JP7292377B2 - アフコシル化抗体およびその製造法 - Google Patents

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Description

発明の分野
本開示は、活性および治療特性が改善されたアフコシル化免疫機能分子（afucosylated immunologically functional molecule）を含むアフコシル化タンパク質、ならびにアフコシル化タンパク質を作製する方法に関する。
発明の背景
糖タンパク質は、触媒作用、シグナリング、細胞間コミュニケーション、ならびに分子認識および分子集合を含むヒトにおける多くの必須機能を媒介する。治療目的で多数の糖タンパク質が開発されており、かつここ２０年で、天然に存在する分泌糖タンパク質の組み換え体（recombinant version）がバイオテクノロジー産業の主要製品となっている。例としては、エリトロポエチン（ＥＰＯ）、治療用モノクローン抗体（治療用ｍＡｂ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、インターフェロン－β（ＩＦＮ－β）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、およびヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）が含まれる。
哺乳類においては５つの抗体のクラス、つまりＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥが存在する。主にヒトＩｇＧクラスの抗体が、その長い血中半減期および機能的特徴、例えば各種エフェクター機能等のため、様々なヒトの病気の診断、予防および治療に主に用いられている。ヒトＩｇＧクラス抗体は次の４つのサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４にさらに分類される。ＩｇＧクラス抗体のエフェクター機能としての抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性および補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）に関し多くの研究が行われており、ＩｇＧ１サブクラスの抗体は、ヒトＩｇＧクラス抗体の中で最も優れたＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性を有することが報告されている。
ヒトＩｇＧ１サブクラス抗体のＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性の発現には、抗体のＦｃ領域と、エフェクター細胞、例えばキラー細胞、ナチュラルキラー細胞、活性化されたマクロファージまたは類似のものの表面に存在する抗体受容体（以下、“ＦｃγＲ”と称する）および各種補体成分との結合が要される。抗体ヒンジ領域およびＣ領域の第２のドメイン（以下、“Ｃγ２ドメイン”と称する）におけるいくつかのアミノ酸残基ならびにＣγ２ドメインに連結する糖鎖もこの結合反応に重要であることが示唆されている。
抗体またはＦｃ融合タンパク質のＮ－グリカンフコシル化の低減または阻害は、ＡＤＣＣ活性を高めることができる。ＡＤＣＣは通常、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化を引き起こし、ＮＫ細胞表面のＦｃ受容体による抗体コート細胞（antibody-coated cell）の認識に依存する。ＮＫ細胞におけるＦｃ受容体へのＦｃドメインの結合は、Ｆｃドメインの糖化の状態に影響される。加えて、ＦｃドメインにおけるＮ－グリカンのタイプもＡＤＣＣ活性に影響する。よって、抗体組成物またはＦｃ融合タンパク質組成物に関し、アフコシル（afucosyl）Ｎ－グリカンの相対量の増加は、ＦｃγＲＩＩＩに対する結合親和性または組成物のＡＤＣＣ活性を高めることができる。
種、組織および細胞型を含む糖鎖付加に影響を与え得るいくつかの要因はいずれも、糖化の発生の仕方において重要であることが示されている。加えて、細胞外環境は、血清濃度のような培養条件の変更により、糖鎖付加に直接影響を与え得る。オリゴ糖産生に関わる特定の酵素の導入または過剰発現を含む特定の宿主生物において実現される糖化パターンを変えるため、様々な方法が提案されている（米国特許第５，０４７，３３５号（特許文献１）、米国特許第５，５１０，２６１号（特許文献２））。これらスキームは細胞内の方法に限定されない(米国特許第５，２７８，２９９号（特許文献３）)。
国際公開第１９９８／５８９６４号（特許文献４）は、実質的に全てのＮ結合型オリゴ糖がＧ２オリゴ糖である抗体組成物について記載している。Ｇ２は２つの末端Ｇａｌｓおよびｎｏ ＮｅｕＡｃｓを有する二分岐構造を指す。国際公開第１９９９／２２７６４号（特許文献５）は、そのＣＨ２ドメインにＮ結合型Ｇ１、Ｇ０、またはＧ－１オリゴ糖を有する糖タンパク質を実質的に含まない抗体組成物に言及している。Ｇ１は１つのＧａｌおよびｎｏ ＮｅｕＡｃｓを有する二分岐構造を指し、Ｇ０は末端のＮｅｕＡｃｓまたはＧａｌｓが存在しない二分岐構造を指し、かつＧ－１はＧｌｃＮＡｃが１つ少ないコアユニットを指す。
国際公開第２０００／６１７３９号（特許文献６）は、ＹＢ２／０（ラットミエローマ）細胞により発現される抗ｈＩＬ－５Ｒ抗体の４７％がα１－６フコース結合型糖鎖を有しており、これに対してＮＳＯ（マウスミエローマ）細胞により発現されるそれら抗体では７３％であったことを報告している。各種宿主細胞により発現されたα－ｈＩＬ－５Ｒ抗体のフコース相対比はＹＢ２／０＜ＣＨＯ／ｄ＜ＮＳＯであった。
国際公開第２００２／３１１４０号（特許文献７）および国際公開第２００３／８５１１８号（特許文献８）は、糖鎖へのフコース結合の修飾が、ＲＮＡｉを用いα１，６－フコシルトランフエェラーゼの機能を抑制することによって制御できることを示している。細胞を用いて抗体組成物を製造するためのプロセスは、複合型Ｎ－グリコシド結合糖鎖におけるα結合により還元末端においてＮ－アセチルグルコサミンの位置６にフコースの位置１が結合した糖鎖を認識するレクチンに抵抗する細胞を用いるステップを含む。
糖鎖の構造は、ヒトＩｇＧ１サブクラス抗体のエフェクター機能において重要な役割を果たし、かつ糖鎖構造を変えることによってより優れたエフェクター機能を有する抗体を作製することが可能となり得る。しかし、糖鎖の構造は多種多様かつ複雑であり、糖鎖の生理学的役割のソリューションは不十分であると共に費用がかかるものである。よって、アフコシル化抗体を製造する方法が求められている。
米国特許第５，０４７，３３５号 米国特許第５，５１０，２６１号 米国特許第５，２７８，２９９号 国際公開第１９９８／５８９６４号 国際公開第１９９９／２２７６４号 国際公開第２０００／６１７３９号 国際公開第２００２／３１１４０号 国際公開第２００３／８５１１８号
参考文献
Figure 0007292377000001
本開示は、活性が改善されたアフコシル化抗体を含むアフコシル化タンパク質を製造する新規な方法に関する。本開示はまた、開示された方法により製造されるアフコシル化タンパク質、およびアフコシル化タンパク質を製造するのに用いる細胞に関する。開示されるアフコシル化抗体は、天然に存在する（naturally-occurring）フコシル化抗体に比して、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性が高められている。
本開示の１態様は、宿主細胞内でアフコシル化抗体を含むアフコシル化タンパク質を産生させる方法に関する。本開示の方法は概して、フコシル化経路の改変酵素をコードする核酸を宿主細胞に導入し、宿主細胞における抗体のフコシル化を阻害するステップを含む。改変酵素は、フコシル化経路における酵素に由来するものであり得る。特定の実施形態において、改変酵素は、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼ（ＧＭＤ）、ＧＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－Ｄ－マンノースエピメラーゼ－還元酵素（ＦＸ）、ならびに／またはフコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ１～ＦＵＴ１２、ＰＯＦＵＴ１、およびＰＯＦＵＴ２）のいずれかに由来するものであってよい。いくつかの実施形態において、改変酵素はＧＭＤまたはＦＵＴに由来するものであり得る。特定の実施形態では、改変酵素はα－１，６－フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）に由来するものであり得る。改変酵素はフコシル化経路において宿主細胞の天然に存在する酵素の機能を阻害することができ、次いで宿主細胞における抗体のフコシル化が阻害される。
いくつかの実施形態において、アフコシル化抗体を含むアフコシル化タンパク質を製造する方法は、（ａ）宿主細胞を準備するステップ、（ｂ）フコシル化経路の改変酵素をコードする核酸を宿主細胞に導入するステップ、および（ｃ）宿主細胞内でアフコシル化タンパク質 を産生させるステップ、を含む。
本開示の別の態様は、本開示の方法により製造されるアフコシル化抗体を含むアフコシル化タンパク質に関する。アフコシル化抗体は、天然に存在するフコシル化抗体に比して、活性が向上かつ改善されている。いくつかの実施形態において、抗体は、ＡＤＣＣが向上かつ改善されている。
本開示はまた、アフコシル化抗体を含むアフコシル化タンパク質を製造するのに用いる細胞に関する。
添付の図面を参照にしながら、以下の実施形態において本開示の詳細な説明を行う。
ＲＣ７９細胞（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）を発現する安定クローン）、およびＦ８３Ｍ、Ｆ８Ｍ１、Ｆ８Ｍ２、Ｆ８Ｍ３、またはＦ８Ｄ１変異タンパク質を発現する組換えＲＣ７９細胞内で産生されたＦＵＴ８タンパク質のウエスタンブロットプロファイルである。グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, ＧＡＰＤＨ）の発現を、タンパク質ローディングコントロールとして用いている。変異ＦＵＴ８酵素を発現するＲＣ７９組換え細胞内でのＦＵＴ８タンパク質の発現量は、親ＲＣ７９細胞内でのＦＵＴ８タンパク質の発現量に類似するか、または同一である。 Ｆ８３Ｍ変異タンパク質を発現するＲＣ７９組換え細胞およびＲＣ７９親細胞のフローサイトメトリー解析である。破線のピークは、ローダミン（Rhodamin）-ＬＣＡで染色した、Ｆ８３Ｍを発現するＲＣ７９組換え細胞を表している。灰色で塗りつぶされたピークは、ローダミン－ＬＣＡ染色をしていない、Ｆ８３Ｍを発現するＲＣ７９組換え細胞（陰性対照）を表している。点線のピークは、ローダミン－ＬＣＡで染色した、ＲＣ７９細胞（Ｆ８３Ｍを発現しない親細胞）（陽性対照）を表している。 図３ａおよび図３ｂはＡＤＣＣアッセイの結果を示すグラフである。図３ａ～図３ｂは、ドナー１（図３ａ）およびドナー２（図３ｂ）由来のＰＢＭＣ細胞によるＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）およびアフコシル化抗ＣＤ２０ ｍＡｂのＡＤＣＣ活性をそれぞれ示している。アフコシル化抗ＣＤ２０ ｍＡｂ（クローンＲ１）のＡＤＣＣ活性は、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）に比べて著しく高い。 図３ａの説明を参照のこと。 図４ａ～図４ｃは、ＳＰＲバイオセンサー（BIACORE（商標）X100）を用いたＦｃγＲＩＩＩａ親和性アッセイのＳＰＲセンサーグラム（sensorgram）を示すグラフである。Ｈｉｓタグ化ＦｃγＲＩＩＩａ（１μｇ／ｍＬ）および５～８０ｎＭのアフコシル化抗ＣＤ２０ ｍＡｂ（図４ａ）、２０～３２０ｎＭのＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（図４ｂ）、または５～８０ｎＭのＧＡＺＹＶＡ（登録商標）（図４ｃ）を流速３０μＬ／ｍｉｎで順次、抗Ｈｉｓ抗体固定化ＣＭ５チップに通流させた。アフコシル化抗ＣＤ２０ ｍＡｂ（クローンＲ１）は、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）およびＧＡＺＹＶＡ（登録商標）よりも、ＦｃγＲＩＩＩａに対する強力な親和性を有していた。 図４ａの説明を参照のこと。 図４ａの説明を参照のこと。 ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）およびアフコシル化抗ＣＤ２０ ｍＡｂのＣＤＣ活性を示すグラフである。アフコシル化抗ＣＤ２０ ｍＡｂ（クローンＲ１）のＣＤＣ活性は、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）のそれと同程度であった。 食塩水（ビヒクル）、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）、またはアフコシル化抗ＣＤ２０ ｍＡｂ（クローンＲ１）で処理したマウスの腫瘍体積を示すグラフである。データ点は、腫瘍体積の平均値±ＳＤを示す（各群ｎ＝５）。アフコシル化抗ＣＤ２０ ｍＡｂ（クローンＲ１）の抗腫瘍効率（anti-tumor efficacy）はＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）に比べて著しく高い。 食塩水（ビヒクル）、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）、またはアフコシル化抗ＣＤ２０ ｍＡｂ（クローンＲ１）で処理したマウスから収集した腫瘍の重量を示すグラフである。アフコシル化抗ＣＤ２０抗体（Ｒ１クローン）で処理したマウスの腫瘍重量は、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）およびビヒクル群に比べ著しく軽い。 食塩水（ビヒクル）、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）、またはアフコシル化抗ＣＤ２０ ｍＡｂ（クローンＲ１）で処理したマウスの体重を示すグラフである。データ点は腫瘍体積の平均値±ＳＤを示す（各群ｎ＝５）。
発明の詳細な説明
本開示は、活性が改善されたアフコシル化抗体を製造する新規な方法に関する。本開示はまた、開示された方法により製造されるアフコシル化抗体、およびアフコシル化抗体を製造するのに用いる細胞に関する。開示されるアフコシル化抗体は、天然に存在するフコシル化抗体に比して、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性が高められている。
以下は、当業者が本発明の実施をする助けとなるように提示する詳細な説明である。本明細書に明示的に記載された実施形態の変更または変化が、本明細に含まれる情報の主旨また範囲を逸脱せずに、本開示に包含されるということを、当該分野において通常に知識を持つ者は理解するであろう。記載において用いられる用語は、単に特定の実施形態を説明するためのものであって、本発明の限定を意図するものではない。下記において用いられる段落の表題は単に構成の目的上のものであって、記載された発明の対象（subject matter）を限定するものとして解されるべきではない。
本明細書に挙げられる全ての刊行物、特許出願、特許、図面およびその他参照文献は、それらの一部も含み、あたかも本明細書において完全に開示および引用されるかのように、それら全体が参照として援用される。
特に説明がない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する技術分野において通常の知識を有する者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。単数形の用語「１つの（a）、（an）」、および「その（the）」は、文脈上明らかに他の意味を示す場合を除き、複数の指示対象を含む。同様に、単語「または（or）」は、文脈上明らかに他の意味を示す場合を除き、「および（and）」を含むよう意図されている。よって、「ＡまたはＢを含む」は、Ａ、またはＢ、或いはＡおよびＢを含むことを意味する。ポリペプチドに用いられる全てのアミノ酸のサイズ、および全ての分子量または分子質量の値はおおよそのものであり、説明のために提示されている。開示される方法の実施または試験には、本明細書に記載されたものと類似するまたは均等な方法および物質を用いることができるが、以下に好適な方法および物質が記載される。本明細書に挙げられる全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参照文献は、その全体が参照することにより援用される。競合のケースにおいては、用語の解釈を含め、本明細書は調整される。さらに、物質、方法、および実施例は単に例示であって、限定されることが意図されていない。
１．細胞におけるフコシル化の阻害
本開示の１態様は、細胞におけるフコシル化を阻害または低減する方法に関する。
ａ．宿主細胞
酵母、昆虫、両生類、魚類、爬虫類、鳥類、哺乳類、もしくはヒト、またはハイブリドーマ細胞由来の宿主細胞を含む任意の適した宿主細胞を、アフコシル化抗体を製造するのに用いることができる。宿主細胞は、未改変細胞もしくは細胞株、または遺伝子改変された（例えば、生物学的産物の産生を促進するため）細胞株であってよい。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、無血清培地のような所望の条件下、細胞懸濁培養または付着性細胞培養における増殖が可能となるように改変された細胞株である。
哺乳類の宿主細胞は、ヒトへの投与用の抗体に用いるのに有利であり得る。いくつかの実施形態において、宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であり、それは、多くの組換えタンパク質の発現に用いられる細胞株である。組換えタンパク質の発現に一般的に用いられるさらなる哺乳類の細胞株には、２９３ＨＥＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＮＳＯ細胞、およびＨＵＶＥＣ細胞が含まれる。他の実施形態において、宿主細胞は、抗体を発現する組換え細胞である。
本明細書にて提示される方法に有用なヒト細胞株の例には、２９３Ｔ（胎児性腎臓（embryonic kidney））、７８６－０（腎臓）、Ａ４９８（腎臓）、Ａ５４９（肺胞基底上皮（alveolar basal epithelial））、ＡＣＨＮ（腎臓）、ＢＴ－５４９（乳房）、ＢｘＰＣ－３（膵臓）、ＣＡＫＩ－１（腎臓）、Ｃａｐａｎ－ｉ（膵臓）、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ（白血病）、ＣＯＬＯ ２０５（結腸）、ＤＬＤ－１（結腸）、ＤＭＳ １１４（小細胞肺（small cell lung））、ＤＵ１４５（前立腺）、ＥＫＶＸ（非小細胞肺）、ＨＣＣ－２９９８（結腸）、ＨＣＴ－１５（結腸）、ＨＣＴ－１ １６（結腸）、ＨＴ２９（結腸）、Ｓ ＩＴ－ １０８０（線維肉腫）、ＨＥＫ ２９３（胎児性腎臓）、ＨｅＬａ（子宮頚部癌）、ＨｅｐＧ２（肝細胞癌）、ＨＬ－６０（ＴＢ）（白血病）、ＨＯＰ－６２（非小細胞肺）、ＨＯＰ－９２（非小細胞肺）、ＨＳ ５７８Ｔ（乳房）、ＨＴ－２９（結腸腺癌）、ＩＧ－ＯＶ１（卵巣）、ＩＭＲ３２（神経芽腫）、Ｊｕｒｋａｔ（Ｔリンパ球）、Ｋ－５６２（白血病）、ＫＭ １２（結腸）、ＫＭ２０Ｌ２（結腸）、ＬＡＮＳ（神経芽腫）、ＬＮＣａｐ．ＦＧＣ（コーカサス人種前立腺腺癌（Caucasian prostate adenocarcinoma））、ＬＯＸ ＩＭＶ１（メラノーマ）、ＬＸＦＬ ５２９（非小細胞肺）、Ｍ １４（メラノーマ）、Ｍ１９－ＭＥＬ（メラノーマ）、ＭＡＬＭＥ－３Ｍ（メラノーマ）、ＭＣＦＩＯＡ（乳腺上皮細胞）、ＭＣＩ'７（乳房）、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３（乳腺上皮細胞）、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８（乳房）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（乳房）、ＭＤＡ－Ｎ（乳房）、ＭＯＬＴ－４（白血病）、ＮＣｌ／ＡＤＲ－ＲＥＳ（卵巣）、ＮＣＩ－ １１２２．０（非小細胞肺）、ＮＣＩ－Ｈ２３（非小細胞肺）、ＮＣ１－Ｈ３２２Ｍ（非小細胞肺）、ＮＣＩ－Ｈ４６０（非小細胞肺）、ＮＣＩ－Ｈ５２２（非小細胞肺）、ＯＶＣＡＲ－３（卵巣）、ＱＶＣＡＲ－４（卵巣）、ＯＶＣＡＲ－５（卵巣）、ＯＶＣＡＲ－８（卵巣）、Ｐ３８８（白血病）、Ｐ３８８／ＡＤＲ（白血病）、ＰＣ－３（前立腺）、ＰＥＲＣ６（登録商標）（Ｅｌ－形質転換胎児性網膜）、ＲＰＭＩ－７９５１（メラノーマ）、ＲＰＭＩ－８２２６（白血病）、ＲＸＦ ３９３（腎臓）、ＲＸＦ－６３１（腎臓）、Ｓａｏｓ－２（骨）、ＳＦ－２６８（ＣＮＳ）、ＳＦ－２９５（ＣＮＳ）、ＳＦ－５３９（ＣＮＳ）、ＳＨＰ－７７（小細胞肺）、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ（神経芽腫）、ＳＫ－ＢＲ３（乳房）、ＳＫ－ＭＥＬ－２（メラノーマ）、ＳＫ－ＭＥＬ－５（メラノーマ）、ＳＫ－ＭＥＬ－２８（メラノーマ）、ＳＫ－ＯＶ－３（卵巣）、ＳＮ１２Ｋ１（腎臓）、ＳＮ１２Ｃ（腎臓）、ＳＮＢ－１９（ＣＮＳ）、ＳＮＢ－７５（ＣＮＳ）、ＳＮＢ－７８（ＣＮＳ）、ＳＲ（白血病）、ＳＷ－６２０（結腸）、Ｔ－４７Ｄ（乳房）、ＴＨＰ－１（単球由来マクロファージ）、ＴＫ－１０（腎臓）、Ｕ８７（神経膠芽腫）、Ｕ２９３（腎臓）、Ｕ２５１（ＣＮＳ）、ＵＡＣＣ－２５７（メラノーマ）、ＵＡＣＣ－６２（メラノーマ）、ＵＯ－３１（腎臓）、 Ｗ１３８（肺）、およびＸＦ ４９８（ＣＮＳ）の細胞株が含まれる。
本明細書にて提示される方法に有用な非ヒト霊長類細胞株の例には、サル腎臓（ＣＶＩ－７６）、アフリカミドリザル腎臓（ＶＥＲＯ－７６）、ミドリザル繊維芽細胞（ＣＯＳ－１）、およびＳＶ４０（ＣＯＳ－７）により形質転換されたサル腎臓（ＣＶＩ）細胞の細胞株が含まれる。さらなる哺乳類細胞株は当業者には周知であり、かつアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）カタログ（Manassas,VA）において整理されている。
ｂ．フコシル化経路における酵素の改変
本開示のアフコシル化抗体は、タンパク質のフコシル化を低減または阻害するようにフコシル化経路を変えた宿主細胞内で産生され得る。
ｉ．改変酵素（Modified enzyme）
本明細書で用いられる「改変酵素」という語句は、改変後にタンパク質の天然の酵素活性を改変または破壊するように変化させたフコシル化経路に天然に存在する、または野生型酵素由来のタンパク質を指す。改変酵素は、その野生型対応物を阻害または干渉して、宿主細胞における野生型酵素の活性を変える、抑制する、または低減する能力を有する。
改変酵素は、天然に存在する酵素を改変することによって、例えば、タンパク質の総電荷を変えること、化学的部分もしくはタンパク質部分を共有結合的に付着させること、アミノ酸置換、挿入、および／もしくは欠失を導入すること、ならびに／または任意のこれらの組み合わせによって製造することができる。いくつかの実施形態において、その天然に存在する酵素対応物に比べ、改変酵素はアミノ酸置換、付加、および／または欠失を有する。いくつかの実施形態において、その天然に存在する対応物に比べ、改変酵素は、１個～約２０個のアミノ酸置換、付加、および／または欠失を有する。アミノ酸置換、付加、および挿入は天然または非天然アミノ酸を用いて達成され得る。非天然存在アミノ酸には、限定はされないが、ε－Ｎリジン、β－アラニン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、チロキシン、γ－アミノ酪酸、ホモセリン、シトルリン、アミノ安息香酸、６－アミノカプロン酸（Ａｃａ；６－アミノヘキサン酸）、ヒドロキシプロリン、メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）、３－ニトロチロシン、ピログルタミン酸、および類似のものが含まれる。天然に存在するアミノ酸には、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンが含まれる。
改変酵素は、フコシル化経路における任意の天然に存在する酵素に由来するものであってよい。例えば、改変酵素は、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼ（ＧＭＤ）、ＧＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－Ｄ－マンノースエピメラーゼ－還元酵素（ＦＸ）、および／またはガラクトシド２－アルファ－Ｌ－フコシルトランスフェラーゼ１（ＦＵＴ１）、ガラクトシド２－アルファ－Ｌ－フコシルトランスフェラーゼ２（ＦＵＴ２）、ガラクトシド３（４）－Ｌ－フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ３）、アルファ（１，３）フコシルトランスフェラーゼ、骨髄特異的（ＦＵＴ４）、アルファ－（１，３）－フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ５）、アルファ－（１，３）－フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ６）、アルファ－（１，３）－フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ７）、アルファ－（１，６）－フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）、アルファ－（１，３）－フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ９）、タンパク質Ｏ－フコシルトランスフェラーゼ１（ＰＯＦＵＴ１），タンパク質Ｏ－フコシルトランスフェラーゼ２（ＰＯＦＵＴ２）を含むフコシルトランスフェラーゼのうちのいずれかに由来するものであってよい。
いくつかの実施形態において、フコシル化経路における１つよりの多くの酵素が改変される。特定の実施形態では、改変酵素は、ＧＭＤ、ＦＸ、および／またはＦＵＴ８に由来するものである。
ｉｉ．改変酵素をコードする核酸
本開示のアフコシル化抗体は、タンパク質のフコシル化を低減または阻害するようにフコシル化経路を変えた宿主細胞内で産生され得る。
いくつかの実施形態において、宿主細胞のフコシル化経路は、フコシル化経路における改変酵素をコードする核酸を細胞に導入することにより改変される。例えば、改変酵素をコードする核酸を、発現ベクター中に挿入し、宿主細胞にトランスフェクトすることができる。改変酵素をコードする核酸分子を、一過的に宿主細胞に導入するか、または宿主細胞のゲノムに安定にインテグレートすることができる。標準的な組換えＤＮＡ方法論を用いて改変酵素をコードする核酸を産生し、発現ベクターに核酸を組み込み、そしてベクターを宿主細胞に導入することができる。
いくつかの実施形態において、宿主細胞は２つ以上の改変酵素を発現することができる。例えば、宿主細胞に、２つ以上の改変酵素をコードする核酸をトランスフェクトすることができる。あるいは、宿主細胞に、各々が１つ以上の改変酵素をコードする１つより多い核酸をトランスフェクトすることができる。
改変酵素をコードする核酸は、追加の核酸配列を含んでいてよい。例えば、核酸は、宿主細胞におけるタンパク質の発現を制御するタンパク質タグ、選択マーカー、または調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、または核酸の転写もしくは翻訳を制御する他の発現制御エレメント(例えばポリアデニル化シグナル)を含んでいてよい。このような調節配列は当該分野において周知である。当業者は、調節配列の選択を含む発現ベクターの選択が、形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベル等を含むいくつかの要因に左右され得るということを理解するであろう。哺乳類宿主細胞発現の例示的な調節配列には、哺乳類細胞における高レベルのタンパク質発現を誘導するウイルス要素、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えばＣＭＶプロモーター／エンハンサー）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えばＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス（例えばアデノウイルス主要後期プロモーター（adenovirus major late promoter, ＡｄＭＬＰ））、およびポリオーマウィルスに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーが含まれる。
特定の実施形態において、ＧＭＤ、ＦＸ、および／またはＦＵＴに由来する改変酵素を含む核酸配列を宿主細胞に導入する。改変酵素を発現する宿主細胞において、フコシル化経路が変化する、阻害される、または低減することになる。
ｃ．改変酵素を発現する宿主細胞
本開示の別の態様は、フコシル化経路における改変酵素を発現する宿主細胞に関する。宿主細胞内における改変酵素の発現は野生型酵素の活性を妨害し、その結果としてフコシル化経路が阻害または低減される。よって、改変酵素を発現する宿主細胞内で産生されるタンパク質(例えば抗体)はアフコシル化される。
本明細書で用いられる語句「低フコシル化細胞」または「低フコシル化宿主細胞」は、細胞がフコシル化経路における改変酵素を発現することにより、フコシル化経路が阻害または低減された細胞を指す。
低フコシル化細胞は、フコシル化経路における改変酵素をコードする核酸配列を含む発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることによって、作製することができる。トランスフェクションは、当該分野において周知である技術を用いて実施することができる。例えば、トランスフェクションは、化学ベースの方法（例えば、脂質、リン酸カルシウム、カチオンポリマー、ＤＥＡＥ－デキストラン、活性化デンドリマー、磁気ビーズ等）を用いることにより、機器ベースの方法（例えばエレクトロポレーション、微粒子銃技術、マイクロインジェクション、レーザーフェクション（laserfection）/オプトインジェクション（optoinjection）等)により、またはウイルスベースの方法により、実施することができる。
発現ベクターに存在する選択マーカーを用い、非トランスフェクト細胞からトランスフェクト細胞を選別および単離することができる。加えて、様々な技術により、正常なフコシル化経路を有する細胞から、フコシル化経路が阻害または低減されたトランスフェクト細胞をさらに選別および単離することができる。例えば、フコシル化は、抗体、レクチン、代謝標識、または化学酵素的なストラテジーを用いて測定することができる。加えて、フコシル化経路が阻害または低減された細胞は、トランスフェクト細胞をレンズ豆レクチン（Lens culinaris agglutinin(LCA), Vector laboratories L-1040)に曝露することによって選別することができる。ＬＣＡは、Ｎ結合型オリゴ糖のα－１，６－フコシル化トリマンノース－コア構造を認識し、この構造を発現する細胞を細胞死経路へと送る。よって、ＬＣＡへの曝露を生き延びた細胞は、フコシル化経路が阻害または低減されたものであり、低フコシル化細胞と見なされる。
２．アフコシル化タンパク質
本開示の別の態様は、アフコシル化タンパク質を製造する方法に関する。いくつかの実施形態において、アフコシル化タンパク質はアフコシル化抗体である。
ａ．タンパク質
アフコシル化タンパク質として製造され得るタンパク質の非限定的な例には、ＧＰ－７３、ヘモペキシン、ＨＢｓＡｇ、Ｂ型肝炎ウイルス粒子、アルファ－酸－糖タンパク質、アルファ－１－抗キモトリプシン、アルファ－１－抗キモトリプシンＨｉｓ－Ｐｒｏ－ｌｅｓｓ、アルファ－１－アンチトリプシン、セロトランスフェリン、セルロプラスミン、アルファ－２－マクログロブリン、アルファ－２－ＨＳ－糖タンパク質、アルファ－フェトプロテイン、ハプトグロビン、フィブリノゲンガンマ鎖前駆体、免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、および類似のものを含む）、ＡＰＯ－Ｄ、キニノゲン、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、補体因子１前駆体、補体因子Ｉ重鎖、補体因子Ｉ軽鎖、補体Ｃ１ｓ、補体因子Ｂ前駆体、補体因子Ｂ Ｂａフラグメント、補体因子Ｂ Ｂｂフラグメント、補体Ｃ３前駆体、補体Ｃ３ベータ鎖、補体Ｃ３アルファ鎖、Ｃ３ａアナフィラトキシン、補体Ｃ３ｂアルファ’鎖、補体Ｃ３ｃフラグメント、補体Ｃ３ｄｇフラグメント、補体Ｃ３ｇフラグメント、補体Ｃ３ｄフラグメント、補体Ｃ３ｆフラグメント、補体Ｃ５、補体Ｃ５ベータ鎖、補体Ｃ５アルファ鎖、Ｃ５ａアナフィラトキシン、補体Ｃ５アルファ’鎖、補体Ｃ７、アルファ－１ Ｂ糖タンパク質、Ｂ－２－糖タンパク質、ビタミンＤ結合タンパク質、インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ２、アルファ－１Ｂ－糖タンパク質、アンジオテンシノーゲン前駆体、アンジオテンシン－１、アンジオテンシン－２、アンジオテンシン－３、ＧＡＲＰタンパク質、ベータ－２－糖タンパク質、クラステリン（Ａｐｏ Ｊ）、インテグリンアルファ－８前駆体糖タンパク質、インテグリンアルファ－８重鎖、インテグリンアルファ－８軽鎖、Ｃ型肝炎ウイルス粒子、ｅｌｆ－５、キニノゲンＨＳＰ３３－ホモログ、リシルエンドペプチダーゼならびにロイシンリッチリピート含有タンパク質３２前駆体が含まれる。
ｂ. 抗体
本明細書で用いられる用語「抗体」は、フコシル化され得るインタクト抗体分子およびそのフラグメントを広く包含する。例えば、抗体には、完全集合（fully assembled）免疫グロブリン（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体、キメラ抗体、脱免疫化（deimmunized）抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、霊長類化抗体、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、合成抗体、および組換抗体)；所望の活性または機能を有するインタクト抗体の部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、単一ドメインフラグメントを含む抗体の免疫学的フラグメント）；ならびにフコシル化され得るＦｃドメインを含むペプチドおよびタンパク質（例えばＦｃ融合タンパク質）が含まれる。
本明細書で用いられる用語「アフコシル化抗体」は、自然な状態の下で産生された抗体に比べ、フコシル化が阻害または著しく低減される条件下で産生された抗体またはその抗体フラグメントを指す。本開示の方法により製造されたアフコシル化抗体は、完全に（１００％）アフコシル化されているものであり得るか、あるいは、フコシル化およびアフコシル化分子の混合を含むものであり得る。例えば、いくつかの実施形態において、開示された方法により製造される抗体は、約２０％～約１００％アフコシル化された分子を含み得る。他の実施形態では、開示された方法により製造される抗体は、約４０％～約１００％アフコシル化された分子を含み得る。特定の実施形態において、開示された方法により製造される抗体は、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、または１００％アフコシル化された分子を含む。全てのＮ－グリコシル化抗体またはそのフラグメント（例えば、Ｆｃ融合タンパク質）がアフコシル化されている必要はない。
ｃ.抗体のタイプ
本明細書に開示された方法を用い、任意の抗体をアフコシル化抗体として製造することができる。開示された方法を用いて製造され得る抗体のタイプに限定はない。以下は、製造され得る抗体の例示列挙（non-exhaustive list）である:
腫瘍関連抗原を認識する抗体の例には、抗ＧＤ２抗体、抗ＧＤ３抗体、抗ＧＭ２抗体、抗ＨＥＲ２抗体，抗ＣＤ５２抗体、抗ＭＡＧＥ抗体、抗ＨＭ１２４抗体、抗副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）抗体、抗塩基性線維芽細胞増殖因子抗体および抗ＦＧＦ８抗体、抗塩基性線維芽細胞増殖因子受容体抗体および抗ＦＧＦＳ受容体抗体、抗インスリン様増殖因子抗体、抗インスリン様増殖因子受容体抗体、抗ＰＭＳＡ抗体、抗血管内皮細胞増殖因子抗体、抗血管内皮細胞増殖因子受容体抗体ならびに類似のものが含まれる。
アレルギーまたは炎症関連抗原を認識する抗体の例には、抗インターロイキン６抗体、抗インターロイキン６受容体抗体、抗インターロイキン５抗体、抗インターロイキン５受容体抗体および抗インターロイキン４抗体、抗腫瘍壊死因子抗体、抗腫瘍壊死因子受容体抗体、抗ＣＣＲ４抗体、抗ケモカイン抗体、抗ケモカイン受容体抗体および類似のものが含まれる。
循環器疾患関連抗原を認識する抗体の例には、抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体、抗血小板由来増殖因子抗体、抗血小板由来増殖因子受容体抗体および抗血液凝固因子抗体ならびに類似のものが含まれる。
ウイルスまたは細菌感染関連抗原を認識する抗体の例には、抗ｇｐｌ ２０抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＣＲ４抗体および抗ベロ毒素抗体ならびに類似のものが含まれる。
いくつかの治療用抗体は市販されており、例えば、ＶＥＧＦに結合する抗体（例えばベバシズマブ（Bevacizumab）(AVASTIN（登録商標）))、ＥＧＦＲに結合する抗体（例えばセツキシマブ（Cetuximab）(ERBITUX（登録商標）))、ＨＥＲ２に結合する抗体（例えばトラスツズマブ（Trastuzumab）(HERCEPTIN（登録商標）))、およびＣＤ２０に結合する抗体（例えばリツキシマブ（Rituximab）(RITUXAN（登録商標）))、ならびにＴＮＦａに結合するＦｃ融合タンパク質（例えば、ＴＮＦ受容体（ｐ７５）の受容体結合ドメインを含むエタネルセプト（Etanercept）(ENBREL（登録商標）)、ＣＤ２に結合するＦｃ融合タンパク質（例えば、ＬＦＡ－３のＣＤ２結合ドメインを含むアレファセプト（Alefacept）(AMEVIVE（登録商標）))、またはＢ７に結合するＦｃ融合タンパク質（ＣＴＬＡ４のＢ７結合ドメインを含むアバタセプト（Abatacept）(ORENCIA（登録商標）))である。
３．アフコシル化タンパク質を製造する方法
本開示のアフコシル化抗体を含むアフコシル化タンパク質は低フコシル化細胞内で産生される。当該分野において周知である技術を用い、例えばタンパク質をコードする発現ベクターを低フコシル化細胞にトランスフェクトすることで、アフコシル化タンパク質を低フコシル化細胞内で発現させることができる。
当該分野において周知である技術を用いてタンパク質をコードする発現ベクターを作製することができる。例えば、好ましくはタンパク質が発現されることとなる生物にとって最適化されたコドンを用い、アミノ酸配列を核酸配列に逆翻訳することにより、発現ベクターを構築することができる。次いで、タンパク質をコードする核酸、および任意の他の調節エレメントを組み立てて、所望の発現ベクターに挿入することができる。改変酵素を含む発現ベクターについて上述したように、発現ベクターは、追加の核酸配列、例えばタンパク質の発現を制御するタンパク質タグ、選択マーカー、または調節配列を含んでいてよい。次いで、トランスフェクションにより発現ベクターを宿主細胞に導入することができる。トランスフェクションは当該分野において周知である技術を用いて実施することができる。例えば、トランスフェクションは、化学ベースの方法（例えば、脂質、リン酸カルシウム、カチオンポリマー、ＤＥＡＥ－デキストラン、活性化デンドリマー、磁気ビーズ等）を用いて、機器ベースの方法（例えばエレクトロポレーション、微粒子銃技術、マイクロインジェクション、レーザーフェクション（laserfection）／オプトインジェクション（optoinjection）等)により、またはウイルスベースの方法により、実施することができる。次いで、選択した発現系および宿主に適した条件下、トランスフェクト細胞内でタンパク質を発現させることができる。次いで、発現されたタンパク質を、アフィニティーカラムまたは当該分野で周知の他の手法を用いて精製することができる。
改変酵素をコードする核酸(低フコシル化細胞となる)、およびタンパク質をコードする核酸(タンパク質を発現する)を、任意の順序で宿主細胞にトランスフェクトし、アフコシル化タンパク質を産生させることができる。例えば、宿主細胞に、先ず改変酵素をコードする核酸(低フコシル化細胞となる)をトランスフェクトしてから、タンパク質をコードする核酸(タンパク質を発現する)をトランスフェクトすることができる。あるいは、宿主細胞に、先ずタンパク質をコードする核酸(タンパク質を発現する)をトランスフェクトしてから、改変酵素をコードする核酸(低フコシル化細胞となる)をトランスフェクトすることができる。他の変形形態では、宿主細胞に、改変酵素をコードする核酸(低フコシル化細胞となる)、およびタンパク質をコードする核酸(タンパク質を発現する)を同時にトランスフェクトすることができる。
特定の実施形態において、下記のステップにしたがって、先ず低フコシル化細胞を作製してから、タンパク質をコードする核酸を低フコシル化細胞にトランスフェクトすることにより、アフコシル化タンパク質を製造する：
ａ）タンパク質を発現するのに適した宿主細胞を得る；
ｂ）改変酵素をコードする核酸を宿主細胞にトランスフェクトする；
ｃ）低フコシル化を有するトランスフェクト細胞を選別および／または単離する；
ｄ）タンパク質をコードする核酸を低フコシル化細胞にトランスフェクトする；
ｅ）タンパク質をコードする核酸をトランスフェクトした低フコシル化細胞を選別および／または単離する；
ｆ）低フコシル化細胞内でのタンパク質の発現を誘発する。
別の実施形態では、下記のステップにしたがって、宿主細胞に先ずはタンパク質をコードする核酸をトランスフェクトしてから、その細胞に改変酵素をコードする核酸をトランスフェクトすることにより、アフコシル化タンパク質を製造する：
ａ）タンパク質を発現するのに適した宿主細胞を得る；
ｂ）タンパク質をコードする核酸を宿主細胞にトランスフェクトする；
ｃ）タンパク質をコードする核酸をトランスフェクトした細胞を選別および／または単離する；
ｄ）改変酵素をコードする核酸をステップ（ｃ）における細胞にトランスフェクトする；
ｅ）低フコシル化を有するステップ（ｄ）におけるトランスフェクト細胞を選別および／または単離する；
ｆ）低フコシル化細胞内でのタンパク質の発現を誘発する。
上記実施形態の変形形態において、アフコシル化タンパク質を：
ａ）タンパク質を発現または過剰発現する宿主細胞を得る；
ｂ）改変酵素をコードする核酸を宿主細胞にトランスフェクトする；
ｃ）低フコシル化を有するトランスフェクト宿主細胞を選別および／または単離する；
ｄ）低フコシル化細胞内でのタンパク質の発現を誘発する
ことにより製造する。
また別の実施形態において、下記のように、改変酵素をコードする核酸(低フコシル化細胞となる)、およびタンパク質をコードする核酸(タンパク質を発現する)を同時に宿主細胞にトランスフェクトすることにより、アフコシル化タンパク質を製造する：
ａ）タンパク質を発現するのに適した宿主細胞を得る；
ｂ）宿主細胞に、タンパク質をコードする第１の核酸および改変酵素をコードする第２の核酸をトランスフェクトする；
ｃ）タンパク質を発現し、かつ低フコシル化を有するトランスフェクト宿主細胞を選別および／または単離する；
ｄ）低フコシル化細胞内でのタンパク質の発現を誘発する。
上述した方法を用いて製造された抗体を含むアフコシル化タンパク質を、当該分野において周知である方法を用いて精製することができる。例えば、上述した方法により製造された抗体を含むアフコシル化タンパク質を、生理化学的分画（physiochemical fractionation）、抗体クラス特異的アフィニティー、抗原特異的アフィニティー等により精製することができる。
４．アフコシル化抗体の改善された特性
本開示の方法により製造されるアフコシル化抗体は、標準的な方法を用いて製造された抗体に比べ、特性が改善されている。
精製アフコシル化抗体の活性は、ＥＬＩＳＡおよび蛍光法および類似の方法により測定することができる。抗原陽性培養細胞株の細胞傷害活性を、そのＡＤＣＣおよびＣＤＣおよび類似のものを測定することによって評価することができる。ヒトにおける抗体の安全性および治療効果は、比較的ヒトに近い動物種の適したモデルを用いて評価することができる。
ａ．ＡＤＣＣ活性の向上
本開示のアフコシル化抗体は、標準的な方法を用いて製造された抗体に比べ、ＡＤＣＣ活性が向上している。
本明細書で用いられる「ＡＤＣＣ活性」は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）反応を誘発する抗体の能力を指す。ＡＤＣＣは、ＦｃＲｓを発現する抗原非特異的な細胞障害性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が、標的細胞の表面に結合した抗体を認識した後、標的細胞の溶解（つまり「殺傷」）を引き起こすという細胞性反応である。ＡＤＣＣにおける主要なメディエーター細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＦｃγＲＩＩＩＡは活性化受容体であり、ＦｃγＲＩＩＩＢは阻害性受容体である。単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。ＡＤＣＣ活性は、実施例３で述べられるアッセイのようなｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを用いて直接評価することができる。
ＡＤＣＣ活性はｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを用いて直接評価することができる。いくつかの実施形態において、本開示のアフコシル化抗体のＡＤＣＣ活性は、野生型対照自体のそれよりも少なくとも０．５、１、２、３、５、１０、２０、５０、１００倍高い。
アフコシル化抗体のＡＤＣＣ活性は高められているため、アフコシル化された治療用抗体は、それらのフコシル化対応物に比べ、より低い量または濃度で投与することが可能である。いくつかの実施形態において、本開示のアフコシル化抗体の濃度は、そのフコシル化対応物と比較して、少なくとも２、３、５、１０、２０、３０、５０、または１００倍低くてよい。いくつかの実施形態において、本開示のアフコシル化抗体は、その野生型対応物と比較して、より高い最大標的細胞溶解（maximal target cell lysis）を示し得る。例えば、本開示のアフコシル化抗体の最大標的細胞溶解は、その野生型対応物と比較して、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上高い。
ｂ．ＣＤＣ活性の向上
本開示のアフコシル化抗体は、標準的な方法を用いて製造された抗体に比べ、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性が向上している。
本明細書で用いられる「ＣＤＣ活性」は、標的細胞に結合した抗体を認識した後に、標的細胞の溶解を引き起こす補体系の１つまたはそれ以上の成分の反応を指す。本開示のアフコシル化抗体はＣＤＣ活性を低減または抑制することはないが、その代わりとして、そのフコシル化対応物と同様に、またはこれに比べてよりＣＤＣ活性を維持する。
本発明はＣＤＣ機能が高められたアフコシル化抗体をさらに提供する。１実施形態において、本発明のＦｃ変異体は向上したＣＤＣを有する。別の実施形態において、前記アフコシル化抗体は、類似の（comparable）分子のそれに比べ、少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも５倍または少なくとも１０倍または少なくとも５０倍または少なくとも１００倍高いＣＤＣ活性を有する。
４．アフコシル化抗体の使用
本開示のアフコシル化抗体は、静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、皮内（ｉ．ｄ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、または任意の粘膜表面経由、例えば経口（ｐ．ｏ．）、舌下（ｓ．ｌ．）、口腔、経鼻的、直腸性、経膣的、または経肺経路（via pulmonary route）投与することができる。
アフコシル化抗体は、癌、炎症性疾患、免疫および自己免疫疾患、アレルギー、循環器疾患（例えば動脈硬化症)、ならびにウイルスまたは細菌感染を含む様々な疾患を治療または予防するのに有用である。
本発明のアフコシル化抗体の用量は、対象および特定の投与の形態によって変化し得る。必要な投薬量は、限定はされないが、抗体のターゲット、対象の種、および対象の大きさ／体重を含む当業者には周知である多数の要因によって変わり得る。投薬量は０．１～１００，０００μｇ／ｋｇ体重の範囲とすることができる。アフコシル化抗体は単回投与または複数回投与で投与することができる。アフコシル化抗体は、２４時間に１回、２４時間に複数回、または持続注入により投与することができる。アフコシル化抗体は、連続的に、または特定のスケジュールで投与することができる。動物モデルから得られる用量－反応曲線により有効用量を推定することが可能である。
４．特定の実施形態
本発明の特定の実施形態には、限定はされないが、下記のものが含まれる：
（１）フコシル化経路の少なくとも１つの改変酵素をコードする核酸を宿主細胞に導入してアフコシル化タンパク質を産生させるステップを含む、宿主細胞内でアフコシル化タンパク質を産生させるための方法。
（２）改変酵素が、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼ（ＧＭＤ）、ＧＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－Ｄ－マンノースエピメラーゼ－還元酵素（ＦＸ）、またはフコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ）に由来する、（１）に記載の方法。
（３）改変酵素がフコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ）に由来する、（１）に記載の方法。
（４）改変酵素がα－１，６－フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）に由来する、（１）に記載の方法。
（５）改変酵素が、宿主細胞において、改変酵素の由来元である野生型酵素の活性を低減または阻害する、（１）に記載の方法。
（６）改変酵素が宿主細胞においてフコシル化を阻害または低減する、（１）に記載の方法。
（７）宿主細胞内で産生されるアフコシル化タンパク質が、アフコシル化抗体またはそのフラグメントである、（１）に記載の方法。
（８）アフコシル化抗体またはそのフラグメントが少なくとも９０％アフコシル化されている、（７）に記載の方法。
（９）そのフコシル化対応物と比較して、アフコシル化抗体は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性が高められている、（７）に記載の方法。
（１０）そのフコシル化対応物と比較して、アフコシル化抗体の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性が低減または抑制されていない、（７）に記載の方法。
（１１）フコシル化経路の改変酵素をコードする第１の核酸配列および産生されるべきタンパク質をコードする第２の核酸配列を宿主細胞にトランスフェクトするステップを含む宿主細胞内でアフコシル化されたタンパク質を産生させる方法。
（１２）第１の核酸および第２の核酸が同時に宿主細胞にトランスフェクトされる、（１１）に記載の方法。
（１３）産生されたアフコシル化タンパク質が抗体および／またはそのフラグメントである、（１２）に記載の方法。
（１４）第１の核酸が、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼ（ＧＭＤ）、ＧＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－Ｄ－マンノースエピメラーゼ－還元酵素（ＦＸ）、および／またはフコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ）由来の改変酵素をコードする、（１１）に記載の方法。
（１５）第１の核酸がα－１，６－フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）由来の改変酵素をコードする、（１１）に記載の方法。
（１６）
（ａ）改変酵素をコードする第１の核酸を宿主細胞にトランスフェクトするステップ；
（ｂ）低フコシル化を有するトランスフェクト細胞を選別および単離するステップ；
（ｃ）産生されるべきタンパク質をコードする第２の核酸を低フコシル化細胞にトランスフェクトするステップ；
（ｄ）低フコシル化細胞内で産生されるべきタンパク質を発現させるステップ
を含む（１１）に記載の方法。
（１７）産生されたアフコシル化タンパク質が抗体および／またはそのフラグメントである、（１１）に記載の方法。
（１８）
（ａ）産生されるべきタンパク質をコードする第２の核酸を宿主細胞にトランスフェクトするステップ；
（ｂ）第２の核酸がトランスフェクトされた細胞を選別および単離するステップ；
（ｃ）改変酵素をコードする第１の核酸をステップ（ｂ）における細胞にトランスフェクトするステップ；
（ｄ）低フコシル化を有するトランスフェクト細胞を選別および単離するステップ；
（ｅ）低フコシル化細胞内で産生されるべきタンパク質を発現させるステップ
を含む（１１）に記載の方法。
（１９）産生されたアフコシル化タンパク質が抗体および／またはそのフラグメントである、（１８）に記載の方法。
５．さらなる実施形態
本発明のさらなる実施形態には、限定はされないが、下記のものが含まれる：
（１）少なくとも１つの改変酵素をコードする核酸を宿主細胞に導入して宿主細胞内でアフコシル化抗体を産生させるステップを含む、アフコシル化抗体を製造するための方法。
（２）改変酵素が、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼ（ＧＭＤ）、ＧＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－Ｄ－マンノースエピメラーゼ－還元酵素（ＦＸ）、またはフコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ）由来である、（１）に記載の方法。
（３）改変酵素がフコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ）由来である、（１）に記載の方法。
（４）改変酵素がα－１，６－フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）由来である、（１）に記載の方法。
（５）改変酵素が宿主細胞における野生型フコシル化酵素の活性を阻害する、（１）に記載の方法。
（６）改変酵素が宿主細胞における抗体のフコシル化を阻害および／または低減する、（１）に記載の方法。
（７）アフコシル化抗体のＡＤＣＣが高められている、（１）に記載の方法。
（８）アフコシル化抗体のＣＤＣ活性が低減または抑制されていない、（１）に記載の方法。
（９）
（ａ）宿主細胞を準備するステップ、
（ｂ）少なくとも１つの改変酵素をコードする核酸を宿主細胞に導入するステップ、および
（ｃ）宿主細胞内でアフコシル化抗体を産生させるステップ
を含む、アフコシル化抗体を製造するための方法。
（１０）ステップ（ａ）において、宿主細胞は、抗体をコードする少なくとも１つの核酸を含む、（９）に記載の方法。
（１１）ステップ（ｂ）の後に、抗体をコードする核酸を宿主細胞にさらに導入する（９）に記載の方法。
（１２）改変酵素が、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼ（ＧＭＤ）、ＧＤＰ－４－ケト－６－デオキシ－Ｄ－マンノースエピメラーゼ－還元酵素（ＦＸ）、および／またはフコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ）由来である、（９）に記載の方法。
（１３）改変酵素がフコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ）由来である、（９）に記載の方法。
（１４）改変酵素がα－１，６－フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）由来である、（９）に記載の方法。
（１５）改変酵素が、宿主細胞におけるフコシル化酵素の活性を阻害する、（９）に記載の方法。
（１６）改変酵素が、宿主細胞における抗体の糖化を阻害および低減する、（９）に記載の方法。
（１７）アフコシル化抗体のＡＤＣＣが高められている、（９）に記載の方法。
（１８）アフコシル化抗体のＣＤＣ活性が低減または抑制されていない、（９）に記載の方法。
（１９）（１）または（９）に記載の方法で製造されたアフコシル化抗体であって、ＡＤＣＣが高められている、アフコシル化抗体。
（２０）アフコシル化抗体がヒト抗体またはそのフラグメントである、（１９）に記載の抗体。
（２１）アフコシル化抗体が元のＣＤＣ活性を維持する、（１９）に記載の抗体。
（２２）（１９）に記載のアフコシル化抗体と、医薬的に許容される担体または賦形剤とを含む、医薬組成物。
（２３）少なくとも１つの改変酵素をコードする核酸を含む低フコシル化を有するか、または有さない、細胞。
本発明のさらなる特定の実施形態には、限定はされないが、以下の実施例が含まれる。
実施例１
フコシル化経路における改変酵素および改変酵素を発現する安定細胞株の作製
１．細胞株
ジヒドロ葉酸還元酵素活性が欠乏したＣＨＯ細胞変異体である市販のＣＨＯｄｈｆｒ（－）細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－９０９６）をＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＣＲＣ，台湾）より購入した。そのＣＨＯｄｈｆｒ（－）細胞株を３つの別々の培養物に分け、次のように処理した。
第１の培養物に、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（リツキシマブ、タンパク質ＣＤ２０に対するキメラモノクローナル抗体）をコードする発現ベクターをトランスフェクトした。ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）を発現する安定クローンを得ると共に、ＲＣ７９と同定した。
第２の培養物に、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ、タンパク質ＨＥＲ２に対するモノクローナル抗体）をコードする発現ベクターをトランスフェクトした。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）を発現する安定クローンを得ると共に、ＨＣ５９と同定した。
第３の培養物を処理せずにおき、ＣＨＯｄｈｆｒ（－）細胞株のままとした。
２．ＦＵＴ８およびＧＭＤの改変酵素をコードする発現ベクターの構築
改変酵素ＦＵＴ８およびＧＭＤをコードするいくつかの発現ベクターを構築した。
Ｆ８３Ｍ、Ｆ８Ｍ１、Ｆ８Ｍ２、Ｆ８Ｍ３、およびＦ８Ｄ１の変異体は、α－１，６－フコシルトランスフェラーゼ、野生型ＦＵＴ８タンパク質(GenBank No. NP_058589.2)のそれぞれ異なる修飾（modification）を表す。表１は、各ＦＵＴ８ベクターの野生型核酸配列に対してなされた修飾、ならびに発現された酵素において生じたアミノ酸の変化を要約したものである。詳細には、Ｆ８３Ｍは、野生型ＦＵＴ８タンパク質において、Ｒ３６５Ａ、Ｄ４０９Ａ、およびＤ４５３Ａに３つの修飾を有する変異体を表す。Ｆ８Ｍ１、Ｆ８Ｍ２、およびＦ８Ｍ３はそれぞれ、野生型ＦＵＴ８タンパク質においてＫ３６９Ｅ、Ｄ４０９Ｋ、およびＳ４６９Ｖに各々１つの修飾を有する変異体を表す。Ｆ８Ｄ１は、野生型ＦＵＴ８タンパク質中の位置３６５～３８６においてアミノ酸残基の欠失を有する変異体を表す。
表２は、ＧＭＤベクターの野生型核酸配列に対してなされた修飾、ならびに発現された酵素において生じたアミノ酸の変化を要約したものである。詳細には、変異ＧＭＤ４Ｍは、野生型ＧＭＤタンパク質においてＴ１５５Ａ、Ｅ１５７Ａ、Ｙ１７９Ａ、およびＫ１８３Ａに４つの変異体を有するＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼ、野生型ＧＭＤタンパク質（GenBank No. NP_001233625.1）の修飾を表す。
Ｆ８３Ｍ、Ｆ８Ｍ１、Ｆ８Ｍ２、Ｆ８Ｍ３、Ｆ８Ｄ１、およびＧＭＤ４Ｍをコードする核酸配列の全てをＧｅｎｅＤｉｒｅＸ社にて合成し、次いでｐＨＤ発現ベクター（pcDNA3.1Hygro, Invitrogen, Carlsbad, CA, cat. no. V870-20 with dhfr gene)のＰａｃＩ／ＥｃｏＲｖまたはＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶ部位にサブクローニングしてｐＨＤ／Ｆ８３Ｍ、ｐＨＤ／Ｆ８Ｍ１、ｐＨＤ／Ｆ８Ｍ２、ｐＨＤ／Ｆ８Ｍ３、ｐＨＤ／Ｆ８Ｄ１、およびｐＨＤ／ＧＭＤ４Ｍプラスミドを形成した。
３．改変酵素を発現する安定組換え細胞株の作製
ｐＨＤ／Ｆ８３Ｍ、ｐＨＤ／Ｆ８Ｍ１、ｐＨＤ／Ｆ８Ｍ２、ｐＨＤ／Ｆ８Ｍ３、ｐＨＤ／Ｆ８Ｄ１、およびｐＨＤ／ＧＭＤ４Ｍプラスミドを、（ａ）ＲＣ７９細胞株（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）を発現するＣＨＯ細胞）、（ｂ）ＨＣ５９細胞株（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）を発現するＣＨＯ細胞）、および（ｃ）ＣＨＯｄｈｆｒ（－）細胞（ジヒドロ葉酸還元酵素活性が欠乏したＣＨＯ細胞変異体）を含む異なる細胞株に、エレクトロポレーション（PA4000 PULSEAGILE（登録商標）エレクトロポレーター, Cyto Pulse Sciences）によりトランスフェクトした。
ａ．ＲＣ７９細胞
先ず、０．１～０．２５ｍｇ／ｍＬのハイグロマイシンを加えたＲＣ７９培地（０．４μＭのＭＴＸ、０．５ｍｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ、０．０５ｍｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎ、４ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ－Ｉ、および０．０１％ Ｆ－６８を含有するＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）３０２無血清培地）でトランスフェクトＲＣ７９細胞株を培養した。次いで、０．４μＭのＭＴＸ、０．５ｍｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ、０．０５ｍｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎｅ、４ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ－Ｉ、０．０１％ Ｆ－６８、および０．２５ｍｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含有するＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）３０２無血清培地中でトランスフェクト細胞を培養し、下記のようにレンズ豆レクチン（ＬＣＡ）で分離して、ＲＣ７９Ｆ８３Ｍ、ＲＣ７９Ｆ８Ｍ１、ＲＣ７９Ｆ８Ｍ２、ＲＣ７９Ｆ８Ｍ３、ＲＣ７９Ｆ８Ｄ１、およびＲＣ７９－ＧＭＤ４Ｍ細胞株を含む５つの細胞プールを生成した。
ｂ．ＨＣ５９細胞
先ず、０．１～０．２５ｍｇ／ｍＬのハイグロマイシンを加えたＨＣ５９培地（０．８μＭのＭＴＸ、０．５ｍｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ、０．０５ｍｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎｅ、および４ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ－Ｉを含有するＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）３２５ＰＦ ＣＨＯ培地）中で、トランスフェクトＨＣ５９細胞株を培養した。次いで、トランスフェクト細胞を、０．８μＭのＭＴＸ、０．５ｍｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ、０．０５ｍｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎｅ、４ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ－Ｉ、および０．２５ｍｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含有するＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）３２５ ＰＦ ＣＨＯ培地中で培養し、下記のようにＬＣＡで分離して、ＨＣ５９Ｆ８３Ｍ細胞株の細胞プールを生成した。
ｃ．ＣＨＯｄｈｆｒ（－）細胞
先ず、トランスフェクトＣＨＯｄｈｆｒ（－）細胞株を、４ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ－Ｉ、および０．１～０．２５ｍｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含有するＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）３２５ ＰＦ ＣＨＯ培地中で培養した。次いで、トランスフェクト細胞を、４ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ－Ｉ、０．２５ｍｇ／ｍＬのハイグロマイシン、および０．０１μＭのＭＴＸを含有するＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）３２５ ＰＦ ＣＨＯ培地で培養し、Ｃ１０９Ｆ８３Ｍ細胞株の細胞プールを生成した。
４．低フコシル化を有する細胞の単離
本実施例では、ローダミン標識レンズ豆レクチン（ＬＣＡ）(Vector Laboratories, Cat. RL-1042)を用い、低フコシル化を有する細胞を選別した。
ＲＣ７９、ＨＣ５９、およびＣＨＯトランスフェクタント全てを、選択圧としてハイグロマイシンを含有する一次選択培地（primary selection medium）に供し、次いで、Ｎ結合型オリゴ糖のα－１，６－フコシル化トリマンノース－コア構造を認識し、この構造を発現する細胞を細胞死経路へと送る、ＬＣＡを用いる最終選択を行った。最初に、ＲＣ７９、ＨＣ５９、またはＣＨＯのトランスフェクタントを１．２×１０５細胞／ｍＬで、０．４ｍｇ／ｍＬのＬＣＡを加えた２．５ｍＬの新鮮培地に播種し、３日目または４日目に細胞生存率をカウントした。細胞生存率が８０％に達するまで細胞をこの初期選択培地で培養した。細胞生存率が８０％に達した後、１．２×１０５細胞／ｍＬで、ＬＣＡの濃度を徐々に高め、新鮮な選択培地に細胞を再懸濁させた。ＬＣＡの最終濃度が０．６～１．２ｍｇ／ｍＬに達するまでＬＣＡ選択を数回繰り返した。
細胞表面におけるフコースレベルを分析するため、細胞をＬＣＡで標識し、フローサイトメトリーにより分析した。先ず、選択試薬ＬＣＡからのシグナル干渉を取り除くため、ＬＣＡを含まない完全培地に細胞を播種して１４日置いた。次いで、３×１０５の細胞を１ｍＬの氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、１％ウシ血清アルブミンおよび５μｇ／ｍＬのＬＣＡを含有する２００μｌの冷ＰＢＳ中に再懸濁させた。氷上で３０分インキュベートした後、細胞を１ｍＬの氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を３５０μｌの冷ＰＢＳ中に再懸濁させ、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーター（BD Biosciences, San Jose, CA）を用いて分析した。
次に、１×１０７の細胞を１０ｍＬの氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、１％ウシ血清アルブミンおよび５μｇ／ｍＬのＬＣＡを含有する６．５ｍＬの氷冷ＰＢＳ中に再懸濁させた。氷上で３０分インキュベートした後、細胞を１０ｍＬの冷ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を、１％の熱失活させたウシ胎児血清（GIBCO, Cat. 10091-148）およびＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Invitrogen, Cat.15240062)を加えた１ｍＬの氷冷ＰＢＳ中に再懸濁させた。
ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）またはＩｎｆｌｕｘ（商標）セルソーター(BD Biosciences, San Jose, CA)により細胞を分析および選別した。フコシル化レベルの低い細胞の均質集団を生成するため、異なるクローンにつき、１～３ラウンドのソーティングが要された。加えて、低フコシル化を有する安定クローンを、ＣＬＯＮＥＰＩＸ（商標）２システム（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＤＥＶＩＣＥＳ（登録商標））を用いて単離し、９６ウェルプレートに移した。およそ２週間培養した後、細胞を６ウェルプレートに移し、フローサイトメトリーで再び分析した。次いで、低フコシル化を有する細胞をフィルター管に移して流加培養し、細胞性能、および得られた細胞から精製した抗体のフコシル化レベルを評価した。
５．ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）を発現するＣ１０９Ｆ８３Ｍ細胞株の作製
ＬＣＡにより低フコシル化ＣＨＯｄｈｆｒ（－）細胞（Ｃ１０９Ｆ８３Ｍ細胞）を単離した後、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）をコードする核酸をエレクトロポレーション（ＰＡ４０００ ＰＵＬＳＥＡＧＩＬＥ（登録商標）エレクトロポレーター, Cyto Pulse Sciences)により細胞にトランスフェクトした。Ｃ１０９Ｆ８３Ｍの低フコース単一クローン、ＡＦ９７を単離し、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）をコードする核酸をエレクトロポレーションによりトランスフェクトして、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）を発現させるようにした。トランスフェクタントを、非選択培地の入った２５Ｔフラスコに移し、回復・成長させた。４８時間後、４ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ、ハイグロマイシン－Ｂ、Ｚｅｏｃｉｎおよび０．０１μＭのＭＴＸを含有する選択培地でトランスフェクタントを培養した。ＣＬＯＮＥＰＩＸ（商標）２システムを用いて単一の細胞を選び取り、ＡＦ９７抗ＣＤ２０クローンを生成した。
得られた細胞はＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）を発現する低フコシル化ＣＨＯｄｈｆｒ（－）細胞であった。本明細書ではＡＦ９７抗ＣＤ２０細胞株と称する。
実施例２
アフコシル化抗体の発現および分析
１．抗体の発現および精製
実施例１で得られた低フコシル化活性を有する細胞を、抗体を発現させるためにバッチまたは流加培養した。細胞から精製した抗体に単糖分析を行って、Ｆｃ領域における糖鎖を定量分析した。
組換えＲＣ７９細胞を、４ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘおよび０．０１％ Ｆ－６８を含有するＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）３０２無血清培地で培養し、シェーカーインキュベーター（Infors Multitron Pro）中に３７℃および５％ ＣＯ２で維持した。
組換えＨＣ７９細胞を、０．８μＭのＭＴＸ、０．５ｍｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ、０．０５ｍｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎｅ、４ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ－Ｉ、および０．２５ｍｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含有するＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）３２５ ＰＦ ＣＨＯ培地で培養し、シェーカーインキュベーター（Infors Multitron Pro）中に３７℃および５％ ＣＯ２で維持した。
細胞培養のパラメーターを毎日ルーチン的に監視した。細胞密度および生存率を、血球計数器を用いトリパンブルー色素排除法により測定した。細胞生存率が６０％を下回ったとき、その条件培地を遠心分離により回収し、発現された抗体をプロテインＡ樹脂で精製した。５カラム容量分の０．１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．３でプロテインＡカラムを平衡化してから、カラムにサンプルをロードした。結合しなかったタンパク質を０．１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．３（２カラム容量分）およびＰＢＳ、ｐＨ６．５（１０カラム容量分）で洗い流した。さらにそのカラムを０．１Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ６．５（１０カラム容量分）で洗浄した。最後に、０．１Ｍのグリシン、ｐＨ２．８で抗体を溶出し、同じ溶出容量の０．１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．３で中和した。
２．抗体のＮ－グリカンプロファイルの決定
ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標）システムによりＮ－グリカンプロファイルを分析した。先ず、０．３ｍｇの抗体サンプルを、３Ｕ ＰＮＧａｓｅ－Ｆが入った０．３ｍＬの消化緩衝液（１５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で３７℃１８時間消化した。放出されたＮ－グリカンを、ＡＭＩＣＯＮ（登録商標）Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ ３０Ｋデバイスを用い１３０００ｒｐｍで５分限外濾過することにより抗体から分離した後、３時間凍結乾燥した。次いで、乾燥したＮ－グリカンを３０μＬのｄｄＨ２Ｏおよび４５μＬの２－ＡＢ標識試薬（０．３４Ｍのアントラニルアミドおよび１Ｍのシアノ水素化ホウ素ナトリウムの入ったＤＭＳＯ－酢酸（７：３ｖ／ｖ）溶媒）中に溶解し、６５℃で３時間インキュベートした。過剰量の２－ＡＢ標識試薬をＰＤ ＭＩＮＩＴＲＡＰ（商標）Ｇ１０サイズ排除カラムで除去した。標識されたＮ－グリカンを一晩凍結乾燥し、５０μＬのｄｄＨ２Ｏ中に再溶解してＵＰＬＣ検出に供した。ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標）システムによりグリカンＢＥＨ Ａｍｉｄｅカラムを用い６０℃でＮ－グリカンプロファイルを得た。１００ｍＭのぎ酸アンモニウム、ｐＨ４．５／アセトニトリル直線勾配を用い、異なる形態のＮ－グリカンを分離した。
フローサイトメトリーの結果から、全ての細胞のタイプにおいて、Ｆ８３Ｍタンパク質を過剰発現する細胞の表面上のＬＣＡ結合が極めて低いことが判明した。同様に、Ｆ８Ｍ１、Ｆ８Ｍ２、Ｆ８Ｍ３、Ｆ８Ｄ１、またはＧＭＤ４Ｍタンパク質を過剰発現するＲＣ７９細胞においてＬＣＡ結合は検出されなかった（データには示していない）。
表３は、未改変フコシル化経路を有するＲＣ７９およびＨＣ５９細胞、ならびにＦ８３Ｍ改変酵素を過剰発現することによりそのフコシル化経路が改変されたＲＣ７９およびＨＣ５９クローンで産生された抗体のＮ－グリカンプロファイルを示している。表３のデータは、未改変フコシル化経路を有する細胞で産生された抗ＣＤ２０抗体および抗ＥｒｂＢ２抗体の大部分が重度にフコシル化されたことを示している。詳細には、抗ＣＤ２０抗体の３．６７％および抗ＥｒｂＢ２抗体の３．６４％のみが、これら細胞内でアフコシル化されていた。これに対し、Ｆ８３Ｍ改変酵素を過剰発現する細胞で産生された抗体はフコシル化レベルが非常に低かった。詳細には、抗ＣＤ２０抗体の約９８．８６～９８．９１％および抗ＥｒｂＢ２抗体の約９２．１２～９６．５２％が、Ｆ８３Ｍ改変酵素を過剰発現する細胞内でアフコシル化されていた。
加えて、表４は、未改変フコシル化経路を有するＲＣ７９細胞、ならびにＦ８Ｍ１、Ｆ８Ｍ２、Ｆ８Ｍ３、Ｆ８Ｄ１、またはＧＭＤ４Ｍ改変酵素のうちの１つを過剰発現することによりそのフコシル化経路が改変されたＲＣ７９クローンで産生された抗体のＮ－グリカンプロファイルを示している。表４のデータは、未改変フコシル化経路を有するＲＣ７９細胞で産生された抗ＣＤ２０抗体の大部分が重度にフコシル化されたことを示している。詳細には、抗ＣＤ２０抗体の３．６７％のみが、これら細胞内でアフコシル化されていた。これに対し、改変酵素を過剰発現するＲＣ７９細胞で産生された抗体はフコシル化レベルが非常に低かった。詳細には、表４に示されるように、Ｆ８Ｍ１、Ｆ８Ｍ２、Ｆ８Ｍ３、Ｆ８Ｄ１、またはＧＭＤ４Ｍ改変酵素を過剰発現する細胞により産生された抗ＣＤ２０抗体のアフコシル化レベルは、約９２．７８％～約９７．１６％であった。
表４はまた、ＦＵＴ８改変酵素（Ｆ８Ｍ１、Ｆ８Ｍ２、Ｆ８Ｍ３、Ｆ８Ｄ１）のうちの１つを過剰発現する細胞により産生された抗体のアフコシル化レベルが９５．７０％～９７．１６％であり、ＧＭＤ改変酵素（ＧＭＤ４Ｍ）を過剰発現する細胞により産生された抗体のフコシル化レベルが９２．７８％であったことを示している。これらの結果は、ＦＵＴ８改変酵素を過剰発現する細胞で産生された抗体のフコシル化レベルが、ＧＭＤ変異タンパク質を過剰発現する細胞で産生された抗体のそれよりも高いということを実証している。
表３および表４に示される結果は、抗体を発現するように操作された宿主細胞に、フコシル化経路における改変酵素（ＦＵＴ８またはＧＭＤ）を発現するベクターをトランスフェクトできるということを証明している。この結果は、これらトランスフェクト細胞内で産生される抗体がアフコシル化されていることを示すものでもある。
加えて、ＡＦ９７細胞株で産生された抗体のフコシル化レベルを評価した。表５の結果は、Ｆ８３Ｍ改変酵素を過剰発現するＡＦ９７細胞で産生された抗体は、フコシル化レベルが非常に低かったことを示している。詳細には、ＡＦ９７細胞で産生された抗ＣＤ２０抗体の９７．８３％がアフコシル化されていた。これに対し、市販のＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（ＭＡＢＴＨＥＲＡ（登録商標））のアフコシル化レベルは３．９２％であった。
表５の結果は、改変酵素をコードする核酸を先ずトランスフェクトしてから、抗体をコードする核酸を再度トランスフェクトした細胞内でアフコシル化抗体を産生できるということを証明している。よって、開示された方法を用いて細胞を改変し、アフコシル化抗体を製造することができる。
３．組換え細胞内でのＦＵＴ８タンパク質の発現
ＲＣ７９細胞、およびＦＵＴ８改変酵素（つまり、Ｆ８Ｍ１、Ｆ８Ｍ２、Ｆ８Ｍ３、またはＦ８Ｄ１）を発現する組換え細胞のペレットを、ホスファターゼ阻害剤カクテル(Sigma-Aldrich, Cat.S8820)を含有する１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中に溶解させた。溶解した細胞の上清におけるタンパク質濃度をＤＣ（商標）(洗浄剤互換)タンパク質アッセイ(BIO-RAD)により測定した。各サンプルにつき３０μｇのタンパク質を含む上清を、１２．５％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を用いて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。その膜を、１２０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％ゼラチン（ｗ／ｗ）および０．１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート）（ｖ／ｗ）を含有する２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を用いて室温で１時間ブロックし、抗ＦＵＴ８抗体（Abcam, Cat.ab204124, 1:500)およびＧＡＰＤＨ抗体（GeneTex, Cat.GT239, 1:10000)と共にそれぞれ一晩４℃でインキュベートした。その膜を、１２０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％ゼラチン（ｗ／ｗ）および０．１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（ｖ／ｗ）を含有する２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で５分、３回洗浄してから、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch, Cat.111-035-144)およびヤギ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ（GeneTex, Cat.GTX213111-01, 1:10000)と共にそれぞれ室温で１時間インキュベートした。さらなる洗浄の後、メタルエンハンサー (Sigma, Cat.D0426)を備えるＳＩＧＭＡＦＡＳＴ ＤＡＢでその膜を分析した。
図１は、ＲＣ７９親細胞および改変酵素を発現するＲＣ７９組換え細胞におけるＦＵＴ８タンパク質の発現を示すウェスタンブロットである。ＦＵＴ８タンパク質の発現量は組換え細胞とＲＣ７９親細胞とで同様である。結果から、改変酵素を発現するＲＣ７９細胞内で産生されたアフコシル化抗体の産生は、ＦＵＴ８タンパク質の発現量と関連の無いことがわかる。これらの結果は、ＦＵＴ８改変酵素が細胞における野生型ＦＵＴ８タンパク質と干渉することでフコシル化経路を阻害および／または低減し、これにより組換え細胞がアフコシル化抗体を効率的に産生することを示唆している。
開示された方法を用いたアフコシル化抗体の産生の機序は、野生型ＦＵＴ８遺伝子を抑制もしくは下方制御することに依存するか、またはＲＮＡ干渉を用いてＦＵＴ８タンパク質の発現を低減する他の方法に比べて新規かつ独特である。
４．組換え細胞の安定性
Ｆ８３Ｍ改変酵素を発現するＲＣ７９組換え細胞の安定性を評価した。
ＲＣ７９組換え細胞を、選択試薬を含まない培地中で３か月培養した。上述したように、３か月間、フローサイトメトリー分析で細胞のフコシル化を毎週監視し、かつＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標）システムを用い、Ｇｌｙｃａｎ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅカラムで精製抗体のＮ－グリカンの組成を毎月測定した。９０日の評価期間にわたりＬＣＡ非結合の特性が維持されており、研究期間においてフコシル化経路が阻害および／または低減されたことが示された（図２)。
加えて、５つの安定なＲＣ７９Ｆ８３Ｍクローン（Ｒ４～Ｒ８）内で産生された抗ＣＤ２０抗体のアフコシル化レベルを７２日間にわたり評価した。表６に示されるように、７２日間の研究にわたり、全てのＲＣ７９Ｆ８３Ｍクローンがアフコシル化抗体を高度に産生した。
この研究からの結果は、開示された方法により作製された改変酵素を発現する組換え細胞株が長期間にわたり安定で、アフコシル化抗体を高度に産生することを実証している。
実施例３
アフコシル化抗体のＡＤＣＣ活性
実施例２で得られた精製抗ＣＤ２０抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性を評価するため、以下の方法にしたがってＡＤＣＣ活性を測定した。
１．エフェクター細胞溶液の作製
健康なドナー（１００ｍＬ）由来のヒト末梢血を、ヘパリンナトリウムを含むＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ（登録商標）チューブに加えた。全血サンプルをＲＰＭＩ １６４０無血清（ＳＦ）培地で１：１に希釈し、穏やかに混合した。Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳを用い、２４ｍＬの希釈した血液をＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ上にスムーズに加えると共に、４００×ｇ、３２分、２５℃で遠心分離することにより、単核細胞を分離した。２０ｍＬのＲＰＭＩ １６４０培地を含む２つの５０ｍＬ遠心管中にバフィーコートを適度に分配してから、２回混合を行った。次いで、その混合物を１，２００ｒｐｍ、１２分、２５℃で遠心分離して上清を得た。ＲＰＭＩ １６４０ ＳＦ培地（１３ｍＬ）をその上清に加え、ＰＢＭＣ細胞を再懸濁させた。その細胞を１，２００ｒｐｍ、１２分、２５℃で遠心分離して上清を得た。ＲＰＭＩ培地（１０ｍＬ）をその上清に加え、ＰＢＭＣ細胞を再懸濁させた。十分な体積のＰＢＭＣ細胞懸濁液を７５Ｔフラスコに加え、フラスコごとに、約１５ｍＬで、最終細胞濃度１．５×１０６細胞／ｍＬとした。ＩＬ－２（２．５μｇ／ｍＬ）を最終濃度３ｎｇ／ｍＬで全てのフラスコに加えた。３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベーター中で１８時間ＰＢＭＣ細胞をインキュベートした。ＩＬ－２で刺激されたＰＢＭＣ細胞を収集し、１，２００ｒｐｍ、５分、２５℃で遠心分離してから、その上清を捨てた。ＰＢＳ（１０ｍＬ）を加えて細胞と混合した。その細胞を１，２００ｒｐｍ、５分、２５℃で遠心分離し、上清を除去した。その細胞をＲＰＭＩ ＡＭで再懸濁させ、最終濃度を２×１０７細胞／ｍＬに調節した。
２．標的細胞溶液の作製
７５Ｔフラスコからの細胞懸濁液を１，０００ｒｐｍで５分遠心分離して上清を除去してから、１０ｍＬの１×ＰＢＳで洗浄した。洗浄した細胞を１，２００ｒｐｍで５分遠心分離して上清を除去した。その細胞をＲＰＭＩアッセイ培地で再懸濁させ、５×１０５細胞／ｍＬの標的細胞溶液を調製した。その標的細胞溶液（４０μＬ、５×１０５細胞／ｍＬ）をＶ底９６ウェル細胞培養プレートのウェルに加えた。次いで、２０μＬの調製された市販のＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）溶液（ＭＡＢＴＨＥＲＡ（登録商標））（２５～０．００２５μｇ／ｍＬ）（陽性対照）、アフコシル化抗体（Ｒ１クローン）溶液（２５～０．００２５μｇ／ｍＬ）、またはＲＰＭＩアッセイ培地（陰性対照）をウェルに加え、標的細胞溶液とそれぞれ混合した。Ｖ底９６ウェル細胞培養プレートを３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベーター中で３０分～６０分インキュベートした。
３．ＡＤＣＣ活性アッセイ
エフェクター細胞溶液（４０μＬの８×１０５エフェクター細胞／ｗｅｌｌ）または４０μＬのＲＰＭＩアッセイ培地をプレートに加え、標的細胞溶液と混合した。プレートを３００×ｇで４分遠心分離した。プレートを３７℃、５％ ＣＯ２で４時間インキュベートした。ＣＹＴＯＴＯＸ ９６（登録商標）の溶解液（１０μＬ）をＴｍａｘおよびＢｌｋＶ群のプレートに加え、上清を回収する前に１時間置いた。Ｖ底９６ウェル細胞培養プレートを３００×ｇで４分遠心分離し、その上清５０μＬを９６ウェル細胞培養プレートから平底アッセイプレートのウェルに移した。
乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）（２μＬ）を１０ｍＬのＬＤＨ陽性対照希釈液に加え、ＬＤＨ陽性対照溶液を調製した。調製されたＬＤＨ陽性対照溶液（５０μＬ）を９６ウェル平底アッセイプレートのウェルに加えた。
ＬＤＨ再構成基質混合物（reconstitute substrate mix）（５０μＬ）をアッセイプレートの各テストウェルに加えた。そのプレートをふたで覆い、暗い環境で室温下３０分インキュベートした。停止液（５０μＬ）をプレートの各テストウェルに加えた。停止液の添加後、直ちに４９０ｎｍにおける吸光度を記録した。各群のブランクを引いた吸光度（Blank-removed absorbance）の値（Ｓ、ＰＢＭＣ、Ｔ、Ｅ、およびＴｍａｘ）を用い、下記に挙げた式によりＡＤＣＣ活性を算出した。
Figure 0007292377000002
式中、Ｓはサンプル（標的細胞＋ＰＢＭＣ＋抗ＣＤ２０抗体）のＬＤＨ放出の吸光度の値であり；ＰＢＭＣは標的細胞およびＰＢＭＣのＬＤＨ放出の吸光度の値であり；ＥはＰＢＭＣのＬＤＨ放出の吸光度の値であり；Ｔは標的細胞の自発的なＬＤＨ放出の吸光度の値であり；Ｔｍａｘは標的細胞の最大ＬＤＨ放出の吸光度の値である。
市販のＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（ＭＡＢＴＨＥＲＡ（登録商標））に比べ、アフコシル化抗ＣＤ２０抗体（クローンＲ１）は、ドナー１（図３ａ）およびドナー２（図３ｂ）由来のＰＢＭＣ細胞の両方において有意に強くかつ高いＡＤＣＣ応答を誘発した。
表７に示されるように、ＲＣ７９Ｆ８３ＭクローンＲ１からのアフコシル化抗ＣＤ２０抗体のＥＣ５０は、フコシル化抗ＣＤ２０抗体である市販のＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）のＥＣ５０より有意に低かった。詳細には、アフコシル化抗ＣＤ２０抗体（クローンＲ１）は、ドナー１およびドナー２由来のＰＢＭＣ細胞においてＥＣ５０がそれぞれ１．７ｎｇ／ｍＬおよび４．６ｎｇ／ｍＬであった。これに対し、フコシル化抗ＣＤ２０抗体（ＭＡＢＴＨＥＲＡ（登録商標））は、ドナー１およびドナー２由来のＰＢＭＣ細胞においてＥＣ５０がそれぞれ１８．２ｎｇ／ｍＬおよび３５．０ｎｇ／ｍＬであった。
この研究の結果は、アフコシル化抗ＣＤ２０抗体（クローンＲ１）が、フコシル化抗ＣＤ２０抗体（ＭＡＢＴＨＥＲＡ（登録商標））の７．６８倍～１０．７倍強いＡＤＣＣ活性を示したことを実証している。
実施例４
アフコシル化抗体の結合親和性
Ｈｉｓタグ化ＦｃγＲＩＩＩａ組換えタンパク質に対するアフコシル化およびフコシル化抗ＣＤ２０抗体の結合親和性を、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｘ１００コントロールソフトウェアの固定化ウィザード（immobilization wizard）およびアミンカップリングキットにより、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＣＭ５チップに結合した抗ヒスチジン（抗Ｈｉｓ）抗体を用いて評価した。
Ｈｉｓタグ化ＦｃγＲＩＩＩａ組換えタンパク質（１μｇ／ｍＬ）を抗Ｈｉｓ抗体固定化ＣＭ５チップに流速１０μＬ／ｍｉｎで２０秒間注入した。
クローン１（５、１０、２０、４０、および８０ｎＭ）からのアフコシル化抗ＣＤ２０抗体、市販のフコシル化抗ＣＤ２０抗体ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（ＭＡＢＴＨＥＲＡ（登録商標））（２０、４０、８０、１６０、および３２０ｎＭ）、ならびに市販のアフコシル化抗ＣＤ２０抗体ＧＡＺＹＶＡ（登録商標）（オビヌツズマブ）（５、１０、２０、４０、または８０ｎＭ）を、流速３０μＬ／ｍｉｎで３分間チップを通してそれぞれ注入した。ランニングバッファーを流速３０μＬ／ｍｉｎで５分間チップに流した。グリシン、ｐＨ１．５（１０ｍＭ）をチップに流速３０μＬ／ｍｉｎで６０秒間注入した。
各サイクルのセンサーグラムをＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｘ１００評価ソフトウェアで分析し、平衡解離定数（ＫＤ）、会合速度定数（Ｋａ）、および解離速度定数（Ｋｄ）を得た。各サイクルのセンサーグラムを１：１ラングミュア結合モデル（Langmuir binding model）によりフィットさせた。Ｃｈｉ２値が１／１０×Ｒｍａｘ値よりも低い場合、フィッティングモデルは適切であり、かつ動力学的結合パラメーターは信頼できるものであった。
図４ａ～４ｃは、テストされる３つの抗体の典型的なＳＰＲセンサーグラムを示している。典型的なＳＰＲセンサーグラムは、このアッセイで用いられる条件（例えば、会合時間、解離時間、および抗体濃度の範囲）が適切であることを示していた。加えて、３つの抗体のＣｈｉ２値は１／１０×Ｒｍａｘ値よりも小さく、１：１ラングミュアモデルが、３つの抗体全てのセンサーグラムフィッティングに適していることが示された。
表８に示されるように、ＭＡＢＴＨＥＲＡ（登録商標）に比べ、アフコシル化抗ＣＤ２０抗体（クローンＲ１）はＦｃγＲＩＩＩａへの結合親和性が１０倍以上強かった（Ｒ１クローンのＫＤ＝１３．０ｎＭ、ＭＡＢＴＨＥＲＡ（登録商標）のＫＤ＝１５１．５ｎＭ）。また、ＧＡＺＹＶＡ（登録商標）に比べ、アフコシル化抗ＣＤ２０抗体（クローンＲ１）はＦｃγＲＩＩＩａへの結合親和性が３倍以上強かった（Ｒ１クローンのＫＤ＝１３．０ｎＭ、ＧＡＺＹＶＡ（登録商標）のＫＤ＝３９．９ｎＭ）。
この研究の結果は、市販のフコシル化抗ＣＤ２０抗体ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（ＭＡＢＴＨＥＲＡ（登録商標））ならびに市販のアフコシル化抗ＣＤ２０抗体（ＧＡＺＹＶＡ（登録商標））と比較して、本開示により作製されたアフコシル化抗ＣＤ２０抗体（クローンＲ１）は、ＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性がより強力であることを実証している。
実施例５
アフコシル化抗体のＣＤＣ活性
開示された方法により製造されたアフコシル化抗体のＣＤＣ活性を評価した。
Ｄａｕｄｉ細胞をＲＰＭＩ培地で培養し、細胞密度が１×１０６細胞／ｍＬに達したときに継代培養した（継代培養密度：２～３×１０５細胞／ｍＬ）。Ｄａｕｄｉ細胞を収集し、３００ｒｐｍで５分遠心分離した。細胞をＲＰＭＩ培地で再懸濁させ、濃度１×１０５細胞／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。再懸濁後、１００μＬの細胞懸濁液または１００μＬのＲＰＭＩ培地を白色９６ウェルプレートのウェル中に播種した。
市販のＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（ＭＡＢＴＨＥＲＡ（登録商標））およびアフコシル化抗ＣＤ２０抗体（クローンＲ１）を濃度１２０μｇ／ｍＬ～０．２３４μｇ／ｍＬで食塩水中にて調製した。次いで、２５μＬのＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）またはアフコシル化抗ＣＤ２０抗体（クローンＲ１）溶液を１２０μｇ／ｍＬ～０．２３４μｇ／ｍＬでＤａｕｄｉ細胞またはＲＰＭＩ培地を含有する白色９６ウェルプレートのウェルに加えた。ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ－ＧＬＯ（登録商標）試薬（２０μＬ）を各ウェルに加えてから混合した。そのプレートを７５０ｒｐｍで２分マイクロプレートシェイカーに置き、次いで暗い環境中にて室温で１０分インキュベートした。高感度ルミネセントカセット（luminescent cassette）が挿入されたマルチモードリーダーにより発光強度を検出し（積分時間：１秒）、抗ＣＤ２０抗体のＥＣ５０値および関連する抗体のＣＤＣ活性を算出した。
図５は、アフコシル化抗ＣＤ２０抗体（クローンＲ１）のＣＤＣ活性が、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）のそれと同程度であったことを示している。アフコシル化抗ＣＤ２０抗体（Ｒ１クローン）のＥＣ５０値は０．６８２μｇ／ｍＬであり、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）のそれ（ＥＣ５０＝０．５８２μｇ／ｍＬ）よりも高かった。
ＧＡＺＹＶＡ（登録商標）、市販のアフコシル化抗ＣＤ２０抗体は、ＡＤＣＣ活性を誘発するが、ＣＤＣ活性を抑制することが示されている（E. Mossener et al. (2010); C. Ferrara et al. (2011))。他の研究より得られた結果は、効果的な癌治療を達成するためにＧＡＺＹＶＡ（登録商標）の量を増加させる必要があることを示唆する。これに対し、この実施例および実施例５からの結果は、開示された方法により製造されたアフコシル化抗ＣＤ２０抗体は、そのフコシル化対応物と同様のＣＤＣ活性を維持しながら、ＡＤＣＣ活性を誘発することを実証している。よって、本開示のアフコシル化抗ＣＤ２０抗体はＧＡＺＹＶＡ（登録商標）に比べ、より性能に優れていた。
実施例６
動物モデルにおけるアフコシル化抗体の有効性の証明
この実施例では、Ｂ細胞リンパ腫皮下異種移植（lymphoma subcutaneous xenograft）モデルを用い、本開示のアフコシル化抗体の抗腫瘍効率を証明した。ＳＵ－ＤＨＬ－４は、細胞膜上に高レベルのＣＤ２０を発現するＢ細胞リンパ腫細胞株であり、かつ皮下で増殖して固形腫瘍を形成し得るものである。よって、ＳＣＩＤ／Ｂｅｉｇｅマウスにおける異種移植モデルを開発し、アフコシル化抗体（Ｒ１クローン）および市販のＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（ＭＡＢＴＨＥＲＡ（登録商標））の抗腫瘍効率を比較した。
ＳＵ－ＤＨＬ－４細胞をフラスコ中にてＲＰＭＩ培地（ＣＭ）で培養した。細胞濃度が０．８～１．０×１０６細胞／ｍＬに達したときに、細胞懸濁液を収集し、３００ｘｇで５分遠心分離して上清を除去した。条件培地（新鮮ＣＭ：条件ＣＭの比＝９：１）をいくらか含有する新たな培地で細胞を再懸濁させた。１：２～１：１０の比（播種する細胞の数：回収した細胞の総数）で細胞を継代培養し、細胞濃度は少なくとも１×１０５細胞／ｍＬとした。培養皿を３７℃でインキュベートした。ＳＵ－ＤＨＬ－４細胞を５つの１５０Ｔフラスコで培養した。細胞濃度が０．８～１．０×１０６細胞／ｍＬに達したら、細胞懸濁液を５０ｍＬのチューブに収集し、次いで１，２００ｒｐｍで５分遠心分離して上清を除去した。無血清ＲＰＭＩ培地を用い、細胞濃度を１×１０８細胞／ｍＬに調節した。氷上で予め冷却したシリンジを用い１８Ｇの針で５０ｍＬの試験管（centritube）内にて細胞懸濁液を等容積のＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）と混合した。最終細胞濃度は５×１０７細胞／ｍＬであった。濃度５×１０７細胞／ｍＬのＭａｔｒｉｇｅｌ－ＳＵ－ＤＨＬ－４細胞混合物（１００ｕＬ）を、予め冷却した１ｍＬシリンジを用い２３Ｇ＊１”の針で、各マウス（ＳＣＩＤ／Ｂｅｉｇｅマウス）の背側領域の右側に皮下注射した。全播種細胞数は５×１０６細胞であった。キャリパーを用い３日または４日おきに各マウスの腫瘍体積を測定し、式Ｖ＝０．５×ａｂ２で算出した。式中、ａおよびｂはそれぞれ腫瘍の長さおよび腫瘍の幅である。
腫瘍播種のおよそ２０日後、腫瘍体積が約２００ｍｍ３（１９８．２５±５５．５３ｍｍ３）に達したとき、マウスを５匹ずつ３つの群に分けてから、食塩水（ビヒクル）、市販のＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（ＭＡＢＴＨＥＲＡ（登録商標））、またはアフコシル化抗ＣＤ２０抗体（クローンＲ１）で処理した。０．２ｍＬの０．１ｍｇ／ｍＬ抗体を３週間にわたり毎週マウスに注射した。電子スケールおよびデジタルキャリパーで週に２回、全てのマウスの体重および腫瘍サイズ測定した。処理期間終了時、マウスを屠殺し、腫瘍組織を取り出して重量を量った。次いで、腫瘍組織を室温で１０％ホルマリンバッファーに固定し、さらなる実験に供した。
図６に示されるように、アフコシル化抗ＣＤ２０抗体（クローンＲ１）は、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）に比べて著しく強力な抗腫瘍効率を示した。ビヒクル群とアフコシル化抗ＣＤ２０抗体（クローンＲ１）処理群との間には腫瘍体積において統計的に有意な差があった（Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定）。これに対し、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）は、ビヒクルのみの群と比べたときに、腫瘍体積に統計的に有意な差を示さなかった。表９に示されるように、アフコシル化抗ＣＤ２０抗体（クローンＲ１）は、１ｍｇ／ｋｇの投与量のＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）に比べ、腫瘍の増殖をより有効に抑制した（Ｒ１クローン＝４６８±１４８ｍｍ３；ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）＝１４０７±２４１ｍｍ３）。アフコシル化抗ＣＤ２０抗体（クローンＲ１）とＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）群との間には腫瘍体積において統計的に有意な差があった（Ｐ＜０．００１）。
図７に示されるように、アフコシル化抗ＣＤ２０抗体（Ｒ１クローン）処理群の腫瘍の重量はビヒクルのみの群のそれに比べて有意に小さかった（Ｐ＜０．００１）。しかし、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）は、ビヒクル群と比べ、同じ投与量での腫瘍の重量に統計的に有意な差を示さなかった。よって、表９に示されるように、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）群と比較して、アフコシル化抗ＣＤ２０抗体（クローンＲ１）群では、腫瘍の重量に統計的に有意な低下があった（Ｒ１クローン＝０．２７±０．１５ｇ；ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）＝０．６２±０．０９ｇ，Ｐ＜０．０１）。アフコシル化抗ＣＤ２０抗体（クローンＲ１）は、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）よりも一層効率的に腫瘍増殖を阻害しており、腫瘍体積で得られた結果と一致している。
図８に示されるように、処理期間中、全ての群におけるマウスの体重は徐々に増加した。
研究の結果は、アフコシル化抗ＣＤ２０抗体（クローンＲ１）が安全であるという事を示唆している。
（表１）アッセイで用いられるＦＵＴ８酵素の修飾
Figure 0007292377000003
１ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の野生型ＦＵＴ８ＤＮＡ配列に基づくＤＮＡ配列位置
２ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の野生型ＦＵＴ８タンパク質配列に基づくアミノ酸の位置
３Ｎ／Ａ＝該当なし
（表２）アッセイに用いられるＧＭＤ酵素の修飾
Figure 0007292377000004
１ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３の野生型配列に基づくＤＮＡ配列位置
２ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４の野生型配列に基づくアミノ酸の位置
（表３）Ｆ８３Ｍ改変酵素の過剰発現を有するおよび有さないＣＨＯ細胞内で産生された抗体のＮ－グリカンプロファイル
Figure 0007292377000005
ｗ／ｏ Ｆｕｃ．：（総グリカン量－フコースの量）／総グリカン量×１００％
（表４）Ｆ８Ｍ１、Ｆ８Ｍ２、Ｆ８Ｍ３、Ｆ８Ｄ１、またはＧＭＤ４Ｍ改変酵素の過剰発現を有するおよび有さない細胞で産生された抗ＣＤ２０抗体Ｎ－グリカンプロファイル
Figure 0007292377000006
ｗ／ｏ Ｆｕｃ．：（総グリカン量－フコースの量）／総グリカン量×１００％
（表５）Ｆ８３Ｍ改変酵素の過剰発現を有するおよび有さない細胞で産生された抗ＣＤ２０抗体のＮ－グリカンプロファイル
Figure 0007292377000007
ｗ／ｏ Ｆｕｃ．：（総グリカン量－フコースの量）／総グリカン量×１００％
（表６）Ｆ８３Ｍ改変酵素を過剰発現する細胞で産生されたアフコシル化抗ＣＤ２０抗体の安定性
Figure 0007292377000008
（表７）フコシル化およびアフコシル化抗ＣＤ２０抗体のＥＣ５０値およびＡＤＣＣ活性
Figure 0007292377000009
（表８）ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）、ＧＡＺＹＶＡ（登録商標）、およびアフコシル化抗体のＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性
Figure 0007292377000010
（表９）各群における処理マウスの腫瘍体積、腫瘍重量および体重
Figure 0007292377000011
値は平均値±Ｓ．Ｄ．（Ｓ．Ｃ．）を表す

Claims (12)

  1. フコシル化経路の少なくとも１つの改変酵素をコードする核酸を宿主細胞に導入してアフコシル化タンパク質を産生させるステップ
    を含む、宿主細胞内でアフコシル化タンパク質を産生させるための方法であって、
    前記宿主細胞が哺乳類の宿主細胞であり、前記改変酵素が、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼ（ＧＭＤ）またはα－１，６－フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）に由来し、前記核酸が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、５、７、９、１１、１５および任意のそれらの組み合わせからなる群より選択され、かつ前記改変酵素が、前記宿主細胞において、前記改変酵素の由来元である野生型酵素の活性を低減または阻害する、前記方法。
  2. 前記宿主細胞内で産生されるアフコシル化タンパク質が、アフコシル化抗体である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記アフコシル化抗体が、少なくとも９０％アフコシル化されている、請求項２に記載の方法。
  4. 前記アフコシル化抗体が、前記アフコシル化抗体のフコシル化対応物と比べて、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性が高められている、請求項２に記載の方法。
  5. 前記アフコシル化抗体の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性が、前記アフコシル化抗体のフコシル化対応物と比べて、低減または抑制されていない、請求項２に記載の方法。
  6. フコシル化経路の改変酵素をコードする第１の核酸および産生されるべきタンパク質をコードする第２の核酸を宿主細胞にトランスフェクトするステップ
    を含む、宿主細胞内でアフコシル化されたタンパク質を産生させるための方法であって、
    前記宿主細胞が哺乳類の宿主細胞であり、前記改変酵素が、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼ（ＧＭＤ）またはα－１，６－フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）に由来し、前記第１の核酸が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、５、７、９、１１、１５および任意のそれらの組み合わせからなる群より選択され、かつ前記改変酵素が、前記宿主細胞において、前記改変酵素の由来元である野生型酵素の活性を低減または阻害する、前記方法。
  7. 前記宿主細胞に前記第１の核酸および前記第２の核酸を同時にトランスフェクトする、請求項６に記載の方法。
  8. 前記産生されるアフコシル化タンパク質が、抗体である、請求項７に記載の方法。
  9. （ａ）前記改変酵素をコードする第１の核酸を前記宿主細胞にトランスフェクトするステップと；
    （ｂ）前記第１の核酸がトランスフェクトされた宿主細胞を選別および単離するステップと；
    （ｃ）前記産生されるべきタンパク質をコードする第２の核酸を、ステップ（ｂ）の第１の核酸がトランスフェクトされた宿主細胞にトランスフェクトするステップと；
    （ｄ）前記第１の核酸および前記第２の核酸がトランスフェクトされた宿主細胞内で前記産生されるべきタンパク質を発現するステップと
    を含む、請求項６に記載の方法。
  10. 前記産生されるアフコシル化タンパク質が、抗体である、請求項９に記載の方法。
  11. （ａ）前記産生されるべきタンパク質をコードする第２の核酸を前記宿主細胞にトランスフェクトするステップと；
    （ｂ）前記第２の核酸がトランスフェクトされた宿主細胞を選別および単離するステップと；
    （ｃ）前記改変酵素をコードする第１の核酸を、ステップ（ｂ）の第２の核酸がトランスフェクトされた宿主細胞にトランスフェクトするステップと；
    （ｄ）前記第２の核酸および第１の核酸がトランスフェクトされた宿主細胞を選別および単離するステップと；
    （ｅ）前記第２の核酸および第１の核酸がトランスフェクトされた宿主細胞内で前記産生されるべきタンパク質を発現するステップと
    を含む、請求項６に記載の方法。
  12. 前記産生されるアフコシル化タンパク質が、抗体である、請求項１１に記載の方法。
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