CN117480180A - 特异性结合hgfr和egfr的抗原结合分子及其医药用途 - Google Patents

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Abstract

一种特异性结合HGFR和EGFR的抗原结合分子及其医药用途。该抗原结合分子可用于治疗肿瘤相关疾病。

Description

特异性结合HGFR和EGFR的抗原结合分子及其医药用途
本申请要求2021年07月14日提交的中国专利申请202110794137.9的优先权。
技术领域
本披露属于生物技术领域，更具体地，本披露涉及抗原结合分子及其应用。
背景技术
这里的陈述仅提供与本披露有关的背景信息，而不必然地构成现有技术。
表皮生长因子受体(EGFR)和肝细胞生长因子受体(HGFR)是两种受体酪氨酸激酶，共同在多种肿瘤细胞上高表达，如非小细胞肺癌(NSCLC)，结直肠癌(CRC)和头颈癌(HNC)等。
EGFR信号通路通过调节细胞增殖，血管生成以及癌症细胞的转移和生存，在肿瘤生物学中发挥着重要作用，该通路的失调会导致肿瘤的发生。由于HGFR的过表达，活化突变，自分泌或旁分泌信号转导或者基因扩增引起的异常信号激活，HGFR也与许多肿瘤的发生相关。通过对癌症疗效的调查发现，EGFR和HGFR信号通路存在着重要联系。
NSCLC占肺癌总数的83％，而EGFR激活型突变是其中常见的类型(白人10-15％，亚洲人50％)。一直以来，EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)都是NSCLC的一线疗法。尽管初始响应率很高(70-80％)，但通常在一年内就会出现耐药。耐药的机制主要有两种，其一是另一种EGFR突变的出现，比如EGFR T790M；其二就是HGFR信号通路的补偿激活。这些因素均影响肿瘤的治疗效果。
发明内容
本披露提供了一种抗原结合分子，其包含至少一个特异性结合HGFR的抗原结合模块1和至少一个特异性结合EGFR的抗原结合模块2。
在一个方面，本披露提供了一种抗原结合分子，其包含至少一个特异性结合HGFR的抗原结合模块1和至少一个特异性结合EGFR的抗原结合模块2；其中，
所述抗原结合模块1包含重链可变区M-VH和轻链可变区M-VL，所述M-VH包含M-HCDR1、M-HCDR2和M-HCDR3，所述M-VL包含M-LCDR1、M-LCDR2和M-LCDR3，其中：
(i)所述M-HCDR1、M-HCDR2和M-HCDR3分别包含SEQ ID NO：16中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列，和所述M-LCDR1、M-LCDR2和M-LCDR3分别包含SEQ ID NO：17中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列，或
(ii)所述M-HCDR1、M-HCDR2和M-HCDR3分别包含SEQ ID NO：12中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列，和所述M-LCDR1、M-LCDR2和M-LCDR3分别包含SEQ ID NO：13中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列；或
(iii)所述M-HCDR1、M-HCDR2和M-HCDR3分别包含SEQ ID NO：14中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列，和所述M-LCDR1、M-LCDR2和M-LCDR3分别包含SEQ ID NO：15中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列；
所述抗原结合模块2包含重链可变区E-VH和轻链可变区E-VL，所述E-VH包含E-HCDR1、E-HCDR2和E-HCDR3，所述E-VL包含E-LCDR1、E-LCDR2和E-LCDR3，其中，所述E-HCDR1、E-HCDR2和E-HCDR3分别包含SEQ ID NO：3中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列，和所述E-LCDR1、E-LCDR2和E-LCDR3分别包含SEQ ID NO：5中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列。
在一些实施方式中，如上所述的抗原结合分子，所述M-HCDR1、M-HCDR2、M-HCDR3、M-LCDR1、M-LCDR2、M-LCDR3、E-HCDR1、E-HCDR2、E-HCDR3、E-LCDR1、E-LCDR2、E-LCDR3、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3是根据Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact编号规则定义的。
在一些实施方式中，所述M-HCDR1、M-HCDR2、M-HCDR3、M-LCDR1、M-LCDR2、M-LCDR3、E-HCDR1、E-HCDR2、E-HCDR3、E-LCDR1、E-LCDR2、E-LCDR3、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3是根据Kabat编号规则定义的。
在一些实施方式中，如上所述的抗原结合分子，所述M-HCDR1、M-HCDR2、M-HCDR3、M-LCDR1、M-LCDR2、M-LCDR3、E-HCDR1、E-HCDR2、E-HCDR3、E-LCDR1、E-LCDR2、E-LCDR3、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3是根据IMGT编号规则定义的。
在一些实施方式中，如上所述的抗原结合分子，所述M-HCDR1、M-HCDR2、M-HCDR3、M-LCDR1、M-LCDR2、M-LCDR3、E-HCDR1、E-HCDR2、E-HCDR3、E-LCDR1、E-LCDR2、E-LCDR3、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3是根据Chothia编号规则定义的。
在一些实施方式中，如上所述的抗原结合分子，所述M-HCDR1、M-HCDR2、M-HCDR3、M-LCDR1、M-LCDR2、M-LCDR3、E-HCDR1、E-HCDR2、E-HCDR3、E-LCDR1、E-LCDR2、E-LCDR3、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3是根据AbM编号规则定义的。
在一些实施方式中，如上所述的抗原结合分子，所述M-HCDR1、M-HCDR2、M-HCDR3、M-LCDR1、M-LCDR2、M-LCDR3、E-HCDR1、E-HCDR2、E-HCDR3、 E-LCDR1、E-LCDR2、E-LCDR3、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3是根据Contact编号规则定义的。
在一些实施方式中，如上任一项所述的抗原结合分子，所述M-HCDR1、M-HCDR2、M-HCDR3、M-LCDR1、M-LCDR2和M-LCDR3是根据Kabat编号规则定义的，其中，
(i)所述M-HCDR1包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列，所述M-HCDR2包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列，所述M-HCDR3包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列，所述M-LCDR1包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列，所述M-LCDR2包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列，和所述M-LCDR3包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列；或
(ii)所述M-HCDR1包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列，所述M-HCDR2包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列，所述M-HCDR3包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，所述M-LCDR1包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列，所述M-LCDR2包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列，和所述M-LCDR3包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列；或
(iii)所述M-HCDR1包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列，所述M-HCDR2包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列，所述M-HCDR3包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列，所述M-LCDR1包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列，所述M-LCDR2包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列，和所述M-LCDR3包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列；和
所述E-HCDR1、E-HCDR2、E-HCDR3、E-LCDR1、E-LCDR2和E-LCDR3是根据Kabat编号规则定义的，所述E-HCDR1包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列，所述E-HCDR2包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列，所述E-HCDR3包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，所述E-LCDR1包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列，所述E-LCDR2包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列，和所述E-LCDR3包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。
在一些实施方式中，如上任一项所述的抗原结合分子，其中所述特异性结合HGFR的抗原结合模块1，其M-VH具有：包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的M-HCDR1、包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的M-HCDR2和包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的M-HCDR3，并且其M-VL具有：包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的M-LCDR1、包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的M-LCDR2和包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的M-LCDR3；和
所述特异性结合EGFR的抗原结合模块2，其E-VH具有：包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的E-HCDR1、包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的E-HCDR2和包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的E-HCDR3，并且其E-VL具有：包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的E-LCDR1、包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的E-LCDR2 和包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的E-LCDR3。
在一些实施方式中，如上任一项所述的抗原结合分子，所述抗原结合分子包含两个特异性结合HGFR的抗原结合模块1，其中一个抗原结合模块1，其M-VH具有：包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的M-HCDR1、包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的M-HCDR2和包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的M-HCDR3，并且其M-VL具有：包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的M-LCDR1、包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的M-LCDR2和包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的M-LCDR3；另一个抗原结合模块1，其M-VH具有：包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的M-HCDR1、包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的M-HCDR2和包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的M-HCDR3，并且其M-VL具有：包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的M-LCDR1、包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的M-LCDR2和包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的M-LCDR3；和
包含特异性结合EGFR的抗原结合模块2，所述抗原结合模块2的E-VH具有：包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的E-HCDR1、包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的E-HCDR2和包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的E-HCDR3，并且其E-VL具有：包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的E-LCDR1、包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的E-LCDR2和包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的E-LCDR3。
在一些实施方式中，如上所述的抗原结合分子，所述M-HCDR1、M-HCDR2、M-HCDR3、M-LCDR1、M-LCDR2、M-LCDR3、E-HCDR1、E-HCDR2、E-HCDR3、E-LCDR1、E-LCDR2、E-LCDR3是根据Kabat编号规则定义的。
在一些实施方案中，如前任一项所述的抗原结合分子，其中：
(i)所述M-VH包含与SEQ ID NO：16具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列，并且所述M-VL包含与SEQ ID NO：17具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列，或
所述M-VH包含与SEQ ID NO：12具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列，并且所述M-VL包含与SEQ ID NO：13具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列，或
所述M-VH包含与SEQ ID NO：14具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列，并且所述M-VL包含与SEQ ID NO：15具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列；和/或
(ii)所述E-VH包含与SEQ ID NO：3具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列，并且所述E-VL包含与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：4具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％ 的序列同一性的氨基酸序列；
在一些实施方案中，如前所述的抗原结合分子，以下功能等价，包括结合相同的表位、具有相同的亲和力(例如KD±50％以内)或其他本专利所披露的功能。
在一些实施方案中，如前任一项所述的抗原结合分子，其中：
(i)所述M-VH包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列，并且所述M-VL包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列，或
所述M-VH包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列，并且所述M-VL包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列，或
所述M-VH包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列，并且所述M-VL包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列；和/或
(ii)所述E-VH包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，并且所述E-VL包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
在一些实施方案中，如前任一项所述的抗原结合分子，其中：
(i)所述抗原结合分子包含两个特异性结合HGFR的抗原结合模块1，其中一个抗原结合模块1的M-VH包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列，并且M-VL包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列；另一个抗原结合模块1的M-VH包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列，并且M-VL包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列；和所述E-VH包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，并且所述E-VL包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；或
(ii)所述抗原结合分子包含至少一个特异性结合HGFR的抗原结合模块1和至少一个特异性结合EGFR的抗原结合模块2，所述E-VH包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，和所述E-VL包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列，并且所述M-VH包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列，和所述M-VL包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列。
在一些实施方案中，如前任一项所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包含两个特异性结合HGFR的抗原结合模块1、一个特异性结合EGFR的抗原结合模块2和Fc区，所述Fc区包含能够相互缔合的第一亚基Fc1和第二亚基Fc2。
在一些实施方案中，所述特异性结合EGFR的抗原结合模块2为特异性结合EGFR的Fv；所述两个特异性结合HGFR的抗原结合模块1分别为特异性结合HGFR的第一Fab和特异性结合HGFR的经替换的Fab，所述经替换的Fab包含M-VH、M-VL、Titin链和Obscurin链，所述Titin链和Obscurin链能够形成二聚体，其中，所述经替换的Fab的M-VH的C端直接或通过连接子融合至Titin链的N端，并且所述经替换的Fab的M-VL的C端直接或通过连接子融合至Obscurin链的N端，或所述经替换的Fab的M-VH的C端直接或通过连接子融合至Obscurin链的N端，并且所述经替换的Fab的M-VL的C端直接或通过连 接子融合至Titin链的N端。
在一些实施方案中，所述特异性结合EGFR的Fv的E-VH的C端直接或通过连接子融合至特异性结合HGFR的第一Fab的重链的N端，所述特异性结合EGFR的Fv的E-VL的C端直接或通过连接子融合至特异性结合HGFR的第一Fab的轻链的N端，所述特异性结合HGFR的第一Fab的重链的C端直接或通过连接子融合至Fc1的N端，所述Titin链的C端或Obscurin链的C端直接或通过连接子融合至Fc2的N端。在一些实施方案中，所述经替换的Fab的M-VH与所述Fc2处于同一条链上。
在一些实施方案中，如前任一项所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包含一个特异性结合HGFR的抗原结合模块1、一个特异性结合EGFR的抗原结合模块2和Fc区，所述Fc区包含能够相互缔合的第一亚基Fc1和第二亚基Fc2。在一些实施方案中，所述抗原结合模块1是Fab；所述抗原结合模块2是经替换的Fab，其包含E-VH、E-VL、Titin链和Obscurin链，所述Titin链和Obscurin链能够形成二聚体；其中，所述E-VH的C端直接或通过连接子融合至Titin链的N端和所述E-VL的C端直接或通过连接子融合至Obscurin链的N端，或所述E-VH的C端直接或通过连接子融合至Obscurin链的N端和所述E-VL的C端直接或通过连接子融合至Titin链的N端。在一些实施方案中，所述特异性结合HGFR的Fab的重链的C端直接或通过连接子融合至Fc1的N端，所述Titin链的C端或Obscurin链的C端直接或通过连接子融合至Fc2的N端。在一些实施方案中，所述E-VH与所述Fc2处于同一条链上。
在一些实施方案中，如前任一项所述的抗原结合分子，所述抗原结合分子包含Fc区，所述Fc区优选为IgG Fc区，更优选为IgG 1Fc区。在一些实施方案中，所述Fc区包含能够相互缔合的第一亚基Fc1和第二亚基Fc2，所述Fc1和Fc2各自独立地具有一个或更多个减少Fc区同源二聚化的氨基酸取代。
在一些实施方案中，(i)所述Fc1具有根据杵臼技术的凸起结构，和所述Fc2具有根据杵臼技术的孔结构；优选地，所述Fc1在366位置的氨基酸残基为W；和所述Fc2在366位置的氨基酸残基为S、在368位置的氨基酸残基为A、和在407位置的氨基酸残基为V，所述氨基酸残基位置依据EU索引编号；和/或(ii)所述第一亚基Fc1和第二亚基Fc2之间具有工程化二硫键，优选地，所述Fc1在354位置的氨基酸残基为C；和所述Fc2在349位置的氨基酸残基为C，所述氨基酸残基位置依据EU索引编号；更优选地，所述Fc1在354位置的氨基酸残基为C、在356位置的氨基酸残基为E、在358位置的氨基酸残基为M和在366位置的氨基酸残基为W；并且所述Fc2在349位置的氨基酸残基为C、在356位置的氨基酸残基为E、在358位置的氨基酸残基为M、在366位置的氨基酸残基为S、在368位置的氨基酸残基为A和在407位置的氨基酸残基为V，所述氨基酸残基位置依据EU索引编号。
在另一些实施方案中，(i)所述Fc2具有根据杵臼技术的凸起结构，和所述Fc1具有根据杵臼技术的孔结构；优选地，所述Fc2在366位置的氨基酸残基为W；和所述Fc1在366位置的氨基酸残基为S、在368位置的氨基酸残基为A、和在407位置的氨基酸残基为V，所述氨基酸残基位置依据EU索引编号；和/或(ii)所述第一亚基Fc2和第二亚基Fc1之间具有工程化二硫键，优选地，所述Fc2在354位置的氨基酸残基为C；和所述Fc1在349位置的氨基酸残基为C，所述氨基酸残基位置依据EU索引编号；更优选地，所述Fc2在354位置的氨基酸残基为C、在356位置的氨基酸残基为E、在358位置的氨基酸残基为M和在366位置的氨基酸残基为W；并且所述Fc1在349位置的氨基酸残基为C、在356位置的氨基酸残基为E、在358位置的氨基酸残基为M、在366位置的氨基酸残基为S、在368位置的氨基酸残基为A和在407位置的氨基酸残基为V，所述氨基酸残基位置依据EU索引编号。
在一些实施方案中，所述Fc1具有SEQ ID NO：107的氨基酸序列，和所述Fc2具有SEQ ID NO：108的氨基酸序列。
在一些实施方案中，如前任一项所述的抗原结合分子，其中：
所述抗原结合分子包含：具有式(a)所示结构的第一链、具有式(b)所示结构的第二链、具有式(c)所示结构的第三链和具有式(d)所示结构的第四链，
式(a)[E-VH]-[连接子1]-[M-VH]-[CH1]-[Fc1]，
式(b)[E-VL]-[连接子2]-[M-VL]-[CL]，
式(c)[M-VH]-[连接子3]-[Titin链]-[Fc2]，
式(d)[M-VL]-[连接子4]-[Obscurin链]。
在一些实施方案中，所述式(a)、式(b)、式(c)和式(d)的连接子是相同或不同的肽连接子；在一些实施方案中，所述肽连接子各自独立地具有L 1-(GGGGS)n-L 2的结构，其中，L 1是键、A、GS、GGS或GGGS(SEQ ID NO：116)，n是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，L2是键、G、GG、GGG或GGGG(SEQ ID NO：117)，并且所述肽连接子不是键。在一些实施方案中，所述肽连接子的长度为3-15个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述肽连接子各自独立地具有(GGGGS)n的结构，其中n是1、2或3。在一些实施方案中，所述式(a)、式(b)、式(c)和式(d)中的连接子的氨基酸序列如SEQ ID NO：105或SEQ ID NO：106所示。在一些实施方案中，所述式(a)和式(b)的连接子的氨基酸序列均如SEQ ID NO：105所示，所述式(c)和式(d)的连接子的氨基酸序列均如SEQ ID NO：106所示。在一些实施方案中，所述抗原结合分子具有一条第一链、一条第二链、一条第三链、一条第四链。在一些实施方案中，所述式(a)中的M-VH和式(c)中的M-VH不相同，所述式(b)中的M-VL和式(d)中的M-VL不相同。在一些实施方案中，所述抗原结合分子具有：包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的第一链、包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列 的第二链、包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的第三链和包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的第四链。
在一些实施方案中，如前任一项所述的抗原结合分子，所述抗原结合分子包含：具有式(e)所示结构的第一链、具有式(f)所示结构的第二链、具有式(g)所示结构的第三链和具有式(h)所示结构的第四链，
式(e)[M-VH]-[CH1]-[Fc1]，
式(f)[M-VL]-[CL]，
式(g)[E-VH]-[连接子1]-[Titin链]-[Fc2]，
式(h)[E-VL]-[连接子2]-[Obscurin链]。
在一些实施方案中，式(g)和式(h)中的连接子是相同或不同的肽连接子。在一些实施方案中，所述肽连接子各自独立地具有L 1-(GGGGS)n-L 2的结构，其中，L 1是键、A、GS、GGS或GGGS(SEQ ID NO：116)，n是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，L2是键、G、GG、GGG或GGGG(SEQ ID NO：117)，并且所述肽连接子不是键。在一些实施方案中，所述肽连接子的长度为3-15个氨基酸残基。在一些实施方案中，式(h)和式(g)中的连接子的氨基酸序列如SEQ ID NO：106所示。在一些实施方案中，所述抗原结合分子具有：包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的第一链、包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的第二链、包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的第三链和包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的第四链。
在一些实施方式中，如前任一项所述的抗原结合分子，其是双特异性抗体。
在另一个方面，本披露提供了一种抗原结合分子，其包含Fv、第一Fab、经替换的Fab和Fc区，其中，所述Fc区包含能够相互缔合的第一亚基Fc1和第二亚基Fc2，所述Fv包含重链可变区Fv-VH和轻链可变区Fv-VL，所述第一Fab包含重链可变区Fab1-VH和轻链可变区Fab1-VL，所述经替换的Fab包含重链可变区Fab-S-VH、轻链可变区Fab-S-VL、Titin链和Obscurin链，所述Titin链和Obscurin链能够形成二聚体；其中：
所述Fab-S-VH的C端直接或通过连接子融合至Titin链的N端和所述Fab-S-VL的C端直接或通过连接子融合至Obscurin链的N端，或所述Fab-S-VH的C端直接或通过连接子融合至Obscurin链的N端和所述Fab-S-VL的C端直接或通过连接子融合至Titin链的N端；以及
所述第一Fab的重链的C端直接或通过连接子融合至Fc1的N端；所述Fv的Fv-VH的C端直接或通过连接子融合至所述第一Fab的重链的N端，所述Titin链的C端或Obscurin链的C端直接或通过连接子融合至Fc2的N端，并且所述Fab-S-VH与所述Fc2处于同一条链上；
在一些实施方式中，所述第一Fab和经替换的Fab各自独立地结合第一抗原，所述Fv结合第二抗原；在一些实施方式中，所述第一抗原为HGFR，所述第二 抗原为EGFR。在一些实施方式中，所述第一Fab和经替换的Fab结合第一抗原的不同表位。
在一些实施方案中，如前任一项所述的抗原结合分子，所述抗原结合分子包含Fc区，所述Fc区优选为IgG Fc区，更优选为IgG 1Fc区。在一些实施方案中，所述Fc区包含能够相互缔合的第一亚基Fc1和第二亚基Fc2，所述Fc1和Fc2各自独立地具有一个或更多个减少Fc区同源二聚化的氨基酸取代。在一些实施方案中，(i)所述Fc1具有根据杵臼技术的凸起结构，和所述Fc2具有根据杵臼技术的孔结构；优选地，所述Fc1在366位置的氨基酸残基为W；和所述Fc2在366位置的氨基酸残基为S、在368位置的氨基酸残基为A、和在407位置的氨基酸残基为V，所述氨基酸残基位置依据EU索引编号；和/或(ii)所述第一亚基Fc1和第二亚基Fc2之间具有工程化二硫键，优选地，所述Fc1在354位置的氨基酸残基为C；和所述Fc2在349位置的氨基酸残基为C，所述氨基酸残基位置依据EU索引编号；更优选地，所述Fc1在354位置的氨基酸残基为C、在356位置的氨基酸残基为E、在358位置的氨基酸残基为M和在366位置的氨基酸残基为W；并且所述Fc2在349位置的氨基酸残基为C、在356位置的氨基酸残基为E、在358位置的氨基酸残基为M、在366位置的氨基酸残基为S、在368位置的氨基酸残基为A和在407位置的氨基酸残基为V，所述氨基酸残基位置依据EU索引编号。在一些实施方案中，(i)所述Fc2具有根据杵臼技术的凸起结构，和所述Fc1具有根据杵臼技术的孔结构；优选地，所述Fc2在366位置的氨基酸残基为W；和所述Fc1在366位置的氨基酸残基为S、在368位置的氨基酸残基为A、和在407位置的氨基酸残基为V，所述氨基酸残基位置依据EU索引编号；和/或(ii)所述第一亚基Fc2和第二亚基Fc1之间具有工程化二硫键，优选地，所述Fc2在354位置的氨基酸残基为C；和所述Fc1在349位置的氨基酸残基为C，所述氨基酸残基位置依据EU索引编号；更优选地，所述Fc2在354位置的氨基酸残基为C、在356位置的氨基酸残基为E、在358位置的氨基酸残基为M和在366位置的氨基酸残基为W；并且所述Fc1在349位置的氨基酸残基为C、在356位置的氨基酸残基为E、在358位置的氨基酸残基为M、在366位置的氨基酸残基为S、在368位置的氨基酸残基为A和在407位置的氨基酸残基为V，所述氨基酸残基位置依据EU索引编号。在一些实施方案中，所述Fc1具有SEQ ID NO：107的氨基酸序列，和所述Fc2具有SEQ ID NO：108的氨基酸序列。
在一些实施方案中，如前任一项所述的抗原结合分子，所述Fc区包含一个或更多个氨基酸取代，所述的氨基酸取代能够减少Fc区与Fc受体的结合。在一些实施方案中，所述的氨基酸取代能够减少其与Fcγ受体的结合。在一些实施方案中，所述Fc区是人IgG 1Fc区，并且在234和235位置的氨基酸残基为A，编号依据为EU索引。
在一些实施方案中，如前任一项所述的抗原结合分子，其中：
所述抗原结合分子包含：具有式(k)所示结构的第一链、具有式(l)所示结构的第二链、具有式(m)所示结构的第三链、具有式(n)所示结构的第四链，
式(k)[Fv-VH]-[连接子1]-[Fab1-VH]-[CH1]-[Fc1]，
式(l)[Fv-VL]-[连接子2]-[Fab1-VL]-[CL]，
式(m)[Fab-S-VH]-[连接子3]-[Titin链]-[Fc2]，
式(n)[Fab-S-VL]-[连接子4]-[Obscurin链]；
在一些实施方案中，所述式(k)、式(l)、式(m)和式(n)的连接子是相同或不同的肽连接子。在一些实施方案中，所述肽连接子各自独立地具有L 1-(GGGGS)n-L 2的结构，其中，L 1是键、A、GS、GGS或GGGS(SEQ ID NO：116)，n是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，L2是键、G、GG、GGG或GGGG(SEQ ID NO：117)，并且所述肽连接子不是键。在一些实施方案中，所述肽连接子的长度为3-15个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述肽连接子各自独立地具有(GGGGS)n的结构，其中n是1、2或3。在一些实施方案中，所述式(k)、式(l)、式(m)和式(n)中的连接子的氨基酸序列如SEQ ID NO：105或SEQ ID NO：106所示。在一些实施方案中，所述式(k)和式(l)的连接子的氨基酸序列均如SEQ ID NO：105所示，所述式(m)和式(n)的连接子的氨基酸序列均如SEQ ID NO：106所示。在一些实施方案中，所述抗原结合分子具有一条第一链、一条第二链、一条第三链、一条第四链。
在一些实施方案中，如前任一项所述的抗原结合分子，其中，
所述Titin链包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列或其变体，所述SEQ ID NO：45的变体相比SEQ ID NO：45，具有选自由3W、8C、11I、13L、20C、22M/22C、25S、26C、39T、40S、42K、45S、47E、49G、56S、58E、60S、64T、66S/66K、70R、75V、77S、79T、81R、82M、83D和84L组成的组中的一个或更多个氨基酸残基取代；和
所述Obscurin链包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列或其变体，或SEQ ID NO：65的氨基酸序列或其变体；其中所述SEQ ID NO：64的变体相比SEQ ID NO：64，具有选自由2E、3C、7K/7R、9C、11L、12S、13Y/13S、14T、17E、20L、22M/22S、25S、30D、32P/32F、34E、36T、41K、42L、44I、45T、48V、53L、58V、62E/62K/62H、66C、67Q/67T、69S、76S、82H、88C、89L、92E、93C、94G和97G组成的组中的一个或更多个氨基酸残基取代；所述SEQ ID NO：65的变体相比SEQ ID NO：65，具有选自由6E、26S、74C、77S、84C和86C组成的组中的一个或更多个氨基酸残基取代。
在一些实施方案中，如前任一项所述的抗原结合分子，其中，所述SEQ ID NO：45的变体具有选自以下任一组所述的氨基酸残基取代：
8C、25S和39T，
20C、25S和39T，
25S、26C和39T，
22C、25S和39T，
8C、25S、39T、66S和77S，
8C、25S、39T、66K、70R、79T和81R，
3W、8C、11I、13L、22M、25S、39T和82M，
8C、11I、25S、39T、66K、79T和81R，
8C、25S、39T、40S、42K、45S、47E、49G、56S、58E、75V、83D和84L，
8C、25S、39T、47E、49G、56S、58E和75V，
8C、25S、39T、56S、58E和75V，
8C、25S、39T、56S、58E、66S和77S，
8C、11I、25S、39T、60S、64T、66K、79T和81R，
8C、11I、20C、25S、39T、60S、64T、66K、79T和81R，
8C、11I、25S、26C、39T、60S、64T、66K、79T和81R。
在一些实施方案中，所述SEQ ID NO：45的变体相比SEQ ID NO：45，其N端具有KAGIR(SEQ ID NO：118)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述SEQ ID NO：45的变体相比SEQ ID NO：45，仅具有上述任一项的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，所述SEQ ID NO：45的变体包含与SEQ ID NO：45具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，如前任一项所述的抗原结合分子，其中，所述SEQ ID NO：64的变体具有选自以下任一组所述的氨基酸残基取代：
88C，
3C，
9C，
25S、76S和88C，
25S、76S和3C，
25S、76S和9C，
7K、25S、62K、76S和88C，
7K、25S、62H、76S和88C，
7R、25S、62K、76S和88C，
7R、25S、62H、76S和88C，
11L、25S、62K、76S和88C，
11L、25S、62H、76S和88C，
12S、13Y、14T、22S、25S、62K、76S和88C，
2E、11L、17E、25S、30D、32P、34E、36T、44I、45T、58V、62E、67Q、69S、76S、88C和97G，
11L、20L、22M、25S、53L、62K、76S和88C，
11L、25S、41K、45T、62K、67Q、69S、76S、88C和89L；
11L、25S、42L、45T、62K、67T、69S、76S、88C、92E和94，
11L、12S、13Y、22S、25S、42L、45T、62K、67Q、69S、76S、88C、92E和94G，
25S、32F、41K、45T、48V、62K、67Q、69S、76S、88C和89L，
13S、25S、32F、41K、45T、48V、62K、67Q、69S、76S、82H、88C和89L，
3C、13S、25S、32F、41K、45T、48V、62K、67Q、69S、76S、82H、88C和89L，
9C、13S、25S、32F、41K、45T、48V、62K、67Q、69S、76S、82H、88C和89L，
13S、32F、41K、45T、48V、62K、67Q、69S、82H、88C和89L，
3C、13S、32F、41K、45T、48V、62K、67Q、69S、82H、88C和89L，
9C、13S、32F、41K、45T、48V、62K、67Q、69S、82H、88C和89L，
13S、25S、32F、41K、45T、48V、62K、66C、67Q、69S、76S、82H、88C、89L和93C，
3C、13S、25S、32F、41K、45T、48V、62K、66C、67Q、69S、76S、82H、88C、89L和93C，
9C、13S、25S、32F、41K、45T、48V、62K、66C、67Q、69S、76S、82H、88C、89L和93C。
在一些实施方案中，所述SEQ ID NO：64的变体相比SEQ ID NO：64，其N端具有DQPQF(SEQ ID NO：119)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述SEQ ID NO：64的变体相比SEQ ID NO：64，仅具有上述任一项的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，所述SEQ ID NO：64的变体包含与SEQ ID NO：64具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，如前任一项所述的抗原结合分子，其中，所述SEQ ID NO：65的变体具有选自以下任一组所述的氨基酸残基取代：
6E和74C，
6E和84C，
6E和86C，
6E、26S、77S和74C，
6E、26S、77S和84C，
6E、26S、77S和86C。
在一些实施方案中，所述SEQ ID NO：65的变体相比SEQ ID NO：65，仅具有上述任一项的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，所述SEQ ID NO：65的变体包含与SEQ ID NO：65具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，如前任一项所述的抗原结合分子，其中所述Titin链包含选自由SEQ ID NO：45至SEQ ID NO：63组成的组的氨基酸序列，所述Obscurin链包含选自由SEQ ID NO：64至SEQ ID NO：104组成的组的氨基酸序列。
在一些实施方案中，如前任一项所述的抗原结合分子，其中所述Titin链包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列，所述Obscurin链包含SEQ ID NO：99的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本披露还提供一种抗原结合分子，其包含一个特异性结合EGFR的抗原结合模块2和两个特异性结合HGFR的抗原结合模块1，所述两个抗原结合模块1结合HGFR的不同表位。
在一些实施方式中，所述两个特异性结合HGFR的抗原结合模块1，其中一个抗原结合模块1与包含SEQ ID NO：16的重链可变区和SEQ ID NO：17的轻链可变区的抗HGFR抗体竞争性结合人HGFR；另一个抗原结合模块1与包含SEQ ID NO：12的重链可变区和SEQ ID NO：13的轻链可变区的抗HGFR抗体竞争性结合人HGFR。
在一些实施方式中，所述两个特异性结合HGFR的抗原结合模块1，其中一个抗原结合模块1能够与Omab竞争性结合，另一个抗原结合模块1能够与Ab10.1竞争性结合。
在一些实施方式中，所述两个特异性结合HGFR的抗原结合模块1，其中一个抗原结合模块1能够与Omab竞争性结合，另一个抗原结合模块1能够与Ab10竞争性结合。
在一些实施方式中，所述两个特异性结合HGFR的抗原结合模块1，其中一个抗原结合模块1与Omab结合相同的表位，另一个抗原结合模块1能够与Ab10.1结合相同的表位。
在一些实施方式中，所述两个特异性结合HGFR的抗原结合模块1，其中一个抗原结合模块1与Omab结合相同的表位，另一个抗原结合模块1与Ab10结合相同的表位。
在一些实施方式中，如前任一项所述的抗原结合分子，所述特异性结合EGFR的抗原结合模块2包含重链可变区E-VH和轻链可变区E-VL，所述E-VH包含E-HCDR1、E-HCDR2和E-HCDR3，所述E-VL包含E-LCDR1、E-LCDR2和E-LCDR3，其中，所述E-HCDR1、E-HCDR2和E-HCDR3分别包含SEQ ID NO： 3中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列，且所述E-LCDR1、E-LCDR2和E-LCDR3分别包含SEQ ID NO：5中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列；和所述特异性结合HGFR的抗原结合模块1包含重链可变区M-VH和轻链可变区M-VL，所述M-VH包含M-HCDR1、M-HCDR2和M-HCDR3，所述M-VL包含M-LCDR1、M-LCDR2和M-LCDR3，其中：一个抗原结合模块1的M-HCDR1、M-HCDR2和M-HCDR3分别包含SEQ ID NO：16中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列，且M-LCDR1、M-LCDR2和M-LCDR3分别包含SEQ ID NO：17中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列；另一个抗原结合模块1的M-HCDR1、M-HCDR2和M-HCDR3分别包含SEQ ID NO：12中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列，且M-LCDR1、M-LCDR2和M-LCDR3分别包含SEQ ID NO：13中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列；在一些实施方式中，所述M-HCDR1、M-HCDR2、M-HCDR3、M-LCDR1、M-LCDR2、M-LCDR3、E-HCDR1、E-HCDR2、E-HCDR3、E-LCDR1、E-LCDR2、E-LCDR3是根据Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact编号规则定义的。
在一些实施方式中，如前任一项所述的抗原结合分子具有以下一种或更多种功能：
a.针对HGFR和/或EGFR的高亲和力。在一些实施方式中，所述的抗原结合分子以小于1.0E-08M(例如小于8.5E-09M、小于7.5E-09M、小于2.5E-09M或更小)的KD值与人HGFR或EGFR结合，所述KD值是通过Biacore方法测定的，具体测试方法见测试例1；
b.针对表达HGFR和/或EGFR的细胞具有体外特异性结合活性，具体测试方法见测试例2；
c.阻断EGF与EGFR的结合。在一些实施方式中，以小于2.7μg/mL的IC 50阻断EGF与EGFR的结合，具体测试方法见测试例3；
d.阻断HGF与HGFR的结合。在一些实施方式中，以大于90％的最大阻断力阻断HGF与HGFR的结合，具体测试方法见测试例4；
e.抑制细胞EGFR磷酸化，具体测试方法见测试例5；
f.抑制细胞HGFR磷酸化，具体测试方法见测试例6；
g.抑制细胞AKT磷酸化，具体测试方法见测试例7；
h.抑制SNU-5细胞的增殖，具体测试方法见测试例9；
i.肿瘤细胞的ADCC杀伤，具体测试方法见测试例10；或
j.体内抑制肿瘤细胞的生长，具体测试方法见测试例11或12。
在一些实施方式中，如前任一项所述的抗原结合分子，其为低岩藻糖基化抗原结合分子；优选地，所述低岩藻糖基化抗原结合分子为至少80％、85％、90％、95％或100％未被岩藻糖糖基化修饰的抗体；更优选地，所述抗原结合分子检测不到岩藻糖糖基化修饰。
在另一个方面，本披露提供了一种药物组合物，其含有：治疗有效量(或预防有效量)的前面任一项所述的抗原结合分子，以及一种或更多种药学上可接受的载体、稀释剂、缓冲剂或赋形剂。
在一些实施方案中，所述的药物组合物中还包含至少一种第二治疗剂。
在另一个方面，本披露还提供分离的核酸，其编码前面任一项所述的抗原结合分子。
在另一个方面，本披露还提供宿主细胞，其包含前述的核酸。在一些实施方式中，所述宿主细胞可选自原核细胞和真核细胞，优选为真核细胞，更优选哺乳动物细胞，优选不包括人类的哺乳动物细胞，其中所述的哺乳动物细胞包括但不限于CHO，293，NSO。在哺乳动物细胞中进行基因编辑可改变抗体或其抗原结合片段的糖基化修饰，进而改变抗原结合分子(例如抗体)的ADCC功能的细胞，例如，敲除Fut8或GnT-III等基因来调节糖基化修饰。
本披露的宿主细胞不能发育成完整植物或动物个体。
在另一个方面，本披露还提供一种治疗或预防疾病的方法，所述方法包括向受试者施用前面任一项所述的抗原结合分子或药物组合物的步骤。在一些实施方式中，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量(或预防有效量)的前面任一项所述的抗原结合分子。
在另一个方面，本披露还提供前面任一项所述的抗原结合分子或药物组合物在制备治疗或预防疾病的药物中的用途。
在另一个方面，本披露还提供用作药物的前述任一项所述的抗原结合分子或组合物。所述药物用于治疗或预防疾病。
在一些实施方式中，前面任一项所述疾病是肿瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤选自肺癌(包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌)、乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌(包括结肠癌和直肠癌)、肉瘤、肾细胞癌、肝细胞癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、头颈癌和胶质母细胞瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤选自肺癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、头颈癌、胃癌和胶质母细胞瘤。
在一些具体的实施方式中，所述肺癌为非小细胞肺癌。
在一些具体的实施方式中，所述肺癌为转移性非小细胞肺癌。
在一些具体的实施方式中，所述肺癌为小细胞肺癌。
在一些具体的实施方式中，所述肺癌为人肺腺癌。
在一些具体的实施方式中，所述肺癌为胃癌。
在一些具体的实施方式中，所述肿瘤为EGFR和/或HGFR相关的肿瘤。
附图说明
图1:Format1的结构示意图。
图2:Format2的结构示意图。
图3:抗体与EGFR CHO-S细胞结合活性实验结果图，其中，附图纵坐标为平均荧光强度(简称MFI，下同)。
图4:抗体与HGFR CHO-S细胞结合活性实验结果图。
图5:抗体与H1975-HGF细胞结合活性实验结果图。
图6:抗体与MKN-45细胞结合活性实验结果图。
图7:抗体对细胞EGFR磷酸化的抑制实验结果。
图8:抗体对细胞HGFR磷酸化的抑制实验结果。
图9:抗体对细胞AKT磷酸化的抑制实验结果。
图10:抗体对细胞表面HGFR的减少实验结果。
图11:抗体对SNU-5细胞的增殖抑制。
图12:抗体对Hs746T细胞的ADCC杀伤实验结果。
图13:抗体对H292细胞的ADCC杀伤实验结果。
图14:抗体抑制HCC827小鼠肿瘤细胞的生长。
具体实施方式
术语
本文所用的术语只是为了描述实施方案的目的，并非旨在进行限制。除非另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。
除非上下文另外清楚要求，否则在整个说明书和权利要求书中，应将词语“包含”、“具有”、“包括”等理解为具有包含意义，而不是排他性或穷举性意义；也即，“包括但不仅限于”的意义。除非另有说明，“包含”包括了“由……组成”。例如，对于包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的M-HCDR1，其明确的包含氨基酸序列如SEQ ID NO：30所示的HGFR-HCDR1。
本披露所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。
术语“和/或”，例如“X和/或Y”应当理解为意指“X和Y”或“X或Y”并且应当被用来提供对两种含义或任一含义的明确支持。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后来修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构(即与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但是以 与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化学化合物。
术语“氨基酸突变”包括氨基酸取代，缺失，插入和修饰。可以进行取代、缺失、插入和修饰的任意组合来实现最终构建体，只要最终构建体拥有期望的特性，例如降低或对Fc受体的结合。氨基酸序列缺失和插入包括在多肽链的氨基端和/或羧基端的缺失和插入。具体的氨基酸突变可以是氨基酸取代。在一个实施方式中，氨基酸突变是非保守性的氨基酸取代，即将一个氨基酸用具有不同结构和/或化学特性的另一种氨基酸替换。氨基酸取代包括由非天然存在的氨基酸或由20种天然氨基酸的衍生物(例如4-羟脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟赖氨酸)替换。可以使用本领域中公知的遗传或化学方法生成氨基酸突变。遗传方法可以包括定点诱变、PCR，基因合成等。基因工程以外的改变氨基酸侧链基团的方法，如化学修饰也可能是可用的。本文中可使用各种名称来指示同一氨基酸突变。本文中，可采用位置+氨基酸残基的方式表示特定位点的氨基酸残基，例如366W，则表示在366位点上的氨基酸残基为W。T366W则表示第366位点上的氨基酸残基由原来的T突变为了W。
术语“抗原结合分子”以最广义使用，涵盖各种特异性结合抗原的分子，包括但不限于抗体、其他具有抗原结合活性的多肽以及两者融合而成的抗体融合蛋白。示例性的，本文中的抗原结合分子是双特异性抗原结合分子(例如：双特异性抗体)。术语“双特异性抗原结合分子”指能够对两个不同抗原或同一抗原的至少两个不同抗原表位特异性结合的抗原结合分子。
术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体；单特异性抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，全长抗体和抗体片段(或抗原结合片段，或抗原结合部分)，只要它们展现出期望的抗原结合活性。“天然抗体”指天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚蛋白，由二硫键结合的两条轻链和两条重链构成。从N至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，又称作可变重域、重链可变区，接着是三个恒定域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，又称作可变轻域，或轻链可变域，接着是一个恒定轻域(轻链恒定区、CL)。
术语“双特异性抗体”指能够对两个不同抗原或同一抗原的两个不同抗原表位特异性结合的抗体(包括抗体或其抗原结合片段，如单链抗体)。现有技术已公开了各种结构的双特异性抗体。根据IgG分子的完整性可分为IgG样双特异性抗体和抗体片段型双特异性抗体。根据抗原结合区域的数量可分为二价、三价、四价或更多价的双特异性抗体。根据结构是否对称可分为对称结构双特异性抗体和不对称结构双特异性抗体。其中，片段型双特异性抗体，例如缺乏Fc片段的Fab片段，其通过将2个或多个Fab片段结合在一个分子中形成双特异性抗体，其具有较低的免疫原性，且分子量小，具有较高的肿瘤组织渗透性，该类型的典 型的抗体结构如F(ab)2、scFv-Fab、(scFv)2-Fab等。IgG样双特异性抗体(例如具有Fc片段)，这类抗体相对分子量较大，Fc片段有助于抗体的纯化，并提高其溶解性、稳定性，Fc部分还可能会与受体FcRn结合，增加抗体血清半衰期。典型的双特异性抗体结构模型如KiH、CrossMAb、Triomab quadroma、FcΔAdp、ART-Ig、BiMAb、Biclonics、BEAT、DuoBody、Azymetric、XmAb、2:1TCBs、1Fab-IgG TDB、FynomAb、two-in-one/DAF、scFv-Fab-IgG、DART-Fc、LP-DART、CODV-Fab-TL、HLE-BiTE、F(ab)2-CrossMAb、IgG-(scFv)2、Bs4Ab、DVD-Ig、Tetravalent-DART-Fc、(scFv)4-Fc、CODV-Ig、mAb2、F(ab)4-CrossMAb等双特异性抗体(参见Aran F.Labrijn等，Nature Reviews Drug Discovery volume 18，pages585–608(2019)；Chen S1等，J Immunol Res.2019 Feb 11；2019:4516041)。
术语“可变区”或“可变域”指抗原结合分子中结合抗原的域。本文中，特异性结合HGFR的抗原结合模块1中的重链可变区标示为M-VH，轻链可变区标示为M-VL；特异性结合EGFR的抗原结合模块2中的重链可变区标示为E-VH，轻链可变区标示为E-VL。VH和VL各包含四个保守的框架区(FR)和三个互补决定区(CDR)。其中，术语“互补决定区”或“CDR”指可变结构域内主要促成与抗原结合的区域；“框架”或“FR”是指除CDR残基之外的可变结构域残基。VH包含3个CDR区：HCDR1、HCDR2和HCDR3；VL包含3个CDR区：LCDR1、LCDR2和LCDR3。本文中，M-VH中的3个CDR区分别标示为M-HCDR1、M-HCDR2和M-HCDR3；M-VL中的3个CDR区分别标示为M-LCDR1、M-LCDR2和M-LCDR3；E-VH中的3个CDR区分别标示为E-HCDR1、E-HCDR2和E-HCDR3；E-VL中的3个CDR区分别标示为E-LCDR1、E-LCDR2和E-LCDR3。每个VH和VL由从氨基末端排到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。单个VH或VL可能足以赋予抗原结合特异性。
可以通过各种公知方案来确定CDR的氨基酸序列边界，例如：“Kabat”编号规则(参见Kabat等(1991)，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD)、“Chothia”编号规则、“ABM”编号规则、“contact”编号规则(参见Martin,ACR.Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains[J].2001)和ImMunoGenTics(IMGT)编号规则(Lefranc，M.P.等，Dev.Comp.Immunol.，27，55-77(2003)；Front Immunol.2018Oct 16；9:2278)等；各种编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的。本披露的编号规则如下表1中所示。
表1.CDR编号系统之间的关系
CDR IMGT Kabat AbM Chothia Contact
HCDR1 27-38 31-35 26-35 26-32 30-35
HCDR2 56-65 50-65 50-58 52-56 47-58
HCDR3 105-117 95-102 95-102 95-102 93-101
LCDR1 27-38 24-34 24-34 24-34 30-36
LCDR2 56-65 50-56 50-56 50-56 46-55
LCDR3 105-117 89-97 89-97 89-97 89-96
除非另有说明，本披露实施例中的可变区和CDR序列均适用“Kabat”编号规则。尽管在具体的实施方案中，采用了Kabat编号规则来限定氨基酸残基，但是其他编号系统所的对应技术方案将视为等同技术方案。
术语“抗体片段”指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的部分，所述部分保留了完整抗体的抗原结合能力。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab′) 2、单域抗体、单链Fab(scFab)、双抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
Fab指由免疫球蛋白的VH和CH1(Fab重链)与VL和CL(Fab轻链)组成的蛋白质。
Fv指由免疫球蛋白的VH与VL组成的抗原结合域。
本披露中，在一些实施方案中，所述第一Fab具有Fab的结构。而在经替换的Fab中，CH1与CL分别被Titin链或Obscurin链替代。
术语“Fc区”或“片段可结晶区”用于定义抗体重链的C末端区域，包括天然Fc区和改造的Fc区。在一些实施方式中，Fc区包含了相同或不同的两个亚基。在一些实施方式中，人IgG重链的Fc区定义为从Cys226位置处的氨基酸残基或从Pro230延伸至其羧基末端。用于本文所述抗体的合适天然序列Fc区包括人IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。除非另有说明，Fc区的编号规则为EU索引。
术语“Titin链”是指Titin蛋白中一段长度为78-118个氨基酸的片段，其包含Titin Ig-样152结构域的肽段或其功能变体。所述Titin链能够与Obscurin链形成二聚化复合物。
术语“Obscurin链”是指Obscurin蛋白上一段长度为87-117个氨基酸的片段，其包含Obscurin Ig-样1结构域的肽段或其功能变体；或是指Obscurin-样1蛋白上一段长度为78-118个氨基酸的片段，其包含Obscurin-样Ig-样1结构域的肽段或其功能变体。所述Obscurin链能够与Titin链结合形成二聚化复合物。本披露的Titin链与Obscurin链可用于替换Fab中的CH1和CL，形成经替换的Fab(Fab-S)。该替换不影响抗原结合分子与抗原的结合。
术语“嵌合”抗体指抗体中的重和/或轻链的一部分自特定的来源或物种衍生，而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生的抗体。
术语“人源化”抗体是保留非人抗体的反应性同时在人中具有较低免疫原性的抗体。例如，可以通过保留非人CDR区，并用其人对应物(即，恒定区以及可变区的框架区部分)替换抗体的其余部分来实现人源化。
术语“亲和力”是指分子(例如，本公开的抗原结合分子)的单个结合部位与其结合配体(例如，抗原)之间非共价相互作用的总体的强度。除非另外指明，如本文所用，“结合亲和力”是指内部结合亲和力，其反映出结合对(例如，抗体与抗原)的成员之间1:1相互作用。分子X对其配体Y的亲和力通常可以由平衡解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法(包括本文所述的那些)测量。术语“kassoc”或“ka”指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，而如本文所使用的术语“kdis”或“kd”意在是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文所使用的，术语“KD”指平衡解离常数，其获得自kd与ka的比率(即kd/ka)并且表示为摩尔浓度(M)。可以使用本领域已知的方法测定抗体的KD值，例如：用于测定抗体KD的方法包括使用生物传感系统例如系统测量表面等离子体共振，或通过溶液平衡滴定法(SET)测量溶液中的亲和力。
术语“效应子功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。
术语“单克隆抗体”指基本上均质的抗体的群或其成员，即在该群中包含的抗体分子的氨基酸序列是相同的，除了可能少量存在的天然突变以外。相比之下，多克隆抗体制剂通常包含在其可变结构域具有不同氨基酸序列的多种不同抗体，其通常特异性针对不同表位。“单克隆”表示从基本上均质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。在一些实施方式中，本披露提供的抗体是单克隆抗体。
术语“抗原”是指能够由抗原结合分子(例如抗体)选择性结合的分子或分子部分。抗原可具有一个或多个能够与不同的抗原结合分子(例如抗体)相互作用的表位。
术语“表位”指能够与抗体或其抗原结合片段特异性结合的抗原上的区域(area或region)。表位可以由连续氨基酸(线性表位)形成或包含非连续氨基酸(构象表位)，例如因抗原的折叠(即通过抗原的三级折叠)而使得非连续的氨基酸在空间上得以接近。构象表位和线性表位的差别在于：在变性溶剂的存在下，抗体对构象表位的结合丧失。通常表位包含处于独特空间构象的至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，或8-10个氨基酸。可以使用本领域例行方法来筛选结合特定表位的(即那些结合相同表位的)抗体，例如但不限于丙氨酸扫描， 肽印迹(见Meth.Mol.Biol.248(2004)443-463)，肽切割分析，表位切除，表位提取，抗原的化学修饰(见Prot.Sci.9(2000)487-496)，和交叉阻断(见“Antibodies”，Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY))。
术语“能够特异性结合”、“特异性结合”或“结合”是指相比其他抗原或表位，抗体能够以更高的亲和力结合至某个抗原或其表位。通常，抗体以约1×10 -7M或更小(例如约1×10 -8M或更小)的平衡解离常数(KD)结合抗原或其表位。在一些实施方式中，抗体与抗原结合的KD为该抗体结合至非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)的KD的10％或更低(例如1％)。可使用已知的方法来测量KD，例如通过FACS或 表面等离子体共振测定法所测量的。然而，特异性结合至抗原或其表位的抗体可能对其它相关的抗原具有交叉反应性，例如，对来自其它物种(同源)(如人或猴，例如食蟹猕猴(Macaca fascicμLaris)(cynomolgus，cyno)、黑猩猩(Pan troglodytes)(chimpanzee，chimp))或狨猴(Callithrix jacchus)(commonmarmoset，marmoset)的相应抗原具有交叉反应性。
术语“抗原结合模块”指特异性结合目标抗原的多肽分子。抗原结合模块包括如本文所述的抗体及其片段。具体的抗原结合模块包括抗体的抗原结合域，其包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区。术语“特异性结合HGFR的抗原结合模块”是指能够以足够的亲和力结合HGFR或其表位的模块。在某些实施例中，特异性结合HGFR的抗原结合模块具有以下的平衡解离常数(KD)：<约1μM、<约100nM或<约10nM或更小，其是通过Biacore方法测量的。在某些实施例中，特异性结合HGFR的抗原结合模块结合来自不同物种的HGFR中的保守表位。术语“特异性结合EGFR的抗原结合模块”是指能够以足够的亲和力结合EGFR或其表位的模块，使得含有该模块的分子可用作靶向EGFR的诊断剂和/或治疗剂。在某些实施例中，特异性结合EGFR的抗原结合模块具有以下的平衡解离常数(KD)：<约1μM、<约100nM、<约10nM或更小，其是通过Biacore方法测量的。在某些实施例中，特异性结合EGFR的抗原结合模块结合来自不同物种的EGFR中的保守表位。抗原结合模块包括如本文定义的抗体片段，例如Fab，经替换的Fab或Fv。
在上下文中，“抗原结合模块1”、“抗原结合模块2”、“连接子1”、“连接子2”中的序数词，其目的仅在于区分不同的技术特征、化学实体；而不限定任何顺序、水平、数量。
术语“连接子”指连接两个多肽片段的连接单元。在本文中，同一或不同结构式中出现的连接子可以是相同或不同的。连接子可以是肽连接子，其包含一个或更多个氨基酸，典型的约1-30个、2-24个或3-15个氨基酸。应用于本文的连接子可以是相同或不同的。当“-”出现在结构式中，其表示两侧的单元直接通过共价键连接。当术语“键”出现在结构单元，其表示该单元两侧的单元直接连 接。
“Tm”是溶解变性温度(例如，通过内源荧光所测量的)。当蛋白质变性(加热或变性剂作用)时，三级结构打开，芳香族氨基酸微环境发生变化，导致发射荧光光谱改变。本披露中，Tm1是指荧光变化到最大值一半时的温度。
“Tonset”是变性起始温度。意指蛋白质开始变性时的温度，即荧光值开始变化时的温度。
“Tagg”是聚集起始温度。通过静态光散射，在266nm和473nm两个波长下检测聚集体，监测到样品开始聚集时的温度。Tagg266指的是266nm下监测到聚集起始温度。
术语“抗体依赖性细胞的细胞毒性”、“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是诱导细胞死亡的机制，该机制依赖于抗体包被的靶细胞与具有裂解活性的效应细胞(如自然杀伤细胞(NK)、单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞)经由效应细胞上表达的Fcγ受体(FcγR)发生的相互作用。例如，NK细胞表达FcγRIIIa，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIIIa。本文提供的抗体的ADCC活性可使用体外测定，使用表达抗原的细胞作为靶细胞和NK细胞作为效应细胞进行评定。根据从裂解的细胞中释放的标记物(例如放射性底物、荧光染料或天然胞内蛋白)来检测细胞裂解。
术语“抗体依赖性细胞吞噬作用”(“ADCP”)是指通过吞噬细胞(如巨噬细胞或树突状细胞)的内化作用消除抗体包被的靶细胞的机制。
术语“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指诱导细胞死亡的机制，其中靶细胞上所结合的抗体的Fc效应域结合并激活补体成分C1q，C1q继而激活补体级联，从而导致靶细胞死亡。补体的激活也可导致补体成分沉积在靶细胞表面上，这些补体成分通过结合白细胞上的补体受体(例如，CR3)来促进CDC。
术语“岩藻糖基化”或“岩藻糖基化的”或“岩藻糖糖基化修饰”指在附着于抗原结合分子(例如抗体)的肽链的寡糖内存在岩藻糖残基。岩藻糖基化是糖蛋白翻译后修饰的一个过程。与核心岩藻糖基化相关的代表性酶基因有GMD(GDP-甘露糖4,6-脱水酶)基因和Fut8(FUT8，fut8，α-1,6-岩藻糖基转移酶)基因。通过抑制这两个基因的表达或者构建Fut8敲除型CHO宿主细胞可有效调节核心岩藻糖基化水平(YAMANE-OHNUKI et al.,“Establishment of FUT8knockout Chinese hamster ovary cells:an ideal host cellline for producing completely defucosylated antibodies with enhancedantibody-dependent cellular cytotoxicity.”,BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING,2004,p614-622)。通常，岩藻糖基化位于抗体Fc区的N-寡糖中，在核心N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)残基处(例如人IgG1Fc的Asn297位置(对应于EU编号规则))包含α-1,6-岩藻糖。
“低岩藻糖基化”是指：带有岩藻糖基化修饰的抗原结合分子(例如抗体)在抗原结合分子群(例如抗体群)中的比例不高于预定值，例如不高于20％、不高于15％、不高于10％、不高于5％、不高于4％、不高于3％、不高于2％、不高于％1、不高于0.5％、不高于0.1％。
“未检测到岩藻糖基化”、“非岩藻糖基化”或“无岩藻糖基化”是指附着于Fc区的碳水化合物结构缺乏岩藻糖的糖基化修饰。技术人员应当理解，在本公开中“无”、“缺乏”不能解读为“完全不存在”，而应当理解为通过本领域已知的寡糖测定方法“检测不到”岩藻糖基化修饰。
抗原结合分子(例如抗体)岩藻糖基化水平可通过本领域已知方法测定所有寡糖，进而确定岩藻糖基化寡糖的百分比。本领域已知的测定岩藻糖基化方法包括但不限于凝胶电泳、液相色谱法、和质谱分析法等。例如，通过亲水性相互作用色谱法(或亲水性相互作用液相色谱法，HILIC)测定抗体的岩藻糖基化的水平，例如用肽-N-聚糖酶F对样品进行处理变性以切割N-连接的聚糖，然后分析N-连接的聚糖的岩藻糖含量。
本披露中，在一些实施方案中，本披露的低岩藻糖基化抗体是至少80％的重链未被岩藻糖的糖基化修饰的抗体，例如至少80-95％、90-95％、95-100％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％抗体重链未被岩藻糖糖基化修饰。本披露中，除非另有说明，否则“非岩藻糖基化”是指100％重链未被岩藻糖糖基化修饰的抗原结合分子(例如抗体)。
低岩藻糖基化或非岩藻糖基化抗原结合分子(例如抗体)可通过本领域公知方法制备。例如通过添加、易位或缺失抗体上存在的一个或多个碳水化合物部分，例如使用岩藻糖苷酶切割抗体的岩藻糖残基(参见Tarentino等(1975)Biochem.14:5516)来制备。低岩藻糖基化的抗体还可通过改变糖基化的组成来改变糖基化水平，例如通过修饰在N297残基处与每个Fc片段附接的聚糖模块来制备(Natsume等(2009)Drug Des.Devel.Ther.3:7)。也可以在不改变抗体序列的情况下，例如，可以通过改变抗体糖基化模式的细胞表达低岩藻糖基化或非岩藻糖基化抗体，包括例如经遗传工程改变的糖基化工程的细胞来制备(参见例如，Hse等，(1997)J.Biol.Chem.272:9062-9070；Yang等，(2015)Nature Biotechnology 33,842-844)。各种糖基化工程的细胞已经在本领域中公开，例如，缺乏岩藻糖转移酶基因(Fut8，(α-(1,6)岩藻糖转移酶)的细胞系Ms704、Ms705和Ms709等(参见Yamane-Ohnuki等(2004)Biotechnol.Bioeng.87:614；美国专利20040110704)，使岩藻糖附接至Asn(297)连接的糖类的能力降低的CHO细胞系Lec13(参见WO 03/035835)，具有很少或没有将岩藻糖添加至N-乙酰葡萄糖胺(其结合抗体的Fc区)的活性的大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(参见EP 1176195)；用于生产具有经修饰的糖基化模式的抗体的植物细胞(参见美国专利US20120276086)。另外，携带编码使用GDP-6-脱氧-D-来苏-4-己糖作为底 物的酶(如GDP-6-脱氧-D-来苏-4-己糖还原酶(RMD))的重组基因细胞也可生产低岩藻糖基化或非岩藻糖基化抗体(参见美国专利US8642292)。
术语“核酸”在本文中可与术语“多核苷酸”互换使用，并且是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。所述术语涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连接的核酸，所述核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有与参考核酸相似的结合特性，并且以类似于参考核苷酸的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
“分离的核酸”指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括在下述细胞中含有的核酸分子，所述细胞通常含有该核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色体位置的染色体位置处。编码所述抗原结合分子的分离的核酸指，编码抗体重链和轻链(或其片段)的一个或更多个核酸分子，并包括在单一载体或分开的载体中，或存在于宿主细胞中一个或更多个位置的一个或更多个核酸分子。除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列以及明确指明的序列。具体地，如下详述，简并密码子取代可以通过产生如下序列而获得，在这些序列中，一个或更多个所选的(或全部)密码子的第三位被简并碱基和/或脱氧肌苷残基取代。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或更多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。除非另外说明，否则特定的多肽序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体。
术语序列“同一性”指，当对两条序列进行最佳比对时，两条序列的氨基酸/核酸在等价位置相同的程度(百分比)；在进行最佳比对时，必要时允许引入间隙以获取最大序列同一性百分比，且不将任何保守性取代视为序列同一性的一部分。为测定序列同一性百分比，比对可以通过本领域技术已知的技术来实现，例如使用公开可得到的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定适用于测量比对的参数，包括在所比较的序列全长上达成最大比对所需的任何算法。
术语“融合”或“连接”是指部件(例如抗原结合模块和Fc结构域)直接地或经由连接子共价连接。
术语“载体”意指能够转运与其连接的另一多核苷酸的多核苷酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指环状双链DNA环，其中可以连接附加的DNA区段。另一种类型的载体是病毒载体，例如腺相关病毒载体(AAV或AAV2)，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿 主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞中后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。术语“表达载体”或“表达构建体”是指适用于对宿主细胞进行转化且含有指导和/或控制(连同宿主细胞一起)与其可操作地连接的一个或更多个异源编码区的表达的核酸序列的载体。表达构建体可以包括但不限于影响或控制转录、翻译且在存在内含子时影响与其可操作地连接的编码区的RNA剪接的序列。
术语“宿主细胞”,“宿主细胞系”,和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已经导入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞及自其衍生的后代，而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变。本文中，该术语包括突变体后代，其包括具有与在原代转化细胞中筛选或选择的细胞具有相同功能或生物学活性。宿主细胞包括原核和真核宿主细胞，其中真核宿主细胞包括但不限于哺乳动物细胞、昆虫细胞系植物细胞和真菌细胞。哺乳动物宿主细胞包括人、小鼠、大鼠、犬、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、A549细胞、3T3细胞和HEK-293细胞。真菌细胞包括酵母和丝状真菌细胞，包括例如巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris)、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、海藻毕赤酵母(Pichia trehalophila)、科克拉马毕赤酵母(Pichia koclamae)、膜状毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、小毕赤酵母(Pichia minuta)(Ogataea minuta、Pichia lindneri)、仙人掌毕赤酵母(Pichiaopuntiae)、耐热毕赤酵母(Pichia thermotolerans)、柳毕赤酵母(Pichia salictaria)、Pichia guercuum、皮杰普毕赤酵母(Pichia pijperi)、具柄毕赤酵母(Pichia stiptis)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、毕赤酵母属、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、酿酒酵母属、多形汉逊酵母(HansenμLa polymorpha)、克鲁维酵母属、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、白色念珠菌(Candida albicans)、构巢曲霉(Aspergillus nidμLans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、勒克氏菌(Chrysosporium lucknowense)、镰刀菌属(Fusarium sp.)、禾谷镰刀菌(Fusarium gramineum)、菜镰刀菌(Fusarium venenatum)、小立碗藓(Physcomitrella patens)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)。毕赤酵母属、任何酿酒酵母属、多形汉逊酵母(HansenμLa polymorpha)、任何克鲁维酵母属、白色念珠菌(Candida albicans)、任何曲霉属、里氏木霉(Trichoderma reesei)、勒克霉菌(Chrysosporium lucknowense)、任何镰刀菌属、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)。
“任选”或“任选地”意味着随后所描述地特征可以但不必发生，将指明包 括该特征发生或不发生的条件。
术语“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述的抗体或抗原结合分子与其他化学组分的混合物，所述其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。
术语“药学上可接受的载体(vehicle)、稀释剂、缓冲剂或赋形剂”指药学配制剂中与活性成分不同的,且对受试者无毒的成分。
术语“受试者”或“个体”包括人类和非人类动物。非人动物包括所有脊椎动物(例如哺乳动物和非哺乳动物)例如非人灵长类(例如，食蟹猴)、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除非指出时，否则所述术语“患者”或“受试者”在本文中可互换地使用。如本文所使用的，术语“食蟹猴(cyno)”或“食蟹猴(cynomolgus)”是指食蟹猴(Macaca fascicμLaris)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
“施用”或“给予”，当其应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。
术语“样品”是指从受试者分离的采集物(如流体、细胞、或组织的，以及存在于受试者体内的流体、细胞或组织)。示例性样品为生物流体，如血液、血清和浆膜液、血浆、淋巴液、尿液、唾液、囊液、泪液、排泄物、痰、分泌组织和器官的粘膜分泌物、阴道分泌物、腹水、胸膜、心包、腹膜、腹腔和其它体腔的流体、由支气管灌洗液收集的流体、滑液、与受试者或生物来源接触的液体溶液，例如培养基(包括条件培养基)、灌洗液等，组织活检样品、细针穿刺、手术切除的组织、器官培养物或细胞培养物。
“治疗(treatment或treat)”和“处理”(及其语法变型)指施加至所治疗个体的临床干预，并且可以为了预防或者在临床病理学的过程期间进行实施。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发，减轻症状，减轻/减少疾病的任何直接或间接病理后果，预防转移，降低疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和消退或改善的预后。在一些实施方案中，使用本披露的抗原结合分子来延迟疾病的形成或减缓疾病的进展。
“有效量”一般是足以降低症状的严重程度和/或频率、消除这些症状和/或潜在病因、预防症状和/或其潜在病因出现和/或改良或改善由疾病状态引起或与其相关的损伤的量。在一些实施例中，有效量是治疗有效量或预防有效量。
“治疗有效量”是足以治疗疾病状态或症状、尤其与该疾病状态相关的状态或症状，或者以其他方式、阻碍、延迟或逆转该疾病状态或与该疾病相关的任何其他不理想症状的进展的量。
“预防有效量”是当给予受试者时将具有预定预防效应，例如预防或延迟该疾病状态的发作(或复发)，或者降低该疾病状态或相关症状的发作(或复发)可能性的量。完全治疗或预防效未必在给予一个剂量之后便发生，可能在给予一 系列剂量之后发生。因而，治疗或预防有效量可以一次或多次给予的方式给予。“治疗有效量”和“预防有效量”可取决于多种因素变化：如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及治疗剂或治疗剂组合在个体中引发期望的应答的能力。有效治疗剂或治疗剂组合的示例性指标包括例如患者改善的健康状况。
靶分子
“HGFR”应作广泛的理解，旨在涵盖HGFR在哺乳动物体内各阶段中的各种形式的分子，例如但不限于HGFR基因在扩增、复制、转录、剪接、加工、翻译、修饰过程中所产生的分子(例如前体HGFR、成熟HGFR、膜表达的HGFR、HGFR剪接变体、修饰的HGFR、或其片段)；该术语也涵盖人工制备的或体外表达的HGFR。
“EGFR”应作广泛的理解，旨在涵盖EGFR在哺乳动物体内各阶段中的各种形式的分子，例如但不限于EGFR基因在扩增、复制、转录、剪接、加工、翻译、修饰过程中所产生的分子(例如前体EGFR、成熟EGFR、膜表达的EGFR、EGFR剪接变体、修饰的EGFR、或其片段)；该术语也涵盖人工制备的或体外表达的EGFR。
本披露的抗原结合分子
本披露提供了抗原结合分子，其具有诸多有利的特性，例如亲和力、对细胞表面HGFR、EGFR的结合特异性、阻断EGF与EGFR的结合、阻断HGF与HGFR的结合、抑制细胞EGFR磷酸化、抑制细胞HGFR磷酸化、抑制细胞AKT磷酸化、抑制SNU-5细胞的增殖、肿瘤细胞的ADCC杀伤、治疗活性、安全性(如更低的细胞因子释放)、药物代谢动力学特性和/或成药性(如产率、纯度和稳定性等)。
示例性的抗原结合分子
在一个方面，本披露提供了一种抗原结合分子，其包含至少一个特异性结合HGFR的抗原结合模块1和至少一个特异性结合EGFR的抗原结合模块2。特别的，本披露的抗原结合分子具有以下一种或更多种功能：
a.针对HGFR和/或EGFR的高亲和力。在一些实施方式中，所述的抗原结合分子以小于1.0E-08M(例如小于8.5E-09M、小于7.5E-09M、小于2.5E-09M或更小)的KD值与人HGFR或EGFR结合，所述KD值是通过Biacore方法测定的，具体测试方法见测试例1；
b.针对表达HGFR和/或EGFR细胞的体外特异性结合活性，具体测试方法见测试例2；
c.阻断EGF与EGFR的结合。在一些实施方式中，以小于2.7μg/mL的IC50阻断EGF与EGFR的结合，具体测试方法见测试例3；
d.阻断HGF与HGFR的结合。在一些实施方式中，以大于90％的最大阻断力阻断HGF与HGFR的结合，具体测试方法见测试例4；
e.抑制细胞EGFR磷酸化，具体测试方法见测试例5；
f.抑制细胞HGFR磷酸化，具体测试方法见测试例6；
g.抑制细胞AKT磷酸化，具体测试方法见测试例7；
h.抑制SNU-5细胞的增殖，具体测试方法见测试例9；
i.肿瘤细胞的ADCC杀伤，具体测试方法见测试例10；或
j.体内抑制肿瘤细胞的生长，具体测试方法见测试例11或12。
在一个方面，本披露提供了一种抗原结合分子，其包含至少一个特异性结合HGFR的抗原结合模块1和至少一个特异性结合EGFR的抗原结合模块2；其中，所述抗原结合模块1包含重链可变区M-VH和轻链可变区M-VL，所述M-VH包含M-HCDR1、M-HCDR2和M-HCDR3，所述M-VL包含M-LCDR1、M-LCDR2和M-LCDR3，所述抗原结合模块2包含重链可变区E-VH和轻链可变区E-VL，所述E-VH包含E-HCDR1、E-HCDR2和E-HCDR3，所述E-VL包含E-LCDR1、E-LCDR2和E-LCDR3；其中
所述特异性结合HGFR的抗原结合模块1，其中(i)所述M-HCDR1如SEQ ID NO：30所示，所述M-HCDR2如SEQ ID NO：31所示，所述M-HCDR3如SEQ ID NO：32所示，所述M-LCDR1如SEQ ID NO：27所示，所述M-LCDR2如SEQ ID NO：33所示，和所述M-LCDR3如SEQ ID NO：29所示；或(ii)所述M-HCDR1如SEQ ID NO：18所示，所述M-HCDR2如SEQ ID NO：19所示，所述M-HCDR3如SEQ ID NO：20所示，所述M-LCDR1如SEQ ID NO：21所示，所述M-LCDR2如SEQ ID NO：22所示，和所述M-LCDR3如SEQ ID NO：23所示；或(iii)所述M-HCDR1如SEQ ID NO：24所示，所述M-HCDR2如SEQ ID NO：25所示，所述M-HCDR3如SEQ ID NO：26所示，所述M-LCDR1如SEQ ID NO：27所示，所述M-LCDR2如SEQ ID NO：28所示，和所述M-LCDR3如SEQ ID NO：29所示；和
所述特异性结合EGFR的抗原结合模块2，其中所述E-HCDR1如SEQ ID NO：6所示，所述E-HCDR2如SEQ ID NO：7所示，所述E-HCDR3如SEQ ID NO：8所示，所述E-LCDR1如SEQ ID NO：9所示，所述E-LCDR2如SEQ ID NO：10所示，和所述E-LCDR3如SEQ ID NO：11所示。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子包含两个特异性结合HGFR的抗原结合模块1，其中一个抗原结合模块1，其M-VH具有：如SEQ ID NO：30所示的M-HCDR1、如SEQ ID NO：31所示的M-HCDR2和如SEQ ID NO：32所示的M-HCDR3，并且其M-VL具有：如SEQ ID NO：27所示的M-LCDR1、如SEQ ID NO：33所示的M-LCDR2和如SEQ ID NO：29所示的M-LCDR3；另一个抗原结合模块1，其M-VH具有：如SEQ ID NO：18所示的M-HCDR1、如SEQ ID NO：19所示的M-HCDR2和如SEQ ID NO：20所示的M-HCDR3，并且其M-VL具有：如SEQ ID NO：21所示的M-LCDR1、如SEQ ID NO：22所 示的M-LCDR2和如SEQ ID NO：23所示的M-LCDR3；和
所述特异性结合EGFR的抗原结合模块2，其E-VH具有：如SEQ ID NO：6所示的E-HCDR1、如SEQ ID NO：7所示的E-HCDR2和如SEQ ID NO：8所示的E-HCDR3，并且其E-VL具有：如SEQ ID NO：9所示的E-LCDR1、如SEQ ID NO：10所示的E-LCDR2和如SEQ ID NO：11所示的E-LCDR3；或
在一些实施方式中，所述特异性结合HGFR的抗原结合模块1，其M-VH具有：如SEQ ID NO：18所示的M-HCDR1、如SEQ ID NO：19所示的M-HCDR2和如SEQ ID NO：20所示的M-HCDR3，并且其M-VL具有：如SEQ ID NO：21所示的M-LCDR1、如SEQ ID NO：22所示的M-LCDR2和如SEQ ID NO：23所示的M-LCDR3；和
所述特异性结合EGFR的抗原结合模块2，其E-VH具有：如SEQ ID NO：6所示的E-HCDR1、如SEQ ID NO：7所示的E-HCDR2和如SEQ ID NO：8所示的E-HCDR3，并且其E-VL具有：如SEQ ID NO：9所示的E-LCDR1、如SEQ ID NO：10所示的E-LCDR2和如SEQ ID NO：11所示的E-LCDR3。
在一些实施方式中，所述M-VH如SEQ ID NO：16所示，并且所述M-VL如SEQ ID NO：17所示，或所述M-VH如SEQ ID NO：12所示，并且所述M-VL如SEQ ID NO：13所示，或所述M-VH如SEQ ID NO：14所示，并且所述M-VL如SEQ ID NO：15所示；和/或
(ii)所述E-VH如SEQ ID NO：3所示，并且所述E-VL如SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：4所示。
在一些实施方案中，如前任一项所述的抗原结合分子，其中：
(i)所述抗原结合分子如两个特异性结合HGFR的抗原结合模块1，其中一个抗原结合模块1的M-VH如SEQ ID NO：16所示，并且M-VL如SEQ ID NO：17所示；另一个抗原结合模块1的M-VH如SEQ ID NO：12所示，并且M-VL如SEQ ID NO：13所示；和所述E-VH如SEQ ID NO：3所示，并且所述E-VL如SEQ ID NO：5所示；或
(ii)所述抗原结合分子如至少一个特异性结合HGFR的抗原结合模块1和至少一个特异性结合EGFR的抗原结合模块2，所述E-VH如SEQ ID NO：3所示，和所述E-VL如SEQ ID NO：5所示，并且所述M-VH如SEQ ID NO：12所示，和所述M-VL如SEQ ID NO：13所示。
在一些实施方案中，如前任一项所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子还包含Fc区，所述Fc区包含能够相互缔合的第一亚基Fc1和第二亚基Fc2。在一些实施方案中，所述Fc区是IgG Fc区，特别是IgG 1Fc区。
在一些实施方案中，如前任一项所述的抗原结合分子，其具有：式(a)所示结构的第一链、式(b)所示结构的第二链、式(c)所示结构的第三链和式(d)所示结构的第四链，
式(a)[E-VH]-[连接子1]-[M-VH]-[CH1]-[Fc1]，
式(b)[E-VL]-[连接子2]-[M-VL]-[CL]，
式(c)[M-VH]-[连接子3]-[Titin链]-[Fc2]，
式(d)[M-VL]-[连接子4]-[Obscurin链]。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子具有：一条如SEQ ID NO：34所示的第一链、一条如SEQ ID NO：35所示的第二链、一条如SEQ ID NO：36所示的第三链和一条如SEQ ID NO：37所示的第四链。
在一些实施方案中，如前任一项所述的抗原结合分子，其具有：式(e)所示结构的第一链、式(f)所示结构的第二链、式(g)所示结构的第三链和式(h)所示结构的第四链，
式(e)[M-VH]-[CH1]-[Fc1]，
式(f)[M-VL]-[CL]，
式(g)[E-VH]-[连接子1]-[Titin链]-[Fc2]，
式(h)[E-VL]-[连接子2]-[Obscurin链]。
在一些具体的实施方案中，所述抗原结合分子具有：一条如SEQ ID NO：38所示的第一链、一条如SEQ ID NO：39所示的第二链、一条如SEQ ID NO：40所示的第三链和一条如SEQ ID NO：41所示的第四链。
抗原结合分子的变体
在某些实施方案中，涵盖本文中提供的抗原结合分子的氨基酸序列变体。例如，可以期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将合适的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗原结合分子的氨基酸序列内的残基的删除、和/或插入、和/或取代。可以进行删除、插入、和取代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如抗原结合特性。
包含取代、插入、和删除的变体
在某些实施方案中，提供了具有一处或多处氨基酸取代的抗原结合分子变体。感兴趣的位点包括CDR和FR。保守取代在表2中在“优选的取代”的标题下显示。示例性取代在表2中在“示例性取代”的标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸取代引入感兴趣的抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合，降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC。
表2.氨基酸的取代
原始残基 示例性取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp,Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
依照常见的侧链特性，氨基酸可以如下分组:
(1)疏水性的：Nle，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中性，亲水性的：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性的：Asp，Glu；
(4)碱性的：His，Lys，Arg；
(5)影响链取向(orientation)的残基：Gly，Pro；
(6)芳香族的：Trp，Tyr，Phe。
非保守取代是指，用一个类别的成员替换另一个类别的成员。
一类取代变体涉及取代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或更多个CDR残基。一般地，经选择用于进一步研究的所得变体相对于亲本抗体会具有某些生物学特性(例如升高的亲和力，降低的免疫原性)的改变(例如改善)，和/或会基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。一种示例性的取代变体是亲和力成熟的抗体，可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(如本文所述的那些技术)，便利地产生所述抗体。简言之，将一个或更多个CDR残基突变，并将变体抗体在噬菌体上展示，并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。可以对CDR做出改变(例如取代)，例如以改善抗体亲和力。可以对CDR“热点”(即在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子所编码的残基)和/或对接触抗原的残基做出此类改变。同时对所得的变体VH或VL测试结合亲和力。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如易错PCR、链改组、或寡核苷酸指导的诱变)的任一种，将多样性引入所选择用于成熟的可变基因中。 然后，创建次级文库。然后，筛选文库以鉴定具有期望的亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法涉及CDR定向的方法，其中将几个CDR残基(例如一次4-6个残基)随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定涉及抗原结合的CDR残基。特别地，经常靶向HCDR3和LCDR3。
在某些实施方案中，取代、插入或缺失可以在一个或更多个CDR内发生，只要此类变化不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以对CDR做出保守变化(例如保守取代，如本文中提供的)，其不实质性降低结合亲和力。此类变化不发生在接触抗原的残基。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个CDR是未改变的，或者含有不超过1、2或3处氨基酸取代。
一种可用于鉴定抗体中可以作为诱变靶位的残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”。在这种方法中，鉴定一个残基或残基组(例如带电荷的残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，并且用中性或带负电荷的氨基酸(例如，Ala或聚丙氨酸)替换以确定该抗体与抗原的相互作用是否受影响。可以在对初始取代显示功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的取代。此外，可通过研究抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体与抗原间的接触点。这些接触残基及邻近残基可以作为取代候选物被打靶或消除。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。
氨基酸序列插入包括：在氨基和/或羧基端融合1个残基或长度为100或更多个残基的多肽，和单个或多个氨基酸残基的序列内插入。在末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括在抗体的N或C端融合有酶(或延长抗体的血清半衰期的多肽)的融合物。
Fab的改造
在一个方面，本披露的抗原结合分子中，所述特异性结合HGFR的抗原结合模块是Fab，所述特异性结合EGFR的抗原结合模块是经替换的Fab，所述经替换的Fab包含重链可变区、轻链可变区、Titin链和Obscurin链。在经替换的Fab中，Fab原有的CH1和CL被Titin链和Obscurin链所替换。
在另一个方面，本披露的抗原结合分子中，所述特异性结合EGFR的抗原结合模块是Fab，所述特异性结合HGFR的抗原结合模块是经替换的Fab，所述经替换的Fab包含重链可变区、轻链可变区、Titin链和Obscurin链。在经替换的Fab中，Fab原有的CH1和CL被Titin链和Obscurin链所替换。
Fc区的改造
在一个方面，本披露的抗原结合分子的Fc区包含一个或更多个氨基酸取代，所述一个或更多个氨基酸取代减少其与Fc受体的结合，例如其与Fcγ受体的结合，并且降低或消除效应子功能。天然IgG Fc区，具体地是IgG 1Fc区或IgG 4Fc区，可能导致本披露的抗原结合分子靶向表达Fc受体的细胞，而不是表达抗原的细胞。本披露改造的Fc区表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在一些实施方案中，改造的Fc区与天然Fc区相比，对Fc受体的 结合亲和力下降50％、80％、90％或95％以上。在一些实施方案中，所述的Fc受体是Fcγ受体。在一些实施方案中，所述Fc受体是人Fcγ受体，例如FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIB、FcγRIIIa。在一些实施方案中，改造的Fc区与天然Fc区相比，对补体，如C1q的结合亲和力降低。在一些实施方案中，改造的Fc区与天然Fc区相比，对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力不降低。在一些实施例中，改造的Fc区具有降低的效应子功能，所述降低的效应子功能可以包括但不限于以下中的一个或更多个：降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)、降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、降低的抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)、减少的细胞因子分泌、减少的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、减少的与NK细胞的结合、减少的与巨噬细胞的结合、减少的与单核细胞的结合、减少的与多形核细胞的结合、减少的直接信号传导诱导性细胞凋亡、降低的树突细胞成熟或减少的T细胞引发。对于IgG 1Fc区，在238、265、269、270、297、327和329等位置的氨基酸残基取代可降低的效应子功能。
在一些实施方案中，所述Fc区是人IgG 1Fc区，并且在234和235位置的氨基酸残基为A，编号依据为EU索引。对于IgG 4Fc区，在228等位置的氨基酸残基取代可降低的效应子功能。
抗原结合分子可包含与Fc区的两个亚基融合的不同抗原结合模块，可能导致不期望的同源二聚化。为了提高产率和纯度，因此在本披露的抗原结合分子的Fc区中引入促进异源二聚化的修饰将是有利的。在一些实施方式中，本披露的Fc区包含根据杵臼(knob-into-hole，KIH)技术的改造，该方法涉及在第一亚基的界面处引入凸起结构(knob)以及在第二亚基的界面处引入孔结构(hole)；或者在第二亚基的界面处引入凸起结构(knob)以及在第一亚基的界面处引入孔结构(hole)。使得所述凸起结构可以定位在孔结构中，促进异源二聚体的形成并抑制同源二聚体的产生。凸起结构是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一亚基的界面的小氨基酸侧链而构建的。而孔结构是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链而在第二亚基的界面中创建的。凸起结构和孔结构通过改变编码多肽的核酸来制备。在一些实施方案中，可选的氨基酸取代如下表所示：
表3.KIH突变组合
除了杵臼技术外，用于修饰重链的CH3结构域以实现异源二聚化的其他技术也是本领域中已知的，例如WO96/27011、WO98/050431、EP1870459、 WO2007/110205、WO 007/147901、WO2009/089004、WO2010/129304、WO2011/90754、WO2011/143545、WO2012/058768、WO2013/157954和WO013/096291。
抗原结合分子还可包含二硫键改造，例如Fc区的第一亚基包含354C突变和第二亚基包含349C突变，使Fc区的第一亚基和第二亚基之间产生工程化二硫键，促进Fc区第一亚基和第二亚基的形成异源二聚化。
抗原结合分子的Fc区还可进一步引入其它的氨基酸改造，例如降低免疫原性的同种异型氨基酸残基突变。在一些实施方案中，IgG1的Fc引入356E和358M突变。
Fc区的C末端可以是以氨基酸残基PGK结束的完整C末端；也可以是截短的C末端，例如在所述截短的C末端中已经去除了一个或两个C末端氨基酸残基。在一个优选的方面中，重链的C末端是以PG结束的截短的C末端。因此，在一些实施方式中，完整抗体的组合物可以包括去除了所有K447残基和/或G446+K447残基的抗体群体。在一些实施方式中，完整抗体的组合物可以包括没有去除K447残基和/或G446+K447残基的抗体群体。在一些实施方式中，完整抗体的组合物具有带有或不带有K447残基和/或G446+K447残基的抗体混合物的抗体群体。
重组方法
抗原结合分子可以使用重组方法来产生。对于这些方法，提供编码抗原结合分子的一个或更多个分离的核酸。
在天然抗体、天然抗体片段或具有同源二聚体重链的双特异性抗体的情况下，需要两个核酸，一个用于轻链或其片段，一个用于重链或其片段。此类核酸编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含抗体VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。这些核酸可以在相同的表达载体上或在不同的表达载体上。
在具有异二聚体重链的双特异性抗体的情况下，需要四个核酸，一个用于第一轻链，一个用于包含第一Fc区多肽的第一重链，一个用于第二轻链，并且一个用于包含第二Fc区多肽的第二重链。这四个核酸可包含在一个或更多个核酸分子或表达载体中，通常这些核酸位于两个或三个表达载体上，即一个载体可包含这些核酸中的多于一个。
在一个实施方案中，本披露提供了编码如前所述的抗体的分离的核酸。此类核酸可以独立编码前述的任一多肽链。在另一方面中，本披露提供了包含此类核酸的一种或多种载体(例如表达载体)。在另一方面中，本披露提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个实施方案中，提供制备抗原结合分子的方法，其中所述方法包括，在适合抗体表达的条件下，培养包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞，如上文所提供的，和任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。
为了重组产生抗原结合分子，将编码蛋白的核酸分离并插入一个或更多个载 体中，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸可以使用常规程序容易地分离和测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，或者通过重组方法产生或通过化学合成获得。
用于克隆或表达编码抗体的载体的适当宿主细胞包括本文描述的原核或真核细胞。例如，抗体可在细菌中产生，特别是当抗体不需要糖基化和Fc效应子功能时。在表达后，抗体可以在可溶级分中从细菌细胞糊状物分离，并且可进一步纯化。
除了原核生物以外，真核微生物如丝状真菌或酵母也是用于编码抗体的载体的合适的克隆或表达宿主，包括真菌和酵母菌株，其糖基化途径已经“人源化”，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。适于表达(糖基化)抗体的合适的宿主细胞也可源自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)；无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株，其可与昆虫细胞联合使用，特别是用于草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的转染；还可利用植物细胞培养物作为宿主，例如US5959177、US 6040498、US6420548、US 7125978和US6417429；也可将脊椎动物细胞用作宿主，例如适应于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系。适宜的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是经SV40转化的猴肾CVl系(COS-7)；人胚肾系(293或293T细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；水牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞；MRC 5细胞；和FS4细胞。其它适宜的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞；以及骨髓瘤细胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。关于适合产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如Yazaki，P.和Wu，A.M.，Methods in MolecμLar Biology，Vol.248，Lo，B.K.C.(编)，Humana Press，Totowa，NJ(2004)，第255-268页。
诊断与治疗组合物
在某些实施方案中，本披露提供的抗原结合分子可用于检测生物学样品中HGFR或EGFR的存在。在用于本文时，术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中，生物学样品包含细胞或组织，如肿瘤组织。
在一个实施方案中，提供了在诊断或检测方法中使用的抗原结合分子。在又一方面，提供了检测生物学样品中HGFR或EGFR的存在/水平的方法。在某些实施方案中，该方法包括在适宜条件下使生物学样品与抗原结合分子接触，并检测是否在检测试剂与抗原之间形成复合物。此类方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，使用抗原结合分子来选择适合治疗的受试者，例如HGFR或EGFR是用于选择受试者的生物标志物。
在某些实施方案中，提供了经标记的抗原结合分子。标记物包括但不限于直接检测的标记物或模块(如荧光、发色、电子致密、化学发光、和放射性标记物)，和间接检测的模块(例如，经由酶反应或分子相互作用间接检测的模块，如酶或配体)。
在另外的方面，提供包含所述抗原结合分子的药物组合物，例如，用于以下任何治疗方法。在一个方面，药物组合物包含本文提供的任何抗体和药学上可接受的载体。在另一个方面，药物组合物包含本文提供的任何抗体和至少一种另外的治疗剂。
本披露所述的抗原结合分子的药物组合物通过以下制备：将具有所需纯度的此类抗体与一种或更多种任选的药学上可接受的载体混合，所述药物组合物为冻干组合物或水溶液的形式。用于体内施用的配制剂一般是无菌的。无菌性可容易地实现，例如通过穿过无菌滤膜过滤。
治疗方法与施用途径
本文提供的任何抗原结合分子可用于治疗方法。
在又一个方面，本披露提供抗原结合分子在药物的制造或制备中的用途。在一个实施方案中，所述药物用于治疗HGFR和/或EGFR相关疾病，例如肿瘤，如高表达HGFR和/或EGFR的肿瘤，例如肺癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、头颈癌、胃癌或胶质母细胞瘤。并且所述药物是以对上述疾病的有效量的形式存在的。
在一些实施方式中，所述有效量是单位日剂量或单位周剂量。在一个此类实施方案中，所述用途进一步包括向受试者施用有效量的至少一种另外的治疗剂(例如一种、两种、三种、四种、五种或六种另外的治疗剂)。
根据任意以上实施方案的“受试者”可以是人。当用于治疗目的时，受试者是已患有、疑似患有目标疾病的个体。当用于预防目的时，受试者是易感于目标疾病的个体。
在又一个的方面，提供包含所述抗原结合分子的药物组合物，例如，其用于以上任何制药用途或治疗方法。在另一个实施方案中，药物组合物还包含至少一种另外的治疗剂。
本披露的抗原结合分子可单独使用或与其他试剂联合用于治疗。例如，本披露的抗体可与至少一种另外的治疗剂联合施用(同时、或先后施用)。
本披露的抗原结合分子(和任何另外的治疗剂)可通过任何合适的手段施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，并且如果需要局部治疗，则病灶内施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可以通过任何适当的途径，例如，通过注射，如静脉内或皮下注射，这部分取决于施用是短期的还是长期的。本文考虑多种给药时间方案，包括但不限于，单次或在多个时间点多次施用，推注施用和脉冲输注。
本披露的抗原结合分子将以符合良好医疗实践(如GOOD MEDICAL PRACTICE Guideline，GMP)的方式配制、给药和施用。在此背景下考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、个体受试者的临床状况、病症的起因、试剂的递送部位、施用方法、施用时间安排以及医学从业者已知的其他因素。抗原结合分子无需但任选地与目前用于预防或治疗所述病症的一种或更多种试剂一起配制。此类其它试剂的有效量取决于药物组合物中存在的抗原结合分子的量、病症或治疗的类型以及上文讨论的其它因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和施用路径使用，或以本文所述剂量的约1至99％使用，或以任何剂量使用，并通过经验/临床确定为合适的任何途径使用。
为了预防或治疗疾病，本披露的抗原结合分子(当单独使用或与一种或更多种其他另外的治疗剂组合使用时)的适当的剂量将取决于待治疗的疾病的类型，治疗分子的类型，疾病的严重性和病程，是为预防还是治疗目的施用，之前的治疗，受试者的临床病史和对治疗分子的响应，和主治医师的判断。治疗分子恰当地以一次或经过一系列治疗施用于受试者。取决于疾病的类型和严重性，示例性的单位日剂量为50μg-5g。
制品
在本披露的另一方面中，提供一种制品，所述制品包含可用于治疗、预防和/或诊断上述病症的材料。该制品包含容器和在容器上或与容器联合的标签或包装插页(package insert)。合适的容器包括，例如，瓶子、管形瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以自各种材料如玻璃或塑料形成。容器装有单独的有效治疗、预防和/或诊断疾患的组合物、或与另一种组合物组合，并且可具有无菌的存取口(例如，容器可以是具有塞子的静脉内溶液袋或管形瓶)。组合物中的至少一种活性试剂是本披露的抗原结合分子。标签或包装插页指示使用该组合物是来治疗选择的病况。
此外，制品可以包含：
(a)装有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本披露的抗原结合分子；和
(b)装有组合物的第二容器，其中所述组合物包含细胞毒性剂或其他方面的治疗剂。
备选地，或另外地，制品可进一步包含第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包含药学上可接受的缓冲液。从商业和用户立场，它可进一步包括所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。在一个具体的实施方案中，所述制品是药盒。
实施例与测试例
以下结合实施例和测试例进一步描述本披露，但这些实施例和测试例并非限 制着本披露的范围。本披露实施例和测试例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例
实施例1.含有Titin链/Obscurin链的抗原结合分子
本披露的Titin链/Obscurin链可以来源于任意适宜的多肽，包括来源于PCT/CN2021/070832及其公开文本WO2021139758A1(通过援引完整收入本文)中以及CN202110527339.7及将其作为优先权文件的专利中的多肽。构建双特异性抗体，其中CL为PCT/CN2021/070832中的kappa轻链恒定区，Titin链和Obscurin链的氨基酸序列见表4-1和表4-2，连接子序列包括GGGGS(SEQ ID NO：106)、ASTKG(SEQ ID NO：109)或RTVAS(SEQ ID NO：110)，本实施例中的Fc1、Fc2、CH1的氨基酸序列如下所示。
表4-1.Titin链的氨基酸序列
表4-2.Obscurin链的氨基酸序列
>Fc1(knob，SEQ ID NO：111)
>Fc2(hole，SEQ ID NO：112)
>CH1(SEQ ID NO：113)
1.1 DI双特异性抗体
参照PCT/CN2021/070832实施例5，构建抗hNGF和hRANKL的双特异性抗体DI：DI-2至DI-20，其包含如下所述的第一重链、第二重链、第一轻链和第二轻链：
第一重链：从N端到C端依次为：[VH1-I]-[连接子1]-[Obscurin链]-[Fc2]，
第一轻链：从N端到C端依次为：[VL1-I]-[连接子2]-[Titin链]，
第二重链：从N端到C端依次为：[VH2-D]-[CH1]-[Fc1]，和
第二轻链：从N端到C端依次为：[VL2-D]-[CL]；
其中，VH1-I和VL1-I分别为PCT/CN2021/070832中I0的重链可变区和轻链可变区，VH2-D和VL2-D分别为PCT/CN2021/070832中D0的重链可变区和轻链可变区。本实施例中DI双特异性抗体中Obscurin链、Titin链、连接子1、连接子2结构见下表。
表5.DI双特异性抗体中Obscurin链/Titin链和连接子对应表
注：表格中Titin链和Obscurin链的编号见表4-1和表4-2。
采用PCT/CN2021/070832的测试例4中的方法检测DI-2至DI-20双特异性抗体与其抗原的结合活性。对抗体进行热稳定性研究。研究方法：用PBS将抗体的浓度稀释至5mg/mL，采用高通量微分扫描荧光仪(UNCHAINED，规格型号：Unit)测定其热稳定性。
实验结果表明，改造后的双特异性抗体对抗原的结合活性没有显著变化；并且，与DI-2相比，DI-4至DI-8、DI-10至DI-16、DI-20的Tm1(℃)、Tonset(℃)有明显的提升，双特异性抗体的热稳定性更优。
表6.DI双特异性抗体的结合活性检测
表7.DI双特异性抗体的热稳定性实验结果
编号 Tm1(℃) Tonset(℃) 编号 Tm1(℃) Tonset(℃)
DI-2 55.6 48.3 DI-11 57.35 -
DI-4 60.1 52.493 DI-12 59.9 51.726
DI-5 61 51.967 DI-13 61 50.988
DI-6 60.8 53.012 DI-14 61.2 52.191
DI-7 60.34 52.003 DI-15 60.41 50.558
DI-8 60.61 50.425 DI-16 61.5 50.691
DI-10 60.2 52.766 DI-20 60.7 51.859
采用10mM乙酸，pH5.5，9％蔗糖的缓冲液配制含DI双特异性抗体的溶液，将溶液置于40℃恒温箱中孵育四周，结束后将抗体浓度浓缩至孵育开始时浓度，观察溶液沉淀情况。实验结果表明，DI-2双特异性抗体组溶液出现沉淀，DI-3至DI-7相比DI-2具有更好的稳定性。
表8.DI双特异性抗体的沉淀
编号 开始浓度 第4周浓缩到浓度 溶液沉淀情况
DI-2 20mg/mL 20mg/mL 出现沉淀
DI-3 20mg/mL 20mg/mL 无沉淀
DI-4 60mg/mL 60mg/mL 无沉淀
DI-5 25mg/mL 25mg/mL 无沉淀
DI-6 60mg/mL 60mg/mL 无沉淀
DI-7 16mg/mL 16mg/mL 无沉淀
1.2 PL双特异性抗体
构建抗hPDL1和hCTLA4的PL双特异性抗体：PL-1至PL-19，其包含如下所述的第一重链、第二重链、第一轻链和第二轻链：
第一重链：从N端到C端依次为：[VH1-P]-[连接子1]-[Obscurin链]-[Fc1]，
第一轻链：从N端到C端依次为：[VL1-P]-[连接子2]-[Titin链]，
第二重链：从N端到C端依次为：[VH2-L]-[CH1]-[Fc2]，和
第二轻链：从N端到C端依次为：[VL2-L]-[CL]；
其中，VH1-P和VL1-P分别为WO2020177733A1中h1831K抗体的重链可变区和轻链可变区，VH1-L和VL1-L的氨基酸序列如下所示。
>VH2-L(SEQ ID NO：114)
>VL2-L(SEQ ID NO：115)
本实施例中PL双特异性抗体中Obscurin链、Titin链、连接子1、连接子2结构见下表。
表9.PL双特异性抗体中Obscurin链/Titin链和连接子对应表
注：表格中Titin链和Obscurin链的编号见表4-1和表4-2。
参照PCT/CN2021/070832中测试例4中的ELISA方法检测PL双特异性抗体的结合活性，其中hPDL1、hCTLA4抗原购自：Sino biology。对抗体进行热稳定性研究。方法：用PBS将抗体的浓度稀释至1.4-3mg/mL，采用高通量微分扫描荧光仪(UNCHAINED，规格型号：Unit)测定其热稳定性。实验结果表明，PL双特异性抗体对抗原仍具有良好的结合活性；并且，与PL-1相比，PL-2至PL-19的Tm1(℃)、Tagg 266(℃)、Tonset(℃)有明显的提升，双特异性抗体的热稳定性更优。
表10.PL双特异性抗体的结合活性检测
表11.PL双特异性抗体的热稳定性实验结果
1.3 HJ双特异性抗体
构建抗hIL5和hTSLP的HJ双特异性抗体：HJ-3至HJ11，其包含如下所述的第一重链、第二重链、第一轻链和第二轻链：
第一重链：从N端到C端依次为：[VH1-H]-[连接子1]-[Titin链]-[Fc1]，
第一轻链：从N端到C端依次为：[VL1-H]-[连接子2]-[Obscurin链]，
第二重链：从N端到C端依次为：[VH2-J]-[CH1]-[Fc2]，和
第二轻链：从N端到C端依次为：[VL2-J]-[CL]；
其中，VH1-H和VL1-H分别为PCT/CN2021/070832中H0的重链可变区和轻链可变区，VH2-J和VL2-J分别为PCT/CN2021/070832中J1的重链可变区和轻链可变区。本实施例中HJ双特异性抗体中Obscurin链、Titin链、连接子1、连接子2结构见下表。
表12.HJ双特异性抗体中Obscurin链/Titin链和连接子对应表
参照PCT/CN2021/070832中测试例4中的方法检测HJ双特异性抗体的抗原结合活性。对抗体的热稳定性进行研究，方法：用10mM乙酸pH5.5、9％蔗糖的缓冲液配制HJ双特异性抗体稀释溶液，然后通过超滤浓缩的方法将双特异性抗体浓缩，获得不同浓度的HJ双特异性抗体溶液(HJ双特异性抗体的浓度见表19)，然后将浓缩溶液置于40℃恒温箱中孵育，第0天(也即40℃孵育开始前，D0)，第7天(40℃孵育第7天，D7)，第14天(40℃孵育第14天，D14)，第21天(40℃孵育第21天，D21)和第28天(40℃孵育第28天，D28)检测样品的SEC纯度，40℃孵育28天后，马上取样检测样品CE-SDS纯度。实验结果表明，本披露构建的HJ双特异性抗体对抗原的结合活性没有显著变化；并且，与HJ-3相比，HJ-5至HJ-11双特异性抗体的热稳定性更优。
表13-1.HJ双特异性抗体的结合活性检测
表13-2.HJ双特异性抗体加速稳定性实验结果
实施例2：抗原蛋白及抗体的制备
1.1抗原蛋白结构
以人EGFR蛋白(UniProt Epidermal growth factor receptor，Uniprot号：P00533)作为EGFR的模板，在EGFR蛋白基础上融合His标签，设计本发明检测用的带His标签的人EGFR蛋白胞外域(简称：EGFR-His)；其氨基酸序列如下：
EGFR-His的氨基酸序列：
注释：划线部分为EGFR蛋白胞外域；斜体部分为His标签。
以人HGFR蛋白(UniProt Hepatocyte growth factor receptor，Uniprot号：P08581)作为HGFR的模板，在HGFR蛋白基础上融合His标签或Fc，设计本发明检测用的带His标签的HGFR蛋白胞外域(简称HGFR-His)、带Fc标签的HGFR蛋白胞外域(简称HGFR-Fc)，其氨基酸序列如下：
HGFR-His的氨基酸序列：
注释：划线部分为HGFR蛋白胞外域；斜体部分为His标签。
以人HGF蛋白(UniProt Hepatocyte growth factor，Uniprot号：P14210)作为HGF的模板，设计本披露检测用带His标签的HGF蛋白(简称HGF-His)，其氨基酸序列如下：
HGF-His的氨基酸序列：
注释：划线部分为HGF蛋白；斜体部分为His标签。
1.2蛋白的纯化
1.2.1重组蛋白的纯化步骤：
将细胞表达上清样品高速离心去除杂质，并将缓冲液置换为PBS，加入咪唑至终浓度为5mM。用含有5mM咪唑的PBS溶液平衡镍柱，冲洗2-5倍柱体积。将置换后的细胞上清样品上Ni Sepharose excel柱(GE，17-3712-02)。用含有5mM咪唑的PBS溶液冲洗柱子，至A280读数降至基线。后用PBS+10mM咪唑冲洗层析柱，除去非特异结合的杂蛋白，并收集流出液。再用含有300mM咪唑的PBS溶液洗脱目的蛋白，并收集洗脱峰。收集的洗脱液浓缩后用凝胶层析Superdex200(GE，28-9893-35)进一步纯化，流动相为PBS。去除聚体峰，收集洗脱峰。所得到的蛋白经电泳，肽图，LC-MS鉴定为正确后分装备用。
1.2.2抗体的纯化步骤：
将细胞表达上清样品高速离心去除杂质，上清进行MabSelect Sure(GE，17-5438-01)亲和层析。MabSelect Sure层析柱先用0.2M NaOH再生，利用纯水冲洗后用PBS平衡柱子，将上清结合后，利用PBS进行洗涤至A280读数降至基线。用0.1M醋酸缓冲液在pH3.5条件下洗脱目的蛋白，用1M Tris-HCl中和。洗脱样品适当浓缩后利用PBS平衡好的凝胶层析Superdex200(GE，28-9893-35)进一步纯化，合并收集目的蛋白所在接收管浓缩至适当浓度。此方法用来纯化本发明中涉及的抗体。
实施例3.特异性结合HGFR和EGFR的双特异性抗体的制备及鉴定
利用特异性结合HGFR的分子与特异性结合EGFR的分子，构建特异性结合HGFR和EGFR的抗体。
1.特异性结合EGFR的分子
特异性结合EGFR的分子可以来源于任意适宜的抗体，例如Zalutumumab(简称Zal)或其变体(例如Zal.1，Zal.1是通过将Zal轻链第一位氨基酸残基由A突变为D获得)，其中：
>Zal重链的氨基酸序列：
>Zal轻链的氨基酸序列：
>Zal的重链可变区的氨基酸序列：
>Zal的轻链可变区的氨基酸序列：
>Zal.1的轻链可变区的氨基酸序列：
>Zal.1的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：3。
Zal和Zal.1的CDR序列见表14：
表14.特异性结合EGFR分子的CDR
备注：上述CDR根据Kabat编号系统确认。
2.特异性结合HGFR的分子
特异性结合HGFR的分子可以来源于任意适宜的抗体，包括描述于国际公开号WO2013003680A1(通过援引完整收入本文)中的Onartuzumab(简称Omab)等抗体；描述于国际公开号WO2016165580A1(通过援引完整收入本文)中的Ab10等抗体；以及上述抗体的突变抗体。其中，Omab、Ab10的可变区的氨基酸序列如下：
>Omab的重链可变区的氨基酸序列：
>Omab的轻链可变区的氨基酸序列：
>Ab10的重链可变区的氨基酸序列：
>Ab10的轻链可变区的氨基酸序列：
通过对Ab10的CDR进行突变，获得Ab10突变抗体：Ab10.1；Ab10.1的恒定区与Ab10相同，Ab10.1可变区氨基酸序列如下：
>Ab10.1的重链可变区的氨基酸序列：
>Ab10.1的轻链可变区的氨基酸序列：
备注：上述特异性结合HGFR分子的序列中，其中下划线部分为根据Kabat编号系统确认的CDR区部分，斜体加粗部分为突变氨基酸残基。
特异性结合HGFR分子的CDR见表15：
表15.特异性结合HGFR分子的CDR
备注：上述CDR根据Kabat编号系统确认。
3.特异性结合HGFR和EGFR的双特异性抗体
利用特异性结合HGFR的分子与特异性结合EGFR的分子，构建特异性结合HGFR和EGFR的具有Format1或Format2结构的双特异性抗原结合分子，Format1的结构示意图见图1，Format2的结构示意图见图2；其中，
Format1包含如下结构的4条链，其中：
链1为：
VH(抗EGFR抗体)-连接子1-VH(抗HGFR抗体1)-IgG 1(CH1)-IgG 1Fc(knob)，
链2为：VL(抗EGFR抗体)-连接子1-VL(抗HGFR抗体1)-CL，
链3为：VH(抗HGFR抗体2)-连接子2-Titin链-IgG 1Fc(hole)，
链4为：VL(抗HGFR抗体2)-连接子2-Obscurin链。
Format2包含如下结构的4条链，其中：
链1为：VH(抗HGFR抗体)-IgG 1(CH1)-IgG 1Fc(knob)，
链2为：VL(抗HGFR抗体)-CL，
链3为：VH(抗EGFR抗体)-连接子2-Titin链-IgG 1Fc(hole)，
链4为：VL(抗EGFR抗体)-连接子2-Obscurin链；
示例性地，利用Ab10.1(抗HGFR抗体1)、Omab(抗HGFR抗体2)、Zal.1(抗EGFR抗体)、人IgG 1重链恒定区/kappa轻链恒定区以及T.16(Titin链)/O.28(Obscurin链)，构建具有Format1结构的EM1和具有Format2结构的EM2。EM1的4条链的氨基酸序列如下：
EM1的链1的氨基酸序列：
EM1的链2的氨基酸序列：
EM1的链3的氨基酸序列：
EM1的链4的氨基酸序列：
EM2的4条链的氨基酸序列如下所示：
EM2的链1的氨基酸序列：
EM2的链2的氨基酸序列：
EM2的链3的氨基酸序列：
EM2的链4的氨基酸序列：
备注：上述序列中，单下划线部分为可变区，虚下划线部分为CL，点下划线部分为Fc区，斜体部分为CH1，双下划线部分为连接子，波浪线部分为Obscurin链/Titin-T链。
连接子1的氨基酸序列：GGGGSGGGG(SEQ ID NO：105)
连接子2的氨基酸序列：GGGGS(SEQ ID NO：106)
IgG1Fc(knob)的氨基酸序列：
IgG 1Fc(hole)的氨基酸序列：
CL：
测试例
测试例1：Biacore检测体外结合亲和力和动力学实验
通过Biacore T200(GE)测定待测分子与人EGFR(SEQ ID NO：42)或人HGFR蛋白(SEQ ID NO：43)的亲和力，方法如下：
用Protein A生物传感芯片亲和捕获抗体分子，然后于芯片表面流经抗原180秒，之后解离600秒，用Biacore T200仪器实时检测反应信号获得结合和解离曲线。在每个实验循环解离完成后，用10mM Gly-HCl(pH 1.5)将生物传感芯片洗净再生。数据拟合模型采用1:1Model，获得待测分子亲和力数值。本实施例中，阳性对照MCLA为一种特异性结合HGFR和EGFR的双特异性抗体(具体序列参见WO2019031965中的PB8532)。
实验结果见表16，实验结果表明，本披露构建的突变抗体和双特异性抗原结合分子均具有很强的亲和力，Ab10.1的亲和力至少是母抗体Ab10亲和力的4倍。
表16：本发明抗体与人EGFR或人HGFR的体外亲和力
测试例2：抗体的体外细胞结合实验
特异性结合HGFR和EGFR的抗原结合分子的细胞结合活性通过流式细胞仪来检测。将1×10 6细胞/mL EGFR CHO-S稳转细胞株、HGFR CHO-S稳转细胞株、H1975-HGF或MKN-45肿瘤细胞株用1％BSA PBS缓冲液封闭后，加入不同浓度稀释的抗体样品(C25为阴性对照，其为无关靶点的IgG1抗体蛋白，以下同)孵育1小时。洗两次后，再加入R-PE-羊抗人(H+L)抗体(Invitrogen，CAT#H10104)孵育0.5小时。洗两次后，使用流式细胞仪读取荧光信号值。
实验结果见图3至图6，实验结果显示，本披露的特异性结合HGFR和EGFR的抗原结合分子对肿瘤细胞的结合能力比阳性抗体MCLA更强。
测试例3：抗体拮抗EGFR结合EGF的阻断实验
抗体对EGF/EGFR的阻断能力通过ELISA来检测。包被1μg/mL兔抗His抗体(金斯瑞，A01857)，4度过夜后封闭。洗板后加入2μg/mL EGFR-His(SEQ ID NO：42)，孵育1h。洗板后加入2μg/mL EGF-mFc(Acro，EGF-H525b)和不同浓度稀释的抗体，孵育1小时。洗板后加入辣根过氧化物酶-羊抗鼠IgG抗体(Jackson，115-035-062)，孵育1小时。洗板后加入四甲基联苯胺溶液显色，最后加入终止液，在酶标仪上测量OD450值。实施例中，阳性对照JNJ为一种特异性结合HGFR和EGFR的双特异性抗体(JNJ也称Amivantamab，具体序列结构参见WHO Drug Information,33(2):237-239)。
实验结果见表17，实验结果表明，本披露的特异性结合HGFR和EGFR的抗原结合分子能有效阻断EGF与EGFR的结合。
表17.双特异性抗原结合分子阻断EGF与EGFR的结合实验结果
抗体 IC 50(μg/mL) Max(％)
EM1 2.37 93.5
EM2 2.60 94.5
JNJ 3.66 90.5
测试例4：抗体拮抗HGFR结合HGF的阻断实验
抗体对HGF/HGFR的阻断能力通过ELISA来检测。包被5μg/mL HGFR-His(序列参见SEQ ID NO：43)，4℃过夜后封闭。洗板后加入2μg/mL bio-HGF-His(序列参见SEQ ID NO：44)和不同浓度稀释的抗体，孵育1小时。洗板后加入辣根过氧化物酶-链霉亲和素(Jackson，016-030-084)，孵育1小时。洗板后加入四甲基联苯胺溶液显色，最后加入终止液，在酶标仪上测量OD450值。
实验结果见表18，实验结果显示，本披露的特异性结合HGFR和EGFR的抗原结合分子阻断HGFR结合HGF的最大阻断力比阳性抗体JNJ更强。
表18.双特异性抗原结合分子阻断HGF与HGFR的结合实验结果
抗体 IC50(μg/mL) Max(％)
EM1 0.25 95.5
JNJ 0.27 82.3
MCLA 1.36 94.1
测试例5：抗体对细胞EGFR磷酸化的抑制实验
取H292细胞(也称NCI-H292，人肺癌细胞(淋巴结转移)，中国科学院细胞库，下同)以12000个/孔铺于96孔板(Corning，3599)，培养基为RPMI1640+10％FBS，其后将96孔板在37℃、5％CO 2培养箱培养24小时。第二天，弃去培养基，更换成无血清的培养基(RPMI640+25mM HEPES+0.1mM NEAA+1mM丙酮酸钠)饥饿16-20小时。第三天，配制抗体，首浓度为6μM，5倍梯度稀释，更换饥饿培养基，37℃、5％CO 2培养箱培养1小时，期间加入50μL 100ng/mL rEGF(R&D，236-EG-200)，37℃、5％CO 2培养箱继续培养15分钟，最后根据PHOSPHO-EGFR(TYR1068)KITS(Cisbio，64EG1PEG)说明书，检测磷酸化EGFR。
实验结果见图7，实验结果显示，本披露的特异性结合HGFR和EGFR的抗原结合分子能有效抑制细胞EGFR磷酸化。
测试例6：抗体对细胞HGFR磷酸化的抑制实验
取H292细胞以12000个/孔铺于96孔板(Corning，3599)，培养基为RPMI1640+10％FBS，其后将96孔板在37℃、5％CO 2培养箱培养24小时。第二天，弃去培养基，更换成无血清的培养基(RPMI640+25mM HEPES+0.1mM NEAA+1mM丙酮酸钠)饥饿16-20小时。第三天，配制抗体，首浓度为1μM，10倍梯度稀释，更换饥饿培养基，37℃、5％CO 2培养箱培养1小时，期间加入50μL 200ng/mL rHGF(R&D,294-HG-005)37℃、5％CO 2培养箱继续培养30分钟，最后根据p-c-Met(Tyr1234/1235)Assay Kit(PerkinElmer，ALSU-PCMET-A50)说明书，检测磷酸化HGFR。
实验结果见图8，实验结果显示，本披露的特异性结合HGFR和EGFR的抗原结合分子能有效抑制细胞HGFR磷酸化，抑制能力比Ab10.1强。
测试例7：抗体对细胞AKT磷酸化的抑制实验
取H292细胞以12000个/孔铺于96孔板(Corning，3599)，培养基为RPMI1640+10％FBS，其后将96孔板在37℃、5％CO 2培养箱培养24小时。第二天，弃去培养基，更换成无血清的培养基(RPMI640+25mM HEPES+0.1mM NEAA+1mM丙酮酸钠)饥饿16-20小时。第三天，配制抗体，首浓度为4μM，5倍梯度稀释，更换饥饿培养基，37℃、5％CO 2培养箱培养1小时，期间加入50μL 200ng/mL rHGF(R&D,294-HG-005)和50ng/mL rEGF(R&D，236-EG-200)，混合均匀，37℃、5％CO 2培养箱继续培养1小时，最后根据PHOSPHO-AKT(SER473)KITS(Cisbio，64AKSPEG)说明书，检测磷酸化AKT。细胞内AKT磷酸化水平通过665nm的荧光信号值与620nm的荧光信号值比值(ratio)来反应，比值＝665nm处荧光信号值/620nm处荧光信号值*10 4，比值越高,细胞内AKT磷酸化水平越高。
实验结果见图9，实验结果显示，本披露的特异性结合HGFR和EGFR的抗原结合分子能有效抑制细胞AKT磷酸化，且抑制能力比阳性对照抗体强。
测试例8：抗体降低细胞表面的HGFR表达
取HCC827细胞(人非小细胞肺癌细胞，源自ATCC)以3×10 5个/孔铺于6孔板，培养基RPMI1640+10％FBS，其后将6孔板在37℃，5％CO 2培养箱培养24小时。配制抗体至浓度200nM，处理且反应18小时。处理过后，PBS洗细胞一次，加入500μl无酶细胞解离缓冲液(Gibco,#13151)收集细胞，通过离心分离细胞与无酶细胞解离缓冲液。使用羊抗人HGFR抗体(R&D systems,AF276)进行免疫荧光染色，4℃反应1小时。随后，用含2％FBS的PBS洗两次。其后加入ALEXA488-驴抗羊二抗(Thermo Fisher,A-11055)4℃反应1小时，洗两次后用BD Cytofix(BD,#554655)固定细胞。再用PBS洗一次后，使用流式细胞仪读取荧光信号值。
实验结果见图10，实验结果显示，相较阳性对照抗体，本披露的特异性结合HGFR和EGFR的抗原结合分子能更有效地减少细胞表面的HGFR，抑制受体信号通路。
测试例9：抗体对SNU-5细胞的增殖抑制实验
取SNU-5细胞(人胃癌细胞，源自ATCC)以4000个/孔铺于96孔板(Corning，3903)，培养基为IMDM+5％FBS，其后将96孔板在37℃、5％CO 2培养箱培养24小时。配制抗体至浓度5μM，5倍梯度稀释，加入上述96孔板，其后在37℃、5％CO 2培养箱培养5天，最后，根据说明书配制 Luminescent Cell Viability Assay(Promega，G7573)，每孔加入50μL CTG，室温下孵育10min，用封底膜封好后，用多标记微孔板检测系统(PerkinElmer,victor3)检测荧光强度(Luminescence，简称Lum)。
计算公式：Lum＝测定值-培养基读数；
％抑制＝(Lum0-Lum)/Lum0*100％；
其中Lum0为抗体浓度为0的孔的荧光强度，Lum为各稀释浓度抗体孔的荧光强度。
实验结果见图11，实验结果显示，本披露的特异性结合HGFR和EGFR的抗原结合分子对SNU-5细胞的增殖抑制能力比阳性抗体更强。
测试例10：抗体对肿瘤细胞的ADCC杀伤实验
配制抗体至200nM浓度，5倍梯度稀释。分别收集肿瘤细胞：Hs746T细胞(人胃癌细胞，南京科佰生物科技有限公司)和H292细胞，PBS洗一次后，用缓冲液(PBS+10％FBS+20mMHEPES)调整细胞密度为1×10 6个/mL，然后在2mL细胞中加入3μL BATDA试剂(PerkinElmer，AD0116)，在37℃，5％CO 2培养箱孵育15min。离心后，用冲洗缓冲液(PBS+20mMHEPES)洗三次，计数调 整细胞密度为1×10 5个/mL。收集NK92--FCGR3A(176V)细胞(稳定转化有FCGR3A(176V)的NK92细胞(购自南京科佰生物科技有限公司))，PBS洗一次后，用培养基重悬细胞计数，调整细胞密度为5×10 5个/mL。最后在96孔板(corning，3788)中加入100μL NK92--FCGR3A(176V)细胞，50μL稀释抗体，50μL标记后的肿瘤细胞。同时，设置自发对照释放孔，其不含NK92--FCGR3A(176V)细胞，而含有100μL培养基；设置阳性对照孔，其含有10μL裂解缓冲液+50μL标记后的肿瘤细胞+140μL培养基；设置背景对照孔，其含标记后的细胞上清50μL+150μL培养基。然后将96孔板300rpm离心2分钟后，在37℃，5％CO 2培养箱孵育2小时。取上清100μL到新96孔板(corning，3788)，300g离心5min后，取20μL到检测板(PerkinElmer，AD0116)，然后加入200μL铕溶液(PerkinElmer，AD0116)，室温下震荡孵育15分钟，最后检测TRF。其中，EM1(afuc)为去岩藻糖基化的EM1；EM2(afuc)为去岩藻糖基化的EM2。
计算公式：特异释放％＝(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)*100。
实验结果见图12和图13，实验结果显示，本披露的特异性结合HGFR和EGFR的抗原结合分子去岩藻糖基化后，可显著提高其对细胞的ADCC杀伤能力。
测试例11：抗体在小鼠H1975-HGF模型的体内药效实验
将H1975-HGF细胞(稳转人HGF的H1975细胞(人肺腺癌细胞，ATCC))(5×10 6个)接种于CD1裸雌性小鼠(维通利华)右肋部皮下。
当瘤体积大小为189mm 3时，根据瘤体积大小将动物随机分组，每组10只，包括C25-3mpk组(阴性对照，其为无关靶点的IgG1抗体蛋白，给药剂量为3mg/kg)、JNJ-3mpk组(阳性对照，给药剂量为3mg/kg)和EM1-3.5mpk组(EM1试验组，给药剂量为3.5mg/kg)。以动物分组(0天)起，每周给药两次，腹腔注射给药，连续2到3周。每周测量肿瘤体积2次，称小鼠体重，记录数据。通过T-检验对数据进行统计学分析。其中，其中，C25-3mpk、JNJ-3mpk、EM1-3.5mpk为等摩尔量。
肿瘤体积(T)计算公式：T＝1/2长×(短) 2；
相对肿瘤增殖率T/C％＝(T-T0)/(C-C0)×100％；
抑瘤率TGI％＝1-T/C％；
其中，T和T0为给药组肿瘤体积，其中T0为实验开始时的肿瘤体积；C和C0是阴性对照组肿瘤体积，其中C0是阴性对照组实验开始时的肿瘤体积。
实验结果见表19，实验结果显示，本披露的特异性结合HGFR和EGFR的抗原结合分子能显著抑制肿瘤细胞的生长，第21天时，等摩尔的本披露的特异性结合HGFR和EGFR的抗原结合分子组的平均肿瘤体积小于阳性对照的一半，抑瘤药效强于阳性对照抗体JNJ。
表19.抗体在小鼠H1975-HGF模型的体内药效实验
测试例12：抗体在小鼠HCC827模型的体内药效实验
将HCC827细胞(人非小细胞肺癌细胞，源自ATCC)(8.555×10 6个)接种于NUNU雌性小鼠(维通利华)右肋部皮下。
当瘤体积大小为200mm 3时，根据瘤体积大小将动物随机分组，每组10只，包括C25-3mpk组(阴性对照，其中C25为无关靶点的IgG1抗体蛋白，给药剂量为3mg/kg)、MCLA-3mpk组(阳性对照，给药剂量为3mg/kg)、EM1-3.5mpk组(EM1高剂量试验组，给药剂量为3.5mg/kg)、EM1-1.17mpk组(EM1低剂量试验组，给药剂量为1.17mg/kg)和EM2-3mpk组(EM2试验组，给药剂量为3mg/kg)。以动物分组(0天)起，每周给药两次，腹腔注射给药，连续2到3周。每周测量肿瘤体积2次，称小鼠体重，记录数据。其中，C25-3mpk、MCLA-3mpk、EM1-3.5mpk和EM2-3mpk为等摩尔量。
实验结果见图14，实验结果显示，本披露的特异性结合HGFR和EGFR的抗原结合分子能显著抑制肿瘤细胞的生长，抑瘤效果强于阳性对照抗体。

Claims (19)

  1. 一种抗原结合分子，其包含：
    至少一个特异性结合HGFR的抗原结合模块1、和
    至少一个特异性结合EGFR的抗原结合模块2；
    其中，
    所述抗原结合模块1包含重链可变区M-VH和轻链可变区M-VL，所述M-VH包含M-HCDR1、M-HCDR2和M-HCDR3，所述M-VL包含M-LCDR1、M-LCDR2和M-LCDR3，其中：
    (i)所述M-HCDR1、M-HCDR2和M-HCDR3分别包含SEQ ID NO：16中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列，和
    所述M-LCDR1、M-LCDR2和M-LCDR3分别包含SEQ ID NO：17中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列，或
    (ii)所述M-HCDR1、M-HCDR2和M-HCDR3分别包含SEQ ID NO：12中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列，和
    所述M-LCDR1、M-LCDR2和M-LCDR3分别包含SEQ ID NO：13中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列，或
    (iii)所述M-HCDR1、M-HCDR2和M-HCDR3分别包含SEQ ID NO：14中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列，和
    所述M-LCDR1、M-LCDR2和M-LCDR3分别包含SEQ ID NO：15中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列；
    所述抗原结合模块2包含重链可变区E-VH和轻链可变区E-VL，所述E-VH包含E-HCDR1、E-HCDR2和E-HCDR3，所述E-VL包含E-LCDR1、E-LCDR2和E-LCDR3，
    其中，所述E-HCDR1、E-HCDR2和E-HCDR3分别包含SEQ ID NO：3中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列，和
    所述E-LCDR1、E-LCDR2和E-LCDR3分别包含SEQ ID NO：5中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列；
    优选地，
    所述E-HCDR1、E-HCDR2、E-HCDR3、E-LCDR1、E-LCDR2和E-LCDR3是根据Kabat编号规则定义的，所述E-HCDR1包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列，所述E-HCDR2包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列，所述E-HCDR3包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，所述E-LCDR1包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列，所述E-LCDR2包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列，和所述E-LCDR3包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列；和
    所述M-HCDR1、M-HCDR2、M-HCDR3、M-LCDR1、M-LCDR2和M-LCDR3 是根据Kabat编号规则定义的，其中，
    (i)所述M-HCDR1包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列，所述M-HCDR2包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列，所述M-HCDR3包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列，所述M-LCDR1包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列，所述M-LCDR2包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列，和所述M-LCDR3包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列，或
    (ii)所述M-HCDR1包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列，所述M-HCDR2包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列，所述M-HCDR3包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，所述M-LCDR1包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列，所述M-LCDR2包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列，和所述M-LCDR3包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列，或
    (iii)所述M-HCDR1包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列，所述M-HCDR2包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列，所述M-HCDR3包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列，所述M-LCDR1包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列，所述M-LCDR2包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列，和所述M-LCDR3包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列。
  2. 根据权利要求1所述的抗原结合分子，其中：
    (i)所述抗原结合分子包含两个特异性结合HGFR的抗原结合模块1，
    其中一个抗原结合模块1，其M-VH具有：包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的M-HCDR1、包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的M-HCDR2和包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的M-HCDR3，并且其M-VL具有：包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的M-LCDR1、包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的M-LCDR2和包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的M-LCDR3；
    另一个抗原结合模块1，其M-VH具有：包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的M-HCDR1、包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的M-HCDR2和包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的M-HCDR3，并且其M-VL具有：包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的M-LCDR1、包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的M-LCDR2和包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的M-LCDR3；和
    所述抗原结合模块2，其E-VH具有：包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的E-HCDR1、包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的E-HCDR2和包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的E-HCDR3，并且其E-VL具有：包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的E-LCDR1、包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的E-LCDR2和包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的E-LCDR3；或
    (ii)所述抗原结合模块1，其M-VH具有：包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的M-HCDR1、包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的M-HCDR2和包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的M-HCDR3，并且其M-VL具有：包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的M-LCDR1、包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的M-LCDR2和包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的M-LCDR3；和
    所述抗原结合模块2，其E-VH具有：包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的E-HCDR1、包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的E-HCDR2和包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的E-HCDR3，并且其E-VL具有：包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的E-LCDR1、包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的E-LCDR2和包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的E-LCDR3。
  3. 根据权利要求1或2所述的抗原结合分子，其中：
    (i)所述M-VH包含与SEQ ID NO：16具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，并且所述M-VL包含与SEQ ID NO：17具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列；或
    所述M-VH包含与SEQ ID NO：12具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，并且所述M-VL包含与SEQ ID NO：13具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列；或
    所述M-VH包含与SEQ ID NO：14具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，并且所述M-VL包含与SEQ ID NO：15具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列；和/或
    (ii)所述E-VH包含与SEQ ID NO：3具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，并且所述E-VL包含与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：4具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列；
    优选地，
    (i)所述抗原结合分子包含两个特异性结合HGFR的抗原结合模块1，
    其中一个抗原结合模块1的M-VH包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列，并且M-VL包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列；
    另一个抗原结合模块1的M-VH包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列，并且M-VL包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列；和
    所述E-VH包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，并且所述E-VL包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；或
    (ii)所述E-VH包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，和所述E-VL包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列，并且
    所述M-VH包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列，和所述M-VL包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列。
  4. 根据权利要求1至3中任一项所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合 分子包含：
    两个特异性结合HGFR的抗原结合模块1、
    一个特异性结合EGFR的抗原结合模块2、和
    Fc区，所述Fc区包含能够相互缔合的第一亚基Fc1和第二亚基Fc2；
    优选地，所述抗原结合模块2为特异性结合EGFR的Fv；
    所述两个抗原结合模块1，其中一个为特异性结合HGFR的第一Fab，另一个为特异性结合HGFR的经替换的Fab；
    所述经替换的Fab包含M-VH、M-VL、Titin链和Obscurin链，所述Titin链和Obscurin链能够形成二聚体，其中，所述经替换的Fab的M-VH的C端直接或通过连接子融合至Titin链的N端，并且所述经替换的Fab的M-VL的C端直接或通过连接子融合至Obscurin链的N端，或所述经替换的Fab的M-VH的C端直接或通过连接子融合至Obscurin链的N端，并且所述经替换的Fab的M-VL的C端直接或通过连接子融合至Titin链的N端；
    更优选地，所述特异性结合EGFR的Fv的E-VH的C端直接或通过连接子融合至所述第一Fab的重链的N端，所述特异性结合EGFR的Fv的E-VL的C端直接或通过连接子融合至所述第一Fab的轻链的N端，
    所述第一Fab的重链的C端直接或通过连接子融合至Fc1的N端，所述Titin链的C端或Obscurin链的C端直接或通过连接子融合至Fc2的N端。
  5. 根据权利要求1至3中任一项所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包含：
    一个特异性结合HGFR的抗原结合模块1、
    一个特异性结合EGFR的抗原结合模块2、和
    Fc区，所述Fc区包含能够相互缔合的第一亚基Fc1和第二亚基Fc2；
    优选地，
    所述抗原结合模块1是Fab；所述抗原结合模块2是经替换的Fab，其包含E-VH、E-VL、Titin链和Obscurin链，所述Titin链和Obscurin链能够形成二聚体；所述E-VH的C端直接或通过连接子融合至Titin链的N端和所述E-VL的C端直接或通过连接子融合至Obscurin链的N端，或所述E-VH的C端直接或通过连接子融合至Obscurin链的N端和所述E-VL的C端直接或通过连接子融合至Titin链的N端；
    更优选地，
    所述特异性结合HGFR的Fab的重链的C端直接或通过连接子融合至Fc1的N端；所述Titin链的C端或Obscurin链的C端直接或通过连接子融合至Fc2的N端。
  6. 根据权利要求4或5所述的抗原结合分子，其中，
    所述Titin链包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列或其变体，其中所述SEQ ID NO：45的变体相比SEQ ID NO：45，具有选自由3W、8C、11I、13L、20C、22M/22C、25S、26C、39T、40S、42K、45S、47E、49G、56S、58E、60S、64T、66S/66K、70R、75V、77S、79T、81R、82M、83D和84L组成的组中的一个或更多个氨基酸残基取代；和
    所述Obscurin链包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列或其变体，或包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列或其变体；
    其中所述SEQ ID NO：64的变体相比SEQ ID NO：64，具有选自由2E、3C、7K/7R、9C、11L、12S、13Y/13S、14T、17E、20L、22M/22S、25S、30D、32P/32F、34E、36T、41K、42L、44I、45T、48V、53L、58V、62E/62K/62H、66C、67Q/67T、69S、76S、82H、88C、89L、92E、93C、94G和97G组成的组中的一个或更多个氨基酸残基取代；
    所述SEQ ID NO：65的变体相比SEQ ID NO：65，具有选自由6E、26S、74C、77S、84C和86C组成的组中的一个或更多个氨基酸残基取代；
    优选地，
    所述Titin链包含选自SEQ ID NO：45至SEQ ID NO：63中的任一条氨基酸序列，
    所述Obscurin链包含选自SEQ ID NO：64至SEQ ID NO：104中的任一条氨基酸序列；
    更优选地，
    所述Titin链包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列，所述Obscurin链包含SEQ ID NO：99的氨基酸序列。
  7. 根据权利要求1至6中任一项所述的抗原结合分子，所述抗原结合分子包含Fc区，所述Fc区包含能够相互缔合的第一亚基Fc1和第二亚基Fc2，所述Fc1和Fc2各自独立地具有一个或更多个减少Fc区同源二聚化的氨基酸取代；
    优选地，
    (i)所述Fc1具有根据杵臼技术的凸起结构，和所述Fc2具有根据杵臼技术的孔结构，或者所述Fc2具有根据杵臼技术的凸起结构，和所述Fc1具有根据杵臼技术的孔结构；优选地，所述Fc1在366位置的氨基酸残基为W；和所述Fc2在366位置的氨基酸残基为S、在368位置的氨基酸残基为A、和在407位置的氨基酸残基为V，所述氨基酸残基位置依据EU索引编号；和/或
    (ii)所述第一亚基Fc1和第二亚基Fc2之间具有工程化二硫键，优选地，所述Fc1在354位置的氨基酸残基为C；和所述Fc2在349位置的氨基酸残基为C，所述氨基酸残基位置依据EU索引编号；
    更优选地，
    所述Fc1在354位置的氨基酸残基为C、在356位置的氨基酸残基为E、在358位置的氨基酸残基为M和在366位置的氨基酸残基为W；并且所述Fc2在349位置的氨基酸残基为C、在356位置的氨基酸残基为E、在358位置的氨基酸残基为M、在366位置的氨基酸残基为S、在368位置的氨基酸残基为A和在407位置的氨基酸残基为V，所述氨基酸残基位置依据EU索引编号。
  8. 根据权利要求7所述的抗原结合分子，其包含：
    具有式(a)所示结构的第一链、
    具有式(b)所示结构的第二链、
    具有式(c)所示结构的第三链、和
    具有式(d)所示结构的第四链，
    其中：
    式(a)[E-VH]-[连接子1]-[M-VH]-[CH1]-[Fc1]，
    式(b)[E-VL]-[连接子2]-[M-VL]-[CL]，
    式(c)[M-VH]-[连接子3]-[Titin链]-[Fc2]，
    式(d)[M-VL]-[连接子4]-[Obscurin链]；
    优选地，所述式(a)、式(b)、式(c)和式(d)的连接子是相同或不同的肽连接子；
    更优选地，所述式(a)、式(b)、式(c)和式(d)中的连接子的氨基酸序列如SEQ ID NO：105或SEQ ID NO：106所示；
    特别地，所述抗原结合分子具有：一条包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的第一链、一条包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的第二链、一条包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的第三链和一条包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的第四链。
  9. 根据权利要求1至3、5至7中的任一项所述的抗原结合分子，其包含：
    具有式(e)所示结构的第一链、
    具有式(f)所示结构的第二链、
    具有式(g)所示结构的第三链、和
    具有式(h)所示结构的第四链，
    其中：
    式(e)[M-VH]-[CH1]-[Fc1]，
    式(f)[M-VL]-[CL]，
    式(g)[E-VH]-[连接子1]-[Titin链]-[Fc2]，
    式(h)[E-VL]-[连接子2]-[Obscurin链]；
    优选地，式(g)和式(h)中的连接子是相同或不同的肽连接子；
    更优选地，式(h)和式(g)中的连接子的氨基酸序列如SEQ ID NO：106所示；
    特别地，
    所述抗原结合分子具有：一条包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的第一链、一条包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的第二链、一条包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的第三链和一条包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的第四链。
  10. 一种抗原结合分子，其包含：
    Fv、
    第一Fab、
    经替换的Fab、和
    Fc区，
    其中，
    所述Fc区包含能够相互缔合的第一亚基Fc1和第二亚基Fc2，
    所述Fv包含重链可变区Fv-VH和轻链可变区Fv-VL，
    所述第一Fab包含重链可变区Fab1-VH和轻链可变区Fab1-VL，
    所述经替换的Fab包含重链可变区Fab-S-VH、轻链可变区Fab-S-VL、Titin链和Obscurin链，所述Titin链和Obscurin链能够形成二聚体；其中：
    所述Fab-S-VH的C端直接或通过连接子融合至Titin链的N端和所述Fab-S-VL的C端直接或通过连接子融合至Obscurin链的N端，或所述Fab-S-VH的C端直接或通过连接子融合至Obscurin链的N端和所述Fab-S-VL的C端直接或通过连接子融合至Titin链的N端；并且
    所述第一Fab的重链的C端直接或通过连接子融合至Fc1的N端；所述Fv的Fv-VH的C端直接或通过连接子融合至所述第一Fab的重链的N端，所述Titin链的C端或Obscurin链的C端直接或通过连接子融合至Fc2的N端，并且所述Fab-S-VH与所述Fc2处于同一条链上；
    优选地，所述第一Fab和经替换的Fab各自独立地结合第一抗原，所述Fv结合第二抗原；更优选地，所述第一抗原为HGFR，所述第二抗原为EGFR。
  11. 根据权利要求10所述的抗原结合分子，其中：
    所述Titin链包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列或其变体，其中所述SEQ ID NO：45的变体相比SEQ ID NO：45，具有选自由3W、8C、11I、13L、20C、22M/22C、25S、26C、39T、40S、42K、45S、47E、49G、56S、58E、60S、64T、66S/66K、70R、75V、77S、79T、81R、82M、83D和84L组成的组中的一个或更多个氨基酸残基取代；和
    所述Obscurin链包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列或其变体，或SEQ ID NO：65的氨基酸序列或其变体；其中所述SEQ ID NO：64的变体相比SEQ ID NO：64，具有选自由2E、3C、7K/7R、9C、11L、12S、13Y/13S、14T、17E、20L、22M/22S、25S、30D、32P/32F、34E、36T、41K、42L、44I、45T、48V、53L、58V、62E/62K/62H、66C、67Q/67T、69S、76S、82H、88C、89L、92E、93C、94G和97G组成的组中的一个或更多个氨基酸残基取代；所述SEQ ID NO：65的变体相比SEQ ID NO：65，具有选自由6E、26S、74C、77S、84C和86C组成的组中的一个或更多个氨基酸残基取代；
    优选地，
    所述Titin链包含选自由SEQ ID NO：45至SEQ ID NO：63组成的组中的任一条氨基酸序列，所述Obscurin链包含选自由SEQ ID NO：64至SEQ ID NO：104组成的组中的任一条氨基酸序列；
    更优选地，
    所述Titin链包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列，所述Obscurin链包含SEQ ID NO：99的氨基酸序列。
  12. 根据权利要求10或11所述的抗原结合分子，所述Fc1和Fc2各自独立地具有一个或更多个减少Fc区同源二聚化的氨基酸取代；
    优选地，
    (i)所述Fc1具有根据杵臼技术的凸起结构，和所述Fc2具有根据杵臼技术的孔结构，或者所述Fc2具有根据杵臼技术的凸起结构，和所述Fc1具有根据杵臼技术的孔结构；优选地，所述Fc1在366位置的氨基酸残基为W；和所述Fc2在366位置的氨基酸残基为S、在368位置的氨基酸残基为A、和在407位置的氨基酸残基为V，所述氨基酸残基位置依据EU索引编号；和/或
    (ii)所述第一亚基Fc1和第二亚基Fc2之间具有工程化二硫键，优选地，所述Fc1在354位置的氨基酸残基为C；和所述Fc2在349位置的氨基酸残基为C，所述氨基酸残基位置依据EU索引编号；
    更优选地，
    所述Fc1在354位置的氨基酸残基为C、在356位置的氨基酸残基为E、在358位置的氨基酸残基为M和在366位置的氨基酸残基为W；并且所述Fc2在349位置的氨基酸残基为C、在356位置的氨基酸残基为E、在358位置的氨基酸残基为M、在366位置的氨基酸残基为S、在368位置的氨基酸残基为A和在407位置的氨基酸残基为V，所述氨基酸残基位置依据EU索引编号。
  13. 根据权利要求10至12中任一项所述的抗原结合分子，其包含：
    具有式(k)所示结构的第一链、
    具有式(l)所示结构的第二链、
    具有式(m)所示结构的第三链、和
    具有式(n)所示结构的第四链，
    其中：
    式(k)[Fv-VH]-[连接子1]-[Fab1-VH]-[CH1]-[Fc1]，
    式(l)[Fv-VL]-[连接子2]-[Fab1-VL]-[CL]，
    式(m)[Fab-S-VH]-[连接子3]-[Titin链]-[Fc2]，
    式(n)[Fab-S-VL]-[连接子4]-[Obscurin链]；
    优选地，所述式(k)、式(l)、式(m)和式(n)的连接子是相同或不同的肽连接子；
    更优选地，所述式(k)、式(l)、式(m)和式(n)中的连接子的氨基酸序列如SEQ ID NO：105或SEQ ID NO：106所示。
  14. 一种抗原结合分子，其包含：
    一个特异性结合EGFR的抗原结合模块2、和
    两个特异性结合HGFR的抗原结合模块1，所述抗原结合模块1结合HGFR的不同表位；
    优选地，其中一个抗原结合模块1与包含SEQ ID NO：16的重链可变区和SEQ ID NO：17的轻链可变区的抗HGFR抗体竞争性结合人HGFR；另一个抗原结合模块1与包含SEQ ID NO：12的重链可变区和SEQ ID NO：13的轻链可变区的抗HGFR抗体竞争性结合人HGFR。
  15. 根据权利要求1至14中任一项所述的抗原结合分子，其中所述的抗原结合分子为低岩藻糖基化的抗原结合分子；
    优选地，至少80％的抗原结合分子未被岩藻糖糖基化修饰；
    更优选地，所述抗原结合分子检测不到岩藻糖糖基化修饰。
  16. 一种药物组合物，其含有：
    治疗有效量的权利要求1至15中任一项所述的抗原结合分子，以及
    一种或更多种药学上可接受的载体、稀释剂、缓冲剂或赋形剂；
    优选地，所述的药物组合物中还包含至少一种第二治疗剂。
  17. 分离的核酸，其编码权利要求1至15中任一项所述的抗原结合分子。
  18. 宿主细胞，其包含如权利要求17所述的分离的核酸。
  19. 一种治疗疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的权利要求1至15中任一项所述的抗原结合分子或权利要求16所述药物组合物的步骤；
    优选地，所述疾病是肿瘤；更优选地，所述肿瘤选自肺癌、乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌、肉瘤、肾细胞癌、肝细胞癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、头颈癌和胶质母细胞瘤。
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