BRPI0707529A2 - métodos para modulação do teor de manose de proteìnas recombinantes - Google Patents

métodos para modulação do teor de manose de proteìnas recombinantes Download PDF

Info

Publication number
BRPI0707529A2
BRPI0707529A2 BRPI0707529-4A BRPI0707529A BRPI0707529A2 BR PI0707529 A2 BRPI0707529 A2 BR PI0707529A2 BR PI0707529 A BRPI0707529 A BR PI0707529A BR PI0707529 A2 BRPI0707529 A2 BR PI0707529A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
approximately
composition
amino acid
culture medium
antibody
Prior art date
Application number
BRPI0707529-4A
Other languages
English (en)
Inventor
La Cruz Michael De
Gregory Flynn
Nicole Le
Jian Wu
Original Assignee
Amgen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=38266667&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BRPI0707529(A2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Amgen Inc filed Critical Amgen Inc
Publication of BRPI0707529A2 publication Critical patent/BRPI0707529A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/06—Antiabortive agents; Labour repressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0037—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/02—Atmosphere, e.g. low oxygen conditions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/74—Undefined extracts from fungi, e.g. yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/76—Undefined extracts from plants

Abstract

MéTODOS PARA MODULAçãO DO TEOR DE MANOSE DE PROTEìNAS RECOMBINANTES A presente invenção se refere a métodos de modulação (por exemplo, redução) do teor de manose, particularmente do alto teor de manose de glicoproteinas recombinantes.

Description

"MÉTODOS PARA MODULAÇÃO DO TEOR DE MANOSE DEPROTEÍNAS RECOMBINANTES"
Fundamentos da Invenção
Eucariotos superiores realizam uma variedade de modificações pós-traducionais, incluindo metilação, sulfuração, fosforilação, adição de lipídios eglicosilação. Tais modificações podem ser de crítica importância para a função de umaproteína. Proteínas secretadas, proteínas de membrana, e proteínas direcionadas paravesículas ou algumas organelas intracelulares devem provavelmente ser glicosiladas.
A glicosilação N-Iigada é uma forma de glicosilação que envolve a adiçãode oligossacarídeos a um resíduo de asparagina encontrado na seqüência dereconhecimento (por exemplo, Asn-X-Ser/Ter) em proteínas. Glicoproteínas N-Iigadascontém estruturas ramificadas padrões, que são compostas de manose (Man), galactose,N-acetilglucosamina (GlcNAc) e ácidos neurâmicos. A N-glicosilação de proteínastipicamente se origina no retículo endoplasmático (RE), onde um oligossacarídeo N-Iigado(por exemplo, Glc3, Mam, GlcNAC2) associado a dolicol (um intermediário carreador delipídio) é transferido para a asparagina apropriada (Asn) de uma proteína nascente. Este éum evento comum a todas as glicoproteínas N-Iigadas eucarióticas. Existem dois tiposprincipais de sacarídeos N-associados: oligossacarídeos de alta manose, e oligossacarídeoscomplexos.
Oligossacarídeos de alta manose tipicamente incluem duas N-acetilglucosamina com alguns resíduos de manose (por exemplo, mais de 4).Oligossacarídeos complexos são assim chamados devido a poderem conter praticamentequalquer número de outros tipos de sacarídeos, incluindo mais do que as duas N-acetilglucosaminas originais. As proteínas podem ser glicosiladas por ambos os tipos deoligossacarídeos em diferentes porções da proteína. Se um oligossacarídeo é de altamanose ou complexo imagina-se depender de sua acessibilidade às proteínas modificadorasde sacarídeo no aparelho de Golgi. Se o sacarídeo é relativamente inacessível, este maisprovavelmente ficará na sua forma original de alta manose. Se este é acessível, então éprovável que alguns dos resíduos de manose sejam clivados e o sacarídeo seja aindamodificado pela adição de outros tipos de grupos como acima discutido.Após uma cadeia de oligossacarídeo ter sido adicionada a uma proteína, ostrês resíduos de glicose e um de manose são removidos por três diferentes enzimas numaordem fixa. Este evento ocorre no RE e é um sinal de que a proteína pode ser transportadapara o Golgi para processamentos adicionais. Após o processamento no RE, ooligossacarídeo do tipo alta manose é formado. Os resíduos de três glicoses e um resíduoespecífico de manose alfa-l,2-ligada são removidos por glucosidases específicas e umaalfa-1,2-manosidase no RE, resultando na estrutura central do oligossacarídeo, MangGlcNAc2. A proteína com esta estrutura central de açúcar é transportada para o aparelhode Golgi onde a porção de açúcar experimenta várias modificações.
Nas células de mamíferos, a modificação da cadeia de açúcar se processaatravés de três diferentes vias dependendo da porção de proteína a qual esta é adicionada.
As três diferentes vias são: (1) a cadeia central de açúcar não muda; (2) a cadeia centralde açúcar é modificada pela adição da porção N-acetilglucosamina-1-fosfato (GlcNAc-I-P)em UDP-N-acetilglucosamina (UDP-GlcNAc) na manose de posição 6 na a cadeia centralde açúcar, seguido pela remoção da porção GlcNAc para formar uma cadeia de açúcarácida na glicoproteína; ou (3) a cadeia central de açúcar é primeiro convertida em MaibGlcNAc2 pela remoção de 3 resíduos de manose com manosidase I, Mans GlcNAc2 é aindamodificada pela adição de GlcNAc e remoção de mais 2 resíduos de manose, seguido daadição seqüencial de GlcNAc, galactose (Gal), e ácido N-acetilneuamínico (tambémchamado ácido siálico (NeuNAc)) para formar várias cadeias híbridas ou complexas deaçúcar (R. Kornfeld e S. Kornfeld, Ann. Rev. Biochem. 54: 631-664 (1985); Chiba et al.,J. Biol. Chem. 273: 26298-26304 (1998)).
O teor de oligossacarídeo de proteínas recombinantes pode afetar asegurança e eficácia das glicoproteínas terapêuticas. Conseqüentemente, os métodos decontrole do teor de oligossacarídeo, particularmente o teor de manose, de taisglicoproteínas seriam benéficos.
O alto teor de manose de composições de glicoproteínas, particularmenteanticorpos terapêuticos, pode significativamente afetar a segurança e eficácia de taisproteínas durante o uso terapêutico. Sem estar associado a uma teoria em particular, asevidências sugerem que glicoproteínas de alta manose são claramente de circulação maisrápida do que seus equivalentes de baixa manose devido, por exemplo, aos receptores demanose nos macrófagos e células dendríticas. Adicionalmente, espera-se que asglicoproteínas de alta manose sejam mais imunogênicas. Conseqüentemente, é desejávelproduzir glicoproteínas terapêuticas tais como, por exemplo, anticorpos terapêuticos, quepossuem baixo teor de manose.
Os presentes inventores solucionam esta necessidade na arte fornecendométodos para modular (por exemplo, controlar ou reduzir) o teor de manose de proteínase peptídeos produzidos recombinantemente.
Resumo da Invenção
A presente invenção é baseada, pelo menos em parte, na descoberta defatores que afetam o teor de manose e, em particular, teor de alta manose, deglicoproteínas expressas recombinantemente.
Conseqüentemente, num aspecto, a presente invenção fornece um métodopara modular o teor de manose (isto é, numa cadeia lateral de oligossacarídeo) de umaglicoproteína recombinante produzida numa célula hospedeira de mamífero pelamanipulação das condições de cultura das células de modo que a glicoproteína produzidapela célula tenha um teor baixo de manose. Como aqui usado, o termo "baixo teor demanose" se refere às composições de glicoproteínas em que menos de cerca de 10%, oumenos de cerca de 8%, ou menos de cerca de 5% (por exemplo, cerca de 4% ou menos)das glicoproteínas na composição possuem mais do que 4 resíduos de manose (isto é, sãoespécies de M5 ou mais). Como aqui usado, o termo "baixo teor de manose" também serefere a composições de glicoproteína em que menos de cerca de 10%, menos de cerca de9%, menos de cerca de 8%, menos de cerca de 7%, menos de cerca de 6%, menos decerca de 5%, menos de cerca de 4%, menos de cerca de 3%, menos de cerca de 2%,menos de cerca de 1%, ou qualquer valor entre qualquer destas faixas anteriores, oumesmo zero.
Numa realização da invenção, o baixo teor de manose é alcançadomantendo-se o ambiente da cultura de células com baixa osmolalidade (por exemplo,menos de cerca de 600 mOsm/Kg, ou menos de cerca de 500 mOsm/Kg, ou menos decerca de 400 mOsm/Kg, por exemplo, entre cerca de 380 a 250 mOsm/Kg). Istoenriquece a cultura de célula em glicoproteínas que tem baixo teor de manose, isto é, quepossui 4 ou menos resíduos de manose nas cadeias laterais de oligossacarídeos daglicoproteína. Conseqüentemente, numa realização particular, a invenção fornece ummétodo para produzir uma glicoproteína recombinante que apresenta um baixo teor demanose que compreende cultivar uma célula hospedeira de mamífero (por exemplo, numafaze de expansão ou produção da cultura) que expressa a glicoproteína num meio quepossui uma osmolalidade de cerca de 600 mOsm/Kg ou menos (por exemplo, entre umafaixa de cerca de 200 e 600 mOsm/Kg, por exemplo, cerca de 250 e 550 mOsm/Kg, cercade 250 e 500 mOsm/Kg, cerca de 250 e 450 mOsm/Kg, cerca de 250 e 400 mOsm/Kg,cerca de 250 e 380 mOsm/Kg, ou cerca de 250 e 350 mOsm/Kg).
As faixas de osmolalidade acima podem ser alcançadas pela manipulação deum número de parâmetros de cultura de célula incluindo, mas não limitado a,concentrações de um ou mais sais, vitaminas, açúcares, peptonas e aminoácidos no meiode cultura de células. Conseqüentemente, numa realização particular, a invenção forneceum método de produção de uma glicoproteína recombinante que tem um baixo teor demanose pelo cultivo de uma célula hospedeira que expressa a glicoproteína num meiocontendo potássio numa concentração de cerca de 70 mM ou menos (por exemplo, cercade 10 mM a cerca de 50 mM); e/ou sódio numa concentração de cerca de 200 mM oumenos (por exemplo, cerca de 50 mM a cerca de 100 mM) e manter a osmolalidade dacultura de células em cerca de 600 mOsm/Kg ou menos.
Ainda numa outra realização, a invenção fornece um método de produçãode uma glicoproteína recombinante que possui um baixo teor de manose pelo cultivo deuma célula hospedeira que expressa a glicoproteína num meio que é substancialmenteisento de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo que consiste de alanina,arginina, ácido aspártico e ácido glutâmico, e mantendo a osmolalidade da cultura decélula em cerca de 600 mOsm/Kg ou menos.
Adicionalmente, ainda numa outra realização, o meio pode incluir uma oumais vitaminas selecionadas do grupo que consiste de biotina, D-cálcio pantotenato,cloreto de colina, ácido fólico, i-inositol, niacinamida, piridoxal HCl, piridoxina HCl,riboflavina, tamina HCl e cianocobalamina, numa concentração de cerca de 0,00005 g/L acerca de 0,9 g/L. Ainda numa outra realização, o meio inclui glicose numa concentraçãode cerca de 1 raM a cerca de 90 raM. Numa outra realização, o meio inclui uma ou maispeptonas selecionadas do grupo que consiste de extrato de lêvedo, hidrolisado de lêvedo,peptona de soja, hidrolisado de soja, peptona de trigo e hidrolisado de trigo, numaconcentração de cerca de 0,5 g/L a cerca de 60 g/L.
Ainda numa outra realização da presente invenção, o meio de cultura decélulas pode incluir um ou mais osmoprotetores numa quantidade necessária para manter aosmolalidade num nível desejado, por exemplo, cerca de 600 mOsm/Kg ou menos.Osmoprotetores adequados são conhecidos na arte e incluem, por exemplo, betaína,glicina, L-treonina e L-prolina, e derivados destes tais como, por exemplo, glicina betaínae aldeído betaína. Numa realização particular, o osmoprotetor (por exemplo, betaína) estápresente numa concentração de cerca de 20 mM ou mais no meio de cultura de células.Em realizações particulares, os osmoprotetores (por exemplo, betaína) está presente numaconcentração de cerca de 1 mM a cerca de 100 mM ou cerca de 20 mM a cerca de 30 mM.
Parâmetros adicionais de cultura de célula que podem ser controlados, tantosozinhos ou em combinação com um ou mais dos parâmetros aqui descritos incluem, porexemplo, temperatura e tempo de duração em que as células foram cultivadas. Emalgumas realizações, uma célula hospedeira que expressa uma glicoproteína recombinanteé cultivada por um período de tempo na faixa de cerca de 5 dias a cerca de 14 dias.
Células hospedeira adequadas para expressar glicoproteínas recombinantesde acordo com a presente invenção são bem conhecidos na arte e incluem qualquer umadaquelas aqui descritas, tal como células CHO, células linfocíticas (por exemplo, célulasNOS) e uma variedade de outras células de mamíferos.
A presente invenção pode ser empregada para produzir uma amplavariedade de glicoproteínas que possuem um baixo teor de manose como aqui descrito.Numa realização em particular, a invenção é utilizada para produzir um anticorpomonoclonal recombinante ou um fragmento de antígeno-ligante deste que possui um baixoteor de manose. Anticorpos adequados podem incluir, por exemplo, murina, quimérica,humanizada e anticorpos completamente humanos, bem como, outras formas de anticorposconhecidos na arte. Numa outra realização particular, o anticorpo que se liga a IL-15,inclui mas não se limita aos anticorpos revelados na publicação US No. 2003-0138421,que é aqui incorporada como referência na sua integridade. Numa outra realizaçãoparticular, o anticorpo é com anticorpo monoclonal completamente humano que liga IL-15apresentando uma cadeia leve de região variável que compreende a seqüência deaminoácidos estabelecida em SEQ ID No:4 e/ou uma cadeia pesada de região variável quecompreende a seqüência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID No:2, bem comoseqüências homólogas que ligam IL-15 (por exemplo, tendo seqüências de aminoácidos decerca de 80, 85, 90, 95% ou maior identidade a SEQ ID No:4 ou SEQ ID No:2,respectivamente). Numa outra realização particular, o anticorpo é um anticorpo humanoque liga IL-15, ou um fragmento de antígeno-ligante deste, que apresenta uma cadeia levede região variável que compreende uma ou mais regiões determinantes decomplementaridade (RDCs) estabelecida em SEQ ID Nos:8-10, bem como seqüênciashomólogas que ligam IL-15 (por exemplo, tendo seqüências de aminoácidos de cerca de80, 85, 90, 95% ou maior identidade a qualquer uma das SEQ ID Nos:8-10,respectivamente), e uma cadeia pesada de região variável que compreende todas trêsRDCs estabelecidas na SEQ ID No:8-10, e uma cadeia pesada de região variável quecompreende todas três RDCs estabelecidas na SEQ ID Nos:5-7, ou substituiçõesconservativas de aminoácidos destas.
Ainda num outro aspecto, a presente invenção fornece glicoproteínasrecombinantes que possuem baixo teor de manose produzido pelos métodos aqui descritos.Conseqüentemente, tais glicoproteínas podem incluir qualquer uma das glicoproteínasterapêuticas acima mencionadas, tais como anticorpos, hormônios, enzimas, peptídeos eoutras glicoproteínas.
A presente invenção também engloba composições que compreendemqualquer uma das glicoproteínas acima mencionadas que possuem baixos teores demanose. Numa realização particular, a composição é uma composição farmacêutica queinclui uma glicoproteína isolada (por exemplo, um anticorpo monoclonal humano isoladoque liga IL-15 ou um fragmento de antígeno ligante deste) que possui baixo teor demanose e um carreador farmaceuticamente aceitável.Conseqüentemente, ainda num outro aspecto, a presente invenção forneceum método de tratamento ou prevenção de uma doença que está associada a umasuperexpressão de IL-15 humana e/ou em que efeitos induzidos de uma regulação negativaou inibição de IL-15 humana são benéficos, são fornecidos pela administração a umindivíduo de um anticorpo IL-15 isolado que possui baixo teor de manose. Doenças deexemplo incluem, mas não se limitam a, vasculiitis, psoríase, esclerose múltipla, artritereumatóide, doença inflamatória do intestino (por exemplo, doença de Crohn ou doençaceliac), rejeição à alotransplante, reação hospedeiro versus enxerto, limfoma das célulasT, e leucemia de células T.
Conseqüentemente, ainda num outro aspecto, a presente invenção forneceum método ou tratamento ou prevenção de uma disfunção que está associada com umasuperexpressão de IL-15 humana e/ou em que os efeitos induzidos pela regulação negativaou inibição de IL-15 humana são benéficos é fornecido, pela administração a um indivíduode um anticorpo IL-15 isolado que possui baixo teor de manose. Doenças de exemploincluem, mas não se limitam a, artrites, disfunções do tecido conjuntivo, doençasoftalmológicas, doenças neurológicas, doenças gastrintestinais e hepáticas, doençasalérgicas, doenças hematológicas, doenças de pele, doenças pulmonares, malignidade,doenças derivadas de transplantes, doenças endocrinológicas, doenças vasculares, doençasginecológicas e doenças infecciosas.
Breve Descrição dos Desenhos
A figura 1 é um gráfico que descreve a correlação entre osmolalidade e altoteor de manose de um anticorpo monoclonal completamente humano que liga IL-15produzido pelas células cultivadas que expressam o anticorpo num agitadores controlados(50mL) e biorreatores (150 L e 500 L).
A figura 2 é um gráfico que descreve a correlação entre a adição de umosmoprotetor, betaína, e um alto teor de manose de um anticorpo monoclonalcompletamente humano que liga IL-15.
A figura 3 é um gráfico que descreve a correlação entre osmolalidade e aconcentração de K+ do meio de cultura.
A figura 4 é um gráfico que descreve a correlação entre alto teor de manosede um anticorpo monoclonal completamente humano que liga IL-15 e osmolalidade, pelocultivo de células num meio contendo tanto 15mM ou 45mM de KCl.
A figura 5 é uma representação gráfica da correlação entre a concentraçãode K+ e o alto teor de manose, mostrando que a concentração ótima de K+ para manter oalto teor de manose abaixo de 10% está entre cerca de 0 e cerca de 70mM.
A figura 6 é um gráfico representando a correlação entre a concentração deNa+ e o alto teor de manose, mostrando que a concentração ótima de Na+ para manter oalto teor de manose abaixo de 10% está entre cerca de 0 e cerca de 200mM.
A figura 7 é um gráfico que descreve a correlação entre a concentração deaminoácidos e o alto teor de manose.
A figura 8 é um gráfico que descreve a correlação entre o tipo de meionutriente usado e o alto teor de manose.
Descrição Detalhada da Invenção
Conseqüentemente, é desejável produzir glicoproteínas terapêuticas taiscomo, por exemplo, tendo baixo teor de manose.
I. Definições
As porções de carboidrato são descritas aqui com referência a nomenclaturacomumente usada para oligossacarídeos. Uma revisão da química de carboidratos queutiliza esta nomenclatura pode ser encontrada, por exemplo, em Hubbard e Ivatt, "Ann.
Ver. Biochem. 50:555-583 (1981). Esta nomenclatura inclui, por exemplo, Man, querepresenta manose; GlcNAc, que representa 2-N-acetilglucosamina, Gal, que representagalactose; e Glc, que representa glicose. Ácidos siálicos são descritos com referência anotação abreviada, NeuNAc, para ácido 5-N-acetilneuramínico, e NeuNGc para ácido 5-glicolilneuramínico.
O termo "osmolalidade", como aqui usado, se refere a uma medida depressão osmótica de partículas de soluto dissolvidas numa solução aquosa. As partículasde soluto incluem tanto moléculas ionizadas e não ionizadas. A osmolalidade é expressacomo a concentração de partículas osmoticamente ativas (isto é, osmóticos) dissolvidos em1 Kg de solução (1 mOsm/kg HaO a 380C é equivalente a uma pressão osmótica de 19mmHg). Como aqui usado, a abreviação "mOsm" significa "miliosmoles/Kg de solução".Nas realizações de exemplo, a osmolalidade do meio de cultura de célula é mantido emcerca de 600 mOsm/kg ou menos, ou cerca de 550 mOsm/kg ou menos, ou cerca de 380mOsm/kg ou menos, ou entre cerca de 200 mOsm/kg e cerca de 600 mOsm/kg, ou entrecerca de 250 mOsm/kg e cerca de 550 mOsm/kg, ou entre cerca de 250 mOsm/kg e cercade 500 mOsm/kg, ou entre cerca de 250 mOsm/kg e cerca de 450 mOsm/kg, ou entrecerca de 250 mOsm/kg e cerca de 400 mOsm/kg, ou entre cerca de 250 mOsm/kg e cercade 380 mOsm/kg, ou entre cerca de 250 mOsm/kg e cerca de 350 mOsm/kg.
Como aqui usado, o termo "glicoproteína" se refere a peptídeos eproteínas, incluindo anticorpos, que possuem pelo menos uma cadeia lateral deoligossacarídeo que inclui resíduos de manose. As glicoproteínas podem ser homólogas àcélula hospedeira, ou podem ser heterólogas, isto é, estranha, à célula hospedeira que éutilizada, como tal, por exemplo, uma glicoproteína humana produzida por uma célulahospedeira de ovário de hamster chinês. Tais glicoproteínas são geralmente referidascomo "glicoproteínas recombinantes". Em algumas realizações, as glicoproteínasexpressas por uma célula hospedeira são diretamente secretadas no meio. Exemplos deglicoproteínas de mamíferos incluem as seguintes moléculas e anticorpos contra estas,citocinas, por exemplo, IL-I a IL-15, e seus receptores; quimocinas, tais como TNF,TECK, e seus receptores, por exemplo, TNFRs, CCR9; hormônio do crescimento,incluindo hormônio do crescimento humano, e hormônio do crescimento bovino; fator deliberação do hormônio do crescimento; hormônio da paratireóide; hormônio estimuladorda tireóide; lipoproteínas; alfa-l-antitripsina; cadeia-A da insulina, cadeia-B da insulina,proinsulina, hormônio estimulador do folículo; calcitonina; hormônio luteinizante;glucagon; fatores de coagulação tais como fatores VIIIC, faor IX, fator de tecido, e fatorVon Willebrands; fatores anti-coagulantes tais como proteína-C; fator atrial natriurético;tensoativo de pulmão; ativador de plasminogêneo, tal como uroquinase ou urina humanaou ativador de plasminogêneo tipo tecido (t-PA); bombesina, trombina; fator decrescimento hematopoiético; enquefalinase; RANTES (regulada sobre ativação de célulasT expressas normais e secretadas); proteína de macrófago inflamatório humano (MIP-1-alfa); soro albumina tal como soro albumina humana; substância uterina inibidora; cadeia-A de relaxina; cadeia-B de relaxina; prorelaxina; peptídeo gonadotropina associado decamundongo; proteína microbiana, tal como beta-lactamase; DNase; inibina, ativina, fatordo crescimento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormônios ou fatores docrescimento; integrina, proteína-A ou D; fatores reumatóideos; um fator neurotrófico talcomo fator neurotrófico ósteo-derivado (BDNF), neurotrofina-3, -4,-5, ou -6 (NT-3, NT-4, NT-5, ou NT-6), ou um fator de crescimento do nervo tal como NGF-beta; fator decrescimento derivado de plaquetas (PDGF); fator do crescimento de fibroblastos tal comoaFGF e bFGF; fator de crescimento da epiderme (EGF); fator de crescimento detransformação (TGF) tal como TGF-alfa e TGF-beta, incluindo TGF-betal, TGF-beta2,TGF-beta3, TGF-beta4, ou TGF-beta5; fator de crescimento tipo insulina I e II (IGF-I eIGF-II); des(l-3)-IGF-I (IGF-I de cérebro), proteínas ligantes de fator de crescimento tipoinsulina; proteínas CD tal como CD-3, CD-4, CD-8, e CD-19; eritropoietina, fatoresosteoindutores; imunotoxinas; proteína morfogenética de osso (BMF); interferons taiscomo interferon-alfa, -beta, e -gama; fatores de estimulação de colônia (CSFs), porexemplo, M-CSF, GM-CSF, e G-CSF; interleucinas (ILs), por exemplo, IL-I a IL-15;superóxido dismutase; receptores de célula T; proteínas de superfície de membrana; fatorde aceleração de decaimento; antígeno viral tal como, por exemplo, uma porção doenvelope do vírus da AIDS; proteínas de transporte; receptores de redirecionamento; eproteínas reguladoras.
Como aqui usado, os termos "meio de cultura de células" e "meio decultura" se referem a uma solução nutriente utilizada para o crescimento de células demamíferos que tipicamente fornecem pelo menos um componente de uma ou mais dasseguintes categorias: 1) uma fonte de energia, usualmente na forma de um carboidrato talcomo, por exemplo, glicose; 2) um ou mais de todos os aminoácidos essenciais, eusualmente o conjunto básico de vinte aminoácidos mais cisteína; 3) vitaminas e/ou outroscompostos orgânicos requeridos em baixas concentrações; 4) ácidos graxos livres; e 5)elementos traço, onde elementos traço são definidos como compostos inorgânicos ouelementos de ocorrência natural que são tipicamente requeridos em concentrações muitobaixas, usualmente na faixa de micromolar. A solução nutriente pode opcionalmente sersuplementada com componentes adicionais para otimizar o crescimento celular.
A cultura de células de mamíferos da presente invenção é preparada nummeio adequado para a célula em particular que está sendo cultivada. Meios de cultura decélula adequados que podem ser utilizados para o cultivo de um tipo particular de célulasão aparentes para qualquer pessoa versada na arte. Meios de cultura de exemplocomercialmente disponíveis, por exemplo, meio Ham FlO (SIGMA), Meio EssencialMínimo (MEM, SIGMA), RPMI-1640 (SIGMA), e meio "Eagle" Modificado porDulbecco (DMEM, SIGMA). Qualquer destes ou outros meios adequados podem sesuplementados conforme a necessidade com hormônios e/ou outros fatores de crescimento(tais como insulina, transferina, ou fator de crescimento epidérmico), sais (tais comocloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tal como HEPES), nucleosídeos(tais como adenosina e timidina), antibióticos (tal como Gentamicina™), elementos traços(definidos como compostos inorgânicos usualmente presentes em concentrações finais nafaixa de micromolar) lipídios (tais como linoléico ou outros ácidos graxos) e seuscarreadores adequados, e glicose ou uma fonte de energia equivalente, e/ou modificadocomo aqui descrito para facilitar a produção de glicoproteínas recombinantes queapresentam baixo teor de manose. Numa realização particular, o meio de cultura decélulas é isento de soro.
Em algumas realizações, um meio de cultura de células é otimizado demodo a modular (por exemplo, reduzir) o alto teor de manose de uma glicoproteínarecombinante expressa por uma célula hospedeira cultivada em tal meio. Numa realizaçãoparticular, a célula hospedeira de mamífero é uma célula CHO e um meio adequadocontém um componente basal do meio tal como uma formulação básica DMEM/HAM Ε-12 com concentrações modificadas de um ou mais componentes tais como, por exemplo,aminoácidos, sais, açúcares, peptonas e vitaminas, de modo a modular (por exemplo,reduzir) o alto teor de manose de uma glicoproteína recombinante expressa por uma célulaCHO cultivada em tal meio.
O termo "fase de crescimento" de uma cultura de células se refere aoperíodo de crescimento celular exponencial (isto é, a fase log) onde as células estãogeralmente se dividindo rapidamente. As células são mantidas na fase de crescimento porum período de cerca de um dia, ou cerca de dois dias, ou cerca de três dias, ou cerca dequatro dias, ou mais do que quatro dias. O tempo de duração no qual as células sãomantidas na fase de crescimento variará com base no tipo de célula e velocidade decrescimento das células e as condições de cultivo, por exemplo.
O termo "fase de transição" se refere a um período de tempo entre a fase decrescimento e a fase de produção. Geralmente, a fase de transição é o tempo durante oqual as condições de cultivo podem ser controladas para sustentar uma mudança da fase decrescimento para a fase de produção. Vários parâmetros de cultura de células que podemser controlados incluem mas não se limitam a, um ou mais de, temperatura, osmolalidade,vitaminas, aminoácidos, açúcares, peptonas, amônio e sais.
O termo "fase de produção" de uma cultura se refere ao período de tempoem que o crescimento celular estacionou. O crescimento celular logarítmico tipicamentetermina antes ou durante esta fase e a produção de proteína se inicia. É desejávelsuplementar o meio de cultura de células de modo a alcançar a produção desejada deproteína neste estágio.
Os termos "célula hospedeira de mamífero", "célula hospedeira" e "célulade mamífero" se referem a linhagens de células derivadas de mamíferos que são capazesde crescer e sobreviver quando colocadas tanto numa cultura monocamada quanto numacultura em suspensão num meio contendo nutrientes e fatores de crescimento apropriados.Tipicamente, tais células são capazes de expressar e secretar grandes quantidades de umaglicoproteína em particular de interesse no meio de cultura. Exemplos de célulashospedeiras adequadas de mamíferos incluem, mas não estão limitados a, células de ováriode hamster chinês/-DHFR (Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:4216(1980)); células dp 12CHO (EP 307247); linhagem CVl de rim de macaco transformadopelo SV40 (ATCC CRL 1651); linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293subclonadas por crescimento em cultura em suspensão) (Graham et ai. J. Gen Virol.,36:59 (1977)); células de rim de filhote de hamster (ATCC CCL 10); células de Sertolide camundongo (TM4) (Mather, Bibl. Reprod., 23:243-251 (1980)); células de rim demacaco (ATCC CCL 70); células de rim do macaco verde africano (VERO-76) (ATCCCRL-1587); células de carcinoma cervical humanas (HeLa) (ATCC CCL 2); células derim canino (MDCK) (ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A) (ATCCCRL 1442); células de pulmão humano (W138) (ATCC CCL 75); células de fígadohumano (Hep G2 HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCCCCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); célulasMRC 5; células FS4; e uma linha de hepatoma humano (Hep G2).
O termo "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente "célulahospedeira"), como aqui usado, é pretendido para se referir a uma célula em que um vetorde expressão recombinante foi introduzido. Deve-se compreender que tais termos sãopretendidos para se referir não apenas a célula em questão mas a progênie de tal célula.Porque algumas modificações podem ocorrer nas gerações sucessoras devida tanto àmutação ou influências ambientais, tal progênie pode não, de fato, ser idêntica a célulaparental, mas estão ainda incluídas dentro do escopo do termo "células hospedeiras",como aqui usado.
O termo "expressão", "expresso" e "expressos" geralmente se referem àtranscrição e tradução que ocorre dentro de uma célula hospedeira. O nível de expressãode produto de gene numa célula hospedeira pode ser determinado com base tanto naquantidade de mRNA correspondente que está presente na célula ou a quantidade daproteína codificada pelo gene. Por exemplo, o m-RNA transcrito de um gene de produtopode ser quantificado por hibridização northern. (Sanbrook et al., "Molecular Cloning: ALaboratory Manual", pp. 7.3-7.57, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Umaproteína codificada por um gene pode ser quantificada tanto pelo ensaio para a atividadebiológica da proteína ou pelo emprego de ensaios que são independentes de tal atividade,tal como, por exemplo, análise de western blotting ou radioimunoensaio utilizandoanticorpos que são capazes de reagir com a proteína. (Sanbrook et al., "MolecularCloning: A Laboratory Manual", pp. 18.1-18.88, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)). Em algumas realizações, os termos "expressão", "expresso" e "expressos" sãousados em referência a uma proteína recombinante que apresenta um baixo teor de manoseproduzido por um método da invenção.
Os termos "baixa manose" e "baixo teor de manose", como aqui usado, serefere a uma composição de glicoproteína, onde não mais do que cerca de 10% dacomposição compreende glicoproteínas que possuem mais do que 4 resíduos de manose,isto é, espécies M5 ou mais. Ao contrário, "alto teor de manose" se refere a umacomposição de glicoproteína onde mais do que cerca de 10% da composição compreendeglicoproteínas que possuem mais do que 4 resíduos de manose. Os termos "baixa manose"e "baixo teor de manose", são também usados em referência a uma composição deglicoproteína que inclui mais do que cerca de 90%, ou mais do que cerca de 95% dacomposição que possui glicoproteínas incluindo 4 ou menos de 4 resíduos de manose.
O termo "uma glicoproteína que possui baixo teor de manose" é usado emreferência a uma composição de glicoproteína recombinante, que quando produzida pelocultivo de uma célula hospedeira inclui, mas não se limita a, não mais do que cerca de4%, não mais do que cerca de 5%, não mais do que entre cerca de 4% e cerca de 5% nãomais do que cerca de 6%, não mais do que entre cerca de 5% e 6%, não mais do quecerca de 7%, não mais do que entre cerca de 6% e 7%, não mais do que cerca de 8%, nãomais do que entre cerca de 7% e 8%, não mais do que cerca de 9%, não mais do queentre cerca de 8% e 9%, não mais do que cerca de 10%, ou não mais do que entre cercade 9% e 10% das glicoproteínas na composição que apresenta mais do que 4 resíduos demanose (isto é, espécies M5 ou mais). Conseqüentemente, o termo "uma glicoproteínaque possui baixo teor de manose" se refere a uma composição de glicoproteínarecombinante, que quando produzida pelo cultivo de uma célula hospedeira, inclui mais doque cerca de 90%, mais do que cerca de 95% das glicoproteínas na composição queapresenta 4 ou menos de 4 resíduos de manose (isto é, 0-4 resíduos de manose).
O alto teor de manose pode ser medido por um ou mais métodos bemconhecidos na arte, por exemplo, como descrito por Wuhrer et al. ("Journal ofChromatography" B Vol. 825:124-133, 2005) e Dell et al. (Science Vol. 291:2351-2356),e aqueles descritos aqui incluindo, por exemplo, o método analítico para mapeamento deN-Glicano de glicoproteínas. Resumidamente, os N-glicanos são removidosenzimaticamente das glicoproteínas recombinantes, tal como um anticorpo monoclonalrecombinante,e marcados com um marcador fluorescente (2-aminobenzamida) no terminalredutor. Os N-glicanos fluorescentes são separados por cromatografia de troca aniônicaem pH alto (HPAEC), e detectados utilizando detecção de fluorescência. A separação deN-glicanos neutros é geralmente baseada no aumento da complexidade nas estruturas deN-glicano. A separação dos N-glicanos carregados é baseada no número e tipo de ácidosiálico, sulfato, ou outras modificações presentes a partir das quais um número de cargapode ser derivado. Estes perfis de glicanos de amostras de teste são comparadosvisualmente a um padrão apropriado.
O alto teor de manose também pode ser medido utilizando um métodoinstantâneo aqui revelado: um método de alta produtividade para detectar e/ou quantificaro alto teor de manose de uma glicoproteína, incluindo mas não limitando a, anticorpo oufragmentos deste, por exemplo, fragmentos de Fab, proteínas de fusão que compreendemfragmentos Fc e anticorpo quando expressos em células hospedeiras eucarióticas.Anticorpos tipicamente possuem um único glicano N-Iigado na região Fe. Por causa daestrutura parcialmente escondida do glicano, este é freqüentemente apenas parcialmenteprocessado, resultando num excesso de alta manose e tipos híbridos. A seleção de clones,mutação de células ou outras manipulações genéticas, ou manipulação de cultura decélulas pode alterar os tipos de glicanos produzidos pelas células. Grandes números decondições/células são explorados, assim muitos estes de glicano são requeridos durante avarredura. O mapeamento tradicional de glicano é lento e de intensivo trabalho,requerendo múltiplos dias. O ensaio de glicano alta manose/híbrido da presente invençãofornece razões entre tipos de glicanos muito mais rápido com muito menos esforço dooperador.
Em particular, a invenção fornece um método para detectar e/ou quantificaro alto teor de manose de uma glicoproteína numa amostra ou uma composição quecompreende a dita glicoproteína, o dito método compreende submeter a amostra oucomposição que compreende a glicoproteína a uma digestão com endoglicosidase,reduzindo as glicoproteínas digeridas utilizando um agente redutor (se requerido), eseparando as glicoproteínas digeridas pela eletroforese desnaturante de tal forma que arazão entre glicanos tipo alta manose/híbrido é determinada pela subtração da fração dacadeia pesada não glicosilada (fração do pico sem tratamento com endoglicosidase) apartir da fração da cadeia pesada de-glicosilada (pico seguinte a digestão comendoglicosidase). A fração da cadeia pesada não glicosilada ou fração do pico semtratamento com endoglicosidase é gerada submetendo a mesma amostra ou composição asmesmas condições de digestão exceto que nenhuma endoglicosidase está presente. Estaetapa pode ser realizada simultaneamente com ou separadamente da etapa de digestão comendoglicosidase.
Qualquer endoglicosidase que seletivamente clive glicanos de alta manose ehíbridos entre GlcNAc 1 e GlcNAc2 no centro do glicano (ou gere pequenos glicanos naproteína), enquanto deixa os glicanos N-Iigados complexos intactos podem ser usadosnesta invenção. Para o propósito de quantificação, a endoglicosidase não deve estar emquantidades limitantes. A condição específica para realizar a digestão comendoglicosidase, incluindo a concentração da enzima, a temperatura de incubação e otempo de digestão, depende do tipo de endoglicosidase usada. Exemplos deendoglicosidases relacionadas a esta invenção incluem mas não se limitam aendoglicosidase H e endoglicosidase Fl. Numa realização da presente invenção, a amostracompreende as glicoproteínas é tratada com endoglicosidase H a 370C por cerca de 2horas, reduzidas com β-mercaptoetanol, e submetida a análise CE-SDS.
Exemplos de métodos para separar as glicoproteínas de-glicosiladas, porexemplo, anticorpo de-glicosilado, a partir de glicoproteínas glicosiladas, por exemplo,anticorpo glicosilado, incluem mas não se limitam aos dois seguintes métodos:
1) CE-SDS sob condições redutoras. A glicoproteína glicosilada, porexemplo, um anticorpo, é desnaturada com SDS e um agente redutor e a cadeia pesada(CP) desta com o glicano é separada da CP clivada (CP deglicosilada) por eletroforese-SDS por capilaridade (CE-SDS). Um eletroforegrama é gerado do sinal de UV. As áreassob os picos são proporcionais as quantidades relativas. Deste modo, a quantidade dostipos alta manose/híbrido é determinada a partir da fração que elui na primeira posição deCP deglicosilada. Uma vez que GlcNAc-CP co-migra com a CP deglicosilada, a % de CPdeglicosilada a partir de uma amostra não digerida é subtraída do pré-pico de uma amostradigerida para gerar o valor de % de alta manose. A separação requer 15-30 minutos,
dependendo da configuração.
2) CE-SDS microfluídico-baseado. A glicoproteína é desnaturada como em1) mas separada utilizando um instrumento "laboratório em pastilha", tal como o LC90 da"Caliper". O mesmo princípio é usado no ensaio e na separação, embora um corantefluorescente seja usado para detectar a proteína. O tempo de separação é reduzido a cercade 30 segundos por ensaio e a amostra pode ser tomada de uma placa microtituladora.
O método da presente invenção como descrito acima pode ser realizado naproteína purificada mas também nas amostras de cultura bruta de células. Com anticorposrecombinantes, o sinal é forte suficiente tal que a purificação não é requerida.
Em algumas realizações, glicoproteínas que possuem mais de 4 resíduos de
manose incluem glicoproteínas que possuem de 5 a 9 resíduos de manose (isto é, espéciesM5-M9). Sem desejar estar associado a uma teoria em particular, um técnico versado naarte compreenderá que uma composição de glicoproteína expressa por uma célulahospedeira inclui glicoproteínas com variado número de resíduos de manose. Porexemplo, as glicoproteínas de baixo teor de manose possuem 4 ou menos de 4 resíduos demanose (por exemplo, 0-4 resíduos de manose), e glicoproteínas de alto teor de manosepossuem mais de 4 resíduos de manose (por exemplo, espécies M5 ou mais).
Numa realização particular da invenção, uma glicoproteína que possui baixoteor de manose é um anticorpo recombinante ou um fragmento antígeno-ligante deste.
Numa outra realização particular da invenção, uma glicoproteína recombinante queapresenta baixo teor de manose é um anticorpo monoclonal humano que liga IL-15 ou umfragmento antígeno-ligante deste.
O termo "substancialmente isento", como aqui usado, geralmente se referea preparações de um meio de cultura de células que é isento ou possui uma quantidadereduzida (isto é, relativa ao meio de cultura não modificado) de alguns componentes. Porexemplo, numa realização, o meio de cultura usado para produzir glicoproteínasrecombinantes que possuem baixo teor de manose, é substancialmente isento de algunsaminoácidos (por exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados do grupo que consistede alanina, arginina, ácido aspártico e ácido glutâmico). Em algumas realizações, ummeio de cultura substancialmente isento de um ou mais componentes é modificado paraincluir menos de cerca de 1%, ou menos de cerca de 3%, ou menos de cerca de 5%, oumenos de cerca de 10% de um ou mais de tais componentes em relação ao meio de culturanão modificado.
Os termos "IL-15", "antígeno IL-15" e "interleucina IL-15" são aquiusados intercambiavelmente, e incluem qualquer variante ou isoforma que sejamnaturalmente expressas pelas células.
O termo "anticorpo", como aqui referido inclui todos os anticorpos equalquer fragmento antígeno-ligante (isto é, "porção antígeno-ligante") ou cadeia simplesdeste. Um "anticorpo" se refere a uma glicoproteína que compreende pelo menos duascadeias pesadas (P) e duas cadeias leves (L) inter-conectadas por pontes dissulfeto, ou umaporção antígeno-ligante deste. Cada cadeia pesada compreende uma região variável dacadeia pesada (aqui abreviada como Vp) e uma região constante da cadeia pesada. Aregião constante da cadeia pesada compreende três domínios, CPI, CP2 e CP3. Cadacadeia leve compreende uma região variável da cadeia leve (aqui abreviada como Vl) euma região constante da cadeia leve. A região constante da cadeia leve compreende umdomínio, CL. As regiões Vp e Vl ainda podem ser subdivididas em regiões dehipervariabilidade, chamadas regiões determinantes de complementaridade (RDC),intercaladas com regiões que são mais conservadas, chamadas regiões estruturais (RE).Cada Vp e Vl é composto de três RDCs e REs, dispostas do amino-terminal para ocarboxi-terminal na seguinte ordem: REI, RDC1, RE2, RDC2, RE3, RDC3, RE4. Asregiões variáveis das cadeias pesada e leve contêm um domínio ligante que interage comum antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação daimunoglobulina com os tecidos ou fatores hospedeiros, incluindo várias células do sistemaimune (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistemacomplementar clássico.
Os termos "porção antígeno-ligante" e "fragmento antígeno-ligante" de umanticorpo (ou simplesmente "porção de anticorpo"), como aqui usados, se referem a umou mais fragmentos de um anticorpo que seletivamente se liga a um antígeno (porexemplo, IL-15). Tem sido mostrado que a função do antígeno-ligante de um anticorpopode ser realizada pelos fragmentos de um anticorpo de comprimento completo. Exemplosde fragmentos de antígeno-ligante englobados pelo termo "porção antígeno-ligante" de umanticorpo inclui (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste dosdomínios Vl, Vp, CL e CPI; (ii) um fragmento F9ab)2, um fragmento bivalente quecompreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região articulada;(iii) um fragmento Fd que consiste dos domínios Vp e CPI; (iv) um fragmento Fv queconsiste dos domínios Vl e Vp de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAb(Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)), que consiste de um domínio Vp; e (vi) umaregião determinante de complementaridade isolado (RDC) ou (vii) uma combinação dedois ou mais RDCs isolados que podem opcionalmente ser unidos por um ligante sintético.
Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, Vl e Vp, sejam codificados porgenes separados, utilizando métodos recombinantes, com um ligante sintético que ospossibilite de serem produzidos como uma cadeia protéica única em que as regiões Vl eVp formem um par para produzir moléculas monovalentes (conhecidas como cadeia únicaFv (scFv); ver por exemplo, Bird et al. Science 242:423-426 (1988); e Huston et al.,Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883 (1988). Tais anticorpos de cadeia única sãotambém pretendidos ser englobados pelos termos "porção antígeno-ligante" e "fragmentoantígeno-ligante" de um anticorpo. Estes fragmentos de anticorpo são obtidos utilizando-setécnicas convencionais conhecidas por aqueles com habilidade na arte, e os fragmentos sãoselecionados por sua utilidade, da mesma maneira como quando estão nos anticorposintactos.
O termo "anticorpo monoclonal" como aqui usado, se refere a um anticorpoque apresenta uma especificidade e afinidade de ligação única e por um epitopo.Conseqüentemente, o termo "anticorpo monoclonal humano" se refere a um anticorpo queapresenta uma especificidade de ligação única e que possui regiões variáveis e constantesderivadas das seqüências de imunoglobulina de linha germinal humana. Numa realização,os anticorpos monoclonais humanos são produzidos por um hibridoma que inclui umacélula-B obtida a partir de um animal transgênico não humano, por exemplo, umcamundongo transgênico, que possui um genoma compreendendo uma cadeia pesa humanatransgênica e uma cadeia leve transgênica fundidas numa célula imortalizada.
O termo "anticorpo humano recombinante", como aqui usado, inclui todosos anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meiosrecombinantes, tal como (a) anticorpos isolados de um animal (por exemplo, umcamundongo) que é transgênico ou transcromossomal para os genes de imunoglobulinahumana ou um hibridoma preparado a partir destes, (b) anticorpos isolados de uma célulahospedeira transformada para expressar o anticorpo, por exemplo, de um transfectoma,(c) anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpos humanos combinatórios,recombinantes, e (d) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualqueroutro meio que envolve unir seqüências do gene da imunoglobulina humana a outrasseqüências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes possuem regiões variáveis econstantes derivadas das seqüências de imunoglobulina de linha germinal humana. Emalgumas realizações, contudo, tais anticorpos humanos recombinantes podem sersubmetidos a mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico com as seqüênciasde Ig humana é usado em mutagênese somática in vivo) e assim as seqüências deaminoácidos das regiões Vp e Vl dos anticorpos recombinantes são seqüências que,enquanto derivadas de e relacionada às seqüências Vp e Vl da linha germinal humana,podem não existir naturalmente dentro do repertório de linha germinal do anticorpohumano in vivo.
Como aqui usado, um "anticorpo heterólogo" é definido em relação aoorganismo transgênico não humano que produz tal anticorpo. Este termo se refere a umanticorpo que possui uma seqüência de aminoácidos ou uma seqüência de ácidos nucléicoscodificantes correspondentes àqueles encontrados num organismo que não consiste doanimal transgênico não humano, e geralmente de uma espécie diferente da do animal
transgênico não humano.
Um "anticorpo isolado", como aqui usado, se refere a um anticorpo que ésubstancialmente isento de outros anticorpos que apresentem especificidades antigênicasdiferentes (por exemplo, um anticorpo isolado que especificamente se liga a IL-15 ésubstancialmente isento de anticorpos que especificamente se liguem a outros antígenosque não IL-15). Um anticorpo isolado que se liga especificamente a um epitopo de IL-15pode, contudo, apresentar reatividade cruzada com outras citocinas relacionadas ou outrasproteínas IL-15 de espécies diferentes. Contudo, o anticorpo preferivelmente sempre seliga a IL-15 humana. Adicionalmente, um anticorpo isolado é tipicamentesubstancialmente isento de outro material celular e/ou químico. Numa realizaçãoparticular, uma combinação de anticorpos monoclonais "isolados" que apresentamdiferentes especificidades por IL-15 são combinados numa composição bem definida.
Como aqui usado, "ligação específica", "ligação seletiva" e "ligar-seseletivamente", se refere a um anticorpo ou um fragmento deste, que se liga a umantígeno predeterminado. Por exemplo, numa realização, o anticorpo se liga com umaafinidade (Kd) aproximadamente menor que IO"7 M, tal como aproximadamente menor doque IO 8 M, IO 9 M ou IO"10 M ou mesmo menor quando determinado pela tecnologia deressonância de plásmon de superfície (SPR) num instrumento BIACORE 3000 que utilizaIL-15 humana recombinante como o analito e o anticorpo como o ligante, e se liga a umantígeno predeterminado com uma afinidade que é no mínimo duas vezes maior do quesua afinidade para se ligar a um antígeno não-específico (por exemplo, BSA, caseína)diferente daquele antígeno predeterminado ou um antígeno proximamente relacionado. Asfrases "um anticorpo que reconhece um antígeno" e "um anticorpo específico para umantígeno" são aqui usadas intercambiavelmente com o termo "um anticorpo que se ligaseletivamente a um antígeno".
O termo "Kd", como aqui usado, é pretendido para se referir a constante deequilíbrio de dissociação de uma interação particular anticorpo-antígeno.
Como aqui usado, "isotipo" se refere às classes de anticorpos (porexemplo, IgM ou IgGI) que é codificado pelos genes da região constante da cadeia pesada.
Como aqui usado, "isotipo de troca" se refere ao fenômeno pelo qual aclasse, ou isotipo de um anticorpo muda de uma classe Ig para uma outra classe Ig.
Como aqui usado, "isotipo não trocado" se refere à classe isotípica decadeia pesada que é produzida quando não há ocorrência de isotipo de troca; o gene daCP que codifica o isotipo não trocado é tipicamente o primeiro gene CP imediatamente ajusante do gene VDJ funcionalmente rearranjado. Os isotipos de troca foram classificadoscomo isotipo de troca clássico e não-clássico. O isotipo de troca clássico corre peloseventos de recombinação que envolvem pelo menos uma região de seqüência de troca notransgênico. O isotipo de troca não-clássico pode ocorrer pela, por exemplo,recombinação homóloga entre σμ humano e Σμ (deleção δ-associada). Mecanismosalternativos de troca não-clássica, tais como recombinação intertransgênica e/ouintercromossomal, entre outros, podem ocorrer e efetivar o isotipo de troca.
Como aqui usado, o termo "seqüência de troca" se refere àquelasseqüências de DNA responsáveis pela recombinação de troca. Uma seqüência "doadora detroca", tipicamente uma região de troca μ, será 5' (isto é, a montante) da regiãoconstruída para ser deletada durante a recombinação de troca. A região "aceptora detroca" ficará entre a região construída a ser deletada e a região constante de substituição(isto é, γ, ε, etc.)· Como não há sítio específico onde a recombinação sempre ocorre, aseqüência de genes final não será tipicamente previsível a partir do construído.
Como aqui usado, "padrão de glicosilação" é definido como o padrão deunidades de carboidratos que são covalentemente ligados a uma proteína, maisespecificamente a uma proteína imunoglobulina. Um padrão de glicosilação de umanticorpo heterólogo pode ser caracterizado como sendo substancialmente similar aospadrões de glicosilação que ocorrem naturalmente nos anticorpos produzidos pelasespécies de animais transgênicos não humanos, quando um técnico versado na artereconheceria o padrão de glicosilação do anticorpo heterólogo como sendo mais similar aodito padrão de glicosilação nas espécies do animal transgênico não humano do que nasespécies a partir das quais os genes CP do transgênico foram derivados.
O termo, "ocorrência natural" como aqui usado como aplicado a um objetose refere ao fato do objeto poder ser encontrado na natureza. Por exemplo, uma seqüênciapolipeptídica ou polinucleotídica que está presente num organismo (incluindo os vírus) quepodem ser isoladas de uma fonte natural e que não foram intencionalmente modificadospelo homem no laboratório é de ocorrência natural.
O termo "rearranjado" como aqui usado se refere a uma configuração deum lócus da imunoglobulina de cadeia pesada ou cadeia leve em que um segmento V éposicionado imediatamente adjacente a um segmento D-J ou J numa conformação quecodifica essencialmente um domínio completo Vp ou Vl, respectivamente. Um lócus degene de imunoglobulina rearranjado pode ser identificado por comparação com o DNA dalinha germinal; um lócus rearranjado terá pelo menos um elemento de homologiaheptâmero/nonâmero recombinado.
O termo "não rearranjado" ou "configura de linha germinal" como aquiusado em referência a um segmento V se refere à configuração em que o segmento V nãoé recombinado de modo a ser imediatamente adjacente a um segmento D ou J.
O termo "molécula de ácido nucléico", como aqui usado, se refere àsmoléculas de DNA e RNA. Uma molécula de ácido nucléico pode ser de fita simples oufita dupla, mas preferivelmente é um DNA de fita dupla.
O termo "molécula de ácido nucléico isolada", como aqui usado emreferência aos ácidos nucléicos que codificam anticorpos ou porções de anticorpos (porexemplo, Vp, Vl, RDC3) que seletivamente se ligam a IL-15, se refere a uma molécula deácido nucléico em que as seqüências de nucleotídeos que codificam o anticorpo ou aporção do anticorpo são isentas de outras seqüências nucleotídicas que codificamanticorpos ou porções de anticorpos que se ligam a antígenos diferentes de IL-15, cujasoutras seqüências podem naturalmente flanquear o ácido nucléico no DNA genômicohumano. SEQ ID Nos: 1-4 correspodem as seqüências de aminoácidos e nucleotídeos quecompreendem as regiões variáveis da cadeia pesada (Vp) e a cadeia leve (Vl) de umanticorpo anti-IL-15 humano. Em particular, SEQ ID Nos: 1 e 2 correspondem à Vp doanticorpo e SEQ ID Nos: 3 e 4 correspondem à Vl do anticorpo.
Numa realização particular, um anticorpo monoclonal humano que liga IL-15, ou um fragmento de antígeno ligante deste, inclui uma região variável de cadeia leveque compreende uma ou mais e preferivelmente todas três RDCs estabelecidas nas SEQID Nos: 8-10 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma ou mais epreferivelmente todas três RDCs estabelecidas nas SEQ ID Nos: 5-7.
Numa realização particular, a presente invenção também engloba"modificações de seqüências conservativas" ou "substituição de seqüências conservativas"das seqüências estabelecidas em SEQ ID Nos: 1-10, isto é, modificações nas seqüênciasde aminoácidos e de nucleotídeos que não afetam ou alteram significativamente ascaracterísticas de ligação do anticorpo codificado pela seqüência nucleotídica ou quecontém a seqüência de aminoácidos. Tais modificações das seqüências conservativasincluem substituições, adições e deleções de nucleotídeos e aminoácidos. Modificaçõespodem ser introduzidas nas SEQ ID Nos: 1-10 por técnicas padrões conhecida na arte, talcomo matagênese sítio direcionada e mutagênese PCR-mediada. As substituiões deaminoácidos conservativos incluem aqueles que o resíduo de aminoácido é substituído porum resíduo de aminoácido que possui uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos deaminoácidos que possuem cadeias laterais similares foram definidas no estado da arte.Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina,arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácidoglutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina,glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais apolares (porexemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina,fenilalanina, triptofano, histidina). Assim, um resíduo de aminoácido não essencialprevisto num anticorpo anti-IL-15 humano é preferivelmente substituído por um outroresíduo de aminoácido da mesma família de cadeia lateral.
Alternativamente, numa outra realização, mutações podem ser introduzidasrandomicamente ao longo de todo ou parte da seqüência codificadora do anticorpo anti-IL-15, tal como por mutagênese de saturação, e os anticorpos modificados anti-IL-15resultantes podem ser selecionado pela atividade de ligação.
Conseqüentemente, anticorpos codificados pela (região variável da cadeiapesada e leve) seqüências de nucleotídeos aqui revelados e/ou que contém as (regiãovariável da cadeia pesada e leve) seqüências de aminoácidos aqui reveladas (isto é, SEQID Nos: 1-4) incluem substancialmente anticorpos similares codificados por ou contendoseqüências similares que foram conservativamente modificadas. Além disso, a discussãode como tais anticorpos substancialmente similares podem ser gerados com base nasseqüências parciais aqui reveladas como SEQ ID Nos: 1-4 é abaixo fornecida.
Para ácidos nucléicos, o termo "substancial homologia" indica que doisácidos nucléicos, ou seqüências projetadas destes, quando otimamente alinhadas ecomparadas, são idênticas, com inserções ou deleções apropriadas de nucleotídeos, empelo menos cerca de 80% dos nucleotídeos, normalmente pelo menos cerca de 90% a95%, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 98% a 99,5% dos nucleotídeos.
Alternativamente, substancial homologia existe quando os segmentos hibridizam sobcondições seletivas de hibridização, com a fita complementar.
Para seqüências de aminoácidos, o termo "homologia" indica o grau deidentidade entre duas seqüências de aminoácidos quando otimamente alinhadas ecomparadas com inserções ou deleções apropriadas.
O percentual de identidade entre duas seqüências é uma função do númerode posições idênticas compartilhadas pelas seqüências (isto é, % homologia = # deposições idênticas/# total de posições χ 100) considerando o número de espaços, e ocomprimento de cada espaço, que necessita ser introduzido para o perfeito alinhamentodas duas seqüências. A comparação das seqüências e determinação da porcentagem deidentidade entre duas seqüências pode ser acompanhada utilizando um algoritmomatemático.
A porcentagem de identidade entre duas seqüências nucleotídicas pode serdeterminada utilizando o programa GAP do pacote de software GCG (disponível emhttp://www.gcg.com), utilizando uma matriz NWSgapdna.CMP e um peso de gap de 40,50, 60, 70 ou 80 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6. O percentual deidentidade entre duas seqüências nucleotídicas ou de aminoácidos também pode serdeterminada usando-se o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989))que foi incorporado pelo programa ALIGN (versão 2.0), que utiliza uma tabela de peso deresíduo PAM120, uma penalidade de comprimento de espaço de 12 e uma penalidade deespaço de 4. Adicionalmente, a porcentagem de identidade entre duas seqüências deaminoácidos pode ser determinada usando-se o algoritmo de Needleman e Wunsch (J.Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)) que foi incorporado no programa GAP no pacote desoftware GCG (disponível em http://www.gcg.com), utilizando tanto uma matriz Blossum62 quanto uma matriz PAM250, e um peso de gap de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um pesode comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6.
As seqüências de ácido nucléico e proteína da presente invenção aindapodem ser utilizadas como uma "seqüência de consulta" para realizar uma busca em basesde dados públicas para, por exemplo, identificar seqüências relacionadas. Tais buscaspodem ser realizadas usando-se os programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) deAltschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10 (1990). As buscas de nucleotídeos BLASTpodem ser realizadas com o programa NBLAST, pontuação = 100, comprimento dapalavra = 12 para se obter seqüências nucleotídicas homólogas as moléculas de ácidonucléico da invenção. As busca de proteínas BLAST podem ser realizadas com oprograma XBLAST, pontuação = 50, comprimento da palavra = , 3 para se obterseqüências de aminoácidos homólogas as moléculas de proteína da invenção. Para se obteros alinhamentos dos espaços para o propósito de comparação, o "Gapped BLAST" podeser utilizado como descrito por Altschul, et al. Nucleic Acids Realizações. 25(17):3389-3402 (1997).Quando se utiliza os programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetrospadrões dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) pode ser usado.
(Ver http: //www. ncbi. nlm. nih. gov).
Os ácidos nucléicos podem estar presentes em células íntegras, num lisadode células, ou numa forma parcialmente purificada ou substancialmente pura. Um ácidonucléico é "isolado" ou "substancialmente puro" quando purificado dos outroscomponentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nucléicos ouproteínas celulares, por técnicas padrões, incluindo tratamento alcalino/SDS, faixas deCsCl, cromatografia em coluna, eletroforese em gel de agarose e outras bem conhecidasna arte. Ver, F. Ausubel, et al., ed. "Current Protocols in Molecular Biology", Greene
Publishing and Wiley Interscience, New York (1987).
As composições de ácidos nucléicos da presente invenção, enquantofreqüentemente numa seqüência nativa (exceto para os sítios de restrição modificados esimilares), tanto do cDNA, DNA genômico ou misturas destes, podem ser modificadas,de acordo com técnicas padrões para fornecer seqüências de genes. Para seqüênciacodificantes, estas mutações, podem afetar a seqüência de aminoácido como desejado.Particularmente, as seqüências de DNA substancialmente homólogas ou derivadas dasseqüências V, D, J, constantes, de troca e outras aqui descritas são contempladas (onde"derivada" indica que uma seqüência é idêntica ou modificada de uma outra seqüência).
Um ácido nucléico é "operacionalmente ligado" quando este é colocadonuma relação funcional com uma outra seqüência de ácido nucléico. Por exemplo, umpromotor ou um acentuador é operacionalmente ligado a uma seqüência codificadora seesta afeta a transcrição da seqüência. Com relação as seqüências reguladoras datranscrição, operacionalmente ligadas significa que as seqüências de DNA que estãoligadas contíguas e, onde necessário para unir duas regiões codificadoras de proteína,contígua e em fita de leitura. Para as seqüências de troca, operacionalmente ligadas indicaque as seqüências são capazes de efetuar a recombinação por troca.
O termo "vetor", como aqui usado, é pretendido para se referir a umamolécula de ácido nucléico capaz de transportar um outro ácido nucléico ao qual este foiligado. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a uma volta de DNA circularde fita dupla em que os segmentos adicionais de DNA podem ser ligados. Um outro tipode vetor é um vetor viral, em que os segmentos adicionais de DNA podem ser ligados nogenoma viral. Alguns vetores são capazes de replicação autônoma numa célula hospedeiraem que estes são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos que possuem uma origemde replicação bacteriana e vetores epissomais de mamíferos). Outros vetores (porexemplo, vetores epissomais de mamíferos) podem ser integrados ao genoma de umacélula hospedeira sob a introdução na célula hospedeira, e deste modo são replicados juntocom o genoma hospedeiro. Além disso, alguns vetores são capazes de direcionar aexpressão dos genes para os quais estes estão operacionalmente ligados. Tais vetores sãoreferidos aqui como "vetores de expressão recombinantes" (ou simplesmente, "vetores deexpressão"). Em geral, vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNArecombinante estão freqüentemente na forma de plasmídeos. Na presente especificação,"plasmídeo" e "vetor" podem ser usados intercambiavelmente uma vez que plasmídeo é aforma de vetor mais comumente usada. Contudo, a presente invenção é pretendida paraincluir tais outras formas de adenovírus e vírus adeno-associados), que servem em funçõesequivalentes.
Como aqui usado, o termo "indivíduo" inclui qualquer animal humano ounão humano. Por exemplo, os métodos e composições da presente invenção podem serusados para tratar um indivíduo que apresenta uma doença inflamatória, tal como artrite,por exemplo, artrite reumatóide. O termo "animal não humano" inclui todos osvertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos,ovelhas, cães, bovinos, frangos, anfíbios, répteis, etc.
Vários aspectos da invenção são descritos em maior detalhe nas subseçõesabaixo.
II. Fatores que Afetam o Teor de Manose
(a) Osmolalidade
Vários parâmetros de cultura de células podem afetar o teor de manose deuma glicoproteína recombinante expressa em cultura de células de mamíferos. Emparticular, foi revelado por meio da presente invenção que quanto maior a osmolalidadedo meio de cultura de células, maior a porcentagem de glicoproteínas na composição quepossui mais do que 4 resíduos de manose (isto é, espécies M5 ou mais).Conseqüentemente, numa realização da presente invenção, a osmolalidade do meio decultura de células é mantida menor do que cerca de 600 mOsm/Kg para reduzir oucontrolar o teor de manose de glicoproteínas expressas (por exemplo, cerca de 250mOsm/Kg a cerca de 600 mOsm/Kg).
Para uma cultura de células de mamíferos, a osmolalidade do meio decultura de células é mantida menor do que cerca de 550 mOsm/Kg, ou menos de cerca de500 mOsm/Kg, ou menos de cerca de 450 mOsm/Kg, ou menos de cerca de 400mOsm/Kg, ou menos de cerca de 380 mOsm/Kg, ou entre cerca de 200 mOsm/Kg e cercade 600 mOsm/Kg, ou entre cerca de 250 mOsm/Kg e cerca de 550 mOsm/Kg, ou entrecerca de 250 mOsm/Kg e cerca de 500 mOsm/Kg, ou entre cerca de 250 mOsm/Kg ecerca de 450 mOsm/Kg, ou entre cerca de 250 mOsm/Kg e cerca de 400 mOsm/Kg, ouentre cerca de 250 mOsm/Kg e cerca de 400 mOsm/Kg, ou entre cerca de 250 mOsm/Kge cerca de 380 mOsm/Kg, ou entre cerca de 250 mOsm/Kg e cerca de 350 mOsm/Kg.
De modo a alcançar uma osmolalidade na faixa desejada, a concentração devários constituintes do meio de cultura podem ser ajustados. Por exemplo, os solutos quepodem ser adicionados ao meio de cultura de modo a aumentar a osmolalidade desteincluem proteínas, peptídeos, aminoácidos, proteínas animais hidrolisadas, tais comopeptonas, polímeros não metabolizáveis vitaminas, íons, sais, açúcares, metabólitos,ácidos orgânicos, lipídios, e similares. Será apreciado, contudo, que as concentrações deoutros constituintes no meio de cultura podem ser modificadas de modo a alcançar umaosmolalidade desejada.
Em outras realizações, osmolalidade pode ser ajustada nas faixas acimamencionadas pela adição de um ou mais osmoprotetores ao meio de cultura. Exemplos deosmoprotetores são bem conhecidos na arte e incluem, mas não estão limitados a, betaína,glicina, L-treonina e L-prolina, e derivados destes incluindo, mas não limitando a glicinabetaína, aldeído betaína. Numa realização particular, um meio de cultura de célulascontém betaína numa concentração de cerca de 20 mM ou mais, ou cerca de 1 mM a cercade 100 mM e mais preferencialmente cerca de 20 mM a cerca de 30 mM.
A osmolalidade pode ser medida por qualquer meio que seja bem conhecidona arte e aqueles aqui descritos. Por exemplo, um osmômetro tal como o vendido pelaFisher Scientific, Pittsburgh, PA sob o nome OSMETTE pode ser usado para medirosmolalidade de um meio de cultura de células. Alternativamente, Osmette modelo 2007(Precision Systems, Inc., Natick, MA) pode ser usado.
Em outras realizações da invenção, osmolalidade pode ser ajustada pelamodificação da concentração de um ou mais sais, açúcares, peptonas, aminoácidos eamônio no meio de cultura de células.
Ainda em outras realizações, os parâmetros acima mencionados que afetama osmolalidade podem ser combinados com a manipulação da temperatura e o tempo deduração em que as células são cultivadas para modular (por exemplo, reduzir) o teor demanose. Conseqüentemente, deve-se compreender que os vários parâmetros de cultura decélulas aqui descritos podem ser ajustados sozinhos ou em combinação para modular oteor de manose de glicoproteínas recombinantes.
(i) Concentrações de Potássio e Sódio
Nos experimentos conduzidos até a presente invenção, foi demonstrado queum aumento da concentração de (K+) no meio de cultura contribui para o alto teor demanose das glicoproteínas. Conseqüentemente, numa realização, a invenção utiliza ummeio de cultura de células que possui uma concentração de K+ de cerca de 70 mM oumenos (por exemplo, cerca de 10 mM a cerca de 50 mM).
Como acima discutido, a concentração de potássio do meio de cultura decélulas sozinha pode ser controlada ou pode ser controlada em combinação com um oumais dos outros fatores aqui descritos que afetam a osmolalidade. Numa realizaçãoparticular, o meio de cultura ainda inclui uma concentração de sódio de cerca de 200 mMou menos (por exemplo, cerca de 50 mM a cerca de 100 mM).
(ii) Aminoácidos
Outros fatores foram revelados afetar a osmolalidade do meio de cultura decélulas e/ou contribuir para o alto teor de manose de proteínas recombinantementeexpressas são a concentração e o tipo de aminoácidos no meio. Por exemplo, numarealização particular, uma duplicação da concentração de todos os 20 aminoácidos nomeio resulta num aumento no teor de manose. Conseqüentemente, numa realizaçãoparticular da presente invenção, o meio de cultura de células é ajustado para apresentaruma concentração reduzida de aminoácidos. Num meio particular, a concentração deaminoácidos é reduzida a cerca da metade.
Numa outra realização particular, o meio de cultura de células ésubstancialmente isento de um ou mais aminoácidos selecionados do grupo que consiste dealanina, arginina, ácido aspártico e ácido glutâmico.
(iii) Açúcares
Outros fatores que foram revelados afetar a osmolalidade do meio decultura de células e/ou contribuir para o alto teor de manose das proteínasrecombinantemente expressas são a concentração e o tipo de açúcares no meio. Numarealização particular, o meio de cultura de células inclui glicose numa concentração decerca de 1 mM a cerca de 90 raM.
(iv) Amônio
Um outro fator que pode afetar a osmolalidade do meio de cultura decélulas e/ou contribuir para o alto teor de manose de proteínas recombinantementeexpressas é a concentração de amônio de cerca de 30 mM ou menos (por exemplo, cercade 0 mM a cerca de 10 mM). Numa realização, a concentração de amônio é cerca de 10mM ou menos.
(v) Peptonas
Outros fatores que foram revelados afetar a osmolalidade do meio decultura de células e/ou contribuir para o alto teor de manose de proteínasrecombinantemente expressas são a concentração e o tipo de peptonas usadas no meio.
Peptonas são suplementos de meios que são produzidos a partir de proteínas animaishidrolisadas. Fontes de peptonas são bem conhecidas na arte e incluem, por exemplo,subprodutos animais, gelatinas, e materiais de plantas. Exemplos de peptonas incluem,mas não se limitam a, extrato de lêvedo, hidrolisado de lêvedo, peptona de soja,hidrolisado de soja, peptona de trigo e hidrolisado de trigo, numa concentração de cercade 0,5 g/L a cerca de 60 g/L.(vi) Vitaminas
Outros fatores que foram revelados afetar a osmolalidade do meio decultura de células e/ou contribuir para o alto teor de manose de proteínasrecombinantemente expressas são a concentração e o tipo de vitaminas usadas no meio.
Numa realização particular, o meio de cultura de células inclui uma ou mais vitaminasselecionadas do grupo que consiste de biotina, D-cálcio pantotenato, cloreto de colina,ácido fólico, i-inositol, niacinamida, piridoxal HCl, piridoxina HCl, riboflavina, taminaHCl e cianocobalamina, numa concentração de cerca de 0,00005 g/L a cerca de 0,9 g/L.
(b) Temperatura
Ainda um outro fator que foi revelado contribuir para o alto teor de manosede proteínas recombinantemente expressas é a temperatura em que a cultura de células émantida. Conseqüentemente, numa outra realização da presente invenção, a temperaturana qual as células hospedeiras são cultivadas é também ajustada sozinha ou emcombinação com os fatores acima (por exemplo, ajuste do tempo de cultivo das células efatores que afetam a osmolalidade) para modular (por exemplo, reduzir) o teor de manosede glicoproteínas recombinantemente expressas. Em algumas realizações, as célulashospedeiras são cultivadas a cerca de 31°C, ou cerca de 32°C, ou cerca de 33 °C, oucerca de 34°C, ou cerca de 35°C, ou cerca de 36°C, ou cerca de 37°C, ou cerca de38°C.
III. Procedimentos de Cultivo de Células
De acordo com os métodos da presente invenção, as células hospedeiras sãocultivada num meio que permite a expressão de glicoproteínas recombinantes que possuemum baixo teor de manose. Procedimentos e condições adequados de cultura de células sãobem conhecidos na arte. Células hospedeiras (por exemplo, células CHO e NSO) podemser cultivadas numa ampla variedade de formatos e cubas de cultivo. Por exemplo, célulashospedeiras podem ser cultivadas em formatos projetados para produção em grande escalaou pequena escala de glicoproteínas. Adicionalmente, células hospedeiras podem sercultivadas aderidas ao fundo de frascos ou placas de cultura, ou podem ficar em suspensãoem frascos agitados, biorreatores ou culturas em garrafas giratórias. Em algumasrealizações, para a produção de glicoproteínas recombinantes em quantidadescomercialmente relevantes, as células hospedeiras podem ser crescidas em biorreatores, epreferivelmente biorreatores que possuem uma capacidade de cerca de 2 litros ou mais, oucerca de 5 litros ou mais, ou cerca de 10 litros ou mais, ou cerca de 50 litros ou mais, oucerca de 100 litros ou mais, ou cerca de 500 litros ou mais, ou cerca de 1000 litros ou mais, ou cerca de 1500 litros ou mais, ou cerca de 2000 litros ou mais.
Em algumas realizações, as células hospedeiras podem ser cultivadas (porexemplo, mantidas e/ou crescidas) em meios líquidos e preferivelmente são cultivadas,tanto continuamente quanto intermitentemente, por métodos de cultivo convencionais taiscomo cultura em repouso, cultura em tubo de ensaio, cultura sob agitação (por exemplo,cultura sob agitação rotatória, cultura em frascos agitados, etc), cultura sob prato deaeração, ou fermentação. Em algumas realizações, as células hospedeiras são cultivadasem frascos agitados. Ainda em outras realizações, as células hospedeiras são cultivadasnum fermentador (por exemplo, num processo de fermentação). Os processos defermentação incluem, mas não se limitam a, métodos em batelada, batelada alimentada econtínuos de fermentação. Os termos "processo em batelada" e "fermentação embatelada" se referem a um sistema fechado em que a composição dos meios, nutrientes,aditivos suplementares e similares são estabelecidos no início da fermentação e nãosujeitos à alteração durante a fermentação; contudo, tentativas podem ser feitas paracontrolar tais fatores como pH e concentração de oxigênio para evitar a acidificaçãoexcessiva dos meios e/ou morte dos microorganismos. Os termos "processo contínuo" e"fermentação contínua" se referem a um sistema em que um meio de fermentaçãodefinido é adicionado continuamente ao fermentador e uma quantidade igual de meiousado ou "condicionado" é simultaneamente removido, por exemplo, para recuperação doproduto desejado (por exemplo, glicoproteína recombinante). Uma variedade de taisprocessos tem sido desenvolvida e são bem conhecidos no estado da técnica.
Numa realização particular, uma célula hospedeira que expressa umanticorpo monoclonal humano recombinante que liga IL-15 é crescida em garrafasrotatórias, frascos de 2 litros com prato rotatório ou um outro sistema de culturaadequado.
IV. Recuperação da GlicoproteínaSeguinte a fase de produção de polipeptídios, a glicoproteína recombinantede interesse pode ser recuperada do meio de cultura utilizando técnicas que estão bemestabelecidas na arte. A glicoproteína de interesse preferivelmente é recuperada do meiode cultura como um polipeptídio secretado, embora também possa ser recuperado dosUsados das células hospedeiras.
Em algumas realizações, o meio de cultura ou lisado é centrifugado pararemover as partículas dos debris das células. A glicoproteína depois é purificada dasproteínas solúveis e polipeptídios contaminantes utilizando um procedimento depurificação adequado. Exemplos de procedimentos de purificação incluem, mas não selimitam a, fracionamento em colunas de imunoafinidade ou troca iônica; precipitação cometanol, HPLC de fase reversa; cromatografia sobre sílica ou numa resina de trocacatiônica tal como DEAE; chromatofocusing; SDS-PAGE; precipitação com sulfato deamônio; gel filtração utilizando, por exemplo, Sephadex G-75; e colunas de Sepharoseproteína-A para remover contaminantes tais como IgG. Um inibidor de protease tal comofluoreto de fenil metil sulfonil (PMSF) também pode ser útil para inibir a degradaçãoproteolítica durante a purificação. Aquele versado na arte apreciará que os métodos depurificação adequados para a glicoproteína recombinante de interesse podem requerermodificação para conseguir as mudanças no caráter da glicoproteína expressa numacultura de células recombinantes.
Numa realização particular da presente invenção, uma glicoproteínarecombinante expressa utilizando os métodos da presente invenção é um anticorpomonoclonal humano ou um fragmento antígeno-ligante deste. Geralmente, os anticorpossão inicialmente caracterizados por ELISA. Por exemplo, placas de microtitulação podemser cobertas com antígeno purificado tal como, por exemplo, IL-15 em PBS, e entãobloqueados com proteínas irrelevantes tal como soro albumina bovina (BSA) diluída emPBS. Diluições de extratos de células cultivadas são adicionadas em cada poço e incubadaspor 1-2 horas a 37°C. As placas são lavadas com PBS/Tween 20 e então incubadas comum reagente policlonal Fc-específico de IgG de cabra-anti-humano conjugado comfosfatase alcalina por 1 hora a 37°C. Após a lavagem, as placas são desenvolvidas comsubstrato ABTS, e analisadas em D.O. de 405.Para determinar se os anticorpos produzidos pelos métodos da presenteinvenção se ligam a epitopos únicos, cada anticorpo pode ser biotinilado usando reagentescomercialmente disponíveis (Pierce, Rockford, IL). A ligação de MAb biotinilado podeser detectada com uma sonda marcadora de estreptavidina. Para determinar o isotipo dosanticorpos purificados, ELISAs dos isotipos podem ser realizados utilizando-se técnicasreconhecidas na arte. Por exemplo, poços de placas de microtitulação podem ser cobertoscom 10 μg/ml de Ig anti-humano por toda a noite a 4 °C. Após o bloqueio com BSA 5%,as placas são reagidas com 10 μg/ml de anticorpos ou controles de isotipos purificados, natemperatura ambiente por duas horas. Os poços podem então ser reagidos tanto com IgGIhumano ou sondas conjugadas com outro isotipo humano específico. Placas sãodesenvolvidas e analisadas como acima descritas.
Numa realização particular, uma glicoproteína recombinante produzidautilizando os métodos da presente invenção é um anticorpo monoclonal humano que ligaIL-15 ou um fragmento antígeno-ligante deste. Para testar a ligação dos anticorposmonoclonais de IL-15 as células vivas que expressam IL-15, citometria de fluxo pode serusada. Resumidamente, as linhagens de células e/ou PBMCs humanos que expressam IL-ligada à membrana (crescida sob condições de crescimento padrões) são misturadascom várias concentrações de anticorpos monoclonais em PBS contendo BSA 0,1% e NaN30,01% a 4°C por 1 hora. Após a lavagem, as células são reagidas com anticorpo IgG anti- humano marcado com fluoresceína sob as mesmas condições como o corante de anticorpoprimário. As amostras podem ser analisadas pelo instrumento FACScan utilizando aspropriedades de espalhamento lateral e de luz para as células simples e a ligação dosanticorpos marcados serem determinados. Um ensaio alternativo utilizando microscopia defluorescência pode ser usado (adicionalmente ou ao invés de) o ensaio de citometria de fluxo. As células podem ser coradas exatamente como acima descrito e examinadas pormicroscopia de fluorescência. Este método permite a visualização de células individuais,mas podem ter a sensibilidade diminuída dependendo da densidade do antígeno.
IgGs humanos anti-IL-15 podem ainda ser testados quanto a reatividadecom o antígeno IL-15 por Western blotting. Resumidamente, extratos de células de célulashospedeiras que expressam IL-15 podem ser preparados e submentidos a eletroforese emgel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio. Após a eletroforese, os antígenosseparados serão transferidos para as membranas de nitrocelulose, bloqueados com soro decamundongo 20%, e marcado com anticorpos monoclonais a serem testados. A ligação deIgG humano pode ser detectado utilizando IgG anti-humana fosfatase alcalina edesenvolvido com pastilhas de substrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO).
V. Composições Farmacêuticas
Num outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição, porexemplo, uma composição farmacêutica contendo uma ou uma combinação deglicoproteínas recombinantes que possuem baixo teor de manose. Numa realizaçãoparticular, a composição farmacêutica inclui pelo menos uma proteína terapêutica quepossui um baixo teor de manose tal como, por exemplo, um anticorpo terapêutico ou umfragmento antígeno-ligante deste que possui baixo teor de manose (por exemplo, umanticorpo monoclonal humano que liga IL-15 ou um fragmento antígeno-ligante deste).Numa outra realização particular, uma composição farmacêutica da presente invençãoinclui uma ou mais glicoproteínas recombinantes que possuem baixo teor de manose,formulada junto com um carreador farmaceuticamente aceitável.
Composições farmacêuticas da invenção também podem ser administradasem terapia de combinação, isto é, combinada com outros agentes. Por exemplo, a terapiapode incluir uma composição da presente invenção com pelo menos um ou mais agentesterapêuticos adicionais, tais como agentes anti-inflamatórios, quimioterápicos, e agentesde psoríase. As composições farmacêuticas da invenção também podem ser administradasem conjunto com a terapia de radiação. A co-administração com outros anticorpos, taiscomo anticorpos CD4 específicos e anticorpos IL-2 específicos, também são englobadospela invenção. Tais combinações com anticorpos CD4 específicos ou anticorpos IL-2específicos são considerados particularmente úteis no tratamento de doenças auto-imunes erejeições de transplantes.
Como aqui usado, "carreador farmaceuticamente aceitável" inclui qualquerum e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos eantifungicos, agentes isotônicos e de absorção contida, e similares que sãofisiologicamente compatíveis. Preferivelmente, o carreador é adequado para administraçãointravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinhal ou epidérmica (por exemplo,por injeção ou infusão). Dependendo da via de administração, a glicoproteínarecombinante, por exemplo, um anticorpo, molécula bi-específica e multi-específica, podeser revestido com um material para proteger o composto da ação de ácidos e outrascondições naturais que podem inativar o composto.
Um "sal farmaceuticamente aceitável" se refere a um sal que retém aatividade biológica desejada do composto parente e não confere qualquer efeitotoxicológico indesejado (ver, por exemplo, Berge, S.M., et al., J. Pharm. Sei. 66:1-19(1977)). Exemplos de tais sais incluem sais de adição ácida e sais de adição básica. Sais deadição ácida incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos não tóxicos, tais comoclorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromídrico, iodídrico, fosforoso é similares, bemcomo, de ácidos orgânicos não tóxicos tais como ácidos alifáticos mono- e dicarboxílicos,ácidos alcanóicos fenil substituídos, ácidos hidroxi-alcanóicos, ácidos aromáticos, ácidosalifáticos e aromáticos sulfônicos e similares. Sais de adição básicos incluem aquelesderivados de metais alcalinos terrosos, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio esimilares, bem como a partir de aminas orgânicas não tóxicas, tais como N, N'-dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina,etilenodiamina, procaína e similares.
Uma composição da presente invenção pode ser administrada por umavariedade de métodos conhecidos no estado da arte. Como será apreciado por aquelesversados na arte, a via e/ou modo de administração variará dependendo dos resultadosdesejados. Os compostos ativos podem ser preparados com carreadores que protegerão ocomposto contra a rápida liberação, tal como uma formulação de liberação controlada,incluindo implantes, curativos transdérmicos, e sistemas de liberação microencapsulados.Polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem ser usados, tais como etileno vinilacetato, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, e ácido polilático.Muitos métodos para a preparação de tais formulações são patentes ou geralmenteconhecidas por aqueles versados na arte. Ver, por exemplo, "Sustained and ControlledRelease Drug Delivery Systems", J.R. Robinson, ed., Mareei Dekker, Inc., New York, 1978.Para administrar um composto da invenção por algumas vias deadministração, pode ser necessário revestir o composto com, ou co-administrá-lo com, ummaterial para evitar sua inativação. Por exemplo, lipossomas, ou um diluente. Diluentesfarmaceuticamente aceitáveis incluem soluções tampões salinas e aquosas. Os lipossomasincluem emulsões água-em-óleo-em-água CGF bem como lipossomas convencionais(Strejan et al., J. Neuroimmunol. 7:27 (1984)).
Carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções aquosas estéreisou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea das soluções ou dispersõesinjetáveis estéreis. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamenteativas é conhecido na arte. Exceto enquanto como qualquer meio ou agente convencional éincompatível com o composto ativo, o uso deste nas composições farmacêuticas dainvenção é contemplado. Compostos ativos suplementares também podem serincorporados nas composições.
As composições terapêuticas tipicamente devem ser estéreis e estáveis sobas condições de fabricação e armazenagem. A composição pode ser formulada como umasolução, microemulsão, lipossoma, ou outra estrutura ordenada adequada para altaconcentração da droga. O carreador pode ser um meio solvente ou de dispersão contendo,por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietilenoglicol líquido, e similares), e misturas adequadas destes. A fluidez própria pode sermantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, para a manutençãodo tamanho de partícula requerido no caso da dispersão e pelo uso de surfatantes. Emmuitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcooistais como manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongadadas composições injetáveis pode ser trazida pela inclusão na composição de um agente queretarda a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.
Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas pela incorporação docomposto ativo na quantidade requerida num solvente apropriado com um ou umacombinação de ingredientes acima enumerados, conforme requerido, seguido pelaesterilização por microfiltração. Geralmente, as dispersões são preparadas pelaincorporação do composto ativo num veículo estéril que contém um meio de dispersãobásico e os outros ingredientes requeridos a partir daqueles acima enumerados. No caso depós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos depreparação são secagem a vácuo e crio-secagem (liofilização) que gera um pó doingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma soluçãopreviamente esterilizada por filtração desta.
Regimes de dosagens são ajustados para fornecer a resposta ótima desejada(por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, uma única pílula grande pode seradministrada, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou asdoses podem ser proporcionalmente reduzidas ou aumentadas conforme indicado pelasexigências da situação terapêutica. Por exemplo, os anticorpos humanos da invençãopodem ser administrados uma ou duas vezes semanalmente por injeção subcutânea ou umaou duas vezes mensalmente por injeção subcutânea. É especialmente vantajoso formularcomposições parenterais em formas unitárias de doses para facilitar a administração euniformidade da dosagem. Formas unitárias de doses como aqui usado se refere àsunidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos aserem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativocalculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o carreadorfarmaceuticamente requerido. A especificação para as formas unitárias de dosagem dainvenção é ditada por e diretamente dependente (a) das características únicas do compostoativo e do efeito terapêutico em particular a ser alcançado, e (b) as limitações inerentes àarte de formar uma composição de tal composto ativo para o tratamento de sensibilidadeem indivíduos.
Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1)antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, hidrocloreto de cisteína,bisulfato de sódio, metabissulfato de sódio, sulfito de sódio e similares; (2) antioxidantessolúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado (BHA),hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, gaiato de propila, alfa-tocoferol, e similares; e (3)agentes quelantes de metais, tais como ácido cítrico, ácido tetraacético etilenodiamina(EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, e similares.
Para as composições farmacêuticas, as formulações da presente invençãoincluem aquelas adequadas para administração oral, nasal, tópica (incluindo bucal esublingual), retal, vaginal e/ou parenteral. As formulações podem convenientementeserem apresentadas em forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por quaisquermétodos conhecidos na arte farmacêutica. A quantidade de ingrediente ativo que pode sercombinada com um material carreador para produzir uma forma de dosagem unitáriavariará dependendo do indivíduo a ser tratado, e o modo particular de administração. Aquantidade de ingrediente ativo que pode ser combinado com um material carreador paraproduzir uma forma de dose única será geralmente aquela quantidade da composição queproduz um efeito terapêutico. Geralmente, esta quantidade fica na faixa de cerca de 0,001por cento a cerca de noventa por cento de ingrediente ativo, preferivelmente de cerca de0,005 por cento a cerca de 70 por cento, mais preferivelmente de cerca de 0,01 por centoa cerca de 30 por cento.
Formulações da presente invenção que são adequadas para administraçãovaginal também incluem formulações de pessários, tampões, cremes, géis, pastas,espumas ou spray contendo tais carreadores como conhecidos na arte para seremapropriados. Formas de dosagem para a administração tópica ou transdérmica decomposições desta invenção incluem pós, spray, pomadas, pastas, cremes, loções, géis,soluções, curativos e inalantes. O composto ativo pode ser misturado sob condiçõesestéreis com um carreador farmaceuticamente aceitável, e com quaisquer conservantes,tampões, ou propelentes que possam ser requeridos.
As frases "administração parenteral" e "parenteralmente administrada"como aqui usado significa modos de administração diferentes da administração enteral etópica, usualmente por injeção, e inclui, sem limitação, injeção e infusão intravenosa,intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca,intradérmica, intraperitonial, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intraarticular,subcapsular, subaracnóide, intraespinhal, epidural, e intrasternal.
Exemplos de carreadores aquosos e não aquosos adequados que podem serempregados nas composições farmacêuticas da invenção incluem água, etanol, polióis (taiscomo glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, e similares), e misturas adequadasdestes, óleos vegetais, tais como óleo de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, tais comooleato de etila. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiaisde revestimento, tais como lecitina, para a manutenção do tamanho de partícula requeridono caso de dispersões, e pelo uso de surfatantes.
Estas composições também podem conter adjuvantes tais comoconservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes e agentes dispersantes. Aprevenção da presença de microorganismos pode ser assegurada tanto pelos procedimentosde esterilização, supra, quanto pela inclusão de vários agentes antibacterianos eantifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, e similares.
Também pode ser desejável incluir agentes isotônicos, tais como açúcares, cloreto desódio, e similares nas composições. Adicionalmente, a absorção prolongada da formafarmacêutica injetável pode ser trazida pela inclusão de agentes que retardam a absorção,tal como, monoestearato de alumínio e gelatina.
Quando os compostos da presente invenção são administrados comofármacos, a humanos e animais, estes podem ser fornecidos sozinhos ou como umacomposição farmacêutica contendo, por exemplo, 0,001 a 90% (mais preferivelmente,0,005 a 70%, tal como 0,01 a 30%) do ingrediente ativo em combinação com umcarreador farmaceuticamente aceitável.
Independentemente da via de administração selecionada, os compostos dapresente invenção, que podem ser usados numa forma hidratada adequada, e/ou ascomposições farmacêuticas da presente invenção são formuladas em formas de dosagemfarmaceuticamente aceitáveis pelos métodos convencionais conhecidos por aquelesversados na arte.
Níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composiçõesfarmacêuticas da presente invenção podem ser variadas para se obter uma quantidade doingrediente ativo que é eficaz para alcançar a resposta terapêutica desejada de umdeterminado paciente, a composição, e o modo da administração, sem ser tóxico aopaciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de vários fatores farmacocinéticosinclusive a atividade das composições particulares da presente invenção empregada, ou oéster, sal ou amida deste, a via de administração, o tempo da administração, a razão deexcreção do composto em particular que é empregado, a duração do tratamento, outrasdrogas, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particularesempregadas, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e histórico médico anterior dopaciente que está sendo tratado, e fatores similares bem conhecidos na área médica. Ummédico ou veterinário que tem habilidade na arte podem determinar e prescreverprontamente a quantidade eficaz da composição farmacêutica requerida. Por exemplo, omédico ou o veterinário poderiam iniciar doses dos compostos da invenção empregados nacomposição farmacêutica a níveis mais baixos do que aqueles requeridos para alcançar oefeito terapêutico desejado e gradualmente aumentar a dosagem até o efeito desejado seralcançado. Em geral, uma dose diária adequada de uma composição da invenção seráaquela quantidade do composto que é a dose mais baixa eficaz para produzir um efeitoterapêutico. Tal dose efetiva geralmente dependerá dos fatores acima descritos. Epreferido que a administração seja intravenosa, intramuscular, intraperitonial, ousubcutânea, preferivelmente administrada próxima ao local do alvo. Se desejado, a dosediária eficaz de uma composição terapêutica pode ser administrada como dois, três,quatro, cinco, seis ou mais sub-doses administradas separadamente em intervalosapropriados ao longo do dia, opcionalmente, em formas de dosagem de unidade. Enquantoé possível para um composto da presente invenção ser administrado sozinho, é preferíveladministrar o composto como uma formulação (composição) farmacêutica.
As composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivosmédicos conhecidos na arte. Por exemplo, em uma realização preferencial, umacomposição terapêutica da invenção pode ser administrada com um dispositivo de injeçãohipodérmico sem agulha, como os dispositivos revelados nas patentes US Nos. 5399163,5383851, 5312335, 5064413, 4941880, 4790824, ou 4596556. Os exemplos de implantese módulos bem conhecidos úteis na presente invenção incluem: a patente US No.4487603, que revela uma bomba de micro-infusão implantável para dispensar a medicaçãoem uma velociadade controlada; a patente US No. 4486194, que revela um dispositivoterapêutico para administrar medicamentos através da pele; patente US No. 4447233, querevela uma bomba de infusão de medicação para liberar a medicação em uma velocidadede infusão exata; a patente US No. 4447224, que revela um aparelho de infusão de fluxovariável implantável para liberação contínua da droga; a patente US No. 4439196, querevela um sistema osmótico de liberação de droga que possui compartimentos multi-câmaras; e a patente US No. 4475196, que revela um sistema osmótico de liberação dedroga. Muitos outros de tais implantes, sistemas e módulos de liberação são conhecidospor aqueles versados na arte.
Em certas realizações, as glicoproteínas terapêuticas da presente invençãopodem ser formuladas para assegurar a distribuição adequada in vivo. Por exemplo, abarreira cerebral de sangue (BBB) exclui muitos compostos altamente hidrofílicos. Paraassegurar que os compostos terapêuticos da invenção cruzam a BBB (se desejado), estespodem ser formulados, por exemplo, em lipossomas. Para os métodos de fabricação delipossomas, ver, por exemplo, as patentes US Nos. 4522811; 5374548; e 5399331. Oslipossomas podem compreender uma ou várias porções que são seletivamentetransportadas para células ou órgãos específicos, assim acentuam a liberação da droga alvofver, por exemplo, V.V. Ranade J. Clin. Pharmacol. 29:685 (1989). Exemplos deporções alvo incluem folato ou biotina (segundo, por exemplo, a patente US No. 5416016de Low et a!.); manosídeos (Umezawa et al.Biochem. Biophys. Res. Comrnun. 153:1038(1988)); anticorpos (P.G. Bloeman et al. FEBS Lett. 357:140 (1995); M. Owais et al.Antimicrob. Agents Chemother. 39:180 (1995)); receptor de proteína-A surfatante (Briscoeet al. Am. J. Physiol. 1233:134 (1995)), diferentes espécies as quais podem compreenderas formulações da invenção, bem como componentes das moléculas inventadas; pl20(Schreier et al, J. Biol. Chem. 269:9090 (1994)); ver também K. Keinanen; MX.Laukkanen FEBS Lett. 346:123 (1994); J.J. Killion; I.J. Fidler Immunomethods 4:273(1994). Em uma realização da invenção, os compostos terapêuticos da presente invençãosão formulados em lipossomas; numa realização mais preferencial, os lipossomas incluemuma porção alvo. Na realização mais preferencial, os compostos terapêuticos noslipossomas são liberados pela injeção de grande quantidade num local próximo ao tumorou infecção. A composição deve ser fluida numa extensão para que haja uma fácil injeção.Esta deve ser estável nas condições de fabricação e armazenamento e deve ser preservadacontra a ação contaminante de microrganismos tais como bactérias e fungos.
Numa outra realização, uma glicoproteína recombinante da presenteinvenção pode ser formulada para prevenir ou reduzir o transporte através da placenta.Isto pode ser feito por métodos conhecidos na arte, por exemplo, por PEGilação doanticorpo ou pelo uso de fragmentos de F(ab)2'. Outras referências podem ser feitas a"Cunningham-Rundles C, Zhuo Z, Griffith B, Keenan J. (1992) Biological activities ofpolyethylene-glycol immunoglobulin conjugates", "Resistance to enzymatic degradation".J Immunol Methods. 152:177-190; e a Landor M. (1995) "Maternal-fetal transfer ofimmuno globulins", Ann Allergy Asthma Immunol 74:279-283. Isto é especialmenterelevante quando a glicoproteína é um anticorpo usado para tratar ou prevenir o abortoespontâneo recorrente.
Uma "dosagem terapeuticamente eficaz" para artrite reumatóidepreferivelmente resultará numa Definição Preliminar da Melhora ACR20 nos pacientes,mais preferenciais em uma Definição Preliminar da Melhora ACR50 e até maispreferencial numa Definição Preliminar da Melhora ARCD70.
A Definição Preliminar da Melhora ACR20 é definida como: Melhora >20% em : Contagem de Junta Sensível (TCJ) e Contagem de Junta Inchada (SWJ) e melhora>20% em 3 das 5 seguintes avaliações: Avaliação de Dor no Paciente (VAS), avaliaçãoGlobal do Paciente (VAS), Avaliação Médica Global (VAS), Inabilidade Auto-avaliada doPaciente (HAQ), Fase Aguda Reagente (CRP ou ESR).
ACR50 e ACR70 são definidos do mesmo modo com melhoras >50% e>70%, respectivamente. Para maiores detalhes ver Felson et al em "American College ofRheumatology Preliminary Definition of Improvement in Rheumatoid Arthritis; ArthritisRheumatism" 38: 727-735 (1995).
A capacidade de um composto inibir o câncer pode ser avaliada em umsistema de modelo animal de previsão de eficácia em tumores humanos. Alternativamente,esta propriedade de uma composição pode ser avaliada pelo examine da capacidade docomposto inibir, tal inibição in vitro por ensaios conhecidos por pessoas experientes. Umaquantidade terapeuticamente eficaz de um composto terapêutico pode reduzir o tamanhodo tumor, ou de outra maneira melhorar os sintomas de um indivíduo. Uma pessoaversada na arte seria capaz de determinar tais quantidades baseados em tais fatores como otamanho do indivíduo, a gravidade dos sintomas do indivíduo, e a composição particularou a via de administração selecionada.A capacidade dos anticorpos para tratar ou prevenir psoríase também podeser avaliada segundo métodos bem conhecidos na arte.
A composição deve ser estéril e fluida numa extensão em que a composiçãoseja liberada por uma seringa. Além de água, o carreador pode ser uma solução salinatamponada isotônica, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilene glicol, e polietilenoglicol líquido, e similares), e misturas adequadas destes. A fluidez adequada pode sermantida, por exemplo, pelo uso de revestimento tal como lecitina, para a manutenção dotamanho de partícula requerido no caso da dispersão e pelo uso de surfatantes. Em muitoscasos, é preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais comomanitol ou sorbitol, e cloreto de sódio na composição. A absorção de longo prazo dascomposições injetáveis pode ser ocasionada incluindo na composição um agente retardadorda absorção, por exemplo, monostearato de alumínio ou gelatina.
Quando o composto ativo é apropriadamente protegido, como acimadescrito, o composto pode ser oralmente administrado, por exemplo, com um diluenteinerte ou um carreador comestível assimilável.
Outras realizações da presente invenção são descritas nos exemplosseguintes, que não devem ser interpretados como limitativos. Os conteúdos da listagem deseqüência, figuras e todas as referências, patentes e pedidos de patentes publicados citadosem todas as partes deste pedido são expressamente aqui incorporados como referência.
Exemplos
Em todos os exemplos discutidos abaixo, um anticorpo monoclonaltotalmente humano que liga IL-15 tem uma região variável de cadeia leve que compreendea seqüência de aminoácido na SEQ ID No:4 e uma região variável de cadeia pesada quecompreende a seqüência de aminoácido na SEQ ID No:2 foi usada como um exemplo deglicoproteína recombinante (mencionada nos exemplos como "exemplo de glicoproteínarecombinante"). Contudo, ficaria claro para uma pessoa versada na arte que o conteúdo demanose de qualquer glicoproteína recombinante pode ser modulado, como aqui discutido.
Exemplo 1: A osmolalidade afeta o teor de manose de glicoproteínasrecombinantes
De modo a investigar o efeito da osmolalidade no teor de manose deglicoproteínas, o teor de manose de um exemplo de glicoproteína recombinante foianalisado em osmolalidades variáveis tanto em culturas em agitador de frascos como embiorreator. Como demonstrado na figura 1, o alto teor de manose aumentou deaproximadamente 14% para aproximadamente 24% com o aumento da osmolalidade domeio de aproximadamente 500 para aproximadamente 580 mOsmo/Kg.
Num outro experimento, 20 mM de um osmoprotetor, betaína, foramacrescentados à cultura de células para fornecer outra evidência quanto à relação entreosmolalidade e o alto teor de manose. A tabela seguinte resume os resultados de talexperimento.
Tabela I
<table>table see original document page 46</column></row><table>
Ainda outra evidência da correlação entre o alto teor de manose ea osmolalidade é representado na figura 2. A adição de aproximadamente 20 mM debetaína ao meio de cultura de células reduziu dramaticamente o alto teor de manose daglicoproteína recombinante de exemplo. Por exemplo, quando a osmolalidade foi deaproximadamente 300 mOsm/Kg, o alto teor de manose reduziu de aproximadamente9,5% para aproximadamente 0 mM de betaína a aproximadamente 4,5 % com a adição de20 mM de betaína (isto é, cerca de uma redução de 5% no alto teor de manose).Semelhantemente, quando a osmolalidade foi de aproximadamente 400 mOsm/Kg, o altoteor de manose reduziu de aproximadamente 16,5% a aproximadamente 0 mM de betaínaa aproximadamente 7,5% com a adição de 20 mM de betaína (isto é, aproximadamenteuma redução de 9% do alto teor de manose). Além disto, numa osmolalidade deaproximadamente 500 mOsm/Kg, o alto teor de manose reduziu em aproximadamente25% com aproximadamente 0 mM de betaína a aproximadamente 9,5% com a adição deaproximadamente 20 mM de betaína (isto é, redução de aproximadamente 15,5% do altoteor de manose).46/48
Exemplo 2: Concentração de K+ na Cultura pode ser Controlada paraModular o Teor de Manose de Glicoproteínas Recombinantes
Num outro experimento, a concentração de um ou mais sais no meio decultura de células foi controlada para modular (por exemplo, reduzir) o teor de manose(por exemplo, alto teor de manose) da glicoproteína recombinante de exemplo. Numexperimento de exemplo, a concentração de K+ no meio de cultura de células foicontrolada e mostrou afetar o teor de manose e especificamente, o alto teor de manose daglicoproteína recombinante de exemplo. Especificamente, o alto teor de manose (isto é,espécies de M5 ou mais) da glicoproteína recombinante de exemplo produzida pelo cultivode uma célula hospedeira que expressa a glicoproteína tanto em 15 mM quanto em 45 mMfoi examinado.
Como mostrado nas figuras 3 e 4, a porcentagem de alto teor de manoseaumentou de aproximadamente 3% a aproximadamente 13% com o concomitante aumentoda osmolalidade. Uma osmolalidade entre aproximadamente 370 e aproximadamente 500mOsm/Kg levou a um aumento do alto teor de manose que excedeu em 10% dacomposição de glicoproteína.
Num outro experimento, foi demonstrado, como mostrado na figura 5,que a faixa de concentração ótima de K+ no meio de cultura de células éaproximadamente 0 mM a aproximadamente 70 mM de modo a manter a porcentagemdo alto teor de manose de uma glicoproteína recombinante abaixo de 10%.
Exemplo 3: Concentração de Na+ no Meio de Cultura de Células podeser Controlada para Modular o Teor de Manose das Glicoproteínas Recombinantes
Num outro experimento, a concentração de Na+ foi controlada paramodular (por exemplo, reduzir) o alto teor de manose da glicoproteína recombinante deexemplo. Num experimento de exemplo, um aumento na concentração de Na+ no meio decultura de células mostrou contribuir para um aumento na porcentagem do alto teor demanose da glicoproteína recombinante de exemplo.
A figura 6 demonstra que a faixa de concentração ótima de Na+ estáentre aproximadamente 0 mM e aproximadamente 200 mM de modo a manter aporcentagem do alto teor de manose abaixo de 10%.Exemplo 4: Aminoácidos Contribuem para o Alto Teor de Manose deGlicoproteínas Recombinantes
Em outro experimento, o efeito dos aminoácidos presentes num meio decultura de células foi examinado sobre o alto teor de manose da glicoproteínarecombinante de exemplo. Como mostrado na figura 7, a porcentagem do alto teor demanose de uma glicoproteína recombinante aumenta de aproximadamente 4% aaproximadamente 10% pela duplicação da concentração dos 20 aminoácidos no meionutriente. Este experimento demonstrou que um meio enriquecido com aminoácidosresulta em um aumento do conteúdo de glicoproteínas de alto teor de manose expressaspor uma célula hospedeira cultivada em tal meio.
Exemplo 5: Composição Total da Composição de Meio Nutriente podeContribuir para o Alto Teor de Manose das Glicoproteínas Recombinantes
Neste experimento, o efeito dos diferentes tipos de meios nutrientes foiexaminado sobre o alto teor de manose de uma glicoproteína recombinante de exemplo.
Especificamente, o efeito de um meio nutriente modificado, substancialmente isento deaminoácidos L-Alanine, L-Arginine HCL, Ácido L-Aspártico e Ácido L-Glutâmico, e quetambém tem uma concentração mais baixa de CaCl, MgCl, KCl e piruvato de sódio emrelação ao meio não modificado foi investigado quanto ao alto teor de manose daglicoproteína recombinante de exemplo. Como representado na figura 8, o alto teor demanose foi de aproximadamente 4% quando o meio nutriente modificado foi usado e estaporcentagem aumentou a aproximadamente 13% quando o meio nutriente não modificadofoi usado.
Exemplo 6: Efeito da Temperatura sobre o Alto Teor de Manose
O efeito de quatro diferentes temperaturas sobre o alto teor de manose foiexaminado utilizando dois diferentes meios nutrientes. Os dados seguintes na Tabela IIindicam que houve um aumento na porcentagem do alto teor de manose com o aumento datemperatura.
Tabela II
<table>table see original document page 48</column></row><table><table>table see original document page 49</column></row><table>
O relatório descritivo é mais completamente entendido a luz dosensinamentos das referências citadas dentro do relatório que são aqui incorporados comoreferência. As realizações dentro do relatório fornecem uma ilustração das realizaçõesdesta revelação e não devem ser interpretadas para limitar o seu alcance. O técnicoversado na área reconhecerá prontamente que muitas outras realizações são abrangidas poresta revelação. Todas as publicações e patentes citadas e seqüências identificadas peloadesão ou números de referência de bancos de dados nesta revelação são incorporadoscomo referência no seu conjunto. O material incorporado como referência que contradizou é inconsistente com o presente relatório, o presente relatório descritivo substituiqualquer destes materiais. A citação de quaisquer das referências aqui não é uma admissãode que tais referências são do estado da técnica da presente revelação.
A menos que de outra maneira indicado, todos os números que expressamquantidades de ingredientes, cultura de células, condições de tratamento, e similaresusados no relatório descritivo, inclusive reivindicações, devem ser entendidos comomodificados em todos os exemplos pelo termo "cerca de". Conseqüentemente, a menosque de outra maneira indicado o contrário, os parâmetros numéricos são aproximações epodem dependendo muito das propriedades desejadas buscadas para ser obtidas pelapresente invenção. A menos que de outra maneira indicado, o termo "pelo menos"precedente a uma série de elementos deve ser entendido para referir-se a cada elementonas séries. Os versados na arte reconhecerão, ou serão capazes de apurar utilizando nãomais do que a experimentação regular, muitas equivalências às realizações específicas dainvenção aqui descritas. Tais equivalências são destinadas a serem abrangidas pelasreivindicações seguintes.LISTA DE SEQÜÊNCIAS
<110> Amgen Inc.
<120> Métodos para modulação do teor de manose de proteínas recombinantes
<130> A-1059-WO-PCT
<140> ainda não atribuída<141 >23-01-2007
<150> 60/761,477<151 >23-01-2006
<150> 11/644, 345<151 > 22-12-2006
<160> 10
<170> Patente em versão 3.3
<210> 1
<211> 390
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220><221 > CDS<222> (1)...(390)
<400> 1
gag gtg cag ctg gtg cag tct gga gea gag gtg aaa aag ccc ggg gag 48Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gli Ala Glu Val Lis Lis Pro Gli Glu 1 5 10 15 tct ctg aag ate tcc tgt aag gtt tct gga tac ttc ttt acc acc tac 96Ser Leu Lis Ile 20 Ser Cis Lis Val Ser 25 Gli Tir Fen Fen Tre 30 Tre Tir tgg ate ggc tgg gtg cgc cag atg CCC ggg aaa ggc ctg gag tat atg 144Trp Ile Gli 35 Trp Val Arg Gln Met 40 Pro Gli Lis Gli Leu 45 Glu Tir Met ggg ate ate tat CCt ggt gac tct gat acc aga tac age ccg tcc ttc 192Gli Ile Ile Tir Pro Gli Asp Ser Asp Tre Arg Tir Ser Pro Ser Fen 50 55 60 caa ggc cag gtc aec ate tca gcc gac aag tcc ate age acc gcc tac 240Gln Gli Gln Val Tre Ile Ser Ala Asp Lis Ser Ile Ser Tre Ala Tir 65 70 75 80 ctg cag tgg age age ctg aag gcc tcg gac acc gcc atg tat tac tgt 288Leu Gln Trp Ser Ser 85 Leu Lis Ala Ser Asp 90 Tre Ala Met Tir Tir 95 Cis gcg aga ggg ggt aae tgg aac tgc ttt gac tac tgg ggc cag gga acc 336Ala Arg Gli Gli 100 Asn Trp Asn Cis Fen 105 Asp Tir Trp Gli Gln 110 Gli Tre ctg gtc a cc gtc tcc tca gcc tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc CCC 384Leu Val Tre 115 Val Ser Ser Ala Ser 120 Tre Lis Gli Pro Ser 125 Val Fen Proctg gca 390
Leu Ala130<210> 2<211 > 130<212> PRT<213> Homo sapiens
<400>2
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gli Ala Glu Val Lis Lis Pro Gli Glu1 5 10 15 Ser Leu Lis Ile Ser Cis Lis Val Ser Gli Tir Fen Fen Tre Tre Tir 20 25 30 Trp Ile Gli Trp Val Arg Gln Met Pro Gli Lis Gli Leu Glu Tir Met 35 40 45 Gli Ile Ile Tir Pro Gli Asp Ser Asp Tre Arg Tir Ser Pro Ser Fen50 55 60 Gln Gli Gln Val Tre Ile Ser Ala Asp Lis Ser Ile Ser Tre Ala Tir65 70 75 80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lis Ala Ser Asp Tre Ala Met Tir Tir Cis 85 90 95 Ala Arg Gli Gli Asn Trp Asn Cis Fen Asp Tir Trp Gli Gln Gli Tre 100 105 110 Leu Val Tre Val Ser Ser Ala Ser Tre Lis Gli Pro Ser Val Fen Pro 115 120 125 Leu Ala 130 <210> 3 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221 > CDS <222> (1)...(357) <400>3 gaa att gtg ttg acg cag tet cca ggc acc ctg tet ttg tet cca ggg 48Glu Ile Val Leu Tre Gln Ser Pro Gli Tre Leu Ser Leu Ser Pro Gli1 5 10 15 gaa aga gcc acc CtC tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt age age age 96Glu Arg Ala Tre Leu Ser Cis Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 tac tta gcc tgg tac cag cag aaa CCt ggc cag gct CCC agg cte cte 144Tir Leu Ala Trp Tir Gln Gln Lis Pro Gli Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 ate tat ggt gca tcc cg c agg gcc act ggc ate cca gac agg ttc agt 192Ile Tir 50 Gli Ala Ser Arg Arg 55 Ala Tre Gli Ile Pro 60 Asp Arg Fen Ser ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc ate age aga ctg gag 240Gli Ser Gli Ser Gli Tre Asp Fen Tre Leu Tre Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 CCt gaa gat ttt gca gtg tat tac tgt cag cgg tat ggt age tca cac 288Pro Glu Asp Fen Ala 85 Val Tir Tir Cis Gln 90 Arg Tir Gli Ser Ser 95 His a ct ttt ggc cag ggg acc aag ctg gag ate age cg a act gtg gct gca 336Tre Fen Gli Gln 100 Gli Tre Lis Leu Glu 105 Ile Ser Arg Tre Val 110 Ala Ala cca tct gtc ttc ate ttc ccg 357Pro Ser Val 115 Fen Ile Fen Pro
<210> 4
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400>4
Glu Ile Val Leu1
Glu Arg Ala Tre20
Tir Leu Ala Trp35
Ile Tir Gli Ala50
Gli Ser Gli Ser65
Pro Glu Asp Fen
Tre Fen Gli Gln100
Pro Ser Val Fen115
Tre Gln Ser Pro
Leu Ser Cis Arg
Tir Gln Gln Lis40
Ser Arg Arg Ala55
Gli Tre Asp Fen70
Ala Val Tir Tir85
Gli Tre Lis Leu
Ile Fen Pro
Gli Tre Leu Ser
Ala Ser Gln Ser25
Pro Gli Gln Ala
Tre Gli Ile Pro60
Tre Leu Tre Ile75
Cis Gln Arg Tir90
Glu Ile Ser Arg105
Leu Ser Pro Gli
Val Ser Ser Ser30
Pro Arg Leu Leu45
Asp Arg Fen Ser
Ser Arg Leu Glu80
Gli Ser Ser His95
Tre Val Ala Ala110
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400>5
Tre Tir Trp Ile Gli<210> 6<211> 16<212> PRT<213> Homo sapiens
<400>6
Ile Ile Tir Pro Gli Asp Ser Asp Tre Arg Tir Ser Pro Pro Fen1 5 10 15
<210> 7<211> 8<212> PRT<213> Homo sapiens
<400>7
Gli Asn Trp Asn1
Cis Fen Asp Tir5
<210> 8<211> 12<212> PRT<213> Homo sapiens
<400>8
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tir Leu Ala1 5 10
<210>9
<211>7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400>9
Gli Ala Ser Arg Arg Ala Tre1 5
<210> 10<211> 8<212> PRT<213> Homo sapiens
<400> 10
Gln Arg Tir Gli1
Ser Ser His Tre5

Claims (42)

1. Método de produção de uma composição de glicoproteínarecombinante que apresenta baixo teor de manose, CARACTERIZADO porcompreender cultivar uma célula hospedeira que expressa a glicoproteína recombinante emum meio de cultura que tem uma osmolalidade de aproximadamente 600 mOsm/Kg oumenos.
2. Método de produção de uma composição do anticorpo recombinante,ou fragmento antígeno-ligante deste que apresenta um baixo teor de manose,CARACTERIZADO por compreender cultivar uma célula hospedeira que expressa oanticorpo recombinante ou fragmento antígeno-ligante deste em um meio de cultura quetem uma osmolalidade de aproximadamente 600 mOsm/Kg ou menos.
3. Método de produção de uma composição de anticorpo monoclonalhumano recombinante, ou fragmento antígeno-ligante deste, que liga IL-15,CARACTERIZADO por compreender cultivar uma célula hospedeira que expressa oanticorpo ou fragmento antígeno-ligante deste em um meio de cultura que tem umaosmolalidade de aproximadamente 600 mOsm/Kg ou menos, em que o anticorpo ou ofragmento antígeno-ligante deste compreendem uma região variável de cadeia leve quecompreende a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID No:4, ou substituiçõesconservativas de aminoácidos desta, e uma região variável de cadeia pesada quecompreende a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID No:2, ou substituiçõesconservativas de aminoácidos desta.
4. Método de acordo com as reivindicações 1 a 3,CARACTERIZADO pela osmolalidade do meio de cultura estar entre aproximadamente-250 e aproximadamente 600 mOsm/Kg.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelaosmolalidade do meio de cultura estar entre aproximadamente 250 e aproximadamente 500mOsm/Kg.
6. Método de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelaosmolalidade do meio de cultura estar entre aproximadamente 250 e aproximadamente 380mOsm/Kg.
7. Método de acordo com as reivindicações 1 a 3,CARACTERIZADO pelo meio de cultura compreender um sal selecionado do grupocomposto de potássio numa concentração de aproximadamente 70 mM ou menos, sódionuma concentração de aproximadamente 200 mM ou menos, e combinações destes.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADOpelo meio de cultura compreender um sal selecionado do grupo composto de(a) potássio numa concentração de aproximadamente 10 mM aaproximadamente 50 mM;(b) sódio numa concentração de aproximadamente 50 mM aaproximadamente 100 mM; e(c) combinações de (a) e (b).
9. Método de acordo com as reivindicações 1 a 3,CARACTERIZADO pelo meio de cultura ser substancialmente isento de um ou maisaminoácidos selecionados do grupo composto de alanine, arginine, ácido aspártico e ácidoglutâmico.
10. Método de acordo com as reivindicações 1 a 3,CARACTERIZADO pelo meio de cultura compreender uma ou mais vitaminasselecionadas do grupo composto de biotina, pantotenato D-cálcio, cloreto de colina, ácidofólico, i-inositol, niacinaminda, piridoxal HCl, piridoxina HCl, riboflavina, tiamina HCl ecianocobalamina, numa concentração de aproximadamente 0,00005 g/L aaproximadamente 0,9 g/L.
11. Método de acordo com as reivindicações 1 para 3,CARACTERIZADO pelo meio de cultura compreender glicose numa concentraçãode aproximadamente 1 mM a aproximadamente 90 mM.
12. Método de acordo com as reivindicações 1 a 3,CARACTERIZADO pelo meio de cultura compreender uma ou mais peptonasselecionadas do grupo composto de extrato de lêvedo, hidrolisado de lêvedo, peptona desoja, hidrolisado de soja, peptona de trigo e hidrolisado de trigo, numa concentração deaproximadamente 0,5 g/L a aproximadamente 60 g/L.
13. Método de acordo com as reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADOpelo meio de cultura compreender pelo menos um osmoprotetor numa quantidadenecessária para manter a osmolalidade em aproximadamente 600 mOsm/Kg ou menos.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADOpelo osmoprotetor ser selecionado do grupo composto de betaína, glicina, L-treonina, L-prolina, e derivados destes.
15. Método de acordo com a reivindicação 13,CARACTERIZADO pelo osmoprotetor ser betaína numa concentração deaproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM,
16. Método de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADOpela betaína estar presente numa concentração de aproximadamente 20 mM aaproximadamente 30 mM.
17. Método de acordo com as reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADOpela célula hospedeira ser cultivada por um período de aproximadamente 5 aaproximadamente 14 dias.
18. Método de acordo com as reivindicações 1 a 3,CARACTERIZADO pela célula hospedeira ser cultivada numa temperatura deaproximadamente 310C a aproximadamente 38°C.
19. Método de acordo com as reivindicações 1 a 3,CARACTERIZADO pela célula hospedeira ser uma célula mamífera.
20. Método de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADOpela célula hospedeira mamífera ser uma célula de CHO.
21. Composição de glicoproteína recombinante CARACTERIZADApor ser produzida pelo método de acordo com a reivindicação 1.
22. Composição de anticorpo recombinante ou fragmento antígeno-ligante deste CARACTERIZADA por ser produzida pelo método de acordo com areivindicação 2.
23. Composição do anticorpo monoclonal humano ou um fragmentoantígeno-ligante deste que liga IL-15, CARACTERIZADA por ser produzida pelométodo de acordo com a reivindicação 3.
24. Composição CARACTERIZADA por compreender um anticorpoisolado ou um fragmento antígeno-ligante deste que apresenta um baixo teor de manose.
25. Composição CARACTERIZADA por compreender um anticorpomonoclonal humano isolado que liga IL-15, ou fragmento antígeno-ligante deste, queapresenta baixo teor de manose.
26. Composição de um anticorpo monoclonal humano que apresentabaixo teor de manose, CARACTERIZADA pelo dito anticorpo compreender uma regiãovariável de cadeia leve que compreende a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQID No:4, ou uma seqüência de aminoácidos de pelo menos 90% ou pelo menos 95% deidentidade, ou substituições conservativas de aminoácidos destas, e uma região variável decadeia pesada que compreende a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID No:2,ou seqüência de aminoácidos de pelo menos 90% ou pelo menos de 95% de identidade, ousubstituições conservativas de aminoácidos destas.
27. Composição de um anticorpo monoclonal humano que apresenta umbaixo teor de manose, CARACTERIZADA pelo dito anticorpo compreender uma regiãovariável de cadeia leve que compreende uma ou mais RCDs que compreendem asseqüências de aminoácidos estabelecidas nas SEQ ID Nos:8-10, ou seqüência deaminoácidos de pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade, ou substituiçõesconservativas de aminoácidos destas, e uma região variável de cadeia pesada quecompreende uma ou mais RDCs que compreendem seqüências de aminoácidosestabelecidas nas SEQ ID Nos:5-7, ou seqüências de aminoácidos de pelo menos 90% oupelo menos de 95% de identidade, ou substituições conservativas de aminoácidos destas.
28. Composição de acordo com a reivindicação 25,CARACTERIZADA por ainda compreender um carreador farmaceuticamenteaceitável.
29. Método de tratamento ou prevenção de uma doença que estáassociada à super-expressão de IL-15 humano e/ou em que os efeitos induzidos poruma regulação negativa ou inibição de IL-15 humano sejam benéficos,CARACTERIZADO por compreender administrar a um indivíduo um anticorpoisolado produzido pelo método da reivindicação 3.
30. Método de acordo com a reivindicação 29,CARACTERIZADO pela dita doença ser selecionado do grupo que consiste de:vasculite, psoríase, esclerose múltipla, artrite reumatóide, doença inflamatória dointestino, rejeição à alotransplante, reação hospedeiro versus enxerto, limfoma dascélulas T, e leucemia de células T.
31. Método de acordo com a reivindicação 30,CARACTERIZADO pela dita doença ser uma doença inflamatória do intestino.
32. Método de acordo com a reivindicação 31,CARACTERIZADO pela dita doença inflamatória do intestino ser uma doença deCrohn ou doença de celiac.
33. Método de acordo com a reivindicação 29,CARACTERIZADO pela doença ser selecionada do grupo que consiste de artrite,doenças do tecido conjuntivo, doenças oftalmológicas, doenças neurológicas, doençasgastrointestinais e hepáticas, doenças alérgicas, doenças hematológicas, doenças depele, doenças pulmonares, malignidades, doenças derivadas de transplantes, doençasendocrinológicas, doenças vasculares, doenças ginecológicas e doenças infecciosas.
34. Composição de acordo com as reivindicações 26 ou 27,CARACTERIZADA por não mais do que aproximadamente 10% dos anticorpos nadita composição compreender M5 ou mais.
35. Composição de acordo com as reivindicações 26 ou 27,CARACTERIZADA por não mais do que aproximadamente 5% dos anticorpos na ditacomposição compreender M5 ou mais.
36. Composição de acordo com as reivindicações 26 ou 27,CARACTERIZADA por aproximadamente 4% dos anticorpos na dita composiçãocompreender M5 ou mais.
37. Método de detecção e/ou quantificação do alto teor de manose deuma glicoproteína numa amostra CARACTERIZADO por compreender submeter a ditaamostra a uma digestão com endoglicosidase seguida da separação por eletroforese dasglicoproteínas digeridas.
38. Método de acordo com a reivindicação 37,CARACTERIZADO pela endoglicosidase compreender Endoglicosidase H e adigestão ser realizada a 37 0C por aproximadamente 2 horas.
39. O método de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADOpela eletroforese compreender uma eletroforese desnaturante por capilaridade.
40. Método de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADOpor antes da etapa de separação a amostra digerida ser reduzida usando um agente redutor.
41. Método de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADOpelo agente redutor compreender β-mercaptoetanol.
42. Método de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADO pelaglicoproteína compreender um anticorpo produzido por um hibridoma ou uma célulahospedeira eucariótica.
BRPI0707529-4A 2006-01-23 2007-01-23 métodos para modulação do teor de manose de proteìnas recombinantes BRPI0707529A2 (pt)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US76147706P 2006-01-23 2006-01-23
US60/761,477 2006-01-23
US11/644,345 US20070190057A1 (en) 2006-01-23 2006-12-22 Methods for modulating mannose content of recombinant proteins
US11/644,345 2006-12-22
PCT/US2007/002007 WO2007087384A2 (en) 2006-01-23 2007-01-23 Methods for modulating mannose content of recombinant proteins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BRPI0707529A2 true BRPI0707529A2 (pt) 2011-05-03

Family

ID=38266667

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0707529-4A BRPI0707529A2 (pt) 2006-01-23 2007-01-23 métodos para modulação do teor de manose de proteìnas recombinantes

Country Status (17)

Country Link
US (5) US20070190057A1 (pt)
EP (1) EP1984517B2 (pt)
JP (1) JP5133261B2 (pt)
KR (2) KR101257134B1 (pt)
AU (1) AU2007208274B2 (pt)
BR (1) BRPI0707529A2 (pt)
CA (1) CA2637156C (pt)
DK (1) DK1984517T3 (pt)
EA (1) EA016153B1 (pt)
ES (1) ES2391656T5 (pt)
IL (1) IL192981A0 (pt)
PE (1) PE20071111A1 (pt)
PL (1) PL1984517T3 (pt)
PT (1) PT1984517E (pt)
SI (1) SI1984517T2 (pt)
TW (1) TWI408146B (pt)
WO (1) WO2007087384A2 (pt)

Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180002911A (ko) 2005-11-04 2018-01-08 제넨테크, 인크. 안질환 치료를 위한 보체 경로 억제제의 용도
US20070190057A1 (en) 2006-01-23 2007-08-16 Jian Wu Methods for modulating mannose content of recombinant proteins
US8911964B2 (en) 2006-09-13 2014-12-16 Abbvie Inc. Fed-batch method of making human anti-TNF-alpha antibody
AU2007294731B2 (en) 2006-09-13 2014-04-17 Abbvie Inc. Cell culture improvements
KR20160092061A (ko) 2006-11-02 2016-08-03 제넨테크, 인크. 인간화 항-ｄ 인자 항체
AR066660A1 (es) 2007-05-23 2009-09-02 Genentech Inc Prevencion y tratamiento de condiciones del ojo asociadas con su complemento
CR20170001A (es) 2008-04-28 2017-08-10 Genentech Inc Anticuerpos anti factor d humanizados
CA2911256A1 (en) * 2008-10-20 2010-12-09 Robert K. Hickman Isolation and purification of antibodies using protein a affinity chromatography
NZ592097A (en) 2008-10-20 2013-01-25 Abbott Lab Viral inactivation during purification of il-12 and il-18 antibodies
US20110053223A1 (en) * 2009-08-14 2011-03-03 Robert Bayer Cell culture methods to make antibodies with enhanced adcc function
BR112012009828B8 (pt) * 2009-10-26 2022-10-25 Hoffmann La Roche Método para a produção de uma imunoglobulina glicosilada e seu uso
MX2012011648A (es) 2010-04-07 2012-11-29 Momenta Pharmaceuticals Inc Glicanos de alta manosa.
SG185038A1 (en) * 2010-04-26 2012-11-29 Novartis Ag Improved cell culture medium
CN103097409A (zh) * 2010-07-08 2013-05-08 巴克斯特国际公司 在细胞培养物中生产重组高分子量vWF的方法
US20130330340A1 (en) * 2011-02-25 2013-12-12 Stephen R. Hamilton Production of n- and o-sialylated tnfrii-fc fusion protein in yeast
EP2686671A4 (en) 2011-03-12 2015-06-24 Momenta Pharmaceuticals Inc N-GLYCANES CONTAINING N-ACETYLHEXOSAMINE IN GLYCOPROTEIN PRODUCTS
WO2012149197A2 (en) 2011-04-27 2012-11-01 Abbott Laboratories Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
MY169935A (en) 2011-04-29 2019-06-18 Biocon Biologics India Ltd "a method for reducing heterogeneity of antibodies and a process of producing the antibodies thereof"
RU2018119112A (ru) * 2011-05-27 2018-11-07 Эббви Байотекнолоджи Лтд. Композиции и способы на основе dac hyp
KR20170021919A (ko) 2011-10-21 2017-02-28 화이자 인코포레이티드 철을 첨가하여 세포 배양을 개선하는 방법
WO2013158273A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Methods to modulate c-terminal lysine variant distribution
US9334319B2 (en) 2012-04-20 2016-05-10 Abbvie Inc. Low acidic species compositions
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
WO2013176754A1 (en) 2012-05-24 2013-11-28 Abbvie Inc. Novel purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography
EP2856159A4 (en) 2012-06-01 2016-04-13 Momenta Pharmaceuticals Inc METHODS RELATING TO DENOSUMAB
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
KR20150043523A (ko) 2012-09-02 2015-04-22 애브비 인코포레이티드 단백질 불균일성의 제어 방법
WO2014085213A1 (en) * 2012-11-29 2014-06-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Improved cultivation media and process for improved protein production by pichia strains
US20150361128A1 (en) * 2012-12-20 2015-12-17 Medimmune, Llc Methods of using ion exchange chromatography to control levels of high mannose glycoforms
SG11201507230PA (en) 2013-03-12 2015-10-29 Abbvie Inc Human antibodies that bind human tnf-alpha and methods of preparing the same
US9217168B2 (en) 2013-03-14 2015-12-22 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods of cell culture
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
TWI771890B (zh) 2013-03-14 2022-07-21 美商安美基公司 用於增加重組蛋白質之甘露糖含量之方法
WO2014151878A2 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosacharides
WO2014159579A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Abbvie Inc. MUTATED ANTI-TNFα ANTIBODIES AND METHODS OF THEIR USE
US10450361B2 (en) 2013-03-15 2019-10-22 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods related to CTLA4-Fc fusion proteins
EP2996772B1 (en) 2013-05-13 2018-12-19 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods for the treatment of neurodegeneration
CN107318267B (zh) 2013-08-12 2021-08-17 豪夫迈·罗氏有限公司 用于治疗补体相关的病症的组合物和方法
US9598667B2 (en) 2013-10-04 2017-03-21 Abbvie Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
EP3058084A4 (en) 2013-10-16 2017-07-05 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Sialylated glycoproteins
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
US8946395B1 (en) 2013-10-18 2015-02-03 Abbvie Inc. Purification of proteins using hydrophobic interaction chromatography
WO2015073884A2 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
KR102381791B1 (ko) * 2014-01-13 2022-03-31 암젠 인크 재조합 단백질의 고수준 만노스 글리코폼 함량을 조작하기 위한 오르니틴 대사의 조절
SG10201912081RA (en) * 2014-01-29 2020-02-27 Amgen Inc Overexpression of n-glycosylation pathway regulators to modulate glycosylation of recombinant proteins
JP6797458B2 (ja) * 2014-01-29 2020-12-09 エルジー・ケム・リミテッド 培養培地の最適化により組換えタンパク質のガラクトシル化を調節する方法
BR112016025312A2 (pt) 2014-05-01 2017-10-17 Genentech Inc variantes de anticorpo, anticorpo anti-fator d, formulação farmacêutica, dispositivo de distribuição, utilização da formulação e de uma composição, composição e método de tratamento de uma desordem
CN108472382A (zh) 2015-10-30 2018-08-31 豪夫迈·罗氏有限公司 抗-因子d抗体变体缀合物及其用途
JP2018534930A (ja) 2015-10-30 2018-11-29 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｄ因子抗体及びコンジュゲート
US20180002417A1 (en) 2016-06-15 2018-01-04 Celimmune Llc Methods and Compositions for the Treatment of Celiac Disease, Non-Celiac Gluten Sensitivity, and Refractory Celiac Disease
BR112020020854A2 (pt) 2018-04-12 2021-01-19 Amgen Inc. Métodos para produzir composições de proteínas estáveis
CA3099163A1 (en) 2018-05-01 2019-11-07 Amgen Inc. Antibodies with modulated glycan profiles
JP7214029B1 (ja) 2021-12-10 2023-01-27 株式会社西村ケミテック 液体注入及び抽出装置

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0283942B1 (en) 1987-03-24 1992-05-20 W.R. Grace & Co.-Conn. Basal nutrient medium for cell culture
IL87737A (en) 1987-09-11 1993-08-18 Genentech Inc Method for culturing polypeptide factor dependent vertebrate recombinant cells
US6238891B1 (en) * 1987-11-18 2001-05-29 Cetus Oncology Corporation Method of increasing product expression through solute stress
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
GB9022545D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Culture medium
DE4344824C1 (de) 1993-12-28 1995-08-31 Immuno Ag Hochkonzentriertes Immunglobulin-Präparat und Verfahren zu seiner Herstellung
US5721121A (en) * 1995-06-06 1998-02-24 Genentech, Inc. Mammalian cell culture process for producing a tumor necrosis factor receptor immunoglobulin chimeric protein
US6656466B1 (en) * 1995-06-06 2003-12-02 Genetech, Inc. Human tumor necrosis factor—immunoglobulin(TNFR1-IgG1) chimera composition
US5705364A (en) 1995-06-06 1998-01-06 Genentech, Inc. Mammalian cell culture process
US20040191256A1 (en) * 1997-06-24 2004-09-30 Genentech, Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
US6752983B1 (en) * 1997-09-17 2004-06-22 Eastman Chemical Company Hair spray and consumer sprays with reduced volatile organic compounds
US20040136986A1 (en) 1997-10-31 2004-07-15 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6528286B1 (en) * 1998-05-29 2003-03-04 Genentech, Inc. Mammalian cell culture process for producing glycoproteins
DE60139720D1 (de) * 2000-06-28 2009-10-08 Glycofi Inc Verfahren für die Herstellung modifizierter Glykoproteine
AU2002332628B2 (en) * 2001-08-23 2007-07-26 Genmab A/S Human antibodies specific for interleukin 15 (IL-15)
US7247304B2 (en) * 2001-08-23 2007-07-24 Genmab A/S Methods of treating using anti-IL-15 antibodies
WO2003045995A2 (en) * 2001-11-28 2003-06-05 Sandoz Gmbh Cell culture process
KR101001243B1 (ko) 2001-12-27 2010-12-17 글리코파이, 인크. 포유동물-유형 탄수화물 구조의 설계 방법
US7067279B1 (en) 2002-08-23 2006-06-27 Immunex Corporation Cell culture performance with betaine
WO2005011645A2 (en) 2003-08-04 2005-02-10 Jallal Messadek Selected betaines and their uses
US20050123542A1 (en) * 2003-11-06 2005-06-09 Genmab A/S Methods for treating disorders involving monocytes
US20070190057A1 (en) 2006-01-23 2007-08-16 Jian Wu Methods for modulating mannose content of recombinant proteins

Also Published As

Publication number Publication date
IL192981A0 (en) 2011-08-01
US20130330770A1 (en) 2013-12-12
SI1984517T1 (sl) 2012-12-31
EP1984517A2 (en) 2008-10-29
DK1984517T3 (da) 2012-11-26
US9359435B2 (en) 2016-06-07
EP1984517B1 (en) 2012-08-29
KR20080110728A (ko) 2008-12-19
US20160304603A1 (en) 2016-10-20
EP1984517B8 (en) 2012-10-10
EA016153B1 (ru) 2012-02-28
ES2391656T3 (es) 2012-11-28
WO2007087384A2 (en) 2007-08-02
AU2007208274A1 (en) 2007-08-02
PT1984517E (pt) 2012-12-05
US20210115125A1 (en) 2021-04-22
US20070190057A1 (en) 2007-08-16
JP5133261B2 (ja) 2013-01-30
US8354105B2 (en) 2013-01-15
EA200801531A1 (ru) 2009-02-27
SI1984517T2 (sl) 2021-07-30
AU2007208274B2 (en) 2011-05-12
WO2007087384A3 (en) 2007-10-18
PL1984517T3 (pl) 2013-06-28
CA2637156A1 (en) 2007-08-02
KR20130012589A (ko) 2013-02-04
CA2637156C (en) 2021-02-23
US10829551B2 (en) 2020-11-10
EP1984517B2 (en) 2021-02-17
TW200738753A (en) 2007-10-16
JP2009523450A (ja) 2009-06-25
KR101257134B1 (ko) 2013-04-26
PE20071111A1 (es) 2007-11-19
TWI408146B (zh) 2013-09-11
ES2391656T5 (es) 2021-12-30
US20110097336A1 (en) 2011-04-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BRPI0707529A2 (pt) métodos para modulação do teor de manose de proteìnas recombinantes
JP2021104023A (ja) ポリペプチド生成のための細胞培養組成物及び方法
ES2324046T5 (es) Procedimiento para controlar la sialilación de proteínas producidas por un cultivo de células de mamíferos
JPH10505507A (ja) ｇａｓ６による受容体活性化
CN107108739A (zh) 抗CD79b抗体和使用方法
KR20070073737A (ko) 항-아밀로이드 베타 항체의 생산
KR20070069140A (ko) ＴＮＦＲ-Ｉｇ 융합 단백질의 제조
KR20070085220A (ko) 폴리펩타이드의 생산
CN111356471A (zh) 包含赖氨酸盐作为张力调节剂的阿柏西普制剂及其用途
CN111676263A (zh) 调节重组蛋白中甘露糖含量的方法
EP3339444A1 (en) Method for obtaining a glycoprotein with an increased percentage of afucosylated glycans
KR20230124971A (ko) 세포 배양 중 분비된 재조합 발현 단백질에서 시스테인잔기의 산화 수준을 감소시키는 방법
MX2008009232A (en) Methods for modulating mannose content of recombinant proteins
US20230348850A1 (en) Cell culture processes
EP4286414A1 (en) Anti-cd20 antibody compositions

Legal Events

Date Code Title Description
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B08F Application dismissed because of non-payment of annual fees [chapter 8.6 patent gazette]

Free format text: REFERENTE A 9A ANUIDADE.

B08K Patent lapsed as no evidence of payment of the annual fee has been furnished to inpi [chapter 8.11 patent gazette]

Free format text: EM VIRTUDE DO ARQUIVAMENTO PUBLICADO NA RPI 2344 DE 08-12-2015 E CONSIDERANDO AUSENCIA DE MANIFESTACAO DENTRO DOS PRAZOS LEGAIS, INFORMO QUE CABE SER MANTIDO O ARQUIVAMENTO DO PEDIDO DE PATENTE, CONFORME O DISPOSTO NO ARTIGO 12, DA RESOLUCAO 113/2013.