TW202317635A

TW202317635A - 特異性結合ｈｇｆｒ和ｅｇｆｒ的抗原結合分子及其醫藥用途

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Publication number: TW202317635A
Application number: TW111126502A
Authority: TW
Inventors: 葉鑫; 孫樂; 張偉偉; 陶維康
Original assignee: 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司; 大陸商上海恆瑞醫藥有限公司
Priority date: 2021-07-14
Filing date: 2022-07-14
Publication date: 2023-05-01
Also published as: JP2024528573A; WO2023284829A8; KR20240032959A; EP4372001A1; MX2024000501A; AU2022309554A1; CN117480180A; CA3225715A1; WO2023284829A1

Abstract

本揭露關於特異性結合HGFR和EGFR的抗原結合分子及其醫藥用途。該抗原結合分子可用於治療腫瘤相關疾病。

Description

特異性結合HGFR和EGFR的抗原結合分子及其醫藥用途

本申請要求2021年07月14日提交的中國專利申請202110794137.9的優先權。

本揭露屬於生物技術領域，更具體地，本揭露關於抗原結合分子及其應用。

這裡的陳述僅提供與本揭露有關的背景信息，而不必然地構成現有技術。

表皮生長因子受體(EGFR)和肝細胞生長因子受體(HGFR)是兩種受體酪胺酸激酶，共同在多種腫瘤細胞上高表達，如非小細胞肺癌(NSCLC)，結直腸癌(CRC)和頭頸癌(HNC)等。

EGFR信號通路藉由調節細胞增殖，血管生成以及癌症細胞的轉移和生存，在腫瘤生物學中發揮著重要作用，該通路的失調會導致腫瘤的發生。由於HGFR的過表達，活化突變，自分泌或旁分泌信號轉導或者基因擴增引起的異常信號激活，HGFR也與許多腫瘤的發生相關。藉由對癌症療效的調查發現，EGFR和HGFR信號通路存在著重要聯繫。

NSCLC占肺癌總數的83%，而EGFR激活型突變是其中常見的類型(白人10-15%，亞洲人50%)。一直以來，EGFR酪胺酸激酶抑制劑(TKI)都是NSCLC的一線療法。儘管初始響應率很高(70-80%)，但通常在一年內就會出現耐藥。耐藥的機制主要有兩種，其一是另一種EGFR突變的出現，比如EGFR T790M；其二就是HGFR信號通路的補償激活。這些因素均影響腫瘤的治療效果。

本揭露提供了一種抗原結合分子，其包含至少一個特異性結合HGFR的抗原結合模塊1和至少一個特異性結合EGFR的抗原結合模塊2。

在一個方面，本揭露提供了一種抗原結合分子，其包含至少一個特異性結合HGFR的抗原結合模塊1和至少一個特異性結合EGFR的抗原結合模塊2；其中，

該抗原結合模塊1包含重鏈可變區M-VH和輕鏈可變區M-VL，該M-VH包含M-HCDR1、M-HCDR2和M-HCDR3，該M-VL包含M-LCDR1、M-LCDR2和M-LCDR3，其中，

(i)該M-HCDR1、M-HCDR2和M-HCDR3分別包含SEQ ID NO：16中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列，和該M-LCDR1、M-LCDR2和M-LCDR3分別包含SEQ ID NO：17中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列，或

(ii)該M-HCDR1、M-HCDR2和M-HCDR3分別包含SEQ ID NO：12中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列，和該M-LCDR1、M-LCDR2和M-LCDR3分別包含SEQ ID NO：13中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列；或

(iii)該M-HCDR1、M-HCDR2和M-HCDR3分別包含SEQ ID NO：14中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列，和該M-LCDR1、M-LCDR2和M-LCDR3分別包含SEQ ID NO：15中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列；

該抗原結合模塊2包含重鏈可變區E-VH和輕鏈可變區E-VL，該E-VH包含E-HCDR1、E-HCDR2和E-HCDR3，該E-VL包含E-LCDR1、E-LCDR2和E-LCDR3，其中，該E-HCDR1、E-HCDR2和E-HCDR3分別包含SEQ ID NO：3中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列，和該E-LCDR1、E-LCDR2和E-LCDR3分別包含SEQ ID NO：5中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列。

在一些實施方式中，如上所述的抗原結合分子，該M-HCDR1、M-HCDR2、M-HCDR3、M-LCDR1、M-LCDR2、M-LCDR3、E-HCDR1、E-HCDR2、E-HCDR3、E-LCDR1、E-LCDR2、E-LCDR3、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號規則定義的。

在一些實施方式中，該M-HCDR1、M-HCDR2、M-HCDR3、M-LCDR1、M-LCDR2、M-LCDR3、E-HCDR1、E-HCDR2、E-HCDR3、E-LCDR1、E-LCDR2、E-LCDR3、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3是根據Kabat編號規則定義的。

在一些實施方式中，如上所述的抗原結合分子，該M-HCDR1、M-HCDR2、M-HCDR3、M-LCDR1、M-LCDR2、M-LCDR3、E-HCDR1、E-HCDR2、E-HCDR3、E-LCDR1、E-LCDR2、E-LCDR3、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3是根據IMGT編號規則定義的。

在一些實施方式中，如上所述的抗原結合分子，該M-HCDR1、M-HCDR2、M-HCDR3、M-LCDR1、M-LCDR2、M-LCDR3、E-HCDR1、E-HCDR2、E-HCDR3、E-LCDR1、E-LCDR2、E-LCDR3、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3是根據Chothia編號規則定義的。

在一些實施方式中，如上所述的抗原結合分子，該M-HCDR1、M-HCDR2、M-HCDR3、M-LCDR1、M-LCDR2、M-LCDR3、E-HCDR1、E-HCDR2、E-HCDR3、E-LCDR1、E-LCDR2、E-LCDR3、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3是根據AbM編號規則定義的。

在一些實施方式中，如上所述的抗原結合分子，該M-HCDR1、M-HCDR2、M-HCDR3、M-LCDR1、M-LCDR2、M-LCDR3、E-HCDR1、E-HCDR2、E-HCDR3、E-LCDR1、E-LCDR2、E-LCDR3、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3是根據Contact編號規則定義的。

在一些實施方式中，如上任一項所述的抗原結合分子，該M-HCDR1、M-HCDR2、M-HCDR3、M-LCDR1、M-LCDR2和M-LCDR3是根據Kabat編號規則定義的，其中，

(i)該M-HCDR1包含SEQ ID NO：30的胺基酸序列，該M-HCDR2包含SEQ ID NO：31的胺基酸序列，該M-HCDR3包含SEQ ID NO：32的胺基酸序列，該M-LCDR1包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列，該M-LCDR2包含SEQ ID NO：33的胺基酸序列，和該M-LCDR3包含SEQ ID NO：29的胺基酸序列；或

(ii)該M-HCDR1包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列，該M-HCDR2包含SEQ ID NO：19的胺基酸序列，該M-HCDR3包含SEQ ID NO：20的胺基酸序列，該M-LCDR1包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列，該M-LCDR2包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列，和該M-LCDR3包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列；或

(iii)該M-HCDR1包含SEQ ID NO：24的胺基酸序列，該M-HCDR2包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列，該M-HCDR3包含SEQ ID NO：26的胺基酸序列，該M-LCDR1包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列，該M-LCDR2包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列，和該M-LCDR3包含SEQ ID NO：29的胺基酸序列；和

該E-HCDR1、E-HCDR2、E-HCDR3、E-LCDR1、E-LCDR2和E-LCDR3是根據Kabat編號規則定義的，該E-HCDR1包含SEQ ID NO：6的胺基酸序列，該E-HCDR2包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列，該E-HCDR3包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列，該E-LCDR1包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列，該E-LCDR2包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列，和該E-LCDR3包含SEQ ID NO：11的胺基酸序列。

在一些實施方式中，如上任一項所述的抗原結合分子，其中該特異性結合HGFR的抗原結合模塊1，其M-VH具有：包含SEQ ID NO： 18的胺基酸序列的M-HCDR1、包含SEQ ID NO：19的胺基酸序列的M-HCDR2和包含SEQ ID NO：20的胺基酸序列的M-HCDR3，並且其M-VL具有：包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的M-LCDR1、包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列的M-LCDR2和包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列的M-LCDR3；和

該特異性結合EGFR的抗原結合模塊2，其E-VH具有：包含SEQ ID NO：6的胺基酸序列的E-HCDR1、包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列的E-HCDR2和包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列的E-HCDR3，並且其E-VL具有：包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列的E-LCDR1、包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列的E-LCDR2和包含SEQ ID NO：11的胺基酸序列的E-LCDR3。

在一些實施方式中，如上任一項所述的抗原結合分子，該抗原結合分子包含兩個特異性結合HGFR的抗原結合模塊1，其中一個抗原結合模塊1，其M-VH具有：包含SEQ ID NO：30的胺基酸序列的M-HCDR1、包含SEQ ID NO：31的胺基酸序列的M-HCDR2和包含SEQ ID NO：32的胺基酸序列的M-HCDR3，並且其M-VL具有：包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列的M-LCDR1、包含SEQ ID NO：33的胺基酸序列的M-LCDR2和包含SEQ ID NO：29的胺基酸序列的M-LCDR3；另一個抗原結合模塊1，其M-VH具有：包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列的M-HCDR1、包含SEQ ID NO：19的胺基酸序列的M-HCDR2和包含SEQ ID NO：20的胺基酸序列的M-HCDR3，並且其M-VL具有：包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的M-LCDR1、包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列的M-LCDR2和包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列的M-LCDR3；和

包含特異性結合EGFR的抗原結合模塊2，該抗原結合模塊2的E-VH具有：包含SEQ ID NO：6的胺基酸序列的E-HCDR1、包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列的E-HCDR2和包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列的E-HCDR3，並且其E-VL具有：包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列的E-LCDR1、包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列的E-LCDR2和包含SEQ ID NO：11的胺基酸序列的E-LCDR3。

在一些實施方式中，如上所述的抗原結合分子，該M-HCDR1、M-HCDR2、M-HCDR3、M-LCDR1、M-LCDR2、M-LCDR3、E-HCDR1、E-HCDR2、E-HCDR3、E-LCDR1、E-LCDR2、E-LCDR3是根據Kabat編號規則定義的。

在一些實施方案中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中，

(i)該M-VH包含與SEQ ID NO：16具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性的胺基酸序列，並且該M-VL包含與SEQ ID NO：17具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性的胺基酸序列，或

該M-VH包含與SEQ ID NO：12具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性的胺基酸序列，並且該M-VL包含與SEQ ID NO：13具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性的胺基酸序列，或

該M-VH包含與SEQ ID NO：14具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性的胺基酸序列，並且該M-VL包含與SEQ ID NO：15具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性的胺基酸序列；和/或

(ii)該E-VH包含與SEQ ID NO：3具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性的胺基酸序列，並且該E-VL包含與SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：4具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性的胺基酸序列；

在一些實施方案中，如前所述的抗原結合分子，以下功能等價，包括結合相同的表位、具有相同的親和力(例如KD±50%以內)或其他本專利所披露的功能。

(i)該M-VH包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列，並且該M-VL包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列，或

該M-VH包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列，並且該M-VL包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列，或

該M-VH包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列，並且該M-VL包含SEQ ID NO：15的胺基酸序列；和/或

(ii)該E-VH包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列，並且該E-VL包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：4的胺基酸序列。

(i)該抗原結合分子包含兩個特異性結合HGFR的抗原結合模塊1，其中一個抗原結合模塊1的M-VH包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列，並且M-VL包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列；另一個抗原結合模塊1的M-VH包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列，並且M-VL包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列；和該E-VH包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列，並且該E-VL包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列；或

(ii)該抗原結合分子包含至少一個特異性結合HGFR的抗原結合模塊1和至少一個特異性結合EGFR的抗原結合模塊2，該E-VH包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列，和該E-VL包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列，並且該M-VH包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列，和該M-VL包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列。

在一些實施方案中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含兩個特異性結合HGFR的抗原結合模塊1、一個特異性結合EGFR的抗原結合模塊2和Fc區，該Fc區包含能夠相互締合的第一亞基Fc1和第二亞基Fc2。

在一些實施方案中，該特異性結合EGFR的抗原結合模塊2為特異性結合EGFR的Fv；該兩個特異性結合HGFR的抗原結合模塊1分別為特異性結合HGFR的第一Fab和特異性結合HGFR的經替換的Fab，該經替換的Fab包含M-VH、M-VL、Titin鏈和Obscurin鏈，該Titin鏈和Obscurin鏈能夠形成二聚體，其中，該經替換的Fab的M-VH的C端直接或藉由連接子融合至Titin鏈的N端，並且該經替換的Fab的M-VL的C端直接或藉由連接子融合至Obscurin鏈的N端，或該經替換的Fab的M-VH的C端直接或藉由連接子融合至Obscurin鏈的N端，並且該經替換的Fab的M-VL的C端直接或藉由連接子融合至Titin鏈的N端。

在一些實施方案中，該特異性結合EGFR的Fv的E-VH的C端直接或藉由連接子融合至特異性結合HGFR的第一Fab的重鏈的N端，該特異性結合EGFR的Fv的E-VL的C端直接或藉由連接子融合至特異性結合HGFR的第一Fab的輕鏈的N端，該特異性結合HGFR的第一Fab的重鏈的C端直接或藉由連接子融合至Fc1的N端，該Titin鏈的C端或 Obscurin鏈的C端直接或藉由連接子融合至Fc2的N端。在一些實施方案中，該經替換的Fab的M-VH與該Fc2處於同一條鏈上。

在一些實施方案中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含一個特異性結合HGFR的抗原結合模塊1、一個特異性結合EGFR的抗原結合模塊2和Fc區，該Fc區包含能夠相互締合的第一亞基Fc1和第二亞基Fc2。在一些實施方案中，該抗原結合模塊1是Fab；該抗原結合模塊2是經替換的Fab，其包含E-VH、E-VL、Titin鏈和Obscurin鏈，該Titin鏈和Obscurin鏈能夠形成二聚體；其中，該E-VH的C端直接或藉由連接子融合至Titin鏈的N端和該E-VL的C端直接或藉由連接子融合至Obscurin鏈的N端，或該E-VH的C端直接或藉由連接子融合至Obscurin鏈的N端和該E-VL的C端直接或藉由連接子融合至Titin鏈的N端。在一些實施方案中，該特異性結合HGFR的Fab的重鏈的C端直接或藉由連接子融合至Fc1的N端，該Titin鏈的C端或Obscurin鏈的C端直接或藉由連接子融合至Fc2的N端。在一些實施方案中，該E-VH與該Fc2處於同一條鏈上。

在一些實施方案中，如前任一項所述的抗原結合分子，該抗原結合分子包含Fc區，該Fc區較佳為IgG Fc區，更佳為IgG₁ Fc區。在一些實施方案中，該Fc區包含能夠相互締合的第一亞基Fc1和第二亞基Fc2，該Fc1和Fc2各自獨立地具有一個或更多個減少Fc區同源二聚化的胺基酸取代。

在一些實施方案中，(i)該Fc1具有根據杵臼技術的凸起結構，和該Fc2具有根據杵臼技術的孔結構；較佳地，該Fc1在366位置的胺基酸殘基為W；和該Fc2在366位置的胺基酸殘基為S、在368位置的胺基酸殘基為A、和在407位置的胺基酸殘基為V，該胺基酸殘基位置依據EU索引編號；和/或(ii)該第一亞基Fc1和第二亞基Fc2之間具有工程化二硫鍵，較佳地，該Fc1在354位置的胺基酸殘基為C；和該Fc2在349位置的胺基酸殘基為C，該胺基酸殘基位置依據EU索引編號；更佳地，該Fc1在354位置的胺基酸殘基為C、在356位置的胺基酸殘基為E、在358位置的胺基酸殘基為M和在366位置的胺基酸殘基為W；並且該Fc2在349位置的胺基酸殘基為C、在356位置的胺基酸殘基為E、在358位置的胺基酸殘基為M、在366位置的胺基酸殘基為S、在368位置的胺基酸殘基為A和在407位置的胺基酸殘基為V，該胺基酸殘基位置依據EU索引編號。

在另一些實施方案中，(i)該Fc2具有根據杵臼技術的凸起結構，和該Fc1具有根據杵臼技術的孔結構；較佳地，該Fc2在366位置的胺基酸殘基為W；和該Fc1在366位置的胺基酸殘基為S、在368位置的胺基酸殘基為A、和在407位置的胺基酸殘基為V，該胺基酸殘基位置依據EU索引編號；和/或(ii)該第一亞基Fc2和第二亞基Fc1之間具有工程化二硫鍵，較佳地，該Fc2在354位置的胺基酸殘基為C；和該Fc1在349位置的胺基酸殘基為C，該胺基酸殘基位置依據EU索引編號；更佳地，該Fc2在354位置的胺基酸殘基為C、在356位置的胺基酸殘基為E、在358位置的胺基酸殘基為M和在366位置的胺基酸殘基為W；並且該Fc1在349位置的胺基酸殘基為C、在356位置的胺基酸殘基為E、在358位置的胺基酸殘基為M、在366位置的胺基酸殘基為S、在368位置的胺基酸殘基為A和在407位置的胺基酸殘基為V，該胺基酸殘基位置依據EU索引編號。

在一些實施方案中，該Fc1具有SEQ ID NO：107的胺基酸序列，和該Fc2具有SEQ ID NO：108的胺基酸序列。

該抗原結合分子包含：具有式(a)所示結構的第一鏈、具有式(b)所示結構的第二鏈、具有式(c)所示結構的第三鏈和具有式(d)所示結構的第四鏈，

式(a)[E-VH]-[連接子1]-[M-VH]-[CH1]-[Fc1]，

式(b)[E-VL]-[連接子2]-[M-VL]-[CL]，

式(c)[M-VH]-[連接子3]-[Titin鏈]-[Fc2]，

式(d)[M-VL]-[連接子4]-[Obscurin鏈]。

在一些實施方案中，該式(a)、式(b)、式(c)和式(d)的連接子是相同或不同的肽連接子；在一些實施方案中，該肽連接子各自獨立地具有L₁-(GGGGS)n-L₂的結構，其中，L₁是鍵、A、GS、GGS或GGGS(SEQ ID NO：116)，n是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，L2是鍵、G、GG、GGG或GGGG(SEQ ID NO：117)，並且該肽連接子不是鍵。在一些實施方案中，該肽連接子的長度為3-15個胺基酸殘基。在一些實施方案中，該肽連接子各自獨立地具有(GGGGS)n的結構，其中n是1、2或3。在一些實施方案中，該式(a)、式(b)、式(c)和式(d)中的連接子的胺基酸序列如SEQ ID NO：105或SEQ ID NO：106所示。在一些實施方案中，該式(a)和式(b)的連接子的胺基酸序列均如SEQ ID NO：105所示，該式(c)和式(d)的連接子的胺基酸序列均如SEQ ID NO：106所示。在一些實施方案中，該抗原結合分子具有一條第一鏈、一條第二鏈、一條第三鏈、一條第四鏈。在一些實施方案中，該式(a)中的M-VH和式(c)中的M-VH不相同，該式(b)中的M-VL和式(d)中的M-VL不相同。在一些實施方案中，該抗原結合分子具有：包含SEQ ID NO：34的胺基酸序列的第一鏈、包含SEQ ID NO：35的胺基酸序列的第二鏈、包含SEQ ID NO：36的胺基酸序列的第三鏈和包含SEQ ID NO：37的胺基酸序列的第四鏈。

在一些實施方案中，如前任一項所述的抗原結合分子，該抗原結合分子包含：具有式(e)所示結構的第一鏈、具有式(f)所示結構的第二鏈、具有式(g)所示結構的第三鏈和具有式(h)所示結構的第四鏈，

式(e)[M-VH]-[CH1]-[Fc1]，

式(f)[M-VL]-[CL]，

式(g)[E-VH]-[連接子1]-[Titin鏈]-[Fc2]，

式(h)[E-VL]-[連接子2]-[Obscurin鏈]。

在一些實施方案中，式(g)和式(h)中的連接子是相同或不同的肽連接子。在一些實施方案中，該肽連接子各自獨立地具有L₁-(GGGGS)n-L₂的結構，其中，L₁是鍵、A、GS、GGS或GGGS(SEQ ID NO：116)，n是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，L2是鍵、G、GG、GGG或GGGG(SEQ ID NO：117)，並且該肽連接子不是鍵。在一些實施方案中，該肽連接子的長度為3-15個胺基酸殘基。在一些實施方案中，式(h)和式(g)中的連接子的胺基酸序列如SEQ ID NO：106所示。在一些實施方案中，該抗原結合分子具有：包含SEQ ID NO：38的胺基酸序列的第一鏈、包含SEQ ID NO：39的胺基酸序列的第二鏈、包含SEQ ID NO：40的胺基酸序列的第三鏈和包含SEQ ID NO：41的胺基酸序列的第四鏈。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其是雙特異性抗體。

在另一個方面，本揭露提供了一種抗原結合分子，其包含Fv、第一Fab、經替換的Fab和Fc區，其中，該Fc區包含能夠相互締合的第一亞基Fc1和第二亞基Fc2，該Fv包含重鏈可變區Fv-VH和輕鏈可變區Fv-VL，該第一Fab包含重鏈可變區Fab1-VH和輕鏈可變區Fab1-VL，該經替換的Fab包含重鏈可變區Fab-S-VH、輕鏈可變區Fab-S-VL、Titin鏈和Obscurin鏈，該Titin鏈和Obscurin鏈能夠形成二聚體；其中，

該Fab-S-VH的C端直接或藉由連接子融合至Titin鏈的N端和該Fab-S-VL的C端直接或藉由連接子融合至Obscurin鏈的N端，或該Fab-S-VH的C端直接或藉由連接子融合至Obscurin鏈的N端和該Fab-S-VL的C端直接或藉由連接子融合至Titin鏈的N端；以及

該第一Fab的重鏈的C端直接或藉由連接子融合至Fc1的N端；該Fv的Fv-VH的C端直接或藉由連接子融合至該第一Fab的重鏈的N端，該Titin鏈的C端或Obscurin鏈的C端直接或藉由連接子融合至Fc2的N端，並且該Fab-S-VH與該Fc2處於同一條鏈上；

在一些實施方式中，該第一Fab和經替換的Fab各自獨立地結合第一抗原，該Fv結合第二抗原；在一些實施方式中，該第一抗原為HGFR，該第二抗原為EGFR。在一些實施方式中，該第一Fab和經替換的Fab結合第一抗原的不同表位。

在一些實施方案中，如前任一項所述的抗原結合分子，該抗原結合分子包含Fc區，該Fc區較佳為IgG Fc區，更佳為IgG₁ Fc區。在一些實施方案中，該Fc區包含能夠相互締合的第一亞基Fc1和第二亞基Fc2，該Fc1和Fc2各自獨立地具有一個或更多個減少Fc區同源二聚化的胺基酸取代。在一些實施方案中，(i)該Fc1具有根據杵臼技術的凸起結構，和該Fc2具有根據杵臼技術的孔結構；較佳地，該Fc1在366位置的胺基酸殘基為W；和該Fc2在366位置的胺基酸殘基為S、在368位置的胺基酸殘基為A、和在407位置的胺基酸殘基為V，該胺基酸殘基位置依據EU索引編號；和/或(ii)該第一亞基Fc1和第二亞基Fc2之間具有工程化二硫鍵，較佳地，該Fc1在354位置的胺基酸殘基為C；和該Fc2在349位置的胺基酸殘基為C，該胺基酸殘基位置依據EU索引編號；更佳地，該Fc1在354位置的胺基酸殘基為C、在356位置的胺基酸殘基為E、在358位置的胺基酸殘基為M和在366位置的胺基酸殘基為W；並且該Fc2在349位置的胺基酸殘基為C、在356位置的胺基酸殘基為E、在358位置的胺基酸殘基為M、在366位置的胺基酸殘基為S、在368位置的胺基酸殘基為A和在407位置的胺基酸殘基為V，該胺基酸殘基位置依據EU索引編號。在一些實施方案中，(i)該Fc2具有根據杵臼技術的凸起結構，和該Fc1具有根據杵臼技術的孔結構；較佳地，該Fc2在366位置的胺基酸殘基為W；和該Fc1在366位置的胺基酸殘基為S、在368位置的胺基酸殘基為A、和在407位置的胺基酸殘基為V，該胺基酸殘基位置依據EU索引編號；和/或(ii)該第一亞基Fc2和第二亞基Fc1之間具有工程化二硫鍵，較佳地，該Fc2在354位置的胺基酸殘基為C；和該Fc1在349位置的胺基酸殘基為C，該胺基酸殘基位置依據EU索引編號；更佳地，該Fc2在354位置的胺基酸殘基為C、在356位置的胺基酸殘基為E、在358位置的胺基酸殘基為M和在366位置的胺基酸殘基為W；並且該Fc1在349位置的胺基酸殘基為C、在356位置的胺基酸殘基為E、在358位置的胺基酸殘基為M、在366位置的胺基酸殘基為S、在368位置的胺基酸殘基為A和在407位置的胺基酸殘基為V，該胺基酸殘基位置依據EU索引編號。在一些實施方案中，該Fc1具有SEQ ID NO：107的胺基酸序列，和該Fc2具有SEQ ID NO：108的胺基酸序列。

在一些實施方案中，如前任一項所述的抗原結合分子，該Fc區包含一個或更多個胺基酸取代，該胺基酸取代能夠減少Fc區與Fc受體的結合。在一些實施方案中，該胺基酸取代能夠減少其與Fcγ受體的結合。在一些實施方案中，該Fc區是人IgG₁ Fc區，並且在234和235位置的胺基酸殘基為A，編號依據為EU索引。

該抗原結合分子包含：具有式(k)所示結構的第一鏈、具有式(l)所示結構的第二鏈、具有式(m)所示結構的第三鏈、具有式(n)所示結構的第四鏈，

式(k)[Fv-VH]-[連接子1]-[Fab1-VH]-[CH1]-[Fc1]，

式(l)[Fv-VL]-[連接子2]-[Fab1-VL]-[CL]，

式(m)[Fab-S-VH]-[連接子3]-[Titin鏈]-[Fc2]，

式(n)[Fab-S-VL]-[連接子4]-[Obscurin鏈]；

在一些實施方案中，該式(k)、式(l)、式(m)和式(n)的連接子是相同或不同的肽連接子。在一些實施方案中，該肽連接子各自獨立地具有L₁-(GGGGS)n-L₂的結構，其中，L₁是鍵、A、GS、GGS或GGGS(SEQ ID NO：116)，n是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，L2是鍵、G、GG、GGG或GGGG(SEQ ID NO：117)，並且該肽連接子不是鍵。在一些實施方案中，該肽連接子的長度為3-15個胺基酸殘基。在一些實施方案中，該肽連接子各自獨立地具有(GGGGS)n的結構，其中n是1、2或3。在一些實施方案中，該式(k)、式(l)、式(m)和式(n)中的連接子的胺基酸序列如SEQ ID NO：105或SEQ ID NO：106所示。在一些實施方案中，該式(k)和式(l)的連接子的胺基酸序列均如SEQ ID NO：105所示，該式(m)和式(n)的連接子的胺基酸序列均如SEQ ID NO：106所示。在一些實施方案中，該抗原結合分子具有一條第一鏈、一條第二鏈、一條第三鏈、一條第四鏈。

該Titin鏈包含SEQ ID NO：45的胺基酸序列或其變體，該SEQ ID NO：45的變體相比SEQ ID NO：45，具有選自由3W、8C、11I、13L、20C、22M/22C、25S、26C、39T、40S、42K、45S、47E、49G、56S、58E、60S、64T、66S/66K、70R、75V、77S、79T、81R、82M、83D和84L組成的組中的一個或更多個胺基酸殘基取代；和

該Obscurin鏈包含SEQ ID NO：64的胺基酸序列或其變體，或SEQ ID NO：65的胺基酸序列或其變體；其中該SEQ ID NO：64的變體相比SEQ ID NO：64，具有選自由2E、3C、7K/7R、9C、11L、12S、13Y/13S、14T、17E、20L、22M/22S、25S、30D、32P/32F、34E、36T、41K、42L、44I、45T、48V、53L、58V、62E/62K/62H、66C、67Q/67T、69S、76S、82H、88C、89L、92E、93C、94G和97G組成的組中的一個或更多個胺基酸殘基取代；該SEQ ID NO：65的變體相比SEQ ID NO：65，具有選自由6E、26S、74C、77S、84C和86C組成的組中的一個或更多個胺基酸殘基取代。

在一些實施方案中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中，該SEQ ID NO：45的變體具有選自以下任一組所述的胺基酸殘基取代：

8C、25S和39T，

20C、25S和39T，

25S、26C和39T，

22C、25S和39T，

8C、25S、39T、66S和77S，

8C、25S、39T、66K、70R、79T和81R，

3W、8C、11I、13L、22M、25S、39T和82M，

8C、11I、25S、39T、66K、79T和81R，

8C、25S、39T、40S、42K、45S、47E、49G、56S、58E、75V、83D和84L，

8C、25S、39T、47E、49G、56S、58E和75V，

8C、25S、39T、56S、58E和75V，

8C、25S、39T、56S、58E、66S和77S，

8C、11I、25S、39T、60S、64T、66K、79T和81R，

8C、11I、20C、25S、39T、60S、64T、66K、79T和81R，

8C、11I、25S、26C、39T、60S、64T、66K、79T和81R。

在一些實施方案中，該SEQ ID NO：45的變體相比SEQ ID NO：45，其N端具有KAGIR(SEQ ID NO：118)的胺基酸序列。

在一些實施方案中，該SEQ ID NO：45的變體相比SEQ ID NO：45，僅具有上述任一項的胺基酸殘基取代。在一些實施方案中，該SEQ ID NO：45的變體包含與SEQ ID NO：45具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%的序列同一性的胺基酸序列。

在一些實施方案中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中，該SEQ ID NO：64的變體具有選自以下任一組所述的胺基酸殘基取代：

88C，

3C，

9C，

25S、76S和88C，

25S、76S和3C，

25S、76S和9C，

7K、25S、62K、76S和88C，

7K、25S、62H、76S和88C，

7R、25S、62K、76S和88C，

7R、25S、62H、76S和88C，

11L、25S、62K、76S和88C，

11L、25S、62H、76S和88C，

12S、13Y、14T、22S、25S、62K、76S和88C，

2E、11L、17E、25S、30D、32P、34E、36T、44I、45T、58V、62E、67Q、69S、76S、88C和97G，

11L、20L、22M、25S、53L、62K、76S和88C，

11L、25S、41K、45T、62K、67Q、69S、76S、88C和89L；

11L、25S、42L、45T、62K、67T、69S、76S、88C、92E和94，

11L、12S、13Y、22S、25S、42L、45T、62K、67Q、69S、76S、88C、92E和94G，

25S、32F、41K、45T、48V、62K、67Q、69S、76S、88C和89L，

13S、25S、32F、41K、45T、48V、62K、67Q、69S、76S、82H、88C和89L，

3C、13S、25S、32F、41K、45T、48V、62K、67Q、69S、76S、82H、88C和89L，

9C、13S、25S、32F、41K、45T、48V、62K、67Q、69S、76S、82H、88C和89L，

13S、32F、41K、45T、48V、62K、67Q、69S、82H、88C和89L，

3C、13S、32F、41K、45T、48V、62K、67Q、69S、82H、88C和89L，

9C、13S、32F、41K、45T、48V、62K、67Q、69S、82H、88C和89L，

13S、25S、32F、41K、45T、48V、62K、66C、67Q、69S、76S、82H、88C、89L和93C，

3C、13S、25S、32F、41K、45T、48V、62K、66C、67Q、69S、76S、82H、88C、89L和93C，

9C、13S、25S、32F、41K、45T、48V、62K、66C、67Q、69S、76S、82H、88C、89L和93C。

在一些實施方案中，該SEQ ID NO：64的變體相比SEQ ID NO：64，其N端具有DQPQF(SEQ ID NO：119)的胺基酸序列。

在一些實施方案中，該SEQ ID NO：64的變體相比SEQ ID NO：64，僅具有上述任一項的胺基酸殘基取代。在一些實施方案中，該SEQ ID NO：64的變體包含與SEQ ID NO：64具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%的序列同一性的胺基酸序列。

在一些實施方案中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中，該SEQ ID NO：65的變體具有選自以下任一組所述的胺基酸殘基取代：

6E和74C，

6E和84C，

6E和86C，

6E、26S、77S和74C，

6E、26S、77S和84C，

6E、26S、77S和86C。

在一些實施方案中，該SEQ ID NO：65的變體相比SEQ ID NO：65，僅具有上述任一項的胺基酸殘基取代。在一些實施方案中，該SEQ ID NO：65的變體包含與SEQ ID NO：65具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%的序列同一性的胺基酸序列。

在一些實施方案中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該Titin鏈包含選自由SEQ ID NO：45至SEQ ID NO：63組成的組的胺基酸序列，該Obscurin鏈包含選自由SEQ ID NO：64至SEQ ID NO：104組成的組的胺基酸序列。

在一些實施方案中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該Titin鏈包含SEQ ID NO：61的胺基酸序列，該Obscurin鏈包含SEQ ID NO：99的胺基酸序列。

在一些實施方式中，本揭露還提供一種抗原結合分子，其包含一個特異性結合EGFR的抗原結合模塊2和兩個特異性結合HGFR的抗原結合模塊1，該兩個抗原結合模塊1結合HGFR的不同表位。

在一些實施方式中，該兩個特異性結合HGFR的抗原結合模塊1，其中一個抗原結合模塊1與包含SEQ ID NO：16的重鏈可變區和SEQ ID NO：17的輕鏈可變區的抗HGFR抗體競爭性結合人HGFR；另一個抗原結合模塊1與包含SEQ ID NO：12的重鏈可變區和SEQ ID NO：13的輕鏈可變區的抗HGFR抗體競爭性結合人HGFR。

在一些實施方式中，該兩個特異性結合HGFR的抗原結合模塊1，其中一個抗原結合模塊1能夠與Omab競爭性結合，另一個抗原結合模塊1能夠與Ab10.1競爭性結合。

在一些實施方式中，該兩個特異性結合HGFR的抗原結合模塊1，其中一個抗原結合模塊1能夠與Omab競爭性結合，另一個抗原結合模塊1能夠與Ab10競爭性結合。

在一些實施方式中，該兩個特異性結合HGFR的抗原結合模塊1，其中一個抗原結合模塊1與Omab結合相同的表位，另一個抗原結合模塊1能夠與Ab10.1結合相同的表位。

在一些實施方式中，該兩個特異性結合HGFR的抗原結合模塊1，其中一個抗原結合模塊1與Omab結合相同的表位，另一個抗原結合模塊1與Ab10結合相同的表位。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，該特異性結合EGFR的抗原結合模塊2包含重鏈可變區E-VH和輕鏈可變區E-VL，該E-VH包含E-HCDR1、E-HCDR2和E-HCDR3，該E-VL包含E-LCDR1、E-LCDR2和E-LCDR3，其中，該E-HCDR1、E-HCDR2和E-HCDR3分別包含SEQ ID NO：3中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列，且該E-LCDR1、E-LCDR2和E-LCDR3分別包含SEQ ID NO：5中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列；和該特異性結合HGFR的抗原結合模塊1包含重鏈可變區M-VH和輕鏈可變區M-VL，該M-VH包含M-HCDR1、M-HCDR2和M-HCDR3，該M-VL包含M-LCDR1、M-LCDR2和M-LCDR3，其中，一個抗原結合模塊1的M-HCDR1、M-HCDR2和M-HCDR3分別包含SEQ ID NO：16中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列，且M-LCDR1、M-LCDR2和M-LCDR3分別包含SEQ ID NO：17中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列；另一個抗原結合模塊1的M-HCDR1、M-HCDR2和M-HCDR3分別包含SEQ ID NO：12中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列，且M-LCDR1、M-LCDR2和M-LCDR3分別包含SEQ ID NO：13中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列；在一些實施方式中，該M-HCDR1、M-HCDR2、M-HCDR3、M-LCDR1、M-LCDR2、M-LCDR3、E-HCDR1、E-HCDR2、 E-HCDR3、E-LCDR1、E-LCDR2、E-LCDR3是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號規則定義的。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子具有以下一種或更多種功能：

a．針對HGFR和/或EGFR的高親和力。在一些實施方式中，該抗原結合分子以小於1.0E-08M(例如小於8.5E-09M、小於7.5E-09M、小於2.5E-09M或更小)的KD值與人HGFR或EGFR結合，該KD值是藉由Biacore方法測定的，具體測試方法見測試例1；

b．針對表達HGFR和/或EGFR的細胞具有體外特異性結合活性，具體測試方法見測試例2；

c．阻斷EGF與EGFR的結合。在一些實施方式中，以小於2.7μg/mL的IC₅₀阻斷EGF與EGFR的結合，具體測試方法見測試例3；

d．阻斷HGF與HGFR的結合。在一些實施方式中，以大於90%的最大阻斷力阻斷HGF與HGFR的結合，具體測試方法見測試例4；

e．抑制細胞EGFR磷酸化，具體測試方法見測試例5；

f．抑制細胞HGFR磷酸化，具體測試方法見測試例6；

g．抑制細胞AKT磷酸化，具體測試方法見測試例7；

h．抑制SNU-5細胞的增殖，具體測試方法見測試例9；

i．腫瘤細胞的ADCC殺傷，具體測試方法見測試例10；或

j．體內抑制腫瘤細胞的生長，具體測試方法見測試例11或12。

在一些實施方式中，如前任一項所述的抗原結合分子，其為低岩藻糖基化抗原結合分子；較佳地，該低岩藻糖基化抗原結合分子為至少80%、85%、90%、95%或100%未被岩藻糖糖基化修飾的抗體；更佳地，該抗原結合分子檢測不到岩藻糖糖基化修飾。

在另一個方面，本揭露提供了一種醫藥組成物，其含有：治療有效量(或預防有效量)的前面任一項所述的抗原結合分子，以及一種或更多種藥學上可接受的載體、稀釋劑、緩衝劑或賦形劑。

在一些實施方案中，該醫藥組成物中還包含至少一種第二治療劑。

在另一個方面，本揭露還提供分離的核酸，其編碼前面任一項所述的抗原結合分子。

在另一個方面，本揭露還提供宿主細胞，其包含前述的核酸。在一些實施方式中，該宿主細胞可選自原核細胞和真核細胞，較佳為真核細胞，更佳哺乳動物細胞，較佳不包括人類的哺乳動物細胞，其中該哺乳動物細胞包括但不限於CHO，293，NSO。在哺乳動物細胞中進行基因編輯可改變抗體或其抗原結合片段的糖基化修飾，進而改變抗原結合分子(例如抗體)的ADCC功能的細胞，例如，剔除Fut8或GnT-III等基因來調節糖基化修飾。

本揭露的宿主細胞不能發育成完整植物或動物個體。

在另一個方面，本揭露還提供一種治療或預防疾病的方法，該方法包括向受試者施用前面任一項所述的抗原結合分子或醫藥組成物的步驟。在一些實施方式中，該方法包括向有需要的受試者施用治療有效量(或預防有效量)的前面任一項所述的抗原結合分子。

在另一個方面，本揭露還提供前面任一項所述的抗原結合分子或醫藥組成物在製備治療或預防疾病的藥物中的用途。

在另一個方面，本揭露還提供用作藥物的前述任一項所述的抗原結合分子或組成物。該藥物用於治療或預防疾病。

在一些實施方式中，前面任一項所述疾病是腫瘤。在一些實施方式中，該腫瘤選自肺癌(包括非小細胞肺癌和小細胞肺癌)、乳腺癌、胰腺癌、結直腸癌(包括結腸癌和直腸癌)、肉瘤、腎細胞癌、肝細胞癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、頭頸癌和膠質母細胞瘤。在一些實施方式中，該腫瘤選自肺癌、乳腺癌、胰腺癌、結腸癌、頭頸癌、胃癌和膠質母細胞瘤。

在一些具體的實施方式中，該肺癌為非小細胞肺癌。

在一些具體的實施方式中，該肺癌為轉移性非小細胞肺癌。

在一些具體的實施方式中，該肺癌為小細胞肺癌。

在一些具體的實施方式中，該肺癌為人肺腺癌。

在一些具體的實施方式中，該肺癌為胃癌。

在一些具體的實施方式中，該腫瘤為EGFR和/或HGFR相關的腫瘤。

圖1為Format1的結構示意圖。

圖2為Format2的結構示意圖。

圖3為抗體與EGFR CHO-S細胞結合活性實驗結果圖，其中，圖式縱坐標為平均螢光強度(簡稱MFI，下同)。

圖4為抗體與HGFR CHO-S細胞結合活性實驗結果圖。

圖5為抗體與H1975-HGF細胞結合活性實驗結果圖。

圖6為抗體與MKN-45細胞結合活性實驗結果圖。

圖7為抗體對細胞EGFR磷酸化的抑制實驗結果。

圖8為抗體對細胞HGFR磷酸化的抑制實驗結果。

圖9為抗體對細胞AKT磷酸化的抑制實驗結果。

圖10為抗體對細胞表面HGFR的減少實驗結果。

圖11為抗體對SNU-5細胞的增殖抑制。

圖12為抗體對Hs746T細胞的ADCC殺傷實驗結果。

圖13為抗體對H292細胞的ADCC殺傷實驗結果。

圖14為抗體抑制HCC827小鼠腫瘤細胞的生長。

術語

本文所用的術語只是為了描述實施方案的目的，並非旨在進行限制。除非另外定義，本文所用的全部技術術語和科學術語具有與本揭露所屬技術領域具有通常知識者通常所理解的相同意義。

除非上下文另外清楚要求，否則在整個說明書和申請專利範圍中，應將詞語“包含”、“具有”、“包括”等理解為具有包含意義，而不是排他性或窮舉性意義；也即，“包括但不僅限於”的意義。除非另有說明，“包含”包括了“由……組成”。例如，對於包含SEQ ID NO：30的胺基酸序列的M-HCDR1，其明確的包含胺基酸序列如SEQ ID NO：30所示的HGFR-HCDR1。

本揭露所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。

術語“和/或”，例如“X和/或Y”應當理解為意指“X和Y”或“X或Y”並且應當被用來提供對兩種含義或任一含義的明確支持。

術語“胺基酸”是指天然存在的和合成的胺基酸，以及以與天然存在的胺基酸類似的方式起作用的胺基酸類似物和胺基酸模擬物。天然存在的胺基酸是由遺傳密碼編碼的那些胺基酸，以及後來修飾的那些胺基酸，例如羥脯胺酸、γ-羧基谷胺酸和O-磷酸絲胺酸。胺基酸類似物是指與天然存在的胺基酸具有相同基本化學結構(即與氫、羧基、胺基和R基團結合的α碳)的化合物，例如高絲胺酸、正亮胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。此類類似物具有修飾的R基團(例如，正亮胺酸)或修飾的肽骨架，但保留與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構。胺基酸模擬物是指具有與胺基酸的一般化學結構不同的結構，但是以與天然存在的胺基酸類似的方式起作用的化學化合物。

術語“胺基酸突變”包括胺基酸取代，缺失，插入和修飾。可以進行取代、缺失、插入和修飾的任意組合來實現最終構建體，只要最終構建體擁有期望的特性，例如降低或對Fc受體的結合。胺基酸序列缺失和插入包括在多肽鏈的胺基端和/或羧基端的缺失和插入。具體的胺基酸突變可以是胺基酸取代。在一個實施方式中，胺基酸突變是非保守性的胺基酸取代，即將一個胺基酸用具有不同結構和/或化學特性的另一種胺基酸替換。胺基酸取代包括由非天然存在的胺基酸或由20種天然胺基酸的衍生物(例如4-羥脯胺酸、3-甲基組胺酸、鳥胺酸、高絲胺酸、5-羥賴胺酸)替換。可以使用本領域中公知的遺傳或化學方法生成胺基酸突變。遺傳方法可以包括定點誘變、PCR，基因合成等。基因工程以外的改變胺基酸側鏈基團的方法，如化學修飾也可能是可用的。本文中可使用各種名稱來指示同一胺基酸突變。本文中，可採用位置+胺基酸殘基的方式表示特定位點的胺基酸殘基，例如366W，則表示在366位點上的胺基酸殘基為W。T366W則表示第366位點上的胺基酸殘基由原來的T突變為了W。

術語“抗原結合分子”以最廣義使用，涵蓋各種特異性結合抗原的分子，包括但不限於抗體、其他具有抗原結合活性的多肽以及兩者融合而成的抗體融合蛋白。示例性的，本文中的抗原結合分子是雙特異性抗原結合分子(例如：雙特異性抗體)。術語“雙特異性抗原結合分子”指能夠對兩個不同抗原或同一抗原的至少兩個不同抗原表位特異性結合的抗原結合分子。

術語“抗體”以最廣義使用，並且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體，多株抗體；單特異性抗體，多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，全長抗體和抗體片段(或抗原結合片段，或抗原結合部分)，只要它們展現出期望的抗原結合活性。“天然抗體”指天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗體是約150,000道爾頓的異四聚蛋白，由二硫鍵結合的兩條輕鏈和兩條重鏈構成。從N至C端，每條重鏈具有一個可變區(VH)，又稱作可變重域、重鏈可變區，接著是三個恆定域(CH1、CH2和CH3)。類似地，從N至C端，每條輕鏈具有一個可變區(VL)，又稱作可變輕域，或輕鏈可變域，接著是一個恆定輕域(輕鏈恆定區、CL)。

術語“雙特異性抗體”指能夠對兩個不同抗原或同一抗原的兩個不同抗原表位特異性結合的抗體(包括抗體或其抗原結合片段，如單鏈抗體)。現有技術已公開了各種結構的雙特異性抗體。根據IgG分子的完整性可分為IgG樣雙特異性抗體和抗體片段型雙特異性抗體。根據抗原結合區域的數量可分為二價、三價、四價或更多價的雙特異性抗體。根據結構是否對稱可分為對稱結構雙特異性抗體和不對稱結構雙特異性抗體。其中，片段型雙特異性抗體，例如缺乏Fc片段的Fab片段，其藉由將2個或多個Fab片段結合在一個分子中形成雙特異性抗體，其具有較低的免疫原性，且分子量小，具有較高的腫瘤組織滲透性，該類型的典型的抗體結構如F(ab)2、scFv-Fab、(scFv)2-Fab等。IgG樣雙特異性抗體(例如具有Fc片段)，這類抗體相對分子量較大，Fc片段有助於抗體的純化，並提高其溶解性、穩定性，Fc部分還可能會與受體FcRn結合，增加抗體血清半衰期。典型的雙特異性抗體結構模型如KiH、CrossMAb、Triomab quadroma、Fc△Adp、ART-Ig、BiMAb、Biclonics、BEAT、DuoBody、Azymetric、XmAb、2：1 TCBs、1Fab-IgG TDB、FynomAb、two-in-one/DAF、scFv-Fab-IgG、DART-Fc、LP-DART、CODV-Fab-TL、HLE-BiTE、F(ab)2-CrossMAb、IgG-(scFv)2、Bs4Ab、DVD-Ig、Tetravalent-DART-Fc、(scFv)4-Fc、CODV-Ig、mAb2、F(ab)4-CrossMAb等雙特異性抗體(參見Aran F.Labrijn等，Nature Reviews Drug Discovery volume 18，pages585-608(2019)；Chen S1等，J Immunol Res.2019Feb 11；2019：4516041)。

術語“可變區”或“可變域”指抗原結合分子中結合抗原的域。本文中，特異性結合HGFR的抗原結合模塊1中的重鏈可變區標示為M-VH，輕鏈可變區標示為M-VL；特異性結合EGFR的抗原結合模塊2中的重鏈可變區標示為E-VH，輕鏈可變區標示為E-VL。VH和VL各包含四個保守的框架區(FR)和三個互補決定區(CDR)。其中，術語“互補決定區”或“CDR”指可變結構域內主要促成與抗原結合的區域；“框架”或“FR”是指除CDR殘基之外的可變結構域殘基。VH包含3個CDR區：HCDR1、HCDR2和HCDR3；VL包含3個CDR區：LCDR1、LCDR2和LCDR3。本文中，M-VH中的3個CDR區分別標示為M-HCDR1、M-HCDR2和M-HCDR3；M-VL中的3個CDR區分別標示為M-LCDR1、M-LCDR2和M-LCDR3；E-VH中的3個CDR區分別標示為E-HCDR1、E-HCDR2和E-HCDR3；E-VL中的3個CDR區分別標示為E-LCDR1、 E-LCDR2和E-LCDR3。每個VH和VL由從胺基末端排到羧基末端按以下順序排列的三個CDR和四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。單個VH或VL可能足以賦予抗原結合特異性。

可以藉由各種公知方案來確定CDR的胺基酸序列邊界，例如：“Kabat”編號規則(參見Kabat等(1991)，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD)、“Chothia”編號規則、“ABM”編號規則、“contact”編號規則(參見Martin,ACR.Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains[J].2001)和ImMunoGenTics(IMGT)編號規則(Lefranc，M.P.等，Dev.Comp.Immunol.，27，55-77(2003)；Front Immunol.2018 Oct 16；9：2278)等；各種編號系統之間的對應關係是所屬技術領域具有通常知識者熟知的。本揭露的編號規則如下表1中所示。

除非另有說明，本揭露實施例中的可變區和CDR序列均適用“Kabat”編號規則。儘管在具體的實施方案中，採用了Kabat編號規則來限定胺基酸殘基，但是其他編號系統所的對應技術方案將視為等同技術方案。

術語“抗體片段”指不同於完整抗體的分子，其包含完整抗體的部分，該部分保留了完整抗體的抗原結合能力。抗體片段的實例包括但不限於Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab′)₂、單域抗體、單鏈Fab(scFab)、雙抗體、線性抗體、單鏈抗體分子(例如scFv)；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。

Fab指由免疫球蛋白的VH和CH1(Fab重鏈)與VL和CL(Fab輕鏈)組成的蛋白質。

Fv指由免疫球蛋白的VH與VL組成的抗原結合域。

本揭露中，在一些實施方案中，該第一Fab具有Fab的結構。而在經替換的Fab中，CH1與CL分別被Titin鏈或Obscurin鏈替代。

術語“Fc區”或“片段可結晶區”用於定義抗體重鏈的C末端區域，包括天然Fc區和改造的Fc區。在一些實施方式中，Fc區包含了相同或不同的兩個亞基。在一些實施方式中，人IgG重鏈的Fc區定義為從Cys226位置處的胺基酸殘基或從Pro230延伸至其羧基末端。用於本文所述抗體的合適天然序列Fc區包括人IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。除非另有說明，Fc區的編號規則為EU索引。

術語“Titin鏈”是指Titin蛋白中一段長度為78-118個胺基酸的片段，其包含Titin Ig-樣152結構域的肽段或其功能變體。該Titin鏈能夠與Obscurin鏈形成二聚化複合物。

術語“Obscurin鏈”是指Obscurin蛋白上一段長度為87-117個胺基酸的片段，其包含Obscurin Ig-樣1結構域的肽段或其功能變體；或是指Obscurin-樣1蛋白上一段長度為78-118個胺基酸的片段，其包含Obscurin-樣Ig-樣1結構域的肽段或其功能變體。該Obscurin鏈能夠與Titin鏈結合形成二聚化複合物。本揭露的Titin鏈與Obscurin鏈可用於替換Fab中的CH1和CL，形成經替換的Fab(Fab-S)。該替換不影響抗原結合分子與抗原的結合。

術語“嵌合”抗體指抗體中的重和/或輕鏈的一部分自特定的來源或物種衍生，而重和/或輕鏈的剩餘部分自不同來源或物種衍生的抗體。

術語“人源化”抗體是保留非人抗體的反應性同時在人中具有較低免疫原性的抗體。例如，可以藉由保留非人CDR區，並用其人對應物(即，恆定區以及可變區的框架區部分)替換抗體的其餘部分來實現人源化。

術語“親和力”是指分子(例如，本公開的抗原結合分子)的單個結合部位與其結合配體(例如，抗原)之間非共價相互作用的總體的強度。除非另外指明，如本文所用，“結合親和力”是指內部結合親和力，其反映出結合對(例如，抗體與抗原)的成員之間1：1相互作用。分子X對其配體Y的親和力通常可以由平衡解離常數(KD)表示。親和力可以藉由本領域已知的常規方法(包括本文所述的那些)測量。術語“kassoc”或“ka”指特定抗體-抗原相互作用的締合速率，而如本文所使用的術語“kdis”或“kd”意在是指特定抗體-抗原相互作用的解離速率。如本文所使用的，術語“KD”指平衡解離常數，其獲得自kd與ka的比率(即kd/ka)並且表示為莫耳濃度(M)。可以使用本領域已知的方法測定抗體的KD值，例如：用於測定抗體KD的方法包括使用生物傳感系統例如系統測量表面電漿共振，或藉由溶液平衡滴定法(SET)測量溶液中的親和力。

術語“效應子功能”指那些可歸於抗體Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列變體Fc區)且隨抗體同種型而變化的生物學活性。抗體效應子功能的例子包括：C1q結合和補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)下調；和B細胞活化。

術語“單株抗體”指基本上均質的抗體的群或其成員，即在該群中包含的抗體分子的胺基酸序列是相同的，除了可能少量存在的天然突變以外。相比之下，多株抗體製劑通常包含在其可變結構域具有不同胺基酸序列的多種不同抗體，其通常特異性針對不同表位。“單株”表示從基本上均質的抗體群體獲得的抗體的特徵，並且不應解釋為要求藉由任何特定方法來生產抗體。在一些實施方式中，本揭露提供的抗體是單株抗體。

術語“抗原”是指能夠由抗原結合分子(例如抗體)選擇性結合的分子或分子部分。抗原可具有一個或多個能夠與不同的抗原結合分子(例如抗體)相互作用的表位。

術語“表位”指能夠與抗體或其抗原結合片段特異性結合的抗原上的區域(area或region)。表位可以由連續胺基酸(線性表位)形成或包含非連續胺基酸(構象表位)，例如因抗原的折疊(即藉由抗原的三級折疊)而使得非連續的胺基酸在空間上得以接近。構象表位和線性表位的差別在於：在變性溶劑的存在下，抗體對構象表位的結合喪失。通常表位包含處於獨特空間構象的至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，或8-10個胺基酸。可以使用本領域例行方法來篩選結合特定表位的(即那些結合相同表位的)抗體，例如但不限於丙胺酸掃描，肽印跡(見Meth.Mol.Biol.248(2004)443-463)，肽切割分析，表位切除，表位提取，抗原的化學修飾(見Prot.Sci.9(2000)487-496)，和交叉阻斷(見“Antibodies”，Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY))。

術語“能夠特異性結合”、“特異性結合”或“結合”是指相比其他抗原或表位，抗體能夠以更高的親和力結合至某個抗原或其表位。通常，抗體以約1×10^-7M或更小(例如約1×10^-8M或更小)的平衡解離常數(KD)結合抗原或其表位。在一些實施方式中，抗體與抗原結合的KD為該抗體結合至非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白)的KD的10%或更低(例如1%)。可使用已知的方法來測量KD，例如藉由FACS或BIACORE^®表面電漿共振測定法所測量的。然而，特異性結合至抗原或其表位的抗體可能對其它相關的抗原具有交叉反應性，例如，對來自其它物種(同源)(如人或猴，例如食蟹獼猴(Macaca fascicμLaris)(cynomolgus，cyno)、黑猩猩(Pan troglodytes)(chimpanzee，chimp))或狨猴(Callithrix jacchus)(commonmarmoset，marmoset)的相應抗原具有交叉反應性。

術語“抗原結合模塊”指特異性結合目標抗原的多肽分子。抗原結合模塊包括如本文所述的抗體及其片段。具體的抗原結合模塊包括抗體的抗原結合域，其包含抗體重鏈可變區和抗體輕鏈可變區。術語“特異性結合HGFR的抗原結合模塊”是指能夠以足夠的親和力結合HGFR或其表位的模塊。在某些實施例中，特異性結合HGFR的抗原結合模塊具有以下的平衡解離常數(KD)：<約1μM、<約100nM或<約10nM或更小，其是藉由Biacore方法測量的。在某些實施例中，特異性結合HGFR的抗原結合模塊結合來自不同物種的HGFR中的保守表位。術語“特異性結合EGFR的抗原結合模塊”是指能夠以足夠的親和力結合EGFR或其表位的模塊，使得含有該模塊的分子可用作靶向EGFR的診斷劑和/或治療劑。在某些實施例中，特異性結合EGFR的抗原結合模塊具有以下的平衡解離常數(KD)：<約1μM、<約100nM、<約10nM或更小，其是藉由Biacore方法測量的。在某些實施例中，特異性結合EGFR的抗原結合模塊結合來自不同物種的EGFR中的保守表位。抗原結合模塊包括如本文定義的抗體片段，例如Fab，經替換的Fab或Fv。

在上下文中，“抗原結合模塊1”、“抗原結合模塊2”、“連接子1”、“連接子2”中的序數詞，其目的僅在於區分不同的技術特徵、化學實體；而不限定任何順序、水平、數量。

術語“連接子”指連接兩個多肽片段的連接單元。在本文中，同一或不同結構式中出現的連接子可以是相同或不同的。連接子可以是肽連接子，其包含一個或更多個胺基酸，典型的約1-30個、2-24個或3-15個胺基酸。應用於本文的連接子可以是相同或不同的。當“-”出現在結構式中，其表示兩側的單元直接藉由共價鍵連接。當術語“鍵”出現在結構單元，其表示該單元兩側的單元直接連接。

“Tm”是溶解變性溫度(例如，藉由內源螢光所測量的)。當蛋白質變性(加熱或變性劑作用)時，三級結構打開，芳香族胺基酸微環境發生變化，導致發射螢光光譜改變。本揭露中，Tm1是指螢光變化到最大值一半時的溫度。

“Tonset”是變性起始溫度。意指蛋白質開始變性時的溫度，即螢光值開始變化時的溫度。

“Tagg”是聚集起始溫度。藉由靜態光散射，在266nm和473nm兩個波長下檢測聚集體，監測到樣品開始聚集時的溫度。Tagg266指的是266nm下監測到聚集起始溫度。

術語“抗體依賴性細胞的細胞毒性”、“抗體依賴性細胞介導的細胞毒性”或“ADCC”是誘導細胞死亡的機制，該機制依賴於抗體包被的靶細胞與具有裂解活性的效應細胞(如自然殺傷細胞(NK)、單核細胞、巨噬細胞和中性粒細胞)經由效應細胞上表達的Fcγ受體(FcγR)發生的相互作用。例如，NK細胞表達FcγRIIIa，而單核細胞表達FcγRI、FcγRII和FcγRIIIa。本文提供的抗體的ADCC活性可使用體外測定，使用表達抗原的細胞作為靶細胞和NK細胞作為效應細胞進行評定。根據從裂解的細胞中釋放的標記物(例如放射性受質、螢光染料或天然胞內蛋白)來檢測細胞裂解。

術語“抗體依賴性細胞吞噬作用”(“ADCP”)是指藉由吞噬細胞(如巨噬細胞或樹突狀細胞)的內化作用消除抗體包被的靶細胞的機制。

術語“補體依賴性細胞毒性”或“CDC”是指誘導細胞死亡的機制，其中靶細胞上所結合的抗體的Fc效應域結合並激活補體成分C1q，C1q繼而激活補體級聯，從而導致靶細胞死亡。補體的激活也可導致補體成分沉積在靶細胞表面上，這些補體成分藉由結合白細胞上的補體受體(例如，CR3)來促進CDC。

術語“岩藻糖基化”或“岩藻糖基化的”或“岩藻糖糖基化修飾”指在附著於抗原結合分子(例如抗體)的肽鏈的寡糖內存在岩藻糖殘基。岩藻糖基化是糖蛋白翻譯後修飾的一個過程。與核心岩藻糖基化相關的代表性酶基因有GMD(GDP-甘露糖4,6-脫水酶)基因和Fut8(FUT8， fut8，α-1,6-岩藻糖基轉移酶)基因。藉由抑制這兩個基因的表達或者構建Fut8剔除型CHO宿主細胞可有效調節核心岩藻糖基化水平(YAMANE-OHNUKI et al.,“Establishment of FUT8knockout Chinese hamster ovary cells：an ideal host cellline for producing completely defucosylated antibodies with enhancedantibody-dependent cellular cytotoxicity.”,BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING,2004,p614-622)。通常，岩藻糖基化位於抗體Fc區的N-寡糖中，在核心N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)殘基處(例如人IgG1 Fc的Asn297位置(對應於EU編號規則))包含α-1,6-岩藻糖。

“低岩藻糖基化”是指：帶有岩藻糖基化修飾的抗原結合分子(例如抗體)在抗原結合分子群(例如抗體群)中的比例不高於預定值，例如不高於20%、不高於15%、不高於10%、不高於5%、不高於4%、不高於3%、不高於2%、不高於%1、不高於0.5%、不高於0.1%。

“未檢測到岩藻糖基化”、“非岩藻糖基化”或“無岩藻糖基化”是指附著於Fc區的碳水化合物結構缺乏岩藻糖的糖基化修飾。所屬技術領域具有通常知識者應當理解，在本公開中“無”、“缺乏”不能解讀為“完全不存在”，而應當理解為藉由本領域已知的寡糖測定方法“檢測不到”岩藻糖基化修飾。

抗原結合分子(例如抗體)岩藻糖基化水平可藉由本領域已知方法測定所有寡糖，進而確定岩藻糖基化寡糖的百分比。本領域已知的測定岩藻糖基化方法包括但不限於凝膠電泳、液相色譜法、和質譜分析法等。例如，藉由親水性相互作用色譜法(或親水性相互作用液相色譜法， HILIC)測定抗體的岩藻糖基化的水平，例如用肽-N-聚糖酶F對樣品進行處理變性以切割N-連接的聚糖，然後分析N-連接的聚糖的岩藻糖含量。

本揭露中，在一些實施方案中，本揭露的低岩藻糖基化抗體是至少80%的重鏈未被岩藻糖的糖基化修飾的抗體，例如至少80-95%、90-95%、95-100%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%抗體重鏈未被岩藻糖糖基化修飾。本揭露中，除非另有說明，否則“非岩藻糖基化”是指100%重鏈未被岩藻糖糖基化修飾的抗原結合分子(例如抗體)。

低岩藻糖基化或非岩藻糖基化抗原結合分子(例如抗體)可藉由本領域公知方法製備。例如藉由添加、易位或缺失抗體上存在的一個或多個碳水化合物部分，例如使用岩藻糖苷酶切割抗體的岩藻糖殘基(參見Tarentino等(1975)Biochem.14：5516)來製備。低岩藻糖基化的抗體還可藉由改變糖基化的組成來改變糖基化水平，例如藉由修飾在N297殘基處與每個Fc片段附接的聚糖模塊來製備(Natsume等(2009)Drug Des.Devel.Ther.3：7)。也可以在不改變抗體序列的情況下，例如，可以藉由改變抗體糖基化模式的細胞表達低岩藻糖基化或非岩藻糖基化抗體，包括例如經遺傳工程改變的糖基化工程的細胞來製備(參見例如，Hse等，(1997)J.Biol.Chem.272：9062-9070；Yang等，(2015)Nature Biotechnology 33,842-844)。各種糖基化工程的細胞已經在本領域中公開，例如，缺乏岩藻糖轉移酶基因(Fut8，(α-(1,6)岩藻糖轉移酶)的細胞系Ms704、Ms705和Ms709等(參見Yamane-Ohnuki等(2004)Biotechnol.Bioeng.87：614；美國專利20040110704)，使岩藻糖附接至Asn(297)連接的糖類的能力降低的CHO細胞系Lec13(參見WO 03/035835)，具有很少或沒有將岩藻糖添加至N-乙醯葡萄糖胺(其結合抗體的Fc區)的活性的大鼠骨髓瘤細胞系YB2/0(參見EP 1176195)；用於生產具有經修飾的糖基化模式的抗體的植物細胞(參見美國專利US20120276086)。另外，攜帶編碼使用GDP-6-脫氧-D-來蘇-4-己糖作為受質的酶(如GDP-6-脫氧-D-來蘇-4-己糖還原酶(RMD))的重組基因細胞也可生產低岩藻糖基化或非岩藻糖基化抗體(參見美國專利US8642292)。

術語“核酸”在本文中可與術語“多核苷酸”互換使用，並且是指呈單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。該術語涵蓋含有已知核苷酸類似物或修飾的骨架殘基或連接的核酸，該核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有與參考核酸相似的結合特性，並且以類似於參考核苷酸的方式代謝。此類類似物的實例包括但不限於硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。

“分離的核酸”指已經與其天然環境的組分分開的核酸分子。分離的核酸包括在下述細胞中含有的核酸分子，該細胞通常含有該核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外或存在於不同於其天然染色體位置的染色體位置處。編碼該抗原結合分子的分離的核酸指，編碼抗體重鏈和輕鏈(或其片段)的一個或更多個核酸分子，並包括在單一載體或分開的載體中，或存在於宿主細胞中一個或更多個位置的一個或更多個核酸分子。除非另有說明，否則特定的核酸序列還隱含地涵蓋其保守修飾的變體(例如，簡併密碼子取代)和互補序列以及明確指明的序列。具體地，如下詳述，簡併密碼子取代可以藉由產生如下序列而獲得，在這些序列中，一個或更多個所選的(或全部)密碼子的第三位被簡並鹼基和/或脫氧肌苷殘基取代。

術語“多肽”和“蛋白質”在本文中可互換使用，指胺基酸殘基的聚合物。該術語適用於胺基酸聚合物，其中一個或更多個胺基酸殘基是相應天然存在的胺基酸的人工化學模擬物，以及適用於天然存在的胺基酸聚合物和非天然存在的胺基酸聚合物。除非另外說明，否則特定的多肽序列還隱含地涵蓋其保守修飾的變體。

術語序列“同一性”指，當對兩條序列進行最佳比對時，兩條序列的胺基酸/核酸在等價位置相同的程度(百分比)；在進行最佳比對時，必要時允許引入間隙以獲取最大序列同一性百分比，且不將任何保守性取代視為序列同一性的一部分。為測定序列同一性百分比，比對可以藉由本領域技術已知的技術來實現，例如使用公開可得到的計算機軟體，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)軟體。所屬技術領域具有通常知識者可確定適用於測量比對的參數，包括在所比較的序列全長上達成最大比對所需的任何算法。

術語“融合”或“連接”是指部件(例如抗原結合模塊和Fc結構域)直接地或經由連接子共價連接。

術語“載體”意指能夠轉運與其連接的另一多核苷酸的多核苷酸分子。一種類型的載體是“質粒”，其是指環狀雙鏈DNA環，其中可以連接附加的DNA區段。另一種類型的載體是病毒載體，例如腺相關病毒載體(AAV或AAV2)，其中另外的DNA區段可以連接到病毒基因組中。某些載體能夠在引入它們的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其他載體(例如，非附加型哺乳動物載體)可以在引入宿主細胞中後整合到宿主細胞的基因組中，從而與宿主基因組一起複製。術語“表達載體”或“表達構建體”是指適用於對宿主細胞進行轉化且含有指導和/或控制(連同宿主細胞一起)與其可操作地連接的一個或更多個異源編碼區的表達的核酸序列的載體。表達構建體可以包括但不限於影響或控制轉錄、翻譯且在存在內含子時影響與其可操作地連接的編碼區的RNA剪接的序列。

術語“宿主細胞”，“宿主細胞系”，和“宿主細胞培養物”可互換使用，並且指已經導入外源核酸的細胞，包括此類細胞的後代。宿主細胞包括“轉化體”和“經轉化的細胞”，其包括原代的經轉化的細胞及自其衍生的後代，而不考慮傳代的次數。後代在核酸內容物上可以與親本細胞不完全相同，而是可以含有突變。本文中，該術語包括突變體後代，其包括具有與在原代轉化細胞中篩選或選擇的細胞具有相同功能或生物學活性。宿主細胞包括原核和真核宿主細胞，其中真核宿主細胞包括但不限於哺乳動物細胞、昆蟲細胞系植物細胞和真菌細胞。哺乳動物宿主細胞包括人、小鼠、大鼠、犬、猴、豬、山羊、牛、馬和倉鼠細胞，包括但不限於中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NSO、SP2細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人肝細胞癌細胞(例如，Hep G2)、A549細胞、3T3細胞和HEK-293細胞。真菌細胞包括酵母和絲狀真菌細胞，包括例如巴氏畢赤酵母(Pichiapastoris)、芬蘭畢赤酵母(Pichia finlandica)、海藻畢赤酵母(Pichia trehalophila)、科克拉馬畢赤酵母(Pichia koclamae)、膜狀畢赤酵母(Pichia membranaefaciens)、小畢赤酵母(Pichia minuta)(Ogataea minuta、Pichia lindneri)、仙人掌畢赤酵母(Pichiaopuntiae)、耐熱畢赤酵母(Pichia thermotolerans)、柳畢赤酵母(Pichia salictaria)、古爾克畢赤酵母(Pichia guercuum)、皮傑普畢赤酵母(Pichia pijperi)、具柄畢赤酵母(Pichia stiptis)、甲醇畢赤酵母 (Pichia methanolica)、畢赤酵母屬、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、釀酒酵母屬、多形漢遜酵母(HansenμLa polymorpha)、克魯維酵母屬、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、白色念珠菌(Candida albicans)、構巢麯黴(Aspergillus nidμLans)、黑麯黴(Aspergillus niger)、米麯黴(Aspergillus oryzae)、裡氏木黴(Trichoderma reesei)、勒克氏菌(Chrysosporium lucknowense)、鐮刀菌屬(Fusarium sp.)、禾穀鐮刀菌(Fusarium gramineum)、菜鐮刀菌(Fusarium venenatum)、小立碗蘚(Physcomitrella patens)和粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)。畢赤酵母屬、任何釀酒酵母屬、多形漢遜酵母(HansenμLa polymorpha)、任何克魯維酵母屬、白色念珠菌(Candida albicans)、任何麯黴屬、裡氏木黴(Trichoderma reesei)、勒克黴菌(Chrysosporium lucknowense)、任何鐮刀菌屬、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)和粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)。

“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地特徵可以但不必發生，將指明包括該特徵發生或不發生的條件。

術語“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述的抗體或抗原結合分子與其他化學組分的混合物，該其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。

術語“藥學上可接受的載體(vehicle)、稀釋劑、緩衝劑或賦形劑”指藥學配製劑中與活性成分不同的，且對受試者無毒的成分。

術語“受試者”或“個體”包括人類和非人類動物。非人動物包括所有脊椎動物(例如哺乳動物和非哺乳動物)例如非人靈長類(例如，食蟹猴)、綿羊、狗、牛、雞、兩棲動物和爬行動物。除非指出時，否則該術語“患者”或“受試者”在本文中可互換地使用。如本文所使用的，術語“食蟹猴(cyno)”或“食蟹猴(cynomolgus)”是指食蟹猴(Macaca fascicμLaris)。在某些實施方案中，個體或受試者是人。

“施用”或“給予”，當其應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組成物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。

術語“樣品”是指從受試者分離的採集物(如流體、細胞、或組織的，以及存在於受試者體內的流體、細胞或組織)。示例性樣品為生物流體，如血液、血清和漿膜液、血漿、淋巴液、尿液、唾液、囊液、淚液、排泄物、痰、分泌組織和器官的黏膜分泌物、陰道分泌物、腹水、胸膜、心包、腹膜、腹腔和其它體腔的流體、由支氣管灌洗液收集的流體、滑液、與受試者或生物來源接觸的液體溶液，例如培養基(包括條件培養基)、灌洗液等，組織活檢樣品、細針穿刺、手術切除的組織、器官培養物或細胞培養物。

“治療(treatment或treat)”和“處理”(及其語法變型)指施加至所治療個體的臨床干預，並且可以為了預防或者在臨床病理學的過程期間進行實施。治療的期望效果包括但不限於預防疾病的發生或復發，減輕症狀，減輕/減少疾病的任何直接或間接病理後果，預防轉移，降低疾病進展速率，改善或減輕疾病狀態，和消退或改善的預後。在一些實施方案中，使用本揭露的抗原結合分子來延遲疾病的形成或減緩疾病的進展。

“有效量”一般是足以降低症狀的嚴重程度和/或頻率、消除這些症狀和/或潛在病因、預防症狀和/或其潛在病因出現和/或改良或改善由疾病狀態引起或與其相關的損傷的量。在一些實施例中，有效量是治療有效量或預防有效量。

“治療有效量”是足以治療疾病狀態或症狀、尤其與該疾病狀態相關的狀態或症狀，或者以其他方式、阻礙、延遲或逆轉該疾病狀態或與該疾病相關的任何其他不理想症狀的進展的量。

“預防有效量”是當給予受試者時將具有預定預防效應，例如預防或延遲該疾病狀態的發作(或復發)，或者降低該疾病狀態或相關症狀的發作(或復發)可能性的量。完全治療或預防效未必在給予一個劑量之後便發生，可能在給予一系列劑量之後發生。因而，治療或預防有效量可以一次或多次給予的方式給予。“治療有效量”和“預防有效量”可取決於多種因素變化：如個體的疾病狀態、年齡、性別和體重，以及治療劑或治療劑組合在個體中引發期望的應答的能力。有效治療劑或治療劑組合的示例性指標包括例如患者改善的健康狀況。

靶分子

“HGFR”應作廣泛的理解，旨在涵蓋HGFR在哺乳動物體內各階段中的各種形式的分子，例如但不限於HGFR基因在擴增、複製、轉錄、剪接、加工、轉譯、修飾過程中所產生的分子(例如前體HGFR、成熟HGFR、膜表達的HGFR、HGFR剪接變體、修飾的HGFR、或其片段)；該術語也涵蓋人工製備的或體外表達的HGFR。

“EGFR”應作廣泛的理解，旨在涵蓋EGFR在哺乳動物體內各階段中的各種形式的分子，例如但不限於EGFR基因在擴增、複製、轉錄、剪接、加工、轉譯、修飾過程中所產生的分子(例如前體EGFR、成熟EGFR、膜表達的EGFR、EGFR剪接變體、修飾的EGFR、或其片段)；該術語也涵蓋人工製備的或體外表達的EGFR。

本揭露的抗原結合分子

本揭露提供了抗原結合分子，其具有諸多有利的特性，例如親和力、對細胞表面HGFR、EGFR的結合特異性、阻斷EGF與EGFR的結合、阻斷HGF與HGFR的結合、抑制細胞EGFR磷酸化、抑制細胞HGFR磷酸化、抑制細胞AKT磷酸化、抑制SNU-5細胞的增殖、腫瘤細胞的ADCC殺傷、治療活性、安全性(如更低的細胞因子釋放)、藥物代謝動力學特性和/或成藥性(如產率、純度和穩定性等)。

示例性的抗原結合分子

在一個方面，本揭露提供了一種抗原結合分子，其包含至少一個特異性結合HGFR的抗原結合模塊1和至少一個特異性結合EGFR的抗原結合模塊2。特別的，本揭露的抗原結合分子具有以下一種或更多種功能：

b．針對表達HGFR和/或EGFR細胞的體外特異性結合活性，具體測試方法見測試例2；

c．阻斷EGF與EGFR的結合。在一些實施方式中，以小於2.7μg/mL的IC50阻斷EGF與EGFR的結合，具體測試方法見測試例3；

e．抑制細胞EGFR磷酸化，具體測試方法見測試例5；

f．抑制細胞HGFR磷酸化，具體測試方法見測試例6；

g．抑制細胞AKT磷酸化，具體測試方法見測試例7；

h．抑制SNU-5細胞的增殖，具體測試方法見測試例9；

i．腫瘤細胞的ADCC殺傷，具體測試方法見測試例10；或

在一個方面，本揭露提供了一種抗原結合分子，其包含至少一個特異性結合HGFR的抗原結合模塊1和至少一個特異性結合EGFR的抗原結合模塊2；其中，該抗原結合模塊1包含重鏈可變區M-VH和輕鏈可變區M-VL，該M-VH包含M-HCDR1、M-HCDR2和M-HCDR3，該M-VL包含M-LCDR1、M-LCDR2和M-LCDR3，該抗原結合模塊2包含重鏈可變區E-VH和輕鏈可變區E-VL，該E-VH包含E-HCDR1、E-HCDR2和E-HCDR3，該E-VL包含E-LCDR1、E-LCDR2和E-LCDR3；其中

該特異性結合HGFR的抗原結合模塊1，其中(i)該M-HCDR1如SEQ ID NO：30所示，該M-HCDR2如SEQ ID NO：31所示，該M-HCDR3如SEQ ID NO：32所示，該M-LCDR1如SEQ ID NO：27所示，該M-LCDR2如SEQ ID NO：33所示，和該M-LCDR3如SEQ ID NO：29所示；或(ii)該M-HCDR1如SEQ ID NO：18所示，該M-HCDR2如SEQ ID NO：19所示，該M-HCDR3如SEQ ID NO：20所示，該M-LCDR1如SEQ ID NO：21所示，該M-LCDR2如SEQ ID NO：22所示，和該M-LCDR3如SEQ ID NO：23所示；或(iii)該M-HCDR1如SEQ ID NO：24所示，該M-HCDR2如SEQ ID NO：25所示，該M-HCDR3如SEQ ID NO：26所示，該M-LCDR1如SEQ ID NO：27所示，該M-LCDR2如SEQ ID NO：28所示，和該M-LCDR3如SEQ ID NO：29所示；和

該特異性結合EGFR的抗原結合模塊2，其中該E-HCDR1如SEQ ID NO：6所示，該E-HCDR2如SEQ ID NO：7所示，該E-HCDR3如SEQ ID NO：8所示，該E-LCDR1如SEQ ID NO：9所示，該E-LCDR2如SEQ ID NO：10所示，和該E-LCDR3如SEQ ID NO：11所示。

在一些實施方式中，該抗原結合分子包含兩個特異性結合HGFR的抗原結合模塊1，其中一個抗原結合模塊1，其M-VH具有：如SEQ ID NO：30所示的M-HCDR1、如SEQ ID NO：31所示的M-HCDR2和如SEQ ID NO：32所示的M-HCDR3，並且其M-VL具有：如SEQ ID NO：27所示的M-LCDR1、如SEQ ID NO：33所示的M-LCDR2和如SEQ ID NO：29所示的M-LCDR3；另一個抗原結合模塊1，其M-VH具有：如SEQ ID NO：18所示的M-HCDR1、如SEQ ID NO：19所示的M-HCDR2和如SEQ ID NO：20所示的M-HCDR3，並且其M-VL具有：如SEQ ID NO：21所示的M-LCDR1、如SEQ ID NO：22所示的M-LCDR2和如SEQ ID NO：23所示的M-LCDR3；和

該特異性結合EGFR的抗原結合模塊2，其E-VH具有：如SEQ ID NO：6所示的E-HCDR1、如SEQ ID NO：7所示的E-HCDR2和如SEQ ID NO：8所示的E-HCDR3，並且其E-VL具有：如SEQ ID NO：9所示的E-LCDR1、如SEQ ID NO：10所示的E-LCDR2和如SEQ ID NO：11所示的E-LCDR3；或

在一些實施方式中，該特異性結合HGFR的抗原結合模塊1，其M-VH具有：如SEQ ID NO：18所示的M-HCDR1、如SEQ ID NO：19所示的M-HCDR2和如SEQ ID NO：20所示的M-HCDR3，並且其M-VL具有：如SEQ ID NO：21所示的M-LCDR1、如SEQ ID NO：22所示的M-LCDR2和如SEQ ID NO：23所示的M-LCDR3；和

該特異性結合EGFR的抗原結合模塊2，其E-VH具有：如SEQ ID NO：6所示的E-HCDR1、如SEQ ID NO：7所示的E-HCDR2和如SEQ ID NO：8所示的E-HCDR3，並且其E-VL具有：如SEQ ID NO：9所示的E-LCDR1、如SEQ ID NO：10所示的E-LCDR2和如SEQ ID NO：11所示的E-LCDR3。

在一些實施方式中，該M-VH如SEQ ID NO：16所示，並且該M-VL如SEQ ID NO：17所示，或該M-VH如SEQ ID NO：12所示，並且該M-VL如SEQ ID NO：13所示，或該M-VH如SEQ ID NO：14所示，並且該M-VL如SEQ ID NO：15所示；和/或

(ii)該E-VH如SEQ ID NO：3所示，並且該E-VL如SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：4所示。

(i)該抗原結合分子如兩個特異性結合HGFR的抗原結合模塊1，其中一個抗原結合模塊1的M-VH如SEQ ID NO：16所示，並且M-VL如SEQ ID NO：17所示；另一個抗原結合模塊1的M-VH如SEQ ID NO：12所示，並且M-VL如SEQ ID NO：13所示；和該E-VH如SEQ ID NO：3所示，並且該E-VL如SEQ ID NO：5所示；或

(ii)該抗原結合分子如至少一個特異性結合HGFR的抗原結合模塊1和至少一個特異性結合EGFR的抗原結合模塊2，該E-VH如SEQ ID NO：3所示，和該E-VL如SEQ ID NO：5所示，並且該M-VH如SEQ ID NO：12所示，和該M-VL如SEQ ID NO：13所示。

在一些實施方案中，如前任一項所述的抗原結合分子，其中該抗原結合分子還包含Fc區，該Fc區包含能夠相互締合的第一亞基Fc1和第二亞基Fc2。在一些實施方案中，該Fc區是IgG Fc區，特別是IgG₁ Fc區。

在一些實施方案中，如前任一項所述的抗原結合分子，其具有：式(a)所示結構的第一鏈、式(b)所示結構的第二鏈、式(c)所示結構的第三鏈和式(d)所示結構的第四鏈，

式(a)[E-VH]-[連接子1]-[M-VH]-[CH1]-[Fc1]，

式(b)[E-VL]-[連接子2]-[M-VL]-[CL]，

式(c)[M-VH]-[連接子3]-[Titin鏈]-[Fc2]，

式(d)[M-VL]-[連接子4]-[Obscurin鏈]。

在一些實施方案中，該抗原結合分子具有：一條如SEQ ID NO：34所示的第一鏈、一條如SEQ ID NO：35所示的第二鏈、一條如SEQ ID NO：36所示的第三鏈和一條如SEQ ID NO：37所示的第四鏈。

在一些實施方案中，如前任一項所述的抗原結合分子，其具有：式(e)所示結構的第一鏈、式(f)所示結構的第二鏈、式(g)所示結構的第三鏈和式(h)所示結構的第四鏈，

式(e)[M-VH]-[CH1]-[Fc1]，

式(f)[M-VL]-[CL]，

式(g)[E-VH]-[連接子1]-[Titin鏈]-[Fc2]，

式(h)[E-VL]-[連接子2]-[Obscurin鏈]。

在一些具體的實施方案中，該抗原結合分子具有：一條如SEQ ID NO：38所示的第一鏈、一條如SEQ ID NO：39所示的第二鏈、一條如SEQ ID NO：40所示的第三鏈和一條如SEQ ID NO：41所示的第四鏈。

抗原結合分子的變體

在某些實施方案中，涵蓋本文中提供的抗原結合分子的胺基酸序列變體。例如，可以期望改善抗體的結合親和力和/或其它生物學特性。可以藉由將合適的修飾引入編碼抗體的核苷酸序列中，或者藉由肽合成來製備抗體的胺基酸序列變體。此類修飾包括例如對抗原結合分子的胺基酸序列內的殘基的刪除、和/或插入、和/或取代。可以進行刪除、插入、和取代的任何組合以得到最終的構建體，只要最終的構建體擁有期望的特徵，例如抗原結合特性。

包含取代、插入、和刪除的變體

在某些實施方案中，提供了具有一處或多處胺基酸取代的抗原結合分子變體。感興趣的位點包括CDR和FR。保守取代在表2中在“較佳的取代”的標題下顯示。示例性取代在表2中在“示例性取代”的標題下提供，並且如下文參照胺基酸側鏈類別進一步描述的。可以將胺基酸取代引入感興趣的抗體中，並且對產物篩選期望的活性，例如保留/改善的抗原結合，降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC。

依照常見的側鏈特性，胺基酸可以如下分組：

(1)疏水性的：Nle，Met，Ala，Val，Leu，Ile；

(2)中性，親水性的：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；

(3)酸性的：Asp，Glu；

(4)鹼性的：His，Lys，Arg；

(5)影響鏈取向(orientation)的殘基：Gly，Pro；

(6)芳香族的：Trp，Tyr，Phe。

非保守取代是指，用一個類別的成員替換另一個類別的成員。

一類取代變體涉及取代親本抗體(例如人源化或人抗體)的一個或更多個CDR殘基。一般地，經選擇用於進一步研究的所得變體相對於親本抗體會具有某些生物學特性(例如升高的親和力，降低的免疫原性)的改變(例如改善)，和/或會基本上保留親本抗體的某些生物學特性。一種示例性的取代變體是親和力成熟的抗體，可以例如使用基於噬菌體展示的親和力成熟技術(如本文所述的那些技術)，便利地產生該抗體。簡言之，將一個或更多個CDR殘基突變，並將變體抗體在噬菌體上展示，並對其篩選特定的生物學活性(例如結合親和力)。可以對CDR做出改變(例如取代)，例如以改善抗體親和力。可以對CDR“熱點”(即在體細胞成熟過程期間以高頻率經歷突變的密碼子所編碼的殘基)和/或對接觸抗原的殘基做出此類改變。同時對所得的變體VH或VL測試結合親和力。在親和力成熟的一些實施方案中，藉由多種方法(例如易錯PCR、鏈改組、或寡核苷酸指導的誘變)的任一種，將多樣性引入所選擇用於成熟的可變基因中。然後，創建次級文庫。然後，篩選文庫以鑑定具有期望的親和力的任何抗體變體。另一種引入多樣性的方法涉及CDR定向的方法，其中將幾個CDR殘基(例如一次4-6個殘基)隨機化。可以例如使用丙胺酸掃描誘變或建模來特異性鑑定涉及抗原結合的CDR殘基。特別地，經常靶向HCDR3和LCDR3。

在某些實施方案中，取代、插入或缺失可以在一個或更多個CDR內發生，只要此類變化不實質性降低抗體結合抗原的能力。例如，可以對CDR做出保守變化(例如保守取代，如本文中提供的)，其不實質性降低結合親和力。此類變化不發生在接觸抗原的殘基。在上文提供的變體VH和VL序列的某些實施方案中，每個CDR是未改變的，或者含有不超過1、2或3處胺基酸取代。

一種可用於鑑定抗體中可以作為誘變靶位的殘基或區域的方法稱作“丙胺酸掃描誘變”。在這種方法中，鑑定一個殘基或殘基組(例如帶電荷的殘基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，並且用中性或帶負電荷的胺基酸(例如，Ala或聚丙胺酸)替換以確定該抗體與抗原的相互作用是否受影響。可以在對初始取代顯示功能敏感性的胺基酸位置引入進一步的取代。此外，可藉由研究抗原-抗體複合物的晶體結構來鑑定抗體與抗原間的接觸點。這些接觸殘基及鄰近殘基可以作為取代候選物被打靶或消除。可以篩選變體以確定它們是否含有期望的特性。

胺基酸序列插入包括：在胺基和/或羧基端融合1個殘基或長度為100或更多個殘基的多肽，和單個或多個胺基酸殘基的序列內插入。在末端插入的例子包括具有N端甲硫胺醯基殘基的抗體。抗體分子的其它插入變體包括在抗體的N或C端融合有酶(或延長抗體的血清半衰期的多肽)的融合物。

Fab的改造

在一個方面，本揭露的抗原結合分子中，該特異性結合HGFR的抗原結合模塊是Fab，該特異性結合EGFR的抗原結合模塊是經替換的Fab，該經替換的Fab包含重鏈可變區、輕鏈可變區、Titin鏈和Obscurin鏈。在經替換的Fab中，Fab原有的CH1和CL被Titin鏈和Obscurin鏈所替換。

在另一個方面，本揭露的抗原結合分子中，該特異性結合EGFR的抗原結合模塊是Fab，該特異性結合HGFR的抗原結合模塊是經替換的Fab，該經替換的Fab包含重鏈可變區、輕鏈可變區、Titin鏈和Obscurin鏈。在經替換的Fab中，Fab原有的CH1和CL被Titin鏈和Obscurin鏈所替換。

Fc區的改造

在一個方面，本揭露的抗原結合分子的Fc區包含一個或更多個胺基酸取代，該一個或更多個胺基酸取代減少其與Fc受體的結合，例如其與Fcγ受體的結合，並且降低或消除效應子功能。天然IgG Fc區，具體地是IgG₁ Fc區或IgG₄ Fc區，可能導致本揭露的抗原結合分子靶向表達Fc受體的細胞，而不是表達抗原的細胞。本揭露改造的Fc區表現出降低的對Fc受體的結合親和力和/或降低的效應子功能。在一些實施方案中，改造的Fc區與天然Fc區相比，對Fc受體的結合親和力下降50%、80%、90%或95%以上。在一些實施方案中，該Fc受體是Fcγ受體。在一些實施方案中，該Fc受體是人Fcγ受體，例如FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIB、FcγRIIIa。在一些實施方案中，改造的Fc區與天然Fc區相比，對補體，如C1q的結合親和力降低。在一些實施方案中，改造的Fc區與天然Fc區相比，對新生兒Fc受體(FcRn)的結合親和力不降低。在一些實施例中，改造的Fc區具有降低的效應子功能，該降低的效應子功能可以包括但不限於以下中的一個或更多個：降低的補體依賴性細胞毒性(CDC)、降低的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)、降低的抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)、減少的細胞因子分泌、減少的免疫複合物介導的抗原呈遞細胞的抗原攝取、減少的與NK細胞的結合、減少的與巨噬細胞的結合、減少的與單核細胞的結合、減少的與多形核細胞的結合、減少的直接信號傳導誘導性細胞凋亡、降低的樹突細胞成熟或減少的T細胞引發。對於IgG₁ Fc區，在238、265、269、270、297、327和329等位置的胺基酸殘基取代可降低的效應子功能。

在一些實施方案中，該Fc區是人IgG₁ Fc區，並且在234和235位置的胺基酸殘基為A，編號依據為EU索引。對於IgG₄ Fc區，在228等位置的胺基酸殘基取代可降低的效應子功能。

抗原結合分子可包含與Fc區的兩個亞基融合的不同抗原結合模塊，可能導致不期望的同源二聚化。為了提高產率和純度，因此在本揭露的抗原結合分子的Fc區中引入促進異源二聚化的修飾將是有利的。在一些實施方式中，本揭露的Fc區包含根據杵臼(knob-into-hole，KIH)技術的改造，該方法涉及在第一亞基的界面處引入凸起結構(knob)以及在第二亞基的界面處引入孔結構(hole)；或者在第二亞基的界面處引入凸起結構(knob)以及在第一亞基的界面處引入孔結構(hole)。使得該凸起結構可以定位在孔結構中，促進異源二聚體的形成並抑制同源二聚體的產生。凸起結構是藉由用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)取代來自第一亞基的界面的小胺基酸側鏈而構建的。而孔結構是藉由用較小的胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)取代大胺基酸側鏈而在第二亞基的界面中創建的。凸起結構和孔結構藉由改變編碼多肽的核酸來製備。在一些實施方案中，可選的胺基酸取代如下表所示：

除了杵臼技術外，用於修飾重鏈的CH3結構域以實現異源二聚化的其他技術也是本領域中已知的，例如WO96/27011、WO98/050431、EP1870459、WO2007/110205、WO 007/147901、WO2009/089004、WO2010/129304、WO2011/90754、WO2011/143545、WO2012/058768、WO2013/157954和WO 013/096291。

抗原結合分子還可包含二硫鍵改造，例如Fc區的第一亞基包含354C突變和第二亞基包含349C突變，使Fc區的第一亞基和第二亞基之間產生工程化二硫鍵，促進Fc區第一亞基和第二亞基的形成異源二聚化。

抗原結合分子的Fc區還可進一步引入其它的胺基酸改造，例如降低免疫原性的同種異型胺基酸殘基突變。在一些實施方案中，IgG1的Fc引入356E和358M突變。

Fc區的C末端可以是以胺基酸殘基PGK結束的完整C末端；也可以是截短的C末端，例如在該截短的C末端中已經去除了一個或兩個C末端胺基酸殘基。在一個較佳的方面中，重鏈的C末端是以PG結束的截短的C末端。因此，在一些實施方式中，完整抗體的組成物可以包括去除了所有K447殘基和/或G446+K447殘基的抗體群體。在一些實施方式中，完整抗體的組成物可以包括沒有去除K447殘基和/或G446+K447殘基的抗體群體。在一些實施方式中，完整抗體的組成物具有帶有或不帶有K447殘基和/或G446+K447殘基的抗體混合物的抗體群體。

重組方法

抗原結合分子可以使用重組方法來產生。對於這些方法，提供編碼抗原結合分子的一個或更多個分離的核酸。

在天然抗體、天然抗體片段或具有同源二聚體重鏈的雙特異性抗體的情況下，需要兩個核酸，一個用於輕鏈或其片段，一個用於重鏈或其片段。此類核酸編碼包含抗體VL的胺基酸序列和/或包含抗體VH的胺基酸序列(例如抗體的輕鏈和/或重鏈)。這些核酸可以在相同的表達載體上或在不同的表達載體上。

在具有異二聚體重鏈的雙特異性抗體的情況下，需要四個核酸，一個用於第一輕鏈，一個用於包含第一Fc區多肽的第一重鏈，一個用於第二輕鏈，並且一個用於包含第二Fc區多肽的第二重鏈。這四個核酸可包含在一個或更多個核酸分子或表達載體中，通常這些核酸位於兩個或三個表達載體上，即一個載體可包含這些核酸中的多於一個。

在一個實施方案中，本揭露提供了編碼如前所述的抗體的分離的核酸。此類核酸可以獨立編碼前述的任一多肽鏈。在另一方面中，本揭露提供了包含此類核酸的一種或多種載體(例如表達載體)。在另一方面中，本揭露提供了包含此類核酸的宿主細胞。在一個實施方案中，提供製備抗原結合分子的方法，其中該方法包括，在適合抗體表達的條件下，培養包含編碼該抗體的核酸的宿主細胞，如上文所提供的，和視需要地從宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該抗體。

為了重組產生抗原結合分子，將編碼蛋白的核酸分離並插入一個或更多個載體中，用於在宿主細胞中進一步選殖和/或表達。此類核酸可以使用常規程序容易地分離和測序(例如藉由使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針)，或者藉由重組方法產生或藉由化學合成獲得。

用於選殖或表達編碼抗體的載體的適當宿主細胞包括本文描述的原核或真核細胞。例如，抗體可在細菌中產生，特別是當抗體不需要糖基化和Fc效應子功能時。在表達後，抗體可以在可溶級分中從細菌細胞糊狀物分離，並且可進一步純化。

除了原核生物以外，真核微生物如絲狀真菌或酵母也是用於編碼抗體的載體的合適的株或表達宿主，包括真菌和酵母菌株，其糖基化途徑已經“人源化”，導致產生具有部分或完全人糖基化模式的抗體。適於表達(糖基化)抗體的合適的宿主細胞也可源自多細胞生物體(無脊椎動物和脊椎動物)；無脊椎動物細胞的例子包括植物和昆蟲細胞。已經鑑定了許多杆狀病毒株，其可與昆蟲細胞聯合使用，特別是用於草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞的轉染；還可利用植物細胞培養物作為宿主，例如US5959177、US 6040498、US6420548、US 7125978和 US6417429；也可將脊椎動物細胞用作宿主，例如適應於在懸浮液中生長的哺乳動物細胞系。適宜的哺乳動物宿主細胞系的其它例子是經SV40轉化的猴腎CV1系(COS-7)；人胚腎系(293或293T細胞)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)細胞(TM4細胞)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；水牛鼠(buffalo rat)肝細胞(BRL3A)；人肺細胞(W138)；人肝細胞(Hep G2)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞；MRC 5細胞；和FS4細胞。其它適宜的哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR-CHO細胞；以及骨髓瘤細胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。關於適合產生抗體的某些哺乳動物宿主細胞系的綜述參見例如Yazaki，P.和Wu，A.M.，Methods in MolecμLar Biology，Vol.248，Lo，B.K.C.(編)，Humana Press，Totowa，NJ(2004)，第255-268頁。

診斷與治療組成物

在某些實施方案中，本揭露提供的抗原結合分子可用於檢測生物學樣品中HGFR或EGFR的存在。在用於本文時，術語“檢測”涵蓋定量或定性檢測。在某些實施方案中，生物學樣品包含細胞或組織，如腫瘤組織。

在一個實施方案中，提供了在診斷或檢測方法中使用的抗原結合分子。在又一方面，提供了檢測生物學樣品中HGFR或EGFR的存在/水平的方法。在某些實施方案中，該方法包括在適宜條件下使生物學樣品與抗原結合分子接觸，並檢測是否在檢測試劑與抗原之間形成複合物。此類方法可以是體外或體內方法。在一個實施方案中，使用抗原結合分子來選擇適合治療的受試者，例如HGFR或EGFR是用於選擇受試者的生物標誌物。

在某些實施方案中，提供了經標記的抗原結合分子。標記物包括但不限於直接檢測的標記物或模塊(如螢光、發色、電子緻密、化學發光、和放射性標記物)，和間接檢測的模塊(例如，經由酶反應或分子相互作用間接檢測的模塊，如酶或配體)。

在另外的方面，提供包含該抗原結合分子的醫藥組成物，例如，用於以下任何治療方法。在一個方面，醫藥組成物包含本文提供的任何抗體和藥學上可接受的載體。在另一個方面，醫藥組成物包含本文提供的任何抗體和至少一種另外的治療劑。

本揭露所述的抗原結合分子的醫藥組成物藉由以下製備：將具有所需純度的此類抗體與一種或更多種視需要的藥學上可接受的載體混合，該醫藥組成物為凍乾組成物或水溶液的形式。用於體內施用的配製劑一般是無菌的。無菌性可容易地實現，例如藉由穿過無菌濾膜過濾。

治療方法與施用途徑

本文提供的任何抗原結合分子可用於治療方法。

在又一個方面，本揭露提供抗原結合分子在藥物的製造或製備中的用途。在一個實施方案中，該藥物用於治療HGFR和/或EGFR相關疾病，例如腫瘤，如高表達HGFR和/或EGFR的腫瘤，例如肺癌、乳腺癌、胰腺癌、結腸癌、頭頸癌、胃癌或膠質母細胞瘤。並且該藥物是以對上述疾病的有效量的形式存在的。

在一些實施方式中，該有效量是單位日劑量或單位週劑量。在一個此類實施方案中，該用途進一步包括向受試者施用有效量的至少一種另外的治療劑(例如一種、兩種、三種、四種、五種或六種另外的治療劑)。

根據任意以上實施方案的“受試者”可以是人。當用於治療目的時，受試者是已患有、疑似患有目標疾病的個體。當用於預防目的時，受試者是易感於目標疾病的個體。

在又一個的方面，提供包含該抗原結合分子的醫藥組成物，例如，其用於以上任何製藥用途或治療方法。在另一個實施方案中，醫藥組成物還包含至少一種另外的治療劑。

本揭露的抗原結合分子可單獨使用或與其他試劑聯合用於治療。例如，本揭露的抗體可與至少一種另外的治療劑聯合施用(同時、或先後施用)。

本揭露的抗原結合分子(和任何另外的治療劑)可藉由任何合適的手段施用，包括腸胃外、肺內和鼻內，並且如果需要局部治療，則病灶內施用。腸胃外輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下施用。給藥可以藉由任何適當的途徑，例如，藉由注射，如靜脈內或皮下注射，這部分取決於施用是短期的還是長期的。本文考慮多種給藥時間方案，包括但不限於，單次或在多個時間點多次施用，推注施用和脈衝輸注。

本揭露的抗原結合分子將以符合良好醫療實踐(如GOOD MEDICAL PRACTICE Guideline，GMP)的方式配製、給藥和施用。在此背景下考慮的因素包括所治療的具體病症、所治療的具體哺乳動物、個體受試者的臨床狀況、病症的起因、試劑的遞送部位、施用方法、施用時間安排以及醫學從業者已知的其他因素。抗原結合分子無需但視需要地與目前用於預防或治療該病症的一種或更多種試劑一起配製。此類其它試劑的有效量取決於醫藥組成物中存在的抗原結合分子的量、病症或治療的類型以及上文討論的其它因素。這些通常以與本文所述相同的劑量和施用路徑使用，或以本文所述劑量的約1至99%使用，或以任何劑量使用，並藉由經驗/臨床確定為合適的任何途徑使用。

為了預防或治療疾病，本揭露的抗原結合分子(當單獨使用或與一種或更多種其他另外的治療劑組合使用時)的適當的劑量將取決於待治療的疾病的類型，治療分子的類型，疾病的嚴重性和病程，是為預防還是治療目的施用，之前的治療，受試者的臨床病史和對治療分子的響應，和主治醫師的判斷。治療分子恰當地以一次或經過一系列治療施用於受試者。取決於疾病的類型和嚴重性，示例性的單位日劑量為50μg-5g。

製品

在本揭露的另一方面中，提供一種製品，該製品包含可用於治療、預防和/或診斷上述病症的材料。該製品包含容器和在容器上或與容器聯合的標簽或包裝插頁(package insert)。合適的容器包括，例如，瓶子、管形瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以自各種材料如玻璃或塑料形成。容器裝有單獨的有效治療、預防和/或診斷疾患的組成物、或與另一種組成物組合，並且可具有無菌的存取口(例如，容器可以是具有塞子的靜脈內溶液袋或管形瓶)。組成物中的至少一種活性試劑是本揭露的抗原結合分子。標簽或包裝插頁指示使用該組成物是來治療選擇的病況。

此外，製品可以包含：

(a)裝有組成物的第一容器，其中該組成物包含本揭露的抗原結合分子；和

(b)裝有組成物的第二容器，其中該組成物包含細胞毒性劑或其他方面的治療劑。

備選地，或另外地，製品可進一步包含第二(或第三)容器，該第二(或第三)容器包含藥學上可接受的緩衝液。從商業和用戶立場，它可進一步包括所需的其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、濾器、針頭和注射器。在一個具體的實施方案中，該製品是藥盒。

實施例與測試例

以下結合實施例和測試例進一步描述本揭露，但這些實施例和測試例並非限制著本揭露的範圍。本揭露實施例和測試例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如冷泉港的抗體技術實驗手冊，分子選殖手冊；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。

實施例

實施例1. 含有Titin鏈/Obscurin鏈的抗原結合分子

本揭露的Titin鏈/Obscurin鏈可以來源於任意適宜的多肽，包括來源於PCT/CN2021/070832及其公開文本WO2021139758A1(藉由援引完整收入本文)中以及CN202110527339.7及將其作為優先權文件的專利中的多肽。構建雙特異性抗體，其中CL為PCT/CN2021/070832中的kappa輕鏈恆定區，Titin鏈和Obscurin鏈的胺基酸序列見表4-1和表4-2，連接子序列包括GGGGS(SEQ ID NO：106)、ASTKG(SEQ ID NO：109)或RTVAS(SEQ ID NO：110)，本實施例中的Fc1、Fc2、CH1的胺基酸序列如下所示。

>Fc1(knob，SEQ ID NO：111)

>Fc2(hole，SEQ ID NO：112)

>CH1(SEQ ID NO：113)

1.1 DI雙特異性抗體

參照PCT/CN2021/070832實施例5，構建抗hNGF和hRANKL的雙特異性抗體DI：DI-2至DI-20，其包含如下所述的第一重鏈、第二重鏈、第一輕鏈和第二輕鏈：

第一重鏈：從N端到C端依次為：[VH1-I]-[連接子1]-[Obscurin鏈]-[Fc2]，

第一輕鏈：從N端到C端依次為：[VL1-I]-[連接子2]-[Titin鏈]，

第二重鏈：從N端到C端依次為：[VH2-D]-[CH1]-[Fc1]，和

第二輕鏈：從N端到C端依次為：[VL2-D]-[CL]；

其中，VH1-I和VL1-I分別為PCT/CN2021/070832中I0的重鏈可變區和輕鏈可變區，VH2-D和VL2-D分別為PCT/CN2021/070832中D0的重鏈可變區和輕鏈可變區。本實施例中DI雙特異性抗體中Obscurin鏈、Titin鏈、連接子1、連接子2結構見下表。

採用PCT/CN2021/070832的測試例4中的方法檢測DI-2至DI-20雙特異性抗體與其抗原的結合活性。對抗體進行熱穩定性研究。研究方法：用PBS將抗體的濃度稀釋至5mg/mL，採用高通量微分掃描螢光儀(UNCHAINED，規格型號：Unit)測定其熱穩定性。

實驗結果表明，改造後的雙特異性抗體對抗原的結合活性沒有顯著變化；並且，與DI-2相比，DI-4至DI-8、DI-10至DI-16、DI-20的Tm1(℃)、Tonset(℃)有明顯的提升，雙特異性抗體的熱穩定性更優。

採用10mM乙酸，pH5.5，9%蔗糖的緩衝液配製含DI雙特異性抗體的溶液，將溶液置於40℃恆溫箱中孵育四週，結束後將抗體濃度濃縮至孵育開始時濃度，觀察溶液沉澱情況。實驗結果表明，DI-2雙特異性抗體組溶液出現沉澱，DI-3至DI-7相比DI-2具有更好的穩定性。

1.2 PL雙特異性抗體

構建抗hPDL1和hCTLA4的PL雙特異性抗體：PL-1至PL-19，其包含如下所述的第一重鏈、第二重鏈、第一輕鏈和第二輕鏈：

第一重鏈：從N端到C端依次為：[VH1-P]-[連接子1]-[Obscurin鏈]-[Fc1]，

第一輕鏈：從N端到C端依次為：[VL1-P]-[連接子2]-[Titin鏈]，

第二重鏈：從N端到C端依次為：[VH2-L]-[CH1]-[Fc2]，和

第二輕鏈：從N端到C端依次為：[VL2-L]-[CL]；

其中，VH1-P和VL1-P分別為WO2020177733A1中h1831K抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區，VH1-L和VL1-L的胺基酸序列如下所示。

>VH2-L(SEQ ID NO：114)

>VL2-L(SEQ ID NO：115)

本實施例中PL雙特異性抗體中Obscurin鏈、Titin鏈、連接子1、連接子2結構見下表。

參照PCT/CN2021/070832中測試例4中的ELISA方法檢測PL雙特異性抗體的結合活性，其中hPDL1、hCTLA4抗原購自：Sino biology。對抗體進行熱穩定性研究。方法：用PBS將抗體的濃度稀釋至1.4-3mg/mL，採用高通量微分掃描螢光儀(UNCHAINED，規格型號：Unit)測定其熱穩定性。實驗結果表明，PL雙特異性抗體對抗原仍具有良好的結合活性；並且，與PL-1相比，PL-2至PL-19的Tm1(℃)、Tagg 266(℃)、Tonset(℃)有明顯的提升，雙特異性抗體的熱穩定性更優。

1.3 HJ雙特異性抗體

構建抗hIL5和hTSLP的HJ雙特異性抗體：HJ-3至HJ11，其包含如下所述的第一重鏈、第二重鏈、第一輕鏈和第二輕鏈：

第一重鏈：從N端到C端依次為：[VH1-H]-[連接子1]-[Titin鏈]-[Fc1]，

第一輕鏈：從N端到C端依次為：[VL1-H]-[連接子2]-[Obscurin鏈]，

第二重鏈：從N端到C端依次為：[VH2-J]-[CH1]-[Fc2]，和

第二輕鏈：從N端到C端依次為：[VL2-J]-[CL]；

其中，VH1-H和VL1-H分別為PCT/CN2021/070832中H0的重鏈可變區和輕鏈可變區，VH2-J和VL2-J分別為PCT/CN2021/070832中J1的重鏈可變區和輕鏈可變區。本實施例中HJ雙特異性抗體中Obscurin鏈、Titin鏈、連接子1、連接子2結構見下表。

參照PCT/CN2021/070832中測試例4中的方法檢測HJ雙特異性抗體的抗原結合活性。對抗體的熱穩定性進行研究，方法：用10mM乙酸pH5.5、9%蔗糖的緩衝液配製HJ雙特異性抗體稀釋溶液，然後藉由超濾濃縮的方法將雙特異性抗體濃縮，獲得不同濃度的HJ雙特異性抗體溶液(HJ雙特異性抗體的濃度見表19)，然後將濃縮溶液置於40℃恆溫箱中孵育，第0天(也即40℃孵育開始前，D0)，第7天(40℃孵育第7天，D7)，第14天(40℃孵育第14天，D14)，第21天(40℃孵育第21天，D21)和第28天(40℃孵育第28天，D28)檢測樣品的SEC純度，40℃孵育28天後，馬上取樣檢測樣品CE-SDS純度。實驗結果表明，本揭露構建的HJ雙特異性抗體對抗原的結合活性沒有顯著變化；並且，與HJ-3相比，HJ-5至HJ-11雙特異性抗體的熱穩定性更優。

實施例2：抗原蛋白及抗體的製備

1.1 抗原蛋白結構

以人EGFR蛋白(UniProt Epidermal growth factor receptor，Uniprot號：P00533)作為EGFR的模板，在EGFR蛋白基礎上融合His 標簽，設計本發明檢測用的帶His標簽的人EGFR蛋白胞外域(簡稱：EGFR-His)；其胺基酸序列如下：

EGFR-His的胺基酸序列：

SEQ ID NO：42

註釋：劃線部分為EGFR蛋白胞外域；斜體部分為His標簽。

以人HGFR蛋白(UniProt Hepatocyte growth factor receptor，Uniprot號：P08581)作為HGFR的模板，在HGFR蛋白基礎上融合His標簽或Fc，設計本發明檢測用的帶His標簽的HGFR蛋白胞外域(簡稱HGFR-His)、帶Fc標簽的HGFR蛋白胞外域(簡稱HGFR-Fc)，其胺基酸序列如下：

HGFR-His的胺基酸序列：

SEQ ID NO：43

註釋：劃線部分為HGFR蛋白胞外域；斜體部分為His標簽。

以人HGF蛋白(UniProt Hepatocyte growth factor，Uniprot號：P14210)作為HGF的模板，設計本揭露檢測用帶His標簽的HGF蛋白(簡稱HGF-His)，其胺基酸序列如下：

HGF-His的胺基酸序列：

SEQ ID NO：44

註釋：劃線部分為HGF蛋白；斜體部分為His標簽。

1.2 蛋白的純化

1.2.1 重組蛋白的純化步驟：

將細胞表達上清樣品高速離心去除雜質，並將緩衝液置換為PBS，加入咪唑至終濃度為5mM。用含有5mM咪唑的PBS溶液平衡鎳管柱，沖洗2-5倍管柱體積。將置換後的細胞上清樣品上Ni Sepharose excel管柱(GE，17-3712-02)。用含有5mM咪唑的PBS溶液沖洗管柱，至A280讀數降至基線。後用PBS+10mM咪唑沖洗層析管柱，除去非特異結合的雜蛋白，並收集流出液。再用含有300mM咪唑的PBS溶液沖提目的蛋白，並收集沖提峰。收集的沖提液濃縮後用凝膠層析Superdex200(GE，28-9893-35)進一步純化，流動相為PBS。去除聚體峰，收集沖提峰。所得到的蛋白經電泳，肽圖，LC-MS鑑定為正確後分裝備用。

1.2.2 抗體的純化步驟：

將細胞表達上清樣品高速離心去除雜質，上清進行MabSelect Sure(GE，17-5438-01)親和層析。MabSelect Sure層析管柱先用0.2M NaOH再生，利用純水沖洗後用PBS平衡管柱子，將上清結合後，利用PBS進行洗滌至A280讀數降至基線。用0.1M醋酸緩衝液在pH3.5條件下沖提目的蛋白，用1M Tris-HCl中和。沖提樣品適當濃縮後利用PBS平衡好的凝膠層析Superdex200(GE，28-9893-35)進一步純化，合併收集目的蛋白所在接收管濃縮至適當濃度。此方法用來純化本發明中涉及的抗體。

實施例3. 特異性結合HGFR和EGFR的雙特異性抗體的製備及鑑定

利用特異性結合HGFR的分子與特異性結合EGFR的分子，構建特異性結合HGFR和EGFR的抗體。

1.特異性結合EGFR的分子

特異性結合EGFR的分子可以來源於任意適宜的抗體，例如Zalutumumab(簡稱Zal)或其變體(例如Zal.1，Zal.1是藉由將Zal輕鏈第一位胺基酸殘基由A突變為D獲得)，其中，

>Zal重鏈的胺基酸序列：

SEQ ID NO：1

>Zal輕鏈的胺基酸序列：

SEQ ID NO：2

>Zal的重鏈可變區的胺基酸序列：

SEQ ID NO：3

>Zal的輕鏈可變區的胺基酸序列：

SEQ ID NO：4

>Zal.1的輕鏈可變區的胺基酸序列：

SEQ ID NO：5

>Zal.1的重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO：3。

Zal和Zal.1的CDR序列見表14：

2.特異性結合HGFR的分子

特異性結合HGFR的分子可以來源於任意適宜的抗體，包括描述於國際公開號WO2013003680A1(藉由援引完整收入本文)中的Onartuzumab(簡稱Omab)等抗體；描述於國際公開號WO2016165580A1(藉由援引完整收入本文)中的Ab10等抗體；以及上述抗體的突變抗體。其中，Omab、Ab10的可變區的胺基酸序列如下：

>Omab的重鏈可變區的胺基酸序列：

SEQ ID NO：12

>Omab的輕鏈可變區的胺基酸序列：

SEQ ID NO：13

>Ab10的重鏈可變區的胺基酸序列：

SEQ ID NO：14

>Ab10的輕鏈可變區的胺基酸序列：

SEQ ID NO：15

藉由對Ab10的CDR進行突變，獲得Ab10突變抗體：Ab10.1；Ab10.1的恆定區與Ab10相同，Ab10.1可變區胺基酸序列如下：

>Ab10.1的重鏈可變區的胺基酸序列：

SEQ ID NO：16

>Ab10.1的輕鏈可變區的胺基酸序列：

SEQ ID NO：17

備註：上述特異性結合HGFR分子的序列中，其中下劃線部分為如Kabat編號系統確認的CDR區部分，斜體加粗部分為突變胺基酸殘基。

特異性結合HGFR分子的CDR見表15：

3.特異性結合HGFR和EGFR的雙特異性抗體

利用特異性結合HGFR的分子與特異性結合EGFR的分子，構建特異性結合HGFR和EGFR的具有Format1或Format2結構的雙特異性抗原結合分子，Format1的結構示意圖見圖1，Format2的結構示意圖見圖2；其中，

Format1包含如下結構的4條鏈，其中，

鏈1為：

VH(抗EGFR抗體)-連接子1-VH(抗HGFR抗體1)-IgG₁(CH1)-IgG₁Fc(knob)，

鏈2為：VL(抗EGFR抗體)-連接子1-VL(抗HGFR抗體1)-CL，

鏈3為：VH(抗HGFR抗體2)-連接子2-Titin鏈-IgG₁Fc(hole)，

鏈4為：VL(抗HGFR抗體2)-連接子2-Obscurin鏈。

Format2包含如下結構的4條鏈，其中，

鏈1為：VH(抗HGFR抗體)-IgG₁(CH1)-IgG₁Fc(knob)，

鏈2為：VL(抗HGFR抗體)-CL，

鏈3為：VH(抗EGFR抗體)-連接子2-Titin鏈-IgG₁Fc(hole)，

鏈4為：VL(抗EGFR抗體)-連接子2-Obscurin鏈；

示例性地，利用Ab10.1(抗HGFR抗體1)、Omab(抗HGFR抗體2)、Zal.1(抗EGFR抗體)、人IgG₁重鏈恆定區/kappa輕鏈恆定區以及T.16(Titin鏈)/O.28(Obscurin鏈)，構建具有Format1結構的EM1和具有Format2結構的EM2。

EM1的4條鏈的胺基酸序列如下：

EM1的鏈1的胺基酸序列：

SEQ ID NO：34

EM1的鏈2的胺基酸序列：

SEQ ID NO：35

EM1的鏈3的胺基酸序列：

SEQ ID NO：36

EM1的鏈4的胺基酸序列：

SEQ ID NO：37

EM2的4條鏈的胺基酸序列如下所示：

EM2的鏈1的胺基酸序列：

SEQ ID NO：38

EM2的鏈2的胺基酸序列：

SEQ ID NO：39

EM2的鏈3的胺基酸序列：

SEQ ID NO：40

EM2的鏈4的胺基酸序列：

SEQ ID NO：41

備註：上述序列中，單下劃線部分為可變區，虛下劃線部分為CL，點下劃線部分為Fc區，斜體部分為CH1，雙下劃線部分為連接子，波浪線部分為Obscurin鏈/Titin-T鏈。

連接子1的胺基酸序列：GGGGSGGGG(SEQ ID NO：105)

連接子2的胺基酸序列：GGGGS(SEQ ID NO：106)

IgG1Fc(knob)的胺基酸序列：

(SEQ ID NO：107)

IgG₁Fc(hole)的胺基酸序列：

(SEQ ID NO：108)

CL：

(SEQ ID NO：120)。

測試例

測試例1：Biacore檢測體外結合親和力和動力學實驗

藉由Biacore T200(GE)測定待測分子與人EGFR(SEQ ID NO：42)或人HGFR蛋白(SEQ ID NO：43)的親和力，方法如下：

用Protein A生物傳感芯片親和捕獲抗體分子，然後於芯片表面流經抗原180秒，之後解離600秒，用Biacore T200儀器實時檢測反應信號獲得結合和解離曲線。在每個實驗循環解離完成後，用10mM Gly-HCl(pH 1.5)將生物傳感芯片洗淨再生。數據擬合模型採用1：1 Model，獲得待測分子親和力數值。本實施例中，陽性對照MCLA為一種特異性結合HGFR和EGFR的雙特異性抗體(具體序列參見WO2019031965中的PB8532)。

實驗結果見表16，實驗結果表明，本揭露構建的突變抗體和雙特異性抗原結合分子均具有很強的親和力，Ab10.1的親和力至少是母抗體Ab10親和力的4倍。

測試例2：抗體的體外細胞結合實驗

特異性結合HGFR和EGFR的抗原結合分子的細胞結合活性藉由流式細胞儀來檢測。將1×10⁶細胞/mL EGFR CHO-S穩轉細胞株、HGFR CHO-S穩轉細胞株、H1975-HGF或MKN-45腫瘤細胞株用1%BSA PBS緩衝液封閉後，加入不同濃度稀釋的抗體樣品(C25為陰性對照，其為無關靶點的IgG1抗體蛋白，以下同)孵育1小時。洗兩次後，再加入R-PE-羊抗人(H+L)抗體(Invitrogen，CAT#H10104)孵育0.5小時。洗兩次後，使用流式細胞儀讀取螢光信號值。

實驗結果見圖3至圖6，實驗結果顯示，本揭露的特異性結合HGFR和EGFR的抗原結合分子對腫瘤細胞的結合能力比陽性抗體MCLA更強。

測試例3：抗體拮抗EGFR結合EGF的阻斷實驗

抗體對EGF/EGFR的阻斷能力藉由ELISA來檢測。包被1μg/mL兔抗His抗體(金斯瑞，A01857)，4度過夜後封閉。洗板後加入2μg/mL EGFR-His(SEQ ID NO：42)，孵育1h。洗板後加入2μg/mL EGF-mFc(Acro，EGF-H525b)和不同濃度稀釋的抗體，孵育1小時。洗板後加入辣根過氧化物酶-羊抗鼠IgG抗體(Jackson，115-035-062)，孵育1小時。洗板後加入四甲基聯苯胺溶液顯色，最後加入終止液，在酶標儀上測量OD450值。實施例中，陽性對照JNJ為一種特異性結合HGFR和EGFR的雙特異性抗體(JNJ也稱Amivantamab，具體序列結構參見WHO Drug Information,33(2)：237-239)。

實驗結果見表17，實驗結果表明，本揭露的特異性結合HGFR和EGFR的抗原結合分子能有效阻斷EGF與EGFR的結合。

測試例4：抗體拮抗HGFR結合HGF的阻斷實驗

抗體對HGF/HGFR的阻斷能力藉由ELISA來檢測。包被5μg/mL HGFR-His(序列參見SEQ ID NO：43)，4℃過夜後封閉。洗板後加入2μg/mL bio-HGF-His(序列參見SEQ ID NO：44)和不同濃度稀釋的抗體，孵育1小時。洗板後加入辣根過氧化物酶-鏈黴親和素(Jackson，016-030-084)，孵育1小時。洗板後加入四甲基聯苯胺溶液顯色，最後加入終止液，在酶標儀上測量OD450值。

實驗結果見表18，實驗結果顯示，本揭露的特異性結合HGFR和EGFR的抗原結合分子阻斷HGFR結合HGF的最大阻斷力比陽性抗體JNJ更強。

測試例5：抗體對細胞EGFR磷酸化的抑制實驗

取H292細胞(也稱NCI-H292，人肺癌細胞(淋巴結轉移)，中國科學院細胞庫，下同)以12000個/孔鋪於96孔板(Corning，3599)，培養基為RPMI1640+10%FBS，其後將96孔板在37℃、5% CO₂培養箱培養24小時。第二天，棄去培養基，更換成無血清的培養基(RPMI640+25mM HEPES+0.1mM NEAA+1mM丙酮酸鈉)饑餓16-20小時。第三天，配製抗體，首濃度為6μM，5倍梯度稀釋，更換饑餓培養基，37℃、5% CO₂ 培養箱培養1小時，期間加入50μL 100ng/mL rEGF(R&D，236-EG-200)，37℃、5% CO₂培養箱繼續培養15分鐘，最後根據PHOSPHO-EGFR(TYR1068)KITS(Cisbio，64EG1PEG)說明書，檢測磷酸化EGFR。

實驗結果見圖7，實驗結果顯示，本揭露的特異性結合HGFR和EGFR的抗原結合分子能有效抑制細胞EGFR磷酸化。

測試例6：抗體對細胞HGFR磷酸化的抑制實驗

取H292細胞以12000個/孔鋪於96孔板(Corning，3599)，培養基為RPMI1640+10%FBS，其後將96孔板在37℃、5% CO₂培養箱培養24小時。第二天，棄去培養基，更換成無血清的培養基(RPMI640+25mM HEPES+0.1mM NEAA+1mM丙酮酸鈉)饑餓16-20小時。第三天，配製抗體，首濃度為1μM，10倍梯度稀釋，更換饑餓培養基，37℃、5% CO₂培養箱培養1小時，期間加入50μL 200ng/mL rHGF(R&D,294-HG-005)37℃、5% CO₂培養箱繼續培養30分鐘，最後根據p-c-Met(Tyr1234/1235)Assay Kit(PerkinElmer，ALSU-PCMET-A50)說明書，檢測磷酸化HGFR。

實驗結果見圖8，實驗結果顯示，本揭露的特異性結合HGFR和EGFR的抗原結合分子能有效抑制細胞HGFR磷酸化，抑制能力比Ab10.1強。

測試例7：抗體對細胞AKT磷酸化的抑制實驗

取H292細胞以12000個/孔鋪於96孔板(Corning，3599)，培養基為RPMI1640+10% FBS，其後將96孔板在37℃、5% CO₂培養箱培養24小時。第二天，棄去培養基，更換成無血清的培養基(RPMI640+ 25mM HEPES+0.1mM NEAA+1mM丙酮酸鈉)饑餓16-20小時。第三天，配製抗體，首濃度為4μM，5倍梯度稀釋，更換饑餓培養基，37℃、5% CO₂培養箱培養1小時，期間加入50μL 200ng/mL rHGF(R&D,294-HG-005)和50ng/mL rEGF(R&D，236-EG-200)，混合均勻，37℃、5% CO₂培養箱繼續培養1小時，最後根據PHOSPHO-AKT(SER473)KITS(Cisbio，64AKSPEG)說明書，檢測磷酸化AKT。細胞內AKT磷酸化水平藉由665nm的螢光信號值與620nm的螢光信號值比值(ratio)來反應，比值=665nm處螢光信號值/620nm處螢光信號值*10⁴，比值越高，細胞內AKT磷酸化水平越高。

實驗結果見圖9，實驗結果顯示，本揭露的特異性結合HGFR和EGFR的抗原結合分子能有效抑制細胞AKT磷酸化，且抑制能力比陽性對照抗體強。

測試例8：抗體降低細胞表面的HGFR表達

取HCC827細胞(人非小細胞肺癌細胞，源自ATCC)以3×10⁵個/孔鋪於6孔板，培養基RPMI1640+10% FBS，其後將6孔板在37℃，5% CO₂培養箱培養24小時。配製抗體至濃度200nM，處理且反應18小時。處理過後，PBS洗細胞一次，加入500μl無酶細胞解離緩衝液(Gibco,#13151)收集細胞，藉由離心分離細胞與無酶細胞解離緩衝液。使用羊抗人HGFR抗體(R&D systems,AF276)進行免疫螢光染色，4℃反應1小時。隨後，用含2%FBS的PBS洗兩次。其後加入ALEXA488-驢抗羊二抗(Thermo Fisher,A-11055)4℃反應1小時，洗兩次後用BD Cytofix (BD,#554655)固定細胞。再用PBS洗一次後，使用流式細胞儀讀取螢光信號值。

實驗結果見圖10，實驗結果顯示，相較陽性對照抗體，本揭露的特異性結合HGFR和EGFR的抗原結合分子能更有效地減少細胞表面的HGFR，抑制受體信號通路。

測試例9：抗體對SNU-5細胞的增殖抑制實驗

取SNU-5細胞(人胃癌細胞，源自ATCC)以4000個/孔鋪於96孔板(Corning，3903)，培養基為IMDM+5%FBS，其後將96孔板在37℃、5% CO₂培養箱培養24小時。配製抗體至濃度5μM，5倍梯度稀釋，加入上述96孔板，其後在37℃、5% CO₂培養箱培養5天，最後，根據說明書配製CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay(Promega，G7573)，每孔加入50μL CTG，室溫下孵育10min，用封底膜封好後，用多標記微孔板檢測系統(PerkinElmer,victor3)檢測螢光強度(Luminescence，簡稱Lum)。

計算公式：Lum=測定值-培養基讀數；

%抑制=(Lum0-Lum)/Lum0*100%；

其中Lum0為抗體濃度為0的孔的螢光強度，Lum為各稀釋濃度抗體孔的螢光強度。

實驗結果見圖11，實驗結果顯示，本揭露的特異性結合HGFR和EGFR的抗原結合分子對SNU-5細胞的增殖抑制能力比陽性抗體更強。

測試例10：抗體對腫瘤細胞的ADCC殺傷實驗

配製抗體至200nM濃度，5倍梯度稀釋。分別收集腫瘤細胞：Hs746T細胞(人胃癌細胞，南京科佰生物科技有限公司)和H292細胞，PBS洗一次後，用緩衝液(PBS+10%FBS+20mMHEPES)調整細胞密度為1×10⁶個/mL，然後在2mL細胞中加入3μL BATDA試劑(PerkinElmer，AD0116)，在37℃，5% CO₂培養箱孵育15min。離心後，用沖洗緩衝液(PBS+20mMHEPES)洗三次，計數調整細胞密度為1×10⁵個/mL。收集NK92--FCGR3A(176V)細胞(穩定轉化有FCGR3A(176V)的NK92細胞(購自南京科佰生物科技有限公司))，PBS洗一次後，用培養基重新懸浮細胞計數，調整細胞密度為5×10⁵個/mL。最後在96孔板(corning，3788)中加入100μL NK92--FCGR3A(176V)細胞，50μL稀釋抗體，50μL標記後的腫瘤細胞。同時，設置自發對照釋放孔，其不含NK92--FCGR3A(176V)細胞，而含有100μL培養基；設置陽性對照孔，其含有10μL裂解緩衝液+50μL標記後的腫瘤細胞+140μL培養基；設置背景對照孔，其含標記後的細胞上清50μL+150μL培養基。然後將96孔板300rpm離心2分鐘後，在37℃，5% CO₂培養箱孵育2小時。取上清100μL到新96孔板(corning，3788)，300g離心5min後，取20μL到檢測板(PerkinElmer，AD0116)，然後加入200μL銪溶液(PerkinElmer，AD0116)，室溫下震盪孵育15分鐘，最後檢測TRF。其中，EM1(afuc)為去岩藻糖基化的EM1；EM2(afuc)為去岩藻糖基化的EM2。

計算公式：特異釋放%=(實驗釋放-自發釋放)/(最大釋放-自發釋放)*100。

實驗結果見圖12和圖13，實驗結果顯示，本揭露的特異性結合HGFR和EGFR的抗原結合分子去岩藻糖基化後，可顯著提高其對細胞的ADCC殺傷能力。

測試例11：抗體在小鼠H1975-HGF模型的體內藥效實驗

將H1975-HGF細胞(穩轉人HGF的H1975細胞(人肺腺癌細胞，ATCC))(5×10⁶個)接種於CD1裸雌性小鼠(維通利華)右肋部皮下。

當瘤體積大小為189mm³時，根據瘤體積大小將動物隨機分組，每組10隻，包括C25-3mpk組(陰性對照，其為無關靶點的IgG1抗體蛋白，給藥劑量為3mg/kg)、JNJ-3mpk組(陽性對照，給藥劑量為3mg/kg)和EM1-3.5mpk組(EM1試驗組，給藥劑量為3.5mg/kg)。以動物分組(0天)起，每週給藥兩次，腹腔注射給藥，連續2到3週。每週測量腫瘤體積2次，稱小鼠體重，記錄數據。藉由T-檢驗對數據進行統計學分析。其中，其中，C25-3mpk、JNJ-3mpk、EM1-3.5mpk為等莫耳量。

腫瘤體積(T)計算公式：T=1/2長×(短)²；

相對腫瘤增殖率T/C%=(T-T0)/(C-C0)×100%；

抑瘤率TGI%=1-T/C%；

其中，T和T0為給藥組腫瘤體積，其中T0為實驗開始時的腫瘤體積；C和C0是陰性對照組腫瘤體積，其中C0是陰性對照組實驗開始時的腫瘤體積。

實驗結果見表19，實驗結果顯示，本揭露的特異性結合HGFR和EGFR的抗原結合分子能顯著抑制腫瘤細胞的生長，第21天時，等莫耳的本揭露的特異性結合HGFR和EGFR的抗原結合分子組的平均腫瘤體積小於陽性對照的一半，抑瘤藥效強於陽性對照抗體JNJ。

測試例12：抗體在小鼠HCC827模型的體內藥效實驗

將HCC827細胞(人非小細胞肺癌細胞，源自ATCC)(8.555×10⁶個)接種於NUNU雌性小鼠(維通利華)右肋部皮下。

當瘤體積大小為200mm³時，根據瘤體積大小將動物隨機分組，每組10隻，包括C25-3mpk組(陰性對照，其中C25為無關靶點的IgG1抗體蛋白，給藥劑量為3mg/kg)、MCLA-3mpk組(陽性對照，給藥劑量為3mg/kg)、EM1-3.5mpk組(EM1高劑量試驗組，給藥劑量為3.5mg/kg)、EM1-1.17mpk組(EM1低劑量試驗組，給藥劑量為1.17mg/kg)和EM2-3mpk組(EM2試驗組，給藥劑量為3mg/kg)。以動物分組(0天)起，每週給藥兩次，腹腔注射給藥，連續2到3週。每週測量腫瘤體積2次，稱小鼠體重，記錄數據。其中，C25-3mpk、MCLA-3mpk、EM1-3.5mpk和EM2-3mpk為等莫耳量。

實驗結果見圖14，實驗結果顯示，本揭露的特異性結合HGFR和EGFR的抗原結合分子能顯著抑制腫瘤細胞的生長，抑瘤效果強於陽性對照抗體。

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Claims

一種抗原結合分子，其包含：

至少一個特異性結合HGFR的抗原結合模塊1、和

至少一個特異性結合EGFR的抗原結合模塊2；

其中，

該抗原結合模塊1包含重鏈可變區M-VH和輕鏈可變區M-VL，該M-VH包含M-HCDR1、M-HCDR2和M-HCDR3，該M-VL包含M-LCDR1、M-LCDR2和M-LCDR3，其中，

(i)該M-HCDR1、M-HCDR2和M-HCDR3分別包含SEQ ID NO：16中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列，和

該M-LCDR1、M-LCDR2和M-LCDR3分別包含SEQ ID NO：17中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列，或

(ii)該M-HCDR1、M-HCDR2和M-HCDR3分別包含SEQ ID NO：12中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列，和

該M-LCDR1、M-LCDR2和M-LCDR3分別包含SEQ ID NO：13中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列，或

(iii)該M-HCDR1、M-HCDR2和M-HCDR3分別包含SEQ ID NO：14中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列，和

該M-LCDR1、M-LCDR2和M-LCDR3分別包含SEQ ID NO：15中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列；

該抗原結合模塊2包含重鏈可變區E-VH和輕鏈可變區E-VL，該E-VH包含E-HCDR1、E-HCDR2和E-HCDR3，該E-VL包含E-LCDR1、E-LCDR2和E-LCDR3，

其中，該E-HCDR1、E-HCDR2和E-HCDR3分別包含SEQ ID NO：3中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列，和

該E-LCDR1、E-LCDR2和E-LCDR3分別包含SEQ ID NO：5中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列；

較佳地，

該E-HCDR1、E-HCDR2、E-HCDR3、E-LCDR1、E-LCDR2和E-LCDR3是根據Kabat編號規則定義的，該E-HCDR1包含SEQ ID NO：6的胺基酸序列，該E-HCDR2包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列，該E-HCDR3包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列，該E-LCDR1包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列，該E-LCDR2包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列，和該E-LCDR3包含SEQ ID NO：11的胺基酸序列；和

該M-HCDR1、M-HCDR2、M-HCDR3、M-LCDR1、M-LCDR2和M-LCDR3是根據Kabat編號規則定義的，其中，

(i)該M-HCDR1包含SEQ ID NO：30的胺基酸序列，該M-HCDR2包含SEQ ID NO：31的胺基酸序列，該M-HCDR3包含SEQ ID NO：32的胺基酸序列，該M-LCDR1包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列，該M-LCDR2包含SEQ ID NO：33的胺基酸序列，和該M-LCDR3包含SEQ ID NO：29的胺基酸序列，或

(ii)該M-HCDR1包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列，該M-HCDR2包含SEQ ID NO：19的胺基酸序列，該M-HCDR3包含SEQ ID NO：20的胺基酸序列，該M-LCDR1包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列，該M-LCDR2包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列，和該M-LCDR3包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列，或

(iii)該M-HCDR1包含SEQ ID NO：24的胺基酸序列，該M-HCDR2包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列，該M-HCDR3包含SEQ ID NO：26的胺基酸序列，該M-LCDR1包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列，該M-LCDR2包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列，和該M-LCDR3包含SEQ ID NO：29的胺基酸序列。
如請求項1所述的抗原結合分子，其中，

(i)該抗原結合分子包含兩個特異性結合HGFR的抗原結合模塊1，

其中一個抗原結合模塊1，其M-VH具有：包含SEQ ID NO：30的胺基酸序列的M-HCDR1、包含SEQ ID NO：31的胺基酸序列的M-HCDR2和包含SEQ ID NO：32的胺基酸序列的M-HCDR3，並且其M-VL具有：包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列的M-LCDR1、包含SEQ ID NO：33的胺基酸序列的M-LCDR2和包含SEQ ID NO：29的胺基酸序列的M-LCDR3；

另一個抗原結合模塊1，其M-VH具有：包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列的M-HCDR1、包含SEQ ID NO：19的胺基酸序列的M-HCDR2和包含SEQ ID NO：20的胺基酸序列的M-HCDR3，並且其M-VL具有：包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的M-LCDR1、包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列的M-LCDR2和包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列的M-LCDR3；和

該抗原結合模塊2，其E-VH具有：包含SEQ ID NO：6的胺基酸序列的E-HCDR1、包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列的E-HCDR2和包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列的E-HCDR3，並且其E-VL具有：包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列的E-LCDR1、包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列的E-LCDR2和包含SEQ ID NO：11的胺基酸序列的E-LCDR3；或

(ii)該抗原結合模塊1，其M-VH具有：包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列的M-HCDR1、包含SEQ ID NO：19的胺基酸序列的M-HCDR2和包含SEQ ID NO：20的胺基酸序列的M-HCDR3，並且其M-VL具有：包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的M-LCDR1、包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列的M-LCDR2和包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列的M-LCDR3；和

該抗原結合模塊2，其E-VH具有：包含SEQ ID NO：6的胺基酸序列的E-HCDR1、包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列的E-HCDR2和包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列的E-HCDR3，並且其E-VL具有：包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列的E-LCDR1、包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列的E-LCDR2和包含SEQ ID NO：11的胺基酸序列的E-LCDR3。
如請求項1或2所述的抗原結合分子，其中，

(i)該M-VH包含與SEQ ID NO：16具有至少90%的序列同一性的胺基酸序列，並且該M-VL包含與SEQ ID NO：17具有至少90%的序列同一性的胺基酸序列；或

該M-VH包含與SEQ ID NO：12具有至少90%的序列同一性的胺基酸序列，並且該M-VL包含與SEQ ID NO：13具有至少90%的序列同一性的胺基酸序列；或

該M-VH包含與SEQ ID NO：14具有至少90%的序列同一性的胺基酸序列，並且該M-VL包含與SEQ ID NO：15具有至少90%的序列同一性的胺基酸序列；和/或

(ii)該E-VH包含與SEQ ID NO：3具有至少90%的序列同一性的胺基酸序列，並且該E-VL包含與SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：4具有至少90%的序列同一性的胺基酸序列；

較佳地，

(i)該抗原結合分子包含兩個特異性結合HGFR的抗原結合模塊1，

其中一個抗原結合模塊1的M-VH包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列，並且M-VL包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列；

另一個抗原結合模塊1的M-VH包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列，並且M-VL包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列；和

該E-VH包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列，並且該E-VL包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列；或

(ii)該E-VH包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列，和該E-VL包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列，並且

該M-VH包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列，和該M-VL包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列。
如請求項1至3中任一項所述的抗原結合分子，其中，該抗原結合分子包含：

兩個特異性結合HGFR的抗原結合模塊1、

一個特異性結合EGFR的抗原結合模塊2、和

Fc區，該Fc區包含能夠相互締合的第一亞基Fc1和第二亞基Fc2；

較佳地，該抗原結合模塊2為特異性結合EGFR的Fv；

該兩個抗原結合模塊1，其中一個為特異性結合HGFR的第一Fab，另一個為特異性結合HGFR的經替換的Fab；

該經替換的Fab包含M-VH、M-VL、Titin鏈和Obscurin鏈，該Titin鏈和Obscurin鏈能夠形成二聚體，其中，該經替換的Fab的M-VH的C端直接或藉由連接子融合至Titin鏈的N端，並且該經替換的Fab的M-VL的C端直接或藉由連接子融合至Obscurin鏈的N端，或該經替換的 Fab的M-VH的C端直接或藉由連接子融合至Obscurin鏈的N端，並且該經替換的Fab的M-VL的C端直接或藉由連接子融合至Titin鏈的N端；

更佳地，該特異性結合EGFR的Fv的E-VH的C端直接或藉由連接子融合至該第一Fab的重鏈的N端，該特異性結合EGFR的Fv的E-VL的C端直接或藉由連接子融合至該第一Fab的輕鏈的N端，

該第一Fab的重鏈的C端直接或藉由連接子融合至Fc1的N端，該Titin鏈的C端或Obscurin鏈的C端直接或藉由連接子融合至Fc2的N端。
如請求項1至3中任一項所述的抗原結合分子，其中，該抗原結合分子包含：

一個特異性結合HGFR的抗原結合模塊1、

一個特異性結合EGFR的抗原結合模塊2、和

Fc區，該Fc區包含能夠相互締合的第一亞基Fc1和第二亞基Fc2；

較佳地，

該抗原結合模塊1是Fab；該抗原結合模塊2是經替換的Fab，其包含E-VH、E-VL、Titin鏈和Obscurin鏈，該Titin鏈和Obscurin鏈能夠形成二聚體；該E-VH的C端直接或藉由連接子融合至Titin鏈的N端和該E-VL的C端直接或藉由連接子融合至Obscurin鏈的N端，或該E-VH的C端直接或藉由連接子融合至Obscurin鏈的N端和該E-VL的C端直接或藉由連接子融合至Titin鏈的N端；

更佳地，

該特異性結合HGFR的Fab的重鏈的C端直接或藉由連接子融合至Fc1的N端；該Titin鏈的C端或Obscurin鏈的C端直接或藉由連接子融合至Fc2的N端。
如請求項4或5所述的抗原結合分子，其中，

該Titin鏈包含SEQ ID NO：45的胺基酸序列或其變體，其中該SEQ ID NO：45的變體相比SEQ ID NO：45，具有選自由3W、8C、11I、13L、20C、22M/22C、25S、26C、39T、40S、42K、45S、47E、49G、56S、58E、60S、64T、66S/66K、70R、75V、77S、79T、81R、82M、83D和84L組成的組中的一個或更多個胺基酸殘基取代；和

該Obscurin鏈包含SEQ ID NO：64的胺基酸序列或其變體，或包含SEQ ID NO：65的胺基酸序列或其變體；

其中該SEQ ID NO：64的變體相比SEQ ID NO：64，具有選自由2E、3C、7K/7R、9C、11L、12S、13Y/13S、14T、17E、20L、22M/22S、25S、30D、32P/32F、34E、36T、41K、42L、44I、45T、48V、53L、58V、62E/62K/62H、66C、67Q/67T、69S、76S、82H、88C、89L、92E、93C、94G和97G組成的組中的一個或更多個胺基酸殘基取代；

該SEQ ID NO：65的變體相比SEQ ID NO：65，具有選自由6E、26S、74C、77S、84C和86C組成的組中的一個或更多個胺基酸殘基取代；

較佳地，

該Titin鏈包含選自SEQ ID NO：45至SEQ ID NO：63中的任一條胺基酸序列，

該Obscurin鏈包含選自SEQ ID NO：64至SEQ ID NO：104中的任一條胺基酸序列；

更佳地，

該Titin鏈包含SEQ ID NO：61的胺基酸序列，該Obscurin鏈包含SEQ ID NO：99的胺基酸序列。
如請求項1至6中任一項所述的抗原結合分子，其中，該抗原結合分子包含Fc區，該Fc區包含能夠相互締合的第一亞基Fc1和第二亞基Fc2，該Fc1和Fc2各自獨立地具有一個或更多個減少Fc區同源二聚化的胺基酸取代；

較佳地，

(i)該Fc1具有根據杵臼技術的凸起結構，和該Fc2具有根據杵臼技術的孔結構，或者該Fc2具有根據杵臼技術的凸起結構，和該Fc1具有根據杵臼技術的孔結構；較佳地，該Fc1在366位置的胺基酸殘基為W；和該Fc2在366位置的胺基酸殘基為S、在368位置的胺基酸殘基為A、和在407位置的胺基酸殘基為V，該胺基酸殘基位置依據EU索引編號；和/或

(ii)該第一亞基Fc1和第二亞基Fc2之間具有工程化二硫鍵，較佳地，該Fc1在354位置的胺基酸殘基為C；和該Fc2在349位置的胺基酸殘基為C，該胺基酸殘基位置依據EU索引編號；

更佳地，

該Fc1在354位置的胺基酸殘基為C、在356位置的胺基酸殘基為E、在358位置的胺基酸殘基為M和在366位置的胺基酸殘基為W；並且該Fc2在349位置的胺基酸殘基為C、在356位置的胺基酸殘基為E、在358位置的胺基酸殘基為M、在366位置的胺基酸殘基為S、在368位置的胺基酸殘基為A和在407位置的胺基酸殘基為V，該胺基酸殘基位置依據EU索引編號。
如請求項7所述的抗原結合分子，其包含：

具有式(a)所示結構的第一鏈、

具有式(b)所示結構的第二鏈、

具有式(c)所示結構的第三鏈、和

具有式(d)所示結構的第四鏈，

其中，

式(a)[E-VH]-[連接子1]-[M-VH]-[CH1]-[Fc1]，

式(b)[E-VL]-[連接子2]-[M-VL]-[CL]，

式(c)[M-VH]-[連接子3]-[Titin鏈]-[Fc2]，

式(d)[M-VL]-[連接子4]-[Obscurin鏈]；

較佳地，該式(a)、式(b)、式(c)和式(d)的連接子是相同或不同的肽連接子；

更佳地，該式(a)、式(b)、式(c)和式(d)中的連接子的胺基酸序列如SEQ ID NO：105或SEQ ID NO：106所示；

特別地，該抗原結合分子具有：一條包含SEQ ID NO：34的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：35的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：36的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：37的胺基酸序列的第四鏈。
如請求項1至3、5至7中的任一項所述的抗原結合分子，其包含：

具有式(e)所示結構的第一鏈、

具有式(f)所示結構的第二鏈、

具有式(g)所示結構的第三鏈、和

具有式(h)所示結構的第四鏈，

其中，

式(e)[M-VH]-[CH1]-[Fc1]，

式(f)[M-VL]-[CL]，

式(g)[E-VH]-[連接子1]-[Titin鏈]-[Fc2]，

式(h)[E-VL]-[連接子2]-[Obscurin鏈]；

較佳地，式(g)和式(h)中的連接子是相同或不同的肽連接子；

更佳地，式(h)和式(g)中的連接子的胺基酸序列如SEQ ID NO：106所示；

特別地，

該抗原結合分子具有：一條包含SEQ ID NO：38的胺基酸序列的第一鏈、一條包含SEQ ID NO：39的胺基酸序列的第二鏈、一條包含SEQ ID NO：40的胺基酸序列的第三鏈和一條包含SEQ ID NO：41的胺基酸序列的第四鏈。
一種抗原結合分子，其包含：

Fv、

第一Fab、

經替換的Fab、和

Fc區，

其中，

該Fc區包含能夠相互締合的第一亞基Fc1和第二亞基Fc2，

該Fv包含重鏈可變區Fv-VH和輕鏈可變區Fv-VL，

該第一Fab包含重鏈可變區Fab1-VH和輕鏈可變區Fab1-VL，

該經替換的Fab包含重鏈可變區Fab-S-VH、輕鏈可變區Fab-S-VL、Titin鏈和Obscurin鏈，該Titin鏈和Obscurin鏈能夠形成二聚體；其中，

該Fab-S-VH的C端直接或藉由連接子融合至Titin鏈的N端和該Fab-S-VL的C端直接或藉由連接子融合至Obscurin鏈的N端，或該Fab-S-VH的C端直接或藉由連接子融合至Obscurin鏈的N端和該Fab-S-VL的C端直接或藉由連接子融合至Titin鏈的N端；並且

該第一Fab的重鏈的C端直接或藉由連接子融合至Fc1的N端；該Fv的Fv-VH的C端直接或藉由連接子融合至該第一Fab的重鏈的N端，該Titin鏈的C端或Obscurin鏈的C端直接或藉由連接子融合至Fc2的N端，並且該Fab-S-VH與該Fc2處於同一條鏈上；

較佳地，該第一Fab和經替換的Fab各自獨立地結合第一抗原，該Fv結合第二抗原；更佳地，該第一抗原為HGFR，該第二抗原為EGFR。
如請求項10所述的抗原結合分子，其中，

該Titin鏈包含SEQ ID NO：45的胺基酸序列或其變體，其中該SEQ ID NO：45的變體相比SEQ ID NO：45，具有選自由3W、8C、11I、13L、20C、22M/22C、25S、26C、39T、40S、42K、45S、47E、49G、56S、58E、60S、64T、66S/66K、70R、75V、77S、79T、81R、82M、83D和84L組成的組中的一個或更多個胺基酸殘基取代；和

該Obscurin鏈包含SEQ ID NO：64的胺基酸序列或其變體，或SEQ ID NO：65的胺基酸序列或其變體；其中該SEQ ID NO：64的變體相比SEQ ID NO：64，具有選自由2E、3C、7K/7R、9C、11L、12S、13Y/13S、14T、17E、20L、22M/22S、25S、30D、32P/32F、34E、36T、41K、42L、44I、45T、48V、53L、58V、62E/62K/62H、66C、67Q/67T、69S、76S、82H、88C、89L、92E、93C、94G和97G組成的組中的一個或更多個胺基酸殘基取代；該SEQ ID NO：65的變體相比SEQ ID NO：65，具有選自由6E、26S、74C、77S、84C和86C組成的組中的一個或更多個胺基酸殘基取代；

較佳地，

該Titin鏈包含選自由SEQ ID NO：45至SEQ ID NO：63組成的組中的任一條胺基酸序列，該Obscurin鏈包含選自由SEQ ID NO：64至SEQ ID NO：104組成的組中的任一條胺基酸序列；

更佳地，

該Titin鏈包含SEQ ID NO：61的胺基酸序列，該Obscurin鏈包含SEQ ID NO：99的胺基酸序列。
如請求項10或11所述的抗原結合分子，其中，該Fc1和Fc2各自獨立地具有一個或更多個減少Fc區同源二聚化的胺基酸取代；

較佳地，

(i)該Fc1具有如杵臼技術的凸起結構，和該Fc2具有如杵臼技術的孔結構，或者該Fc2具有如杵臼技術的凸起結構，和該Fc1具有如杵臼技術的孔結構；較佳地，該Fc1在366位置的胺基酸殘基為W；和該Fc2在366位置的胺基酸殘基為S、在368位置的胺基酸殘基為A、和在407位置的胺基酸殘基為V，該胺基酸殘基位置依據EU索引編號；和/或

(ii)該第一亞基Fc1和第二亞基Fc2之間具有工程化二硫鍵，較佳地，該Fc1在354位置的胺基酸殘基為C；和該Fc2在349位置的胺基酸殘基為C，該胺基酸殘基位置依據EU索引編號；

更佳地，

該Fc1在354位置的胺基酸殘基為C、在356位置的胺基酸殘基為E、在358位置的胺基酸殘基為M和在366位置的胺基酸殘基為W；並且該Fc2在349位置的胺基酸殘基為C、在356位置的胺基酸殘基為E、在358 位置的胺基酸殘基為M、在366位置的胺基酸殘基為S、在368位置的胺基酸殘基為A和在407位置的胺基酸殘基為V，該胺基酸殘基位置依據EU索引編號。
如請求項10至12中任一項所述的抗原結合分子，其包含：

具有式(k)所示結構的第一鏈、

具有式(l)所示結構的第二鏈、

具有式(m)所示結構的第三鏈、和

具有式(n)所示結構的第四鏈，

其中，

式(k)[Fv-VH]-[連接子1]-[Fab1-VH]-[CH1]-[Fc1]，

式(l)[Fv-VL]-[連接子2]-[Fab1-VL]-[CL]，

式(m)[Fab-S-VH]-[連接子3]-[Titin鏈]-[Fc2]，

式(n)[Fab-S-VL]-[連接子4]-[Obscurin鏈]；

較佳地，該式(k)、式(l)、式(m)和式(n)的連接子是相同或不同的肽連接子；

更佳地，該式(k)、式(l)、式(m)和式(n)中的連接子的胺基酸序列如SEQ ID NO：105或SEQ ID NO：106所示。
一種抗原結合分子，其包含：

一個特異性結合EGFR的抗原結合模塊2、和

兩個特異性結合HGFR的抗原結合模塊1，該抗原結合模塊1結合HGFR的不同表位；

較佳地，其中一個抗原結合模塊1與包含SEQ ID NO：16的重鏈可變區和SEQ ID NO：17的輕鏈可變區的抗HGFR抗體競爭性結合人 HGFR；另一個抗原結合模塊1與包含SEQ ID NO：12的重鏈可變區和SEQ ID NO：13的輕鏈可變區的抗HGFR抗體競爭性結合人HGFR。
如請求項1至14中任一項所述的抗原結合分子，其中，該抗原結合分子為低岩藻糖基化的抗原結合分子；

較佳地，至少80%的抗原結合分子未被岩藻糖糖基化修飾；

更佳地，該抗原結合分子檢測不到岩藻糖糖基化修飾。
一種醫藥組成物，其含有：

治療有效量的請求項1至15中任一項所述的抗原結合分子，以及

一種或更多種藥學上可接受的載體、稀釋劑、緩衝劑或賦形劑；

較佳地，該醫藥組成物中還包含至少一種第二治療劑。
一種分離的核酸，其編碼如請求項1至15中任一項所述的抗原結合分子。
一種宿主細胞，其包含如請求項17所述的分離的核酸。
一種治療疾病的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的如請求項1至15中任一項所述的抗原結合分子或如請求項16所述醫藥組成物的步驟；

較佳地，該疾病是腫瘤；更佳地，該腫瘤選自肺癌、乳腺癌、胰腺癌、結直腸癌、肉瘤、腎細胞癌、肝細胞癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、頭頸癌和膠質母細胞瘤。