MX2012003404A - Procedimiento para producir moleculas que contienen estructuras de glicano especializadas. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a células para producir una molécula que carece de fucosa, que tienen una cantidad reducida de fucosa, o que tienen otros azúcares atípicos en sus porciones glico. También se refiere a métodos para producir una molécula que carece de fucosa, que tiene una cantidad reducida de fucosa, o que tienen ,otros azúcares atípicos en sus porciones glico usando dichas células y a moléculas obtenibles por dichos métodos. La presente invención además se refiere a moléculas que tienen un patrón de glicosilación artificial.

Description

PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR MOLÉCULAS QUE CONTIENEN ESTRUCTURAS DE GLICANO ESPECIALIZADAS La presente invención se refiere a células para producir una molécula que carece de fucosa, que tiene una cantidad reducida de fucosa, o que tiene otros azúcares atipicos sobre sus porciones glico. También se refiere a métodos para producir una molécula que carece de fucosa, que tiene una cantidad reducida de fucosa, o que tiene otros azúcares atipicos sobre sus porciones glico usando dichas células y a moléculas obtenibles por dichos métodos. La presente invención además se refiere a moléculas que tienen un patrón de glicosilación artificial.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las moléculas glicosiladas terapéuticas diseñadas para usarse en humanos deben tener patrones de glicosilación complejos similares a aquellos encontrados en los humanos. Por lo tanto, las células animales generalmente se usan para producir moléculas glicosiladas terapéuticas, tales como proteínas, o lípidos, en donde es deseable que las moléculas glicosiladas tienen un patrón de glicosilación complejo, similar al humano. La estructura y complejidad de glicanos afecta severamente la función in vivo de la biomolécula por modulación de la vida media, unión a receptor, inducción o supresión de reacciones inmunológicas .

Las cadenas de azúcar de glicolipidos son complejas y pueden contener una cantidad significativa de fucosa (PNAS 1985; 82: 3045-3049). Las cadenas de azúcar de glicoproteinas se dividen empíricamente en dos tipos, a saber cadenas de azúcar que se unen a asparagina (cadena de azúcar enlazada a N-glicósido) y cadenas' de azúcar que se unen a otro aminoácido tal como serina, treonina (cadena de azúcar enlazada a O-glicósido) , con base en la forma de unión a la porción de proteína.

Las cadenas de azúcar enlazadas a N-glicósido tienen varias estructuras (Biochemical Experimentation Method 23 - Method 'for Studying Glycoproteína Sugar Chain (Gakujutsu Shuppan Center) , editado por Reiko Takahashi (1989)), pero se sabe que tienen una estructura de núcleo común básica. El término .cadena de azúcar que se une a asparagina se llama extremo reductor, y el lado opuesto se llama extremo no reductor. La cadena de azúcar enlazada a N-glicósido incluye un tipo, con alto contenido de mañosa en el cual la mañosa por sí sola se une al extremo no reductor de la estructura del núcleo; un tipo complejo en el cual el lado extremo no reductor del núcleo de' trimanosa típicamente tiene por lo menos una galactosa-N-acetilglucosamina (de aquí en adelante referido como Gal-GlcNAc) unido a cada uno de . los dos brazos de mañosa (1,3 y 1,6) . El lado del extremo no reductor de Gal-GlcNAc puede contener galactosa y ácido siálico, N-acetilglucosamina de bisección o similar. En un tipo híbrido, el lado del extremo no reductor de la estructura del núcleo tiene ramas tanto del tipo con alto contenido de mañosa como del tipo complejo. En glicanos de _ fucosa de células de vertebrados se pueden unir al GlcNAc antenario por un enlace alfa 1,3 (fucosa terminal) o al GlcNAc enlazado a asparagina mediante un enlace de alfa 1,6 (fucosa 'de núcleo). Las células de insecto producen glicanos que pueden contener fucosa de núcleo 1 , 3-enlazada .

La porción oligosacárido de proteínas N-glicosiladas es inicialmente biosintetizada a partir de oligosacáridos enlazados a lípido para formar un Glc3MangGlc Ac2-pirofosforil-dolicol que después es transferido a asparagina que ocurre en la secuencia de tripéptido Asn-X-Ser o Thr, en donde X podría ser cualquier aminoácido excepto Pro, de una proteína en el retículo endoplásmico (ER) . Posteriormente, la proteína es transportada al aparato de Golgi, en donde la porción oligosacárido es además procesada en la siguiente secuencia: primero, todos los tres residuos de glucosa (GIc) son removidos por glucosidasas I y II para dar Man9GlcNAc2-proteína. La estructura de MangGlcNAc2 además puede ser procesada por la remoción de un número de residuos de mañosa (Man). Inicialmente , cuatro mañosas a-1 , 2-enlazadas son removidas para dar una Man5GlcNAc2-proteína que es después alargada mediante la adición de un residuo de N-acetilglucosamina (GlcNAc) . Esta nueva estructura, la GlcNAcMan5GlcNAc2-proteina , es el sustrato para manosidasa II que remueve las mañosas a-1,3- y a-1 , 6-enlazadas . Posteriormente, los otros azúcares, GlcNAc, galactosa, fucosa y ácido siálico, se añaden secuencialmente para dar los tipos complejos de estructuras a menudo encontradas en proteínas N-glicosiladas .

Una molécula de IgG, por ejemplo, contiene un oligosacárido N-enlazado covalentemente unido en el Asn297 conservado de cada uno de los dominios CH2 en la región Fe. Los oligosacáridos encontrados en la región Fe de IgGs en el suero son en su mayoría glicanos biantenarios del tipo complejo. Variaciones de patrones de' glicosilación de IgG incluyen la unión de ácido siálico terminal (NeuAc) , un tercer brazo de GlcNac (GlcNAc de bisección) , una galactosilación terminal (G) , y fucosilación (F) de a-1,6-enlazado a la estructura de núcleo: 2x N-Acet i Iglucosamina (GlcNAc) y 3x mañosa (Man) (GlcNAc2Man3) . ' El patrón exacto de glicosilación depende de las propiedades estructurales de subcomponentes de IgG, en particular, dominios CH2 y CH3 (Lund et al. (2000) Eur. J. Biochem. , 267: 7246-7257).

Células animales y humanas tienen fucosiltransferasas que añaden residuo de fucosa al residuo de GlcNAc en el extremo reductor de los N-glicanos en una proteina u otras glicoestructuras nacientes en glicolipidos . La fucosilación de porciones glico unidas a proteina o lipido requiere un azúcar de nucleótido, GDP-L-fucosa, como un donador y también la presencia de fucosiltransferasas particulares, que transfieren el residuo fucosilo de la molécula donadora a la aceptora (Becker y Lowe, 1999) . En células eucarióticas , la GDP-L-fucosa puede ser sintetizada mediante dos vías diferentes, ya sea mediante la más prominente vía de novo de fucosa o mediante la vía de ahorro menor (Becker y Lowe, 1999) . La via de ahorro o "vía depuradora" es una fuente menor de GDP-L-fucosa (circa 10%) que puede ser fácilmente bloqueada por omisión de fucosa libre y glicoproteínas fucosiladas del medio de cultivo. La vía de ahorro empieza a partir de fucosa extracelular que puede ser transportada hacia el compartimiento citosólico mediante los transportadores de la membrana plasmática específicos de fucosa. Alternativamente, la fucosa digerida de las glicoproteínas endocitosadas puede entrar al citosol. La L-fucosa citosólica es fosforilada por fucocinasa a fucosa-l-fosfato y después convertida por GDP-Fucosa Pirofosforilasa a GDP-L-fucosa (figura 1, panel de mano derecha) . Los experimentos con cultivos de células sugieren que la vía de ahorro hace una contribución relativamente menor a los acervos de GDP-L-fucosa citosólicos (Becker y Lowe, 1999) .

La vía de novo de fucosa más prominente empieza a partir de GDP-D-manosa y consiste de una GDP-manosa deshidratasa (GMD) y GDP-ceto-desoxi-manosa-epimerasa/GDP-ceto-desoxi-galactosa-reductasa (GMER, también conocida como Fx en humanos), ambas localizadas en el citoplasma, que en conjunto convierten la GDP-manosa a GDP-L-fucosa (figura 1, panel de mano izquierda). Posteriormente, la GDP-L-fucosa es transportada al aparato de Golgi mediante un transportador de GDP-fucosa localizado en la membrana del aparato de Golgi. Una vez que la GDP-L-fucosa ha entrado al compartimiento luminal del aparato de Golgi, las fucosiltransferasas pueden enlazar covalentemente la GDP-L-fucosa a porciones glico nacientes dentro del aparato de Golgi. En particular, la fucosiltransferasa (Fut8) transfiere el residuo de fucosa por medio de un 1,6-enlace a la posición 6 del residuo GlcNAc en el extremo reductor del N-glicano.

Se ha mostrado que la falta de fucosa en glicoproteínas tiene ventajas específicas. Por ejemplo, en anticuerpos monoclonales , inmunoglobulinas , y moléculas relacionadas, se ha mostrado que la ausencia del azúcar fucosa de núcleo del N-glicano unido a Asn297 de la porción Fe (dominio CH2) de inmunoglobulinas incrementa o altera su unión a receptores de Fe. Diferentes tipos de regiones constantes se unen a diferentes receptores de Fe. Ejemplos incluyen la unión de dominios Fe de IgGl a receptores de Fe cognados CD 16 (FcyRIII), CD32 (FcyRII-Bl y -B2), o CD64 (FcyRI), la unión de dominios Fe de IgA al receptor de Fe cognado CD89 (FcaRI), y la unión de dominios de IgE a receptores de Fe cognados FceFRl o CD23. La unión al FcyRIII que está presente sobre la superficie de una célula N es fuertemente incrementada (Shields et al. JBC 277 (30): 26733. (2002)).

Un modo de acción dominante de anticuerpos terapéuticos es citotoxicidad dependiente de anticuerpo (de aquí en adelante referida como "actividad de ADCC") . El anticuerpo que se une a una célula objetivo (una célula tumoral o una célula infectada con un patógeno) con su porción Fab es reconocida en su porción Fe por el receptor de Fe de una célula efectora, típicamente una célula NK. Una vez unida, la célula efectora libera citocinas tales como IFN-?, y gránulos citotóxicos que contienen perforina y granzimas que entran a la célula objetivo induciendo muerte celular. La afinidad de unión a FcyRIII es crítica para anticuerpos que actúan a través de ATCC. Los 'vehículos de un alelo de afinidad baja del receptor responden deficientemente a anticuerpos terapéuticos tales como Rituximab (Cartron et al. Blood 99: 754-758) .

Consecuentemente, la afinidad más alta a FcyRIII mediada por la ausencia de fucosa de núcleo sobre el glicano de Fe puede incrementar la potencia o reducir la dosis efectiva de producto bioterapéutico con implicaciones mayores para beneficio clínico y costo.

A fin de modificar la estructura de la cadena de azúcar de la glicoproteína producida, se han intentado varios métodos tales como: 1) aplicación de un inhibidor contra una enzima relacionada con la modificación de la cadena de azúcar, 2) inactivación homocigótica de un gen implicado en síntesis o transferencia de azúcar, 3) selección de un mutante, 3) introducción de un gen que codifica una enzima relacionada con la modificación de una cadena de azúcar y similares. Ejemplos específicos se describen a continuación.

Ejemplos de inhibidores contra enzimas relacionadas con la modificación de una cadena de azúcar incluyen castanoespermina y N-metil-l-desoxino irimicina que son inhibidores de glicosidasa I, bromocondulitol que es un inhibidor de glicosidasa II, 1-desoxinoj irimicina y 1,4-dioxi-1, 4-imino-D-manitol que son inhibidores de manosidasa I, swainsonina que es un inhibidor de la manosidasa II y similares. Ejemplos de un inhibidor específico para una glicosiltransferasa incluyen derivados desoxi de sustratos contra N-acetilglucosamina transferasa V (GnTV) y similares. utantes de enzimas relacionadas con la modificación de cadenas de azúcar han sido principalmente seleccionadas y obtenidas de una linea de células resistentes a lectina. Por ejemplo, mutantes de células CHO se han obtenido de una linea de células resistente a lectina usando una lectina tal como un WGA (aglutinina de germen de trigo derivado de T. vulgaris) , ConA (cocanavalina A derivada de C. ensiformis) , RIC (una toxina derivada de R. communis) , L-PHA ( leucoaglutinina derivada de P. vulgaris) , LCA (.lentil aglutinina derivada de L. culinaris) , PSA (lectina de guisante derivada de P. sativum) o similares.

Además, se han reportado varios métodos para producir anticuerpos recombinantes que carecen de fucosa. Una de las enzimas más importantes que permite la fucosilación del núcleo de porciones N-glico es , 1 , 6-fucosiltransferasa 8 (Fut8). Dicha enzima cataliza la unión de fucosa a la posición 6 de N-acetilglucosamina en el 'extremo reductor a través de un enlace a en un pentanúcleo de cadena de azúcar ligada a N-glicósido de un N-glicano de tipo complejo ( O 00/61739). Los anticuerpos con contenido de fucosa reducida también se han logrado usando una célula en la cual la expresión de genes transportadores de fucosa es artificialmente suprimida (US 20090061485) . También se ha descrito que la introducción de ARN capaz de 'suprimir la función de a-1 , 6-fucosiltransferasa conduce a la producción de moléculas de anticuerpo que carecen de fucosa (EP 1 792 987 Al) .

Muchas de las células o métodos propuestos para producir moléculas tienen un patrón de glicosilación modificado, que se puede usar para indicaciones terapéuticas, tienen desventajas significativas. Por ejemplo, el tratamiento de anticuerpos con enzimas que remueven glicosilaciones , v.gr., fucosidasas para remover residuos de fucosa, implican pasos de fabricación adicionales que son costosos, consumen tiempo y que tienen riesgos económicos y de · consistencia de fármaco potencialmente significativos. Además, el diseño de ingeniería molecular de líneas de células para inactivar enzimas claves implicadas en la síntesis de glicoproteíñas es tedioso, costoso y no siempre tiene éxito. Además, dichas líneas de células tienen la desventaja de que no permiten la producción "ajustable" de moléculas con potencia de ADCC o CDC variable para optimizar la eficacia y seguridad para un uso terapéutico. · El tratamiento de líneas de células con iARN o moléculas antisentido para disminuir el nivel de enzimas clave implicadas en la síntesis de glicoproteínas puede tener efectos no dirigidos al objetivo impredecibles , es costoso y parece ser poco práctico para la implementación a escala de fabricación .

Por lo tanto, existe la necesidad de células ventajosas novedosas y métodos para la producción de moléculas con un patrón de glicosilación modificado que tenga propiedades mejoradas para usos terapéuticos.

La presente invención provee células para la producción de moléculas que tienen un patrón de glicosilación modificado, es decir moléculas que carecen de fucosa, tienen cantidad reducida de fucosa o tienen otros azúcares atipicos en sus estructuras de glicano. También proveen métodos para la producción de moléculas que tienen un patrón de glicosilación modificado, es decir, moléculas que carecen de fucosa, tienen una cantidad reducida de fucosa o tienen otros azúcares artificiales sobre sus estructuras de glicano, usando dichas células. Dichas moléculas tienen propiedades mejoradas para usos terapéuticos, v.gr., actividad de ADCC o CDC incrementada, capacidad mejorada para inhibir eventos de señalización, capacidad incrementada para inducir apoptosis, y/o capacidad incrementada para inmunoterapia . Además, las células y métodos provistos por la presente invención permiten la producción ajustable, confiable, de bajo costo y directa de moléculas que tienen un patrón de glicosilación modificado, es decir, moléculas que carecen de fucosa, que tienen una cantidad reducida de fucosa o que tienen otros azúcares artificiales en sus estructuras de glicano. Además, la presente invención provee métodos que son adecuados para fabricar a gran escala.

En muchos casos, se ha invertido tiempo considerable y esfuerzos enormes se han hecho para generar y desarrollar líneas de células productoras efectivas que expresen el transgén de interés a niveles deseables. En casos en donde el transgén de interés es un anticuerpo terapéutico que podría beneficiarse de la función efectora de DAC incrementado, sería deseable manipular adicionalmente la línea de células productoras de tal manera que la célula productora alta sea incapaz de unir la fucosa de núcleo a las porciones N-glico o sea capaz de unir azúcares artificiales a porciones N-glico.

La presente invención provee una unidad de expresión que se puede aplicar fácilmente a células genéticamente manipuladas ya existentes en una forma que las haga incapaces de unir la fucosa a glicoestructuras nacientes de glicoproteíñas o que las haga capaces de unir otros azúcares artificiales distintos a la fucosa a glicoestructuras nacientes de glicoproteínas, v.gr., a fin de producir anticuerpos que tengan una actividad de ADCC mejorada.

Sumario de la invención En un primer aspecto, la presente invención se refiere a. una célula de vertebrado para producir una molécula, que naturalmente comprende fucosa sobre sus porciones glico, que carecen de fucosa o que tienen una cantidad reducida de fucosa en sus porciones glico que comprenden por lo menos una enzima que usa GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa como un sustrato, en donde la enzima no cataliza la reacción que convierte GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa a GDP-L-fucosa .

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un método para producir una molécula, que comprende naturalmente fucosa en sus porciones glico, que carece de fucosa o que tiene una cantidad reducida de fucosa en sus porciones glico que comprenden los pasos de: i) proveer una célula de vertebrado de conformidad con el primer aspecto, ii) aislar la molécula que es capaz de ser un sustrato para una fucosiltransferasa , preferiblemente una proteina o lipido, de la célula en i) .

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a una molécula que carece de fucosa o que tiene una cantidad reducida de fucosa en sus porciones glico obtenible por el método del segundo aspecto.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a una molécula que comprende porciones glico que contienen D-ramnosa, D-perosamina, desoxi-D-talosa , 6-desoxi-D-altrosa, 4 -ceto-3 , 6-didesoxi-D-manosa , y/o L-colitosa obtenibles por el método del segundo aspecto.

En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a una composición que comprende glicoproteinas que comprenden i) entre 70 y 95% de G0-GlcNAc, G0, Gl, y/o N-glicanos de tipo complejo G2, y ii) entre 5 y 30% de N-glicanos de tipo mañosa elevada, en donde los N-glicanos de tipo complejo son libres de fucosa o sustancialmente libres de fucosa.

En un sexto aspecto, la presente invención se refiere a una proteina o lipido que comprende porciones glico que contienen D-ramnosa, D-perosamina , desoxi-D-talosa , 6-desoxi-D-altrosa , 4-ceto-3, 6-didesoxi-D-manosa, y/o L-colitosa.

En un séptimo aspecto, la presente invención se refiere a una unidad de expresión que comprende: i) una o más secuencias de control de expresión de vertebrados, y ii) un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima que usa GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa como un sustrato, en donde la enzima no cataliza la reacción que convierte GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa a GDP-L-fucosa .

En un octavo aspecto, la presente invención se refiere a una célula eucariótica para producir una proteina, que normalmente comprende fucosa en sus porciones glico, que carecen de fucosa o que tienen una cantidad reducida de fucosa en sus porciones glico que comprenden: i) un primer polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima que usa GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa como un sustrato, y ii) un segundo polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteina, en donde la enzima no cataliza la reacción que convierte GDP-6-desoxi-D-lixo- -hexulosa a GDP-L-fucosa .

En un noveno aspecto, la presente invención se refiere a un método para producir una proteina que normalmente comprende fucosa en sus porciones glico, que carece de fucosa o que tiene una cantidad reducida de fucosa en sus porciones glico que comprenden: i) proveer una célula eucariota de conformidad con el octavo aspecto, ii) expresar la enzima codificada por el primer polinucleótido y la proteina codificada por el segundo polinucleótido en dicha célula, y iii) aislar la proteina de dicha célula.

En un décimo aspecto, la presente invención se refiere a una- proteina que carece de fucosa o que tiene una cantidad reducida de fucosa en sus porciones glico obtenibles por el método del noveno aspecto.

Descripción detallada de la invención Antes de describir con detalle más adelante la presente invención, cabe entender que esta invención no está limitada a la metodología particular, protocolos y reactivos descritos aquí ya que estos pueden variar. También cabe entender que la terminoloqía usada aquí es para el propósito de describir modalidades particulares únicamente, y no pretende limitar el alcance de la presente invención que será limitado únicamente por las reivindicaciones anexas. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que es entendido comúnmente por un experto en la técnica.

Preferiblemente, los términos usados en la presente son definidos como se describe en "Un glosario multilingüe de términos biotecnológicos : (recomendaciones de la IUPAC)", Leuenberger, H.G. , Nagel, B. y Kólbl, H. eds. (1995), Helvética Chimica Acta, CH-4010 Basel, Suiza) .

A lo largo de esta especificación y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera otra cosa, la palabra "comprenden", y variaciones tales como "comprende" y "que comprende", se entenderá que implican la inclusión de una entidad o paso establecido o grupo de entidades o pasos pero no la exclusión de cualquier otra entidad o paso o grupo de entidades o pasos..

Varios documentos se citan a lo largo del texto de esta especificación. Cada uno de los documentos citados aquí (incluyendo todas las patentes, solicitudes de patente, publicaciones científicas, especificaciones del fabricante, instrucciones, sumisiones de secuencia de número de acceso a GenBank, etc.), ya sea antes mencionados o después mencionados, se incorporan aquí por referencia en su totalidad. En la¦ presente nada debe considerarse como una admisión de que la invención no tiene derecho a anticipar dicha descripción en virtud de la invención anterior.

A continuación, se describirán los elementos de la presente invención. Estos elementos se listan con modalidades específicas, sin embargo, cabe entender que se pueden combinar de cualquier manera y en cualquier número para crear modalidades adicionales. No deben considerarse que los ejemplos variadamente descritos y modalidades preferidas limitan la presente invención únicamente a las modalidades explícitamente descritas. Se debe entender que esta descripción soporta y abarca modalidades que combinan las modalidades explícitamente descritas con cualquier número de los elementos descritos y/o preferidos. Además, cualesquiera permutaciones y combinaciones de todos los elementos descritos en esta solicitud deben considerarse descritos por la presente solicitud a menos que el contexto indique otra cosa .

El término "comprenden" o variaciones tales como "comprende" o "que comprende" de conformidad con la presente invención significa la inclusión de una entidad establecida o grupo de entidades pero no la exclusión de cualquier entidad o grupo de entidades. El término "que consiste esencialmente de" de conformidad con la presente invención significa la inclusión de una entidad establecida o grupo de entidades, mientras que excluye modificaciones de otras entidades que afectarían materialmente o, alterarían la entidad establecida. El término "que consisten de" o variaciones tales como "consiste de" de conformidad con la presente invención significa la inclusión de una entidad establecida o grupo de entidades y la exclusión de cualquier otra entidad o grupo de entidades.

En el contexto de la presente invención, el término "oligopéptido" se refiere a una cadena enlazada a péptido corta de aminoácidos, v.gr., una que es típicamente menor que aproximadamente 50 aminoácidos de longitud y muy típicamente menor de aproximadamente 30 aminoácidos de longitud.

Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente en el contexto de la presente -invención y se refieren a una cadena enlazada a péptidos larga deaminoácidos, v.gr., una que es típicamente de 50 aminoácidos de longitud o más larga que 50 aminoácidos.

El término "fragmento de polipéptido", como se usa en el contexto de la presente invención, se refiere a un polipéptido que tiene una deleción, v.gr . , una deleción amino-terminal , y/o una deleción carboxi-terminal , y/o una deleción interna comparada con un polipéptido de longitud completa .

En el contexto de la presente invención, el término "proteína de fusión" se refiere a un polipéptido que comprende un polipéptido o fragmento de polipéptido acoplado a secuencias de aminoácidos heterólogas. Las proteínas de fusión son útiles porque pueden ser consideradas como que contienen dos o más elementos funcionales deseadas de dos o más proteínas diferentes.

Los términos "anticuerpo", "inmunoglobulina", "Ig" y "molécula de Ig" se usan indistintamente en el contexto de la presente invención. El dominio CH2 de cada cadena pesada contiene un solo sitio para glicosilación N-enlazáda en un residuo de asparagina que enlaza un N-glicano a molécula de anticuerpo, usualmente en el residuo Asn-297 (Kabat et al., Secuencia de proteínas de interés inmunológico, Quinta Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publicación No. 91-3242). Incluidas dentro del alcance del término están las clases de Igs, a saber, IgG, IgA, IgE, IgM y IgD. También dentro del alcance de los términos se incluyen los subtipos de IgGs, a saber, IgGl, IgG2, IgG3 y IgG4. Los términos se usan en su sentido más amplio e incluyen anticuerpos monoclonales (que incluyen anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales , anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos multiespecificos (v.gr., anticuerpos biespecificos ) .

El término "fragmento de anticuerpo" como se usa en el contexto de la presente invención se refiere a un fragmento de un anticuerpo que contiene por lo menos la porción del dominio CH2 de la región- constante de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende un sitio de glicosilación N-enlazado del dominio CH2 y es capaz de unión especifica a un antigeno, es decir, cadenas de por lo menos una cadena VL y/o VH o parte de unión de la misma.

Los términos "de dominio Fe" y "región Fe" se refieren a una porción C-terminal de una cadena pesada de anticuerpo que' interactúa con receptores de superficie celular llamados receptores Fe y algunas proteínas del sistema de complemento. Esta propiedad permite a los anticuerpos activar el sistema inmunológico .

En el contexto de la presente invención, el término "glicoproteina" se refiere a proteínas que contienen cadenas de oligosacáridos (glicanos) covalentemente unidas a sus cadenas laterales de polipéptido. El carbohidrato es unido a la proteína en una modificación co-traduccional o post-traduccional . Este proceso es conocido como glicosilación, tal como N-glicosilación u O-glicosilación .

"N-glicosilación" significa la adición de cadenas de azúcar al nitrógeno de amida en la región lateral de la asparagina. "O-glicosilación" significa la adición de cadenas de azúcar al oxigeno del hidroxilo en la cadena lateral de hidroxilisina , hidroxiprolina , serina o treonina.

El término' "glicolipido", como se usa en el contexto de la presente invención se refiere a lipidos unidos a carbohidrato. Estos ocurren en donde una cadena de carbohidrato está asociada con fosfolipidos sobre la superficie exoplásmica de la membrana celular. Los carbohidratos se encuentran sobre la superficie exterior de todas las membranas -celulares eucarióticas . La estructura de carbohidrato del glicolipido es controlada por glicosiltransferasas que añaden los ' lipidos y glicosilhidrolasas que modifican el glicano después de la adición. Los glicolipidos también ocurren sobre la superficie de virus con envoltura que incluyen aquellos usados como vacunas vivas atenuadas.

Los términos "glicano" o "porción glico" se usan indistintamente en el contexto de la presente invención para referirse a un polisacárido u oligosacárido . El término "oligosacárido" significa un polímero de sacárido que contiene un número pequeño (típicamente tres a diez) de azúcares componentes, también conocidos como azúcares simples o monosacáridos . El término "polisacárido" significa una estructura de carbohidrato polimérica, formada de unidades repetidas (ya sea monosacáridos o disacáridos, típicamente >10) unidos entre si por enlaces glicosídicos . Los glicanos se pueden encontrar unidos a proteínas como en las glicoproteíñas o unidos a lípidos como en glicolípidos . El término abarca N-glicanos, tales como N-glicanos de tipo mañosa elevada, N-glicanos de tipo complejo o N-glicanos de tipo híbrido, O-glicanos.

En el contexto de la presente invención, los siguientes .monosacáridos se abrevian como sigue: Glucosa = Glc, Galactosa = Gal, Mañosa = Man, Fucosa = Fue o F, N-acetilgalactosamina = GalNAc, o N- acetilglucosamina = GlcNAc.

Un "N-glicano" significa un polisacárido u oligosacárido N-enlazado. Un oligosacárido N-enlazado es por ejemplo uno que es o fue unido por un residuo de N-acetilglucosamina enlazado al nitrógeno de la amida de un residuo de asparagina en una proteína. Los azúcares es encontrados en N-glicoproteínas son glucosa, galactosa, mañosa, fucosa, N-acetilgalactosamina (GalNAc) , N-acetilglucosamina (GlcNAc) y ácido siálico (v.gr., ácido N-acetil-neuramínico (NANA) ) . El procesamiento de los grupos azúcar ocurre co-traduccionalmente en el lumen del retículo endoplásmico y continúa en el aparato de Golgi para glicoproteínas N-enlazadas. Los N-glicanos tienen un núcleo de pentasacárido común de Man3GlcNAc2 ("Man" se refiere a mañosa; "Glc" se refiere a glucosa; y "NAc" se refiere a N-acetilo; GlcNAc se refiere a N-acetilglucosamina ) . N-glicanos difieren con respecto al número de ramas (antenas) que comprenden azúcares periféricos (v.gr. , GlcNAc, galactosa, fucosa y ácido siálico) que se añaden a la estructura del núcleo de Man3GlcNAc2 que también es referido como el "núcleo de trimanosa", el "núcleo de pentasacárido" o el "núcleo de paucimanosa" . N-glicanos se clasifican de conformidad con sus constituyentes ramificados (v.gr., mañosa alta, complejo o híbrido) .

Un "N-glicano de tipo mañosa alta" significa un polisacárido u oligosacárido N-enlazado que tiene cinco residuos de mañosa (Mans), o más residuos de mañosa (v.gr. Mane, Man7, o Man8 ) .

Un "N-glicano de tipo complejo" significa un polisacárido u oligosacárido N-enlazado que tiene típicamente tiene por lo menos un GlcNAc unido al brazo de 1,3 mañosa y por lo menos un GlcNAc unido al brazo 1,6 mañosa de un núcleo de "trimanosa". Los N-glicanos complejos también pueden tener residuos de galactosa ("Gal") o N-acetilgalactosamina ("GalNAc") que son opcionalmente modificados con ácido siálico o derivados (v.gr., "NANA" o "NeuAc", en donde "Neu" se refiere a ácido neuramínico y "Ac" se refiere a acetilo) . Los N-glicanos complejos también pueden tener sustituciones de intracadena que comprenden GlcNAc de "bisección" y fucosa de núcleo ("Fue") . Los N-glicanos de tipo complejo en el contexto de laa presente invención puede contener zero (GO), uno (Gl) , o dos (G2) galactosas asi como una fucosa unida a del primer GlcNAc en el extremo reductor (denotado como GOF, GIF, G2F, respectivamente) .

Un "N-glicano de tipo híbrido" significa un polisacárido u oligosacérido N-enlazado que tiene por lo menos un GlcNAc en la terminal -del brazo de 1,3 mañosa del núcleo de trimanosa y cero o más mañosas en el brazo de 1,6 mañosa del núcleo de trimanosa.

Las abreviaturas usadas en el contexto de la presente invención para describir las glicoestructuras se definen como sigue: núcleo = Man3 GlcNAc2 GO = GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 GO -GlcNAc = Estructura de GO que carece de un GlcNAc (es decir, GlcNAc Man3 GlcNAc2) Gl = Estructura de GO que contiene un residuo de galactosa adicional (es decir, Gal GlcNAc2 Man3 GlcNAc2) G2 = Estructura de GO que contiene dos residuos de galactosa adicionales (es decir, Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc2) GOF = Estructura de GO que contiene un residuo de fucosa adicional que está conectado al primer residuo GlcNAc del núcleo de pentasacárido (es decir, GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 Fue) . .

GOF-GlcNAc = Estructura de GO-GlcNAc que contiene un residuo de fucosa adicional que está conectado al primer residuo GlcNAc del núcleo de pentasacárido (es decir, GlcNAc an3 GlcNAc2 Fue) GIF = Estructura de Gl que contiene un residuo de fucosa adicional que está conectado al primer residuo GlcNAc del núcleo de pentasacárido (es decir, · Gal GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 Fue) G2F = Estructura de G2 que contiene un residuo de fucosa adicional que está conectado al primer residuo GlcNAc del núcleo de pentasacárido (es decir, Gal2 GlcNAc2 an3 GlcNAc2 Fue) Man4 = Estructura de núcleo que contiene un residuo de mañosa adicional (es decir, Man Man3 GlcNAc2) Man5 = Estructura de núcleo que contiene dos residuos de mañosa adicionales (es decir, Man2 Man3 GlcNAc2) Man6 = Estructura de núcleo que contiene tres residuos de mañosa adicionales (es- decir, Man3 Man3 GlcNAc2) Man7 = Estructúra de núcleo que contiene cuatro residuos de mañosa adicionales (es decir, Man4 Man3 Glc Ac2) Man8 = Estructura de núcleo que contiene cinco residuos de mañosa adicionales (es decir, Man5 Man3 GlcNAc2) Un "O-glicano" significa un polisacárido u oligosacárido 0-enlazado. Los glicanos O-enlazados usualmente se unen a la cadena de péptido a través de residuos de serina o treonina. La glicosilación O-enlazada es un evento de posttraducción verdadero que ocurre en el aparato de Golgi y que no requieren una secuencia de consenso y no se requiere precursor de oligosacárido para transferencia de proteina. El tipo más común de glicanos O-enlazados contienen un residuo de GalNAc inicial (o epitope Tn) , éstos son comúnmente referidos como glicanos de tipo mucina. Otros glicanos 0-enlazados incluyen glucosamina, xilosa, galactosa, fucosa o mañosa como el azúcar inicial unido a los residuos de Ser/Thr. Las glicoproteíñas O-enlazadas usualmente son proteínas grandes (> 200 kDa) que son comúnmente biantenarias con ramificación comparativamente menor que los N-glicanos.

El término "una molécula que naturalmente comprende fucosa en sus porciones glico", como se usa en el contexto de la presente invención, se refiere a cualquier compuesto que durante la producción en una célula eucariótica, preferiblemente célula de vertebrado, capaz de añadir fucosa a porciones glico, es decir, con una capacidad no alterada para añadir fucosa a porciones glico, comprende porciones glico que comprende por lo menos un residuo de fucosa. Dichas moléculas comprenden por lo menos uno o más motivos de secuencia reconocidos por una enzima de transferencia de glicano, v.gr. que comprende un residuo Asp, Ser o Thr, preferiblemente una secuencia de tripáptido Asn-X-Ser/Thr , en donde X es cualquier aminoácido excepto Pro. Ejemplos preferidos de células eucarióticas (v.gr., células de vertebrado) que producen moléculas que comprenden porciones glico con' fucosa son CHO, AGE1.HN, AGE1.C, AGE1.CR.PIX, o AGE1.CS. Preferiblemente dichos compuestos son proteínas de fusión o lípidos. Preferiblemente, las proteínas- son eucarióticas, preferiblemente vertebrados, muy preferiblemente de origen de mamífero o derivadas del mismo.

El término "una molécula que carece de fucosa en sus porciones glico", en el contexto de la presente invención, significa que en una molécula que naturalmente comprende fucosa en sus porciones glico, la cantidad no detectable de fucosa está presente. Expresado en términos de pureza, "una molécula que carece de fucosa en sus porciones glico" significa que en una molécula que naturalmente comprende fucosa en sus porciones glico es hasta 100% libre del residuo de azúcar fucosa en sus porciones glico.

El término "una molécula con una cantidad reducida de fucosa en sus porciones glico" se refiere a una molécula, en donde la cantidad de fucosa en las porciones glico es reducida del número (n) cuando se expresa en una célula capaz de añadir fucosa a porciones glico, es decir, con una capacidad no alterada para añadir fucosa a porciones glico. Por lo tanto, el estado reducido es n-x, en donde n tiene el significado indicado antes y x es un entero de 1 a (n-1) . Preferiblemente, si 'n es 2- en el estado natural es reducido a 1. De manera similar, si n es 3 en el estado natural, es preferiblemente reducido a 2 ó 1; si n es 4 en el estado natural, es preferiblemente reducido a 3, 2 ó 1; si n es 5 en el estado natural, es preferiblemente reducido a 4, 3, 2 ó 1; o si n es 6 en el estado natural, es preferiblemente reducido a 5, 4, 3, 2 ó 1.

El término "una composición de moléculas con una cantidad reducida de fucosa en sus porciones glico", se usa en el contexto de la presente invención para indicar, que las moléculas de una composición que naturalmente comprende fucosa en sus porciones glico tienen un número reducido de fucosa en sus porciones glico. Dicha comparación preferiblemente se lleva a cabo usando moléculas producidas por las lineas de células indicadas antes. Expresado en términos de reducción, significa que de un número dado de moléculas de una composición, preferiblemente de 1, 10, 100 ó 1000 pmol de moléculas de una composición, el número de residuos de fucosa es reducido entre 10% y 95%, preferiblemente aproximadamente 15%, aproximadamente 20%, aproximadamente 25%, aproximadamente 30%, aproximadamente 35%, 40%, aproximadamente 45%, ' aproximadamente 50%, aproximadamente 55%, aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 86%, aproximadamente 87%, aproximadamente 88%, aproximadamente 89%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, o aproximadamente 94%,. La reducción global se puede deber a un incremento de moléculas en la composición que carece de fucosa en sus porciones glico y/o que tiene una cantidad reducida de fucosa en sus porciones glico.

El término "una composición de moléculas que son sustancialmente libres de fucosa en sus porciones glico" se usa en el contexto de la presente invención para indicar que las moléculas de una composición, que naturalmente comprende fucosa en sus porciones glico, están esencialmente desprovistas del residuo de azúcar fucosa en sus porciones glico. Expresado en términos de pureza, el término "una composición de moléculas que son sustancialmente libres de fucosa en sus porciones glico" significa que de un número dado de moléculas de una composición, preferiblemente de 1, 10, 100 ó 1000 pmol de moléculas de una composición, por lo menos aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99%, aproximadamente 99,1%, aproximadamente 99,2%,. aproximadamente 99,3%, aproximadamente 99,4%, aproximadamente 99,5%, aproximadamente 99,6%, aproximadamente 99,7%, aproximadamente 99,8%, o por lo menos aproximadamente 99,9% de dichas moléculas son libres del residuo de azúcar fucosa en sus porciones glico.

El experto en la técnica puede determinar fácilmente de manera experimental la cantidad reducida de fucosa en las porciones glico de una molécula particular, v.gr., una molécula de anticuerpo, al (i) cultivar células de la presente invención bajo condiciones en donde la molécula de interés es producida, (ii) aislar dicha molécula a partir de las células y (iii) analizar la estructura de cadena de azúcar de dicha molécula con respecto a los residuos de fucosa unidos a sus porciones glico y calcular el valor medio de residuos de fucosa presentes en la estructura de cadena de azúcar de dicha molécula, y (iv) comparar .el resultado con el resultado de la misma molécula, v.gr., una molécula de anticuerpo, producida en células, en donde la molécula es producida con un patrón de glicosilación no reducido en fucosa. Preferiblemente, las células usadas en los dos experimentos son idénticos excepto por la diferencia de que una célula comprende por lo menos una enzima que usa GDP-6-desoxi-D-lixo-4 -hexulosa como sustrato, en donde la enzima no cataliza la reacción que convierte GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa a GDP-L-fucosa . Preferiblemente, ambas células son cultivadas bajo las condiciones de cultivo idénticas para excluir variaciones en fucosilación que se pueden deber a diferencias en condiciones de cultivo.

La 'estructura de cadena de azúcar en una molécula, v.gr., molécula de anticuerpo, simplemente puede ser analizada por el método de mapeo de cadena de azúcar bidimensional (Anal. Biochem. , 171, 73 (1988), Métodos de Experimentación Bioquímicos 23 - Métodos para Estudiar Cadenas de Azúcar de Glicoproteína (Japan Scientific Societies Press) editado por Reiko Takahashi (1989)). La estructura deducida por el método de mapeo de cadena de azúcar bidimensional se puede determinar llevando a cabo espectrometría de masa tal como MALDI ( Desorción/ Ioni zación con Láser Asistida por Matri z ) -TOF-MS de cada cadena de azúcar.

La fucosilación de moléculas, v.gr., proteínas o lípidos, que comprenden porciones glico en células eucarióticas (v.gr., células de vertebrado) requiere un azúcar de nucleotido, GDP-L-fucosa, como un donador y también la presencia de fucosiltransferasas particulares, que transfieren el residuo fucosilo de la molécula donadora a la aceptora . En células eucarióticas (v.gr. células de vertebrado) , la GDP-L-fucosa puede ser sintetizada por dos vías diferentes, ya sea por la vía de novo de fucosa más prominente o por la vía de ahorro menos prominente.

Los inventores de la presente invención han encontrado que la presencia de una enzima (enzima de desviación) en una célula eucariótica (v.gr., una célula de vertebrado) que utiliza de manera efectiva GDP-6-desoxi-D-lixo- -hexulosa como sustrato, pero que no cataliza la reacción que convierte GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa a GDP-L-fucosa, conduce a la producción de una molécula, v.gr., proteína o lípido, que carece de fucosa o con una cantidad reducida de fucosa en sus porciones glico. El término "GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa" es sinónimo del término "GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa" . Ambos términos se usan indistintamente en la presente.

Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención provee una' célula de vertebrado (modificada) para producir una molécula, que naturalmente comprende fucosa en sus porciones glico, que carece de fucosa o con una cantidad reducida de fucosa en sus porciones glico que comprende por lo menos una enzima que usa GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa como sustrato, en donde la enzima no cataliza la reacción que convierte GDP-6-desoxi"-D-lixo-4- exulosa a GDP-L-fucosa .

La enzima presente en la célula de vertebrado del primer aspecto de la invención puede ser cualquier enzima que use GDP-6-desoxi-D-lixo-4 -hexulosa como sustrato con la condición de que dicha enzima no cataliza la reacción que convierte GDP-6-desoxi-D-lixo-4 -hexulosa a GDP-L-fucosa . Más bien, dicha enzima convierte GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa a un producto que ya no puede ser utilizado para síntesis de GDP-L-fucosa en una célula de vertebrado.

.La enzima que está comprendida en la célula de vertebrado del primer aspecto de la presente invención es una enzima que normalmente no está presente en la célula de vertebrado, es decir, una enzima heteróloga o artificial, v.gr., una enzima de un organismo de otro reino, tal como de procariotas, preferiblemente bacterias. Alternativamente dicha enzima también puede ser una enzima que normalmente está presente en una célula de vertebrado, pero que no convierte el sustrato GDP- 6-desoxi-D-lixo- -hexulosa a GDP-L-fucosa sino más bien a un producto diferente, v.gr., debido a la presencia de mutaciones.

La enzima, que está presente en la célula de vertebrado del primer aspecto de la presente invención, ha sido introducida en la célula de vertebrado, por ejemplo, mediante microinyección de proteína, electroporación de proteína o lipofección de proteína. También es posible introducir la secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima, preferiblemente integrada en un vector de expresión, en la célula de vertebrado, por ejemplo mediante microinyección de ADN, electroporación de ADN o lipofección de ADN, que es subsecuentemente transcrita y traducida en la proteína respectiva en la célula de vertebrado. El experto en la técnica está bien informado acerca de las técnicas de biología molecular, tales como microinyección, electroporación o lipofección, para introducir proteínas o secuencia de ácido nucleicos que codifican proteínas en una célula de vertebrado y sabe cómo realizar estas técnicas.

Se prefiere que dos o más enzimas, es decir, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7, que usan GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa como sustrato y que no catalizan la conversión de GDP-6-desoxi-D-lixo-4 -hexulosa a GDP-L-fucosa están presentes en una célula de vertebrado para bloquear de manera efectiva la vía de novo de fucosa en dicha célula.

Preferiblemente, la enzima que usa GDP-6-desoxi-D-lixo- -hexulosa como sustrato se selecciona del grupo que consiste de GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa reductasa (sinónimo de GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa reductasa, abreviada RMD) , GDP-perosamina sintetasa (Per) , GDP-6-deso'xi-D-talose sintetasa (GTS) , GDP-Fucosa sintetasa Cysl09Ser-mutante de (GFS-Cysl09Ser ) , GDP-4-ceto-6-desoximanosa-3-deshidratasa (ColD) , preferiblemente GDP-4 -ceto-6-desoximanosa-3-deshidratasa (ColD) en combinación con GDP-L-colitosa sintasa (ColC) , y variantes de las mismas, preferiblemente la enzima es de bacterias o derivada de dicha enzima bacteriana. Muy preferiblemente, la enzima que usa GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa como sustrato es una GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa reductasa (RMD) , GDP-Fucosa sintetasa Cysl09Ser-mutante de (GFS-Cysl09Ser ) , y/o una GDP-perosamina sintetasa (Per) .

GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa reductasa (RMD) reduce el sustrato GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa a GDP-D-ramnosa. GDP-D-ramnosa es un donador de azúcar de nucleótido para D-ramnosilación en bacterias y no ocurre en vertebrados. Las células . de vertebrado también carecen de ramnosiltransferasas especificas por lo que la GDP-D-ramnosa no puede ser incorporada en glicoestructuras nacientes de glicoproteinas o glicolipidos dentro de las células de vertebrado .

La enzima GDP-6-desoxi-D-talosa sintetasa (GTS) reduce el sustrato GDP -6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa a GDP-desoxi-D-talosa . GDP-desoxi-D-talosa es un donador de azúcar de nucleótido para 6-desoxi-D-talosilación en bacterias y no ocurre en vertebrados. Las células de vertebrado también carecen de desoxitalosiltransferasas especificas por lo que GDP-desoxi-D-talosa no puede ser incorporada en glicoestructuras nacientes dentro de las células de vertebrado.

Además, la enzima GDP-perosamina sinte-tasa (Per) reduce y transamina el sustrato GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa a GDP-D-perosamina. GDP-D-perosamina es un donador de azúcar de nucleótido para perosaminilación en bacterias, v.gr. , E. coli. La GDP-D-perosamina normalmente no está presente en células de vertebrado. Las células de vertebrado también carecen de perosaminiltransferasas especificas por lo que la GDP-D-perosamina no puede ser unida a glicoestructuras nacientes dentro de las células de vertebrado.

Por lo tanto, las enzimas heterólogas GTS y/o Per (i) agotan el sustrato GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa en la célula de vertebrado, y (ii) conducen a la síntesis de productos artificiales (es decir, GDP-desoxi-D-talosa en el caso de GTS y GDP-D-perosamina en el caso de Per) que ya no puede ser utilizada para síntesis de GDP-L-fucosa . Por consiguiente, las moléculas, que normalmente comprenden fucosa en sus porciones glico, producidas en la célula de vertebrado que comprende GTS y/o Per, que carece de fucosa o con una cantidad reducida de fucosa en sus porciones glico.

La enzima GDP-4 -ceto-6-desoximanosa-3-deshidratasa (ColD) usa el sustrato GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa y lo convierte a GDP-4-ceto-3, 6-didesoxi-D-manosa . Puesto que el intermediario GDP-4-ceto-3, 6-didesoxi-D-manosa puede ser inestable en células de vertebrado, ColD es preferiblemente usado en combinación con la enzima GDP-L-colitosa sintasa (ColC) . La enzima ColC pertenece a la clase de GDP-4-deshidro-6-desoxi-D-manosa epimerasas/reductasas . La enzima ColC además convierte el intermediario GDP-4-ceto-3, 6-didesoxi-D-manosa al producto final estable GDP-L-colitosa. Ambos productos pueden no ser incorporados en glicoestructuras nacientes dentro de células de vertebrado ya que dichas células carecen de la glicosiltransferasa respectiva para transferir la GDP-4-ceto-3, 6-didesoxi-D-manosa y/o GDP-L-colitosa a las porciones glico de moléculas presentes en dichas células. Por lo tanto, se prefiere que ColD esté presente en la célula de vertebrado en combinación con ColC.

La enzima GDP-Fucosa sintetasa (GFS) (también conocida como GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa epimerase/ reductasa, GMER) convierte la GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa a GDP-L-fucosa en células de vertebrado. La reacción de GFS implica epimerizaciones tanto en C-3" como en C-5" seguido por unan reducción dependiente de NADPH del carbonilo en C-4. Un mutante de sitio activo, preferiblemente GFS-Cysl09Ser , se usa en la presente, invención, que convierte GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa en un producto diferente de GDP-L-fucosa, a saber GDP-6-desoxi-D-altrosa (véase Lau S.T.B., Tanner, M.E. 2008. Mecanismo y residuos de sitio activo de GDP-Fucosa Sintasa, Journal of the American Chemical Society, Vol. 130, No. 51, pp. 17593-17602).

Preferiblemente, dos o más enzimas, es decir, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7, seleccionadas del grupo que consiste de GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa reductasa (R D) , GDP-perosamina sintetasa (Per), GDP-6-desoxi-D-talosa sintetasa (GTS), GDP-Fucosa sintetasa Cysl09Ser-mutante de (GFS-Cysl09Ser) , GDP-4-ceto-6-desoximanosa-3-deshidratasa (ColD) , preferiblemente GDP-4 -ceto-6-desoximanosa-3-deshidratasa (ColD) en combinación con GDP-L-colitosa sintasa (ColC) , y variantes de las mismas están presentes en la célula de vertebrado.

Una variante de enzima RMD, Per, GTS, GFS-Cysl09Ser, ColD o ColC que es preferida en la presente invención difiere de la enzima RMD, Per, GTS, GFS-Cysl 09Ser, ColD o ColC de la cual se deriva hasta por 150 aminoácidos (es decir, hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140 ó 150) cambia en la secuencia de aminoácidos (es decir, intercambios, inserciones, deleciones, N-terminal truncaciones y/o C-terminal truncaciones) . Los intercambios de aminoácidos pueden ser conservativos o no conservativos. Una variante de enzima RMD, Per, GTS, GFS-Cysl09Ser, ColD o ColC, que es preferida en la presente invención alternativamente o adicionalmente puede ser caracterizada por un cierto grado de identidad de secuencia a la enzima RMD, Per, GTS, GFS-Cysl09Ser, ColD, o ColC de la cual se deriva. Por lo tanto, las variantes de enzima RMD, Per, GTS , GFS-Cysl09Ser, ColD o ColC . enzima, que son preferidas en la presente invención tienen una identidad de secuencia de por lo menos 80%, por lo menos 81%, por lo menos 82%, por lo menos 83%, por lo menos 84%, por lo menos 85%, por lo menos 86%, por lo menos 87%, por lo menos 88%, por lo menos 89%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos .98%, o por lo menos 99% a la enzima RMD, Per, GTS, GFS-Cysl09Ser , ColD o ColC de referencia respectiva. Preferiblemente, la identidad de secuencia es sobre un tramo continuo de 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300 o más aminoácidos, preferiblemente sobre la longitud completa de la enzima RMD, Per, GTS, GFS-Cysl09Ser , ColD o ColC de referencia respectiva. Es particularmente preferido que la identidad de secuencia sea por lo menos 80% sobre la longitud completa, sea por lo menos 85% sobre la longitud completa, sea por lo menos 90% sobre la longitud completa, sea por lo menos 95% sobre la longitud completa, sea por lo menos' 98%) sobre la longitud completa, o sea por lo menos 99.5% sobre la longitud completa de la enzima RMD, Per, GTS, GFS-Cysl09Ser, ColD o ColC de referencia respectiva. También es particularmente preferido que la identidad de secuencia sea por lo menos 80% sobre por lo menos 200 o 250 aminoácidos, sea por lo menos 85%) sobre por lo menos 200 o 250 aminoácidos, sea por lo menos 90% sobre por lo menos 200 o 250 aminoácidos, sea por lo menos 95% sobre por lo menos 200 o 250 aminoácidos, sea por lo menos 98% sobre por lo menos 200 o 250 aminoácidos, o sea por lo menos 99.5% sobre por lo menos 200 o 250 aminoácidos de la enzima RMD, Per, GTS, GFS-Cysl09Ser, ColD o ColC de referencia respectiva.

Un fragmento (o variante de deleción) de la enzima RMD, Per, GTS, GFS-Cysl09Ser, ColD o ColC preferiblemente tiene una deleción de hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60', 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140 ó 150 aminoácidos en su N-terminal y/o en su C-terminal y/o internamente.

Además, una enzima RMD, Per, GTS, GFS-Cysl09Ser, ColD o ColC que tiene el grado de relación indicado anteriormente a la enzima de referencia sólo se considera como una variante, si presenta la actividad biológica relevante a un grado de por lo menos 30% de la actividad de ¦la enzima dé referencia respectiva. La "actividad biológica" relevante en el contexto de la presente invención es la "actividad de la enzima", es decir, la actividad de la variante de enzima RMD, Per, GTS, GFS-Cysl 09Ser, ColD o ColC para utilizar el sustrato GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa y covertirlo a GDP-D-ramnosa, GDP-D-perosamina, GDP-desoxi-D-talosa, GDP-6-desoxi-D-altrosa, GDP-4-ceto-3, 6-didesoxi-D-manosa o GDP-L-colitosa , respectivamente. El experto en la técnica puede evaluar fácilmente si una variante de enzima RMD, Per, GTS, GFS-Cysl 09Ser, ColD o ColC tiene una actividad de enzima de por lo menos 30%· de la actividad de enzima de la enzima RMD, Per, GTS, GFS-Cysl09Ser , ColD o ColC de referencia respectiva. Pruebas adecuadas, v.gr., pruebas de actividad de enzima, para determinar la "actividad de enzima" de la variante de enzima comparada con la enzima actividad de la enzima de referencia respectiva son conocidas por el experto en la técnica.

Preferiblemente, la enzima GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa reductasa (RMD) es de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO: 1) . La enzima GDP-6-desoxi-D-talosa sintetasa (GTS) es preferiblemente de Actinobacillus actino ycetemcomitans (SEQ ID NO: 2). Se prefiere que la enzima GDP-perosamina sintetasa (Per) sea de Vibrio cholerae (SEQ ID NO: 3) . Preferiblemente, la GDP-4-ceto-6-desoximanosa-3-deshidratasa (ColD) es de £. coli (SEQ ID NO: 4) . El uso del GDP-L-colitose sintasa (ColC) de E. coli también es preferido (SEQ ID NO: 7). La GDP-fucosa sintetasa (GFS) de tipo silvestre es de Cricetulus griseus (hámster chino) (SEQ ID NO: 5) . El mutante GDP-fucosa-sintetasa Cysl09Ser- (GFS-Cysl09Ser ) de Cricetulus griseus (hámster chino) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6.

Como se mencionó antes, la invención abarca variantes de las enzimas usando GDP-6-desoxi-D-lixp-4-hexulosa como un sustrato. Por lo tanto, la presente invención también cubre variantes de los números de identificador de secuencia antes mencionados, es decir, variantes de SEQ ID NO: 1, variantes de SEQ ID NO: 2, variantes de SEQ ID NO: 3, variantes de SEQ ID NO: 3, variantes de SEQ ID NO: 4, variantes de SEQ ID NO: 5, variantes de SEQ ID NO: 6 y variantes de SEQ ID NO: 7. En cuanto a la definición estructural y/o funcional de dichas variantes, se hace referencia a los párrafos antes mencionados .

Preferiblemente, las secuencias de ácido nucleico de RMD, Per, GTS, ColD, ColC o GFS-CyslO 9Ser son optimizadas en codón. El término "optimizada en codón", como se usa en el contexto de la presente invención significa, por ejemplo, la remoción de cajas Tata internas, sitios chi, sitios de entrada de ribosomas, motivos de inestabilidad de ARN, secuencias de repetición, estructuras secundarias de ARN intensas y sitios de empalme crípticos así como el uso de codones de utilización más alta en células eucarióticas (v.gr., vertebrados), o genes altamente expresados en células eucarióticas (v.gr., vertebrados).

Además se prefiere que la vía de ahorro de la fucosa adicionalmente sea bloqueada en la célula de , vertebrados. Por lo tanto, se prefiere usar medio de crecimiento libre de fucosa y de glicoproteínas fucosiladas, cuando se cultivan las células de la presente invención.

La célula de vertebrados además o alternativamente a la enzima comprende GDP-D-ramnosa, GDP-D perosamina, GDP- desoxi-D-talosa , GDP- 6-desoxi-D-altrosa , GDP- -ceto-3 , 6- didesoxi-D-manosa, y/o GDP-L-colitosa para inhibir o prevenir la síntesis de GDP-L-fucosa ya que los inventores de la presente invención han observado inesperadamente que el complemento, particularmente el complemento citosólico, v.gr., por inyección intracitoplásmica , de los azúcares artificiales GDP-D-ramnosa , GDP-D-perosamina, GDP-desoxi-D-talosa, GDP-6-desoxi-D-altrosa, GDP-4 -ceto-3 , 6-didesoxi-D-manosa, y/o GDP-L-colitosa contribuye positivamente a la inhibición de transferencia de fucosa en células de vertebrado. La complementacion del azúcar (es) artificial (es) GDP-6-desoxi-D-altrosa, GDP-D-ramnosa y/o GDP-D-perosamina es (son) particularmente preferido.

Se prefiere que la enzima que usa GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa como un sustrato y que no cataliza la reacción que convierte GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa a GDP-L-fucosa se exprese a partir de una secuencia de ácido nucleico transitoriamente presente o establemente mantenida en la célula de vertebrado ya sea episomalmente o 'cromosómicamente .

La secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima, preferiblemente GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa reductasa (RMD) , GDP-perosamina sintetasa (Per), GDP-6-desoxi-D-talosa sintetasa (GTS) , GDP-Fucosa sintetasa Cysl09Ser mutante (GFS-Cysl09Ser) , GDP-4-ceto-6-desoximanosa- 3-deshidratasa (ColD) , o GDP-L-colitosa sintasa (ColC) es integrada en un vector de expresión, que se usa para transformar la célula.

Los vectores * de . expresión adecuados comprenden plásmidos, cósmidos, cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y vectores virales. Preferiblemente, se usan los vectores de expresión no virales.

La expresión del ácido nucleico que codifica la enzima es controlada por secuencias de control de expresión.

Los términos "secuencias de control de expresión" se refiere a secuencias de nucleótidos que afectan la expresión en células eucarióticas (v.gr., células de vertebrado) , de secuencias codificantes a las cuales están operablemente enlazadas. Las secuencias de control de expresión son secuencias que controlan la transcripción, v.gr., promotores,, caja TATA, incrementadores ; eventos de post-transcripción, v.gr., poliadenilación; y traducción de secuencias de ácidos nucleicos.

Los promotores preferidos son promotores constitutivos que incluyen el promotor de gen temprano inmediato de citomegalovirus hCMV, los promotores temprano o tardío de SV40 o promotores regulados incluyendo el promotor CUP-1, el tet-represor como se utiliza, por ejemplo, en los sistemas de tet-activado o tet-desactivado, el promotor para 3-fosfoglicerato cinasa (PGK), los promotores de fosfatasa ácida, y los promotores de factores de concordancia a o concordancia a de levadura, v.gr., el promotor de gen temprano inmediato de CMV constitutivo, el promotor temprano o tardío de SV 40, el promotor de poliedrina, LTRs retrovirales, promotor de PGK, factor de alargamiento 1-a '(EF-l- .), EF2 fosfoenolpiruvato carboxi cinasa (PEPCK). Los promotores particularmente preferidos son promotores que soportan sólo la expresión intermedia o débil de la enzima para evitar problemas. de toxicidad potenciales. La resistencia a la expresión de un promotor dado puede ser normalizada al comparar la expresión con la resistencia a la expresión del promotor constitutivo fuerte que dirige la expresión de GAPDH endógena. Un promotor que dirige la expresión de la enzima a una fuerza de 10% a 1% de GAPDH se considera un promotor que dirige la expresión intermedia y un promotor que dirige la expresión de la enzima a una fuerza de menos de 1% se considera un promotor débil. La fuerza de expresión puede ser evaluada por métodos conocidos en la técnica incluyendo, v.gr., PCR en tiempo real.

También se pueden usar etiquetas marcadoras en las modalidades de la presente invención. Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico de la etiqueta marcadora está operablemente enlazada a la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteina (v.gr., enzimas, anticuerpos) que ha de ser etiquetada. Preferiblemente, la etiqueta marcadora es una proteina fluorescente seleccionada del grupo que consiste de GFP y variantes de la misma; incluyendo, pero sin limitarse a, GFP. Como se usa en la presente, "operablemente enlazada" significa que un ácido nucleico es enlazado a un segundo ácido nucleico de tal manera que la expresión en marco de una proteina de fusión correspondiente puede ser afectada evitando desplazamientos de marco o codones de detención. Estos términos también significan el enlace de secuencias de control de expresión a una secuencia de ácido nucleico codificante de interés (v.gr., enzima, anticuerpo) para controlar efectivamente la expresión de dicha secuencia. Estos términos también se refieren al enlace de secuencias de ácido nucleico que codifican la etiqueta de afinidad o etiqueta marcadora a una secuencia de ácido nucleico codificante de interés (v.gr., enzima, anticuerpo).

Se prefiere que la secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima RMD, Per, GTS, GFS-Cysl09Ser , ColD o ColC en el vector de expresión sea enlazada operablemente a secuencias de control de expresión especificas de vertebrados, que permita la expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima RMD, Per, GTS, GFS-Cysl09Ser, ColD o ColC en la célula de vertebrado.

Como resultado, la enzima (s) RMD, Per, GTS, GFS-Cysl09Ser, y/o ColD, ColD preferiblemente en combinación con ColC, son expresadas en la célula de vertebrados de la presente invención en rendimientos óptimos para el efecto deseado. Dependiendo de la naturaleza de la enzima y la •célula usada para expresión, estos rendimientos pueden ser altamente moderados o bajos. Es fácil para los expertos en la técnica escoger secuencias de control de expresión especificas de vertebrados apropiadas para lograr un nivel de expresión alto, moderado o bajo.

La expresión de la enzima (s) RMD, Per, GTS, GFS-Cysl09Ser, y/o ColD, ColD preferiblemente en combinación con ColC, en la célula de vertebrado tiene el efecto de que bloquea efectivamente la síntesis de GDP-L-fucosa y por lo tanto conduce a la producción de moléculas, que comprenden naturalmente fucosa en sus porciones glico, pero que se debido a su expresión carece de fucosa o tiene una cantidad reducida de fucosa en sus porciones glico.

Para producción de alto rendimiento a largo plazo de una expresión estable de proteínas recombinante es preferida. Por ejemplo, las células eucarióticas (v.gr., células de vertebrado) que expresan establemente ácidos nucleicos que codifican la enzima que usa GDP-6-desoxi-D-lixo-4 -hexulosa como un sustrato, en donde la enzima no cataliza la reacción que convierte GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa en GDP-L-fucosa y la proteína, v.gr., un anticuerpo, puede ser genéticamente manipulado. -En vez de usar vectores de expresión que contengan ' orígenes de replicación virales, las células eucarióticas (v.gr., células de vertebrado) pueden ser transformadas con vectores controlados por secuencias de control de expresión apropiadas (v.gr., promotor, incrementador, secuencias, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y opcionalmente un marcador seleccionable . Después de la introducción de ADN extraño, las células transformadas pueden ser detectadas, al analizar ácidos nucleicos a partir de dichas células, al detectar el efecto de expresión (v.gr., la falta de fucosa usando unión de lectina) o se puede seleccionar al aplicar presión selectiva. Los sistemas de selección adecuados también son conocidos en la técnica.

Preferiblemente, la célula de vertebrados además comprende por lo menos una molécula (aceptora) que es capaz de ser un sustrato para una fucosiltransferasa . El término "molécula (aceptora) capaz de ser un sustrato para una fucosiltransferasa" como se usa en el contexto de la presente invención, se refiere a cualquier compuesto de interés, v.gr., una proteina, un polipéptido, un oligopéptido, un lipido, un fragmento de lipido o una proteina de fusión, que tiene o que comprende porciones glico a ' las cuales por lo menos un residuo de fucosa está unido, si es producido en una célula que tiene una actividad de fucosilación no alterada. Dicho compuesto es un sustrato adecuado para una fucosiltransferasa . Una molécula aceptora preferida por consiguiente es una glicoproteina, un glicopolipéptido, un glicooligopéptido, un glicolipido, un fragmento de glicolipido o una proteína de fusión glicosilada. El término "molécula (aceptora) capaz de ser un sustrato para una fucosiltransferasa", como se usa en el contexto de la presente invención también se refiere a cualquier proteína o lipido, siempre que sea una glicoproteina o glicolípido prospectiva a la cual por lo menos un residuo de fucosa puede estar unido, es decir, una proteina o lipido a la cual las estructuras de oligosacárido estén' enlazadas comprendiendo un monosacárido al cual la fucosa puede ser unida por la fucosiltransferasa después de su producción por la célula de vertebrado. Preferiblemente, la proteina no es de origen procariótico . Es particularmente preferido que la proteina sea una proteina de mamífero o derivada del mismo.

La presencia de una molécula capaz de ser un sustrato para una fucosiltransferasa, v.gr., una proteína o lipido que comprende porciones glico a las cuales por lo menos un residuo de fucosa puede ser unido, en una célula de vertebrado de la invención, conduce a la producción de esta molécula que no comprende fucosa en sus porciones glico o que tiene una cantidad reducida de fucosa en sus porciones glico, a pesar del hecho de que los residuos de fucosa se puedan unir.

Se prefiere que la molécula capaz de ser un sustrato para una fucosiltransferasa sea una proteína, preferiblemente una proteína endógena o exógena. El término "proteína exógena" significa cualquier proteína ya sea que provenga desde el exterior de la célula respectiva o que sea expresada dentro de la célula a partir de un ácido nucleico introducido en la célula respectiva. El término "proteína endógena" se refiere a cualquier proteína que es codificada por el genoma de la célula. Preferiblemente, la proteína de interés, a saber la glicoproteína prospectiva, es expresada recombinantemente en la célula de vertebrado. Se prefiere que dicha proteína sea expresada a partir de una secuencia de ácido nucleico transitoriamente presente o establemente mantenida en la célula de vertebrado. Los vectores de expresión adecuados y secuencias de control de expresión se han descrito anteriormente con respecto a la enzima. Estos se pueden usar igualmente en el contexto de la expresión del ácido nucleico que codifica la proteína de interés.

Por lo tanto, en una modalidad preferida, de la presente invención, la célula de vertebrado comprende (i) por lo menos un polinucleót ido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa reductasa (RMD) , GDP-perosamina sintetasa (Per), GDP-6-desoxi-D-talosa sintetasa (GTS), GDP-fucosa sintetasa Cysl09Ser mutante (GFS-Cysl09Ser) , GDP-4-ceto-6-desoximanosa-3-deshidratasá (ColD) , o GDP-L-colitosa sintasa (ColC) , operablemente enlazada a secuencias de control de expresión específicas, que permiten la expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima respectiva, y (ii) por lo menos un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de interés, a saber la glicoproteina prospectiva', v.gr., un anticuerpo, tal como IgGl, operablemente enlazado a secuencias de control de expresión especificas de vertebrado, que conducen a la expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteina de interés, v.gr., un anticuerpo, tal como IgGl, en dicha célula.- Como resultado, (i) la enzima (s) RMD, Per, GTS, GFS-Cysl09Ser, y/o ColD, ColD preferiblemente en combinación con ColC, y (ii). la proteina (s) de interés, a saber la glicoproteina ( s ) prospectiva, v.gr., un anticuerpo, tal como IgGl, se expresan en la célula de vertebrado de la presente invención : Preferiblemente, en el primer aspecto de la invención, la proteina es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una proteina de fusión, una proteina de virus, un fragmento de proteina de virus, un antigeno o una hormona. Muy preferiblemente, el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de IgG, preferiblemente IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD e IgE. Muy preferiblemente, la proteina de fusión comprende la región Fe de un anticuerpo, v.gr., la región Fe de IgG, tal como la región Fe de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD o IgE. Muy preferiblemente, la hormona es una hormona estimulante del folículo (FSH), hormona gonadotrópica, hormona estimulante de la tiroides, interleucina-2 , interleucina-6, interleucina-10 , interleucina-11 , interleucina-4 soluble, eritropoyetina o trombopoyetina . Preferiblemente, la proteina de virus o el fragmento de proteina de virus está comprendido en la membrana de envoltura de un virus con envoltura. Es particularmente preferido que la proteina de virus sea proteina G o F del virus de sincicio respiratorio y que el fragmento de proteina de virus sea el fragmento extracelular de dicha proteina. ??· aspecto adicional de la invención es un virus que comprende dicha proteina de virus o fragmento de proteina de virus.

Se prefiere que la molécula capaz de ser un sustrato para fucosiltransferasa sea un lipido. Preferiblemente, el lipido es un gliceroglicolipido, muy preferiblemente un galactolipido, un sulfolipido (SQDG) o un glicoesfingolipidos, muy preferiblemente un cerebrósido (v.gr., un galactocerebrósido o un glucocerebrósido) , un gangliósido, un globósido, una sulfatida o un glicofosfoesfingolipido . Es particularmente preferido que el lipido esté comprendido en la membrana de envoltura de un virus con envoltura.

El glicoesfingolipido (GSL) es particularmente preferido. Los glicoesfingolipidos contienen una ceramida hidrofóbica que es anclada a la N-acilesfingosina y un grupo de cabeza hidrofilica compuesto de ' sacáridos . Normalmente se encuentran en la superficie exterior de las membranas celulares. La composición de la porción sacárido es especifica del tipo de célula y depende de la etapa de desarrollo del organismo o puede cambiar con el estado oncogénico de una célula.

Muy preferiblemente, la proteina de virus y/o lipido está comprendida en la envoltura de un virus con envoltura .

Como ya se mencionó antes, la proteina puede ser una proteina de virus que esté comprendida en la membrana de envoltura de un virus con envoltura. El lipido también puede ser lipido comprendido en la membrana de envoltura de un virus con envoltura.

Un aspecto adicional de la invención es un virus que comprende dicho lipido.

El virus antes mencionado puede ser introducido en la célula de vertebrado mediante infección del virus. El virus también puede ser introducido en la célula de vertebrado al introducir ácidos nucleicos que codifican todo o una parte del virus que ha de ser producido. En el caso que ' sea necesario proveer proteínas requeridas para replicación, ensamble, etc., esto se, logra usualmente usando líneas de células productoras de virus capaces de expresar una o más proteínas del virus. Por ejemplo, las células HEK293, Per.C6 y AGE1.HN expresan proteínas E1A de adenovirus y por lo tanto son capaces de complementar ADN que carece de regiones codificantes de El.

Preferiblemente, la célula de vertebrado es una célula de mamífero, de pez, de anfibio o reptil o de un ave.

Es particularmente preferido que i) la célula de mamífero sea una célula humana, de hámster, canino o mono, preferiblemente una célula de ovario de hámster chino (CHO) , una célula de- riñon de mono verde africano (VERO-76) (ATCC CRL-1587), una célula de carcinoma cervical humana (HeLa) (ATCC CCL 2), una célula de riñon de canino Madin Darbin (MDCK) (ATCC CCL 34), una célula PER.C6 humana (celular comercial de Crucell, Leiden, Países Bajos), o una célula AGE1.HN humana {Homo sapiens) (célula comercial de ProBioGen, Berlín, Alemania) ; ii) la célula de pez es célula de ovario (CCO) de Ictalurus punctatus (pez gato de canal) (ATCC CRL-2772), iii) la célula de anfibio es una célula de riñon de Xenopus laevis (ATCC CCL-102) ; iv) la célula de reptil es células de corazón de Iguana iguana (IgH-2) (ATCC CCL-108); o v) la célula de ave es una célula de retina de ave AGEl.CR o AGEl.CR.PIX, o una célula de somita de ave AGE1.CS (todas las células derivadas de pato moscovita, Cairina moschata) . Estas líneas de células están todas ellas comercialmente disponibles de ProBioGen AG.

La linea de células AGE1.CR.PIX (17allb) fue depositada por ProBioGen AG, Goethestr. 54, 13086 Berlín, Alemania, en DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg Ib, 38124 Braunschweig, Alemania el 24 de noviembre de 2005, bajo el número de acceso DSM ACC2749. La línea de células de AGE1.HN (NC5T11#34) fue depositada por ProBioGen AG, Goethestr. 54, 13086 Berlín, Alemania, en DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg Ib, 38124 Braunschweig, Alemania el 4 de noviembre de 2005, bajo el número de acceso DSM ACC2744. La línea de células AGE1.CR.PIX (17allb) es derivada de células de retina embrionarias de pato moscovita {Cairina moschata) . La línea de células AGE1.HN (NC5T11#34) es derivada de una región neural periventricular de un feto humano {Homo sapiens) . Ambas líneas de células son inmortalizadas por la integración y expresión estables de proteínas E1A y E1B de adenovirus.

Otra célula de vertebrado preferida es la célula EB14 de ave que es una célula comercial de VIVALIS (Nantes, Francia) . Otras células de vertebrado preferidas se resumen en la siguiente tabla 1.

Tabla 1 Las células de vertebrados, naturalmente comprenden una glicosiltransferasa para GDP-D-ramnosa , GDP perosamin, GDP-desoxi-D-talosa , GDP-6-desoxi-D-altrosa, GDP-4-ceto-3, 6-didesoxi-D-manosa o GDP-L-colitosa ya que dichos azúcares normalmente no son sintetizados o están presentes en células de vertebrados. Por lo tanto, aun cuando los azúcares artificiales GDP-D-ramnosa, GDP-D-perosamina , GDP-desoxi-D-talosa, GDP-6-desoxi-D-altrosa , GDP-4-ceto-3, 6-didesoxi-D-manosa, o GDP-L-colitosa sean no naturalmente producidos en las células de vertebrados de conformidad con el primer aspecto de la presente invención, no pueden ser incorporados en glicoestructuras nacientes de proteínas o lípidos.

Los inventores de la presente invención, sin embargo, inesperadamente han encontrado que los azúcares artificiales GDP-D-ramnosa, GDP-D-perosamina, GDP-desoxi-D-talosa, GDP-6-desoxi-D-altrosa , GDP-4 -ceto-3 , 6-didesoxi-D-mañosa o GDP-L-colitosa pueden ser integrados en las estructuras de glicano · de proteínas o lípidos con la condición de que las glicosiltransferasas heterólogas respectivas, y opcionalmente un transportador de nucleótido con GDP-con azúcar desoxihexosa heterólogo respectivo, esté (estén) presente (s) también en la célula de vertebrado.

Por consiguiente, en una modalidad preferida, la célula de vertebrado de conformidad con el primer aspecto de la presente invención comprende además por lo menos una glicosiltransferasa para GDP-D-ramnosa, GDP-D-perosamina, GDP-desoxi-D-talosa, GDP-6-desoxi-D-altrosa, GDP-4 -ceto-3 , 6-didesoxi-D-manosa, o GDP-L-colitosa, preferiblemente codificado por un ácido nucleico comprendido en la célula de vertebrado y operablemente enlazado a secuencias, de control de expresión especificas de vertebrado, que permiten la expresión de la secuencia de ácido nucleico, y opcionalmente por lo menos un t ansportador de nucleótido de GDP-azúcar desoxihexosa para GDP-D-ramnosa, GDP-D-perosamina, GDP-desoxi-D-talosa , GDP-6-desoxi-D-altrosa, GDP-4 -ceto-3 , 6-didesoxi-D-manosa o GDP-L-colitosa, preferiblemente codificado por un ácido nucleico comprendido en la célula de vertebrado y operablemente enlazado a las secuencias de control de expresión especificas de vertebrado, que permiten la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico. En una modalidad más preferida, la célula de vertebrado de conformidad con el primer aspecto de la presente invención además comprende una glicosiltransferasa para GDP-D-ramnosa, GDP-D-perosamina y/o GDP-6-desoxi-D-altrosa .

Es particularmente preferido que dos o más, v.gr., 2, 3, 4, 5, 6 ó 7, de las glicosiltransferasas antes mencionadas, y opcionalmente dos o más, v.gr., 2, 3, 4, 5, 6 ó 7, del transportador de nucleótido de GDP-azúcar desoxihexosa estén presentes en la célula de vertebrado, v.gr., célula eucariótica.

Los sistemas adecuados para expresión transitoria o estable de dichos ácidos nucleicos son conocidas por un experto en la técnica y las preferidas se describieron anteriormente y se pueden usar de manera similar en el contexto de expresar glicosiltransferasa, y opcionalmente transportadores de nucleótido de GDP-azúcar desoxihexosa.

-Preferiblemente, la glicosiltransferasa para GDP-D-ramnosa, GDP-D-perosamina , GDP-desoxi-D-talosa , GDP-6-desoxi-D-altrosa, GDP-4 -ceto-3 , 6-didesoxi-D-manosa o GDP-L-colitosa es recombinantemente expresada en la célula de vertebrado. La glicosiltransferasa para GDP-D-ramnosa , GDP-D-perosamina, GDP-desoxi-D-talosa, GDP-6-desoxi-D-altrosa, GDP-4 -ceto-3 , 6-didesoxi-D-manosa o GDP-L-colitosa puede ser expresada a partir de una secuencia de ácido nucleico transitoriamente presente o establemente mantenida en la célula de vertebrado. También se prefiere que el transportador de nucleótido de GDP-azúcar de desoxihexosa antes mencionado sea recombinantemente expresado en la célula de vertebrado. Dicho transportador de nucleótido de GDP-azúcar desoxihexosa puede ser -expresado a partir de una secuencia de ácido nucleico transitoriamente presente o establemente mantenida en la célula de vertebrado.

Por lo tanto, en otra modalidad preferida de la presente invención, la célula de vertebrado comprende (i) por lo menos un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa reductasa (RMD) , GDP-perosamina sintetasa (Per), GDP-6-desoxi-D-talosa sintetasa (GTS), mutante GDP-fucosa-sintetasa Cysl09Ser (GFS-Cysl09Ser ) , GDP-4-ceto-6-desoximanosa-3-deshidratasa (ColD) o GDP-L-colitosa sintasa (ColC) operablemente enlazada a s.ecuencias de control de expresión especificas de vertebrado, (ii) por lo menos un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteina de interés, a saber una glicoproteina prospectiva, v.gr., un anticuerpo, tal como IgGl, operablemente enlazada a secuencias de control de expresión especificas de vertebrado, que permiten la expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica dicha proteina en la célula, y (iii) por lo menos un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la glicosiltransferasa para GDP-D-ramnosa , GDP-D-perosamina, GDP-desoxi-D-talosa, GDP-6-desoxi-D-altrosa , GDP-4 -ceto-3 , 6-didesoxi-D-manosa o GDP-L-colitosa operablemente enlazada a secuencias de control de expresión especificas de vertebrado, que permite la expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteina en dicha célula, y opcionalmente (iv) por lo menos un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica transportador de nucleótido de GDP-azúcar desoxihexosa para GDP-D-ramnosa, GDP-D-perosamina, GDP-desoxi-D-talosa, GDP-6-desoxi-D-altrosa, GDP-4-ceto-3, 6-didesoxi-D-manosa o GDP-L-colitosa operablemente enlazada a secuencias de control de expresión especificas de vertebrado, que permiten la expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica dicha proteina en la célula.

Como resultado, (i) la(s) enzima(s), (ii) la(s) proteina(s) de interés, (iii) la(s) glicosiltransferasa (s) , y opcionalmente (iv) el transportador de nucleótido del GDP-azúcar desoxihexosa son sobreexpresados en la célula de vertebrado de la presente invención.

Dicha (s) proteina (s) son adicionalmente modificdas por la(s) glicosiltransferasa ( s ) co-expresada ( s ) , que hace(n) uso del (los) producto (s) final (es) de la(s) enzima (s), a saber .GDP-D-ramnosa, GDP-D-perosamina, GDP-desoxi-D-talosa, GDP-6-desoxi-D-altrosa, GDP-4 -ceto-3 , 6-didesoxi-D-manosa , y/o GDP-L-colitosa , y los integran en las glicoestructuras de la(s) proteina (s) que carece (n) de fucosa o con una cantidad reducida de fucosa en sus porciones glico. Esto conduce a la generación de proteina (s) artificial ( es ) nueva (s) que comprende (n) D-ramnosa, D-perosamina, desoxi-D-talosa, 6-desoxi-D-altrosa , 4-ceto-3, 6-didesoxi-D-manosa, y/o L-colitosa en sus porciones glico.

Preferiblemente, el transportador de nucleótido del GDP-azúcar desoxihexosa antes mencionado es transportador de nucleótido del GDP-azúcar desoxihexosa del aparato de Golgi, a saber transportador que permite el transporte de los azúcares de nucleótido antes mencionados a través de la membrana del aparato de Golgi de una célula de vertebrado, v.gr., célula eucariótica.

La célula de vertebrado (modificada) de conformidad con la presente invención se puede usar para producir virus con envoltura que comprenden glicoproteinas o glicolipidos de la superficie de la envoltura que no tienen fucosa en sus porciones glico o con una cantidad reducida de fucosa en sus porciones glico.

Preferiblemente, el virus con envoltura se usa en su totalidad o en parte como un componente activo de una vacuna viral. El término "vacuna viral" significa una preparación de un virus debilitado o muerto que al administrarse estimula la producción de anticuerpos o inmunidad celular contra el virus pero es incapaz de causar infecciones severas.

La célula de vertebrado (modificada) de conformidad con la presente invención también se puede usar para producir virus con envoltura que comprenden glicoproteinas o glicolipidos de la superficie de la envoltura que comprenden D-ramnosa, D-perosamina , desoxi-D-talosa , 6-desoxi-D-altrosa, 4-ceto-3, 6-didesoxi-D-manosa, y/o L-colitosa en sus porciones glico .

En un segundo aspecto, la presente invención se ¦ refiere a un método para producir una molécula, que naturalmente comprende fucosa en sus porciones glicó, que carece de fucosa o con una cantidad reducida de fucosa en sus porciones glico que comprende los pasos de: i) proveer una célula de. vertebrado de conformidad con el primer aspecto, ii) aislar la molécula que es capaz de ser un sustrato para una fucosiltransferasa, preferiblemente una proteina o lipido, de la célula en i) .

Preferiblemente, en el paso i), la molécula que es capaz de ser un sustrato para una fucosiltransferasa, v.gr., una proteina, es expresada en la célula en i) .

Dichas moléculas, v.gr.-, proteínas o lípidos que carecen de fucosa o con una cantidad reducida de fucosa en sus porciones glico, pueden ser fácilmente aisladas en el paso, ii) de la célula de vertebrado.

Varios procedimientos de aislamiento se conocen en la técnica para moléculas encerradas dentro de células eucarióticas (v.gr., células de vertebrado) o secretadas a partir de dichas células que comprenden las moléculas modificadas, v.gr., proteínas que carecen de fucosa o con una cantidad reducida de fucosa en sus porciones glico. Dichos métodos típicamente implican cosecha, desintegración y fraccionamiento/purificación de células, en el caso de moléculas intracelulares y generación de un sobrenadante de cultivo libre de células seguido por purificación de moléculas secretadas.

Un procedimiento de extracción que es útil de conformidad con la invención no interfiere con moléculas modificadas para ser aisladas. Por ejemplo, la extracción preferiblemente se realiza en ausencia de detergentes fuertes y agentes- reductores, o cualquier agente que pueda inducir desnaturalización de proteina.

En un tercer aspecto, la presente invención provee una molécula que carece de fucosa o con una cantidad reducida de fucosa en sus porciones glico obtenible por el método del segundo aspecto. Preferiblemente, esta molécula es un lipido o proteina.

Es particularmente preferido que la proteina sea un anticuerpo, una hormona, un antigeno o una proteina viral como se expuso anteriormente con respecto al primer aspecto.

Es particularmente preferido que el lipido sea un gliceroglicolipido, muy preferiblemente un galactolipido , un sulfolipido (SQDG), o glicosphingolipidos , muy preferiblemente un cerebrósido (v.gr., un galactocerebrósido o un glucocerebrósido) , un gangliósido, un globósido, un sulfátido o un glicofosfoesfingolipido . Preferiblemente, el lipido, v.gr., gangliósido, está comprendido en la membrana de un virus con envoltura.

Muy preferiblemente, la proteina y/o lipido viral están comprendidos en la envoltura de un virus con envoltura.

En un aspecto adicional, la presente invención provee una composición de moléculas de conformidad con el tercer aspecto.

En un cuarto aspecto, la presente invención provee una molécula que comprende porciones glico que contienen D-ramnosa, D-perosamina, desoxi-D-talosa, 6-desoxi-D-altrosa, 4-ceto-3, 6-didesoxi-D-manosa, y/o L-colitosa obtenible por el método del segundo aspecto.

Se prefiere que esta molécula no comprenda o que comprenda una cantidad reducida de L-fucosa en sus porciones glico. Preferiblemente, esta molécula es un lipido o proteina. Además, se proveen células de vertebrado, preferiblemente células tumorales que expresan dichas moléculas modificadas, preferiblemente lipidos y/o proteínas. Particularmente preferidas son células tumorales que contienen glicanos que comprende D-ramnosa. D-ramnosa es un bloque de construcción de polisacáridos de Ganoderma lucidum. Estos polisacáridos se usan en la medicina china tradicional para incrementar la actividad de células efectoras inmunológicas : células NK y células asesinas activadas por linfocina son activadas y fagocitosis y citotoxicidad de macrófagos se incrementan (Zhu- et al., 2007, Journal of Ethnopharmacology 111 (2), 219-226). Dichas células se pueden usar para incrementar la respuesta inmunológica contra una célula tumoral dada, v.gr., como en un enfoque de inmunización activo.

En un aspecto adicional, la presente invención provee una composición de moléculas de conformidad con el cuarto aspecto.

En un quinto aspecto, la presente invención provee una composición que comprende glicoproteinas que comprenden i) entre 70 y 95%, es decir, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, . 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% y 95%, preferiblemente 80% de N-glicanos de tipo complejo G0-GlcNac, G0, Gl, y/o G2, y ii) entre 5 y 30%, es decir, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, .11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29% y 30%, preferiblemente 20% de N-glicanos de tipo de alto contenido de mañosa, en donde los N-glicanos de tipo complejo de las glicoproteinas son libres de fucosa o sustancialmente libres de fucosa. Preferiblemente, las glicoproteinas de la composición son las glicoproteinas preferidas antes indicadas, en particular, anticuerpos.

Es particularmente preferido que de los N-glicanos de tipo complejo dentro de la composición 70%) a 80%), preferiblemente aproximadamente 75% sean G0 y 20% a 30%, prefériblemente aproximadamente 25% sean N-glicanos de tipo complejo G0-GlcNac, Gl y/o G2, y/o que de los N-glicános de tipo de alto contenido de mañosa 45%) a 55%, preferiblemente aproximadamente 50% sean glicanos man5 y 45 a 55%, preferiblemente aproximadamente 50% sean N-glicanos man6, man7 y/o man8. Cabe entender que los números en cada caso se agregan hasta 100%.

Es también particularmente preferido que de los N-glicanos de tipo complejo dentro de la composición 70%) a 90%., preferiblemente aproximadamente 80%) sean G0 y 10% a 30%, preferiblemente aproximadamente 20% sean N-glicanos de tipo complejo G0-GlcNac, Gl y/o G2, y/o que de los N-glicanos de tipo de alto .contenido de mañosa 60%) a 85%), preferiblemente aproximadamente 70% sean glicanos man5 y 15 a 40%, preferiblemente aproximadamente 30% sean N-glicanos man6, man7 y/o man8. Cabe entender que los números en cada caso se agregan hasta 100%.

Las glicoproteinas son preferiblemente aquellas indicadas como preferidas en el contexto del primer aspecto de la invención, en particular anticuerpos, v.gr., IgGls, IgG2s, IgG3s o IgG4s, en donde estos anticuerpos preferiblemente tienen una actividad de ADCC más alta que una composición de anticuerpo producida en una célula progenitora, no modificada (v.gr., célula eucariótica, tal como célula de vertebrado) ADCC es el mecanismo dominante por el cual los anticuerpos dirigidos contra células tumorales (cáncer) exhiben su efecto) . ADCC también se puede usar para eliminar células inmunes específicas para interrumpir patogénesis en enfermedad autoinmune.

Varias enfermedades que incluyen infecciones virales y bacterianas se pueden prevenir y tratar al suprimir proliferación de células infectadas con un virus o bacteria usando el anticuerpo que tiene actividad de ADCC alta de conformidad con la presente invención.

En un sexto aspecto, la presente invención provee una proteína, preferiblemente una proteína no procariótica, preferiblemente una proteína de virus o mamífero, o un lípido, preferiblemente un lípido no procariótico, v.gr. , un glicoesfingolípido, que comprende porciones glico que contiene D-ramnosa, D-perosamina, desoxi-D-talosa, 6-desoxi-D-altrosa, 4 -ceto-3 , ß-didesoxi-D-manosa y/o L-colitosa. Preferiblemente, la proteína y/o lípido de virus están comprendidos en la envoltura de un virus con envoltura. Alternativamente, se proveen células eucarióticas, preferiblemente de vertebrado, muy preferiblemente de mamífero y muy preferiblemente aún células humanas (células tumorales alogénicas o autólogas) que comprende dichas proteínas y/o lipidos.

Preferiblemente, la proteína o lípido comprende D-ramnosa, D-perosamina, desoxi-D-talosa,- 6-desoxi-D-altrosa, 4 -ceto-3 , 6-didesoxi-D-manosa , y/o L-colitosa, muy preferiblemente D-ramnosa y/o D-perosamina , en sus porciones glico y sin L-fucosa o una cantidad reducida de L-fucosa en sus porciones glico. Está claro que las proteínas del sexto aspecto también pueden tener todas las propiedades, que son la consecuencia de- usar los aspectos preferidos y particularmente preferidos de los métodos de la presente invención .

Se sabe que los azúcares artificiales, tales como D-ramnosa, D-perosamina, desoxi-D-talosa, 6-desoxi-D-altrosa, 4-ceto-3 , 6-didesoxi-D-manosa y/o L-colitosa, confieren resistencia a péptidos catiónicos, v.gr., polimixina B, defensinas, etc., por ejemplo, al neutralizar la carga en la superficie bacteriana (véase Breazeale et al., 2003, The Journal of Biological Chemistry, 278, 24731-24739).

Las defensinas son proteínas catiónicas ricas en cisteína pequeñas encontradas, por ejemplo, en eucariotas (v.gr., vertebrados). Son activas contra bacterias, hongos y muchos virus con envoltura y sin envoltura. Consisten de 18-45 aminoácidos incluyendo 6 (en vertebrados) a 8 residuos de cisteína conservados. Las células eucarióticas (v.gr., vertebrado) del sistema inmunológico contienen estos péptidos para ayudar a matar bacterias fagocitizadas, por ejemplo en granulocitos de neeutrófilos y casi todas las células epiteliales .

Por lo tanto, el establecimiento de virus con envoltura que comprende proteínas de virus que contienen D-ramnosa, D-perosamina , desoxi-D-talosa , 6-desoxi-D-altrosa, 4-ceto-3 , 6-didesoxi-D-manosa, y/o L-colitosa, preferiblemente el amino azúcar catiónico D-perosamina, en sus porciones glico es altamente útil, por ejemplo, en la terapia génica como vectores, ya que estos virus serían resistentes contra ataques de defensinas y otros péptidos catiónicos de la defensa inmunológica congénita. La producción de virus o glicoproteíñas de virus que contienen uno o más de los residuos de azúcar D-ramnosa, D-perosamina, desoxi-D-talosa, ß-desoxi-D-altrosa, 4-ceto-3, ß-didesoxi-D-manosa, y/o L-colitosa en sus porciones glico sería altamente útil para inducir una respuesta inmunológica superior. Estos residuos de azúcar naturalmente no están presentes en glicoproteínas de mamífero. Sin embargo, son frecuentes en glicoproteínas y lipopolisacáridos de bacterias. Pseudomonas aeruginosa, el origen de la secuencia de RMD es un o de los patógenos bacterianos más importantes encontrados por hospederos inmunocomprometidos y pacientes con fibrosis cística (CF) .

Particularmente, el establecimiento de proteínas que contienen el residuo de azúcar D-perosamina o virus con envoltura que comprende proteínas de virus que contiene el residuo de azúcar D-perosamina es favorecido, debido a la cationicidad de D-perosamina. Un virus.' que comprende glicoproteínas que contienen el residuo de azúcar D-perosamina en su envoltura tiene una carga de superficie catiónica que puede proteger a dicho virus contra la defensa inmunológica congénita.

En un séptimo aspecto, la presente invención provee una unidad de expresión que comprende una o más secuencias de control de expresión en vertebrados operativamente enlazadas a un (primer) polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima que usa GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa como sustrato, en donde la enzima no cataliza la reacción que convierte GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa a GDP-L-fucosa .

La unidad de expresión puede ser cualquier sistema de expresión conocido por el experto en la técnica en el cual una o más secuencias de control de expresión en vertebrados y un (primer) polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima que usa GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa como sustrato puede ser integrada, v.gr., un plásmido, un cósmido, un virus, etc.

Preferiblemente, una o más secuencias de control de expresión . en vertebrados comprendida en la unidad de expresión están operativamente enlazadas al (primer) polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima que usa GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa como sustrato para permitir la expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima que usa GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa como sustrato en la célula de vertebrado, v.gr., célula CHO o HeLa .

Preferiblemente, el vector de expresión, v.gr., vector de plásmido, permite la expresión transitoria de una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima que usa GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa como sustrato en el citoplasma de una célula de vertebrado o permite la expresión estable de una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima que usa GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa como sustrato en la célula de vertebrado después de la integración de dicha secuencia en el genoma de dicha célula.

Es particularmente preferido que la enzima que usa GDP-6-desoxi-D-lixo-4'-hexulosa como sustrato se seleccione del grupo que consiste de GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa reductasa (RMD) , GDP-perosamina sintetasa (Per), GDP-6-desoxi-D-talosa sintetasa (GTS), GDP-Fucosa sintetasa Cysl09Ser-mutante de (GFS-Cysl09Ser ) , GDP-4-ceto-6-desoximanosa-3-deshidratasa (ColD) ,· preferiblemente GDP-4-ceto-6-desoximanosa-3-deshidratasa (ColD) en combinación con GDP-L-colitosa sintasa (ColC) , y variantes de las mismas.

Preferiblemente, la unidad de expresión además comprende un (segundo) polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una glicosiltransferasa para GDP-D-ramnosa, GDP-D-perosamina, GDP-desoxi-D-talosa, GDP-6-desoxi-D-altrosa, GDP-4-ceto-3, 6-didesoxi-D-manosa o GDP-L-col itosa , preferiblemente operativamente enlazada a uno o más elementos de control de expresión en vertebrados, v.gr., un promotor, y preferiblemente comprendido en un vector de expresión, v.gr. vector de plásmido, para permitir la expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica dicha glicosiltransferasa en la célula de vertebrado, v.gr., célula CHO, célula HeLa o una célula tumoral, preferiblemente una célula tumoral autóloga, y opcionalmente un (tercer) polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un transportador de nucleótido del GDP-azúcar desoxihexosa para GDP-D-ramnosa, GDP-D-perosamina , GDP-desoxi-D-talosa , GDP-6-desoxi-D-altrosa, GDP-4 -ceto-3 , 6-didesoxi-D-manosa o GDP-L-colitosa , preferiblemente operativamente enlazada a uno o más elementos de control de expresión en vertebrados, v.gr., un promotor, y preferiblemente comprendido en un vector de expresión, v.gr., vector de plásmido, Rara permitir la expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica dicho transportador de nucleótido del GDP-azúcar desoxihexosa en la célula de vertebrado, v.gr., célula CHO, célula HeLa o una célula tumoral, preferiblemente una célula tumoral autóloga.

El primer, segundo y opcionalmente tercer polinucleótido puede ser integrado por separado en vectores de expresión, v.gr., vectores de expresión transitorios o vectores que se integran en el genoma de la célula. Alternativamente, el primero, segundo y opcionalmente tercer polinucleótido pueden estar comprendidos en un vector de expresión. La expresión puede ser impulsada desde un promotor, dos promotores o tres promotores. En el primer caso, se prefiere que las proteínas codificadas por el primer, segundo y opcionalmente tercer polinucleótido sean transcritas como un solo transcrito y sean separadas sólo por un IRES.

En una modalidad preferida de la invención, la unidad de expresión comprende una o más secuencias de control de expresión en vertebrados operativamente enlazadas a un primer polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima RMD, una o más secuencias de control de expresión en vertebrados operativamente enlazadas a un segundo polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una glicosiltransferasa para GDP-D-ramnosa, y opcionalmente una o más secuencias de control de expresión en vertebrados operativamente enlazadas a un tercer polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un transportador de nucleótido del GDP-azúcar desoxihexosa para GDP-D-ramnosa, preferiblemente comprendido en un vector de expresión, en dos vectores de expresión, o en tres vectores de expresión, respectivamente.

En otra modalidad preferida de la invención, la unidad de expresión comprende una o más secuencias de control de expresión en vertebrados que controlan la expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima RMD comprendida dentro de un primer polinucleótido, la -secuencia de ácido nucleico que codifica una glicosiltransferasa para GDP-D-ramnosa comprendida dentro de un segundo polinucleótido, y opcionalmente la secuencia de ácido nucleico que codifica un transportador de nucleótido del GDP-azúcar desoxihexosa para GDP-D-ramnosa dentro de un tercer polinucleótido, en donde el primer, segundo y opcionalmente tercer polinucleótido son separados unos de otros por un IRES, preferiblemente comprendido en un vector de expresión.

La unidad de expresión de conformidad con el séptimo aspecto de la invención también se puede usar en medicina, en particular en la preparación de una vacuna para terapia o profilaxis de enfermedades que se . benefician de estimulación inmunológica , en particular tumores.

Además, en el contexto del séptimo aspecto, todas las modalidades preferidas y particularmente preferidas del primer aspecto de la invención, en particular en relación con los polinucleótidos que comprenden varios ácido nucleicos que han de ser expresados, elementos de control de expresión, v.gr., que impulsan la expresión moderada a baja de la enzima que usa GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa, son igualmente preferidas en el contexto del séptimo aspecto.

En muchos casos, las compañías biofarmacéuticas han utilizado un tiempo considerable y han hecho un gran esfuerzo para generar y desarrollar líneas de células productoras de agentes farmacéuticos que expresan el transgén de interés a niveles deseables. En casos en donde el transgén de interés es un anticuerpo terapéutico que podría beneficiarse de la función de ADCC incrementada, es altamente deseable manipular adicionalmente la línea de células productoras de tal manera que la célula productora alta sea incapaz de unir el núcleo de la fucosa a las porciones N-glico o es capaz de unir azúcares artificiales a las porciones N-glico.

Preferiblemente, como ya se mencionó antes, la unidad de expresión además comprende un segundo polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una glicosiltransferasa para GDP-D-ramnosa, GDP-D-perosamina, GDP-desoxi-D-talosa, GDP-6-desoxi-D-altrosa, GDP-4-ceto-3, 6-didesoxi-D-manosa o GDP-L-colitosa, y opcionalmente- un tercer polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un transportador de nucleótido del GDP-azúcar desoxihexosa para GDP-D-ramnosa, GDP-D-perosamina, GDP-desoxi-D-talosa, GDP-6-desoxi-D-altrosa, GDP-4-ceto-3, 6-didesoxi-D-manosa o GDP-L-colitosa. Se prefiere que el segundo polinucleótido which comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una glicosiltransferasa para GDP-D-ramnosa, GDP-D-perosamina, GDP-desoxi-D-talosa, GDP-6-desoxi-D-altrosa, GDP-4-ceto-3, 6-didesoxi-D-manosa o GDP-L-colitosa está operablemente enlazada a una o más secuencias de control de expresión en vertebrados para permitir la expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica dicha glicosiltransferasa en la célula de vertebrado, v.gr. , célula HeLa o CHO. También se prefiere que el tercer polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico' que codifica un transportador de nucleótido del GDP-ázúcar desoxihexosa para GDP-D-ramnosa , GDP-D-perosamina, GDP-desoxi-D-talosa, GDP-6-desoxi-D-altrosa, GDP- -ceto-3 , ß-didesoxi-D-manosa o GDP-L-colitosa sea operablemente enlazado a una o más secuencias de control de expresión en vertebrados para permitir la expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica dicho transportador de nucleótido del GDP-azúcar desoxihexosa en la célula de vertebrado, v.gr., célula HeLa o CHO.

La relación de la expresión de las diferentes secuencias de ácido nucleico una a otra depende tanto del número de copias como del sitio de integración en el genoma de la célula de vertebrado. Por medio de los procesos de determinación selectiva estándar, es posible aislar clones de células que expresan los productos de gen individuales en la relación deseada.

Dicha unidad de expresión preferida se puede aplicar fácilmente a lineas de células ya existentes (v.gr., CHO, HeLa) de una manera que las hace capaces de unirse a otros azúcares artificiales que la fucosa (v.gr., D-ramnosa, D-perosamina, . desoxi-D-talosa o ß-desoxi-D-altrosa) a glicoestructuras nacientes de glicoproteinas o glicolipidos . Esta unidad de expresión también se puede aplicar fácilmente a lineas de células ya genéticamente manipuladas (v.gr., CHO IgGl) en una forma que los hace capaces a unirse a otros azúcares artificiales que la fucosa (v.gr., D-ramnosa) a glicoest ucturas nacientes de glicoproteinas, v.gr., a fin de producir anticuerpos que tienen una estructura de glicosilación artificial, tal como IgGl/+D-ramnosa .

Preferiblemente, la unidad de expresión comprende un polinucleótido adicional (ya sea como un segundo, tercer, o cuarto polinucleótido) que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteina de interés, v.gr., IgGl. Se prefiere que el polinucleótido adicional, que comprende un ácido nucleico que codifica una proteina de interés, v.gr., IgGl, es operablemente enlazada a secuencias de control de expresión que permiten la expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica dicha proteina en una célula de vertebrado, v.gr., célula HeLa o CHO.

En el contexto de la unidad de expresión del séptimo aspecto de la presente invención, todos los elementos, preferiblemente ácidos nucleicos que codifican enzima, elementos de control de expresión, secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima, que usa GDP-6-desoxi-D-lixo- -hexulosa como sustrato y en donde la enzima no cataliza la reacción que convierte GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa a GDP-L-fucosa, enseñada en el primer y segundo aspectos de la invención son similarmente preferidos.

En un octavo aspecto, la presente invención se refiere a una célula eucariótica (modificada) para producir una proteina, que normalmente comprende fucosa en sus porciones glico, que carece de fucosa o que tiene una cantidad reducida de fucosa en sus porciones glico que comprende : i) un primer polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima que usa GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa como sustrato, y ii) un segundo polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteina, en donde la enzima no cataliza la reacción que convierte GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa a GDP-L-fucosa .

En el contexto de la célula eucariótica todas las modalidades preferidas y particularmente preferidas previamente descritas en el contexto de la célula de vertebrado del primer aspecto de la invención son similarmente preferidas.

Preferiblemente, la célula eucariótica es un vertebrado, v.gr. , una célula de mamífero, pez, anfibio, reptil o de ave, preferiblemente como se delineó antes con respecto del primer aspecto de la invención, o una célula de insecto. Las células de insecto, v.gr., células Sf9 o Hi5, usadas junto con el sistema de expresión de baculovirus son preferidos ¦ para producir glicoproteinas debido a altos rendimientos y velocidad. Sin embargo, glicoproteinas de células de insecto pueden contener alfa 1,3-fucosa de núcleo. El residuo de azúcar contribuye en un grado mayor a anticuerpos contra glicoproteinas derivadas de insecto, en particular anticuerpos IgE. Son la base de reacciones alérgicas a glicoproteinas de insecto.

Las células de insecto que comprenden por lo menos una enzima que usa GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa como sustrato, en donde la enzima no cataliza la reacción que convierte GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa a GDP-L-fucosa carecerán de fucosa o tendrán fucosa reducida en sus glicanos. Esto reducirá o eliminará reacciones alérgicas a dichas glioproteinas .

Las células eucarióticas antes mencionadas (modificadas) también pueden comprender más de un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima que usa GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa como sustrato, v.gr., polinucleótidos que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican diferentes enzimas que usan GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa como sustrato (véase el primer aspecto de la presente invención) .

En un noveno aspecto, la presente invención se refiere a un método para producir una proteina, que normalmente comprende fucosa en sus porciones glico, que -carece de fucosa o con una cantidad reducida de fucosa en sus porciones glico que comprende los pasos de: i) proveer una célula eucariótica de conformidad con el octavo aspecto, ii) expresar la enzima codificada por el primer polinucleótido y la proteina codificada por el segundo polinucleótido en dicha célula, y iii) aislar la proteina de dicha célula.

En el contexto del método que usa la célula eucariótica de la presente invención, todas las modalidades preferidas y particularmente preferidas anteriormente descritas en el contexto de la célula de vertebrado del primer aspecto de la invención y el método del Segundo aspecto de la presente invención son similarmente preferidas en el contexto del noveno aspecto de la invención.

En un décimo aspecto, la presente invención se refiere a proteínas que carecen de fucosa que tienen una cantidad reducida de fucosa en sus porciones glico obtenible por el método del noveno aspecto.

Varias modificaciones y variaciones de la invención serán evidentes para los expertos en la técnica sin apartarse del alcance de invención. Aunque la invención se ha descrito en conexión con modalidades preferidas especificas, cabe entender que la invención, como se reivindica, no debe ser inadecuadamente limitada a dichas modalidades especificas. De hecho, se pretende que varias modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención que son obvias para los expertos en la técnica en los campos pertinentes sean cubiertas por la presente invención.

Las siguientes figuras y ejemplos son simplemente ilustrativos de la presente invención y no deben considerarse como limitantes del alcance de la invención como lo indican las reivindicaciones anexas en cualquier forma.

Breve descripción de los dibujos La figura 1 muestra una vista general de las vías de ahorro y de novo de fucosa en células eucarióticas (v.gr., vertrebrate células). En ausencia de fucosa, las células son incapaces de sintetizar GDP-fucosa mediante la vía de ahorro (véase panel de mano derecha) . La via de novo puede ser bloqueada por conversión enzimática del intermediario GDP-4-ceto-6-desoximanosa en un producto final muerto que típicamente no ocurre en células de vertebrado (panel de mano izquierda) . Si la enzima de desviación es R D, por ejemplo, entonces el producto final muerto es GDP-D-ramnosa . GDP-desoxihexosas tales como GDP-D-ramnosa pueden ejercer una inhibición de retroalimentación sobre la enzima GMD bloquando asi además la vía ce novo de fucosa asi como la síntesis de GDP-ramnosa alterna. ¦ La figura 2 muestra GFP-fluorescencia de células RMD-CHO-IgG que establemente sobreexpresan el transgén de RMD.

La figura 3 muestra un análisis de RT-PCR de clones que expresan el transgén de RMD. Franja M= bp-ADN-Marcador , Franja 1: clon 1 de RMD-CHO-IgG; Franja 2: clon 2 de RMD-CHO-IgG; Franja 3: clon 3 de RMD-CHO-IgG; Franja 4: clon 4 de RMD-CHO-IgG; Franja 5: clon 5 de RMD-CHO-IgG; Franja 6: clon 6 de RMD-CHO-IgG; Franja 7: clon progenitor de CHO-IgG; Franja 8: control de PCR negativo. La banda de RMD es visible en todos los clones RMD-tranfectados .

La figura 4 muestra una .comparación sinóptica de perfiles de MALDI MS de N-glicanos permetilados liberados de IgGl de células CHO-IgG (B) y RMD-CHO-IgG (A) . Los oligosacáridos de anticuerpo Fe liberados por digestión con PNGasa F fueron analizados usando un espectrómetro de masa UltraFlex III TOF/TOF equipado con un láser smartbeam-II™. Los picos del valor de m/z corresponden al ion de oligosacárido asociado a sodio. Todas las señales de ion molecular [M + Na]+ marcadas podrían ser asignadas como se indica. Un desplazamiento de 164 Da de los picos de m/z -mayores en el espectro de MALDI mostrados en el panel A es indicativo de la pérdida de fucosa. La estructura de oligosacárido esquemática de cada pico se ilustra arriba de cada pico indicado. Las N-Glicoestructuras obtenidas de un anticuerpo IgGl terapéutico expresado en células RMD-CHO-IgG que establemente sobreexpresan el transgén de RMD son completamente carentes de residuos de fucosa unidos y contienen una cantidad comparativamente más grande de estructuras con . alto contenido de mañosa basadas en intensidades de pico de MALDI (Panel A; estructuras con alto contenido de mañosa prominentes) mientras que las N-Glicoestructuras obtenidas de un anticuerpo IgGl terapéutico expresado en las células progenitoras de CHO-IgG no modificadas son núcleo-fucosiladas y contienen cantidades significativamente más bajas de estructuras con alto contenido de mañosa. (Residuos de fucosa = triángulos negros encerrados en circulo; Panel B) .

La figura 5 muestra un espectro de ALDI-TOF de N-glicanos de IgG desililatados producidos usando (A) células WT CHO; (B) clon Hl de RMD-CHO; (C) clon H2 de RMD-CHO; (D) clon H3 de RMD-CHO. Todos los iones moleculares están presentes ya sea en forma sodiada [M+Na+] o potasiada [M+K+] (cruz negra) . Circulo gris oscuro, Man; Circulo gris claro, Gal; cuadro negro, GlcNAc; triángulo negro, Fue; cruz blanca, no contienen algún material de carbohidrato.

La figura 6 muestra en (A) curvas de unión de FcgRIIIa-His (Phel58) a WT IgG y IgG afucosilada en ausencia de plasma. La unión a FcyRIIIa fue detectada por una ELISA usando FcyRIIIa-His como un reactivo de captura, anticuerpo conjugado a IgG peroxidasa anti-humano y tetrametilbenzidina (TMB) como un sustrato cromogénico. Los puntos indican la absorción media de TMB que reaccionó con peroxidasa a 450 nm, n=2. Las barras indican D.E. Circuios abiertos = IgG fucosilada de tipo silvestre (WT), circuios cerrados = IgG afucosilada derivada de clon Hl (Hl); cuadros cerrados = IgG afucosilada derivada de clon H2 (H2); triángulos cerrados apuntando hacia arriba = IgG afucosilada derivada de clon H3 (H3). Se muestra en (B) incremento de pliegue relativo en unión a FcyRIII de IgG afucosilada sobre IgG WT . El incremento de pliegue relativo en unión a FcyRIII se calculó a partir de los valores de EC50. WT, IgG fucosilada de tipo silvestre; Hl, IgG afucosilada derivada de clon Hl; H2, IgG afucosilada derivada de clon H2; H3, IgG afucosilada derivada de clon H3.

La figura 7 muestra la preparación y análisis de células NK para pruebas de actividad de ADCC. (A) Gráfica de puntos que muestra el nivel de pureza de las células NK primarias aisladas usadas en las pruebas de ADCC. Las células NK primarias se aislaron de sangre entera de un donador humano sano por separación de cuentas magnéticas. Las células NK aisladas se analizaron después para pureza por citometria de flujo usando anticuerpos contra los marcadores de células N CD16 y CD56. (B) Rendimiento de las células NK aisladas. A fin de determinar la actividad citoliticca de las células NK aisladas, las células objetivo K562 teñidas con calceina AM se incubaron ya sean solas, con células NK o con el agente de lisis de células saponina durante 4 hr. La intensidad de fluorescencia media (MFI) liberada de las células objetivo incubadas indirectamente indica el grado de lisis celular. El MFI observado para lisis de células mediada por NK sustraído del MFI obtenido para lisis de células espontánea indica el máximo posible especifico para MFI que ha de ser observado en la prueba de ADCC . Cabe notar que la lisis mediada por NK no alcanza completamente el nivel de MFI obtenido de lisis total.

La figura 8 muestra actividad de ADCC in vitro de IgG afucosilaada y fucosilada derivada de CHO y RMD-CHO. Los puntos indican lisis celular especifica media (%) a una concentración de IgG dada (%), n=4 ; las barras indican +/-D.E., IgG de tipo silvestre (cuadros abiertos), IgG afucosilada derivada de clon Hl (circuios cerrados), IgG afucosilada derivada de clon H2 (triángulo cerrado que apunta hacia abajo) y IgG afucosilada derivada de clon H3 (triángulo cerrado que apunta hacia arriba) . Los datos comparables se obtuvieron cuando se usaron células SK-BR-3 como células objetivo (no se muestran datos) .

La figura 9 muestra un perfil de HPAEC-PAD de monosacáridos hidrolizados de la fracción citosólica de (A) células CHO no modificadas y (C) clon H2 de RMD-CHO. (B) , (A) salpicado con 10 pmol/µ? de L-ramnosa y (D), (C) salpicado con 10 pmol/µ? de L-ramnosa. Como los monosacáridos no fueron re-N-acetilados después de la hidrólisis de TFA, GlcNAc se midió como GlcNH2. Bajo las condiciones seleccionadas, el pico de L-ramnosa se eluye en un tiempo de retención de aproximadamente 15.5 minutos. Cabe notar la ausencia del pico de fucosa de los cromatogramas HPAEC-PAD del lisado delular del clon H2 modificado.

La figura 10 muestra un perfil de HPAEC-PAD de monosacáridos liberados de IgG N-glicanos de (A) , WT CHO y (C), el clon H2 de RMD-CHO modificado, (B) , (A) salpicado con 10 pmol/µ? de L-ramnosa y (D) , (C) salpicado con 10 pmol/µ? de L-ramnosa. Como los monosacáridos no fueron re-N-acetilados después de la hidrólisis de TFA, GlcNAc se midió como GlcNH2. Bajo las condiciones seleccionadas, el pico de L-ramnosa se eluye en un tiempo de retención de aproximadamente 15.5 minutos. Cabe notar la ausencia del pico de fucosa de los cromatogramas HPAEC-PAD de la muestra de N-glicano de IgG derivada de clon H2 de RMD-CHO.

Ej emplos 1. Parte experimental 1.1 Materiales y métodos 1.1.1 Lineas de células La linea de células CHO/DG44 recombinante CHO-IgG se estableció anteriormente en el laboratorio de los inventores de la presente por transfección estable de la linea de células CHO deficiente en dihidrofolato reductasa, CHO/DG44 (Urlaub et al., 1986, Proc Nati Acad Sci USA. 83 (2): 337-341) con un vector de expresión que contiene un cásete de expresión de anticuerpo que comprende secuencias de nucleótido que codifican cadena ligera y pesada de un anticuerpo monoclonal terapéutico (Trastuzumab (Herceptin®) ) . La generación de la linea de células RMD-CHO-IgG empezó a partir de la linea de células CHO-IgG existente. Ambas lineas de células se mantuvieron en un medio libre de suero. 1.1.2 Optimización y síntesis de gen La secuencia de aminoácidos para la oxidoreductasa Rmd (Pseudomonas aeruginosa PAOl; 304 aminoácidos) (GenBank Acceso No. GenBank: AAG08839.1) se tradujo en reversa y la secuencia de nucleótidos resultante fue optimizada por privación de sitios de empalme críptico y elementos de secuencia desestabili zadora de ARN, optimización para ' estabilidad de ARN incrementada y adaptación de uso de codón para concordar con los requerimientos de células CHO (Cricetulus griseus) . 1.1.3 Construcción del plásmido de expresión de RMD El constructo de RMD sintetizado se cortó con EcoRI y Bgl II y se desfosforiló con fosfatasa intestinal de ternera. El inserto digerido y desfosforilado fue ligado en un vector de expresión bicistrónico pre-digerido que permite la co-expresión coordinada de RMD y proteina fluorescente verde a partir de un mensaje bicistrónico (gfp) . El plásmido-de expresión es equipado con un gen de resistencia a neomicina que permite la selección directa de células que han integrado establemente el cásete de expresión bicistrónico. Los procedimientos generales para construir plásmidos de expresión se describen en Sambrook, J., E.F. Fritsch y T. Maniatis: Cloning I/II/HI, A Laboratory Manual New York/Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, segunda edición. 1.1.4 Conversión de células CHO-IgG productoras de anticuerpo en células que secretan anticuerpos no fucosilados Las células CHO-IgG que expresan establemente el anticuerpo terapéutico de tipo IgGl Trastuzumab fueron establemente transíectadas con el transgén de RMD-gfp por electroporación de conformidad con las instrucciones del fabricante (MicroPorator, PEQLAB Biotech, Alemania) . 24 hr después de la electroporación, los transíec'tantes se seleccionaron en alfa-MEM que contenia el antibiótico G418. Los clones resistentes a G418 después se aislaron por clonación de dilución limitante, es decir, fueron resuspendidos en e?jte medio selectivo y sembrados en flacas de 96 pozos a diluciones en donde la probabilidad de obtener una colonia a partir de una sola célula es mayor que 95% con base en estadísticas de Poisson. Para asegurar monoclonalidad, las células que crecieron dentro de los 96 pozos se aislaron y nuevamente se sembraron en placas de 96 pozos a dilución limitante. Después de estas dos rondas de clonación de células individuales, un par de los clones de células individuales aislados se expandieron en volúmenes más grandes. Posteriormente, se adaptaron para crecer en suspensión. Usando el protocolo de electroporación descrito, una eficiencia de transformación de aproximadamente 2000 por 2 x 106 células electroporadas se logró como se evaluó a partir de distribución de fluorescencia gfp en las cajas de cultivo (figura 2) . 1.1.5 Determinación selectiva de clon por microscopía de fluorescencia Clones de células individuales se sembraron en placas de 96 pozos y se determinaron selectivamente para integración de RMD exitosa al monitorear fluorescencia de GFP con un Olympus IX-50 (Olympus Optical Co., Europe) equipado con un adaptador de cantidad. Para escudriñamiento de GFP, un filtro de fluorescencia a extensión de 200 veces se usó versus contraste de fase. Las imágenes fueron editadas por aplicación de Viewfmder lite. Además, la expresión de ARNm del transgén de RMD fue confirmada por análisis de RT-PCR. La expresión exitosa del transgén de RMD fue confirmada por RT-PCR usando un conjunto de cebadores específicos de RMD ( figura 3 ) . 1.1.6 Producción de IgGl no modificada y glico-genéticamente manipulada por cultivo intermitente libre de suero en tubos con agitador A fin de comparar las glicoestructuras de anticuerpos producidas por clones productores de. CHO modificados por RMD (RMD-CHO-IgG) con la glicoestructura de anticuerpos de tipo IgGl secretados a partir de células productoras de anticuerpo de CHO no modificadas (CHO-IgG) , ambas líneas de células se usaron para producir anticuerpos IgGl en el sobrenadante del cultivo. Clones productores de anticuerpo RMD-CHO-IgG y CHO-IgG fueron inoculados a 2 x 10s células/ml en un medio de crecimiento deficiente en fucosa. Los tubos con agitador se incubaron a 180 rpm, 37 °C, 7.5% pC02. El cultivo se detuvo después de 7 días cuando las células aún mostraban 'una vitalidad > 80%. La densidad de células viables se midió con un contador de células automático, Vi-CELL™ XR (Beckman Coulter, Fullerton, CA) , usando exclusión con azul de tripano. El patrón de declininación de viabilidad con la duración de la prueba intermitente de alimentación asi como la productividad especifica promedio (qp) entre días 3 y 10 de la prueba de agitador intermitente con alimentación permaneció comparable entre los dos clones diferentes. Las células después se comprimieron por centrifugación durante 10' a 5000 rpm y el sobrenadante fue transferido a un frasco separado. RMD-CHO IgG y células CHOIgG no modificadas se cultivaron de manera similar. La concentración de anticuerpo en los sobrenadantes de cultivo se midió en la estación de trabajo Gyrolab (Gyros AB, Suecia) por un inmunoensayo intercalado específico para IgGl humana. Ambos clones crecieron logarítmicamente, dieron títulos de IgG comparativos en las fechas de muestreo respectivas y tuvieron un tiempo de duplicación inicial comparativo. Ambos clones retuvieron la morfología típica de las células de ovario de hámster chino. 1.1.7 Purificación de IgGl por cromatografía de afinidad de proteína A Después de la filtración de esterilización por un filtro de 0.2 um, el sobrenadante se cargó en una mini-columna de Proteína-A-Sefarosa . 0.5 mi de material de soporte de columna con una capacidad total de 10 mq se usaron. La columna fue equilibrada con 5 volúmenes de columna de 20 mM de fosfato de sodio, pH 7.0 a flujo por gravedad. Después de la unión a proteina a una velocidad de flujo lenta, la columna se lavó dos veces con el regulador de pH de equilibrio. Después, el anticuerpo se eluyó con 4 volúmenes de columna 0.1 M de regulador de pH de glicina, pH 3.0 a flujo por gravedad. Las fracciones de 1 mi fueron recolectadas e inmediatamente neutralizadas con 1 M de Tris-HC1, pH 9. La integridad y pureza de cada IgGl purificada fue confirmada por análisis de SDS-PAGE reductor. La pureza fue > 90% y . la integridad de los anticuerpos eluidos fue confirmada por análisis de SDS-PAGE reductor. 1.1.8 Preparación de oligosacáridos N-enlazados derivados de anticuerpo 100 \iq de cada anticuerpo se usaron para caracterización espectrométrica de masa de oligosacáridos N-enlazados. Las proteínas fueron digeridas con tripsina (0:2 mg/ml, 16 hr, 37°C) antes de que los N-Glicanos fueran liberados por incubación con 1 unidad de péptido-N-glicosidasa F (PNGaseF, Roche Diagnostics) durante 18 hr a 37°C. Los N-glicanos liberados fueron recuperados por cromatografía de dos pasos en columnas RP-(Sep-Pak C18-) seguido por columnas limpias de extracto de carbógrafo (Wuhrer et al., 2006, Glycobiology 16 (2006), ??.' 991-1006). 50%. de cada acervo de Ñ-glicano fue digerido con 10 mU de Neuraminidasa 18 hr a 37 °C y 50% fue permetilado con yoduro de metilo como se describe por Ciucanu y Kerek (Ciucanu y Kerek, 1984, Carbohydr Res. 1984: 131: 209). 1.1.9 Análisis de oligosacáridos N-enlazados por MALDI-TOF-MS Los .N-glicanos liberados de cada IgGl purificada fueron analizados por un espectrómetro de masa UltraFlex III TOF/TOF (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemania) equipado con un láser smartbeam-II™. Las mediciones se llevaron a cabo en el modo de ion positivo. Los iones positivos fueron sometidos a un voltaje de aceleración de 25 kV y un retraso de extracción de 10 ns y analizados en un modo reflectrón. Para análisis, los glicanos desilalilatados se disolvieron en H20 y los glicanos permetilados se disolvieron en 70% (v/v) de acetonitrilo . 0.5 µ? de muestras se mezclaron 1:1 (v/v) con arabinosazona (2 mg/ml) disuelta en EtOH al 80% en un objetivo y se dejaron secar a temperatura ambiente. Se usó una calibración externa con una escalera de dextrano. Los espectros se analizaron usando Glyco-peakfinder (Maas et al., 2007, Proteomics 7, 4435-4444) . Las glicanoestructuras identificadas se construyeron con el software Glyco orkbench (Ceroni et al., 2008, J. Proteome Res. 7(4) 1650-1659). El análisis del perfil de oligosacárido de productos purificados a partir del medio de cultivo final confirmó que los oligosacáridos de Fe N-enlazados de los productos fueron de alto contenido de mañosa así como del tipo de complejo biantenario, y que el producto de IgGl secretado del clon RMD-CHO-IgG careció completamente de fucosilación del núcleo. El análisis de glicoestructura mostró que la relación de oligosacáridos no fucosilados de los anticuerpos producidos por los clones - que co-expresan RMD habían incrementado significativamente en 'cada caso (es decir, hasta 99%, 95%, 97% y 98%), comparado con los de clones CHO-IgG progenitores (figura' 4) . Las N-Glicoestructuras obtenidas del producto de anticuerpo IgGl expresadas en células RMD-CHO-IgG son casi completamente carentes de residuos de fucosa unidos y contienen una cantidad comparativamente más grande de estructuras con alto contenido de mañosa basadas en intensidades relativas de MALDI-Pico (figura 4, Panel A; estructuras con alto contenido de mañosa prominentes encerradas en círculo) , mientras que las N-Glicoestructuras obtenidas de un anticuerpo IgGl terapéutico expresado en células CHO-IgG no modificadas son núcleo-fucosiladas y contienen cantidades significativamente menores de estructuras con alto contenido de mañosa (Residuos de fucosa = triángulos encerrados en un círculo; figura 4, panel B) . 2. Parte experimental 2.2 Materiales y métodos 2.2.1 Lineas de células, optimización y síntesis de gen, construcción del plásmido de expresión de RMD, conversión de células CHO-IgG productoras de anticuerpo en células que secretan anticuerpos no fucosilados, determinación selectiva de clon por microscopía de fluorescencia y RT-PCR En cuanto a la línea de células CHO-IgG usada para producir la línea de células RMD-CHO- IgG, la optimización y síntesis de gen de RMD, la construcción del plásmido de expresión de RMD, la ' conversión de células CHO-IgG productoras de anticuerpo en células que secretan anticuerpos no fucosilados, determinación selctiva de clon por microscopía de fluorescencia para la integración de RMD exitosa y la RT-PCR para expresión de ARNm exitosa del transgén de RMD, se refiere a los puntos 1.1.1 a 1.1.5 como se mencionó antes (1. Parte experimental). 2.2.2 Cultivo intermitente alimentado IgG se produjeron usando tanto RMD CHO como RMD-CHO (clones Hl, H2 y H3) a fin de comparar sus estructuras de N-glicano. Las células se sembraron a 4 x 10s células/ml en matraces de agitación de 500 mi en 100 mi de medio libre de suero (formulación personalizada para ProBioGen; SAFC Bioscience, Lenexa, KA) complementado con 4 mM de glutamina pero sin antibióticos o MTX. Los cultivos se agitaron a 180 rpm en 37 °C y 7.5% de C02. Las células fueron alimentadas con 1.75 mi de PBG-Feed Mix por 100 mi de volumen de cultivo en el día 4 de cultivo. La densidad y viabilidad celular se determinaron por exclusión con azul de tripano usando un sistema de cuantificación de células ViCell automatizado (Beckman Coulter, Brea, CA) . Alícuotas de sobrenadante de cultivo de células se recolectaron los días 3, 5 y 7 para determinar las concentraciones de IgG, que se midieron por inmunoensayo intercalado de Gyrolab. El cultivo se detuvo después de 7 días cuando las células aún mostraban una vitalidad mayor que 80%. El sobrenadante del cultivo de células se recolectó y se filtró para esterilidad. 2.2.3 inmunoensayo intercalado de Gyrolab específico de IgGl La concentración de IgGl se determinó mediante un inmunoensayo intercalado realizado en una estación de trabajo Gyrolab (Gyros AB, Uppsala, Suecia) . El ensayo incluyó adición secuencial de anticuerpo de captura biotinilado, que reconoce epítopes en la parte Fe de IgG, muestras de sobrenadante de cultivo de células o estándar de referencia de IgG humano policlonal y un anticuerpo de detección marcado con Alexa Fluor 647, que se une a epítopes en el dominio Fab de IgG. Muestras y estándares se midieron por triplicado. La OD media, desviación estándar (D.E.), y % de coeficiente de variación (% CV) fueron calculados automáticamente por el software evaluador de Gyrolab después de cada operación. El inmunoensayo intercalado de Gyrolab de IgGl fue pre-validado con base en la premisa de que los residuos para cada estándar de calibración cumplieron con un limite de aceptación de 20% de error relativo (RE) . 2.2.4 Purificación de IgG usando cromatografía de afinidad de proteína A El sobrenadante de cultivo de células se cargó en una columna de 0.5 mi de Proteína A-Sefarosa, pre-equilibrada con 20 mM fosfato de sodio, pH 7.0. Después de lavar la columna con dos volúmenes de lecho de . regulador de pH de equilibrio, el- anticuerpo se eluyó con 4-volúmenes de columna, 0.1 M de glicina, pH 3.0. Las fracciones se recolectaron e inmediatamente se neutralizaron con 1 M de Tris-HCl, pH 9. La integridad y pureza de cada IgG purificada fue confirmada por análisis de SDS-PAGE reductor. La concentración de proteína de la IgG purificada se determinó por inmunoensayo intercalado de Gyrolab. 2'.2.5 Procesamiento de N-glicanos de IgG Las IgGs (100 g) fueron digeridas con tripsina durante 16 hr a 37 °C. La reacción se terminó calentando la muestra durante 5 min a 95°C. Los anticuerpos además fueron digeridos con 1 UPNGasa F durante 18 hr a 37°C. Los N-glicanos liberados se aislaron y desalaron en cartuchos Sep-Pak C18 de fase inversa seguidos por columnas limpias de extracto de carbógrago. Cada acervo de N-glicano fue digerido con 10 mU de Neuraminidasa 18 hr a 37°C. 2.2.6 Espectrometría de masa Los N-glicanos se analizaron en un espectrómetro de masa UltraFlex III TOF/TOF (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemania) equipado con un láser smartbeam-II™ y una instalación de LIFT-MS/MS . Los espectros se registraron en un modo de reflector a un voltaje de aceleración de 25 kV y un retraso de extracción de 10 ns . Las mediciones se llevaron a cabo en el modo de ion positivo. La calibración externa se realizó usando una escalera de dextrano. Los N-glicanos desialilatados se disolvieron en H20. 0.5 µ? de muestras se mezclaron 1:1 (v/v) con D-arabinosazona (5 mg/ml) disuelta en etanol acuoso al 70% en un objetivo de acero (Chen et al. 1997). Los espectros se analizaron usando Glyco-Peakfinder [Maas et al., 2007]. Las estructuras de glicano identificadas se construyeron con el software de estación de trabajo Glyco- [Ceroni et al . , 2008] . 2.2.7 Prueba de unión especifica de receptor de Fc-gamma IIIA (FcyRIIIA) La actividad de unión a FcyRIIIA de las muestras de IgG fue analizada por un ensayo de unión especifica de FcyRIIIA como se describe en Niwa et al., 2004 con ligeras modificaciones. Una FcyRIIIA con etiqueta de histidina (HIS) (F158) (22 kDa; 158F; R&D Systems, Minneapolis , M) se usó en combinación con un anticuerpo monoclonal anti-tetraHIS (Qiagen, Hilden, Alemania) para unión a receptor. Se revistieron inmunoplacas (Maxisorp, Thermo, Waltham, MA) con anticuerpo anti-tetraHIS y se bloqueó con reactivo bloqueador (Roche Diagnostics, Penzberg, Alemania) . Subsecuentemente, FcyRIIIA con etiqueta de HIS recombinante se añadió a las inmunoplacas. Las placas revestidas después se incubaron con diluciones de muestra en serie y controles para que pudieran unirse al receptor de FcyRIIIA inmovilizado. Después de un paso de lavado, las IgGs unidas fueron detectadas por un mAb conjugado a IgG peroxidasa anti-humana (Dianova, Hamburg, Alemania) y la cantidad de IgG unida se cuantificó mediante actividad de peroxidasa. Después de cada paso de incubación, la inmunoplaca se lavó 3 veces con PBS que contenia 0.2% de Tween-20. Se usó tetrametilbenzidina (TMB; Seramun, Heidesee, Alemania) como un sustrato cromogénico, la reacción se terminó usando ácido sulfúrico 1 M y finalmente, la absorción se detectó a 450 nm (Infinite F200 Reader, Tecan, Crailsheim, Alemania) . Con base en los datos de absorción dependientes de la concentración, se condujeron ajustes de curva completos usando un modelo de curva logística de A parámetros (Magellan Software 6.1, Tecan) . La precisión intra-serial para esta prueba de unión a FcyRIIIA se determinó para estar dentro de 15% de CV. 2.2.8 Prueba de citotoxicidad dependiente de anticuerpo (ADCC) Células NK humanas primarias se aislaron de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs). Las PBMCs se separaron de sangre entera de donadores humanos sanos por centrifugación por gradiente de densidad y las células NK fueron subsecuentemente aisladas por separación de cuentas magnéticas negativas (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania) . La pureza de las células NK aisladas fue confirmado por citometría de flujo (CD16 conjugado a PE y anticuerpos CD56 conjugados a Alexa488, BD, San José, CA) . Las líneas de células BT-474 (Lasfargues et al.., 1978, carcinoma ductal invasivo de mama, humano, CLS Eppelheim, Alemania) y SK-BR-3 (Zabrecky ét al., 1991, adenocarcinoma de mama, humana, ATCC, Manassas, VA) se usaron como células objetivo. Ambas líneas de células fueron confirmadas positivas para el marcador Her2/neu por citometría de flujo (no se muestran datos) . Las líneas de células objetivo fueron revitalizadas de un banco de células de investigación 3 días antes de la inoculación.

La lisis de células objetivo de células NK dependientes de anticuerpo fueron cuantificadas por liberación de una tinción vital (Calcein AM, Life Technologies, Carlsbad, CA) . Las células objetivo se tiñeron de conformidad con el protocolo del fabricante y se sembraron a 2 x 104 células viables/pozo en 50 RPMI1640 (Life Technologies) + 10% FCS (Biochrom, Berlín, Alemania) en placas de microtitulación de 96 pozos. Diluciones seriales 1:3 de anticuerpos en RPMI1640 + 10%' de FCS se prepararon. 50 µ?/???? de cada dilución se obtuvo con pipeta con n = 3 y se pre-incubó con las células objetivo durante 30 min a 37°C antes de la inoculación de células NK. Al final de la pre-incubación del anticuerpo, las células efectoras se sembraron a una relación de efector a célula objetivo (E:T) de 5:1. Las placas fueron subsecuentemente centrifugadas a 200 g durante 3 min y se incubaron durante 4 hr a 37°C y 5% de C02. Para cada linea de células, un control de lisis de células objetivo espontáneo (sin células NK) , un control de lisis de células objetivo independiente de anticuerpo (con células NK) y un control de lisis de células objetivo total (inducido por saponina) fueron inducidos. La lisis total en los pozos de control fue inducida añadiendo 15 pL/pozo 0.1 mg/mL de saponina en RPMI1640 + 10% FCS 15 min antes del final del período de incubación. En todos los otros pozos, 15 pL, se añadieron RPMI1640 + 10% FCS. La liberación de calceína AM fue cuantificada por detección de fluorescencia en el sobrenadante de cultivo. Las placas fueron centrifugadas (150 g; 3 min) y 100-pL de sobrenadante de cada pozo fueron transferidos en una placa de fluorescencia negra de 96 pozos (Thermo) . La intensidad de fluorescencia media (MFI) fue detectada usando un lector Infinite F200 (Tecan, filtro de excitación/emisión de 485/535 nm) . El ajuste de curva se hizo usando un modelo de dosis- respuesta logistico de 4 parámetros (software Magellan, versión 6.1). La lisis de células especifica se calculó como sigue: La lisis de células especifica [%] = [MFI (muestra) -MFI (espontáneo) ]/ [MFI (total) - MFI (espontáneo)] x 100. Mientras que la MFI (muestra) es la intensidad de ¦fluorescencia media liberada por la lisis de células objetivo, MFI (espontáneo) es la liberación gradual del colorante fluorescente por las células objetivo, y MFI (total) es la intensidad de fluorescencia media obtenida después de la lisis de células objetivo total inducida por detergente. 2.2.9 Análisis de monosacárido y determinación de ramnosa Las células (3xl07) se separaron del sobrenadante por centrifugación a 100 g durante 5 min.

Estas fueron subsecuentemente lisadas por 3 'ciclos de congelamiento-descongelamiento. Las membranas celulares después se separaron de fracciones citosólicas a 21 000 g durante 30 min a 4°C. Los sobrenadantes del cultivo de células, membranas celulares, fracciones citosólicas asi como N-glicanos de IgG fueron hidrolozadas en TFA 2 N durante 4 hr a 100°C. Después de .la evaporación bajo atmósfera reducida, las muestras fueron analizadas por HPAEC-PAD en una columna PA-1 usando una Dionex ICS-3000 y se usó 2-desoxiribosa como el estándar interno. Los monosacáridos neutros se separaron por elución isocrática con 2.25 mM de NaOH. La adición de post-columna de 200 mM de NaOH permitió detección amperométrica . Puesto que HPAEC-PAD no permite asignación de identidad enantomérica (Horton, D. 2004), L-ramnosa se usó como' un estándar para determinar el tiempo de retención esperado para D-ramnosa. La LOD para ramnosa se determinó como se describe en el capitulo 6.3 de la guia tripartita armonizada con ICH para validación de procedimientos analíticos (ICHQ2 (Rl)). 2.3 Resultados 2.3.1 Expresión heteróloga del transgén de RMD Para evaluar los efectos de expresión del transgén de RMD sobre los niveles de fucosilación de- IgG secretada, un vector equipado con un cásete de expresión bicistrónico que comprende los genes para GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa reductasa (RMD) y proteína fluorescente verde (gfp) fue generado e introducido en un clon de CHO/DG44 que previamente habla sido genéticamente manipulado para sobreexpresión y secreción de una versión biosimilar del anticuerpo terapéutico de tipo IgG 1 Trastuzumab (Herceptin®, Roche) . Lós clones resistentes a G418 que expresan el transgén fueron identificados por su fluorescencia mediada por gfp y apareció dentro de . 2 semanas de transíección . Una eficiencia de transformación de aproximadamente 80% se logró mediante electroporación como se evalúa a partir de distribución de gfp-fluorescencia (no se muestran datos pero son comparables con los datos mostrados en la figura 2). La expresión exitosa del transgén de RMD fue confirmada por RT-PCR usando un conjunto de cebadores específicos de RMD (no se muestran datos pero son comparables con los datos mostrados en la figura 3). Las células CHO modificadas que expresan el transgén de. RMD se denominan RMD-CHO. 2.3.2 Cultivo intermitente con alimentación libre de suero de células CHO y RMD-CHO productoras de anticuerpo El cultivo intermitente con alimentación libre de suero del CHO progenitor no modificado y las células RMD-CHO transíectadas que producen IgG se llevó a cabo en tubos de biorreactor de 50 mi que contenían un medio de crecimiento deficiente en fucosa complementado con L-glutamina. Los tubos de biorreactor fueron inoculados a una densidad de células de inicio de 4 x 105 células/ml y después se incubaron a 180 rpm, 37 °C, 7.5% de pC02. ¦ El rendimiento de los cultivos intermitentes con alimentación se monitoreó durante 14 dias y se comparó lado a lado. El análisis comparativo de cultivos intermitentes alimentados en paraleló de células CHO y RMD-CHO no mostró desviaciones significativas durante el curso de 14 dias. Velocidades de duplicación iniciales, tasas de proliferación y títulos de IgG en las fechas de muestreo respectivas fueron congruentes para ambas líneas de células. Los dos clones retuvieron la morfología típica de células CHO. El patrón de viabilidad declinante sobre la duración de la prueba intermitente con alimentación así como la productividad específica promedio (qp) entre los días 3 y 10 de la prueba con agitador intermitente con alimentación permaneció comparable para los dos clones diferentes (no se muestran datos) . 2.3.3 Análisis de N-glicano de IgG prodúcida a partir de células CHO y RMD-CHO Células CHO y RMD-CHO se hicieron crecer en un cultivo intermitente. Tres diferentes clones de RMD-CHO que producían IgG se usaron, a saber Hl, H2 y H3. Las células fueron inoculadas a una densidad de célula inicial de 4x 105 células/mL y se hicieron crecer durante 7 días en tubos de biorreactor a 180 rpm, 37°C, 7.5% de pC02. Los sobrenadantes fueron cosechados el día 7 y las muestras de IgG fueron purificadas por cromatografía de afinidad de proteína A. La pureza e integridad de los anticuerpos eluidos fueron confirmados por SDS-PAGE reductor. N-glicanos, liberados usando PNGasa F, fueron desialilateados y subsecuentemente analizados por MALDI-TOF-MS . La cuantificación relativa de intensidades de señal de N-glicanos se realizó como se demostró anteriormente para dar resultados confiables cuando se compararon con métodos cromatográficos ( ada et al., 2007). Las estructuras de N-glicano con alto contenido de mañosa así como diantenarias de tipo complejo se detectaron en todas las muestras (figura 5) . Los N-gicanos diantenarios monofucosilados agalactosilados/monogalactosilados/ digalactosilados fueron las tres estructuras de N-glicano más abundantes encontradas en IgG de tipo silvestre ( T) (figura 5 A) . La presencia de fucosa del núcleo en esos picos, a saber a m/z 1485.4, 1647.4 y 1809.4, fue confirmada por MALDI-TOF/TOF. Un ion de fragmento de diagnóstico dHexiHexNAc2 se observó en cada espectro a m/z 592.8. En las muestras de IgG que se produjeron a partir de células RMD-CHO, sólo cantidades traza de fucosa se observaron (figura 5 B, C, D) que representan un máximo de 2% del acervo de N-glicano total (muestra H2). Simultáneamente, la muestra H2 contenía una cantidad más grande de estructuras con alto contenido de mañosa que IgG de WT . 2.3.4 Actividad de unión a IgGl-Fc de IgG producidas a partir de células CHO y RMD-CHO Puesto que la interacción comparativamente débil (Kd ~ 1 µ?) entre IgGl y su receptor de Fe cognado FcyRIIIa es uno de los factores principales que contribuyen a la función de unión a efector de ADCC (Sondermann et al., 2000), una prueba de unión a FcyRIIIa es una medida indirecta para predecir actividad de ADCC de muestras de anticuerpo monoclonal de IgGl. La unión a FcyRIIIa de IgG afucosilada secretada a partir de células RMD-CHO fue incrementada en gran medida con unión equivalente a ~ 16 veces menos proteina a FcyRIIIa-158F cuando se compara con IgG fucosilada secretada a partir de las células CHO de tipo silvestre (figura 6 A, B) . Los datos se reportan en la figura 6 B como número de veces de incremento relativo en unión de IgG afucosilada usando la IgG fucosilada como referencia. 2.3.5 Actividad de ADCC de IgG afucosilada producida usando células RMD-CHO Para analizar la actividad de ADCC, células NK aisladas y células objetivo que expresan HER2 fueron coincubadas con diluciones seriales de IgG afucosilada y fucosilada. Como un prerrequisito para la prueba, las células NK se aislaron de muestras de sangre entera a un nivel de pureaa de 73% (figura 7). El control de citotoxicidad de células K técnica mostró una actividad de lisis específica de 77% para el material donador usado para la prueba de ADCC (figura 7) . La línea de células objetivo que expresan HER2, BT-474 (aislada de un carcinoma ductal de mama invasivo humano) se usó en la prueba de ADCC. La línea de células objetivo BT-474 es también atacada por células NK por mecanismos distintos de ADCC. Las células BT-474 muestran un valor medio de .16% de lisis de células independientes de anticuerpo (no se muestran datos) . Los datos para lisis ' celular específica inducida por muestras de IgG son desplegados en la figura 8. Todas las tres muestras de IgG afucosilada (H1-H3) indujeron una respuesta de ADCC incrementada al anticuerpo de WT (figura 8). La muestra de IgG afucosilada H2 indujo la respuesta de ADCC más alta (figura 8). Resultados similares se obtuvieron cuando células SK-BR-3 (adenocarcinoma HER2-positivo de mama) se usaron como células objetivo en la prueba. Los valores de EC50 calculados para muestras de IgG afucosilada y fucosilada incubada con células BT-474 y SK-BR-3 se resumen en la tabla 2 (véase más adelante). El desplazamiento observado en EC50- entre IgG de tipo silvestre y las variantes Hl a H3 permanecieron comparables independientemente de la línea de células objetivo usada en la prueba de ADCC (figura 8). En la presencia de las líneas de células objetivo BT474 y SK-BR-3 HER2-positivas y células NK purificadas, la IgG afucosilada mostró' una actividad de agotamiento de células objetivo mediada por anticuerpo de 16 veces promedio con valores de EC50 promedio de 0.443 µg/ml y 0.00817 g/ml que indicó una eficacia mucho más alta comparada con IgG fucosilada. Cabe notar que las muestras de IgG afucosiladas que han mostrado una actividad de unión a FcyRIIIa incrementada también indujo una respuesta de ADCC más alta comparada con la IgG de WT .

Tabla 2: Resultados resumidos de la función efectora de ADCC de IgG afucosilada (Hl-3) y fucosilada (WT) incubada con diferentes células objetivo presentadoras de antigeno (BT-474, SK-BR-3). La relación EC50 ( fucosilada ) /EC50 (afucosilada) calculada indica la función 'efectora de ADCC incrementada . 2.3.6 Análisis de monosacárido - ausencia de cantidades detectables de D-ramnosa en lisados de células asi como en N-glicanos de IgG Membranas celulares, sobrenadantes de cultivo y fracciones citosólicas se aislaron de células RMD-CHO. Los monosacárídos fueron subsecuentemente liberados y analizados por HPAEC-PAD. Como se esperaba, la fucosa estaba presente en células CHO y no en células RMD-CHO. Un nivel de ramnosa que excedía el límite de detección (LOD) no se observó en las fracciones citosólicas (figura 9). Con base en la desviación estándar de intercepción y la pendiente de la curva de calibración, los LOD fueron 1.2 pmol y 1.1 pmol por 10 µ? de volumen de inyección de muestra para ramnosa y fucosa, respectivamente. De manera similar, los N-glicanos, liberados de anticuerpos purificados producidos usando células RMD-CHO, fueron hidrolizados con TFA y los monosacárídos resultantes fueron analizados por HPAEC-PAD. Los N-glicanos TFA-hidrolizados no produjeron ningún pico de ramnosa que excediera el LOD (figura 10). Para concluir, ni las células RMD-CHO ni los anticuerpos secretados contenían cantidades detectables de ramnosa. 2.4 Observaciones finales Los inventores de la presente evaluaron un enfoque glicomanipulado genéticamente para lograr secreción de mAbs deficiente en fucosa a partir de líneas de células que fueron modificadas para remoción continua de un intermediario metabólico clave de la vía de síntesis de novo de fucosa citosólica (figura 1). Los datos muestran claramente que una expresión transgénica de una enzima bacteriana heteróloga conduce al bloqueo deseado en la síntesis de fucosa en N-glicanos de glicoproteína naciente. El grado de agotamiento de fucosa por este método también indica que la omisión de fucosa del medio de cultivo fue suficiente para bloquear completamente la vía de ahorro, que de ora manera puede servir como una fuente alterna de GDP-fucosa citosólica.

El objetivo metabólico clave en el enfoque de los inventores de la presente fue GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa, que es un intermediario común para la síntesis de varias GDP-monodesoxihexosas diferentes incluyendo GDP-L-fucosa , GDP-4-desoxi-D-talosa , GDP-colitosa y GDP-D-perosamina , por ejemplo, en bacterias. Más aún, un mutante de sitio activo Cysl09Ser de GDP-fucosa sintasa produce GDP-6-desoxi-D-altrosa en lugar de GDP-fucosa (Lau y Tanner, 2008) .

La enzima procariótica específica que los inventores de la presente seleccionaron de manera ilustrativa para su enfoque fue GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa reductasa (sinónimo de GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa reductasa, abreviada RMD) (Kneidinger et al., 2001; Maki et al., 2002). Los inventores ' de la presente demostraron aquí que la expresión heteróloga de la enzima · procariótica GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa reductasa (RMD) dentro del citosol puede desviar eficientemente la vía de novo de la" fucosa. Dicha enzima utiliza NADH y NADPH como donadores de hidrógeno y cataliza la reducción dirigida del grupo 4-ceto del intermediario GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa de la vía de la fucosa para producir GDP-D-ramnosa . La conversión de GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa a GDP-D-ramnosa por RMD parece proceder cuantitativamente, porque no se ha detectado reacción de reversa (Kneidinger et al., 2001).

Los datos de los inventores de la presente también muestran que GDP-ramnosa, una 6-desoxihexosa encontrada sólo en glicocon ugados de ciertas bacteria pero no en animales (Webb et al., 2004), es un producto de extremo muerto dentro del contexto del citosol de vertebrados. Las células no modificadas de vertebrado carecen de ramnosiltransferasas (Webb et al., 2004) y los transportadores de membrana por lo que la incorporación de GDP-D-ramnosa en glicanos nacientes es muy poco probable dentro de las células de vertebrado. Los datos de los inventores de la presente podrían confirmar esto. Muestran claramente que la D-ramnosa artificial no fue incorporada en la IgG secretada o de' otra manera en la célula (figura 9 y figura 10).

Además de la falta de fucosa en estructuras de glucano, las IgGs secreteadas de los clones genéticamente manipulados mostraron un nivel más alto de estructuras con alto contenido de mañosa. Esto se puede originar de una inhibición de retroalimentación de GMD por GDP-D-ramnosa. La falta de actividad GMD como un sumidero metabólico alterno para GDP-manosa puede haber contribuido a un acervo elevado de GDP-D-manosa citosólica que a su vez puede haber causado la elevación de estructuras con alto contenido de mañosa observada en productos secretados a partir de células hospederas RMD-modificadas (figura 4 y figura 5).

Los resultados de los inventores de la presente para la prueba de unión a FcyRIII, asi como para prueba de ADCC in vitro también muestran que las IgGs afucosiladas tienen una actividad de unión significativamente más alta para FcyRIIIa y una respuesta de ADCC incrementada. El desplazamiento de EC50 observado y el número de veces de incremento en actividad de agotamiento de células objetivo (tabla 2, figura 8) habrían sido incluso más altos si la prueba se hubiera conducido en presencia de sangre entera, suero o plasma. De manera interesante, los inventores de la presente observaron que la muestra de IgG afucosilada H2 con el nivel más alto de estructuras con alto contenido de mañosa, también mostraron la actividad de ADCC más alta, independientemente de la célula objetivo usada en la prueba (BT474 o SK-BR-3) (tabla 2).

Tomado como un todo, este estudio demuestra que la sobreexpresión de RMD en células hospederas de vertebrado causa un agotamiento de un intermediario clave importante para la síntesis de GDP-fucosa citosólica, GDP- -ceto-6-desoxi-D-manosa . Este enfoque permite la generación de líneas de células metabólicamente manipuladas pero también ofrece una nueva estrategia altamente prometedora para convertir clones de células que expresan anticuerpo, existentes, en células productoras para agentes terapéuticos sin fucosa. La capacidad para diseñar confiablemente deficiencia de fucosa en lineas de células ya existentes puede ayudar a acelerar el desarrollo de fármaco para los anticuerpos monoclonales de la siguiente generación. 3. Abreviaturas ACN, acetonitrilo; CHO, ovario de hámster chino; CV, coeficiente de variación; dHex, desoxihexosa ; EC50, concentración media máxima efectiva (es decir, la concentración de agonista que provoca una respuesta a la mitad entre la linea basal y respuesta máxima) , Fue, fucosa; Gal, galactosa; GalNAc, N-acetilgalactosamina ; GlcNAc, N-acetilglucosamina; GMER, GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa-3, 5-epimerasa/ -reductasa ; HPLC, cromatografía de líquidos de alto rendimiento; HPAEC-PAD, cromatografía de intercambio de aniones a pH elevado con detección amperométrica pulsada; LOD límite de detección; mAb, anticuerpo monoclonal; MALDI-TOF-MS expectrometría de masa de ionización/desorción con láser asistida por matriz - tiempo de vuelo-; MEM, medio de Eagle modificado; PBMCs, mononuclear células de sangre periférica; PBS, solución salina reguladora de pH de fosfato; PNGasa F, péptido-N4- (N-acetil-^-glucosaminil) asparagina amidasa F; Rha, ramnosa; RMD, GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa reductasa; SDS, dodecil sulfato de sodio; TFA, ácido trifluoroacético .

Referencias Ceroni, A., Maass, K., Geyer, H., Geyer, R., Dell, A., Haslam, S.M. 2008. GlycoWorkbench : Una herramienta para la anotación asistida por . computadora de espectros de masa de glicanos, Journal of Proteome Research, 7 (4), 1650-1659.

Chen, P, Baker AG, Novotny MV. 1997. El uso de osazonas como matrices para la espectrometría de masa por desorción/ionización con láser asistida por matriz de carbohidratos. Anal Biochem. 244 ( 1 ) : 1 4 -51.

Horton, D 2004 Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry . D. Horton, Editor, Elsevier Academic Press, Amsterdam and San Diego, Vol. 59, p.ll.

ICH Q2(R1): Guía tripartita armonizada de ICH: validación de procedimientos analíticos: texto y metodología Q2(R1) paso actual 4 versión, guía original con fecha de 27 de octubre de 1994.

Kneidinger B, Graninger M, Adam G, Puchberger M, Kosma P, Zayni S, Messner P. 2001. Identificación de dos GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa reductasas que sintetizan GDP-D-ramnosa en Aneurinibacillus thermoaerophilus L420-91T. J Biol Chem. Feb 23;276 (8) :5577-83.

Lasfargues EY, Coutinho WG y Redfield ES. 1978.

Aislamiento de dos lineas de células epiteliales de tumor humano de carcinomas de mama sólidos. J Nati Cáncer Inst.; 61 (4) : 967-78.

Lau S.T.B., Tanner, M.E. 2008. Mecanismo y residuos de sitio activo de GDP-Fucosa sintasa, Journal of the American Chemical Society, vol. 130, no 51, p . 17593-17602 Maki M, Jarvinen N, Rabina J, Roos C, Maaheimo H, Renkonen R; Pirkko; Mattila. 2002. Expresión funcional de GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa reductasa de Pseudomonas aeruginosa que sintetiza GDP-ramnosa. 'Eur J Biochem. Jan; 269(2) :593-601.

Niwa R, Shoji-Hosaka E, Sakurada M, Shinkawa T, Uchida K, Nakamura K, Matsushima K, Ueda R, Hanai N, Shitara K .2004. Receptor 4 IgGl de quimiocina anti-CC desfucosilada con actividad terapéutica potente de muestra de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo mejorada a leucemia .y linfoma de células T. Cáncer Res, 64:2127-2133.

Niwa R, Hatanaka S, Shoji-Hosaka E, Sakurada M, Kohayashi Y, Uehara A, Yokoi H, Nakamura K, Shitara K. 2004. Mejoramiento de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo de IgGl baja en fucosa es independiente de polimorfismo funcional de FcgammaRIIIa . Clin Cáncer Res, 10: 6248-6255.

Shields RL, Lai J, Keck R, O'Connell LY, Hong K, Meng YG, Weikert SH, Presta LG. 2002. Carencia de fucosa en oligosacárido N-enlazado a IgGl humana mejora la unión a FcgammaRIII humano y toxicidad celular dependiente de anticuerpo. J Biol Chem, 277:26733-26740.

Sondermann, P., Huber, R., Oosthuizen, V., y Jacob, U. 2000. La estructura de cristal 3.2-A del complejo IgGl fragmento de Fc - Fc gammaRIII humano. Nature 406, 267-273.

Urlaub G, Kas E, Carothers AM, Chasin LA. Deleción del locus de dihidrofolato reductasa diploide de células de mamífero cultivadas. Cell. 1983 Jun; 33 (2 ): 05-12.

Urlaub G, Mitchell PJ, Kas E, Chasin LA, Funanage VL, Myoda TT, Hamlin J. 1986. Efecto de rayos gamma en el locus de dihidrofolato reductasa: deleciones e inversiones.

Somatic Cell Mol Genet, 12:555-556. ada, Y.; Azadi, P. ; Costello, C. E . ; Dell, A. ; Dwek, R. A.; Geyer, H. ; Geyer, R. ; Kakehi, K. Karlsson, N.

G.; Kato, K.; Kawasaki, N . ; Khoo, K. H . ; Kim, S . ; Kondo, A.; Lattova, E.; Mechref, Y.; Miyoshi, E . ; Nakamura, K. ; Narimatsu, H.; Novotny, M. V.; Packer, N. H.; Perreault, H.; Peter-Katalinic, J. ; Pohlentz, G.; Reinhold, V. N.; Rudd, P. M . ; Suzuki, A.; Taniguchi, N. 2007. Comparación de los métodos para determinar el perfil de glicanos de glicoproteína - Estudio multi-institucional de iniciativas sobre glicómica/proteoma de enfermedad humana HUPO.

Glycobiology; 17 ( ) : 411-22.

Webb NA, Mulichak AM, Lam JS, Rocchetta HL, Garavito RM. 2004. Estructura de cristal de una GDP-D-manosa 4 , 6-deshidratasa tetramérica de una vía biosintética de GDP-D-ramnosa bacteriana. Protein Sci. Feb; 13 (2) : 529-39.

Zabrecky JR, Lam T, McKenzie SJ y Carney . 1991. El dominio extracelular de pl85/neu es liberado de la superficie de células de carcinoma de mama humano, SK-BR-3. J Biol Chem.; 266(3): 17 6-20.

INDICACIONES. RELACIONADAS CON MICROORGANISMO U OTRO MATERIAL BIOLOGICO DEPOSITADO (Regla 3bis del PCT) A. Las indicaciones hechas a continuación se relacionan con el microorganismo u otro material biológico depositado referido en la descripción en la página 24 , linea 4 a 14 .

B. IDENTIFICACION DEL DEPOSITO Depósitos adicionales son identificados en una hoja adicional ? Nombre de la institución depositaría ? DSMZ- Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Dirección de la institución depositaría {incluyendo código postal y país) Mascheroder Weg 1 b 38124 Braunsch veig DE La linea de células AGEl .HN (NC5TI 1 #34) se deriva de una región neural periventricular de un feto humano (H sapiens). Esta línea de células es inmortalizada por integración y expresión estables de proteínas El A y E l B de adenovirus.

D. ESTADOS DESIGNADOS PARA LOS CUALES SE HACEN INDICACIONES (si las indicaciones no son para todos los estados designados) E. PRESENTACION DE INDICACIONES POR SEPARADO (dejar en blanco si no es aplicable) Las indicaciones listadas a continuación serán presentadas ante la Oficina Internacional posteriormente (especifique la naturaleza general de las indicaciones, v.gr, "Número de Acceso de Depósito ") Forma PCT/RO/134 (julio de 1998; reimpresa en enero de 2004) INDICACIONES RELACIONADAS CON MICROORGANISMO U OTRO MATERIAL BIOLOGICO DEPOSITADO (Regla 136/5 del PCT) A. Las indicaciones hechas a continuación se relacionan con el microorganismo u otro material biológico depositado referido en la descripción en la página_24_, linea 4 a 14 , B. IDENTIFICACION DEL DEPOSITO Depósitos adicionales son identificados en una hoja adicional ? Nombre de la institución depositaría DSMZ- Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Dirección de la institución depositaría (incluyendo código postal y país) Mascheroder Weg I b 38124 Braunschweig DE La línea de células AGEI .CR.PIX( 17a 1 I b) se deriva de células de retina embrionaria de patos muscovitas (Cairina moschata). Esta línea de células es inmortalizada por integración y expresión estables de proteínas El A y El B de adenovirus.

D. ESTADOS DESIGNADOS PARA LOS CUALES SE HACEN INDICACIONES (si las indicaciones no son para lodos los estados designados) E. PRESENTACION DE INDICACIONES POR SEPARADO (dejar en blanco si no es aplicable) Las indicaciones listadas a continuación serán presentadas ante la Oficina Internacional posteriormente (especifique la naturaleza general de las indicaciones, v.gr., "Número de Acceso de Depósito ") Forma PCT/RO/134 (julio de 1998; reimpresa en enero de 2004)

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Una célula de vertebrado para producir una molécula, que naturalmente comprende fucosa en sus porciones glico, que carece de fucosa o con una cantidad reducida de fucosa en sus porciones glico que comprende por lo menos una enzima que usa GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa como sustrato, en donde la enzima no cataliza la reacción que convierte GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa a GDP-L-fucosa. 2. La célula de vertebrado de conformidad con la reivindicación 1, en donde la enzima que usa GDP-6-desoxi-D-lixo- -héxulosa como sustrato se selecciona del grupo que consiste de GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa reductasa (RMD) , GDP-perosamina sintetasa (Per), GDP-6-desoxi-D-talosa sintetasa (GTS) , GDP-Fucosa sintetasa Cysl 09Ser-mutante de (GFS-Cysl09Ser) , GDP- -ceto-6-desoximanosa-3-deshidratasa (ColD) , preferiblemente GDP-4-ceto-6-desoximanosa-3-deshidratasa (ColD) en combinación con GDP-L-colitosa sintasa (ColC) , y variantes de las mismas. 3. La célula de vertebrado de conformidad con la reivindicación 2, en donde la GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa reductasa (RMD) es de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO: 1) . . La célula de vertebrado de conformidad con las reivindicaciones 1 a 3, que además comprende GDP-D-ramnosa, GDP-D-perosamina, GDP-desoxi-D-talosa, GDP-6-desoxi-D-altrosa, GDP- -ceto-3 , 6-didesoxi-D-manosa , y/o GDP-L-colitosa . 5. La célula de vertebrado de conformidad con las reivindicaciones l a 4, en donde la enzima es expresada a partir de un ácido nucleico transitoriamente presente o establemente mantenida en dicha célula. 5. La célula de vertebrado de conformidad con las reivindicaciones 1 a 5, en donde la célula además comprende por lo menos una molécula que es capaz de ser un sustrato para una fucosiltransferasa . 7. La célula de vertebrado de conformidad con la reivindicación 6, en donde la molécula es una proteina o un lipido . 8. La célula de vertebrado de conformidad con la reivindicación 7, en donde la proteina es una proteina endógena o una exógena. 9. La célula de vertebrado de conformidad con la reivindicación 7 u 8, en donde la proteina es un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo de IgGl, un fragmento de anticuerpo, preferiblemente un fragmento de anticuerpo que comprende la región Fe de un anticuerpo, una proteina de fusión, preferiblemente una proteina de fusión que comprende la región Fe de un anticuerpo, una proteina de virus, fragmento de proteina de virus, un antigeno o una hormona. 10. La célula de vertebrado de conformidad con las reivindicaciones 1 a 9, en donde la célula de vertebrado es una célula de mamífero, pez, anfibio, reptil o ave. 11. La célula de vertebrado de conformidad con la reivindicación 10, en donde i) la célula de mamífero es una célula humana, de hámster, canina o de mono, preferiblemente una célula de ovario de hámster chino (CHO) , una célula de riñon de mono verde africano (VERO-76) (ATCC CRL-1587), una célula de carcinoma cervical humano (HELA) (ATCC CCL 2) , una célula de riñon de canino Madin Darbin (MDCK) (ATCC CCL 34), una célula PER.C6 humana, o una célula AGE1.HN humana; ii) la célula de pez es una célula de ovario (CCO) de Ictalurus punctatus (pez gato de canal) (ATCC CRL-2772), iü) la célula de anfibio es una célula de riñon de Xenopus laevis (ATCC CCL-102); iv) la célula de reptil es una célula de corazón de Iguana iguana (IgH-2) (ATCC CCL-108); o v) la célula de ave es una célula de retina de ave, preferiblemente una célula AGE1.CR.PIX, o uha célula de somita de ave. 12. La célula de vertebrado de conformidad con las reivindicaciones l a 11, que además comprende por lo menos una glicosiltransferasa para GDP-D-ramnosa, GDP-D-perosamina , GDP-desoxi-D-talosa, GDP-6-desoxi-D-altrosa , GDP-4 -ceto-3 , 6- didesoxi-D-manosa o GDP-L-colitosa . 13. Un método para producir una molécula, que naturalmente comprende fucosa en sus porciones glico, que carece de fucosa o con una cantidad reducida de fucosa en sus ' porciones glico que comprende los pasos de: i) proveer una célula de vertebrado de conformidad con las reivindicaciones 1 a 12, ii) aislar la molécula que es capaz de ser un sustrato para una fucosiltransferasa, preferiblemente una proteina o lipido, de la célula en i) . 14. Una molécula que carece de fucosa o con una cantidad reducida de fucosa en sus porciones glico obtenible por el método de la reivindicación 13. 15. Una composición de moléculas de conformidad con la reivindicación 14. 16. Una composición que comprende glicoproteinas que comprenden i) entre 70 y 95% de N-glicanos de tipo de complejo de G0-GlcNac, G0, Gl y/o G2, y ii) entre 5 y 30% de N-glicanos de tipo de alto contenido de mañosa, en donde los N-glicanos de tipo de complejo de las glicoproteinas son libres de fucosa o sustancialmente libres de fucosa. 17. La composición de conformidad con la reivindicación 16, en donde, de los N-glicanos de tipo de complejo, 75% son GO y 25% son N-glicanos de tipo de complejo de GO-GlcNac, Gl y/o G2. 18. La composición de conformidad con la reivindicación 16, en donde, de los N-glicanos de tipo de alto contenido de mañosa, 50% son glicanos man5 y 50% son N-glicanos de man6, man7 y/o man8. 19. La composición de conformidad con las reivindicaciones 16 a 18, en donde las glicoproteinas son anticuerpos, preferiblemente, IgGls. 20. Una proteina o lipido que comprende porciones glico que contienen D-ramnosa, D-perosamina, desoxi-D-talosa, 6-desoxi-D-altrosa, 4-ceto-3, 6-didesoxi-D-manosa, y/o L-colitosa . 21. Una unidad de expresión que comprende una o más secuencias de control de expresión en vertebrados operablemente enlazada a un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima que usa GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa como sustrato, en donde la enzima no cataliza la reacción que convierte GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa a GDP-L-fucosa . 22. La unidad de expresión de la reivindicación 21, en donde la enzima que usa GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa como sustrato se selecciona del grupo que consiste de GDP-6-desoxi-D-lixo- -hexulosa reductasa (RMD) , GDP-perosamina sintetasa (Per), GDP-6-desoxi-D-talosa sintetasa (GTS), GDP-Fucosa sintetasa Cysl09Ser-mutante de (-GFS-Cysl09Ser) , GDP-4-ceto-6-desoximanosa-3-deshidratasa (ColD) , preferiblemente GDP-4-ceto-6-desoximanosa-3-deshidratasa (ColD) en combinación con GDP-L-colitosa sintasa (ColC) , y variantes de las mismas. 23. Una célula eucariótica para producir una proteina, que normalmente comprende fucosa en sus porciones glico, que carece de fucosa o con una cantidad reducida de fucosa en sus porciones glico que comprende: i) un primer polinucleótido que comprende una-secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima que usa GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa como sustrato, y ii) un segundo polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteina, en donde la enzima no cataliza la reacción que convierte GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa a GDP-L-fucosa . 24. La célula eucariótica de conformidad con la reivindicación 23, en donde la enzima que usa GDP-6-desoxi-D-lixo-4 -hexulosa como sustrato se selecciona del grupo que consiste de GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa reductasa (RMD) , GDP-perosamina sintetasa (Per), GDP-6-desoxi-D-talosa sintetasa (GTS) , GDP-Fucosa sintetasa Cysl09Ser-mutante de (GFS-Cysl09Ser) , GDP-4-ceto-6-desoximanosa-3-deshidratasa (ColD) , preferiblemente GDP-4 -ceto- 6-desoximanosa-3-deshidratasa (ColD) en combinación con GDP-L-colitosa sintasa (ColC) , y variantes de las mismas. 25. La célula eucariótica de conformidad con la reivindicación 23 ó 24, en donde la proteina es un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo de IgGl, un fragmento de anticuerpo, preferiblemente un fragmento de anticuerpo que comprende la región Fe de un anticuerpo, una proteina · de fusión que comprende la región Fe de un anticuerpo, una proteina de virus, fragmento de proteina de virus, un antigeno o una hormona. 26. Un método para producir una proteina, que normalmente comprende fucosa en sus porciones glico, que carece de fucosa o con una cantidad reducida de fucosa en sus porciones glico que comprende los pasos de: i) proveer una célula eucariótica de conformidad con las reivindicaciones 23 a 25, ii) expresar la enzima codificada por el primer polinucleótido y la proteina codificada por el segundo polinucleótido en dicha célula, y iii) aislar la proteina de dicha célula. 27. Una proteina que carece de fucosa o con una cantidad reducida de fucosa en sus porciones glico obtenibles por el método de la reivindicación 26. RESUMEN La presente invención se refiere a células para producir una molécula que carece de fucosa, que tienen una ' cantidad reducida de fucosa, o que tienen otros azúcares atipicos en sus porciones glico. También se refiere a métodos para producir una molécula que carece de fucosa, que tiene una cantidad reducida de fucosa, o que tienen otros azúcares atipicos en sus porciones glico usando dichas células y a moléculas obtenibles por dichos métodos. La presente invención además se refiere a moléculas que tienen un patrón de glicosilación artificial. 1 / 9 Fig. l VÍA DE NOVO ÍA DE AHORRO inhibición de retroalimentaclón putativa GDP-Manosa Lisosoma Espacio extracelular RMD L-Fucosa GDP-4-ceto-6-desoxtmanosa GOP-D-Ramnosa Extremo muerto - ucosa GDP-Fucosa Vía mayor Via menor Independiente de fuente de fucosa Dependiente de fuente de fucosa Bloqueado por desviación de Bloqueada por evitación de precursor metabólico fuente de fucosa externa 2/9 Fig.2 3/9 Fig.3 4/9 Fig.4 5/9 Fig.5 6/9 7/9 Fig.6 8/9 concentración [ng/mL] 1/12 LISTADO DE SECUENCIAS <110> VOLKER SANDIG <120> PROCESO PARA PRODUCIR MOLÉCULAS QUE CONTIENEN ESTRUCTURAS DE GLICANO ESPECIALIZADAS <130> 513-17 PCT <150> US 61/244,624 <151> 2009-09-22 <160> 7 <170> Patentln versión 3.5 <210> 1 <211> 304 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <220> <221> PÉPTIDO <222> (1) .. (304) <223> GDP-6-deoxi-D-lixo-4-hexulosa reductasa (RMD) <400> 1 Met Thr Gln Arg Leu Phe Val Thr Gly Leu Ser Gly Phe Val Gly Lys 1 5 10 15 His Leu Gln Ala Tyr Leu Ala Ala Ala His Thr Pro Trp Ala Leu Leu 20 25 30 Pro Val Pro His Arg Tyr Asp Leu Leu Glu Pro Asp Ser Leu Gly Asp 35 40 45 Leu Trp Pro Glu Leu Pro Asp Ala Val lie His Leu Ala Gly Gln Thr 50 55 60 Tyr Val Pro Glu Ala Phe Arg Asp Pro Ala Arg Thr Leu Gln lie Asn 65 70 75 80 Leu Leu Gly Thr Leu Asn Leu Leu Gln Ala Leu Lys Ala Arg Gly Phe 85 90 95 Ser Gly Thr Phe Leu Tyr lie Ser Ser Gly Asp Val Tyr Gly Gln Val 100 105 . 110 Ala Glu Ala Ala Leu Pro lie His Glu Glu Leu lie Pro His Pro Arg 115 120 125 2/12 Asn Pro Tyr Ala Val Ser Lys Leu Ala Ala Glu Ser Leu Cys Leu Gln 130 135 140 Trp Gly lie Thr Glu Gly Trp Arg Val Leu Val Ala Arg Pro Phe Asn 145 150 155 160 His lie Gly Pro Gly Gln Lys Asp Ser Phe Val lie Ala Ser Ala Ala 165 170 175 Arg Gln lie Ala Arg Met Lys Gln Gly Leu Gln Ala Asn Arg Leu Glu 180 185 190 Val Gly Asp lie Asp Val Ser Arg Asp Phe Leu Asp Val Gln Asp Val 195 200 205 Leu Ser Ala Tyr Leu Arg Leu Leu Ser His Gly Glu Ala Gly Ala Val 210 215 220 Tyr Asn Val Cys Ser Gly Gln Glu Gln Lys lie Arg Glu Leu lie Glu 225 230 235 240 Leu Leu Ala Asp lie Ala Gln Val Glu Leu Glu lie Val Gln Asp Pro 245 250 255 Ala Arg Met Arg Arg Ala Glu Gln Arg Arg Val Arg Gly Ser His Ala 260 265 270 Arg Leu His Asp Thr Thr Gly Trp Lys Pro Glu lie Thr lie Lys Gln 275 280 285 Ser Leu Arg Ala lie Leu Ser Asp Trp Glu Ser Arg Val Arg Glu Glu 290 295 300 <210> 2 <211> 294 <212> PRT <213> Actinobacillus actinomycetemcomitans <220> <221> PÉPTIDO <222> (1) .. (294) <223> GDP-6-deoxi-D-talosa sintetasa (GTS) <400> 2 3/12 Met Lys lie Leu Val Thr Gly Gly Ser Gly Phe lie Gly Lys Asn Leu 1 5 10 15 lie Tyr Leu Leu Arg Glu Lys Arg Glu Phe Glu Val Phe Gly Ala Thr 20 25 30 Val Glu Glu Thr Mét Asp Leu Thr Asn Pro Cys Ser Val Gln Ser Val 35 40 45 Leu Glu Lys Thr Lys Pro Asp Phe lie Val His Leu Ala Ala Leu Thr 50 55 60 Phe Val Pro Asn Asn Asn Pro lie Thr Phe Tyr Leu Val Asn Thr lie 65 70 75 80 Gly Thr Glu Asn Leu Leu Arg Ser lie Val Asp Leu Asn Val Ala Lys 85 90 95 Leu Gly Val Leu Cys Phe Ser Thr Ala Gly lie Tyr Gly lie Gln Glu 100 105 110 Thr Lys Leu Leu Ser Glu Ser Leu Thr Pro Lys Pro Val Asn His Tyr 115 120 125 Ser Met Ser Lys His Cys Met Glu His lie Val Asn Lys Tyr Arg Cys 130 135 140 Phe Arg Gly lie Thr Val Val Arg Pro Phe Asn Val Leu Gly Leu Gly 145 150 155 160 Gln Asn lie Asn Phe Leu Val Pro Lys Met Val Ser Ala Phe Val Lys 165 170 175 Lys Asp Lys Thr lie Glu Leu Gly Asn Leu Asp Ser Val Arg Asp Phe 180 185 190 lie Ser Val Asn Asp Cys Cys Asp lie lie Tyr Arg Leu lie Ser Lys 195 200 205 Leu lie Glu Asn Glu Thr lie Asn lie Cys Thr Gly lie Gly Tyr Ser 210 215 220 Val Tyr Gln lie Phe Gln Leu Leu Cys Glu lie Ser Met His Gln Met 225 230 235 240 4/12 Glu lie Lys Gln Asn Glu Leu Phe Val Arg His Asp Asp lie Pro Gln 245 250 255 Met lie Gly Asp Pro Ser Lys Leu Leu Asn Val Leu Gly Asn Asp Tyr 260 265 270 Arg Phe Thr Ser Val Arg Ala lie Leu Glu Glu Met Tyr Lys Asn Arg 275 280 285 Leu Leu Glu Leu Ser 290 <210> 3 <211> 367 <212> PRT <213> Vibrio cholerae <220> <221> PÉPTIDO <222> (1)..(367) <223> GDP-perosamina sintetasa (Per) <400> 3 Met lie Pro Val Tyr Glu Pro Ser Leu Asp Gly Asn Glu Arg Lys Tyr 1 5 10 15 Leu Asn Asp Cys lie Asp Ser Gly Trp Val Ser Ser Arg Gly Lys Tyr 20 25 30 lie Asp Arg Phe Glu Thr Glu Phe Ala Glu Phe Leu Lys Val Lys His 35 40 45 Ala Thr Thr Val Ser Asn Gly Thr Val Ala Leu His Leu Ala Met Ser 50 55 60 Ala Leu Gly lie Thr Gln Gly Asp Glu Val lie Val Pro Thr Phe Thr 65 70 75 80 Tyr Val Ala Ser Val Asn Thr lie Val Gln Cys Gly Ala Leu Pro Val 85 90 95 Phe Ala Glu lie Glu Gly Glu Ser Leu Gln Val Ser Val Glu Asp Val 100 105 110 5/12 Lys Arg Lys lie Asn Lys Lys Thr Lys Ala Val Met Ala Val His lie 115 120 125 Tyr Gly Gln Ala Cys Asp lie Gln Ser Leu Arg Asp Leu Cys Asp Glu 130 135 140 His Gly Leu Tyr Leu lie Glu Asp Cys Ala Glu Ala lie Gly Thr Ala 145 150 155 160 Val Asn Gly Lys Lys Val Gly Thr Phe Gly Asp Val Ser Thr Phe Ser 165 170 175 Phe Phe Gly Asn Lys Thr lie Thr Ser Gly Glu Gly Gly Met Val Val 180 185 190 Ser Asn Ser Asp lie lie lie Asp Lys Cys Leu Arg Leu Lys Asn Gln 195 200 205 Gly Val Val Ala Gly Lys Arg Tyr Trp His Asp Leu Val Ala Tyr Asn 210 215 220 Tyr Arg Met Thr Asn Leu Cys Ala Ala lie Gly Val Ala Gln Leu Glu 225 230 235 240 Arg Val Asp Lys lie He Lys Arg Lys Arg Asp He Ala Glu He Tyr 245 250 255 Arg Ser Glu Leu Ala Gly Leu Pro Met Gln Val His Lys Glu Ser Asn 260 265 270 Gly Thr Phe His Ser Tyr Trp Leu Thr Ser He He Leu Asp Gln Glu 275 280 285 Phe Glu Val His Arg Asp Gly Leu Met Thr Phe Leu Glu Asn Asn Asp 290 295 300 He Glu Ser Arg Pro Phe Phe Tyr Pro Ala His Thr Leu Pro Met Tyr 305 310 315 320 Glu His Leu Ala Glu Lys Thr Ala Phe Pro Leu Ser Asn Ser Tyr 325 330 335 Arg Gly He Asn Leu Pro Ser Trp Pro Gly Leu Cys Asp Asp Gln 340 345 350 6/12 Val Lys Glu lie Cys Asn Cys lie Lys Asn Tyr Phe Asn Cys 355 360 365 <210> 4 <211> 388 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> PÉPTIDO <222> (1) .. (388) <223> GDP-4-ceto-6-deoximanosa-3-dehidratasa (ColD) <400> 4 Met lie Asn Tyr Pro Leu Ala Ser Ser Thr Trp Asp Asp Leu Glu Tyr 1 5 10 15 Lys Ala lie Gln Ser Val Leu Asp Ser Lys Met Phe Thr Met Gly Gl 20 25 30 Tyr Val Lys Gln Tyr Glu Thr Gln Phe Ala Lys Thr Phe Gly Ser Lys 35 40 45 Tyr Ala Val Met Val Ser Ser Gly Ser Thr Ala Asn Leu Leu Met lie 50 55 60 Ala Ala Leu Phe Phe Thr Lys Lys Pro Arg Leu Lys Lys Gly Asp Glu 65 70 75 80 lie lie Val Pro Ala Val Ser Trp Ser Thr Thr Tyr Tyr Pro Leu Gln 85 90 95 Gln Tyr Gly Leu Arg Val Lys Phe Val Asp lie Asp lie Asn Thr Leu 100 105 110 Asn lie Asp lie Glu Ser Leu Lys Glu Ala Val Thr Asp Ser Thr Lys 115 120 125 Ala lie Leu Thr Val Asn Leu Leu Gly Asn Pro Asn Asn Phe Asp Glu 130 135 140 lie Asn Lys lie lie Gly Gly Arg Asp lie lie Leu Leu Glu Asp Asn 145 150 155 160 7/12 Cys Glu Ser Met Gly Ala Thr Phe Asn Asn Lys Cys Ala Gly Thr Phe 165 170 175 Gly Leu Met Gly Thr Phe Ser Ser Phe Tyr Ser His His lie Ala Thr 180 185 190 Met Glu Gly Gly Cys lie Val Thr Asp Asp Glu Glu lie Tyr His lie 195 200 205 Leu Leu Cys lie Arg Ala His Gly Trp Thr Arg Asn Leu Pro Lys Lys 210 215 220 Asn Lys Val Thr Gly Val Lys Ser Asp Asp Gln Phe Glu Glu Ser Phe 225 230 235 240 Lys Phe Val Leu Pro Gly Tyr Asn Val Arg Pro Leu Glu Met Ser Gly 245 250 255 Ala lie Gly lie Glu Gln Leu Lys Lys Leu Pro Arg Phe lie Ser Val 260 265 270 Arg Arg Lys Asn Ala Glu Tyr Phe Leu Asp Lys Phe Lys Asp His Pro 275 280 285 Tyr Leu Asp Val Gln Gln Glu Thr Gly Glu Ser Ser Trp Phe Gly Phe 290 295 300 Ser Phe lie lie Lys Lys Asp Ser Gly Val lie Arg Lys Gln Leu Val 305 310 315 320 Glu Asn Leu Asn Ser Ala Gly lie Glu Cys Arg Pro lie Val Thr Gly 325 330 335 Asn Phe Leu Lys Asn Thr Asp Val Leu Lys Tyr Phe Asp Tyr Thr Val 340 345 350 His Asn Asn val Asp Asn Ala Glu Tyr Leu Asp Lys Asn Gly Leu Phe 355 360 365 Val Gly Asn His Gln lie Glu Leu Phe Asp Glu lie Asp Tyr Leu Arg 370 375 380 Val Leu Lys 8/12 <210> 5 <211> 321 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <220> <221> PÉPTIDO <222> (1) .. (321) <223> GDP-Fucosa sintetasa (GST) (proteína Fx) <400> 5 Met Gly Glu Pro Gln Gly Ser Arg Arg lie Leu Val Thr Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Leu Val Gly Arg Ala lie Gln Lys Val Val Ala Asp Gly Ala Gly 20 25 30 Leu Pro Gly Glu Glu Trp Val Phe Val Ser Ser Lys Asp Ala Asp Leu 35 40 45 Thr Asp Ala Ala Gln Thr Gln Ala Leu Phe Gln Lys Val Gln Pro Thr 50 55 60 His Val lie His Leu Ala Ala Met Val Gly Gly Leu Phe Arg Asn lie 65 70 75 80 Lys Tyr Asn Leu Asp Phe Trp Arg Lys Asn Val His lie Asn Asp Asn 85 90 95 Val Leu His Ser Ala Phe Glu Val Gly Thr Arg Lys Val Val Ser Cys 100 105 110 Leu Ser Thr Cys lie Phe Pro Asp Lys Thr Thr Tyr Pro lie Asp Glu 115 120 125 Thr Met lie His Asn Gly Pro Pro His Ser Ser Asn Phe Gly Tyr Ser 130 135 140 Tyr Ala Lys Arg Met lie Asp Val Gln Asn Arg Ala Tyr Phe Gln Gln 145 150 155 160 His Gly Cys Thr Phe Thr Ala Val lie Pro Thr Asn Val Phe Gly Pro 165 170 175 9/12 His Asp Asn Phe Asn lie Glu Asp Gly His Val Leu Pro Gly Leu lie 180 185 190 His Lys Val His Leu Ala Lys Ser Asn Gly Ser Ala Leu Thr Val Trp 195 200 205 Gly Thr Gly Lys Pro Arg Arg Gln Phe lie Tyr Ser Leu Asp Leu Ala 210 215 220 Arg Leu Phe lie Trp Val Leu Arg Glu Tyr Asn Glu Val Glu Pro lie 225 230 235 240 lie Leu Ser Val Gly Glu Glu Asp Glu Val Ser lie Lys Glu Ala Ala 245 250 255 Glu Ala Val Val Glu Ala Met Asp Phe Cys Gly Glu Val Thr Phe Asp 260 265 270 Thr Lys Ser Asp Gly Gln Tyr Lys Lys Thr Ala Ser Asn Gly Lys 275 280 285 Leu Arg Ala Tyr Leu Pro Asp Phe Arg Phe Thr Pro Phe Lys Gln Ala 290 295 300 Val Lys Glu Thr Cys Ala Trp Phe Thr Asp Asn Tyr Glu Gln Ala Arg 305 310 315 320 Lys <210> 6 <211> 314 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <220> <221> PÉPTIDO <222> (1) .. (314) <223> GDP-Fucosa sintetasa Cysl09Ser- (GFS-Cysl09Ser) mutante <400> 6 Met Arg lie Leu Val Thr Gly Gly Ser Gly Leu Val Gly Arg Ala lie 1 5 10 15 10/12 Gln Lys Val Val Ala Asp Gly Ala Gly Leu Pro Gly Glu Glu Trp Val 20 25 30 Phe Val Ser Ser Lys Asp Ala Asp Leu Thr Asp Ala Ala Gln Thr Gln 35 40 45 Ala Leu Phe Gln Lys Val Gln Pro Thr His Val lie His Leu Ala Al 50 55 60 Met Val Gly Gly Leu Phe Arg Asn lie Lys Tyr Asn Leu Asp Phe Trp 65 70 75 80 Arg Lys Asn Val His lie Asn Asp Asn Val Leu His Ser Ala Phe Glu 85 90 95 Val Gly Thr Arg Lys Val Val Ser Cys Leu Ser Thr Ser lie Phe Pro 100 105 110 Asp Lys Thr Thr Tyr Pro lie Asp Glu Thr Met lie His Asn Gly Pro 115 120 125 Pro His Ser Ser Asn Phe Gly Tyr Ser Tyr Ala Lys Arg Met lie Asp 130 135 140 Val Gln Asn Arg Ala Tyr Phe Gln Gln His Gly Cys Thr Phe Thr Ala 145 150 155 160 Val lie Pro Thr Asn Val Phe Gly Pro His Asp Asn Phe Asn lie Glu 165 170 175 Asp Gly His Val Leu Pro Gly Leu lie His Lys Val His Leu Ala Lys 180 185 190 Ser Asn Gly Ser Ala Leu Thr Val Trp Gly Thr Gly Lys Pro Arg Arg 195 200 205 Gln Phe lie Tyr Ser Leu Asp Leu Ala Arg Leu Phe lie Trp Val Leu 210 215 220 Arg Glu Tyr Asn Glu Val Glu Pro lie lie Leu Ser Val Gly Glu Glu 225 230 235 240 Asp Glu Val Ser lie Lys Glu Ala Ala Glu Ala Val Val Glu Ala Met 245 250 255 11/12 Asp Phe Cys Gly Glu Val Thr Phe Asp Ser Thr Lys Ser Asp Gly Gln 260 265 270 Tyr Lys Lys Thr Ala Ser Asn Gly Lys Leu Arg Ala Tyr Leu Pro Asp 275 280 285 Phe Arg Phe Thr Pro Phe Lys Gln Ala Val Lys Glu Thr Cys Ala Trp 290 295 300 Phe Thr Asp Asn Tyr Glu Gln Ala Arg Lys 305 310 <210> 7 <211> 307 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> PÉPTIDO <222> (1) .. (307) <223> GDP-L-colitosa sintasa (ColC) <400> 7 Met Lys lie Leu Leu Thr Gly Ser Thr Gly Met Val Gly Arg Asn lie 1 5 10 15 Val Asp Asn Asn Asn Ser Asn Lys Tyr Glu Leu Leu Cys Pro Thr 20 25 30 Ser Glu Leu Asn Leu Leu Asp Asn Lys Ala Val His Asp Tyr lie Thr 35 40 45 Cys His Ser Pro Asp Leu lie lie His Ala Ala Gly Leu Val Gly Gly 50 55 60 lie Gln Ala Asn lie Lys Arg Pro Val Asp Phe Leu Val Ser Asn Leu 65 70 75 80 Lys Met Gly Val Asn lie Val Asn Glu Ala Lys Asn Cys Gly Val Lys 85 90 95 Asn Phe lie Asn Leu Gly Ser Ser Cys Met Tyr Pro Lys Gly lie Asp 100 105 lio 12/12 Thr Ala lie Ser Glu Asp Ala Leu Leu Thr Gly Lys Leu Glu His Thr 115 120 125 Asn Glu Gly Tyr Ala Leu Ala Lys lie Thr Val Ala Lys Leu Cys Glu 130 135 140 Tyr lie Thr Lys Glu Ser Glu Gly Tyr His Tyr Lys Thr lie lie Pro 145 150 155 160 Cys Asn Leu Tyr Gly Lys Tyr Asp Lys Phe Asp Glu His Ser Ser His 165 170 175 Met lie Pro Ala Val lie Asn Arg lie His Asn Ala Lys Val Asn Asn 180 185 190 He Lys Leu He Glu He Trp Gly Asp Gly Glu Ser Arg Arg Glu Phe 195 200 205 Met Tyr Ala Glu Asp Phe Ala Asn Phe He Tyr Gln Ala He Pro Asn 210 215 220 He Gln Arg Leu Pro Cys Met Leu Asn Val Gly Leu Gly His Asp Phe 225 230 235 240 Ser He Asn Asp Tyr Tyr Lys Val He Ala Glu Glu He Gly Tyr Lys 245 250 255 Gly Ser Phe Thr His Asp Leu Thr Lys Pro Val Gly Met Arg Arg Lys 260 265 270 Leu Val Asp He Thr Leu Leu Ser Glu Phe Gly Trp Lys Tyr Gln Phe 275 280 285 Glu Leu Arg Asp Gly He Lys Glu Thr Tyr Lys Tyr Tyr Leu Glu Asn 290 295 300 Val Tyr Lys 305