコン，ブスルファ
ン，塩酸ニムスチン，ラニムスチン，ダカルバジンな
ど）、代謝拮抗剤（例えばフルオロウラシル，テガフー
ル，シタラビン，塩酸アンシタビン，ブロクスウリジ
ン，ドキシフルリジン，メルカプトプリン，チオイノシ
ン，メトトレキサートなど）、抗生物質（例えばマイト
マイシン，ブレオマイシン，塩酸ダウノルビシン，塩酸
ドキソルビシン，塩酸ピラルビシン，塩酸アクラルビシ
ン，ネオカルチノスタシン，アクチノマイシンＤなど）
植物アルカロイド（例えば硫酸ビンクリスチン，硫酸ビ
ンブラスチン，硫酸ビンデシン，エトポシドなど）ホル
モン剤（例えばクエン酸タモキシフェンなど）その他
（塩酸プロカルバジン，ミトブロニトール，塩酸ミトキ
サントン，シスプラチンなど）が挙げられる。
【００３６】本発明明細書および図面において、塩基や
アミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵ
Ｂ Ｃｏｍｍｉｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ［ｃ
ｎ］Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該
分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下
記する。また、アミノ酸に関し光学異性体がありうる場
合は、特に明示しなければＬ−体を示すものとする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 Ｔｄｒ ：チミジン ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニールアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン。
【００３７】後述の参考例及び実施例で得られた形質転
換体及び動物細胞は、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に
寄託され、また、通商産業省工業技術院生命工業技術研
究所（ＮＩＢＨ）（旧通商産業省工業技術院微生物工業
技術研究所）にブタベスト条約に基づく寄託として寄託
されている。受託番号および受託日を次の表１に示す。 表 １ 形質転換体 ＩＦＯ ＮＩＢＨ ＩＦＯ Ｎｏ． ＦＥＲＭ ＢＰ−Ｎｏ． Ｅ．coli DH1／pGAF1 １５２１７ ３５４７ (1991.8.28） (1991.9.2) Ｅ．coli MM294(DE3)/ １５２４８ ３６８９ pLysS, pETGAF1 (1991.12.3) (1991.12.24) Ｅ．coli MM294(DE3)/ １５５０３ ４３５４ pLysS, pETGAF25 (1993.6.29) (1993.7.6) Ｅ．coli MM294(DE3)/ １５５０４ ４３５５ pLysS, pETGAF23 (1993.6.29) (1993.7.6) マウス・ハイブリドーマ ５０３８５ ４１４３ GAF 150-59 (1992.12.21) (1993.1.7) マウス・ハイブリドーマ ５０３８４ ４１４２ GAF 40-20 (1992.12.21) (1993.1.7) マウス・ハイブリドーマ ５０３８３ ４１４１ GAF 13-3 (1992.12.21) (1993.1.7) マウス・ハイブリドーマ ５０４０８ ４４２８ GAF 4-82 (1993.9.14) (1993.9.29) 以下に参考例および実施例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものでは
ない。 参考例１ （１）ＧＡＦ（Ｎ３）の大腸菌での発現 ＧＡＦ発現用プラスミドｐＥＴＧＡＦ１の構築 ＥＰＯ５０３２９７号公報記載のヒトＧＡＦの全構造遺
伝子を含むプラスミドｐＧＡＦ１を制限酵素ＫｐｎＩ−
ＢａｍＨＩで切断し、１．２５ｋｂのｃＤＮＡ断片を単
離した。一方、Ｔ７プロモーターを含むプラスミドｐＥ
Ｔ３−ｃを制限酵素ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩで切断し、
４．６ｋｂのＤＮＡを単離し、そこに前記のＧＡＦ ｃ
ＤＮＡ １．２５ｋｂ断片と、配列番号３で示されるＧ
ＡＦポリペプチドのＮ末端４番目のアミノ酸Ｌｅｕの前
にＭｅｔが来る様に合成したＤＮＡ断片（ＮｄｅＩ−Ｋ
ｐｎＩ）（〔配列番号：１０〕および〔配列番号：１
１〕）を挿入して、Ｔ７プロモーターの支配下に、ＧＡ
Ｆ ｃＤＮＡを発現させ得る発現用プラスミドｐＥＴＧ
ＡＦ１を構築した。このプラスミドはグリオーマより精
製された３０ＫＤａ ＧＡＦ分子種に相当するポリペプ
チド鎖を発現する。以下、この３０ＫＤａ ＧＡＦポリ
ペプチドをＮ３とよぶことがある。プラスミドｐＥＴＧ
ＡＦ１の構築図を図２に示す。このプラスミドを用いて
大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳを形質転換す
ることにより、Ｎ３を発現する形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ
ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ，ｐＥＴＧＡＦ１
を得た。
【００３８】ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ，ｐＥ
ＴＧＡＦ１をＬＢ培地で培養し、イソプロピル−β−Ｄ
(−)−チオガラクトシド（和光純薬（株）、日本）で発
現を誘導した後、培養液２００μｌ相当の菌体全抽出ポ
リペプチドをＧＡＦポリペプチドのＮ末端部分を認識す
るウサギ抗ＧＡＦポリクローナル抗血清（×５００倍希
釈）を用いウエスタンブロッティング法により調べる
と、特異的なバンドが確認された。ＧＡＦ ｃＤＮＡの
含まれないプラスミドｐＥＴ３−ｃによる形質転換体
Ｅ．ｃｏｌｉＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ，ｐＥ
Ｔ３−ｃではこのバンドは産生されない。
【００３９】（２）大腸菌で産生させたＧＡＦ（Ｎ３）
の抽出Ｅ ．ｃｏｌｉＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ，ｐＥ
ＴＧＡＦ１を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１０
μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢメディウ
ム中にて３７℃で振とう培養した。培養液のＫｌｅｔｔ
値が１２０に達した時点でイソプロピル−β−Ｄ（−）
−チオガラクトシドを最終濃度０．４ｍＭになるように
添加し、さらに３７℃にて３．５時間振とう培養した。
１リットルの培養液より、遠心（６，０００回転／分、
１０分間）により集めた菌体を、氷上にて、８０ｍｌの
２ｍＭ （ｐ−アミジノフェニル）メタンスルホニル フ
ルオライド ハイドロフルオライド（和光純薬（株）、
日本）、１００μｇ／ｍｌの卵白リゾチーム（生化学工
業株式会社、東京）、および０．１Ｍ食塩を含む２０ｍ
Ｍトリス塩緩衝液で懸濁させ４℃にて１時間置いた後、
３７℃で３分間インキュベートした。その懸濁液を、氷
で冷却して超音波処理（BRANSON 社製、SONIFIER（登録
商標）、米国、CELL DISRUPTOR 200 出力８にて２分
間）した。大腸菌抽出物を17,000回転／分、４０分間の
遠心により得た。
【００４０】（３）大腸菌が産生するＧＡＦ（Ｎ３）の
精製 ステップ１：硫安沈殿 １リットルの培養液より得られた８０ｍｌの大腸菌抽出
物に２７ｍｌの飽和硫酸アンモニウム水溶液を添加混合
後、４℃にて１昼夜放置した。その後１７０００回転／
分，４０分間の遠心にて上清を得た。 ステップ２：疎水カラムクロマトグラフィー ステップ１で得られた１００ｍｌの遠心上清を、あらか
じめ２５％飽和硫安を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．６）で平衡化した Butyl-Toyopearl 650 M
(ベッド容積５０ｍｌ、内径２．５ｃｍ×長さ１０ｃ
ｍ、東ソー株式会社製、東京）に通した（８０ｍｌ／時
間、４℃）。１２．５％飽和硫安と２ｍＭのＰＭＳＦを
含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）で充分坦
体を洗浄後、１５％グリセリン、０．１％ＣＨＡＰＳお
よび２ｍＭ ａＰＭＳＦを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７．６）でＧＡＦポリペプチドを含む画分を得
た（８０ｍｌ／時間、１０ｍｌ／フラクション、４℃）
（図５）。図中、Ｅ1は１２．５％飽和硫安と２ｍＭ ａ
ＰＭＳＦを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
６）、Ｅ2は１５％グリセリン、０．１％ＣＨＡＰＳお
よび２ｍＭ ａＰＭＳＦを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７．６）。 ステップ３：ヘパリンアフィニティー高速液体カラムク
ロマトグラフィー ステップ２でのＧＡＦポリペプチドを含む画分（フラク
ション４４から４７）をプールした（４０ｍｌ）。この
４０ｍｌの溶液のうち３６ｍｌを、ＨＲ−８９４（内径
８ｍｍ×長さ５０ｍｍ、昭和電工、日本）を装置した高
速液体クロマトグラフィー（Gilson Medical Electroni
cs社製、フランス)にかけた。レジンに吸着したポリペ
プチドは、ＮａＣｌの濃度を直線的に上昇させることに
より、流速２ｍｌ／分で溶出し分画（２ｍｌ／フラクシ
ョン）した。用いた緩衝液はＡが０．４Ｍ ＮａＣｌ、
０．１％ＣＨＡＰＳと１５％グリセリンを含む１０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）で、Ｂが２Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．１％ＣＨＡＰＳと１５％グリセリンを含む１０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）である。溶出のプ
ログラムは次に記すとおりで行った。すなわち０分（１
００％Ａ）−７０分（７５％Ａ＋２５％Ｂ）−７５分
（１００％Ｂ）−８０分（１００％Ｂ）−８５分（１０
０％Ａ）として行った（図６）。カラム温度は室温であ
った。
【００４１】ポリペプチドの溶出画分の１μｌを２−メ
ルカプトエタノール存在下でＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ド電気泳動し（ゲル濃度１２．５％）、銀染色した結果
を図４に示す。食塩濃度を上昇させることにより溶出さ
れてきた画分は、２７ＫＤａの単一なバンドを与えた。
またこの２７ＫＤａポリペプチドはＮ末部分と結合する
ウサギ抗ＧＡＦポリクローナル抗血清で認識された。フ
ラクション２７から４２をプールした。
【００４２】（４）精製の要約 １リットルのＥ．ｃｏｌｉ ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐ
ＬｙｓＳ，ｐＥＴＧＡＦ１培養液から出発したＧＡＦ
（Ｎ３）の精製の要約を表２に記す。 表 ２ サンプル 全たん白量 全活性 比活性 活性 精製 回収率 倍数 （mg） （U） （U／mg） （％） 大腸菌抽出物 672 4.16×107 6.19×104 100 1 25%飽和硫安上清 210 4.35×107 2.07×105 105 3.3 Butyl-Toyopearl 37.6 4.10×106 1.09×105 10 1.8ヘパリンHPLC 4.5 3.31×106 7.35×105 8.0 12 生物活性の測定は、種々の量のＧＡＦ Ｎ３を１ｎｇ／
ｍｌの２５−ｋＤａ ＧＡＦおよびハイブリドーマ培養
上清の代りに反応混合物に加える以外は後述の参考例２
に記載した方法で行った。生物活性の単位はトリチウム
チミジンの５０％取り込み値を示すサンプルの希釈率の
逆数とした。なお、トリチウムチミジンの１００％取り
込み値は、１０％ウシ胎児血清により誘導される値とし
た。ポリペプチド量はＭｉｃｒｏＢＣＡキット（ＰＩＥ
ＲＣＥ社製、米国）により、ウシ血清アルブミンを対照
にして算定した。
【００４３】実施例１ Ｎ末３３アミノ酸欠損ＧＡＦ（Ｎ３３）の取得 参考例１記載のプラスミドｐＧＡＦ１を制限酵素Ｄｒａ
Ｉ−ＢａｍＨＩで切断し１．２ｋｂのｃＤＮＡ断片を単
離した。一方、Ｔ７プロモーターを含むプラスミドｐＥ
Ｔ３ｃを制限酵素ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩで切断し、３８
ｂｐ ＤＮＡを除去した後、前記のＧＡＦ ｃＤＮＡ
１．２ｋｂ断片と、ＧＡＦの配列番号３で示される配列
の３４番目のアミノ酸Ｓｅｒの前に翻訳開始コドンＡＴ
Ｇが入る様に合成したＤＮＡ断片（ＮｄｅＩ−Ｄｒａ
Ｉ）（（配列番号：１２）および（配列番号：１３））
を挿入して、Ｔ７プロモーターの支配下に配列番号３の
ポリペプチドよりＮ末端側アミノ酸が３３個欠失したＧ
ＡＦ分子を発現させ得る発現用プラスミドｐＥＴＧＡＦ
２５を構築した。この分子はグリオーマより精製された
２５ＫＤａ ＧＡＦ分子種に相当するポリペプチド鎖で
ある。以下、この分子をＮ３３とよぶ。このプラスミド
を用いて大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳを形
質転換することにより、Ｎ３３を発現する形質転換体
Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ，ｐ
ＥＴＧＡＦ２５を得た。以下、大腸菌の培養と菌体から
のＧＡＦ（Ｎ３３）の精製についてＮ３と全く同じ方法
で培養、精製することができた。 （２）ＧＡＦムテインＮ３３の精製 Ｎ３３の精製については次の方法も用いられた。１リッ
トルの培養液から遠心分離によって（６，０００ｒｐｍ
１０分間）回収されたＥ．ｃｏｌｉＭＭ２９４（ＤＥ
３）／ｐＬｙｓ Ｓ， ｐＥＴＧＡＦ２５を氷上で２ｍ
Ｍ（ｐ−アミジノフェニル）メタンスルホニルフルオラ
イドフッ素塩（和光純薬（株））、１００μｇ／ｍｌ卵
白リゾチーム（生化学工業（株））及び０．３Ｍ Ｎａ
Ｃｌを添加した１００ｍｌの２０ｍＭ トリス−塩酸緩
衝液中に懸濁させ、得られた懸濁液にビーズ（ＭＡＨＬ
ＫＯＥＲＰＥＲ ＭＫ−２ＧＸＣＤＲ）０．２５−０．
５ｍｍΦ， Ｗｉｌｌｙ Ａ．ＢａｃｈｏｆｅｎＢａｓ
ａｌ．Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）（ｖｏｌ．３０ｍｌ）
を添加して０℃で激しく撹拌してＥ．ｃｏｌｉ菌体を破
砕した（４分間撹拌、２分間静置を６回繰り返す）。
Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物を遠心分離（ＳＯＲＶＡＬＬ， １
１，０００／ｒｐｍ．３０分間、４℃）によって得た。
この抽出物に硫酸アンモニウムの飽和水溶液を最終濃度
２０％となるまで添加し、次いで撹拌した。該混合物を
４℃に３０分間静置した後、１７，０００ｒｐｍで４０
分間（ＳＯＲＶＡＬＬ ４℃）遠心分離して沈殿物を得
た。この遠心分離による沈殿物を氷上で、０．１５ＭＮ
ａＣｌ及び０．１％ＣＨＡＰＳを添加した２０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）５０ｍｌ中に溶解
した。そしてこのものを０．１５μ ＮａＣｌ及び０．
１％ ＣＨＡＰＳを添加した２０ｍＭ トリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ７．６）５０ｍｌで平衡化したＤＥＡＥ−Ｔ
ｏｙｏｐｅａｒｌカラム６５０Ｓ（床容積：１５０ｍ
ｌ，Ｔｏｓｏｈ Ｃｏｒｐ．）にかけた。このカラムを
同緩衝液で洗浄し、このカラムを通過したフラクション
（フラクション数１１−１８，総量８０ｍｌ）を回収し
た。濾過後、得られた溶液を０．２Ｍ ＮａＣｌを添加
した１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（７．６ｐＨ）で平
衡化したヘパリンカラム（Ｓｈｏｄｅｘ ＨＲ−８９
４，８Φ×５０ｍｍ）にかけた。このカラムを同緩衝液
で洗浄した後、目的とするポリペプチドを０．２Ｍ−２
Ｍ ＮａＣｌ濃度勾配（流速：１ｍｌ／分、６０分）で
溶出した。上記実施例１−（１）のステップ３のヘパリ
ンアフィニティーカラム溶出画分をポリアクリルアミド
ゲル電気泳動すると食塩濃度０．８Ｍ付近に見られる大
きなピークは２２ＫＤａの単一なバンドを与え、ＧＡＦ
のＣ末端ペプチドで惹起したウサギ抗ＧＡＦ Ｃ末抗体
で認識された。このピークに相当するフラクション３６
から４２をプールし、精製標品とした。１リットルの
Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ，ｐ
ＥＴＧＡＦ２５培養液から出発したＮ３３の精製の要約
を表３に示す。 表 ３ サンプル 蛋白量 全活性 比活性 回収率 （mg） （U） （U／mg） （％） 粗抽出液 322.5 933×105 2.89×105 100 硫安沈殿 300.5 788×105 2.62×105 84 DEAE-トヨパール 242.1 416×105 1.72×105 45 ヘパリンHPLC 6.1 183×105 3.00×106 20 実施例２ （１）Ｎ末４９アミノ酸欠損ＧＡＦＮ４９発現プラスミ
ドの構築 実施例１と同様にして得られたＧＡＦ ｃＤＮＡの１．
２ｋｂのＤｒａＩ−ＢａｍＨＩ断片と、配列番号３で示
されるＧＡＦの５０番目のアミノ酸Ａｌａの前に翻訳開
始コドンＡＴＧが入る様に合成したＤＮＡ断片（Ｎｄｅ
Ｉ−ＤｒａＩ）を挿入して、Ｔ７プロモーターの支配下
に、配列番号３のポリペプチドよりＮ末端側アミノ酸が
４９個欠失したＧＡＦ（以下Ｎ４９と称することがあ
る）を発現させ得る発現用プラスミドｐＥＴＧＡＦ２３
を構築した。このプラスミドｐＥＴＧＡＦ２３の構築図
を図４に示す。このプラスミドを用いて大腸菌ＭＭ２９
４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳを形質転換することにより、
Ｎ４９を発現する形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＭ２９４
（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ，ｐＥＴＧＡＦ２３を得た。 （２）Ｎ４９の生成 上記（１）で得られたＥ．ｃｏｌｉＭＭ２９４（ＤＥ
３）／ｐＬｙｓＳ，ｐＥＴＧＡＦ２３を実施例１−
（２）と同様にして菌体抽出液を調製し、（３）と同様
にして精製した。Ｎ４９の回収率はＮ３３とほぼ同等で
あった。
【００４４】実施例３（モノクローナル抗体の作製） （１）免疫 BALB／cマウス（♀６週令）に対し、生理食塩水０．１
ｍｌに溶解させた１００μｇの抗原ヒトＧＡＦ（Ｎ３
３）を皮下に毎日、１０日間注射した。３週間後に、生
理食塩水０．１ｍｌに溶解させた１００μｇの抗原ＧＡ
Ｆ（Ｎ３３）をマウス尾静脈内に接種した。 （２）細胞融合 （１）で示した免疫マウスより、抗原最終投与の４日後
脾臓を摘出し、細胞融合に用いる細胞を得た。この細胞
は、ＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁した。マウスミエロ
ーマ細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ・８ＵＩは１０％ウシ胎児
血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で５％炭酸ガス、９
５％空気の条件で継代培養した。細胞融合は、ケーラー
およびミルスタインらが確立した方法〔ケーラー， G.
およびミルスタイン, C. ：ネイチャー（Nature）256,
495(1975)〕に準じて行った。上記ミエローマ細胞２．
９×107個と上述した方法で得られた免疫されたリンパ
球1.5×108個を混合、遠沈し、０．３mｌのＲＰＭＩ−
１６４０培地に溶解した45％ポリエチレングリコール60
00（以下PEG 6000と称する）を滴下した。ＰＥＧ6000溶
液は、予め37℃に温め、ゆっくりと滴下した。５分後３
７℃に予温したＲＰＭＩ−１６４０培地を１分間に０．
５ｍｌずつ加え１０ｍｌとした後、室温で６００回転１
５分遠心し上清を除去した。この細胞沈殿物を２０％仔
牛血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地２００ｍｌに懸濁
し、96穴マイクロプレート（ヌンク社）に100μｌずつ
植えつけた。１日後、HAT（ヒポキサンチン１×10~4M、
アミノプテリン４×10~7M、チミジン1.6×10~5M）を含
んだＲＰＭＩ−１６４０培地（20％仔牛血清含有）(以
下HAT培地と称する。）を各ウエルに１００μｌずつ添
加し、さらに３日おきに、培地の１／２量をHAT培地と
交換した。このようにして生育した細胞は雑種細胞であ
る。
【００４５】（３）抗体産生細胞の検索 予め、ヒトＧＡＦ（Ｎ３３）を固定したポリスチレン製
９６穴マイクロタイタープレートに、雑種細胞培養上清
を１００μｌずつ加え室温で２時間インキュベートし
た。培養上清を除去、洗浄後、２次抗体としてＨＲＰ標
識抗マウスＩｇＧヤギ抗体（マイルス社）を加え室温で
２時間インキュベートした。２次抗体を除去し、よくウ
エル洗浄した後、反応基質を加えた呈色反応を行った
（ＥＩＡ法)。この方法により３つのウエルに強い結合
価が観察された。 （４） 雑種細胞のクローニング これらのウエル中の細胞を、１ウエルあたり0.5個とな
るように、予め１０4個／ウエルのマウス胸腺細胞を栄
養細胞としてまいておいた９６穴マイクロタイタープレ
ートにまき、クローニングを行った。その結果、３つの
クローンマウスハイブリドーマ細胞 ＧＡＦ １５０−５９細胞 ＧＡＦ ４０−２０細胞 ＧＡＦ １３−３細胞 を得た。クローニングされたハイブリドーマ細胞は、２
０％仔牛血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地に１０％と
なるようジメチルスルホキシド（DMSO）を加え液体窒素
内に貯蔵した。
【００４６】実施例４（モノクローナル抗体の免疫グロ
ブリンクラス） 実施例４の（４）で得られたハイブリドーマより産生さ
れるモノクローナル抗体（以下ＭｏＡｂと略記すること
がある）をマウス抗体サブクラス検出キット（バイオラ
ッド社）により各種標品免疫グロブリンと反応させた。
その結果を表４に示す。 表 ４ 標品免疫 本発明モノクローナル抗体 グロブリン MoAb 150-59 MoAb 40-20 MoAb 13-3 IgG1 + ＋ − ＩｇＧ２ａ − − − ＩｇＧ２ｂ − − ＋ ＩｇＧ３ − − − ＩｇＭ − − − ＩｇＡ − − − 表中、＋は反応陽性を、−は反応陰性を示す。表４に示
す結果より、ＧＡＦ １５０−５９及びＧＡＦ ４０−２
０細胞が産生する抗体はいずれも免疫グロブリンクラス
ＩｇＧ1サブクラスに、そしてＧＡＦ １３−３細胞の産
生する抗体は免疫グロブリンクラスＩｇＧ２ｂサブクラ
スに属することが判明した。
【００４７】実施例５（モノクローナル抗体の精製） ハイブリドーマＧＡＦ １５０−５９，ＧＡＦ ４０−２
０及びＧＡＦ １３−３細胞について、それぞれ２×１
０6個の細胞を予めミネラルオイルを０．５ｍｌ腹腔内
に投与しておいたマウスに接種した。１０日後、一匹あ
たり２〜４ｍｌの腹水を採取した。得られた腹水からの
ＩｇＧの精製は以下の通りに行なった。すなわち、結合
緩衝液（ＰＢＳ）で平衡化したプロテインＧカラムに、
腹水と結合緩衝液を１：１で混合したものを供し、抗体
を添着し、結合緩衝液で洗った後、溶出緩衝液（０．１
Ｍグリシン−塩酸（ｐＨ２．７））で抗体を溶出した。
溶出液には１Ｍトリス（ｐＨ８．０）を加え中性化して
リン酸緩衝生理食塩水で透析し、目的の抗ＧＡＦ抗体
１５０−５９，抗ＧＡＦ抗体 ４０−２０及び抗ＧＡＦ
抗体 １３−３をそれぞれ得た。 参考例２（ＧＡＦ中和抗体産生細胞の検索） 線維芽マウスＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３ Ａ３１細胞を５％仔
牛血清を含むＤＭＥＭ培地でヌンク９６穴マイクロタイ
タープレート（平底）に１穴あたり２×１０3個を７５
μｌの培地にて播種して、培養し、翌日各ウェルより５
０μｌの培地を廃棄し、各ウェルに血清を含まないＤＭ
ＥＭ培地を１７５μｌ添加した。３〜４日培養したのち
各ウェルより２０μｌの培地を廃棄した。その後、−４
℃、３０分間放置した種々の濃度のハイブリドーマ培養
上清、１ｎｇ／ｍｌ ２５ＫＤａＧＡＦ ０．１％ウシ
血清アルブミンを含むＤＭＥＭ培地の２０μｌを各ウェ
ルに添加後、一晩培養した。翌朝、各ウェルに１μＣｉ
の 3Ｈチミジン（５Ｃｉ／ｍｍｏｌ，０．５ｍＣｉ／ｍ
ｌ ＲＣＣ Amersham）を添加後さらに５〜７時間培養し
た。培養後各ウェルを約１ｍｌのＰＢＳで洗浄し、１０
０μｌの５％ＳＤＳを添加し、３７℃で一晩放置した。
各ウェルの細胞抽出液をチューブに集め、細胞に取り込
まれた3Ｈチミジン量をシンチレーションカウンターに
て測定した。
【００４８】実施例６（ＧＡＦ中和作用の検討） 実施例５で精製した抗体１５０−５９を参考例１の方法
によりヒトＧＡＦ中和活性を検討した（図８）。すなわ
ち線維芽マウスＢＡＬＢ／ｃ ３Ｔ３ Ａ３１細胞のＧＡ
Ｆ Ｎ３３ １ｎｇ／ｍｌ存在下での１８時間の増殖で測
定した。ＭｏＡｂ １５０−５９を４０ｎｇ／ｍｌで添
加した場合、正常マウスＩｇＧを添加したものに比べて
3Ｈチミジンの取り込みを約１０分の１に抑えた。 参考例３ 西洋ワサビペルオキシダーゼ標識化抗体の調製 実施例６で得られた精製抗ＧＡＦ抗体を０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ６．５）に対して４℃で２０時間透析し、
０．６ｍｇのＳ−アセチルメルカプトこはく酸無水物を
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０μｌに溶
かして加え２５℃３０分反応後０．５Ｍヒドロキシルア
ミン，５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ
７．０）０．２ｍｌを加えて２５℃、５分間還元した。
反応液をセファデックスＧ−２５ファイン（ファルマシ
ア・ファインケミカル社製、スェーデン)（φ１×１０
０ｃｍ）で５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ６．０）を溶出液として分離し、ＩｇＧ画分を得
た。一方（ベーリンガーマンハイム社製、ドイツ）１０
ｍｇを１．５ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）に溶かし、Ｎ−（γ−マレイミドブチルオキシ）サ
クシイミド（ＧＭＢＳ）３．５ｍｇをＤＭＦ １００μ
ｌに溶かして加え、３０℃で６０分間撹拌後、セファデ
ックスＧ−２５ ファイン（φ１．０×１００ｃｍ）で
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を溶出液として分
離し、マレイミド基の導入されたＨＲＰを得た（マレイ
ミド化ＨＲＰ）。ＩｇＧとマレイミド化ＨＲＰをモル比
で１：１になるように混ぜ、４℃で２０時間反応した。
反応液をウルトロゲルＡｃＡ４４のカラムで０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を溶出液として分離し、酵素
標識抗体（ＭｏＡｂ −ＨＲＰ）を得た。
【００４９】参考例４（抗体感作プレートの調製） 実施例６で得られた抗ＧＡＦ抗体を０．１Ｍ炭酸緩衝液
（ｐＨ９．６）にて５μｇ／ｍｌとなるように希釈し、
ＥＩＡ用イムノプレート（マキシソープ：ヌンク社製、
デンマーク）の各ウエルに１００μｌずつ注入して４℃
で一夜放置して感作させた。０．１５Ｍ ＮａＣｌを含
む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて洗浄した
後、５０％ブロックエースを含む０．０１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）を各ウエルに注入して用時まで冷所保
存した。 参考例５ ヒトＧＡＦの測定 (1) 検量線の作成 (a) 試薬 酵素標識抗体 抗体感作マイクロプレート リコンビナントヒトＧＡＦ(ＧＡＦ）０〜１nｇ／m
ｌ 緩衝液A（0.15M NaClを含むpH7.0の0.02Mリン酸緩
衝液)緩衝液B（10％ブロックエース （乳蛋白質から調
製された遮断剤）（大日本製薬）、0.15M NaClを含むpH
7.0の0.02Mリン酸緩衝液) ペルオキシダーゼ基質溶液（0.02％過酸化水素と0.
15％ o-フェニレンジアミンを含むpH5.5のクエン酸ナト
リウム緩衝液)酵素反応停止溶液（2N-硫酸) (b) 測定 抗体感作プレートの各ウエルに、緩衝液Bに溶解させた
ＧＡＦ溶液100μｌを注入し、４℃で24時間反応させ
た。各ウエルを緩衝液Aで洗浄後、緩衝液Bで2000倍に希
釈した酵素標識抗体溶液100μｌを加えて25℃でさらに
２時間反応させた。各ウエルを緩衝液Aで洗浄し、ペル
オキシダーゼ基質溶液を100μｌ加え25℃で３０分反応
させ、酵素反応停止溶液１００μｌ加えて反応させた
後、マイクロプレート用自動比色計（マルチスキャン・
マルチソフト，ラボシステムズ社）を用い、４９２ｎｍ
における吸光度を測定した。
【００５０】実施例７ 実施例５で得られた精製抗ＧＡＦ抗体１５０−５９
（５．６ｍｇ／ｍｌ）を用い、参考例３記載の方法に従
ってＨＲＰ標識抗体を作成した。 実施例８ 実施例５で得られた精製抗ＧＡＦ抗体１３−３を用い、
参考例４記載の方法に従って抗体感作プレートを作成し
た。 実施例９ 実施例７で得られた酵素標識抗体および実施例８で作成
した抗体感作プレートを用いてＧＡＦを測定した結果を
図９に示す。 実施例１０（ポリクローナル抗体の作製） （１）免疫 リン酸緩衝生理食塩水に溶解させた１ｍｇの抗原ヒトＧ
ＡＦ（Ｎ３３）を加熱殺菌したミコバクテリアを含むオ
イルエマルジョン（フロインドの完全アジュバンド；Ｆ
ｃＡ）としてウサギ（ＫｂＳ：ＪＷ；♂１４週令）に皮
内注射した。さらに２週間後追加免疫としてリン酸緩衝
生理食塩水に溶解させた１ｍｇの抗原ヒトＧＡＦ（Ｎ３
３）をオイルエマルジョン（フロインドの完全アジュバ
ンド；ＦＩＡ）として皮内注射した。同様の操作を３回
繰り返し行なった。 （２）抗体価の測定 最終免疫２週間後に採血を行ない、血液を室温で１時間
放置し、さらに４℃で６時間放置後、遠心分離した血清
を各濃度に希釈し、予め、ＧＡＦ Ｎ３３を固定したポ
リスチレン製９６穴マイクロタイタープレートに１００
μｌずつ加え、室温で２時間インキュベートした。血清
を除去、洗浄後、２次抗体としてＨＲＰ標識抗ウサギＩ
ｇＧヤギ抗体（カッペル社）を加え室温で２時間インキ
ュベートした。２次抗体を除去し、十分にウエルを洗浄
した後、反応基質を加え、呈色反応を行なった（ＥＩＡ
法）。酵素反応停止溶液１００μｌを加えて反応させた
後、マイクロプレート用自動比色計（マルチスキャン・
マルチソフト；ラボシステム社）を用い４９２ｎｍにお
ける吸光度を測定した。血清濃度と吸光度との関係を示
す（図１０）。 （３）抗体の精製 上記（２）で得られた血清と結合緩衝液（ＰＢＳ）を
１：１で混合したものを結合緩衝液で平衡化したプロテ
インＧカラム（日本ガイシ社）に添着した。結合緩衝液
で洗った後、溶出緩衝液（０．１Ｍグリシン−塩酸（ｐ
Ｈ２．７）で溶出した。溶出後には１Ｍトリス（ｐＨ
８．０）を加え中性化してリン酸緩衝生理食塩水で透析
した。 実施例１１（ＧＡＦ中和作用の検討） 実施例１０（２）の方法で精製した抗ウサギＧＡＦＩｇ
Ｇを参考例２記載の方法によりＧＡＦ中和活性を検討し
た。すなわち、線維芽マウスＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３Ａ３１
細胞のＧＡＦ １ｎｇ／ｍｌ存在下での１８時間の増殖
で測定した（図１１）。ウサギポリクローナル抗体中１
抗体（Ｎｏ．４抗ＧＡＦ抗体）はＧＡＦ活性を中和し
た。
【００５１】試験例１ ＧＡＦの活性の比較 ラットグリア細胞株ＲＧ−１を用いたＧＡＦの細胞増殖
促進活性の測定は下記の方法によった。即ち、ＲＧ−１
細胞（グリア細胞株）を１０％牛胎児血清を含むＤＭＥ
Ｍ培地でヌンク９６穴マイクロタイタープレイト（平
底）に１ウェルあたり３×１０3個を１００μｌの培地
にて播種して培養し、２〜３日後、各ウェルより７５μ
ｌの培地を廃棄し、各ウェルに血清を含まないＤＭＥＭ
培地を１７５μｌ添加した。さらに２〜３日培養した
後、各ウェルより２０μｌの培地を廃棄し０．１％ウシ
血清アルブミンを含む培地で希釈したサンプルの２０μ
ｌを各ウェルに添加後、一晩培養した。翌日、各ウェル
に１μＣｉのトリチウムチミジン（５Ｃｉ／ｍｍｏｌ，
０．５ｍＣｉ／ｍｌ ＲＣＣ Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添
加後、更に５〜７時間培養した。培養後、各ウェルの培
地を廃棄した後、各ウェルに１００μｌの０．５％トリ
プシンと０．０１％ＥＤＴＡを含むＰＢＳを添加し、３
７℃で５分間放置した。顕微鏡でＲＧ−１細胞が浮遊し
ていることを確認した後、細胞をセルハーベスター（Fl
ow Laboratories社）を用いてガラスファイバー（大日
本製薬株式会社）上に集め水で洗浄後、細胞に取り込ま
れたトリチウムチミジンのカウントを液体シンチレーシ
ョンカウンターにて測定した。この方法により、ＥＰ０
５０３９７号公報の実施例８に従って参考例１で作製し
た公知のＮ末３アミノ酸欠損体（３０ｋＤａ ＧＡＦ）
および本発明のＧＡＦポリペプチドＮ３３およびＮ４９
のグリア細胞に対する増殖促進活性を比較して図１２に
示した。図１２に示す通り、Ｎ末端側鎖長の短い分子の
方が高い比活性を示し、Ｎ４９ではＮ３の約３倍の比活
性を示した。
【００５２】試験例２ ＧＡＦポリペプチドの安定性の
検討 （１）酸処理に対する安定性 サンプルを５０ｍＭ グリシン・塩酸（ｐＨ２．５），
０．１％ＣＨＡＰＳあるいは５０ｍＭ グリシン・塩酸
（ｐＨ２．５），０．１％ＣＨＡＰＳ，２０μｇ／ｍｌ
ヘパリンに終濃度２００ｎｇ／ｍｌになるように溶かし
室温でインキュベートし、経時的にその５０μｌを取り
４５０μｌの０．１％ ＢＳＡ−ＤＭＥＭ，０．１ ＨＥ
ＰＥＳ（ｐＨ７．２）で中和した後、生物活性を測定し
た。結果を図１３に示した。ｐＨ２．５処理によりＮ３
およびＮ３３のいずれの分子も活性を減じるが、Ｎ３３
の方が活性の減弱の割合がはるかに小さく、酸に対する
安定性に優れていることがわかった。また、ヘパリンの
共存により、いずれの分子も酸処理に対する安定性が向
上されることがわかった。 （２）熱処理に対する安定性 サンプルを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．
６），０．１％ＣＨＡＰＳあるいは１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
・ＨＣｌ（ｐＨ７．６），０．１％ＣＨＡＰＳ，２０μ
ｇ／ｍｌヘパリンに終濃度２００ｎｇ／ｍｌになるよう
に溶かし、５６℃あるいは４２℃でインキュベートし、
経時的にその５０μｌを取り４５０μｌの０．１％ Ｂ
ＳＡ−ＤＭＥＭと混合、０℃にした後、生物活性を測定
した。５６℃処理の結果を図１４に、４２℃処理の結果
を図１５にそれぞれ示した。５６℃の熱処理によりＮ３
およびＮ３３のいずれの分子も急速に失活した。４２℃
処理では失活速度は５６℃処理に比べてかなり遅くなり
Ｎ３に比べてＮ３３の方が安定であることがはっきり示
された。また、いずれの場合もヘパリンの共存は失活を
防いでいる。
【００５３】試験例３ ＧＡＦのＭＫ−ＣＳＦ活性 ＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、７週令）の大腿骨より骨髄
細胞を採取し、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む
ＩＭＤＭ培地（Ｆｌｏｗ社）にて２×１０5 個／ｍｌに
懸濁し、プラスチックシャーレ上で３７℃４５分間イン
キュベートした。非付着性細胞を集め、血清を除去する
ためにＩＭＤＭ培地で洗浄した。これら非付着性骨髄細
胞（１×１０5 個／ｍｌ）をＮｅｕｔｒｉｄｏｍａ−ｓ
ｐ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を含
むＩＭＤＭ培地に懸濁し、９６穴平底プレート（ヌンク
社）に２００μｌずつ播種した。このとき、種々の濃度
のサンプルを添加した。３７℃で７日間培養後、５％グ
ルタルアルデヒド（和光純薬）を５０μｌ添加し、２０
００ｒｐｍで５分間遠心して細胞を固定した。０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で簡単に洗浄し、アセチル
コリンエステラーゼ染色を行った。すなち、ヨウ化アセ
チルチオコリン（シグマ社）３０ｍｇを０．１Ｍリン酸
緩衝液４５ｍｌに溶解後、３０ｍＭ硫酸銅６ｍｌ、０．
１Ｍクエン酸ナトリウム３ｍｌ、５ｍＭフェリシアン化
カリウム６ｍｌを加えたものを用時調製し、各ウェルに
２００μｌずつ添加し、室温で６時間染色した。０．１
Ｍリン酸緩衝液で洗浄後、倒立顕微鏡で検鏡し、巨核球
系細胞の数を数えた。結果を図１６に示す。図１６に示
す様に、Ｎ３３およびＮ４９はマウス骨髄中の巨核球系
前駆細胞を容量依存的に増殖させた。その活性の強さ
は、Ｎ３＞Ｎ３３＞Ｎ４９であった。
【００５４】試験例４ ＧＡＦの投与による末梢血血小板の産生亢進 Ｎ３、Ｎ３３およびＮ４９を、ウシ血清アルブミン〔Ｂ
ＳＡ（アーマー社）〕１００μｇ／ｍｌを含有する生理
食塩水（大塚製薬）中に、５００μｇ／ｍｌの濃度とな
るように溶解した。この溶液の１００μｌを１日２回２
日間ＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、７週令；チャールズリ
バー）に皮下投与した。コントロールとして１００μｇ
／ｍｌ ＢＳＡを含有する生理食塩水を投与した。第１
回投与後４，７，９，１１，１４，１７日目に採血を行
い、末梢血中の血小板数を、多目的自動血球計数装置
（東亜医用電子（株））にて測定した。その結果、いず
れの分子の投与群でも末梢血中の血小板数が投与後７〜
１１日に明らかに増加していた（図１７）。その活性の
強さはＮ４９＞Ｎ３３≧Ｎ３であり、Ｎ末端側鎖長の短
いものほど強い傾向が認められた。
【００５５】試験例５ ＧＡＦＮ３３の投与による末梢血小板数の変化 Ｎ３３を、ウシ血清アルブミン〔ＢＳＡ（アーマー
社）〕１００μｇ／ｍｌを含有する生理食塩水（大塚製
薬）中に、２，１０および５００μｇ／ｍｌの濃度とな
るように溶解しサンプル溶液を調製した。これらの溶液
の１００μｌを１日２回それぞれＢＡＬＢ／ｃマウス
（メス、７週令）に１４日間皮下投与した。コントロー
ルとして１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡを含有する生理食塩
水を投与した。第１回投与後３，５，７，１０，１２，
１４，１７，２５日目に採血を行い、末梢血中の血小板
数を、多目的自動血球計数装置（東亜医用電子（株））
にて測定した。その結果を図１８に示す。いずれのサン
プルも投与後１０〜１２日に明らかな末梢血中の血小板
数の増加を示していた。また血小板数の増加は投与量に
依存して上昇した。
【００５６】試験例６ 正常マウスでのＧＡＦ Ｎ３３
の血小板増加作用 体重約 20 g の雌のCDF1マウスの静脈内もしくは皮下に
実施例１で作製したＧＡＦ Ｎ３３を１日１回連続５日
間投与し、投与終了後一定期間末梢血を採取し、血小板
数を測定した。ＧＡＦ Ｎ３３は正常マウス血清を１％
添加した生理食塩水(溶解液)に溶解し、投与量として
０.２ ml/２０gマウス体重（静脈内投与）もしくは０.
１ml/２０g（皮下投与）となるよう調製した。薬物の投
与量はマウス１匹あたりの薬物重量(μg)で表し、血小
板数の測定日はＧＡＦ Ｎ３３の投与終了後の日数とし
て表した。なお、血小板数の測定は、多項目自動血球計
数装置 E-2500(東亞医用電子KK、Sysmex) を用いて行っ
た。得られた結果を表５に示した。 表 ５ 投与量 投与 動物 血小板数 (×104/mm3) ルート 数 平均 ± (標準偏差) ( μg/マウス/ 日) (匹) 5 日 7 日 10 日 無投与対照 5 62.09 61.67 70.20 ( 7.17) (10.11) (11.55) 溶解液 0 静脈内 5 59.92 62.44 71.68 (10.76) (15.48) ( 9.22) GAF N33 40 静脈内 5 87.50 84.70 79.80 ( 7.17) ( 9.02) ( 3.70) 溶解液 0 皮下 5 73.92 57.20 73.50 ( 7.65) ( 8.90) ( 7.09) GAF N33 40 皮下 5 87.36 85.12 85.82 ( 9.80) ( 7.82) (15.51) 。
【００５７】試験例７ 担癌マウスでのＧＡＦ Ｎ３３
の血小板増加作用 体重約２０gの雌のＣ５７ＢＬ/６マウスの腹部皮内にＭ
５０７６細網細胞肉腫(５ｘ１０5個) を移植し、腫瘍移
植後５日目よりＧＡＦ Ｎ３３を同マウスの皮下に１日
１回連続１０日間投与し、投与終了後一定期間末梢血を
採取し、血小板数を測定した。ＧＡＦ Ｎ３３は正常マ
ウス血清を1%添加した生理食塩水(溶解液)に溶解し、投
与量として０.１ ml/２０gマウス体重となるよう調製し
た。薬物の投与量はマウス1 匹あたりの薬物重量( μg)
で表し、血小板数の測定日はＧＡＦ Ｎ３３の投与終了
後の日数として表した。なお、血小板数の測定は、多項
目自動血球計数装置 E-2500(東亞医用電子KK、Sysmex)
を用いて行った。得られた結果を表６に示した。 表 ６ 投与量 投与 動物 血小板数 (x 104/mm3) ルート 数 平均 ± (標準偏差) ( μg/マウス/ 日) (匹) 2 日 5 日 7 日 無投与対照 5 60.34 62.72 65.18 ( 6.85) (11.33) (14.81) 溶解液 0 皮下 5 63.98 65.24 79.88 ( 8.86) (18.56) (15.94) GAF N33 40 皮下 5 103.74 93.24 100.66 ( 6.01) (20.10) ( 7.67) 試験例８ 抗腫瘍剤カルボプラチン(CBDCA) を正常マ
ウスに投与し血小板を減少させたときのＧＡＦ Ｎ３３
の血小板増加作用 体重約２０gの雌のＣＤＦ１マウスの静脈内にＣＢＤＣ
Ａ(ブリストル・マイヤーズ スクイブ(株)製造販売)１０
０mg/kg を１回投与し、投与３日後よりＧＡＦＮ３３を
同マウスの皮下に１日２回連続７日間投与し、投与終了
後 一定期間末梢血を採取し、血小板数を測定した。Ｇ
ＡＦ Ｎ３３は正常マウス血清を１％添加した生理食塩
水(溶解液) に溶解し、投与量として０.１ml/２０gマウ
ス体重となるよう調製した。薬物の投与量はマウス1 匹
あたりの薬物重量( μg)で表し、血小板数の測定日はＧ
ＡＦ Ｎ３３の投与終了後の日数として表した。なお、
血小板数の測定は、多項目自動血球計数装置 E-2500(東
亞医用電子KK、Sysmex) を用いて行った。得られた結果
を表７に示した。 表 ７ 投与量 投与 動物 血小板数 (x 104/mm3) ルート 数 平均 ± (標準偏差) ( μg/マウス/ 日) (匹) 3 日 5 日 8 日 無投与対照 5 62.88 67.19 56.16 (11.74) ( 8.17) ( 7.80) CBDCA + 溶解液 皮下 5 32.00 35.33 47.84 ( 1.70) (14.51) (11.13) CBDCA + GAF N33 皮下 5 96.40 95.70 79.60 40 (16.91) ( 9.39) (12.48) 100 mg/kg (2 mg/20g マウス体重) 1 回 20 μg ずつ 2回に分けて投与した。
【００５８】試験例 ９ 抗腫瘍剤カルボプラチン(CBD
CA) を担癌マウスに投与し血小板を減少させたときのＧ
ＡＦ Ｎ３３の血小板増加作用 体重約２０gの雌のＣ５７ＢL/６ マウスの腹部皮内にＭ
５０７６細網細胞肉腫(５ｘ１０5個) を移植し、腫瘍移
植後６日目にＣＢＤＣＡ１００mg/kgを静脈内に投与
し、更に、７日目よりＧＡＦ Ｎ３３を同マウスの皮下
に１日１回連続７日間投与し、投与終了後一定期間末梢
血を採取し、血小板数を測定した。ＧＡＦＮ３３は正常
マウス血清を1%添加した生理食塩水(溶解液)に溶解し、
投与量として０.１ml/２０gマウス体重となるよう調製
した。薬物の投与量はマウス１匹あたりの薬物重量( μ
g)で表し、血小板数の測定日はＧＡＦ Ｎ３３の投与終
了後の日数として表した。なお、血小板数の測定は、多
項目自動血球計数装置 E-2500(東亞医用電子KK、Sysme
x) を用いて行った。得られた結果を表８に示した。 表 ８ 投与量 投与 動物 血小板数 (×104/mm3) ルート 数 平均 ± (標準偏差) ( μg/マウス/ 日) (匹) 1 日 3 日 5 日 無投与対照 5 72.10 70.98 47.88 ( 8.44) ( 7.76) (16.08) CBDCA + 溶解液 皮下 4 29.17 39.55 50.40 0 (11.16) (18.26) ( 7.34) CBDCA + GAF N33 皮下 5 40.25 59.15 72.98 20 (21.43) (16.61) ( 4.02) 100 mg/kg (2 mg/20g マウス体重)。
【００５９】実施例１２ モノクローナル抗体の作製
（２） 実施例３と同様にして抗ＧＡＦ抗体産生マウスハイブリ
ドーマＧＡＦ４−８２細胞を得た。ＧＡＦ４−８２細胞
の産生する抗体をマウス抗体サブクラス検出キット（バ
イオラッド社）により検討した結果、免疫グロブリンク
ラスＩｇＭサブクラスに属することが判明した。 実施例１３ モノクローナル抗体の精製（２） 実施例７に記載の方法により、ハイブリドーマＧＡＦ４
−８２より目的の抗ＧＡＦ抗体ＧＡＦ４−８２を得た。
【００６０】試験例１０ ＧＡＦ巨核球系細胞の増殖に
対する抗ＧＡＦ抗体の中和作用 ＢＡＬＢ／ｃマウス（雄、６−８週令、チャールズリバ
ー社）の大腿骨より骨髄細胞を採取し、１０％のＦＣＳ
を含むイスコフ改変ダルベッコ培地（Iscove'sModifica
tion of Dulbecco's medium）（ＩＭＤＭ，Ｆｌｏｗ
社）にて２×１０6個／ｍｌに懸濁し、プラスティック
シャーレ上で３７℃、４５分間インキュベートした。Ｉ
ＭＤＭ培地で洗浄して血清を除去した非付着性細胞（１
×１０5）を、Ｎｅｕｔｒｉｄｏｍａ−ＳＰ（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を含むＩＭＤＭ培
地に懸濁し１００ｎｇ／ｍｌのＧＡＦ Ｎ３と種々の濃
度に希釈した抗体と共に９６穴平底プレートに２００μ
ｌずつ播種した。３７℃で７日間培養後、５％グルタル
アルデヒド（和光純薬）を５０μｌ添加し２０００ｒｐ
ｍで５分間遠心して細胞を固定した後、０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄し、アセチルコリンエステ
ラーゼ染色を行い、陽性細胞数を数えた。ＭｏＡｂ １
５０−５９はＧＡＦ Ｎ３による巨核球系細胞に対する
増殖を中和しなかった。これに対して、ＭｏＡｂ ４−
８２はＧＡＦ Ｎ３の巨核球系細胞の増殖を濃度依存的
に抑制し、２０μｇ／ｍｌで完全に中和した（図１
９）。ＭｏＡｂ ４−８２はＧＡＦ Ｎ３の巨核球系細
胞の増殖に対して中和活性があることがわかった。Ｍｏ
Ａｂ ４０−２０はＧＡＦ Ｎ３の活性には影響をおよ
ぼさなかった。
【００６１】試験例１１ 抗ＧＡＦモノクローナル抗体のＧＡＦ Ｎ３３の末梢血
小板数増加作用に対する中和作用 ＢＡＬＢ／ｃマウス（雄、７週令、１群６匹）に１００
μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，Ａｒｍｅｒ
社）を含有する生理食塩水（大塚製薬）で希釈した。Ｇ
ＡＦ Ｎ３３（５０μｇ）と２０倍過剰量（１ｍｇ）の
ＭｏＡｂ １５０−５９、ＭｏＡｂ ４−８２或いはＭ
ｏＡｂ ４０−２０を混合したものを１日２回２日間皮
下投与した。またポジティヴコントロールとしてはＧＡ
Ｆ Ｎ３３（５０μｇ）のみを投与した。ネガティブコ
ントロールとして１００μｇ／ｍｌＢＳＡを含有する生
理食塩水を投与した。投与後、経時的に眼底静脈により
採血し多目的自動血球計数装置（東亜医用電子（株））
にて血液検査を行った。Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓの多重比較
検定を行った。ＧＡＦ Ｎ３３の投与によって末梢血中
の血小板数は増加し、１０日目にピークを示した。Ｍｏ
Ａｂ １５０−５９投与群はＧＡＦ Ｎ３３の２０倍過
剰量でＧＡＦ Ｎ３３の血小板産生促進活性を完全に中
和し、生理食塩水を投与したネガティブコントロール群
と同じレベルの血小板数を示した（ＧＡＦ Ｎ３３投与
群に対して Ｐ＜０．０１で有意）。ＭｏＡｂ ４−８
２はＧＡＦ Ｎ３３の活性を一部中和した（ＧＡＦ Ｎ
３３投与群に対して Ｐ＜０．０５で有意）。ＭｏＡｂ
４０−２０はＧＡＦ Ｎ３３の血小板産生促進活性に
は影響を与えなかった（図２０）。
【００６２】試験例１２ 幼若ラット肝細胞に対するＧＡＦ Ｎ３３の増殖促進活
性 ＳＤラット（日本クレア、♀、生後６日）の肝臓を、ｉ
ｎ ｓｉｔｕ かん流法（実験医学 第６巻 第１１０
５頁（１９８８））によってコラゲナーゼ消化し、肝実
質細胞を分離した。細胞をＷＥ培地（Ｆｌｏｗ社）で洗
浄後、１０~9Ｍインシュリン（シグマ社）、１０~9Ｍデ
キサメタゾン（シグマ社）及び５％ウシ胎児血清（ＦＣ
Ｓ，Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ Ｍ．Ａ．Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃ
ｔｓ）を含むＷＥ培地に２．５×１０5個／ｍｌになる
様に懸濁し予め０．３３％コラーゲン溶液（高研のセル
ゲン１−ＡＣを０．０２Ｎ酢酸で希釈）でコーティング
した９６ウェルマイクロプレート（ヌンク社）に２．５
×１０4個／ウェル播種し、３７℃で６時間培養した。
新しい培地に交換し、３７℃で１晩培養後、種々の濃度
のリコンビナントヒト上皮細胞成長因子（ｒｈＥＧＦ）
（湧永製薬（株））あるいはＧＡＦ Ｎ３３を添加し、
更に２日間培養した。５ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴ−ＰＢＳ溶
液を２０μ／ウェル添加し３７℃ ４時間培養後、１０
％ＳＤＳ、０．０１Ｎ ＨＣｌ溶液を１００μｌ添加
し、更に３７℃で１晩インキュベートし、５９０ｎｍの
吸収をＴｉｔｅｒｔｅｋマルチスキャン（Ｆｌｏｗ社）
で測定した。図２１に示すように、ＧＡＦ Ｎ３３には
ｒｈＥＧＦより弱いがラット幼若肝実質細胞を増殖させ
る活性があった。
【００６３】試験例１３ ＧＡＦ Ｎ３３のマウス肝重量増加作用 ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア、７週齢、♀、ｎ＝
６）に１００μｇ／ｍｌＢＳＡ（シグマ社）を含む生理
食塩水（大塚製薬）でそれぞれ２０μｇ／ｍｌ、ＧＡＦ
Ｎ３３ １００μｌを１日２回１０日間下記の群構成
で皮下投与し、対照群には１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡを
含む生理食塩水を投与した。最終投与翌日にマウスを解
剖し、肝臓の重量を測定した。群間の有意差検定にはＤ
ｕｎｎｅｔｔ’ｓの多重比較検定を実施した。 群構成 １．Ｃｏｎｔｒｏｌ ２．ＧＡＦ Ｎ３３（４μｇ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙ） ３．ＧＡＦ Ｎ３３（２０μｇ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙ） ４．ＧＡＦ Ｎ３３（１００μｇ／ｍｏｕｓｅ／ｄａ
ｙ） 結果を表９に示す。表９から明らかなようにＧＡＦ Ｎ
３３の投与量に依存して、有意に肝重量が増加すること
が判明した。ＧＡＦ Ｎ３３投与により重量増加した肝
臓切片の剖検では、無投与群切片と有意な差は認められ
ず、肝実質細胞と間質細胞の増加が肝重量の増加の原因
と考えられた。 表 ９ ＧＡＦ Ｎ３３のマウス肝重量増加作用 群 n 肝臓 (g) Control 6 1.00± 0.07 GAF( 4μg) 6 1.17± 0.08＊ GAF( 20μg) 6 1.18± 0.13＊＊ GAF(100μg) 6 1.32± 0.07＊＊ Ｍｅａｎ±ＳＤ．：＊，＊＊：対照群から有意の差あり
（Dunnett's test，＊：Ｐ＜０．０５，＊：Ｐ＜０．０
１)。
【００６４】試験例１４ ＧＡＦ Ｎ３，Ｎ３３，Ｎ４９の肝重量増加作用 ＢＡＬＢ／ｃマウス（チャールズリバー，７週令，♀，
ｎ＝６）に１００μｇ／ｍｌのＢＳＡを含む生理食塩水
で５００μｇ／ｍｌに希釈したＧＡＦ Ｎ３、Ｎ３３及
びＮ４９ １００μｌを１日２回６日間連投した。コン
トロール群には１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡを含む生理食
塩水を投与した。投与後１０日目にマウスを解剖し、肝
臓重量を測定した。群間の有意差検定にはＤｕｎｎｅｔ
ｔ’ｓの多重比較検定を実施した。その結果、いずれの
ＧＡＦポリペプチドとも肝重量が有意に増加することが
分かった（ｐ＜０．０１）。また、鎖長の長いポリペプ
チド分子種ほど肝重量の増加が大きい傾向が認められた
（図２２）。
【００６５】実施例１４ ＧＡＦ ｃＤＮＡによるマウスＢＡＬＢ／ｃ ３Ｔ３
細胞の形質転換と形質転換体の取得 （Ａ）プラスミドの構築 プラスミドｐＧＡＦ１（Miyamoto M. ら Mol. Cell. Bi
ol. 13 4251 (1993))を制限酵素 BamHI で切断し、1.5
5kbの全cDNA部分を単離した。一方、動物細胞ベクター
ｐＴＢ３９９（Sasada R. ら Cell Struct. Funct. 12
205（1987))を制限酵素 BamHI で切断し、IL-2 cDNA 領
域を除去した後、前記のＧＡＦ ｃＤＮＡ １．５５ｋ
ｂ 断片を挿入して、Ａｂｅｌｓｏｎ マウス白血球ウ
ィルス（ＭｕＬＶ）−ＬＴＲ プロモーターの支配下に
動物細胞でヒトＧＡＦを発現させうる発現用プラスミド
ｐＲＧＢ１２を構築した（図２３）。 （Ｂ）形質転換体の取得 マウス ＢＡＬＢ／ｃ ３Ｔ３ クローン Ａ３１−１
−１ 細胞（Ａ３１細胞、Ｋａｋｕｎａｇａ Ｔ．ら
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９ ５０５（１９８０））は１０
％ウシ血清（ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ；ＣＳ，Ｆｌｏｗ
社）を含む ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅ
ｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅ
ｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ、Ｆｌｏｗ社）で培養した。Ａ３
１細胞（１×１０5個）を６０ｍｍ組織培養用ディッシ
ュ（Ｆａｌｃｏｎ社）に播種し、翌日にリン酸カルシウ
ム共沈法（Ｗｉｇｌｅｒ Ｍ．ｅｔ．ａｌ． Ｃｅｌｌ
１６ ７７７（１９７９））にて発現用ベクターｐＲ
ＧＢ１２、１０μｇをトランスフェクトした。トランス
フェクトした細胞は５％仔牛血清（ＣＳ）（Ｆｌｏｗ
社）を含むＤＭＥＭ培地で４週間培養し、フォーカスフ
ォーミング法にて形質転換体を選出し、限界希釈法にて
ＡＴＧ１、ＡＴＧ２、ＡＴＧ３、ＡＴＧ４およびＡＴＧ
５の５つのクローンをクローニングした。これらの細胞
は親株Ａ３１に比べて著しい形態変化を示した。すなわ
ち、Ａ３１細胞は偏平で、増殖して一層の規則的な敷石
状になり、顕著な接触阻止を示す。一方、得られたクロ
ーンは、立体的な紡錘型となり、互いに重層して増殖
し、悪性化細胞様の形態を示した。このようなトランス
フォーム細胞様の形態変化は、Ａ３１細胞にＧＡＦを添
加した場合にも認められた（Ｎａｒｕｏ Ｋ．ら Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８２８５７（１９９３））。 （Ｃ）形質転換体の性質 各形質転換体及び親株Ａ３１細胞（２．５×１０4個）
を３５ｍｍ組織培養用フラスコに播種し、２ｍｌの５％
ＣＳ ＤＭＥＭ培地で２〜３日毎に培地を交換しながら
培養し、コールターカウンターで細胞数を数え、飽和密
度と増殖スピードを算出した。その結果を図２４と表１
０に示した。これらの形質転換体は親株のＡ３１細胞に
比べて増殖速度が速かった。また、Ａ３１細胞が４〜５
日できれいな一層の細胞となって増殖を止めるのに対し
て、これらの形質転換体は互いに重層しつつ７〜９日間
増殖を続け飽和密度はＡ３１細胞の５〜８倍に達した。 （Ｄ）形質転換体のＧＡＦ生産性 各形質転換体あるいは、親株のＡ３１細胞（１×１０5
個）を３５ｍｍの組織培養用ディッシュに播種し、２ｍ
ｌの５％ＣＳ ＤＭＥＭ培地で３日間培養し培養上清と
細胞抽出液を集めＧＡＦ活性を測定した。細胞抽出液
は、シャーレから細胞をセルスクレーパーでかきとりＰ
ＢＳで洗浄後、１ｍｌのＰＢＳに懸濁し氷冷下で超音波
処理（９０秒）を行い、１５０００ｒｐｍで２０分間遠
心した上清を用いた。表１０に示したように各形質転換
体の培養上清中にはＧＡＦ活性が検出された。これに対
して、細胞抽出液中にはＧＡＦ活性はほとんど検出でき
なかった。形質転換体の増殖速度とＧＡＦ産生量との間
に相関が認められた。 表 １０ 形質転換体の性質 細胞 形態変化 GAFポリペプチド(ng/ディッシュ) 飽和密度 倍加時間 培地 細胞抽出液 (105個/cm2) （時間) Ａ３１ − 0.03 0.03 0.32 24.0 ＡＴＧ１ ＋ 1.8 0.03 1.5 21.5 ＡＴＧ２ ＋ 7.8 0.06 2.2 20.5 ＡＴＧ３ ＋ 60 0.6 2.5 15.5 ＡＴＧ４ ＋ 19 0.5 1.8 19.0 ＡＴＧ５ ＋ 78 0.35 1.4 17.0 。
【００６６】実施例１５ 抗体による形質転換体のトランスフォーム形質の復帰 形質転換体はＧＡＦを細胞外に分泌しており、ＧＡＦの
オートクライン作用によってトランスフォーム形質を発
現していることが考えられた。従って、ＧＡＦ活性を中
和する抗体を添加することでこれらの形質が抑えられる
かどうかについて検討した。形質転換体をＭｏＡｂ １
５０−５９存在下で培養すると細胞の形態は親株Ａ３１
様に戻り、増殖速度は落ち、飽和密度も小さくなった
（図２５）。正常マウスＩｇＧ存在下では形質転換体は
何の変化も示さなかった。形質転換体培養上清中のＧＡ
Ｆ活性は、ＭｏＡｂ １５０−５９を添加した場合に
は、全く検出されなかった。これらのことから、ＭｏＡ
ｂ １５０−５９はＧＡＦの異常産生により生じた、オ
ートクライン機構によって癌化した細胞に対して抗腫瘍
活性を示すことが認められた。
【００６７】実施例１６ 形質転換体の足場非依存性増殖と抗体の効果 足場非依存性増殖の獲得は、細胞の癌化と最も関連性の
あるｉｎ ｖｉｔｒｏでの性質であると考えられてい
る。そこで、得られた形質転換体について軟寒天培地中
での増殖を検討した。０．５％ Ｂａｃｔｏ−Ａｇａｒ
（Ｄｉｆｃｏ社）、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地を
３５ｍｍ組織培養用ディッシュに２ｍｌずつ分注してお
く。細胞はトリプシンで剥がして、０．３％ Ｂａｃｔ
ｏ−Ａｇａｒ、１０％ＦＣＳを含む培地に１×１０4個
／ｍｌとなるように懸濁し、１ｍｌずつ先の培地の上に
重層した。抗体の作用を調べる実験では、１０μｇ／ｍ
ｌのウサギ抗ＧＡＦ抗体あるいはＭｏＡｂ １５０−５
９を細胞懸濁液に添加した。３７℃で２週間培養した
後、生細胞からなるコロニーをヨードニトロテトラゾリ
ウムで染色しカウントした。（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ
Ａ．ｅｔ．ａｌ． Ｃｅｌｌ ４６ ３０１ （１９８
６））。その結果を表１１に示した。親株Ａ３１細胞が
ほとんどコロニーを形成できなかったのにたいして、形
質転換体は多くのコロニーを形成した。ＧＡＦ産生量の
多いＡＴＧ３細胞及びＡＴＧ５細胞は大きなコロニーを
形成する傾向が認められたが、ＧＡＦ産生量とコロニー
形成頻度との間には相関は認められなかった。ウサギ抗
ＧＡＦ中和抗体によって形質転換体のコロニー形成が抑
制されたことから、形質転換体が産生するＧＡＦによっ
て足場非依存性の増殖が起こっていると考えられた。な
お、正常動物のＩｇＧは形質転換体のコロニー形成には
影響を及ぼさなかった（データ不載）。ところが、Ｍｏ
Ａｂ １５０−５９はＡＴＧ１細胞のコロニー形成は阻
害したが、他の形質転換体のコロニー形成は阻害できな
かった。
【００６８】 表１１ 形質転換体の足場非依存性増殖と抗ＧＡＦ抗体の作用 実験１ 細胞 コロニー数 ウサギ抗ＧＡＦ抗体 共存下のコロニー数 Ａ３１ １２ ２ ＡＴＧ１ ６５２ １００ ＡＴＧ２ １１８１ １６６ ＡＴＧ３ ５２６ １０６ ＡＴＧ４ ８００ ２１１ ＡＴＧ５ ５６７ １２４ 実験２ 細胞 コロニー数 ＭｏＡｂ１５０・５９ 共存下のコロニー数 Ａ３１ ５ ８ ＡＴＧ１ ８０３ ２７７ ＡＴＧ２ １１８２ １３８５ ＡＴＧ３ １３１２ １３８６ ＡＴＧ４ ６８１ ５４１ ＡＴＧ５ １５１９ １５９２ コロニー形成は予備免疫前動物から調製したＩｇＧフラ
クションの添加によっては影響を受けなかった。上記抗
ＧＡＦ抗体の存在下で形成したコロニーは、該抗ＧＡＦ
抗体の非存在下で形成したコロニーよりも小さかった。
【００６９】実施例１７ 形質転換体のヌードマウスでの造腫瘍能と抗体による抑
止 （Ａ）形質転換体の造腫瘍能 トランスフォーマントのｉｎ ｖｉｖｏでの造腫瘍活性
を調べるために、ヌードマウスにＡＴＧ３、或いはＡＴ
Ｇ５細胞を接種し、生着して腫瘍を形成するかどうか検
討した。ヌードマウス（チャールズリバー、メス、７週
令）（１群５匹）に、ｉｎ ｖ ｉｔｒｏで培養したＡＴ
Ｇ３、ＡＴＧ５あるいはＡ３１細胞、３×１０6個をそ
れぞれ皮下に接種し、１４日後の形成された腫瘍の大き
さを測定した。腫瘍の体積は（腫瘍の幅）2×（腫瘍の
長さ）／２で算出した。表１２に示したようにＡＴＧ３
細胞とＡＴＧ５細胞は共にヌードマウスに生着し、癌を
形成した。なお親株のＡ３１細胞は癌を形成しなかっ
た。 表１２ トランスフォーマントＡＴＧ３，ＡＴＧ５細胞のヌードマウスでの造腫瘍性 細胞 個体数 腫瘍サイズ ｍｅａｎ±ＳＤ（ｍｍ3） Ａ３１ ５ ０ ＡＴＧ３ ６ ４２８０±１２１２ ＡＴＧ５ ６ ２２０３±１３３２ ｎｏｎｅ ５ （−） （Ｂ）抗体の抗腫瘍作用 ヌードマウス（チャールズリバー、♀、７週令）（１群
５匹）に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養したＡＴＧ５細胞
１．５×１０6個を皮下に接種し、３日後より５日間に
わたって２００μｇ／マウス／日のＭｏＡｂ１５０−５
９，ＭｏＡｂ４０−２０或いは正常マウスＩｇＧを静脈
内投与し、腫瘍の体積を経時的に測定した。ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏでＧＡＦに対する中和活性を示すＭｏＡｂ １５
０−５９投与によって腫瘍形成は著しく阻害され、中和
抗体に抗腫瘍活性のあることが示された（図２６）。こ
れに対して、ＧＡＦを認識するが中和活性のないＭｏＡ
ｂ４０−５６、あるいは正常マウスのＩｇＧは腫瘍形成
には影響を与えなかった。さらに、トランスフォーマン
トが生着し、腫瘍が形成されてから抗体を投与して、腫
瘍が退縮するかどうか検討した。ヌードマウス（チャー
ルズリバー、♀、７週令）（ｎ＝５）にＡＴＧ５細胞
１．５×１０6個を皮下に接種した。細胞が生着し、腫
瘍サイズが１０００ｍｍ3になった１１日後から５日間
にわたって２００μｇ／マウス／日の正常マウスＩｇ
Ｇ、ＭｏＡｂ４０−２０、或いはＭｏＡｂ １５０−５
９を静脈内投与した。経時的に腫瘍の大きさを測定し
た。腫瘍の体積は（腫瘍の幅）2×（腫瘍の長さ）／２
で算出した。この治療実験の結果を図２７に示した。Ｍ
ｏＡｂ １５０−５９の投与によって形成されていた腫
瘍は退縮し、治癒した。抗体投与終了後、２０日目まで
の観察において腫瘍の再形成は観察されなかった。
【００７０】実施例１８ ヒト腫瘍に対するＭｏＡｂ
１５０−５９の抗腫瘍作用 ヒト腫瘍由来の種々の細胞株のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養上
清について実施例１０に記載の方法に従ってＧＡＦ産生
の有無を検討した。結果を表１３に示した。調べた範囲
内では、最初にＧＡＦを抽出精製したグリオーマ細胞Ｎ
ＭＣ−Ｇ１と胃癌細胞ＡＺ−５２１がＧＡＦを培地中に
産生放出していた。これらＧＡＦ産生、ヒト腫瘍がＧＡ
Ｆを介したオートクライン機構によって腫瘍化している
かどうか、またＧＡＦ中和抗体が、その腫瘍形質を抑え
られるかどうかについて検討した。 表１３ 各種細胞培養上清中におけるＧＡＦの測定 腫瘍／組織／部位 名称 ＧＡＦ（Pg/m1) 癌（腫）、カルチノーマ 首 Ｈｅｌａ−Ｓ３ − 結腸 ＷｉＤＲ − 肺 ＣＡＤＯ−ＬＣ３ − Ｃａｌｕ−１ − Ａ５４９ − 胃 ＡＺ−５２１ ７４０ ＮＵＧＣ−３ − ＮＵＧＣ−４ − 白血病とリンパ腫 胸（ろく）膜の滲出 Ｕ９３７ − 骨髄 ＩＭ−９ − ＭＥＧ−０１ − 血液 Ｊ−１１１ − バーキットリンパ腫 Ｎａｍａｌｗａ − Ｒａｊｉ − 肉腫、サルコーマ Ｒｅｔ−２ − ＨＯＳ − ＭＧ−６３ − 黒色腫 Ｇ−３６１ − グリア芽細胞腫 ＮＭＣ−Ｇ１ ４６０ Ｔ９８Ｇ − リンパ芽球 ＲＰＭＩ−１７７８ − ＮＣ−３７ −上皮様，羊膜 ＷＩＳＨ − ＭｏＡｂ １３−３及びＨＲＰ−ＭｏＡｂ１５０−５９
を用いたＥＩＡ法により、各種細胞培養上清中のＧＡＦ
を測定した結果を示す。 −：検出限界（３０ｐｇ／ｍｌ）以下 ＡＺ−５２１細胞（２×１０4個）を２４ウェル リン
ブロプレートに播種し、２０μｇ／ｍｌのヘパリン存在
下或いは非存在下で種々の濃度のＭｏＡｂ １５０−５
９或いはＭｏＡｂ ４０−２０を含む５％ＦＣＳ ＤＭ
ＥＭ培地中で７日間培養した。７日後に細胞数を数え、
増殖に及ぼす抗体の効果を検討した。その結果、図２８
に示したようにヘパリン共存下ではＭｏＡｂ １５０−
５９は濃度依存的にＡＺ−５２１細胞の増殖を抑制し
た。ヘパリン非存在下では抑制作用は認めれなかった。
また、ＭｏＡｂ ４０−２０は、ヘパリンの存在に関係
なくＡＺ−５２１細胞の増殖には影響を及ぼさなかっ
た。さらにｉｎ ｖｉｖｏでのＡＺ−５２１の造腫瘍性
に対して抗ＧＡＦ抗体が抗腫瘍作用を示すかどうか検討
した。ヌードマウス（チャールズリバー、♀ ７週令
ｎ＝６）にｉｎ ｖｉｔｒｏで培養したＡＺ−５２１細
胞 ３×１０6個を皮下に接種し、１１日後と１８日後
からそれぞれ５日間ずつ２００μｇ／マウス／日のＭｏ
Ａｂ １５０−５９，ＭｏＡｂ ４０−２０或いは正常
マウスＩｇＧをｉ．ｖ．投与し、腫瘍の体積を経時的に
測定した。結果を図２９に示した。ＭｏＡｂ １５０−
５９投与によって腫瘍の増殖速度は約１／２に抑えられ
た。従って、抗体ＧＡＦ中和抗体はＧＡＦ産生性のヒト
腫瘍に対して抗腫瘍作用を示すことが分かった。
【００７１】製剤例１ 注射用製剤: GAF N33 30 mg 乳糖 170 mg HPC-L(オキシプロピルセルロース) 10 mg 計 210 mg 上記各成分を混合したのち注射用水もしくは生理食塩水
に溶解し、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)を０.５％に成
るよう添加してメンブランフィルター(孔径０.０２μm)
をもちいて濾過した。得られた濾液を無菌的に１ml ず
つバイアル瓶に分注して凍結乾燥し、注射用血小板増加
剤を調製した。本注射用製剤は、用時注射用水に5 mlに
溶解する。
【００７２】製剤例２ 注射用製剤: GAF N33 30 mg 乳糖 170 mg ラウリル硫酸ナトリウム 1000 mg 計 1200 mg 上記各成分を混合したのち注射用水もしくは生理食塩水
に溶解し、ＨＳＡを０.５％に成るよう添加してメンブ
ランフィルター(孔径０.０２μm)をもちいて濾過した。
得られた濾液を無菌的に１mlずつバイアル瓶に分注して
凍結乾燥し、注射用血小板増加剤を調製した。本注射用
製剤は、用時注射用水５mlに溶解する。
【００７３】
【配列表】
配列番号(SEQ ID NO)： 1 配列の長さ(SEQUENCE LENGTH)： 142 配列の型(SEQUENCE TYPE)：アミノ酸（amino acid） トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE)：タンパク質（protein） ハイポセティカル配列(HIPOTHTICAL)：Ｎｏ 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：ヒト ハプロタイプ(HAPLO TYPE)：2n 組織の種類(TISSUE TYPE)：包皮 細胞の種類(CELL TYPE)：繊維芽細胞 直接起源(IMMIDIATE SOURCE)： ライブラリー名(LIBRARY)：ヒト包皮ｃＤＮＡライブラ
リー クローン名(CLONE)：pGAF1 配列: Leu Asp His Leu Lys Gly Ile Leu Arg Arg Arg Gln Leu Tyr Cys Arg 5 10 15 Thr Gly Phe His Leu Glu Ile Phe Pro Asn Gly Thr Ile Gln Gly Thr 20 25 30 Arg Lys Asp His Ser Arg Phe Gly Ile Leu Glu Phe Ile Ser Ile Ala 35 40 45 Val Gly Leu Val Ser Ile Arg Gly Val Asp Ser Gly Leu Tyr Leu Gly 50 55 60 Met Asn Glu Lys Gly Glu Leu Tyr Gly Ser Glu Lys Leu Thr Gln Glu 65 70 75 80 Cys Val Phe Arg Glu Gln Phe Glu Glu Asn Trp Tyr Asn Thr Tyr Ser 85 90 95 Ser Asn Leu Tyr Lys His Val Asp Thr Gly Arg Arg Tyr Tyr Val Ala 100 105 110 Leu Asn Lys Asp Gly Thr Pro Arg Glu Gly Thr Arg Thr Lys Arg His 115 120 125 Gln Lys Phe Thr His Phe Leu Pro Arg Pro Val Asp Pro Asp 130 135 140。
【００７４】配列番号(SEQ ID NO)： 2 配列の長さ(SEQUENCE LENGTH)： 207 配列の型(SEQUENCE TYPE)：アミノ酸（amino acid） トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE)：タンパク質（protein） ハイポセティカル配列(HIPOTHTICAL)：Ｎｏ 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：ヒト ハプロタイプ(HAPLO TYPE)：2n 組織の種類(TISSUE TYPE)：包皮 細胞の種類(CELL TYPE)：繊維芽細胞 直接起源(IMMIDIATE SOURCE)： ライブラリー名(LIBRARY)：ヒト包皮ｃＤＮＡライブラ
リー クローン名(CLONE)：pGAF1 配列: Ala Pro Leu Gly Glu Val Gly Asn Tyr Phe Gly Val Gln Asp Ala Val 1 5 10 15 Pro Phe Gly Asn Val Pro Val Leu Pro Val Asp Ser Pro Val Leu Leu 20 25 30 Ser Asp His Leu Gly Gln Ser Glu Ala Gly Gly Leu Pro Arg Gly Pro 35 40 45 Ala Val Thr Asp Leu Asp His Leu Lys Gly Ile Leu Arg Arg Arg Gln 50 55 60 Leu Tyr Cys Arg Thr Gly Phe His Leu Glu Ile Phe Pro Asn Gly Thr 65 70 75 80 Ile Gln Gly Thr Arg Lys Asp His Ser Arg Phe Gly Ile Leu Glu Phe 85 90 95 Ile Ser Ile Ala Val Gly Leu Val Ser Ile Arg Gly Val Asp Ser Gly 100 105 110 Leu Tyr Leu Gly Met Asn Glu Lys Gly Glu Leu Tyr Gly Ser Glu Lys 115 120 125 Leu Thr Gln Glu Cys Val Phe Arg Glu Gln Phe Glu Glu Asn Trp Tyr 130 135 140 Asn Thr Tyr Ser Ser Asn Leu Tyr Lys His Val Asp Thr Gly Arg Arg 145 150 155 160 Tyr Tyr Val Ala Leu Asn Lys Asp Gly Thr Pro Arg Glu Gly Thr Arg 165 170 175 Thr Lys Arg His Gln Lys Phe Thr His Phe Leu Pro Arg Pro Val Asp 180 185 190 Pro Asp Lys Val Pro Glu Leu Tyr Lys Asp Ile Leu Ser Gln Ser 195 200 205。
【００７５】配列番号(SEQ ID NO)： 3 配列の長さ(SEQUENCE LENGTH)： 208 配列の型(SEQUENCE TYPE)：アミノ酸（amino acid） トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE)：タンパク質（protein） ハイポセティカル配列(HIPOTHTICAL)：Ｎｏ 起源（ＯＲＩＧＩＮＡＬ ＳＯＵＲＣＥ） 生物名（ＯＲＧＡＮＩＳＭ）：ヒト ハプロタイプ(HAPLO TYPE)：2n 組織の種類(TISSUE TYPE)：包皮 細胞の種類(CELL TYPE)：繊維芽細胞 直接起源(IMMIDIATE SOURCE)： ライブラリー名(LIBRARY)：ヒト包皮ｃＤＮＡライブラ
リー クローン名(CLONE)：pGAF1 配列: Met Ala Pro Leu Gly Glu Val Gly Asn Tyr Phe Gly Val Gln Asp Ala 1 5 10 15 Val Pro Phe Gly Asn Val Pro Val Leu Pro Val Asp Ser Pro Val Leu 20 25 30 Leu Ser Asp His Leu Gly Gln Ser Glu Ala Gly Gly Leu Pro Arg Gly 35 40 45 Pro Ala Val Thr Asp Leu Asp His Leu Lys Gly Ile Leu Arg Arg Arg 50 55 60 Gln Leu Tyr Cys Arg Thr Gly Phe His Leu Glu Ile Phe Pro Asn Gly 65 70 75 80 Thr Ile Gln Gly Thr Arg Lys Asp His Ser Arg Phe Gly Ile Leu Glu 85 90 95 Phe Ile Ser Ile Ala Val Gly Leu Val Ser Ile Arg Gly Val Asp Ser 100 105 110 Gly Leu Tyr Leu Gly Met Asn Glu Lys Gly Glu Leu Tyr Gly Ser Glu 115 120 125 Lys Leu Thr Gln Glu Cys Val Phe Arg Glu Gln Phe Glu Glu Asn Trp 130 135 140 Tyr Asn Thr Tyr Ser Ser Asn Leu Tyr Lys His Val Asp Thr Gly Arg 145 150 155 160 Arg Tyr Tyr Val Ala Leu Asn Lys Asp Gly Thr Pro Arg Glu Gly Thr 165 170 175 Arg Thr Lys Arg His Gln Lys Phe Thr His Phe Leu Pro Arg Pro Val 180 185 190 Asp Pro Asp Lys Val Pro Glu Leu Tyr Lys Asp Ile Leu Ser Gln Ser 195 200 205。
【００７６】配列番号(SEQ ID NO)： 4 配列の長さ(SEQUENCE LENGTH)： 205 配列の型(SEQUENCE TYPE)：アミノ酸（amino acid） トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE)：タンパク質（protein） ハイポセティカル配列(HIPOTHTICAL)：Ｎｏ 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：ヒト ハプロタイプ(HAPLO TYPE)：2n 組織の種類(TISSUE TYPE)：包皮 細胞の種類(CELL TYPE)：繊維芽細胞 直接起源(IMMIDIATE SOURCE)： ライブラリー名(LIBRARY)：ヒト包皮ｃＤＮＡライブラ
リー クローン名(CLONE)：pGAF1 配列: Leu Gly Glu Val Gly Asn Tyr Phe Gly Val Gln Asp Ala Val Pro Phe 5 10 15 Gly Asn Val Pro Val Leu Pro Val Asp Ser Pro Val Leu Leu Ser Asp 20 25 30 His Leu Gly Gln Ser Glu Ala Gly Gly Leu Pro Arg Gly Pro Ala Val 35 40 45 Thr Asp Leu Asp His Leu Lys Gly Ile Leu Arg Arg Arg Gln Leu Tyr 50 55 60 Cys Arg Thr Gly Phe His Leu Glu Ile Phe Pro Asn Gly Thr Ile Gln 65 70 75 80 Gly Thr Arg Lys Asp His Ser Arg Phe Gly Ile Leu Glu Phe Ile Ser 85 90 95 Ile Ala Val Gly Leu Val Ser Ile Arg Gly Val Asp Ser Gly Leu Tyr 100 105 110 Leu Gly Met Asn Glu Lys Gly Glu Leu Tyr Gly Ser Glu Lys Leu Thr 115 120 125 Gln Glu Cys Val Phe Arg Glu Gln Phe Glu Glu Asn Trp Tyr Asn Thr 130 135 140 Tyr Ser Ser Asn Leu Tyr Lys His Val Asp Thr Gly Arg Arg Tyr Tyr 145 150 155 160 Val Ala Leu Asn Lys Asp Gly Thr Pro Arg Glu Gly Thr Arg Thr Lys 165 170 175 Arg His Gln Lys Phe Thr His Phe Leu Pro Arg Pro Val Asp Pro Asp 180 185 190 Lys Val Pro Glu Leu Tyr Lys Asp Ile Leu Ser Gln Ser 195 200。
【００７７】配列番号(SEQ ID NO)： 5 配列の長さ(SEQUENCE LENGTH)： 206 配列の型(SEQUENCE TYPE)：アミノ酸（amino acid） トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE)：タンパク質（protein） ハイポセティカル配列(HIPOTHTICAL)：Ｎｏ 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：ヒト ハプロタイプ(HAPLO TYPE)：2n 組織の種類(TISSUE TYPE)：包皮 細胞の種類(CELL TYPE)：繊維芽細胞 直接起源(IMMIDIATE SOURCE)： ライブラリー名(LIBRARY)：ヒト包皮ｃＤＮＡライブラ
リー クローン名(CLONE)：pGAF1 配列: Met Leu Gly Glu Val Gly Asn Tyr Phe Gly Val Gln Asp Ala Val Pro 5 10 15 Phe Gly Asn Val Pro Val Leu Pro Val Asp Ser Pro Val Leu Leu Ser 20 25 30 Asp His Leu Gly Gln Ser Glu Ala Gly Gly Leu Pro Arg Gly Pro Ala 35 40 45 Val Thr Asp Leu Asp His Leu Lys Gly Ile Leu Arg Arg Arg Gln Leu 50 55 60 Tyr Cys Arg Thr Gly Phe His Leu Glu Ile Phe Pro Asn Gly Thr Ile 65 70 75 80 Gln Gly Thr Arg Lys Asp His Ser Arg Phe Gly Ile Leu Glu Phe Ile 85 90 95 Ser Ile Ala Val Gly Leu Val Ser Ile Arg Gly Val Asp Ser Gly Leu 100 105 110 Tyr Leu Gly Met Asn Glu Lys Gly Glu Leu Tyr Gly Ser Glu Lys Leu 115 120 125 Thr Gln Glu Cys Val Phe Arg Glu Gln Phe Glu Glu Asn Trp Tyr Asn 130 135 140 Thr Tyr Ser Ser Asn Leu Tyr Lys His Val Asp Thr Gly Arg Arg Tyr 145 150 155 160 Tyr Val Ala Leu Asn Lys Asp Gly Thr Pro Arg Glu Gly Thr Arg Thr 165 170 175 Lys Arg His Gln Lys Phe Thr His Phe Leu Pro Arg Pro Val Asp Pro 180 185 190 Asp Lys Val Pro Glu Leu Tyr Lys Asp Ile Leu Ser Gln Ser 195 200 205。
【００７８】配列番号(SEQ ID NO)： 6 配列の長さ(SEQUENCE LENGTH)： 175 配列の型(SEQUENCE TYPE)：アミノ酸（amino acid） トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE)：タンパク質（protein） ハイポセティカル配列(HIPOTHTICAL)：Ｎｏ 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：ヒト ハプロタイプ(HAPLO TYPE)：2n 組織の種類(TISSUE TYPE)：包皮 細胞の種類(CELL TYPE)：繊維芽細胞 直接起源(IMMIDIATE SOURCE)： ライブラリー名(LIBRARY)：ヒト包皮ｃＤＮＡライブラ
リー クローン名(CLONE)：pGAF1 配列: Ser Asp His Leu Gly Gln Ser Glu Ala Gly Gly Leu Pro Arg Gly Pro 1 5 10 15 Ala Val Thr Asp Leu Asp His Leu Lys Gly Ile Leu Arg Arg Arg Gln 20 25 30 Leu Tyr Cys Arg Thr Gly Phe His Leu Glu Ile Phe Pro Asn Gly Thr 35 40 45 Ile Gln Gly Thr Arg Lys Asp His Ser Arg Phe Gly Ile Leu Glu Phe 50 55 60 Ile Ser Ile Ala Val Gly Leu Val Ser Ile Arg Gly Val Asp Ser Gly 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gly Met Asn Glu Lys Gly Glu Leu Tyr Gly Ser Glu Lys 85 90 95 Leu Thr Gln Glu Cys Val Phe Arg Glu Gln Phe Glu Glu Asn Trp Tyr 100 105 110 Asn Thr Tyr Ser Ser Asn Leu Tyr Lys His Val Asp Thr Gly Arg Arg 115 120 125 Tyr Tyr Val Ala Leu Asn Lys Asp Gly Thr Pro Arg Glu Gly Thr Arg 130 135 140 Thr Lys Arg His Gln Lys Phe Thr His Phe Leu Pro Arg Pro Val Asp 145 150 155 160 Pro Asp Lys Val Pro Glu Leu Tyr Lys Asp Ile Leu Ser Gln Ser 165 170 175。
【００７９】配列番号(SEQ ID NO)： 7 配列の長さ(SEQUENCE LENGTH)： 176 配列の型(SEQUENCE TYPE)：アミノ酸（amino acid） トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE)：タンパク質（protein） ハイポセティカル配列(HIPOTHTICAL)：Ｎｏ 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：ヒト ハプロタイプ(HAPLO TYPE)：2n 組織の種類(TISSUE TYPE)：包皮 細胞の種類(CELL TYPE)：繊維芽細胞 直接起源(IMMIDIATE SOURCE)： ライブラリー名(LIBRARY)：ヒト包皮ｃＤＮＡライブラ
リー クローン名(CLONE)：pGAF1 配列: Met Ser Asp His Leu Gly Gln Ser Glu Ala Gly Gly Leu Pro Arg Gly 1 5 10 15 Pro Ala Val Thr Asp Leu Asp His Leu Lys Gly Ile Leu Arg Arg Arg 20 25 30 Gln Leu Tyr Cys Arg Thr Gly Phe His Leu Glu Ile Phe Pro Asn Gly 35 40 45 Thr Ile Gln Gly Thr Arg Lys Asp His Ser Arg Phe Gly Ile Leu Glu 50 55 60 Phe Ile Ser Ile Ala Val Gly Leu Val Ser Ile Arg Gly Val Asp Ser 65 70 75 80 Gly Leu Tyr Leu Gly Met Asn Glu Lys Gly Glu Leu Tyr Gly Ser Glu 85 90 95 Lys Leu Thr Gln Glu Cys Val Phe Arg Glu Gln Phe Glu Glu Asn Trp 100 105 110 Tyr Asn Thr Tyr Ser Ser Asn Leu Tyr Lys His Val Asp Thr Gly Arg 115 120 125 Arg Tyr Tyr Val Ala Leu Asn Lys Asp Gly Thr Pro Arg Glu Gly Thr 130 135 140 Arg Thr Lys Arg His Gln Lys Phe Thr His Phe Leu Pro Arg Pro Val 145 150 155 160 Asp Pro Asp Lys Val Pro Glu Leu Tyr Lys Asp Ile Leu Ser Gln Ser 165 170 175。
【００８０】配列番号(SEQ ID NO)： 8 配列の長さ(SEQUENCE LENGTH)： 159 配列の型(SEQUENCE TYPE)：アミノ酸（amino acid） トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE)：タンパク質（protein） ハイポセティカル配列(HIPOTHTICAL)：Ｎｏ 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：ヒト ハプロタイプ(HAPLO TYPE)：2n 組織の種類(TISSUE TYPE)：包皮 細胞の種類(CELL TYPE)：繊維芽細胞 直接起源(IMMIDIATE SOURCE)： ライブラリー名(LIBRARY)：ヒト包皮ｃＤＮＡライブラ
リー クローン名(CLONE)：pGAF1 配列: Ala Val Thr Asp Leu Asp His Leu Lys Gly Ile Leu Arg Arg Arg Gln 1 5 10 15 Leu Tyr Cys Arg Thr Gly Phe His Leu Glu Ile Phe Pro Asn Gly Thr 20 25 30 Ile Gln Gly Thr Arg Lys Asp His Ser Arg Phe Gly Ile Leu Glu Phe 35 40 45 Ile Ser Ile Ala Val Gly Leu Val Ser Ile Arg Gly Val Asp Ser Gly 50 55 60 Leu Tyr Leu Gly Met Asn Glu Lys Gly Glu Leu Tyr Gly Ser Glu Lys 65 70 75 80 Leu Thr Gln Glu Cys Val Phe Arg Glu Gln Phe Glu Glu Asn Trp Tyr 85 90 95 Asn Thr Tyr Ser Ser Asn Leu Tyr Lys His Val Asp Thr Gly Arg Arg 100 105 110 Tyr Tyr Val Ala Leu Asn Lys Asp Gly Thr Pro Arg Glu Gly Thr Arg 115 120 125 Thr Lys Arg His Gln Lys Phe Thr His Phe Leu Pro Arg Pro Val Asp 130 135 140 Pro Asp Lys Val Pro Glu Leu Tyr Lys Asp Ile Leu Ser Gln Ser 145 150 155。
【００８１】配列番号(SEQ ID NO)： ９ 配列の長さ（ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＥＮＧＴＨ）： 160 配列の型(SEQUENCE TYPE)：アミノ酸（amino acid） トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE)：タンパク質（protein） ハイポセティカル配列(HIPOTHTICAL)：Ｎｏ 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：ヒト ハプロタイプ(HAPLO TYPE)：2n 組織の種類(TISSUE TYPE)：包皮 細胞の種類(CELL TYPE)：繊維芽細胞 直接起源(IMMIDIATE SOURCE)： ライブラリー名(LIBRARY)：ヒト包皮ｃＤＮＡライブラ
リー クローン名(CLONE)：pGAF1 配列: Met Ala Val Thr Asp Leu Asp His Leu Lys Gly Ile Leu Arg Arg Arg 1 5 10 15 Gln Leu Tyr Cys Arg Thr Gly Phe His Leu Glu Ile Phe Pro Asn Gly 20 25 30 Thr Ile Gln Gly Thr Arg Lys Asp His Ser Arg Phe Gly Ile Leu Glu 35 40 45 Phe Ile Ser Ile Ala Val Gly Leu Val Ser Ile Arg Gly Val Asp Ser 50 55 60 Gly Leu Tyr Leu Gly Met Asn Glu Lys Gly Glu Leu Tyr Gly Ser Glu 65 70 75 80 Lys Leu Thr Gln Glu Cys Val Phe Arg Glu Gln Phe Glu Glu Asn Trp 85 90 95 Tyr Asn Thr Tyr Ser Ser Asn Leu Tyr Lys His Val Asp Thr Gly Arg 100 105 110 Arg Tyr Tyr Val Ala Leu Asn Lys Asp Gly Thr Pro Arg Glu Gly Thr 115 120 125 Arg Thr Lys Arg His Gln Lys Phe Thr His Phe Leu Pro Arg Pro Val 130 135 140 Asp Pro Asp Lys Val Pro Glu Leu Tyr Lys Asp Ile Leu Ser Gln Ser 145 150 155 160。
【００８２】配列番号(SEQ ID NO)：10 配列の長さ(SEQUENCE LENGTH)：47 配列の型(SEQUENCE TYPE)：核酸（nucleic acid） 鎖の数(STRANDEDNESS)：一本鎖（single） トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE)：他の核酸（other nuclei
c acid） 合成DNA(synthetic DNA) ハイポセティカル配列(HIPOTHTICAL)：No アンチセンス(ANTI-SENCE)：No 配列: TATGTTAGGT GAAGTTGGGA ACTATTTCGG TGTGCAGGAT GCGGTAC 47。
【００８３】配列番号(SEQ ID NO)：11 配列の長さ(SEQUENCE LENGTH)：41 配列の型(SEQUENCE TYPE)：核酸（nucleic acid） 鎖の数(STRANDEDNESS)：一本鎖（single） トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE)：他の核酸（other nuclei
c acid） 合成DNA(synthetic DNA) ハイポセティカル配列(HIPOTHTICAL)：No アンチセンス(ANTI-SENCE)：Yes 配列: CGCATCCTGC ACACCGAAAT AGTTCCCAAC TTCACCTAAC A 41。
【００８４】配列番号(SEQ ID NO)：12 配列の長さ(SEQUENCE LENGTH)：75 配列の型(SEQUENCE TYPE)：核酸（nucleic acid） 鎖の数(STRANDEDNESS)：一本鎖（single） トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE)：他の核酸（other nuclei
c acid） 合成DNA(synthetic DNA) ハイポセティカル配列(HIPOTHTICAL)：No アンチセンス(ANTI-SENCE)：No 配列: TATGAGTGAC CACCTGGGTC AGTCCGAAGC AGGGGGGCTC CCCAGGGGAC CCGCAGTCAC 60 GGACTTGGAT CATTT 75。
【００８５】配列番号(SEQ ID NO)：13 配列の長さ(SEQUENCE LENGTH)：73 配列の型(SEQUENCE TYPE)：核酸（nucleic acid） 鎖の数(STRANDEDNESS)：一本鎖（single） トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULE TYPE)：他の核酸（other nuclei
c acid） 合成DNA(synthetic DNA) ハイポセティカル配列(HIPOTHTICAL)：No アンチセンス(ANTI-SENCE)：Yes 配列: AAATGATCCA AGTCCGTGAC TGCGGGTCCC CTGGGGAGCC CCCCTGCTTC GGACTGACCC 60 AGGTGGTCAC TCA 73。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒトＧＡＦの全アミノ酸配列を示す。
【図２】 プラスミドｐＥＴＧＡＦ１の構築図である。
【図３】 ｐＥＴＧＡＦ２５の構築図である。
【図４】 ｐＥＴＧＡＦ２３の構築図である。
【図５】 疎水カラムクロマトグラフィー（実施例１
（３）ステップ２）での蛋白の溶出パターンを示す図で
ある。
【図６】 ヘパリンアフィニティー高速液体カラムクロ
マトグラフィー（実施例１(３）ステップ３）での蛋白
の溶出パターンを示す図である。
【図７】 精製ＧＡＦのＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動図である。
【図８】 ＭｏＡｂ １５０−５９が有するＧＡＦの増
殖促進作用に対する中和活性を示す図である。
【図９】 ＭｏＡｂ １３−３とＭｏＡｂ １５０−５９
を用いて作成したサンドイッチＥＩＡ法によるＧＡＦの
検量線を示す図である。
【図１０】 ＧＡＦで免疫して得られたウサギＮｏ．４
血清とＮｏ．６血清の抗体価の測定値を示す図である。
【図１１】 ウサギ抗ＧＡＦ Ｎｏ．４血清のＧＡＦの
有する細胞増殖促進作用に対する中和活性を示す図であ
る。
【図１２】 Ｎ３，Ｎ３３およびＮ４９のラットグリア
細胞株に対する増殖促進活性を示す図である。図中、−
●−はＮ３を、−▲−はＮ３３を、−■−はＮ４９をそ
れぞれ示す。
【図１３】 Ｎ３およびＮ３３の酸に対する安定性を示
す図である。図中、−●−はＮ３を、−○−はＮ３３
を、−▲−はＮ３，２０μｇ／ｍｌのヘパリン共存を、
−△−はＮ３３，２０μｇ／ｍｌのヘパリン共存をそれ
ぞれ示す。
【図１４】 Ｎ３およびＮ３３の熱（５６℃処理）に対
する安定性を示す図である。図中、−●−はＮ３を、−
○−はＦＧＦ−９，Ｎ３３を、−▲−はＮ３，２０μｇ
／ｍｌのヘパリン共存を、−△−はＮ３３，２０μｇ／
ｍｌのヘパリン共存をそれぞれ示す。
【図１５】 Ｎ３およびＮ３３の熱（４２℃処理）に対
する安定性を示す図である。図中、−●−はＦＧＦ−
９，Ｎ３を、−○−はＦＧＦ−９，Ｎ３３を、−▲−は
ＦＧＦ−９，Ｎ３，２０μｇ／ｍｌのヘパリン共存を、
−△−はＦＧＦ−９，Ｎ３３，２０μｇ／ｍｌのヘパリ
ン共存をそれぞれ示す。
【図１６】 Ｎ３，Ｎ３３およびＮ４９のＭＫ−ＣＳＦ
活性を示す図である。図中、−●−はＮ３を、−▲−は
Ｎ３３を、−■−はＮ４９をそれぞれ示す。
【図１７】 Ｎ３，Ｎ３３およびＮ４９投与によるマウ
ス末梢血中の血小板数の変動を示す図である。図中、−
●−はＮ３を、−▲−はＮ３３を、−■−はＮ４９を、
−○−はビークル投与（コントロール），−△−は無処
理を、それぞれ示す。
【図１８】 Ｎ３３の投与量を変化させたときのマウス
末梢血中の血小板数の変動を示す図である。図中、−■
−は１００μｇ／ｄａｙ，−▲−は２０μｇ／ｄａｙ，
−●−は４μｇ／ｄａｙ，−○−はビークル投与（コン
トロール），−△−は無処理をそれぞれ示す。また、＊
ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００
１をそれぞれ示す。
【図１９】 抗ＧＡＦモノクローナル抗体によるＧＡＦ
（Ｎ３）のＭＫ−ＣＳＦ活性の阻害を示す。図中、記号
はそれぞれマウス非付着性骨髄細胞（１×１０5）を種
々の濃度のＭｏＡｂ １５０−５９（●）、ＭｏＡｂ
４−８２（▲）、ＭｏＡｂ ４０−２０（△）或いは正
常マウスＩｇＧ（○）をＧＡＦ（Ｎ３）（１００μｇ／
ｍｌ）と共に添加した群を示す。
【図２０】 抗ＧＡＦモノクローナル抗体によるＧＡＦ
（Ｎ３３）の末梢血小板数の増加作用の抑制を示す図。
５０μｇのＧＡＦ Ｎ３３と共に１ｍｇのＭｏＡｂ １
５０−５９（●）、ＭｏＡｂ ４−８２（▲）、ＭｏＡ
ｂ ４０−２０（■）を１日２回２日間皮下投与した
群、ポジティブ・コントロールとしてＧＡＦ Ｎ３３の
みを投与した群（○）及びネガティブコントロールとし
て１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡを含有する生理食塩水を投
与した群（△）の結果を示す。 ＊、＊＊：各種抗体投与群についてＧＡＦ Ｎ３３投与
群に対して有意差検定を行った（＊：ｐ＜０．０５，＊
＊：ｐ＜０．０１、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔ）。
【図２１】ＧＡＦ（Ｎ３３）のラット幼若肝実質細胞に
対する増殖促進作用を示す。
【図２２】ＧＡＦ（Ｎ３），（Ｎ３３）及び（Ｎ４９）
のマウス肝重量増加作用を示す。
【図２３】動物細胞用ＧＡＦ発現プラスミドｐＲＧＢ１
２の構造を示す。
【図２４】ＧＡＦｃＤＮＡにより形質転換されたトラン
スフォーマントＡＴＧ１（●）、ＡＴＧ２（▲）、ＡＴ
Ｇ３（▼）、ＡＴＧ４（■）、ＡＴＧ５（□）及びＡ３
１（○）の増殖曲線を示す図である。
【図２５】親株Ａ３１(ａ)、トランスフォーマントＡＴ
Ｇ３(ｂ)或いはＡＴＧ５(ｃ)の増殖への抗ＧＡＦ抗体の
作用を示す。ここで抗体としては、正常マウスＩｇＧ
（△）あるいはＭｏＡｂ １５０−５９（●）を１０μ
ｇ／ｍｌ添加した。またコントロールには何も添加しな
かった（○）。
【図２６】トランスフォーマントＡＴＧ５細胞のヌード
マウスでの腫瘍形成及び抗ＧＡＦ抗体による抑止効果を
示す。
【図２７】トランスフォーマントによりヌードマウスに
形成された腫瘍の抗ＧＡＦ抗体による治療実験を示す。
【図２８】抗ＧＡＦ抗体、ＭｏＡｂ １５０−５９の胃
癌細胞ＡＺ−５２１の増殖抑制効果を示す。
【図２９】胃癌細胞ＡＺ５２１のヌードマウスにおける
腫瘍形成に対する抗ＧＡＦ抗体の効果を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ Ｎ Ｃ０７Ｋ 14/47 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ 5/10 5/20 15/06 15/12 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｌ 33/577 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (32)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】グリア活性化因子ポリペプチドを特異的に
    認識し、かつその生物活性を中和しうる抗体。
  2. 【請求項２】抗体がモノクローナル抗体である、請求項
    １記載の抗体。
  3. 【請求項３】生物活性がグリア活性化作用である請求項
    １記載の抗体。
  4. 【請求項４】マウスモノクローナル抗体ＧＡＦ１５０−
    ５９である請求項３記載の抗体。
  5. 【請求項５】生物活性が巨核芽球増殖促進作用である請
    求項１記載の抗体。
  6. 【請求項６】マウスモノクローナル抗体ＧＡＦ４−８２
    である請求項５記載の抗体。
  7. 【請求項７】グリア活性化因子ポリペプチドがアミノ酸
    配列： Leu Asp His Leu Lys Gly Ile Leu Arg Arg Arg Gln Leu Tyr Cys Arg Thr Gly Phe His Leu Glu Ile Phe Pro Asn Gly Thr Ile Gln Gly Thr Arg Lys Asp His Ser Arg Phe Gly Ile Leu Glu Phe Ile Ser Ile Ala Val Gly Leu Val Ser Ile Arg Gly Val Asp Ser Gly Leu Tyr Leu Gly Met Asn Glu Lys Gly Glu Leu Tyr Gly Ser Glu Lys Leu Thr Gln Glu Cys Val Phe Arg Glu Gln Phe Glu Glu Asn Trp Tyr Asn Thr Tyr Ser Ser Asn Leu Tyr Lys His Val Asp Thr Gly Arg Arg Tyr Tyr Val Ala Leu Asn Lys Asp Gly Thr Pro Arg Glu Gly Thr Arg Thr Lys Arg His Gln Lys Phe Thr His Phe Leu Pro Arg Pro Val Asp Pro Asp （配列番号：１）で示されるポリペプチドを含むポリペプチドであ る請求項１記載の抗体。
  8. 【請求項８】グリア活性化因子ポリペプチドがアミノ酸
    配列： (Met)n X1 Val Thr Asp Leu Asp His Leu Lys Gly Ile Leu Arg Arg Arg Gln Leu Tyr Cys Arg Thr Gly Phe His Leu Glu Ile Phe Pro Asn Gly Thr Ile Gln Gly Thr Arg Lys Asp His Ser Arg Phe Gly Ile Leu Glu Phe Ile Ser Ile Ala Val Gly Leu Val Ser Ile Arg Gly Val Asp Ser Gly Leu Tyr Leu Gly Met Asn Glu Lys Gly Glu Leu Tyr Gly Ser Glu Lys Leu Thr Gln Glu Cys Val Phe Arg Glu Gln Phe Glu Glu Asn Trp Tyr Asn Thr Tyr Ser Ser Asn Leu Tyr Lys His Val Asp Thr Gly Arg Arg Tyr Tyr Val Ala Leu Asn Lys Asp Gly Thr Pro Arg Glu Gly Thr Arg Thr Lys Arg His Gln Lys Phe Thr His Phe Leu Pro Arg Pro Val Asp Pro Asp Lys Val Pro Glu Leu Tyr Lys Asp Ile Leu Ser Gln Ser 〔ただしnは０または１を、X1 は Ala Pro Leu Gly Glu
    Val Gly Asn Tyr Phe Gly Val Gln Asp Ala Val Pro P
    he Gly Asn Val Pro Val Leu Pro Val Asp Ser Pro Val
    Leu Leu Ser Asp His Leu Gly Gln Ser Glu Ala Gly G
    ly Leu Pro Arg Gly Pro Ala またはその断片を、それ
    ぞれ示す（ｎ＝０配列番号：２，ｎ＝１配列番号：
    ３）〕で示されるポリペプチドからなる請求項１記載の
    抗体。
  9. 【請求項９】Ｘ1がLeu Gly Glu Val Gly Asn Tyr Phe G
    ly Val Gln Asp Ala Val Pro Phe Gly Asn Val Pro Val
    Leu Pro Val Asp Ser Pro Val Leu Leu Ser Asp His L
    eu Gly Gln Ser Glu Ala Gly Gly Leu Pro Arg Gly Pro
    Ala （ｎ＝０配列番号：４，ｎ＝１配列番号：５）で
    ある請求項８記載の抗体。
  10. 【請求項１０】Ｘ1が Ser Asp His Leu Gly Gln Ser Gl
    u Ala Gly Gly Leu Pro Arg Gly Pro Ala （ｎ＝０配列
    番号：６，ｎ＝１配列番号：７）である請求項８記載の
    抗体。
  11. 【請求項１１】Ｘ1が Ala （ｎ＝０配列番号：８，ｎ＝
    １配列番号：９）である請求項８記載の抗体。
  12. 【請求項１２】グリア活性化因子ポリペプチドを特異的
    に認識し、かつその生物活性を中和し得る抗体を産生す
    るハイブリドーマ。
  13. 【請求項１３】マウスハイブリッドハイブリドーマＧＡ
    Ｆ１５０−５９またはマウスハイブリッドハイブリドー
    マＧＡＦ４−８２である請求項１２記載のハイブリドー
    マ。
  14. 【請求項１４】グリア活性化因子ポリペプチドで免疫し
    た哺乳動物の脾臓細胞と、同種または異種のミエローマ
    とを融合させて得られる細胞をクローニングすることを
    特徴とするハイブリドーマの製造法。
  15. 【請求項１５】請求項１４記載の方法で得られたハイブ
    リドーマを液体培地中または哺乳動物の腹腔内で増殖
    し、モノクローナル抗体を生成、蓄積せしめ、これを採
    取することを特徴とする、グリア活性化因子ポリペプチ
    ドを特異的に認識し、かつその生物活性を中和しうるモ
    ノクローナル抗体の製造法。
  16. 【請求項１６】請求項１ないし１１記載のいずれかの抗
    体を用いることを特徴とするグリア活性化因子ポリペプ
    チドの免疫測定法。
  17. 【請求項１７】請求項１ないし１１記載のいずれかの抗
    体を用いることを特徴とするグリア活性化因子ポリペプ
    チドの精製法。
  18. 【請求項１８】アミノ酸配列： (Met)n X2 Val Thr Asp Leu Asp His Leu Lys Gly Ile Leu Arg Arg Arg Gln Leu Tyr Cys Arg Thr Gly Phe His Leu Glu Ile Phe Pro Asn Gly Thr Ile Gln Gly Thr Arg Lys Asp His Ser Arg Phe Gly Ile Leu Glu Phe Ile Ser Ile Ala Val Gly Leu Val Ser Ile Arg Gly Val Asp Ser Gly Leu Tyr Leu Gly Met Asn Glu Lys Gly Glu Leu Tyr Gly Ser Glu Lys Leu Thr Gln Glu Cys Val Phe Arg Glu Gln Phe Glu Glu Asn Trp Tyr Asn Thr Tyr Ser Ser Asn Leu Tyr Lys His Val Asp Thr Gly Arg Arg Tyr Tyr Val Ala Leu Asn Lys Asp Gly Thr Pro Arg Glu Gly Thr Arg Thr Lys Arg His Gln Lys Phe Thr His Phe Leu Pro Arg Pro Val Asp Pro Asp Lys Val Pro Glu Leu Tyr Lys Asp Ile Leu Ser Gln Ser 〔ただし nは０または１を、X2 は Ser Asp His Leu Gl
    y Gln Ser Glu Ala GlyGly Leu Pro Arg Gly Pro Ala
    またはその断片を、それぞれ示す〕を有するポリペプチ
    ド。
  19. 【請求項１９】Ｘ2が Ser Asp His Leu Gly Gln Ser Gl
    u Ala Gly Gly Leu Pro Arg Gly Pro Ala である請求項
    １８記載のポリペプチド。
  20. 【請求項２０】Ｘ2が Ala である請求項１８記載のポリ
    ペプチド。
  21. 【請求項２１】請求項１８、１９または２０記載のポリ
    ペプチドをコードするＤＮＡ。
  22. 【請求項２２】請求項２１記載のＤＮＡを含有するベク
    ター。
  23. 【請求項２３】請求項２２記載のベクターを含有する形
    質転換体。
  24. 【請求項２４】請求項１８、１９または２０記載のポリ
    ペプチドを含有することを特徴とする医薬組成物。
  25. 【請求項２５】血小板増加剤である請求項２４記載の医
    薬組成物。
  26. 【請求項２６】他の医薬と組合せて用いられる請求項２
    ５記載の医薬組成物。
  27. 【請求項２７】他の医薬が制癌剤である請求項２６記載
    の医薬組成物。
  28. 【請求項２８】制癌剤との混合物である請求項２７記載
    の医薬組成物。
  29. 【請求項２９】制癌剤と別個に組合せてなる請求項２７
    記載の医薬組成物。
  30. 【請求項３０】請求項１８、１９または２０記載のポリ
    ペプチドおよび製剤学的に許容し得る担体を含有するこ
    とを特徴とする医薬組成物と制癌剤とを含有する医薬用
    キット。
  31. 【請求項３１】制癌剤がアルキル化剤、抗代謝薬、抗生
    物質、植物アルカロイド、白金錯体誘導体およびホルモ
    ンからなる群から選ばれるものである、請求項２７記載
    の医薬組成物。
  32. 【請求項３２】制癌剤がナイトロゲン・マスタード・Ｎ
    −オキサイド、サイクロホスファミド、メルファラン、
    カルボクオン、ブスルファン、ニマスチン塩酸塩、ラニ
    マスチン、ダカルバジン、フルオロウラシル、テガフ
    ル、サイタラビン、アンサイタビン塩酸塩、ブロキシウ
    リジン、ドキシフルウリジン、メルカプトプリン、チオ
    イノシン、メトトレキセート、マイトマイシン、ブレオ
    マイシン、ダウノルビシン塩酸塩、ドキソルビシン塩酸
    塩、ピラルビシン塩酸塩、アクラルビシン塩酸塩、ネオ
    カルジノスタチン、アクチノマイシンＤ、ヴィンクリス
    チン硫酸塩、ヴィンデシン硫酸塩、ヴィンブラスチン硫
    酸塩、エトポサイド、タモキシフェンクエン酸塩、プロ
    カルバジン塩酸塩、マイトブロニトール、マイトキサン
    トン塩酸塩、カルボプラチンおよびシスプラチンからな
    る群から選ばれるものである、請求項２７記載の医薬組
    成物。
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