TWI745615B - 去岩藻醣基化抗體及表現此抗體的細胞株 - Google Patents

Abstract

本發明係有關於產生去岩藻醣基化抗體的方法、去岩藻醣基化抗體及其組成物，以及用於產生此抗體的細胞。本發明方法包括將編碼岩藻醣基化途徑中至少一經修飾之酵素的核酸導入一宿主細胞中，以在宿主細胞中產生去岩藻醣基化抗體。本發明方法可輕易地、穩定地、低成本地製造去岩藻醣基化抗體。此外，以本發明方法所產生之去岩藻醣基化抗體具有增加的ADCC活性，且不會抑制CDC活性與安全性。

Description

去岩藻醣基化抗體及表現此抗體的細胞株

本發明係有關於一種去岩藻醣基化蛋白，包括有增強的活性及治療特性之去岩藻醣基化免疫功能分子，以及製備去岩藻醣基化蛋白的方法。

醣蛋白涉及人類的許多基本功能，包括催化、信號傳導、細胞間的訊息傳遞以及分子辨識別與結合。許多醣蛋白已被用於治療的目的，且在過去的二十年中，天然存在的分泌醣蛋白重組形式一直是生技產業的主要產物。範例包括促紅血球生成素(erythropoietin，EPO)、治療性單株抗體(therapeutic monoclonal antibody，治療性mAb)、組織纖維溶酶原活化劑(tissue plasminogen activator，tPA)、干擾素-β(interferon-β，IFN-β)、顆粒細胞-噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)和人類絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin，hCG)。

哺乳動物中存在5類抗體，即IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。人類IgG抗體由於其血液中半衰期長與功能特性，如各種效應子功能等，主要用於各種人類疾病的診斷、預防和治療。人類IgG抗體更可分成以下4種 亞類：IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。已有許多針對作為IgG類抗體的效應子功能之抗體依賴性細胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)活性與補體依賴性細胞毒性(complement-dependent cytotoxicity，CDC)的研究，且已報導IgG1亞類的抗體在人類IgG抗體中具有最大的ADCC活性和CDC活性。

人類IgG1亞類抗體的ADCC活性和CDC活性的表現需要抗體Fc區與效應細胞，如殺手細胞、自然殺手細胞、活化的巨噬細胞或其類似細胞及各種補體的表面上存在的抗體受體(以下稱為「FcγR」)結合。已顯示抗體鉸鏈區及C區(以下稱為「Cγ2結構域(domain)」)中第2結構域之許多胺基酸殘基，以及連結至Cγ2區域的醣鏈對於此結合反應是重要的。

降低或抑制抗體或Fc融合蛋白的N-多醣的岩藻醣基化可增強ADCC活性。ADCC一般參與自然殺手(natural killer，NK)細胞的活化，且依賴抗體包覆細胞經NK細胞表面上Fc受體的辨識。Fc區域與NK細胞上Fc受體的結合會受Fc區域醣基化狀態的影響。此外，在Fc區域的N-多醣類型也會影響ADCC活性。因此，對於抗體組成物或Fc融合蛋白組成物，可藉由增加去岩藻醣基之N-多醣的相對量來增加對FcγRIII結合親和力，或組成物的ADCC活性。

許多可影響醣化的因子，包含物種、組織及細胞類型，均已顯示對於醣化的發生方式非常重要。此外，細胞外環境，通過改變培養條件，如血清濃度，可直接對醣基化產生影響。已提出各種方法，來改變在特定宿主生物體中達到的醣基化模式，包括導入或過度表現與產生寡醣有關之某些酵素(U.S.Pat.No.5,047,335；U.S.Pat.No.5,510,261)。

WO98/58964描述抗體組成物，其中大致上所有的N端-連接的寡醣皆為G2寡醣。G2係指具有兩個終端Gal，且沒有NeuAcs的分歧(biantennary)結構。WO99/22764提到大致上沒有在CH2結構域中具有N端-連接之G1、G0或G-1寡醣的醣蛋白的抗體組成物，其。G1係指具有一個Gal，且不具有NeuAcs的分歧結構，G0係指其中不具有末端NeuAcs或Gals的分歧結構，且G-1係指核心單元少一個GlcNAc。

WO00/61739報導的是，與73%的由NSO(小鼠骨髓瘤)細胞表現的抗體相比，47%的由YB2/0(大鼠骨髓瘤)細胞表現的抗-hIL-5R抗體具有α1-6岩藻醣連接的醣鏈。由不同宿主細胞表現的αhIL-5R抗體岩藻醣抗體的岩藻醣相對比例為YB2/0<CHO/d<NSO。

WO02/31140與WO03/85118顯示可藉由利用RNAi抑制α1,6-岩藻醣基轉移酶的功能，來控制與醣鏈結合之岩藻醣的修飾。使用細胞生產抗體組成物的方法，其包括使用抗凝集素的細胞，凝集素辨識醣鏈，其中岩藻醣的第1位置透過複合的N-醣苷連接的醣鏈中的α-鍵，結合至還原端中N-乙醯葡萄醣胺的第6位置。

醣鏈的結構在人類IgG1亞類抗體的效應功能上扮演非常重要的角色，且藉由改變醣鏈結構，來製備具有更強效應功能的抗體可以是可能的。然而，醣鏈的結構多樣且複雜，且解決醣鏈的生理角色仍不充分，且昂貴。因此，需要一種生產去岩藻醣基化抗體的方法。

參考文獻

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本發明係有關於產生具加強活性之去岩藻醣化蛋白，包括去岩藻醣化抗體的新穎方法。本發明也有關於以本發明方法所產生之去岩藻醣基化蛋白，以及產生去岩藻醣基化蛋白的細胞。本發明的去岩藻醣基化抗體，相較於天然存在的岩藻醣基化抗體，具有增加之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)活性。

本發明的一範疇係有關於一種在宿主細胞產生去岩藻醣基化蛋白，包括去岩藻醣基化抗體的方法。本發明之方法一般包括將編碼岩藻醣基化途徑中經修飾之酵素的核酸導入至宿主細胞中，以抑制抗體在此宿主細胞中的岩藻醣基化。經修飾的酵素可源自於岩藻醣基化途徑中的酵素。在某些實施例中，經修飾的酵素可源自於GDP-甘露醣4,6-脫水酶(GDP-mannonse 4,6-dehydratase，GMD)、GDP-4-酮基-6-脫氧-D-甘露醣異構酶-還原酶(GDP-4-keto-6-deoxy-D-mannose epinierase-reductase，FX)及/或岩藻醣轉移酶(FUT1至FUT12、POFUT1及POFUT2)。在一些實施例中，經修飾的酵素可源自於GMD或FUT。在特定實施例中，經修飾的酵素可源自於α-1,6-岩藻醣轉移酶(FUT8)。經修飾的酵素可抑制宿主細胞在岩藻醣化途徑中天然存在的酵素的功能，進而抑制宿主細胞中抗體的岩藻醣化。

在一些實施例中，生產去岩藻醣基化蛋白(包括去岩藻醣基化抗體)的方法，包括(a)提供宿主細胞，(b)將編碼岩藻醣基化途徑之經修飾的酵素的核酸導入至此宿主細胞中，以及(c)於此宿主細胞中產生去岩藻醣 基化蛋白。

本發明另一範疇係有關於以本發明方法所產生的去岩藻醣基化蛋白，包括去岩藻醣基化抗體。相較於天然存在的岩藻醣基化抗體，去岩藻醣化抗體具有增加及改善的活性。在一些實施例中，抗體具有增加及改善的ADCC。

本發明另有關於生產去岩藻醣基化蛋白，包括去岩藻醣基化抗體的細胞。

於以下實施例提供本發明之實施方式，並搭配所附圖式。

第1圖為於RC79細胞(表現RITUXAN®之穩定細胞株)及表現F83M、F8M1、F8M2、F8M3或F8D1突變蛋白之RC79重組細胞中所生產之FUT8蛋白的西方墨點法的圖譜。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)的表現作為蛋白上樣控制組(loading control)。在表現突變FUT8酵素之RC79重組細胞中，FUT8蛋白的表現量類似於，或相同於親源RC79細胞中FUT8蛋白的表現量。

第2圖為表現F83M突變蛋白之RC79重組細胞和RC79親源細胞的流式細胞分析。長虛線之波峰代表經羅丹明-LCA染色之表現F83M的RC79重組細胞。灰色填滿之波峰代表未經羅丹明-LCA染色之表現F83M的RC79重組細胞(陰性對照組)。短虛線之波峰代表經羅丹明-LCA染色的RC79細胞(未表現F83M的親源細胞)(陽性對照組)。

第3a及3b圖為顯示ADCC分析結果的圖。第3a及3b圖分別顯示經由來 自捐贈者1(第3a圖)及捐贈者2(第3b圖)之PBMC細胞的RITUXAN®與去岩藻醣基化抗-CD20單株抗體的ADCC活性。去岩藻醣基化抗-CD20單株抗體(R1細胞株)的ADCC活性顯著高於RITUXAN®。

第4a至4c圖為顯示用SPR生物感應器(BIACORE^TM X100)的FcγRIIIa親和力分析的SPR感應圖的圖。將His-標籤FcγRIIIa(1μg/mL)及5-80nM去岩藻醣基化抗-CD20單株抗體(第4a圖)、20-320nM RITUXAN®(第4b圖)或5-80nM GAZYVA®(第4c圖)，以30μL/分鐘的流速，依序流過抗-His抗體固定的CM5晶片。相較於RITUXAN®和GAZYVA®，去岩藻醣基化抗-CD20單株抗體(R1細胞株)對FcγRIIIa具有更強的親和力。

第5圖為顯示RITUXAN®與去岩藻醣基化抗-CD20單株抗體的CDC活性的圖。去岩藻醣基化抗-CD20單株抗體(R1細胞株)的CDC活性與RITUXAN®的相當。

第6圖為顯示以食鹽水(載體)、RITUXAN®或去岩藻醣基化抗-CD20單株抗體(R1細胞株)治療之老鼠的腫瘤體積的圖。數據點表示腫瘤體積的平均值±SD(每組n=5)。去岩藻醣基化抗-CD20單株抗體(細胞株R1)的抗-腫瘤功效顯著高於RITUXAN®。

第7圖為顯示自以食鹽水(載體)、RITUXAN®或去岩藻醣基化抗-CD20單株抗體(R1細胞株)治療之老鼠收集的腫瘤的重量的圖。以去岩藻醣基化抗-CD20單株抗體(R1細胞株)治療的老鼠的腫瘤重量顯著比RITUXAN®和載體組輕。

第8圖為顯示以食鹽水(載體)、RITUXAN®或去岩藻醣基化抗-CD20單株抗體(R1細胞株)治療之老鼠體重的圖。圖中的數據點表示體重的平均值±SD(每組n=5)。

本發明係有關於生產具改善活性之去岩藻醣基化抗體的新穎方法。本發明亦有關於以此發明方法所產生的抗體以及產生此去岩藻醣基化抗體的細胞。相較於天然存在的岩藻醣基化抗體，本發明之去岩藻醣基化抗體具有增加的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)活性。

以下為提供的實施方式，以協助本發明所屬技術領域中具有通常知識者實施本發明。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可理解本發明說明明確描述的實施例的修改或變化並不會偏離本發明所含有的資訊的精神或範圍，仍屬於本發明之範疇。於描述中所使用的術語僅用於描述特定實施例，並不限制本發明。以下所使用的標題僅為組織各章節的目的，不應被視為限制所描述的主題。

本發明說明中所提及的所有文獻、申請專利、專利、圖式及其他參考文獻整體(包括部分)可完全併入，如在發明說明中所公開和敘述。

除另外說明，本發明說明所使用的所有技術和科學術語與本發明所屬技術領域中具有通常知識者通常理解具有相同的意義。除非上下文另有說明，發明說明中所述單數「一」和「該」包括複數的意思。類似地，除非上下文另有說明，詞語「或」意圖包括「及」的意思。因此，「包括A或B」係指包括A或B、或A及B。更應了解的是，多胜肽的所有胺基酸大小，所有分子量或分子質量值為近似值，且僅供描述。儘管可使用與本發明說明所述類似或相同的方法和材料，但適合的方法及材料如下所述。本發明說明中所述所有文獻、專利說明書、專利及其它文獻皆可併入本發明中。如果發生衝突，會受到本發說明(包括術語解釋)限制。此外，材料、方法和實施例僅是說明性質，不意圖限制本發明。

1.細胞中岩醣基化的抑制

本發明之一範疇係有關於抑制或減少細胞中岩藻醣基化的方法。

a.宿主細胞

任何適當的宿主細胞可用於生產去岩醣基化抗體，包括源自於酵母菌、昆蟲、兩棲類、魚類、爬蟲動物、鳥類、哺乳動物或人類，或融合瘤的宿主細胞。宿主細胞可以是未經修飾的細胞或細胞株，或經遺傳修飾的細胞株(例如，以促進生物產品的生產)。在一些實施例中，宿主細胞為細胞株，其已經修飾，以允許在期望的條件下，例如在無血清培養基中、在細胞懸浮式培養中或在貼壁式細胞培養中生長。

使用哺乳動物宿主細胞有助於給予至人類的抗體。在一些實施例中，宿主細胞為中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細胞，其為用於表現許多重組蛋白的細胞株。一般用於表現重組蛋白的額外哺乳動物細胞株包括293HEK細胞、HeLa細胞、COS細胞、NIH/3T3細胞、Jurkat細胞、NSO細胞及HUVEC細胞。在另一些實施例中，宿主細胞為表現抗體的重組細胞。

於本發明說明提供的方法中有用的人類細胞株的範例包括293T(胚胎腎)、786-0(腎)、A498(腎)、A549(肺泡上皮)、ACHN(腎)、BT-549(乳房)、BxPC-3(胰)、CAKI-1(腎)、Capan-i(胰)、CCRF-CEM(白血病)、 COLO 205(結腸)、DLD-1(結腸)、DMS 114(小細胞肺)、DU145(前列腺)、EKVX(非小細胞肺)、HCC-2998(結腸)、HCT-15(結腸)、HCT-1 16(結腸)、HT29(結腸)、S IT-1080(纖維肉瘤)、HEK 293(胚胎腎)、HeLa(子宮頸癌)、HepG2(肝細胞癌)、HL-60(TB)(白血病)、HOP-62(非小細胞肺)、HOP-92(非小細胞肺)、HS 578T(乳房)、HT-29(結腸腺癌)、IG-OV1(卵巢)、IMR32(神經母細胞瘤)、Jurkat(T淋巴細胞)、K-562(白血病)、KM 12(結腸)、KM20L2(結腸)、LANS(神經母細胞瘤)、LNCap.FGC(高加索前列腺腺癌)、LOX IMV1(黑色素瘤)、LXFL 529(非小細胞肺)、M 14(黑色素瘤)、M19-MEL(黑色素瘤)、MALME-3M(黑色素瘤)、MCFIOA(乳房上皮)、MCI '7(乳腺)、MDA-MB-453(乳房上皮)、MDA-MB-468(乳房)、MDA-MB-231(乳房)、MDA-N(乳房)、MOLT-4(白血病)、NCl/ADR-RES(卵巢)、NCI-1122.0(非小細胞肺)、NCI-H23(非小細胞肺)、NC1-H322M(非小細胞肺)、NCI-H460(非小細胞肺)、NCI-H522(非小細胞肺)、OVCAR-3(卵巢)、QVCAR-4(卵巢)、OVCAR-5(卵巢)、OVCAR-8(卵巢)、P388(白血病)、P388/ADR(白血病)、PC-3(前列腺)、PERC6®(El-變形胚胎視網膜)、RPMI-7951(黑色素瘤)、RPMI-8226(白血病)、RXF 393(腎)、RXF-631(腎)、Saos-2(骨)、SF-268(中央神經系統)、SF-295(中央神經系統)、SF-539(中央神經系統)、SHP-77(小細胞肺)、SH-SY5Y(神經母細胞瘤)、SK-BR3(乳房)、SK-MEL-2(黑色素瘤)、SK-MEL-5(黑色素瘤)、SK-MEL-28(黑色素瘤)、SK-OV-3(卵巢)、SN12K1(腎)、SN12C(腎)、SNB-19(中央神經系統)、SNB-75(中央神經系統)、SNB-78(中央神經系統)、SR(白血病)、SW-620(結腸)、T-47D(乳房)、THP-1(單核細胞之巨噬細胞)、TK-10(腎)、U87(膠質母細胞瘤)、U293 (腎)、U251(中央神經系統)、UACC-257(黑色素瘤)、UACC-62(黑色素瘤)、UO-31(腎)、W138(肺)及XF 498(中央神經系統)之細胞株。

於本發明說明提供的方法中有用之非人類靈長類細胞株的範例包括經SV40(COS-7)轉染之經猴腎(CVI-76)、非洲綠猴腎(VERO-76)、綠猴纖維細胞(COS-1)及猴腎細胞之細胞株。額外的哺乳動物細胞株為本發明所屬技術領域中具有通常知識者已知，且為編錄在美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)目錄(Manassas，VA)中。

b.修飾岩醣基化途徑中的酵素

本發明之去岩藻醣基化抗體可在宿主細胞中產生，此宿主細胞中的岩藻醣基化途徑已經以減少或抑制蛋白的岩藻醣基化的方式被改變。

i.經修飾的酵素

本發明說明中所使用之詞組「經修飾的酵素」係指衍生自在岩藻醣基化途徑中天然存在或野生型酵素的蛋白，其以在修飾後改變或破壞蛋白質的天然酵素活性的方式被改變。經修飾的酵素能夠抑制或干擾其對應的野生型酵素，以改變、抑制或降低宿主細胞中野生型酵素的活性。

經修飾的酵素可藉由改變天然存在的酵素來生產，例如，藉由改變總蛋白質電荷、共價連接化學或蛋白質部分(moiety)、導入胺基酸置換、插入及/或刪除，及/或其任何組合。在一些實施例中，相較於天然存在的酵素對應物，經修飾的酵素具有胺基酸的取代、添加、及/或刪除。在一些實施例中，相較於天然存在的酵素對應物，經修飾的酵素有介於1至約20 個胺基酸取代、添加、及/或刪除。胺基酸的取代、添加及插入可利用天然或非天然胺基酸來完成。非天然存在之胺基酸包括，但不限於，ε-N賴胺酸、ß-丙胺酸、鳥胺酸、正白胺酸、正纈胺酸、羥脯胺酸、甲狀腺素、γ-胺基丁酸、高絲胺酸、瓜胺酸、胺基苯甲酸、6-氨基己酸(Aca；6-Aminohexanoic acid)、羥脯胺酸、硫醇丙酸(MPA)、3-硝基-酪胺酸、焦谷胺酸及其類似。天然存在之胺基酸包括丙胺酸、精胺酸、天門冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、賴胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸及纈胺酸。

經修飾的酵素可源自於岩藻醣基化途徑中的任何天然存在之酵素。例如，經修飾的酵素可源自於GDP-甘露醣4,6-脫水酶(GMD)、GDP-4-酮基-6-脫氧-D-甘露醣異構酶-還原酶(FX)及/或任何岩藻醣轉移酶，包含：2-α-L-岩藻醣轉移酶1(FUT1)、半乳醣苷2-α-L-岩藻醣轉移酶2(FUT2)、半乳醣苷3(4)-L-岩藻醣轉移酶(FUT3)、α(1,3)岩藻醣轉移酶，骨髓特異性(FUT4)、α-(1,3)-岩藻醣轉移酶(FUT5)、α-(1,3)-岩藻醣轉移酶(FUT6)、α-(1,3)-岩藻醣轉移酶(FUT7)、α-(1,6)-岩藻醣轉移酶(FUT8)、α-(1,3)-岩藻醣轉移酶(FUT9)、蛋白O-岩藻醣轉移酶1(POFUT1)、蛋白O-岩藻醣轉移酶2(POFUT2)。

在一些實施例中，岩藻醣基化途徑中之一個以上的酵素被修飾。在某些實施例，經修飾的酵素源自於GMD、FX及/或FUT8。

ii.編碼經修飾的酵素的核酸

本發明的去岩藻醣基化抗體可於宿主細胞中產生，在此宿主 細胞中，岩藻醣基化途徑中酵素已經以降低或抑制蛋白的岩藻醣基化的方式被改變。

在一些實施例中，藉由將編碼岩藻醣基化途徑中經修飾之酵素的核酸導入至宿主細胞中，以改變宿主細胞的岩藻醣基化途徑。例如，將編碼經修飾的酵素的核酸分子插入至表現載體中，並轉染至宿主細胞中。編碼經修飾的酵素的核酸分子可瞬時導入宿主細胞中，或穩定地融合至宿主細胞的基因體中。可使用標準的重組DNA方法，來產生編碼經修飾的酵素的核酸，將核酸併入至表現載體中，以及將載體導入至宿主細胞中。

在一些實施例中，宿主細胞可表現2個或以上的經修飾的酵素。例如，可用編碼2個或以上經修飾的酵素的核酸，來轉染宿主細胞。或者，可用一個以上的核酸，來轉染宿主細胞，各個核酸可編碼一個或以上的經修飾之酵素。

編碼經修飾的酵素的核酸可含有額外的核酸序列。例如，核酸可含有蛋白標籤、篩選標誌、或控制宿主細胞中蛋白表現的調控序列，例如啟動子、增強子或其它控制核酸(如，聚腺苷酸化信號)的轉錄或轉譯的表現控制片段。此種調控序列已為習知。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可理解的是，可依據數個因素，包括要轉形的宿主細胞的選擇、所需蛋白質的表現量等，來選擇表現載體，包括調控片段的選擇。用於哺乳動物宿主細胞表現的示例性調控序列，包括哺乳動物細胞中指引高蛋白質表現量的病毒片段，例如，源自於巨細胞病毒(cytomegalovirus，CMV)(例如，CMV啟動子及/或增強子)、猿猴病毒40(Simian Virus，SV40)(例如，SV40啟動子及/或增強子)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期啟動子(adenovirus major late promoter，AdMLP))與多瘤性病毒的啟動子及/或增強子。

在某些實施例中，將含有源自於GMD、FX及/或FUT的經修飾的酵素之核酸序列導入宿主細胞。在表現經修飾的酵素的宿主細胞中，岩藻醣基化途徑會被改變、抑制、或降低。

c.表現經修飾的酵素的宿主細胞

本發明另一範疇有關於表現岩藻醣基化途徑中經修飾的酵素的宿主細胞。宿主細胞中經修飾的酵素的表現會干擾野生型酵素的活性，導致抑制或降低岩藻醣基化途徑。因此，於表現經修飾的酵素之宿主細細胞中所產生的蛋白(如，抗體)被去岩藻醣基化(無岩醣基化)。

如本發明說所使用的詞組「低岩藻醣基化細胞」或「低岩藻醣基化宿主細胞」係指，因為細胞表現岩藻醣基化途徑中經修飾的酵素，所以岩藻醣基化途徑已受到抑制或減少的細胞。

可藉由將含有編碼岩藻醣基化途徑中經修飾之酵素的核酸序列的表現載體轉染至宿主細胞，以製備低岩藻醣基化細胞。可使用本領域已知的技術進行轉染。例如，可使用以化學為基礎的方法(如，脂質、磷酸鈣、陽離子聚合物、DEAE-葡聚醣、活化的樹枝形大分子，磁珠等)、藉由以儀器為基礎的方法(如，電穿孔、生物噴射技術、顯微注射、雷射/光注射等)，或藉由以病毒為基礎的方法，來進行轉染。

可使用存在於表現載體上的篩選標誌，自未轉染細胞篩選並分離出轉染細胞。此外，可進一步藉由各種技術，自具正常岩醣基化途徑的細胞篩選並分離出具有岩藻醣基化途徑被抑制或降低的轉染細胞，。例如，可使用抗體、凝集素、代謝標誌或化學酵素策略來確定岩藻醣基化。 此外，可藉由使轉染細胞暴露於小扁豆凝集素(Lens culinaris agglutinin，LCA，Vector laboratories L-1040)，來篩選出具有岩藻醣基化途徑被抑制或降低的細胞。LCA辨識N端連接的寡醣的α-1,6-岩藻醣基化三甘露醣核心結構，並使表現此結構的細胞進入細胞死亡途徑。因此，在接觸LCA後存活的細胞具有經抑制或降低的岩藻醣化途徑，且被視為低岩藻醣基化細胞。

2.去岩藻醣基化蛋白

本發明另一範疇係有關於一種生產去岩藻醣基化蛋白的方法。在一些實施例中，去岩藻醣基化蛋白為去岩藻醣基化抗體。

a.蛋白

可被產生為去岩藻醣基化蛋白產生的蛋白的非限制範例包括，GP-73、凝血酶、HBsAg、B型肝炎病毒顆粒、α-酸-醣蛋白、α-1-糜蛋白酶、α-1-糜蛋白酶、α-1-糜蛋白酶 組胺酸-脯胺酸-較少(His-Pro-less)、α-1-抗胰蛋白酶、血清轉鐵蛋白(Serotransferrin)、血漿銅藍蛋白、α-2-巨球蛋白、α-2-HS-醣蛋白、α-甲胎蛋白、結合珠蛋白、纖維蛋白原γ鏈前驅物、免疫球蛋白(包括IgG、IgA、IgM、IgD、IgE及其類似)、APO-D、激肽原、富含組胺酸的醣蛋白、補體因子1前驅物、補體因子I重鏈、補體因子I輕鏈、補體C1s、補體因子B前驅物、補體因子B Ba片段、補體因子B Bb片段、補體C3前驅物、補體C3 β鏈、補體C3 α鏈、C3a過敏毒素、補體、C3b α’鏈、補體C3c片段、補體C3dg片段、補體C3g片段、補體C3d片段、補體C3f片段、補體C5、補體C5 β鏈、補體C5 α鏈、C5a過敏毒素、補體C5α’鏈、補體C7、α-1 B醣蛋白、B-2-醣蛋白、維生素D-結合蛋白、Inter-α-胰蛋白酶抑製劑重鏈H2、α-1B-醣蛋白、血管收縮素原前驅物、血管收縮素-1、血管收縮素-2、 血管收縮素-3、GARP蛋白、β-2-醣蛋白、聚集素(Clusterin)(Apo J)、整合素α-8前驅物醣蛋白、整合素α-8重鏈、整合素α-8輕鏈、C型肝炎病毒顆粒、elf-5、激肽原、HSP33-同源、離胺醯基內肽酶及富含重複亮胺酸的蛋白質32前驅物。

b.抗體

本發明說明所使用的術語「抗體」廣泛地涵蓋了能被岩藻醣基化的完整抗體及其片段。例如，抗體包括完全組裝的免疫球蛋白(例如多株、單株、單特異性、多特異性、嵌合、去免疫、人源化、人類、靈長類化、單鏈、單結構域、合成及重組抗體)；具所需活性或功能之完整抗體的部分(例如，抗體的免疫片段，其含有Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、單域片段)；以及含有能被岩藻醣基化之Fc結構域的胜肽和蛋白(例如，Fc-融合蛋白)。

本發明說明所使用的術語「去岩藻醣基化抗體」係指在相較於在天然條件下所產生的抗體，岩藻醣基化被抑制或顯著降低的條件下所產生的抗體或其片段。以本發明方法所產生的去岩藻醣基化抗體可為完全(100%)去岩藻醣基化，或者可包括岩藻醣基化及去岩藻醣基化的分子的混合。例如，在一些實施例中，由本發明方法所產生之抗體可含有約20%至約100%的去岩藻醣基化分子。在另一些實施例中，由本發明方法所產生之抗體可含有約40%至約100%的去岩藻醣基化分子。在某些實施例中，由本發明方法所產生的抗體可含有約至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97、98%、99%或100%的去岩藻醣基化分子。並非所有的N-醣化抗體或其片段(例如，Fc-融合蛋白) 皆需為去岩藻醣基化。

b.抗體種類

可使用本發明方法可將任何抗體生產為去岩藻醣基化抗體。對於可使用本發明方法產生的抗體的種類並無限制。以下為可產生的抗體的非詳盡列表。

辨識腫瘤相關抗原的抗體的範例包括抗-GD2抗體、抗-GD3抗體、抗-GM2抗體、抗-HER2抗體、抗-CD52抗體、抗-MAGE抗體、抗-HM124抗體、抗-甲狀旁腺激素相關蛋白(parathyroid hormone-related protein，PTHrP)抗體、抗-鹼性纖維細胞生長因子抗體與抗-FGF8抗體、抗-鹼性纖維細胞生長因子受體抗體與抗-FGFS受體抗體、抗-類胰島素生長因子抗體、抗-類胰島素生長因子受體抗體、抗-PMSA抗體、抗-血管內皮細胞生長因子抗體、抗-血管內皮細胞生長因子受體抗體及其類似物。

辨識過敏或發炎相關抗原的抗體的範例包括抗-IL-6抗體、抗-IL-6受體抗體、抗-IL-5抗體、抗-IL-5受體抗體與抗-IL-4抗體、抗-腫瘤壞死因子抗體、抗-腫瘤壞死因子受體抗體、抗-CCR4抗體、抗-趨化因子抗體、抗-趨化因子受體抗體及其類似物。

辨識循環器官疾病相關抗原的抗體的範例包括抗-GpIIb/IIIa抗體、抗-血小板衍生生長因子抗體、抗-血小板衍生生長因子受體抗體及抗-血液凝固因子抗體及其類似物。

辨識病毒或細菌感染相關抗原的抗體的範例包括抗-gpl 20抗體、抗-CD4抗體、抗-CCR4抗體與抗-維羅毒素抗體及其類似物。

許多治療性抗體為市售可得的，例如，結合VEGF(如， Bevacizumab(AVASTIN®))、EGFR(如，Cetuximab(ERBITUX®))、HER2(如，Trastuzumab(HERCEPTIN®))與CD20(如，Rituximab(RITUXAN®))的抗體，及結合TNFa(如，Etanecept(ENBREL®)，其包括TNF受體的受體結合域(p75))、CD2(如，Alefacept(AMEVIVE®)，其包含LFA-3的CD2-結合區)、或B7(Abatacept(ORENCIA®)，其包括CTLA4的B7-結合區)抗體的Fc-融合蛋白。

3.製備去岩藻醣基化蛋白的方法

在低岩藻醣基化細胞中產生本發明去岩藻醣基化蛋白，其包括去岩藻醣基化抗體。使用本領域習知技術，例如以編碼蛋白之表現載體轉染低岩藻醣基化細胞，可在低岩藻醣基化細胞中表現去岩藻醣基化蛋白。

可使用本領域習知技術，來製備編碼蛋白的表現載體。例如，將胺基酸序列反轉錄成核酸序列，以構築表現載體，較佳使用對於在其中表現蛋白質之生物體而言最佳化的核酸密碼子。然後，將編碼蛋白的核酸和其任何調控片段組裝並插入至所欲的表現載體中。表現載體可含有額外的核酸序列，例如蛋白標籤、篩選標誌、或控制蛋白表現的調控序列，如同上述含有經修飾的酵素的表現載體。表現載體接著可利用轉染導入宿主細胞。可使用已知本領域習知技術進行轉染。例如，可使用以化學為基礎的方法(如，脂質、磷酸鈣、陽離子聚合物、DEAE-葡聚醣、活化的樹枝形大分子、磁珠等)，藉由以儀器為基礎的方法(如，電穿孔、生物噴射技術、顯微注射、雷射/光注射等)，或藉由以病毒為基礎的方法進行轉染。之後在適合所選表現系統及宿主的條件下，可在經轉染的細胞中表現蛋白。可接著使用親和性管柱或其它本領域已知技術純化表現的蛋白。

將編碼經修飾的酵素(欲成為一低岩藻醣基化細胞)的核酸及編碼蛋白(欲表現此蛋白)的核酸，以任意的順序轉染至宿主細胞，以產生去岩藻醣基化蛋白。例如，可先將編碼經修飾的酵素(欲成為低岩藻醣基化細胞)的核酸轉染至宿主細胞中，再以編碼一蛋白(欲表現此蛋白)的核酸轉染。或者，可先將編碼蛋白(欲表現此蛋白)的核酸轉染至宿主細胞中，再以編碼經修飾的酵素(欲成為一低岩藻醣基化細胞)的核酸轉染。在另一變化中，可同時將編碼經修飾的酵素(欲成為一低岩藻醣基化細胞)的核酸與編碼蛋白(欲表現此蛋白)的核酸轉染至宿主細胞中。

在一特定實施例中，依照下列步驟，藉由先製備低岩藻醣基化細胞，然後將編碼蛋白質的核酸轉染至低岩藻醣基化細胞中，以產生去岩藻醣基化蛋白：a)獲得適合表現蛋白的宿主細胞；b)將編碼經修飾的酵素的核酸轉染至此宿主細胞中；c)篩選及/或分離具低岩藻醣基化的轉染細胞；d)將編碼蛋白的核酸轉染至低岩藻醣基化細胞中；e)篩選及/或分離經以編碼蛋白之核酸轉染的低岩藻醣基化細胞；f)誘導蛋白在低岩藻醣基化細胞中的表現。

在另一實施例中，依照下列步驟，藉由先將編碼蛋白的核酸轉染至宿主細胞中，再以編碼經修飾的酵素的核酸轉染此細胞，以產生去岩藻醣基化蛋白：a)獲得適合表現蛋白的宿主細胞；b)將編碼蛋白的核酸轉染至宿主細胞中； c)篩選及/或分離經以編碼蛋白的核酸轉染的細胞；d)將編碼經修飾的酵素的核酸轉染至步驟(c)的細胞中；e)篩選及/或分離步驟(d)中之具低岩藻醣基化的轉染細胞；f)誘導蛋白在低岩藻醣基化細胞中的表現。

在上述實施例的變化中，去岩藻醣基化蛋白可依下述步驟產生：a)獲得表現或過度表現蛋白的宿主細胞；b)將編碼經修飾的酵素的核酸轉染至此細胞中；c)篩選及/或分離具低岩藻醣基化的轉染細胞；d)誘導蛋白在低岩藻醣基化細胞中的表現。

在又一實施例中，如下，藉由同時將編碼經修飾的酵素(欲成為一低岩藻醣基化細胞)的核酸和編碼蛋白(欲表現此蛋白)的核酸轉染至宿主細胞，以產生去岩藻醣基化蛋白：a)獲得適合表現一蛋白的宿主細胞；b)將編碼蛋白的第一核酸及編碼經修飾的酵素的第二核酸轉染至宿主細胞；c)篩選及/或分離表現蛋白且具有低岩藻醣基化的轉染細胞；d)誘導蛋白在低岩藻醣基化細胞中的表現。

使用上述的本發明方法產生去岩藻醣基化蛋白，包括抗體，可以本領域習知方法純化。例如，藉由本發明方法所產生的去岩藻醣基化蛋白，包括抗體，可以生理化學分餾、抗體類特異性親和力、抗原特異性親和力等方式純化。

4.去岩藻醣基化抗體改善的特性

相較於使用標準方式所產生的抗體，以本發明方法生產的去岩藻醣基化抗體具有改善的特性。

可藉由ELISA、螢光法及其類似方式，來測量去岩藻醣基化抗體的活性。可藉由測量其ADCC和CDC等方式，來評估抗原陽性的培養細胞株的細胞毒性活性。可使用相對接近人類的動物種類的適當模型，來評估抗體在人體內的安全性和治療效果。

a.增加的ADCC活性

相較於使用標準方式所產生的抗體，本發明的去岩藻醣基化抗體具有增加的ADCC活性。

本發明方法所用之「ADCC活性」係指抗體引起抗體依賴性細胞毒性(ADCC)反應的能力。ADCC為細胞媒介的反應，其中表現FcRs之抗原非特異性細胞毒性細胞(如，自然殺手(NK)細胞、嗜中性細胞與巨噬細胞)辨識結合至目標細胞表面的抗體，接著造成目標細胞的分解(即，殺死)。ADCC中的主要媒介細胞是自然殺手(NK)細胞。NK細胞表現FcγRIII，其中FcγRIIIA為活化受體而FcγRIIIB為抑制受體。單核細胞表現FcγRI、FcγRII與FcγRIII。可使用體外分析法，如實施例3中描述的分析法，來直接評定ADCC活性。

可使用體外分析法，來直接評定ADCC活性。在一些實施例中，本發明的去岩藻醣基化抗體的ADCC活性至少是其野生型對照抗體的0.5、1、2、3、5、10、20、50、100倍。

由於去岩藻醣基化抗體具有增加的ADCC活性，相較於其岩 藻醣基化抗體，可以較低的量或濃度，來給予去岩藻醣基化的治療抗體。在一些實施例中，本發明的去岩藻醣基化抗體的濃度可比其岩藻醣基化抗體的濃度低至少2、3、5、10、20、30、50或100倍。在一些實施例中，相較於其野生型對應物，本發明的去岩藻醣基化抗體可展現更高的最大目標細胞分解(maximal target cell lysis)。例如，本發明的去岩藻醣基化抗體的最大目標細胞分解(maximal targe cell lysis)比其野生型抗體的最大目標細胞分解高10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%或更多。

b.增加的CDC活性

相較於使用標準方法產生的抗體，本發明的去岩藻醣基化抗體具有增加的補體依賴性細胞毒性(CDC)活性。

本發明方法所使用的「CDC活性」係指辨識在目標細胞上結合的抗體，接著使目標細胞分解的補體系統中的一或多個成分的反應。本發明的去岩藻醣基化抗體不會降低或抑制CDC活性，但相反地，其維持類似或高於其岩藻醣基化對應物的CDC活性。

本發明更提供具有增強的CDC功能的去岩藻醣基化抗體。在一實施例中，本發明的Fc變異體具有增加的CDC活性。在另一實施例中，所述去岩藻醣基化抗體具有比相對的分子高至少2倍，或至少3倍，或至少5倍，或至少10倍，或至少50倍，或至少100倍的CDC活性。

4.使用去岩藻醣基化抗體

可以靜脈內(intravenously，i.v.)、皮下(subcutaneously，s.c.)、肌內(intra-muscularly，i.m.)、皮內(intradermal，i.d.)、腹膜內(intraperitoneal，i.p.)或經由任何黏膜表面，如口服(orally，p.o.)、舌下(sublingually，s.l.)、臉 頰、鼻、直腸、陰道或經由肺部途徑，來給予本發明的去岩藻醣基化抗體。

對於治療或預防各種疾病，包括癌症、發炎性疾病、免疫及自體免疫疾病、過敏、循環器官疾病(如，動脈硬化)以及病毒或細菌感染，去岩藻醣基化抗體是有用。

本發明的去岩藻醣基化抗體的劑量會依據給予的對象及特定模式而改變。可根據本發明所屬技術領域中具有通常知識者所熟知的許多因子，包括但不限於，抗體目標、對象的種類以及對象的大小/體重，而改變所需的劑量。劑量可為0.1至100,000μg/kg體重。可單劑或多劑給予去岩藻醣基化抗體。去岩藻醣基化抗體可在24小時期間中給予一次，在24小時期間給予多次，或持續注入。可持續地或以特定時程給予去岩藻醣基化抗體。可由獲自動物模型的劑量-反應曲線推斷有效劑量。

4.特定實施例

本發明的特定實施例包括，但不限於以下：

(1)一種具低岩藻醣基化的重組細胞，包括一編碼岩藻醣基化途徑中一經修飾之酵素的核酸序列。

(2)如(1)之重組細胞，其中經修飾之酵素源自於GDP-甘露醣4,6-脫水酶(GDP-mannose 4,6-dehydratase，GMD)、GDP-4-酮基-6-脫氧-D-甘露醣異構酶-還原酶(GDP-4-keto-6-deoxy-D-mannose epinierase-reductase，FX)、或岩藻醣轉移酶(fucosyltransferase，FUT)。

(3)如(1)之重組細胞，其中經修飾之酵素源自於岩藻醣轉移酶(FUT)。

(4)如(1)之重組細胞，其中經修飾之酵素源自於α-1,6-岩藻醣轉移酶(FUT8)。

(5)如(1)之重組細胞，其中核酸序列擇自於下列所組成之群組：SEQ ID NOs：3、5、7、9、11、15及其任何組合

(6)如(1)之重組細胞，其中經修飾之酵素具有一胺基酸序列，其擇自於下列所組成之群組：SEQ ID NOs：4、6、8、10、12、16及其任何組合。

(7)如(1)之重組細胞，其中經修飾之酵素於該重組細胞中降低或抑制經修飾之酵素所源自的野生型酵素的活性。

(8)如(1)之重組細胞，其中經修飾之酵素抑制或降低重組細胞中的岩藻醣基化。

(9)如(1)之重組細胞，其中在此細胞所產生之蛋白中低於10%為被岩藻醣基化。

(10)如(1)之重組細胞，更包括一編碼一抗體的核酸。

(11)如(10)之重組細胞，其中於此細胞中表現的抗體為一去岩藻醣基化抗體。

(12)一種於如(11)之重組細胞中所產生的去岩藻醣基化抗體。

(13)如(12)之去岩藻醣基化抗體，其至少90%為去岩藻醣基化。

(14)如(12)之去岩藻醣基化抗體，其中去岩藻醣基化抗體，相較於其岩藻醣基化對應物，具有增強的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)活性。

(15)如(12)之去岩藻醣基化抗體，其中，相較於岩藻醣基化對應物，去岩藻醣基化抗體的補體依賴性細胞毒性(CDC)未被降低、或未被抑制。

5.其它實施例

本發明的額外實施例包括，但不限於以下：

(1)一種產生去岩藻醣基化抗體的方法，包括： 導入一編碼至少一修飾酵素的核酸至一宿主細胞中，以在宿主細胞中產生去岩藻醣基化抗體。

(2)如(1)之方法，其中修飾酵素源自於GDP-甘露醣4,6-脫水酶(GMD)、GDP-4-酮基-6-脫氧-D-甘露醣異構酶-還原酶(FX)、或岩藻醣轉移酶(FUT)。

(3)如(1)之方法，其中修飾酵素源自於岩藻醣轉移酶(FUT)。

(4)如(1)之方法，其中修飾酵素源自於α-1,6-岩藻醣轉移酶(FUT8)。

(5)如(1)之方法，其中修飾酵素抑制及或降低宿主細胞中的野生型岩藻醣基化。

(6)如(1)之方法，其中修飾酵素抑制及或降低宿主細胞中抗體的岩藻醣基化。

(7)如(1)之方法，其中去岩藻醣基化抗體具有增強的ADCC活性。

(8)如(1)之方法，其中去岩藻醣基化抗體的CDC活性未被降低或抑制。

(9)一種產生去岩藻醣基化抗體的方法，包括：a)提供一宿主細胞，b)導入一編碼至少一修飾酵素的核酸至宿主細胞中，以及c)在宿主細胞中產生一去岩藻醣基化抗體。

(10)如(9)之方法，其中步驟(a)的宿主細胞包括至少一編碼一抗體的核酸。

(11)如(9)之方法，更包括導入一編碼一抗體的核酸至步驟(b)後的宿主細胞中。

(12)如(9)之方法，其中修飾酵素源自於GDP-甘露醣4,6-脫水酶(GMD)、GDP-4-酮基-6-脫氧-D-甘露醣異構酶-還原酶(FX)、及/或岩藻醣轉移酶(FUT)。

(13)如(9)之方法，其中修飾酵素源自於岩藻醣轉移酶(FUT)。

(14)如(9)之方法，其中修飾酵素源自於α-1,6-岩藻醣轉移酶(FUT8)。

(15)如(9)之方法，其中修飾酵素抑制宿主細胞中岩藻醣基化酵素的活性。

(16)如(9)之方法，其中修飾酵素抑制及降低宿主細胞中抗體的醣基化。

(17)如(9)之方法，其中去岩藻醣基化抗體具有增強的ADCC活性。

(18)如(9)之方法，其中去岩藻醣基化抗體的CDC活性未被降低或抑制。

(19)一種以(1)或(9)之方法所製備的去岩藻醣基化抗體，其中去岩藻醣基化抗體具有增強的ADCC。

(20)如(19)之方法，其中去岩藻醣基化抗體為一人類抗體或其片段。

(21)如(19)之方法，其中去岩藻醣基化抗體維持原有的CDC活性。

(22)一種醫藥組成物，包括(19)之去岩藻醣基化抗體及一藥學上可接受之載體或佐劑。

(23)一種無或低岩藻醣基化的細胞，包括一編碼至少一修飾酵素的核酸。

(24)一種去岩藻醣基化抗體，其以下述方法製備：a)將編碼至少一經修飾酵素的核酸導入一表現岩藻醣基抗體的宿主細胞中；以及b)培養此宿主細胞以在此宿主細胞中產生一去岩藻醣基化抗體；(25)如(24)之去岩藻醣基化抗體，其中經修飾的酵素源自於GDP-甘露醣4,6-脫水酶(GMD)、GDP-4-酮基-6-脫氧-D-甘露醣異構酶-還原酶(FX)、或岩藻醣轉移酶(FUT)。

(26)如(25)之去岩藻醣基化抗體，其中修飾酵素源自於岩藻醣轉移酶(FUT)。

(27)如(26)之去岩藻醣基化抗-CD20抗體，其中修飾酵素源自於α-1,6-岩藻醣轉移酶。

(28)如(24)之去岩藻醣基化抗-CD20抗體，其中修飾酵素抑制宿主細胞中野生型岩藻醣基化酵素的活性。

(29)如(24)之去岩藻醣基化抗-CD20抗體，其中修飾酵素抑制及降低宿主細胞中抗體的醣基化。

(30)如(24)之去岩藻醣基化抗-CD20抗體，其中去岩藻醣基化抗體具有增強的ADCC活性。

(31)如(24)之去岩藻醣基化抗-CD20抗體，其中去岩藻醣基化抗體的CDC活性未被降低或抑制。

(32)如(24)之去岩藻醣基化抗-CD20抗體，其中去岩藻醣基化抗體為一抗-CD20或抗-ErbB2抗體。

(33)一種去岩藻醣基化抗體，其以下述方法製備：a)提供一宿主細胞，b)導入一編碼至少一修飾酵素的核酸至此宿主細胞中，c)導入一編碼具岩藻醣基抗體的核酸，以及b)於此宿主細胞中產生一去岩藻醣基化抗體。

(34)如(33)去岩藻醣基化抗體，其中經修飾的酵素源自於GDP-甘露醣4,6-脫水酶(GMD)、GDP-4-酮基-6-脫氧-D-甘露醣異構酶-還原酶(FX)、及/或岩藻醣轉移酶(FUT)。

(35)如(33)去岩藻醣基化抗體，其中經修飾酵素源自於α-1,6-岩藻醣轉移酶。

(36)如(33)去岩藻醣基化抗體，其中此抗體具有增強的ADCC活性。

(37)如(33)去岩藻醣基化抗體，其中此去岩藻醣基化抗體的CDC活性未被降低或抑制。

(38)如(33)去岩藻醣基化抗體，其中去岩藻醣基化抗體為一抗-CD20或抗-ErbB2抗體。

(39)一種醫藥組成物，包括(1)或(10)的去岩藻醣基化抗體及一藥學上可接之之載體或佐劑。

額外的本發明特定實施例包括，但不限於以下實施例。

【實施例1】

岩藻醣基化途徑中經修飾之酵素的製備及表現此經修飾之酵素的穩定細胞株

1.細胞株

市售CHOdhfr(-)細胞株(ATCC CRL-9096)，其為缺乏二氫葉酸還原酶活性的CHO細胞突變株，購自於菌種保存及研究中心(Culture Collection and Research Center(CCRC)，台灣)。將CHOdhfr^(-)細胞株分成3個分開的培養物，且如下所示進行處理：將第一培養物轉染編碼RITUXAN®(Rituximab，一種抗蛋白質CD20的嵌合單株抗體)的表現載體。獲得表現RITUXAN®的穩定細胞株且鑑別為RC79。

將第二培養物轉染編碼HERCEPTIN®(Trastuzumab，一種抗蛋白質HER2的單株抗體)。獲得表現HERCEPTIN®的穩定細胞株且鑑別為 HC59。

第三培養物為未經處理的細胞，且維持為CHOdhfr(-)細胞株。

2.編碼FUT8與GMD之經修飾的酵素之表現載體的構築

構築許多編碼經修飾之酵素FUT8與GMD的表現載體。

F83M、F8M1、F8M2、F8M3及F8D1突變型分別表示對α-1,6-岩藻醣轉移酶，野生型FUT8蛋白(GenBank No.NP_058589.2)，的不同修飾。表1總結針對各FUT8載體對於野生型核酸序列所做的修飾，及在所表現的酵素中所產生的胺基酸改變。特別是，F83M代表在野生型FUT8蛋白中於R365A、D409A與D453A有3個修飾的突變型。F8M1、F8M2與F8M3分別代表野生型FUT8蛋白中各自在K369E、D409K與S469V有一個修飾的突變型。F8D1代表於野生型FUT8蛋白中，具有於第365至386位之胺基酸殘基刪除的突變型。

表2總結GMD載體對於野生型核酸序列所做的修飾，及在所表現的酵素中所產生的胺基酸改變。特別是，突變型GMD4M表示對GDP-甘露醣4,6-脫水酶，野生型GMD蛋白(GenBank No.NP_001233625.1，的修飾，其在野生型GMD蛋白中有4個突變，在T155A、E157A、Y179A與K183A。

所有編碼F83M、F8M1、F8M2、F8M3、F8D1及GMD4M的核酸序列由GeneDireX公司合成，並次選殖至pHD表現載體(pcDNA3.1Hygro，Invitrogen，Carlsbad,CA,cat.no.V870-20，具dhfr基因)的PacI/EcoRv或BamHI/EcoRV位置，以形成pHD/F83M、pHD/F8M1、pHD/F8M2、pHD/F8M3、pHD/F8D1及pHD/GMD4M質體。

3.表現經修飾的酵素之穩定重組細胞株的製備

將pHD/F83M、pHD/F8M1、pHD/F8M2、pHD/F8M3、pHD/F8D1及pHD/GMD4M質體藉由電穿孔(PA4000 PULSEAGILE® electroporator,Cyto Pulse Sciences)轉染至不同細胞株中，包括(a)RC79細胞株(表現RITUXAN®的CHO細胞)、(b)HC59細胞株(表現HERCEPTIN®的CHO細胞)、以及(c)CHOdhfr^(-)細胞(缺乏二氫葉酸還原酶活性的CHO細胞突變株)。

a.RC79細胞

轉染的RC79細胞株先培養於含0.1至0.25mg/mL潮黴素(Hygromycin)的RC79培養基中(含有0.4μM MTX、0.5mg/mL遺傳黴素(Geneticin)、0.05mg/mL博來黴素(Zeocin)、4mM Glutamax-I和0.01% F-68的EX-CELL®302無血清培養基)中。接著，將轉染細胞培養於含有0.4μM MTX、0.5mg/mL遺傳黴素、0.05mg/mL博來黴素、4mM Glutamax-I,0.01% F-68與0.25mg/mL潮黴素的EX-CELL®302無血清培養基中，並如以下所述，以扁豆凝集素(Lens culinaris agglutinin，LCA)分離，以產生5個細胞庫(cell pool)，包括RC79F83M、RC79F8M1、RC79F8M2、RC79F8M3、RC79F8D1與RC79-GMD4M細胞株。

b.HC59細胞

轉染的HC59細胞株先培養於含0.1至0.25mg/mL潮黴素的HC59培養基(含有0.8μM MTX、0.5mg/mL遺傳黴素、0.05mg/mL博來黴素與4mM Glutamax-I的EX-CELL® 325 PF CHO培養基)。接著，將轉染的細胞培養於含有0.8μM MTX、0.5mg/mL遺傳黴素、0.05mg/mL博來黴素、 4mM Glutamax-I與0.25mg/mL潮黴素的EX-CELL® 325 PF CHO培養基中，並如以下所述，以LCA分離，以產生HC59F83M細胞株的細胞庫。

c.CHOdhfr ^(-) 細胞

CHOdhfr^(-)細胞先培養於含4mM Glutamax-I與0.1至0.25mg/mL潮黴素的EX-CELL® 325 PF CHO培養基。接著，將轉染的細胞培養於含有4mM Glutamax-I、0.25mg/mL潮黴素與0.01μM MTX的EX-CELL® 325 PF CHO培養基中，以產生C109F83M細胞株的細胞庫。

4.具低岩藻醣基化細胞的分離

在此實施例中使用羅丹明(Rhodamine)標記的扁豆凝集素(Lens culinaris agglutinin，LCA)(Vector Laboratories,Cat.RL-1042)，來篩選具低岩藻醣基化的細胞。

所有的RC79、HC59及CHO轉染株受到含有潮黴素的初步篩選培養基作為篩選壓力，接著使用可辨識N-連接寡醣之α-1,6-岩藻醣基化三甘露醣核心結構，並使表現此結構的細胞往細胞死亡途徑的LCA，來進行最終篩選。先以1.2 x 10⁵細胞/mL，將RC79、HC59或CHO的轉染株種於含有0.4mg/mL LCA的2.5mL新鮮培養基中，且在第3或4天時計數細胞存活率。將細胞培養於此初步篩選培養基中，直到細胞存活率達到80%。在細胞存活率達到80%後，以1.2 x 10⁵cells/mL，將細胞重新懸浮於含有梯度濃度之LCA的新鮮篩選培養基中。LCA篩選重複數次，直到LCA最終濃度達到0.6至1.2mg/mL。

為分析細胞表面上的岩藻醣的量，以LCA標誌細胞，且以流式細胞術進行分析。首先，將細胞種於不含LCA的完全培養基14天，以去 除來自篩選試劑LCA的訊號干擾。接著，以1mL冰冷PBS清洗3 x 10⁵細胞2次，且重新懸浮於含1%牛血清白蛋白與5μg/mL LCA的200μl冰PBS中。在冰上培養30分鐘後，以1mL冰冷PBS清洗細胞2次。將細胞重新懸浮於350μl冷的PBS中，並使用FACScalibur^TM流式細胞儀(BD Biosciences,San Jose,CA)進行分析。

接著，以10mL的冰冷PBS清洗1 x 10⁷細胞2次，且重新懸浮於6.5mL含1%牛血清白蛋白與5μg/mL LCA的冰冷PBS中。在冰上培養30分鐘後，以10mL冷的PBS清洗細胞2次。將細胞重新懸浮於1mL含1%熱滅活的胎牛血清(GIBCO,Cat.10091-148)與抗生素-抗黴菌劑(Invitrogen,Cat.15240062)的冰冷PBS中。

以FACSAria^TM或Influx^TM Cell Sorter(BD Biosciences,San Jose,CA)分析及分類細胞。對於不同的細胞株，需要1-3次的分類，以產生具低岩藻醣基化細胞的同質族群。此外，使用CLONEPIX^TM 2系統(MOLECULAR DEVICES®)，來分離具低岩藻醣基化的穩定細胞株，並移至96孔盤。在培養約2週後，將細胞移至6孔盤，並再以流式細胞術分析。然後，將具低岩藻醣基化細胞移至用於饋料批次(fed-batch)培養的過濾管，以評估細胞表現和由所得細胞純化之抗體的岩藻醣基化程度。

5.表現RITUXAN®之C109F83M細胞株的製備

在以LCA分離低岩藻醣基化CHOdhfr^(-)細胞(C109F83M細胞)後，將編碼RITUXAN®的核酸以電穿孔的方式(PA4000 PULSEAGILE® electroporator,Cyto Pulse Sciences)轉染至細胞中。分離出C109F83M的低岩藻醣單一細胞株，AF97，並以電穿孔的方式轉染編碼RITUXAN®的核酸， 以表現RITUXAN®。將轉染株移至含有非選擇性培養基的25T燒瓶燒瓶中，以回復生長。48小時後，將轉染株培養於含有4mM GlutaMAX-I、潮黴素-B、博來黴素與0.01μM MTX的篩選培養基。使用CLONEPIX TM 2系統挑選出單一細胞，以產生AF97抗-CD20細胞株。

所獲得的細胞為表現RITUXAN®的低岩藻醣基化CHOdhfr^(-)細胞，且在此稱為AF97抗-CD20細胞株。

【實施例2】 去岩藻醣基化抗體的表現及分析 1.抗體的表現與純化

將實施例1中所獲得的具低岩藻醣基化活性的細胞以批次或饋料批次培養，來表現抗體。由細胞所純化的抗體進行單醣分析，以對Fc區中的醣鏈進行定量分析。

將重組RC79細胞培養於含有4mM Glutamax與0.01% F-68的EX-CELL® 302無血清培養基中，且維持於37℃、5% CO₂的震盪培養箱(Infors Multitron Pro)中。

將重組HC59細胞培養於含有0.8μM MTX、0.5mg/mL遺傳黴素、0.05mg/mL博來黴素、4mM Glutamax-I與0.25mg/mL潮黴素的EX-CELL® 325 PF CHO培養基中，且維持於37℃、5% CO₂的震盪培養箱(Infors Multitron Pro)中。

每天常規地監測細胞培養的參數。使用血球計數器(hemocytometer)以錐藍質(trypan blue)排除，來判定細胞密度及存活率。當細胞存活率低於60%時，藉由離心來收集條件培養基並以蛋白A樹脂來純化 所表現的抗體。以5倍管柱體積的0.1M Tris，pH 8.3，來平衡蛋白A管柱，接著將樣本添加至管柱中。以0.1M Tris，pH 8.3(2倍管柱體積)及PBS，pH 6.5(10倍管柱體積)清洗掉未結合的蛋白。進一步以0.1M醋酸鈉，pH 6.5(10倍管柱體積)清洗管柱。最後，以0.1M甘胺酸，pH 2.8沖提抗體，並以相同沖提體積的0.1M Tris，pH 8.3進行中和。

2.抗體的N-多醣圖譜分析的判定

以ACQUITY UPLC®系統分析N-多醣圖譜。首先，在37℃下，以含有在0.3mL消化緩衝液(15mM Tris-HCl、pH 7.0)中之3 U PNGase-F，來消化0.3mg抗體樣本18小時。，釋放出的N-多醣藉由使用AMICON®Ultra-0.5mL 30K裝置，於13,000rpm下5分鐘之超過濾，以從抗體分離，然後冷凍乾燥3小時。接著，將乾燥的N-多醣溶於30μL的ddH₂O與45μL的2-AB標記試劑(含0.34M氨基苯甲醯胺與1M氰基硼氫化鈉的DMSO-醋酸(7：3 v/v)溶劑)中，且於65℃下培養3小時。以PD MINITRAP^TM G10尺寸排除管柱除去過量的2-AB標記試劑。將標記的N-多醣冷凍乾燥隔夜，並重新溶於50μL ddH₂O中，以進行UPLC檢測。在60℃下，藉由ACQUITYUPLC®系統和Glycan BEH醯胺管柱，來獲得N-聚醣圖譜。以100mM甲酸銨，pH4.5/乙腈線性梯度，來分離不同形式的N-聚醣。

流式細胞儀的結果顯示，在所有細胞類型中，過度表現F83M蛋白的細胞表面上，LCA的結合極低。類似地，在過度表現F8M1、F8M2、F8M3、F8D1或GMD4M蛋白的RC79細胞上，未偵測到LCA結合(數據未顯示)。

表3顯示，具有未修飾的岩藻醣基化途徑之RC79與HC59細 胞以及藉由過度表現F83M經修飾的酵素，來修飾其岩藻醣基化途徑的RC79與HC59細胞中所產生之抗體的N-聚醣圖譜。表3中的數據顯示，具有未修飾岩藻醣基化途徑之細胞中所產生的抗-CD20與抗-ErbB2抗體大部分被重度岩藻醣基化。特別是，在這些細胞中，僅3.67%的抗-CD20與3.64%的抗-ErbB2抗體被去岩藻醣基化。相較之下，過度表現F83M經修飾之酵素的細胞中所產生之抗體具有非常低的岩藻醣基化程度。特別是，在過度表現F83M經修飾之酵素的細胞中，約98.86-98.91%的抗-CD20與約92.12-96.52%的抗-ErbB2抗體被去岩藻醣基化。

此外，表4顯示具有未修飾的岩藻基化途徑之RC79細胞以及藉由過度表現F8M1、F8M2、F8M3、F8D1或GMD4M經修飾的酵素之一，來修飾其岩藻醣基化途徑的RC79細胞中所產生之抗體的N-聚醣圖譜。表4的數據顯示，具有未修飾的岩藻醣基化途徑的RC79細胞中所產生之抗-CD20抗體大部分被重岩藻醣基化。特別是，在這些細胞中，僅3.67%的抗-CD20抗體為去岩藻醣基化。相較之下，過度表現經修飾的酵素之RC79細胞中所產生的抗體具有非常低的岩藻醣基化程度。特別是，由過度表現F8M1、F8M2、F8M3、F8D1或GMD4M經修飾的酵素之細胞所產生之抗-CD20抗體的去岩藻醣基化程度為約92.78%至約97.16%，如表4所示。

表4亦顯示由過度表現FUT8經修飾的酵素(F8M1、F8M2,F8M3,F8D1)之一的細胞所產生之抗體的去岩藻醣基化程度為95.70至97.16%，且由過度表現GMD經修飾的酵素(GMD4M)所生產之抗體的去岩藻醣基化程度為92.78%。這些結果證實，在過度表現FUT8經修飾的酵素之細胞中所產生之抗體的去岩醣基化程度高於在過度表現GMD突變型蛋白的細 胞中所生產之抗體。

表3及4的結果證實，已經設計來表現抗體的宿主細胞可轉染表現岩藻醣基化途徑中經修飾的酵素(FUT8或GMD)的載體。此結果也顯示，在這些轉染細胞中所產生的抗體是去岩藻醣基化抗體。

此外，評估AF97細胞株中所產生之抗體的岩藻醣基化程度。表5的結果顯示，過度表現F83M經修飾的酵素之AF97細胞中所產生之抗體具有非常低岩藻醣基化程度。特別是，97.83%的在AF97細胞株中所產生之抗-CD20抗體為去岩藻醣基化。相較之下，市售RITUXAN®(MABTHERA®)具有3.92%的去岩藻醣基化程度。

表5的結果顯示，可在先轉染編碼經修飾的酵素之核酸，接著第二次轉染編碼抗體之核酸的細胞中，產生去岩藻醣基化抗體。因此，可使用本發明方法，將細胞修飾以產生去岩藻醣基化抗體。

3.重組細胞中FUT8蛋白的表現

將RC79細胞與表現FUT8經修飾的酵素(如，F8M1、F8M2、F8M3、或F8D1)的重組細胞的沉澱物分解於含有磷酸酶抑制劑雞尾酒(Sigma-Aldrich，Cat.S8820)的1% Triton X-100中。以DC^TM(清潔劑)蛋白質分析(BIO-RAD)試劑，來確認分解細胞的上清液中的蛋白濃度。將含有30μg蛋白的上清液的每個樣品，以12.5%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺膠體電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)來分離並移至硝化纖維素膜上。藉由使用含有120mM NaCl、0.1% gelatin(w/w)與0.1% TWEEN®20(聚乙二醇山梨醣醇酐單月桂酸酯(v/w)之25mM Tris-HCl(pH7.4)，來封阻硝化纖維素膜1小時，並在4℃下分別與抗-FUT8 抗體(Abcam,Cat.ab204124,1：500)及GAPDH抗體(GeneTex,Cat.GT239,1：10000)分別培養隔夜。膜以25mM Tris-HCl(pH7.4)(含有120mM NaCl,0.1% gelatin(w/w)and 0.1% TWEEN® 20(v/w))清洗膜3次，5分鐘，接著在室溫下與山羊抗-兔子IgG(Jackson ImmunoResearch,Cat.111-035-144)和山羊抗-小鼠IgG HRP(GeneTex,Cat.GTX213111-01,1：10000)分別反應1小時。額外清洗後，以SIGMAFAST DAB with Metal Enhancer(Sigma,Cat.D0426)，來分析膜。

第1圖為西方墨點法，其顯示RC79親源細胞中及表現經修飾的酵素之RC79重組細胞中的FUT8蛋白的表現。重組細胞及RC79親源中FUT8蛋白的表現量類似。這些結果表示，表現經修飾的酵素之RC79細胞中之去岩藻醣基化抗體的產生與FUT8蛋白的表現量無關。這些結果顯示FUT8經修飾的酵素會干擾細胞中的野生型FUT8蛋白，以抑制及/或降低岩藻醣基化途徑，使重組細胞有效率地產生去岩藻醣基化抗體。

相較於其它依靠抑制或向下調控野生型FUT8基因、或使用RNAi，來減少FUT8蛋白表現的方式，使用本發明方法產生去岩藻醣基化抗體的機制為新穎且獨特的。

4.重組細胞的穩定性

評估表現F83M經修飾的酵素之RC79重組細胞的穩定性。

將RC79重組細胞培養在不含篩選試劑的培養基3個月。每週以流式細胞術分析，來監測細胞的岩藻醣基化，且每月以ACQUITY UPLC® System與Glycan BEH Amide管柱，判定經純化的抗體的N-聚醣的組成，持續3個月，如上所述。LCA非結合性特性在90天的評估期期間被維持，表示 在整個研究過程中，岩藻醣基化途徑被抑制及/或降低(第2圖)。

此外，在72天的期間，評估在5個穩定的RC79F83M細胞株(R4-R8)中所產生之抗-CD20抗體的去岩藻醣基化程度。如表6所示，所有RC79F83M細胞株在72天的研究中，皆產生高度去岩藻醣基化抗體。

此研究的這些結果證明，藉由本發明方法製備的表現經修飾的酵素之重組細胞株為穩定的且長時間產生高度去岩藻醣基化的抗體。

【實施例3】 去岩藻醣基化抗體的ADCC活性

為了評估實施例2所獲得之經純化的抗-CD20抗體的體外細胞毒性，依照下述方法測量ADCC活性。

1.效應細胞溶液的製備

將自健康捐贈者的人類週邊血液(100mL)加至含有肝素鈉的VACUTAINER®試管。將全血樣本與RPMI 1640無血清(SF)培養基以1：1稀釋並輕輕混合。使用Ficoll-Paque PLUS，藉由緩慢地將24mL經稀釋的血液添加到Ficoll-Paque，並在25℃下以400 x g離心32分鐘，以分離單核細胞。將血沉棕黃層(buffy coat)充分地分配到兩個含有20mL RPMI 1640培養基的50mL離心管中，然後混合2次。接著，將混合物在25℃下，以1,200rpm離心12分鐘，獲得上清液。將RPMI 1640 SF培養基(13mL)添加至上清液，以重新懸浮PBMC細胞。將細胞在25℃下，以1,200rpm離心12分鐘，獲得上清液。將RPMI培養基(10mL)加至上清液中，以重新懸浮PBMC細胞。將充足體積的PBMC細胞懸浮液添加至75T燒瓶，且每個燒瓶約15mL的細胞，其最終細胞密度為1.5 x 10⁶細胞/mL。將IL-2(2.5μg/mL)以最終濃度為3ng/mL 加到所有燒瓶中。將PBMC細胞培養於37℃，5% CO₂的培養箱中18小時。收集經IL-2所刺激的PBMC細胞，並在25℃下，以1,200rpm離心12分鐘，然後丟棄上清液。加入PBS(10mL)，並與細胞混合。將細胞在25℃下以1,200rpm離心12分鐘，以去除上清液。將細胞以RPMI AM重新懸浮，且將最終濃度調整為2×10⁷細胞/mL。

2.目標細胞溶液的製備

將來自75T燒瓶的細胞懸浮液以1,000rpm離心5分鐘，去除上清液，然後以10mL 1X PBS清洗。將經清洗的細胞以1,200rpm離心5分鐘，去除上清液。以RPMI分析培養基，將細胞重新懸浮，以製備5 x 10⁵細胞/mL的目標細胞溶液。將目標細胞溶液(40μL的5 x 10⁵細胞/mL)加至V底的96孔細胞培養盤的孔洞中。接著，分別將20μL的經製備的市售RITUXAN®溶液(MABTHERA®)(25-0.0025μg/mL)(陽性對照組)、去岩藻醣基化抗體(R1細胞株)溶液(25-0.0025μg/mL)、或RPMI分析培養基(陰性對照組)加至孔洞中，且與目標細胞溶液混合。將V底的96孔細胞培養盤培養於37℃，5% CO₂的培養箱中30至60分鐘。

3.ADCC活性分析

將效應細胞溶液(40μL的8 x 10⁵效應細胞/孔洞)或40μL的RPMI分析培養基加至盤中，以與目標細胞溶液反應。將盤子以300 x g離心4分鐘。將盤子於37℃，5% CO₂反應4小時。在收集上清液前，將CYTOTOX 96®的裂解溶液(10μL)添加至Tmax與BlkV組的盤中，反應1小時。將V底的96孔細胞培養盤以300 x g離心4分鐘，且將50μL的上清液從96孔細胞培養盤移至平底分析盤的孔洞中。

將乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)(2μL)加至10mL之LDH陽性對照稀釋劑中，以製備LDH陽性對照溶液。將製備的LDH陽性對照組溶液(50μL)添加至96孔平底分析盤的孔洞中。

將LDH重建基質混合物(50μL)添加至分析盤的每個測試孔洞。將盤子覆蓋，並於室溫下於黑暗中培養30分鐘。將終止溶液(50μL)添加至盤子之每個測試孔洞。在加入終止溶液後，立即記錄波長490nm的吸光值。使用各組(S、PBMC、T、E和Tmax)空白移除吸光值，以下列算式計算ADCC活性。

其中S為樣本(目標細胞+PBMC+抗-CD20抗體)的LDH釋放的吸光值；PBMC為目標細胞及PBMC的LDH釋放的吸光值；E為PBMC的LDH釋放的吸光值；T為目標細胞的自發性LDH釋放的吸光值；且Tmax為目標細胞的最大LDH釋放的吸光值。

相較於市售RITUXAN®(MABTHERA®)，去岩藻醣基化抗-CD20抗體(R1細胞株)在來自捐贈者1(第3a圖)及捐贈者2(第3b圖)兩者的PBMC細胞中誘導顯著地更強且更高的ADCC反應。

如表7所示，來自RC79F83MR1細胞株之去岩藻醣基化抗-CD20抗體的EC₅₀顯著低於市售RITUXAN®，其為岩藻醣基化抗-CD20抗體。特別是，去岩藻醣基化抗-CD20抗體(R1細胞株)在來自捐贈者1和2之PBMC細胞中，分別具有為1.7ng/mL與4.6ng/mL的EC₅₀。相較之下，岩藻 醣基化抗-CD20抗體(MABTHERA®)在來自捐贈者1和2之PBMC細胞中分別具有18.2ng/mL與35.0ng/mL的EC₅₀。

此研究的這些結果證明去岩藻醣基化抗-CD20抗體(R1細胞株)展現的ADCC活性為岩藻醣基化抗-CD20抗體(MABTHERA®)的7.68至10.7倍。

【實施例4】 去岩藻醣基化抗體的結合親和性

使用偶聯至具有胺偶聯套組之BIACORE®CM5晶片的抗-組胺酸(抗-His)抗體和BIACORE®X100控制軟體的固定精靈(immobilization wizard)，評估岩藻醣基化及去岩藻醣基化抗-CD20抗體對於His標記之FcγRIIIa重組蛋白的結合親和性。

以10μL/分鐘的速率，將His標記之FcγRIIIa重組蛋白(1μg/mL)，注入至抗-His抗體固定之CM5晶片上，持續20秒。

將來自細胞株1的去岩藻醣基化抗-CD20抗體(5、10、20、40及80nM)、市售岩藻醣基化抗-CD20抗體RITUXAN®(MABTHERA®)(20、40、80、160及320nM)和市售去岩藻醣基化抗-CD20抗體GAZYVA®(obinutuzumab)(5、10、20、40或80nM)分別以30μL/分鐘的流速注射通過晶片，持續3分鐘。電泳緩衝液以30μL/分鐘的流速流經晶片5分鐘。將甘胺酸、pH 1.5(10mM)以30μL/分鐘的流速注射至晶片60秒。

利用BIACORE® X100評估軟體，來分析各循環的應感圖譜，以獲得平衡解離常數(K_D)、結合速率常數(Ka)和解離速率常數(Kd)的 值。每個循環的應感圖譜以1：1 Langmuir結合模型適配。若Chi²值低於1/10X Rmax值，則適配模型適當且動力學的結合參數是可信的。

第4a至4c圖顯示經測試之三種抗體的典型SPR應感圖譜。典型的SPR應感圖譜顯示，此分析所使用的條件(例如，結合時間、解離時間和抗體濃度範圍)是適當的。此外，三種抗體之Chi²值低於1/10X Rmax值，表示1：1 Langmuir模型適合作為所有三種抗體的應感圖譜適配。

如表8所示，去岩藻醣基化抗-CD20抗體(R1細胞株)對FcγRIIIa的結合親和性比MABTHERA®強10倍(R1細胞株的K_D=13.0nM，MABTHERA®=151.5nM)。此外，去岩藻醣基化抗-CD20抗體(R1細胞株)對FcγRIIIa的結合親和性比GAZYVA®強3倍(R1細胞株的K_D=13.0nM，GAZYVA®=39.9nM)。

此研究的這些結果證實，根據本發明製備的去岩藻醣基化抗-CD20抗體(R1細胞株)具有比市售岩藻醣基化抗-CD20抗體RITUXAN®(MABTHERA®)及市售去岩藻醣基化抗-CD20抗體(GAZYVA®)更強的FcγRIIIa結合親和性。

【實施例5】 去岩藻醣基化抗體的CDC活性

評估以本發明方法所產生之去岩藻醣基化抗體的CDC活性。

以RPMI培養基培養Daudi細胞，且當細胞密度達到1×10⁶細胞/mL時，進行繼代培養(繼代培養密度：2-3 x 10⁵細胞/mL)。收集Daudi細胞，並以300rpm離心5分鐘。以RPMI培養基重新懸浮細胞，以製備濃度 為1 x 10⁵細胞/mL的細胞懸浮液。在重新懸浮後，將100μL的細胞懸浮液或100μL的RPMI培養基種至白色96孔盤的孔洞中。

以120μg/mL至0.234μg/mL的濃度，將市售可得RITUXAN®(MABTHERA®)與去岩藻醣基化抗-CD20抗體(R1細胞株)製備於生理食鹽水中。接著，將濃度為120μg/mL至0.234μg/mL之25μL的RITUXAN®(MABTHERA®)或去岩藻醣基化抗-CD20抗體(R1細胞株)添加至含有Daudi細胞或RPMI培養基的白色96孔盤的孔洞中。將CELLTITER-GLO®試劑(20μL)加至每個孔洞中，接著混合。將盤置於微量盤震盪器上，以750rpm震盪2分鐘，接著在黑暗中於室溫培養10分鐘。藉由插有高靈敏度螢光盒的多模式讀取器，來偵測發光強度(積分時間：1秒)，以計算抗-CD20抗體的EC₅₀值及抗體的相關CDC活性。

第5圖顯示去岩藻醣基化抗-CD20抗體(R1細胞株)與RITUXAN®之CDC活性的比較。去岩藻醣基化抗-CD20抗體(R1細胞株)的EC₅₀值為0.682μg/mL，其高於RITUXAN®的EC₅₀值(EC₅₀=0.582μg/mL)。

GAZYVA®是一種市售去岩藻醣基化抗-CD20抗體，已顯示能誘導ADCC活性，但抑制CDC活性(E.Mössener et al.(2010)；C.Ferrara et al.(2011))。從其它研究獲得的結果顯示為了達到有效率的癌症治療，應該提高GAZYVA®的量。相較之下，本實施例及實施例5的結果證明，藉由本發明方法產生的去岩藻醣基化抗-CD20抗體誘導ADCC活性，並維持類似於其岩藻醣基化抗體的CDC活性。因此，比起GAZYVA®，本發明的去岩藻醣基化抗-CD20抗體表現更佳。

【實施例6】 去岩藻醣基化抗體在動物模型中的功效

在此實施例中，使用B細胞淋巴瘤皮下異種移植模型，來證明本發明的去岩藻醣基化抗體的抗腫瘤功效。SU-DHL-4為B細胞淋巴瘤細胞株，其在細胞膜上表現大量的CD20，且可成長並皮下形成固態腫瘤。因此，開發SCID/Beige小鼠中的異種移植模型，以比較去岩藻醣基化抗體(R1細胞株)與市售可得RITUXAN®(MABTHERA®)的抗腫瘤功效。

以RPMI培養基(CM)，將SU-DHL-4細胞培養於燒瓶中。當細胞濃度達0.8-1.0 x 10⁶細胞/mL時，收集細胞懸浮液並以300g離心5分鐘，以去除上清液。以含有一些條件培養基的新培養基(新鮮CM：條件CM=9：1)，將細胞重新懸浮。細胞以1：2至1：10的比例(接種的細胞數量：總獲得細胞數量)繼代培養，且細胞濃度為至少1 x 10⁵細胞/mL。將培養盤培養於37℃。SU-DHL-4細胞培養於5個150T的燒瓶。當細胞濃度到達0.8至1.0 x 10⁶細胞/mL時，將細胞懸浮液收集至50mL試管，之後以1,200rpm離心5分鐘，以移除上清液。使用無血清RPMI培養基，將細胞濃度調整至1 x 10⁸細胞/mL。在冰上，使用具18G針頭之預冷針筒，於50mL試管中混合細胞懸浮液與等體積的MATRIGEL®。最終細胞濃度為5 x 10⁷細胞/mL。使用具23G*1”針頭的預冷1mL針筒，將5 x 10⁷細胞/mL的Matrigel-SU-DHL-4細胞混合物(100uL)皮下注射至每隻小鼠(SCID/Beige小鼠)背部區域的右側。總接種細胞數量為5 x 10⁶細胞。每3或4天使用卡尺測量每隻小鼠的腫瘤體積，且以等式：V=0.5 x ab²計算，其中a與b分別代表腫瘤的長度及寬度。

當腫瘤體積達約200mm³(198.25±55.53mm³)時，其在接種腫瘤後約20天發生，將小鼠分成三組，每組5隻，之後以食鹽水(載體)， 市售RITUXAN®(MABTHERA)或無岩藻醣基化抗-CD20抗體(R1細胞株)治療。小鼠每週注射0.2mL的0.1mg/mL抗體，共3週。每週兩次，以電子秤和數位卡尺測量所有小鼠的體重與腫瘤大小。於治療期結束時，將小鼠犧牲，取出腫瘤組織，並秤重。接著，使用10%福爾馬林緩衝液，於室溫下固定腫瘤組織，供後續試驗。

如第6圖所示，去岩藻醣基化抗-CD20抗體(R1細胞株)顯示比RITUXAN®顯著更強的抗-腫瘤功效。在載體組與去岩藻醣基化抗-CD20抗體(R1細胞株)治療組之間，腫瘤體積具有統計上的顯著差異(P<0.001，以學生t檢定)。相對地，相較於僅載體組，RITUXAN®在腫瘤體積上不具有統計上顯著差異。在1mg/kg劑量下，去岩藻醣基化抗-CD20抗體(R1細胞株)比起RITUXAN®更有效地抑制腫瘤生長(R1細胞株=468±148mm³；RITUXAN®=1407±241mm³)，如表9中所示。去岩藻醣基化抗-CD20抗體(R1細胞株)與RITUXAN®組之間在腫瘤體積上具有統計上顯著差異(P<0.001)。

去岩藻醣基化抗-CD20抗體(R1細胞株)治療組的腫瘤重量顯著小於僅載體組(P<0.001)的腫瘤重量，如第7圖中所示。然而，在相同劑量下，相較於載體組，RITUXAN®在腫瘤重量上並未顯示統計上顯著差異。因此，相較於RITUXAN®組，在腫瘤重量方面，去岩藻醣基化抗-CD20抗體(R1細胞株)顯著降低(R1細胞株=0.27±0.15g；RITUXAN®=0.62±0.09g，P<0.01)，如表9所示。去岩藻醣基化抗-CD20抗體(R1細胞株)比起RITUXAN®更有效地抑制腫瘤生長，其亦可對應於腫瘤體積的結果。

在治療期間，所有組的小鼠體重逐漸增加，如第8圖所示。

這些研究的結果顯示去岩藻醣基化抗-CD20抗體(R1細胞株)是安全的。

<110> 聯亞藥業 聯合生物製藥 彭文君 陳惠蓉

<120> 去岩藻醣基化抗體及表現此抗體的細胞株

<130> 2018.XX.XX

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1728

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 1

<210> 2

<211> 575

<212> PRT

<213> 人類

<400> 2

<210> 3

<211> 1728

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> F83M經修飾之酵素的核酸序列，野生型FUT8基因第1093-1095、1225-1227與 1357-1359位置被改變

<400> 3

<210> 4

<211> 575

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F83M經修飾之酵素的胺基酸序列，野生型FUT8蛋白第365、409與453位置的 殘基被改變

<400> 4

<210> 5

<211> 1728

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> F8M1經修飾之酵素的核酸序列，野生型FUT8基因第1105-1107位置被改變

<400> 5

<210> 6

<211> 575

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F8M1經修飾之酵素的胺基酸序列，野生型FUT8蛋白第369位置的殘基被改變

<400> 6

<210> 7

<211> 1728

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> F8M2經修飾之酵素的核酸序列，野生型FUT8基因第1225-1227位置被改變

<400> 7

<210> 8

<211> 575

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F8M2經修飾之酵素的胺基酸序列，野生型FUT8蛋白第409位置的殘基被改變

<400> 8

<210> 9

<211> 1728

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> F8M3經修飾之酵素的核酸序列，野生型FUT8基因第1405-1407位置被改變

<400> 9

<210> 10

<211> 575

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F8M3經修飾之酵素的胺基酸序列，野生型FUT8蛋白第469位置的殘基被改變

<400> 10

<210> 11

<211> 1665

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> F8D1經修飾之酵素的核酸序列，野生型FUT8基因第1087-1149位置被刪除

<400> 11

<210> 12

<211> 548

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F8D1經修飾之酵素的胺基酸序列，野生型FUT8蛋白第365-386位置的殘基被刪 除

<400> 12

<210> 13

<211> 1119

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 13

<210> 14

<211> 372

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 14

<210> 15

<211> 1119

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GMD4M經修飾之酵素的核酸序列，野生型GMD基因第463-465、469-471、535-537 與547-549位置被改變

<400> 15

<210> 16

<211> 372

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GMD4M經修飾之酵素的胺基酸序列，野生型GMD基因第155、157、179與183 位置的殘基被改變

<400> 16

<210> 17

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> F8D1突變基因中被刪除的核酸序列

<400> 17

Claims (12)

1. 一種具低岩藻醣基化的重組細胞，包括一編碼岩藻醣基化途徑中一經修飾之酵素的核酸序列，其中該經修飾之酵素源自於GDP-甘露醣4,6-脫水酶(GDP-mannose 4,6-dehydratase，GMD)或岩藻醣轉移酶(fucosyltransferase，FUT)，該經修飾之酵素的核酸序列擇自於由SEQ ID NOs：3、5、7、9、11及15組成之群組，透過將該經修飾之酵素引入該重組細胞中而降低或抑制該經修飾之酵素所源自的野生型酵素的活性。
2. 如申請專利範圍第1項所述之重組細胞，其中該經修飾之酵素源自於岩藻醣轉移酶(FUT)。
3. 如申請專利範圍第1項所述之重組細胞，其中該經修飾之酵素源自於α-1,6-岩藻醣轉移酶(FUT8)。
4. 如申請專利範圍第1項所述之重組細胞，其中該經修飾之酵素具有一胺基酸序列，其擇自於下列所組成之群組：SEQ ID NOs：4、6、8、10、12及16。
5. 如申請專利範圍第1項所述之重組細胞，其中該經修飾之酵素降低或抑制該細胞中的岩藻醣基化。
6. 如申請專利範圍第1項所述之重組細胞，其中在該細胞中所產生之蛋白少於10%為岩藻醣基化。
7. 如申請專利範圍第1項所述之重組細胞，更包括一編碼一抗體的核酸。
8. 如申請專利範圍第7項所述之重組細胞，其中該於該細胞中表現的抗體為一去岩藻醣基化抗體。
9. 一種岩藻醣基化途徑中的一經修飾之酵素用於產生去岩藻醣基化抗體的用途，其中該經修飾之酵素源自於GDP-甘露醣4,6-脫水酶(GMD)或岩藻醣 轉移酶(FUT)，且該經修飾之酵素的核酸序列擇自於由SEQ ID NOs：3、5、7、9、11及15組成之群組，透過將該經修飾之酵素引入一宿主細胞中而降低或抑制該經修飾之酵素所源自的野生型酵素的活性，進而使該宿主細胞成為一具低岩藻醣基化的重組細胞。
10. 如申請專利範圍第9項所述之用途，其中該去岩藻醣基化抗體至少90%去岩藻醣基化。
11. 如申請專利範圍第9項所述之用途，其中該去岩藻醣基化抗體，相較於其岩藻醣基化對應物，具有增強的抗體依賴性細胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)活性。
12. 如申請專利範圍第9項所述之用途，其中，相較於其岩藻醣基化對應物，該去岩藻醣基化抗體的補體依賴性細胞毒性(complement dependent cytotoxicity，CDC)未被降低、或未被抑制。

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