KR101545914B1 - 특수화된 글리칸 구조를 함유하는 분자의 생산 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 분자의 당부분에 푸코즈가 결여되거나, 푸코즈의 양이 감소되거나, 인공의 당을 갖는 분자를 생산하기 위한 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 세포를 사용하여 분자의 당부분에 푸코즈가 결여되거나, 푸코즈의 양이 감소되거나, 다른 이례적인 당을 갖는 분자를 생산하는 방법 및 당해 방법에 의해 수득가능한 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인공 당화 양식을 갖는 분자에 관한 것이다.
Description
본 발명은 분자의 당부분(glycomoiety) 상에 푸코즈가 결여되거나, 푸코즈의 양이 감소되거나, 다른 인공적인 당을 갖는 분자를 생산하는 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 세포를 사용하여 분자의 당부분 상에 푸코즈가 결여되거나, 푸코즈 양이 감소되거나, 다른 인공적인 당을 갖는 분자를 생산하는 방법 및 이러한 방법으로 수득가능한 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인공 당화 양식(glycosylation pattern)을 갖는 분자에 관한 것이다.
사람에서 사용하기 위한 치료학적 당화 분자는 사람에서 발견된 것들과 유사한 복잡한 당화 양식을 가질 수 있다. 따라서, 동물 세포를 일반적으로 사용하여 단백질 또는 지질과 같은 치료학적 당화 분자를 생산하며, 여기서, 당화된 분자는 복잡하고, 사람과 유사한 당화 양식을 갖는 것이 바람직하다. 글리칸의 구조 및 복잡성은 반감기의 조절, 수용체 결합, 면역 반응의 도입 또는 억제를 통해 생분자의 생체내 기능에 심각하게 영향을 미친다.
당지질의 당 쇄는 복잡하며 유의적인 양의 푸코즈를 함유할 수 있다(참조:PNAS 1985; 82: 3045-3049.). 당단백질의 당 쇄는 단백질 잔기에 대한 결합 형태를 기준으로 하여, 대략 2개 유형, 즉, 아스파라긴에 결합하는 당 쇄(N-글리코시드-결합된 당 쇄) 및 세린, 트레오닌과 같은 다른 아미노산에 결합하는 당 쇄(O-글리코시드-결합된 당 쇄)로 나뉘어진다.
N-글리코시드-결합된 당 쇄는 다양한 구조를 가지지만[(참조: Biochemical Experimentation Method 23 - Method for Studying Glycoprotein Sugar Chain(Gakujutsu Shuppan Center), edited by Reiko Takahashi (1989)], 이들은 기본적인 일반적 코어 구조를 가지는 것으로 알려져 있다. 아스파라긴에 결합하는 당 쇄 말단은 환원 말단으로 불리우며, 반대 쪽은 비-환원 말단으로 불린다. N-글리코시드-결합된 당 쇄는, 만노즈가 단독으로 코어 구조의 비-환원 말단에 결합하는 고 만노즈 유형; 트리만노즈 코어의 비-환원 말단 측면이 통상적으로 2개(1,3 및 1,6)의 만노즈 아암(arm) 각각에 부착된 적어도 하나의 갈락토즈-N-아세틸글로코사민(이후, Gal-GlcNAc로 언급됨)을 가진 복합체 유형을 포함한다. Gal-GlcNAc의 비-환원 말단 측면은 N-아세틸글루코사민 등을 이등분하는 갈락토즈 및 시알산을 함유할 수 있다. 하이브리드 유형에서, 코어 구조의 비-환원 말단 측면은 고 만노즈 유형 및 복합체 유형 둘다의 측쇄를 갖는다. 척추동물 세포로부터의 글리칸에서, 푸코즈는 알파 1,3 결합(말단 푸코즈)을 통해 촉각(antennary)의 GlcNAc에 또는 알파 1,6 결합(코어 푸코즈)을 통해 아스파라긴-결합된 GlcNAc에 부착될 수 있다. 곤충 세포는 1,3 결합된 코어 푸코즈를 함유할 수 있는 글리칸을 생산한다.
N-당화된 단백질의 올리고당류는 지질-결합된 올리고당류로부터 초기에 생합성되어 Glc3Man9GlcNAc2-피로포스포릴-돌리촐을 형성하며, 이는 이후 트리펩타이드 서열 Asn-X-Ser 또는 Thr(여기서, X는 Pro를 제외한, 소포체(ER)내 단백질의 임의의 아미노산일 수 있다)내에 존재하는 아스파라긴으로 이동된다. 이후, 단백질은 골지체로 수송되며, 여기서, 올리고당류 부위는 다음 서열로 더욱 가공처리된다: 첫째로, 3개의 모든 글루코즈(GIc) 잔기가 글루코시다제 I 및 II에 의해 제거되어 Man9GlcNAc2-단백질이 수득된다. Man9GlcNAc2 구조는 다수의 만노즈(Man) 잔기의 제거에 의해 추가로 가공될 수 있다. 초기에, 4개의 α-1,2-결합된 만노즈가 제거되어 Man5GlcNAc2-단백질이 수득되며, 이는 이후에 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 잔기의 첨가에 의해 신장된다. 이러한 새로운 구조물, GlcNAcMan5GlcNAc2-단백질은 α-1,3- 및 α-1,6-결합된 만노즈를 제거하는 만노시다제 Il에 대한 기질이다. 이후에, 다른 당, GlcNAc, 갈락토즈, 푸코즈 및 시알산이 순서대로 첨가되어 N-당화된 단백질에서 흔히 발견되는 복합한 유형의 구조물이 수득된다.
IgG 분자는 예를 들면, Fc 영역내 CH2 도메인의 각각의 보존된 Asn297에 공유결합으로 부착된 N-결합된 올리고당류를 함유한다. 혈청 IgG의 Fc 영역내에서 발견된 올리고당류는 대부분 복합체 유형의 이중촉각(biantennary) 글리칸이다. IgG 당화 양식의 변형은 코어 구조: 2x N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 3x 만노즈(Man)(GlcNAc2Man3)에 대한 말단 시알산(NeuAc)의 부착, 제3의 GlcNac 아암(이등분하는 GlcNAc), 말단 갈락토실화(G), 및 α-1,6-결합된 코어 푸코실화(F)를 포함한다. 당화의 정확한 양식은 IgG 소성분, 특히, CH2 및 CH3 도메인의 구조적 특징에 의존한다[참조: Lund et al. (2000) Eur. J. Biochem., 267: 7246-7257].
동물 및 사람 세포는 단백질 상의 N-글리칸의 환원 말단에서 GlcNAc 잔기 및 또는 당지질상의 다른 초기의 당구조물에 푸코즈 잔기를 가하는 푸코실트랜스퍼라제를 갖는다. 단백질- 또는 지질-결합된 당부분의 푸코실화는 공여체로서 뉴클레오타이드 당, GDP-L-푸코즈, 및 푸코실 잔기를 공여체로부터 수용체 분자로 이전시키는 특수한 푸코실 트랜스퍼라제의 존재를 또한 필요로 한다(참조: Becker and Lowe, 1999). 진핵 세포에서 GDP-L-푸코즈는 2개의 상이한 경로, 보다 우세한 푸코즈 드 노보 경로(de novo pathway)에 의해 또는 소수의 구조 경로(salvage pathway)에 의해 합성될 수 있다(참조: Becker an Lowe, 1999). 구조 경로 또는 "스캐빈저(scavenger)" 경로는 배양 배지로부터 유리된 푸코즈 및 푸코실화된 당단백질의 누락에 의해 용이하게 차단될 수 있는 GDP-L-푸코즈의 작은 공급원(약 10%)이다. 구조 경로는 푸코즈-특이적인 혈장막 전달체를 통해 세포질 구획내로 수송될 수 있는 세포외 푸코즈로부터 출발한다. 대안적으로, 세포내이입(endocytosis)된 당단백질로부터 분해된 푸코즈는 세포질로 도입될 수 있다. 세포질성 L-푸코즈는 푸코키나제에 의해 푸코즈-1-포스페이트로 포스포릴화된 후 GDP-푸코즈 피로포스포릴라제에 의해 GDP-L-푸코즈로 전환된다(도 1, 우측 패널). 세포 배양 실험은, 구조 경로가 세포질성 GDP-L-푸코즈 혼주물에 대해 비교적 작게 기여함을 제안한다(참조: Becker and Lowe, 1999).
보다 우세한 푸코즈 드 노보 경로는 GDP-D-만노즈로부터 출발하며 GDP-만노즈 데하이드라타제(GMD) 및 GDP-케토-데옥시-만노즈-에피머라제/GDP-케토-데옥시-갈락토즈-리덕타제(GMER, 또한 사람에서 Fx로 공지됨)로 이루어지며, 이들 둘다는 세포질내에 위치하며, 함께 제휴하여 GDP-만노즈를 GDP-L-푸코즈로 전환시킨다(도 1, 좌측 패널). 이후에, GDP-L-푸코즈는 골지체의 막에 위치한 GDP-푸코즈 전달체를 통해 골지체내로 수송된다. GDP-L-푸코즈가 골지 관강 구획내로 도입되면, 푸코실트랜스퍼라제는 골지체내에서 초기 당부분에 GDP-L-푸코즈에 공유결합으로 결합할 수 있다. 특히, 푸코실트랜스퍼라제(Fut8)는 푸코즈 잔기를 1,6-결합을 사용하여 N-글리칸의 환원 말단에서 GlcNAc 잔기의 6번 위치로 이전시킨다.
당단백질에서 푸코즈의 결여는 특이적인 장점을 갖는 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 모노클로날 항체, 면역글로불린 및 관련 분자에서, 면역글로불린의 Fc 부분(CH2 도메인)의 Asn297에 부착된 N-글리칸으로부터 코어 푸코즈 당의 부재는 Fc 수용체에 대한 이의 결합을 증가시키거나 변경시키는 것으로 밝혀졌다. 상이한 유형의 고정 영역은 상이한 Fc 수용체에 결합한다. 예에는 인지체 Fc 수용체 CD16(FcγIII), CD32(FcγRII-B1 및 -B2), 또는 CD64(FcγRI)에 대한 IgG1 Fc 도메인의 결합, 인지체 Fc 수용체 CD89(FcαRI)에 대한 IgA Fc 도메인의 결합, 및 인지체 Fc 수용체 FcεFR1 또는 CD23에 대한 IgE 도메인의 결합이 포함된다. NK 세포의 표면에 존재하는 FcγRIII에 대한 결합은 강하게 증가되어 있다[참조: Shields et al. JBC 277 (30): 26733. (2002)].
치료학적 항체의 우세한 작용 방식은 항체 의존성 세포독성(이후 "ADCC 활성"으로 언급됨)이다. 이의 Fab 부위를 지닌 표적 세포(종양 세포 또는 병원체로 감염된 세포)에 대한 항체 결합은 효과기 세포, 전형적으로 NK 세포의 Fc 수용체에 의해 이의 Fc 부위내에서 인식된다. 일단 결합되면 효과기 세포는 IFN-γ와 같은 사이토카인, 및 표적 세포내로 도입되어 세포 사멸을 유도하는 그란자임 및 퍼포린을 함유하는 세포독성 과립을 방출한다. FcγRIII에 대한 결합 친화성은 ATCC를 통해 작용하는 항체의 경우 중요하다. 수용체의 저 친화성 대립형질의 담체는 리툭시마브(Rituximab)와 같은 치료학적 항체에 저조하게 반응한다(참조: Cartron et al. Blood 99: 754-758).
결과적으로, Fc 글리칸상의 코어 푸코즈의 부재에 의해 매개된 FcγRIII에 대한 보다 높은 친화성은 임상적 잇점 및 비용에 중요한 영향을 미치며 생물치료학적 생성물의 효능을 증가시키거나 유효 투여량을 감소시킬 수 있다.
생산된 당단백질의 당 쇄 구조를 변형시키기 위하여, 1) 당 쇄의 변형과 관련된 효소에 대한 억제제의 적용, 2) 당 합성 또는 이전에 관여된 유전자의 동종접합 녹아웃(knock out), 3) 돌연변이체의 선택, 4) 당 쇄의 변형과 관련된 효소를 암호화하는 유전자의 도입 등과 같은 각종 방법을 시도하여 왔다. 구체적인 예는 다음에 기술한다.
당 쇄의 변형과 관련된 효소에 대한 억제제의 예는 글리코시다제 I의 억제제인 카스타노스퍼민 및 N-메틸-1-데옥시노지리마이신, 글리코시다제 II의 억제제인 브로모콘둘리톨, 만노시다제 I의 억제제인 1-데옥시노지리마이신 및 1,4-디옥시-1,4-이미노-D-만니톨, 만노시다제 II의 억제제인 스와인소닌 등을 포함한다. 글리코실트랜스퍼라제에 대해 특이적인 억제제의 예는 N-아세틸글루코사민 트랜스퍼라제 V(GnTV) 등에 대한 기질의 데옥시 유도체를 포함한다.
당 쇄의 변형과 관련된 효소의 돌연변이체는 렉틴-내성 세포주로부터 주로 선택되어 수득되어 왔다. 예를 들어, CHO 세포 돌연변이체는 WGA[티. 불가리스(T. vulgaris)로부터 유도된 맥아 아글루티닌(wheat-germ agglutinin), ConA[씨. 엔시포르미스(C. ensiformis)로부터 유도된 콘카나발린 A], RIC[알. 콤무니스(R. communis)로부터 기원한 독소], L-PHA[피. 불가리스(P. vulgaris)로부터 유도된 류코아글루티닌], LCA[엘. 쿨리나리스(L. culinaris)로부터 유도된 렌틸 아글루티닌], PSA[피. 사티붐(P. sativum)으로부터 유도된 완두콩 렉틴] 등과 같은 렉틴을 사용하여 렉틴-내성 세포주로부터 수득되어 왔다.
또한, 푸코즈가 결여된 재조합체 항체를 생산하기 위한 몇가지 방법이 보고되어 왔다. N-당부분의 코어 푸코실화를 가능하도록 하는 가장 중요한 효소들 중 하나는 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 8(Fut8)이다. 당해 효소는 복합체 유형의 N-글리칸의 N-글리코시드-결합된 당 쇄 펜타코어(pentacore)내 α-결합을 통해 환원 말단에서 N-아세틸글루코사민의 6-위치에 대한 푸코즈의 결합을 촉매한다(참조: WO 00/61739). 푸코즈 함량이 감소된 항체는 또한 세포를 사용하여 수행되어 왔으며, 여기서, 푸코즈 전달체 유전자의 발현은 인공적으로 억제된다(참조: US 20090061485). α-1,6-푸코실트랜스퍼라제의 기능을 억제할 수 있는 RNA의 도입은 또한 푸코즈가 결여된 항체 분자의 생산을 초래하는 것으로 기술되어 왔다(참조: EP 1 792 987 A1).
많은 제안된 세포 또는 치료학적 처방에 사용될 수 있는 변형된 당화 양식을 갖는 분자를 생산하는 방법은 유의적인 단점을 갖는다. 예를 들면, 당화를 제거하는 효소, 예를 들면, 푸코즈 잔기를 제거하는 푸코시다제를 사용한 항체의 처리는 고가이고, 시간-소모적이며, 잠재적으로 유의적인 경제적 및 약물 일관성 위험을 갖는 추가의 제조 단계를 포함한다. 또한, 당단백질의 합성시 포함된 주요 효소를 녹-아웃하기 위한 세포주의 분자 가공은 지루하고, 고가이며 항상 성공을 약속하지는 않는다. 또한, 상기 세포주는 치료학적 용도를 위한 효능 및 안정성을 최적화시키기 위해 ADCC 또는 CDC 효능이 변화하는 분자의 "조정가능한(tunable)" 생산을 허용하지 않는다. 당단백질의 합성에 포함된 주요 효소의 수준을 녹-다운시키기 위한 안티센스 분자 또는 RNAi를 사용한 세포주의 처리는 예측할 수 없는 표적을 벗어난 효과를 가질 수 있으며, 비용이 많이 들고 제조-규모에서 실행에 비실용적인 것으로 여겨진다.
따라서, 치료학적 용도를 위한 개선된 특성을 갖는 변형된 당화 양식을 갖는 분자의 생산을 위한 신규의 유리한 세포 및 방법이 요구되고 있다.
본 발명은 변형된 당화 양식을 갖는 분자, 즉, 푸코즈가 결여되거나, 푸코즈의 양이 감소되거나, 이들의 글리칸 구조에 다른 인공적인 당을 갖는 분자의 생산을 위한 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 당해 세포를 사용하여, 변형된 당화 양식을 갖는 분자, 즉, 푸코즈가 결여되거나, 푸코즈의 양이 감소되거나, 이들의 글리칸 구조에 다른 인공적인 당을 갖는 분자를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 분자는 치료학적 용도를 위한 개선된 특성, 예를 들면, 증가된 ADCC 또는 CDC 활성, 시그날링 현상을 억제하기 위한 향상된 능력, 세포자멸사를 유도하는 증가된 능력 및/또는 면역 치료요법을 위한 증가된 능력을 갖는다. 또한, 본 발명에 의해 제공된 세포 및 방법은 변형된 당화 양식을 갖는 분자, 즉, 푸코즈가 결여되거나, 푸코즈의 양이 감소되거나, 이들의 글리칸 구조에 다른 인공적인 당을 갖는 분자의 조정가능하고, 믿을만하고, 저렴하며 직접적인 생산이 가능하다. 또한, 본 발명은 스케일-업(scale-up) 제조에 적합한 방법을 제공한다.
많은 경우에서, 목적한 삽입유전자(transgene)를 바람직한 수준으로 발현하는 효과적인 생산자 세포주를 생성하고 개발하기 위해 상당한 시간이 투자되고 많은 노력이 이루어져 왔다. 목적한 삽입유전자가 향상된 ADCC 효과기 기능으로부터 유리할 수 있었던 치료학적 항체인 경우, 고 생산자 세포가 N-당부분에 코어-푸코즈를 부착할 수 없거나 인공 당을 N-당부분에 부착시킬 수 있도록 하는 방식으로 생산자 세포주를 추가로 조작하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명은 기존의 유전적으로 가공된 세포들에 용이하게 적용시킬 수 있어서 이들이 당단백질의 초기 당구조물에 푸코즈를 부착시킬 수 없거나, 이들이 당 단백질의 초기의 당구조물에 대해 푸코즈와는 다른 인공 당을 부착시킬 수 있도록 하는 방식으로 개선된 ADCC 활성을 갖는 항체를 생산하도록 하는 발현 단위를 제공한다.
제1 국면에서, 본 발명은 기질로서 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 사용하는 적어도 하나의 효소를 포함하여, 당부분에 푸코즈를 천연적으로 포함하는 분자에서 상기 당부분에 푸코즈가 결여되거나, 푸코즈의 양이 감소된 분자를 생산하기 위한 척추동물 세포에 관한 것이며, 여기서, 효소는 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 GDP-L-푸코즈로 전환시키는 반응을 촉매하지 않는다.
제2 국면에서, 본 발명은,
i) 제1 국면에서 따른 척추동물 세포를 제공하는 단계,
ii) 푸코실트랜스퍼라제에 대한 기질일 수 있는 분자, 바람직하게는 단백질 또는 지질을 단계 i)에서의 세포로부터 분리하는 단계를 포함하여, 당부분에 푸코즈를 천연적으로 포함하는 분자에서 상기 당부분에 푸코즈가 결여되거나 푸코즈의 양이 감소된 분자를 생산하는 방법에 관한 것이다.
제3 국면에서, 본 발명은 제2 국면의 방법에 의해 수득가능한 분자의 당부분에 푸코즈가 결여되거나 푸코즈 양이 감소된 분자에 관한 것이다.
제4 국면에서, 본 발명은 제2 국면의 방법에 의해 수득가능한 D-람노즈, D-페로사민, 데옥시-D-탈로즈, 6-데옥시-D-알트로즈, 4-케토-3,6-디데옥시-D-만노즈, 및/또는 L-콜리토즈를 함유하는 당부분를 포함하는 분자에 관한 것이다.
제5 국면에서, 본 발명은
i) 70 내지 95%의 G0-GlcNac, G0, G1, 및/또는 G2 복합체 유형 N-글리칸, 및
ii) 5 내지 30%의 고 만노즈 유형 N-글리칸을 포함하는 당단백질을 포함하는 조성물에 관한 것이며, 여기서, 복합체 유형 N-글리칸은 푸코즈를 포함하지 않거나 실질적으로 푸코즈를 포함하지 않는다.
제6 국면에서, 본 발명은 D-람노즈, D-페로사민, 데옥시-D-탈로즈, 6-데옥시-D-알트로즈, 4-케토-3,6-디데옥시-D-만노즈, 및/또는 L-콜리토즈를 함유하는 당부분를 포함하는 단백질 또는 지질에 관한 것이다.
제7 국면에서, 본 발명은
i) 하나 이상의 척추동물 발현 조절 서열, 및
ii) 기질로서 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 사용하는 효소를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 단위에 관한 것이며, 여기서, 효소는 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 GDP-L-푸코즈로 전환하는 반응을 촉매하지 않는다.
제8 국면에서, 본 발명은
i) 기질로서 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 사용하는 효소를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제1의 폴리뉴클레오타이드, 및
ii) 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제2의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 당부분에 푸코즈를 일반적으로 포함하는 단백질에서 상기 당부분에 푸코즈가 결여되어 있거나 푸코즈 양이 감소된 단백질을 생산하기 위한 진핵 세포에 관한 것이며, 여기서, 효소는 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 GDP-L-푸코즈로 전환시키는 반응을 촉매하지 않는다.
제9 국면에서, 본 발명은
i) 제8 국면에 따른 진핵 세포를 제공하는 단계,
ii) 상기 세포내에서 제1의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 효소 및 제2의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질을 발현시키는 단계, 및
iii) 상기 세포로부터 단백질을 분리하는 단계를 포함하여, 당부분에 푸코즈를 정상적으로 포함하는 단백질의 당부분에 푸코즈가 결여되어 있거나 푸코즈의 양이 감소된 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
제10 국면에서, 본 발명은 제9 국면의 방법에 의해 수득가능한, 이의 당부분 에 푸코즈가 결여된 단백질 또는 푸코즈의 양이 감소된 단백질에 관한 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명을 하기에 상세히 기술하기 전에, 본 발명은 본 출원에 기술된 특별한 방법, 프로토콜 및 시약에 한정되지 않으며 이들이 변할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 출원에 사용된 전문용어는 단지 특별한 양태를 기술하기 위한 목적이며, 첨부된 특허청구범위에 의해서만 한정될 본 발명의 영역을 한정하는 것으로 의도되지 않음을 이해하여야 한다. 달리 정의하지 않는 한, 본 출원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
바람직하게는, 본 출원에 사용된 용어들은 문헌[참조: "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)]에 기술된 것으로서 정의된다.
내용에서 달리 요구하지 않는 한, 다음의 명세서 및 특허청구범위 전체를 통해, 용어 "들을 포함하다" 및, "를 포함하다" 및 "포함하는"과 같은 변형은 기술된 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 그룹의 포함을 내포하나 어떠한 다른 정수 또는 단계 또는, 정수 또는 단계의 그룹의 배재를 내포하지 않음을 의미할 것이다.
몇개의 문헌이 본 명세서의 내용 전체에 인용되어 있다. 본 출원에 인용된 문헌들 각각(모든 특허, 특허출원, 과학 공보, 제조업자의 명세서, 지시서, 유전자뱅크 수탁 번호 서열 제출 등을 포함)은, 앞에서 또는 뒤에서에 상관없이 이의 전문이 본 출원에 의해 참조로 포함된다. 본 발명이 선행의 발명 때문에 이러한 기재 내용을 앞서는 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 본 명세서에서 해석되어야 하는 것은 아니다.
다음에서, 본 발명의 요소들을 기술할 것이다. 이들 요소들은 특정 양태와 함께 나열되지만, 이들은 어떠한 방식으로도 및 어떠한 수로도 합해져서 추가의 양태를 생성할 수 있는 것으로 고려되어야 한다. 다양하게 기술된 예들 및 바람직한 양태들은 본 발명은 명쾌하게 기술된 양태들로만 한정하는 것으로 고려되지 않아야 한다. 당해 기술은 명쾌하게 기술된 양태와 어떠한 수의 기술되고/되거나 바람직한 양태를 합하는 양태를 지지하고 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 출원에서 모든 기술된 양태들의 어떠한 치환 및 조합도 내용에서 달리 나타내지 않는 한 본 출원의 설명에 의해 기재된 것으로 고려되어야 한다.
본 출원에 따른 용어 "들을 포함하다" 또는, "를 포함하다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 기술된 정수 또는 정수들의 그룹의 포함을 의미하나 어떠한 다른 정수 또는 정수들의 조합의 배제를 의미하지 않는다. 본 발명에 따른 용어 "로 필수적으로 이루어진"은, 기술된 정수 또는 정수들 그룹의 포함을 의미하나, 기술된 정수에 실질적으로 영향을 미치거나 변경할 수 있는 변형 또는 다른 정수들을 배제함을 의미한다. 본 발명에 따른 용어 "로 이루어진" 또는 "로 이루어지다"와 같은 변형은, 기술된 정수 또는 정수들의 그룹의 혼입 및 어떠한 다른 정수 또는 정수들의 그룹의 배제를 의미한다.
본 발명의 내용에서, 용어 "올리고펩타이드"는 아미노산의 짧은 펩타이드-결합된 쇄, 예를 들면, 길이가 전형적으로 약 50개 미만의 아미노산 및 보다 전형적으로 약 30개 미만의 아미노산인 상기 쇄를 말한다.
용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 본 발명의 내용에서 상호교환적으로 사용되며 아미노산의 긴 펩타이드-결합된 쇄, 예를 들면, 길이가 전형적으로 50개 아미노산 또는 50개 이상의 아미노산인 상기 쇄를 말한다.
본 발명의 내용에서 사용된 것으로서, 용어 "폴리펩타이드 단편"은 완전한 길이의 폴리펩타이드와 비교하여 결실, 예를 들면, 아미노-말단 결실 및/또는 카복시-말단 결실 및/또는 내부적인 결실을 갖는 폴리펩타이드를 말한다.
본 발명의 내용에서, 용어 "융합 단백질"은 이종 아미노산 서열에 커플링된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 말한다. 융합 단백질은 2개 이상의 상이한 단백질로부터의 2개 이상의 바람직한 기능적 성분을 함유하도록 작제될 수 있으므로 유용하다.
용어 "항체", "면역글로불린", "Ig" 및 "Ig 분자"는 본 발명의 내용에서 상호교환적으로 사용된다. 각각의 중쇄의 CH2 도메인은 항체 분자에 N-글리칸을 결합시키는 아스파라긴 잔기에서, 일반적으로 잔기 Asn-297에서 N-결합된 당화용 단일 부위를 함유한다(참조: Kabat et al., Sequence of proteins of immunological interest, Fifth Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). 당해 용어의 범위내에는 Igs의 부류, 즉, IgG, IgA, IgE, IgM, 및 IgD가 포함된다. 또한, 용어들의 범위내에는 IgGs의 아형, 즉, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4가 포함된다. 당해 용어들은 이들의 가장 광범위한 의미로 사용되며 모노클로날 항체(완전한 길이의 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 단일쇄 항체 및 다중특이적 항체(예를 들면, 이특이적 항체)를 포함한다.
본 발명의 내용에서 사용된 것으로서 용어 "항체 단편"은 CH2 도메인의 N-결합된 당화 부위를 포함하고 항원, 즉, 적어도 하나의 VL 및/또는 VH-쇄 또는 이의 결합 부분의 쇄에 특이적 결합할 수 있는 중쇄 면역글로불린 고정 영역의 CH2 도메인의 적어도 일부를 포함하는 항체의 단편을 말한다.
용어 "Fc 도메인" 및 "Fc 영역"은 Fc 수용체로 불리는 세포 표면 수용체 및 상보체 시스템의 일부 단백질과 상호작용하는 항체 중쇄의 C-말단 부분을 말한다. 당해 특성은 항체가 면역계를 활성화시키도록 한다.
본 발명의 내용에서, 용어 "당단백질"은 이들의 폴리펩타이드 측쇄에 공유결합으로 부착된 올리고당류 쇄(글리칸)을 함유하는 단백질을 말한다. 탄수화물은 동시-해독 또는 해독후 변형시 단백질에 부착된다. 당해 공정은 N-당화 또는 O-당화와 같은 당화로 공지되어 있다.
"N-당화"는 아스파라긴의 측쇄 상에 아미드 질소에 대한 당 쇄의 첨가를 의미한다. "O-당화"는 하이드록시라이신, 하이드록시프롤린, 세린 또는 트레오닌의 측쇄상의 하이드록실 산소에서 당 쇄의 첨가를 의미한다.
본 발명의 내용에서 사용된 것으로서 용어 "당지질"은 탄수화물-부착된 지질을 말한다. 이들은, 탄수화물 쇄가 세포 막의 원형질외 표면상에서 인지질과 연합되는 경우 발생한다. 탄수화물은 모든 진핵세포 막의 외부 표면에서 발견된다. 당지질의 탄수화물 구조는 첨가 후 글리칸을 변형시키는 글리코실하이드롤라제 및 지질을 가하는 글리코실트랜스퍼라제에 의해 조절된다. 당지질은 또한 약화된 생 백신(attenuated life vacine)으로 사용된 것들을 포함하는 외피보유 바이러스(enveloped virus)의 표면에서 발생한다.
용어 "글리칸" 또는 "당부분"은 본 발명의 내용에서 상호교환적으로 사용되어 다당류 또는 올리고당류을 말한다. 용어 "올리고당류"는 단순 당 또는 단당류로 또한 공지된 당 성분중 소수(전형적으로 3 내지 10개)를 함유하는 당 중합체를 의미한다. 용어 "다당류"는 글리코시드 결합에 의해 함께 연결된 반복 단위(단당류 또는 이당류, 전형적으로 > 10)로 형성된, 중합체성 탄수화물 구조를 의미한다. 글리칸은 당단백질에서와 같이 단백질에 부착되거나 당지질에서와 같이 지질에 부착되어 발견될 수 있다. 당해 용어들은 고 만노즈 유형 N-글리칸, 복합체 유형 N-글리칸 또는 하이브리드 유형 N-글리칸, O-글리칸과 같은 N-글리칸을 포함한다.
본 발명의 내용에서, 다음 단당류는 다음과 같이 약칭된다: 글루코즈 = Glc, 갈락토즈 = Gal, 만노즈 = Man, 푸코즈 = Fuc 또는 F, N-아세틸갈락토사민 = GalNAc, 또는 N-아세틸글루코사민 = GlcNAc.
"N-글리칸"은 N-결합된 다당류 또는 올리고당류를 의미한다. N-결합된 올리고당류는 예를 들면 단백질내 아스파라긴 잔기의 아미드 질소에 결합된 N-아세틸글루코사민에 의해 부착된 것이다. N-당단백질에서 발견된 우세한 당은 글루코즈, 갈락토즈, 만노즈, 푸코즈, N-아세틸갈락토사민(GalNAc), N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 시알산(예를 들면, N-아세틸-뉴라민산(NANA))에서 발견된다. 당 그룹의 프로세싱은 ER의 관강(lumen)내에서 동시-해독적으로 발생하며 N-결합된 당단백질의 경우 골지체내에서 지속된다. N-글리칸은 Man3GlcNAc2의 일반적인 오당류 코어를 갖는다("Man"은 만노즈를 말하며; "NAc"는 글루코즈를 말하고; "NAc"는 N-아세틸을 말하며; GlcNAc는 N-아세틸글루코사민을 말한다). N-글리칸은, 또한 "트리만노즈 코어", "오당류 코어" 또는 "파우치만노즈 코어"로 언급되는 Man3GIcNAc2 코어 구조에 첨가된 말초 당(예를 들면, GlcNAc, 갈락토즈, 푸코즈 및 시알산)을 포함하는 측쇄(안테나(antenae))의 수와 관련하여 상이하다. N-글리칸은 이들의 측쇄 성분(예를 들면, 고 만노즈, 복합체 또는 하이브리드)에 따라 분류된다.
"고 만노즈 유형 N-글리칸"은 5개의 만노즈 잔기(Man5), 또는 그 이상의 만노즈 잔기(예를 들면, Man6, Man7, 또는 Man8)를 갖는 N-결합된 다당류 또는 올리고당류를 의미한다.
"복합체 유형 N-글리칸"은 1,3 만노즈 아암(arm)에 부착된 적어도 하나의 GlcNAc 및 "트리만노즈" 코어의 1,6 만노즈 아암에 부착된 적어도 하나의 GlcNAc를 전형적으로 갖는 N-결합된 다당류 또는 올리고당류를 의미한다. 복합체 N-글리칸은 또한 시알산 또는 유도체와 함께 임의로 변형된 갈락토즈("Gal") 또는 N-아세틸갈락토사민("GalNAc") 잔기를 가질 수 있다(예를 들면, "NANA" 또는 NeuAc", 여기서, "Neu"는 뉴라민산을 말하고 "Ac"는 아세틸을 말한다). 복합체 N-글리칸은 또한 "양분하는" GlcNAc 및 코어 푸코즈("Fuc")를 포함하는 쇄내 치환을 가질 수 있다. 본 발명의 내용에서 복합체 유형 N-글리칸은 0(G0), 1(G1), 또는 2(G2) 갈락토즈 및 또한 환원 말단(G0F, G1F, G2F로 각각 지명)상에 제1의 GlcNAc에 부착된 하나의 푸코즈를 함유할 수 있다.
"하이브리드 유형 N-글리칸"은 트리만노즈 코어의 1,3 만노즈 아암의 말단에 적어도 하나의 GlcNAc 및 트리만노즈 코어의 1,6 만노즈 아암에 0개 또는 그 이상의 만노즈를 갖는 N-결합된 다당류 또는 올리고당류를 의미한다.
본 발명의 내용에서 당구조물을 기술하기 위해 사용된 약어들은 다음과 같이 정의된다:
코어 = Man3 GlcNAc2
G0 = GlcNAc2 Man3 GlcNAc2
G0-GlcNAc = 1개의 GlcNAc가 없는 G0-구조물(즉, GlcNAc Man3 GlcNAc2)
G1 = 1개의 추가의 갈락토즈 잔기를 함유하는 G0-구조물(즉, Gal GlcNAc2 Man3 GlcNAc2)
G2 = 2개의 추가의 갈락토즈 잔기를 함유하는 G0-구조물(즉, Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc2)
G0F = 오당류 코어의 제1 GlcNAc-잔기에 연결된 추가의 푸코즈-잔기를 함유하는 G0-구조물(즉, GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 Fuc)
G0F-GlcNAc = 오당류 코어의 제1 GlcNAc-잔기에 연결된 추가의 푸코즈-잔기를 함유하는 G0-GlcNAc-구조물(즉, GlcNAc Man3 GlcNAc2 Fuc)
G1F = 오당류 코어의 제1 GlcNAc-잔기에 연결된 추가의 푸코즈-잔기를 함유하는 G1-구조물(즉, Gal GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 Fuc)
G2F = 오당류 코어의 제1의 GlcNAc-잔기에 연결된 추가의 푸코즈-잔기를 함유하는 G2-구조물(즉, Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 Fuc)
Man4 = 1개의 추가의 만노즈 잔기를 함유하는 코어-구조물(즉, Man Man3 GlcNAc2)
Man5 = 2개의 추가의 만노즈 잔기를 함유하는 코어-구조물(즉, Man2 Man3 GlcNAc2)
Man6 = 3개의 추가의 만노즈 잔기를 함유하는 코어-구조물(즉, Man3 Man3 GlcNAc2)
Man7 = 4개의 추가의 만노즈 잔기를 함유하는 코어-구조물(즉, Man4 Man3 GlcNAc2)
Man8 = (5개의 추가의 만노즈 잔기를 함유하는 코어 구조물(즉, Man5 Man3 GlcNAc2)
"O-글리칸"은 O-결합된 다당류 또는 올리고당류를 의미한다. O-결합된 글리칸은 일반적으로 세린 또는 트레오닌 잔기를 통해 펩타이드 쇄에 부착된다. O-결합된 당화는 골지체에서 발생하며 컨센서스 서열(consensus sequence)을 필요로 하지 않는 실제 해독-후 현상이며 단배질 이전을 위해 올리고당류 전구체가 요구되지 않는다. O-결합된 글리칸의 가장 일반적인 유형은 초기 GalNAc 잔기(또는 Tn 에피토프)를 함유하며, 이들은 일반적으로 뮤신-유형 글리칸(mucin-type glycan)으로 언급된다. 다른 O-결합된 글리칸은 Ser/Thr 잔기에 결합된 초기 당으로서 글루코사민, 크실로즈, 갈락토즈, 푸코즈, 또는 만노즈를 포함한다. O-결합된 당단백질은 N-글리칸보다 비교적 거의 측쇄되어 있지 않은 일반적으로 바이안테나리(bianttennary)인 일반적으로 큰 단백질(> 200 kDa)이다.
본 발명의 내용에서 사용된 것으로서 용어 "이의 당부분에 푸코즈를 천연적으로 포함하는 분자"는 진핵 세포, 바람직하게는 척추동물 세포내에서 생산시 푸코즈를 당부분에 첨가하는 능력, 즉, 푸코즈를 당부분에 첨가하는 변경되지 않은 능력을 가지며, 적어도 하나의 푸코즈 잔기를 함유하는 당부분을 포함하는 모든 화합물을 말한다. 이러한 분자는 예를 들면, Asp, Ser 또는 Thr 잔기, 바람직하게는 트리펩타이드 서열 Asn-X-Ser/Thr(여기서, X는 Pro를 제외한 특정 아미노산이다)을 포함하는 글리칸 이전 효소에 의해 인식된 적어도 하나 이상의 서열 모티프(motiff)를 포함한다. 당부분과 푸코즈를 포함하는 분자를 생산하는 진핵 세포(예를 들면, 척추동물 세포)의 바람직한 예에는 CHO, AGE1.HN, AGE1.CR, AGE1.CR.PIX, 또는 AGE1.CS가 있다. 바람직하게는 이러한 혼합물은 단백질 융합 단백질 또는 지질이다. 바람직하게는 상기 단백질은 진핵 세포의 것이며, 바람직하게는 척추동물, 가장 바람직하게는 포유동물 기원인 것이거나 이로부터 유래된 것이다.
본 발명의 내용에서 용어 "이의 당부분에 푸코즈가 결여된 분자"는 당부분에 푸코즈를 천연적으로 포함하는 분자에서 상기 당부분에 검출가능한 양의 푸코즈가 존재하지 않는 분자를 의미한다. 순도 측면으로 나타낸, "이의 당부분에 푸코즈가 결여된 분자"는 분자의 당부분상의 푸코즈를 천연적으로 포함하는 분자가 이의 당부분에 당 잔기 푸코즈를 100% 포함하지 않음을 의미한다.
용어 "이의 당부분에 푸코즈 양이 감소된 분자"는, 당부분상의 푸코즈의 양이 푸코즈를 당부분에 첨가할 수 있는, 즉 푸코즈를 당부분에 첨가하는 변형되지 않은 능력을 가진 세포내에서 발현시 수(n)으로부터 감소되는 분자를 말한다. 따라서, 감소된 상태는 n-x이고, 여기서, n은 상기 나타낸 의미를 가지며 x는 1 내지 (n-1)의 정수이다. 바람직하게는, n이 천연 상태에서 2인 경우, 이는 1로 감소된다. 유사하게, n이 천연 상태에서 3인 경우, 이는 2, 또는 1로 바람직하게 감소되며; n이 천연 상태에서 4인 경우, 이는 3, 2, 또는 1로 바람직하게 감소되고; n이 천연 상태에서 5인 경우, 이는 4, 3, 2, 또는 1로 바람직하게 감소되거나; n이 천연 상태에서 6인 경우, 이는 5, 4, 3, 2, 또는 1로 바람직하게 감소된다.
용어 "이들의 당부분에 푸코즈의 양이 감소된 분자의 조성물"은 본 발명의 내용에서 이의 당부분에 푸코즈를 천연적으로 포함하는 조성물의 분자가 이의 당부분에 감소된 수의 푸코즈를 가짐을 나타내기 위해 사용된다. 이러한 비교는 바람직하게는 위에서 나타낸 세포주에 의해 생산된 분자를 사용하여 수행된다. 감소 측면에서 표현시, 이는, 조성물의 분자의 제공된 수, 바람직하게는 조성물의 분자의 1, 10, 100 또는 1000 pmol의 감소를 의미하며, 푸코즈 잔기의 수가 10% 내지 95%, 바람직하게는 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 또는 약 94%로 감소됨을 의미한다. 전체적인 감소는 분자의 당부분에 푸코즈가 결여되고/되거나 이의 당부분에 푸코즈의 양이 감소된 조성물내 분자의 증가에 기인할 수 있다.
용어 "이들의 당부분에 푸코즈가 실질적으로 포함되지 않는 분자의 조성물"은 본 발명의 내용에서 이들의 당부분에 푸코즈를 천연적으로 포함하는 조성물의 분자가 이의 당부분에 당 잔기 푸코즈를 필수적으로 포함하지 않음을 나타내기 위해 사용된다. 순도의 측면으로 나타내는 경우, 용어 "이들의 당부분에서 푸코즈를 실질적으로 포함하지 않는 분자의 조성물"은 조성물의 분자의 제공된 수, 바람직하게는 조성물의 분자의 1, 10, 100 또는 1000 pmol, 상기 분자의 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99,1%, 약 99,2%, 약 99,3%, 약 99,4%, 약 99,5%, 약 99,6%, 약 99,7%, 약 99,8%, 또는 적어도 약 99,9%가 이들의 당부분에서 당 잔기 푸코즈를 포함하지 않는 분자의 조성물을 의미한다.
당해 분야의 숙련가는 (i) 본 발명의 세포를 목적 분자가 생산되는 조건하에서 배양하고, (ii) 상기 분자를 상기 세포로부터 분리하고, (iii) 이의 당부분에 부착된 푸코즈 잔기와 관련하여 상기 분자의 당 쇄 구조를 분석하고 상기 분자의 당 쇄 구조상에 존재하는 푸코즈 잔기의 평균 값을 계산하며, (iv) 당해 결과를 동일한 분자, 예를 들면, 세포내에서 생산된 항체 분자(여기서, 당해 분자는 푸코즈가 감소되지 않은 당화 양식으로 생산된다)의 결과와 비교함으로써 특수 분자, 예를 들면, 항체 분자의 당부분에서 푸코즈의 감소된 양을 실험적으로 용이하게 측정할 수 있다. 바람직하게는, 2개 실험에서 사용된 세포는 동일하지만, 하나의 세포가 기질로서 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 사용하는 적어도 하나의 효소를 포함하며, 여기서, 당해 효소는 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 GDP-L-푸코즈로 전환시키는 반응을 촉매하지 않는다는 점에서 상이하다. 바람직하게는, 세포 둘다는 동일한 배양 조건하에서 배양되어 배양 조건에 있어서의 차이에 기인할 수 있는 푸코실화에 있어서의 변이가 배제된다.
분자, 예를 들면, 항체 분자내 당 쇄 구조는 2 차원적 당 쇄 맵핑 방법에 의해 단순하게 분석할 수 있다[참조: Anal. Biochem., 171, 73 (1988), Biochemical Experimentation Methods 23 - Methods for Studying Glycoprotein Sugar Chains(Japan Scientific Societies Press) edited by Reiko Takahashi (1989)]. 2 차원 당 쇄 맵핑 방법에 의해 유추된 구조는 각각의 당 쇄의 MALDI(매트릭스 보조된 레이저 탈착/이온화)와 같은 질량 분광법을 수행함으로써 측정할 수 있다.
분자, 예를 들면, 진핵 세포(예: 척추동물 세포) 속에서 당부분을 포함하는 단백질 또는 지질의 푸코실화는 공여체로서 뉴클레오타이드 당, GDP-L-푸코즈를 필요로 하며, 공여체로부터의 푸코실 잔기를 수용체 분자로 이전시키는, 특별한 푸코실트랜스퍼라제의 존재를 필요로 한다. 진핵 세포(예: 척추동물 세포)에서 GDP-L-푸코즈는 2개의 상이한 경로, 보다 우세한 푸코즈의 드 노보 경로에 의해 또는 소수의 구조 경로에 의해 합성될 수 있다.
본 발명의 발명자들은, 기질로서 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 효과적으로 이용하지만, GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 GDP-L-푸코즈로 전환하는 반응을 촉매하지 않는 진핵 세포(예: 척추동물 세포)내 효소(편향 효소)의 존재가 분자의 당부분에 푸코즈가 결여되거나 푸코즈 양이 감소된 분자, 예를 들면, 단백질 또는 지질의 생산을 초래함을 발견하였다. 용어 "GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈"는 용어 "GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노즈"와 동의어이다. 용어들 둘다는 본 출원에서 상호교환적으로 사용된다.
따라서, 제1 국면에서, 본 발명은 기질로서 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 사용하며 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 GDP-L-푸코즈로 전환하는 반응을 촉매하지 않는 적어도 하나의 효소를 포함하는, 당부분에 푸코즈를 천연적으로 포함하는 분자에서 상기 당부분에 푸코즈가 결여되거나 푸코즈 양이 감소된 분자를 생산하기 위한 (변형된) 척추동물 세포를 제공한다.
본 발명의 제1 국면의 척추동물 세포에 존재하는 효소는, 단, 당해 효소가 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 GDP-L-푸코즈로 전환시키는 반응을 촉매하지 않는 조건하에서 기질로서 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 사용하는 임의의 효소일 수 있다. 오히려 상기 효소는 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 척추동물 세포내에서 GDP-L-푸코즈 합성에 더 이상 이용할 수 없는 생성물로 전환한다. 본 발명의 제1 국면의 척추동물 세포내에 포함된 효소는 척추동물 세포에 일반적으로 존재하지 않는 효소, 즉, 이종 또는 인공 효소, 예를 들면, 원핵 세포, 바람직하게는 세균과 같은 다른 계통의 유기체로부터의 효소이다. 대안적으로, 상기 효소는 또한 척추동물 세포내에서 일반적으로 존재하지만 기질 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 GDP-L-푸코즈로 전환시키기 보다는 오히려 예를 들면, 돌연변이의 존재로 인하여 상이한 생성물로 전환시키는 효소일 수 있다.
본 발명의 제1 국면의 척추동물 세포내에 존재하는 효소는 예를 들면, 단백질 미세주입, 단백질 전기천공(electroporation) 또는 단백질 지질감염을 통해 척추동물 세포내로 도입된다. 바람직하게는 발현 벡터내에 통합된 효소를 암호화하는 핵산 서열을, 예를 들면, DNA 미세주입, DNA 전기천공 또는 DNA 지질 감염을 통해 척추동물 세포내로 도입시키는 것이 가능하며, 이는 후속적으로 척추동물 세포내에서 각각의 단백질로 전사되고 해독된다. 당해 분야의 숙련가들은 단백질 또는 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 척추동물 세포내로 도입시키기 위한 미세주입, 전기천공 또는 지질감염과 같은 분자 생물학적 기술에 대해 잘 알고 있으며 이들 기술을 수행하는 방법을 알고 있다.
기질로서 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 사용하고 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈의 GDP-L-푸코즈로의 전환을 촉매하지 않는 2개 이상의 효소, 즉, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개 효소가 척추동물 세포내에 존재하여 상기 세포내에서 푸코즈 드 노보 경로를 효과적으로 차단시키는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 기질로서 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 사용하는 효소는 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈 리덕타제(GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노즈 리덕타제와 동의어, RMD로 약술), GDP-페로사민 신테타제(Per), GDP-6-데옥시-D-탈로즈 신테타제(GTS), GDP-푸코즈 신테타제 Cys109Ser-(GFS-Cys109Ser) 돌연변이체, GDP-4-케토-6-데옥시만노즈-3-데하이드라타제(ColD), 바람직하게는 GDP-L-콜리토즈 신테타제(ColC)와 결합한 GDP-4-케토-6-데옥시만노즈-3-데하이드라타제(ColD), 및 이의 변이체로 이루어진 그룹 중에서 선택되며, 바람직하게는 효소는 세균으로부터 또는 이러한 세균 효소로부터 기원한다. 보다 바람직하게는, 기질로서 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 사용하는 효소는 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈 리덕타제(RMD), GDP-푸코즈 신테타제 Cys109Ser-(GFS-Cys109Ser) 돌연변이체, 및/또는 GDP-페로사민 신테타제(Per)이다.
GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈 리덕타제(RMD)는 기질 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 GDP-D-람노즈로 환원시킨다. GDP-D-람노즈는 세균에서 D-람노실화용 뉴클레오타이드 당 공여체이며 척추동물내에서 발생하지 않는다. 척추동물 세포는 또한 특이적인 람노실트랜스퍼라제를 결여함으로써 GDP-D-람노즈는 척추동물 세포내에서 당단백질 또는 당지질의 초기의 당구조물로 통합될 수 없다.
효소 GDP-6-데옥시-D-탈로즈 신테타제(GTS)는 기질 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 GDP-데옥시-D-탈로즈로 환원시킨다. GDP-데옥시-D-탈로즈는 세균에서 6-데옥시-D-탈로실화용 뉴클레오타이드 당 공여체이며 척추동물내에 존재하지 않는다. 척추동물 세포는 또한 특이적인 데옥시탈로실트랜스퍼라제를 결여함으로써 GDP-데옥시-D-탈로즈는 척추동물 세포내에서 초기의 당구조물내로 혼입될 수 없다.
추가로, 효소 GDP-페로사민 신테타제(Per)는 기질 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 GDP-D-페로사민으로 환원시키고 아미노기전이반응시킨다. GDP-D-페로사민은 세균, 예를 들면, 이. 콜라이(E. coli)내에서 페로사민화를 위한 뉴클레오타이드 당 공여체이다. GDP-D-페로사민은 일반적으로 척추동물 세포내에 존재하지 않는다. 척추동물 세포는 또한 특이적인 페로사미닐트랜스퍼라제를 결여함으로써 GDP-D-페로사민은 척추동물 세포내에서 초기의 당구조물에 부착할 수 없다.
따라서, 이종 효소 GTS 및/또는 Per는 (i) 척추동물 세포내에서 기질 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 결실하고 있으며, (ii) GDP-L-푸코즈 합성에 더이상 이용될 수 없는 인공 생성물(즉, GTS의 경우에 GDP-데옥시-D-탈로즈 및 Per의 경우에 GDP-D-페로사민)의 합성을 초래한다. 따라서, GTS 및/또는 Per을 포함하는 척추동물 세포내에서 생산된, 이들의 당부분에 푸코즈를 일반적으로 포함하는 분자는 이들의 당부분에 푸코즈가 결여되거나 푸코즈의 양이 감소되어 있다.
효소 GDP-4-케토-6-데옥시만노즈-3-데하이드라타제(ColD)는 기질 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 사용하여 이를 GDP-4-케토-3,6-디데옥시-D-만노즈로 전환시킨다. 중간체 GDP-4-케토-3,6-디데옥시-D-만노즈는 척추동물 세포내에서 불안정할 수 있으므로, ColD가 효소 GDP-L-콜리토즈 신테타제(ColC)와 결합하여 바람직하게 사용된다. 효소 ColC는 GDP-4-데하이드로-6-데옥시-D-만노즈 에피머라제/리덕타제의 부류에 속한다. 효소 ColC는 또한 중간체 GDP-4-케토-3,6-디데옥시-D-만노즈를 안정한 최종 생성물 GDP-L-콜리토즈로 전환시킨다. 상기 세포는 GDP-4-케토-3,6-디데옥시-D-만노즈 및/또는 GDP-L-콜리토즈를 상기 세포내에 존재하는 분자의 당부분에 이전시키기 위한 각각의 글리코실트랜스퍼라제를 결여하고 있으므로 생성물 둘다는 척추동물 세포내에서 초기의 당구조물내로 혼입될 수 없다. 따라서, ColD가 ColC와 결합하여 척추동물 세포내에 존재하는 것이 바람직하다.
효소 GDP-푸코즈 신테타제(GFS)(또한 GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노즈 에피머라제/리덕타제, GMER로 공지됨)는 척추동물 세포내에서 GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노즈를 GDP-L-푸코즈로 전환시킨다. GFS 반응은 C-3" 및 C-5" 둘다에서 에피머화에 이은 C-4에서 카보닐의 NADPH-의존성 환원을 포함한다. GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노즈를 GDP-L-푸코즈와 상이한 생성물, 즉, GDP-6-데옥시-D-알트로즈로 전환시키는 활성 부위 돌연변이체, 바람직하게는 GFS-Cys109Ser가 본 발명에서 사용된다(참조: Lau S.T.B., Tanner, M.E. 2008. Mechanism and active site residues of GDP-Fucose Synthase, Journal of the American Chemical Society, Vol. 130, No. 51, pp. 17593-17602).
바람직하게는, GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈 리덕타제(RMD), GDP-페로사민 신테타제(Per), GDP-6-데옥시-D-탈로즈 신테타제(GTS), GDP-푸코즈 신테타제 Cys109Ser-(GFS-Cys109Ser) 돌연변이체, GDP-4-케토-6-데옥시만노즈-3-데하이드라타제(ColD), 바람직하게는 GDP-L-콜리토즈 신테타제(ColC)와 결합한 GDP-4-케토-6-데옥시만노즈-3-데하이드라타제(ColD)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 2개 이상의 효소, 즉, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 효소, 및 이의 변이체가 척추동물내에 존재한다.
본 발명에서 바람직한 RMD, Per, GTS, GFS-Cys109Ser, ColD, 또는 ColC 효소 변이체는 이로부터 아미노산 서열내 150개 이하(즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150개 이하)까지의 아미노산 변화(즉, 교환, 삽입, 결실, N-말단 절단(trancation) 및/또는 C-말단 절단)가 유도되는 RMD, Per, GTS, GFS-Cys109Ser, ColD, 또는 ColC 효소와는 상이하다. 아미노산 교환은 보존적이거나 비-보존적일 수 있다. 본 발명에서 바람직한 RMD, Per, GTS, GFS-Cys109Ser, ColD, 또는 ColC 효소 변이체는 이것이 기원한 RMD, Per, GTS, GFS-Cys109Ser, ColD, 또는 ColC 효소와 특정 정도의 서열 동일성에 의해 달리 또는 추가로 특징화될 수 있다. 따라서, 본 발명에서 바람직한 RMD, Per, GTS, GFS-Cys109Ser, ColD, 또는 ColC 효소 변이체는 각각의 참조 RMD, Per, GTS, GFS-Cys109Ser, ColD, 또는 ColC 효소에 대해 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 바람직하게는, 서열 동일성은 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300 또는 그 이상의 아미노산의 연속된 신장(stretch)에 결쳐, 바람직하게는 각각의 참조 RMD, Per, GTS, GFS-Cys109Ser, ColD, 또는 ColC 효소의 전체 길이에 걸쳐 존재한다. 서열 동일성이 각각의 참조 RMD, Per, GTS, GFS-Cys109Ser, ColD, 또는 ColC 효소의 전체 길이에 걸쳐 적어도 80%, 전체 길이에 걸쳐 적어도 85%, 전체 길이에 걸쳐 적어도 90%, 전체 길이에 걸쳐 적어도 95%, 전체 길이에 걸쳐 적어도 98%, 전체 길이에 걸쳐 적어도 99.5%인 것이 특히 바람직하다. 서열 동질성이 각각의 참조 RMD, Per, GTS, GFS-Cys109Ser, ColD, 또는 ColC 효소의 적어도 200 또는 250개 아미노산에 걸쳐 적어도 80%, 적어도 200 또는 250개 아미노산에 걸쳐 적어도 85%, 적어도 200 또는 250개 아미노산에 걸쳐 적어도 90%, 적어도 200 또는 250개 아미노산에 걸쳐 적어도 95%, 적어도 200 또는 250개 아미노산에 걸쳐 적어도 98%, 또는 적어도 200 또는 250개 아미노산에 걸쳐 적어도 99.5%인 것이 또한 특히 바람직하다.
RMD, Per, GTS, GFS-Cys109Ser, ColD, 또는 ColC 효소의 단편(또는 결실 변이체)는 바람직하게는 이의 N-말단 및/또는 이의 C-말단 및/또는 내부적으로 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150개 이하의 아미노산의 결실을 갖는다.
또한, 참조 효소에 대해 상기 나타낸 정도의 관련성을 갖는 RMD, Per, GTS, GFS-Cys109Ser, ColD, 또는 ColC 효소는, 이 정도가 각각의 참조 효소의 활성의 적어도 30% 정도까지의 관련 생물학적 활성을 나타내는 경우에만, 변이체로서 고려된다. 본 발명의 내용에서 관련된 "생물학적 활성"은 "효소 활성", 즉, 기질 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 이용하여 이를 GDP-D-람노즈, GDP-D-페로사민, GDP-데옥시-D-탈로즈, GDP-6-데옥시-D-알트로즈, GDP-4-케토-3,6-디데옥시-D-만노즈 또는 GDP-L-콜리토즈로 각각 전환시키는 RMD, Per, GTS, GFS-Cys109Ser, ColD, 또는 ColC 효소 변이체의 활성이다. 당해 분야의 숙련가는, RMD, Per, GTS, GFS-Cys109Ser, ColD, 또는 ColC 효소 변이체가 각각의 참조 RMD, Per, GTS, GFS-Cys109Ser, ColD, 또는 ColC 효소의 효소 활성 중 적어도 30%의 효소 활성을 가지는지를 용이하게 평가할 수 있다. 각각의 참조 효소의 효소 활성과 비교하여 "효소 활성" 효소 변이체를 측정하기 위한 적합한 검정, 예를 들어, 효소 활성 검정은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
바람직하게는, 효소 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈 리덕타제(RMD)는 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)(서열 번호 1)로부터 기원한다. 효소 GDP-6-데옥시-D-탈로즈 신테타제(GTS)는 바람직하게는 악티노바실러스 악티노마이세템코미탄스(Actinobacillus actinomycetemcomitans)(서열 번호 2)로부터 기원한다. 효소 GDP-페로사민 신테타제(Per)가 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae)(서열 번호 3)로부터 기원하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, GDP-4-케토-6-데옥시만노즈-3-데하이드라타제(ColD)는 이. 콜라이(서열 번호 4)로부터 기원한다. 이. 콜라이로부터 GDP-L-콜리토즈 신테타제(ColC)의 이용이 또한 바람직하다(서열 번호 7). 야생형 GDP-푸코즈 신테타제(GFS)는 크리세툴루스 그리세우스(Cricetulus griseus)(차이니즈 햄스터)(서열 번호 5)로부터 기원한다. 크리세툴루스 그리세우스(차이니즈 햄스터)로부터 기원한 GDP-푸코즈 신테타제 Cys109Ser-(GFS-Cys109Ser) 돌연변이체는 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는다.
위에서 언급한 바와 같이, 본 발명은 기질로서 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 사용하는 효소의 변이체를 포함한다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 언급한 서열 확인인자 번호, 즉, 서열 번호 1 변이체, 서열 번호 2 변이체, 서열 번호 3 변이체, 서열 번호 3 변이체, 서열 번호 4 변이체, 서열 번호 5 변이체, 서열 번호 6 변이체, 및 서열 번호 7 변이체를 포함하다. 상기 변이체의 구조적 및/또는 기능적 정의와 관련하여, 상기 언급한 단락을 참조한다.
바람직하게는, RMD, Per, GTS, ColD, ColC, 또는 GFS-Cys109Ser의 핵산 서열은 코돈-최적화된다. 본 발명의 내용에서 사용된 것으로서 용어 "코돈-최적화"는 예를 들면, 내부 타타 박스(Tata boxes), 치 부위(chi site), 리보소옴 도입 부위, RNA 불안정성 모티프, 반복 서열, 강한 RNA 2차 구조 및 잠재 스플라이스 부위(cryptic splice site)의 제거, 및 또한 진핵(예: 척추동물) 세포에서 보다 높은 이용 또는 진핵(예: 척추동물) 세포에서 고도로 발현된 유전자의 용도를 의미한다.
추가로 푸코즈 구조 경로가 척추동물 세포내에서 차단되는 것이 또한 바람직하다. 따라서, 본 발명의 세포를 배양하는 경우, 푸코즈 및 푸코실화된 당단백질을 함유하지 않는 성장 배지를 사용하는 것이 바람직하다.
척추동물 세포는, 본 발명의 발명자들이 예를 들면, 인공 당 GDP-D-람노즈, GDP-D-페로사민, GDP-데옥시-D-탈로즈, GDP-6-데옥시-D-알트로즈, GDP-4-케토-3,6-디데옥시-D-만노즈, 및/또는 GDP-L-콜리토즈의 세포질내 주입에 의해 보충, 특히 세포질성 보충이 척추동물 세포내에서 푸코즈 이전의 억제에 양성적으로 기여함을 예기치 않게 인식하였으므로, GDP-L-푸코즈 합성을 억제하거나 예방하기 위한 GDP-D-람노즈, GDP-D-페로사민, GDP-데옥시-D-탈로즈, GDP-6-데옥시-D-알트로즈, GDP-4-케토-3,6-디데옥시-D-만노즈, 및/또는 GDP-L-콜리토즈를 효소에 추가하여 또는 효소에 대한적으로 포함한다. 인공 당(들) GDP-6-데옥시-D-알트로즈, GDP-D-람노즈, 및/또는 GDP-D-페로사민의 보충이 특히 바람직하다.
기질로서 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 사용하고 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 GDP-L-푸코즈로 전환시키는 반응을 촉매하지 않는 효소가 에피솜적으로 또는 염색체적으로 척추동물 세포내에서 안정하게 유지되거나 일시적으로 존재하는 핵산 서열로부터 발현되는 것이 바람직하다.
효소, 바람직하게는 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈 리덕타제(RMD), GDP-페로사민 신테타제(Per), GDP-6-데옥시-D-탈로즈 신테타제(GTS), GDP-푸코즈 신테타제 Cys109Ser-(GFS-Cys109Ser) 돌연변이체, GDP-4-케토-6-데옥시만노즈-3-데하이드라타제(ColD), 또는 GDP-L-콜리토즈 신테타제(ColC)를 암호화하는 핵산 서열은 세포를 형질전환하는데 사용된 발현 벡터내에 통합된다.
적합한 발현 벡터는 플라스미드 코스미드, 세균 인공 염색체(BAC) 및 바이러스성 벡터를 포함한다. 바람직하게는, 비-바이러스 발현 벡터가 사용된다.
효소를 암호화하는 핵산의 발현은 발현 조절 서열에 의해 조절된다.
용어 "발현 조절 서열"은 작동적으로 연결된 암호화 서열의 진핵 세포(예: 척추동물 세포)내 발현에 영향을 미치는 뉴클레오타이드 서열을 말한다. 발현 조절 서열은 전사를 조절하는 서열, 예를 들면, 프로모터, TATA-박스, 인핸서(enhancer); 전사-후 현상, 예를 들면, 폴리아데닐화; 및 핵산 서열의 해독을 조절하는 서열이다.
바람직한 프로모터는 사이토메갈로바이러스 hCMV 이미디어트 얼리 유전자 프로모터(immediate early gene promoter), SV40의 얼리(early) 또는 레이트(late) 프로모터 또는 CUP-1 프로모터, 예를 들면, tet-on 또는 tet-off 시스템에 사용된 바와 같은 tet-리프레서(repressor)를 포함하는 조절된 프로모터, 3-포스포글리세레이트 키나제(PGK)에 대한 프로모터, 산 포스파타제의 프로모터, 및 효모 α- 또는 α-교배 인자의 프로모터, 예를 들면, 구성적 CMV 이미디어트 얼리 유전자 프로모터, 얼리 또는 레이트 SV 40 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, 레트로바이러스 LTR, PGK 프로모터, 신장 인자 1-α(EF1-α), EF2 및 포스포에놀피루베이트 카복시 키나제(PEPCK)를 포함하는 구성적 프로모터이다. 특히 바람직한 프로모터는 효소의 중간 또는 약한 발현만을 지지하여 잠재적인 독성 문제를 피하는 프로모터들이다. 제공된 프로모터의 발현 강도는 발현을, 내인성 GAPDH의 발현을 지시하는 강력한 구성적 프로모터의 발현 강도에 대해 비교함으로써 표준화할 수 있다. GAPDH의 10% 내지 1%의 강도에서 효소의 발현을 지시하는 프로모터는 중간 발현을 지시하는 프로모터로 고려되고 1% 미만의 강도에서 효소의 발현을 지시하는 프로모터는 약한프로모터로 고려된다. 발현 강도는 예를 들면, 실시간 PCR을 포함하는 당해 분야에 공지된 방법에 의해 추정될 수 있다.
마커 태그(marker tag)를 또한 본 발명의 양태에서 사용할 수 있다. 바람직하게는, 마커 태그의 핵산 서열은 태그될 단백질(예: 효소, 항체)을 암호화하는 핵산 서열에 작동적으로 결합된다. 바람직하게는, 마커 태그는 GFP 및, GFP를 포함하나, 이에 한정되지 않는 이의 변이체로 이루어진 그룹 중에서 선택된 형광성 단백질이다. 본원에 사용된 것으로서, "작동적으로 결합된"은, 하나의 핵산이 제2의 핵산에 결합됨으로써 상응하는 융합 단백질의 프레임내(in-frame) 발현이 프레임-이동(frame-shift) 또는 정지 코돈을 피하면서 영향받을 수 있음을 의미한다. 이들 용어들은 또한 목적한 암호화 핵산 서열(예: 효소, 항체)에 대해 발현 조절 서열을 결합시켜 상기 서열의 발현을 효과적으로 조절함을 의미한다. 이들 용어는 또한 친화성 태그 또는 마커 태그를 암호화하는 핵산 서열을 목적한 암호화 핵산 서열(예: 효소, 항체)에 결합시킴을 말한다.
발현 벡터내에서 효소 RMD, Per, GTS, GFS-Cys109Ser, ColD 또는 ColC를 암호화하는 핵산 서열을 척추동물 특이적인 발현 조절 서열에 작동적으로 결합시켜, 척추동물 세포내에서 효소 RMD, Per, GTS, GFS-Cys109Ser, ColD 또는 ColC를 암호화하는 핵산의 발현을 허용하는 것이 바람직하다.
그 결과, 효소(들) RMD, Per, GTS, GFS-Cys109Ser, 및/또는 ColD, 바람직하게는 ColC와 결합된 ColD는 바람직한 효과를 위한 최적 수율로 본 발명의 척추동물 세포내에서 발현된다. 발현에 사용된 효소 및 세포의 특성에 따라서 당해 수율은 높거나, 중간이거나 낮을 수 있다. 당해 분야의 숙련가들이 발현의 높은, 중간 또는 낮은 수율을 달성하기 위해 적절한 척추동물 특이적인 발현 조절 서열을 선택하는 것은 용이하다.
척추동물 세포내에서 효소(s) RMD, Per, GTS, GFS-Cys109Ser, 및/또는 ColD, 바람직하게는 ColC와 결합된 ColD는 GDP-L-푸코즈 합성을 효과적으로 차단함으로써 분자의 당부분에 푸코즈를 천연적으로 포함하지만 이들의 발현으로 인하여 푸코즈가 결여되거나 이들의 당부분에 푸코즈 양이 감소되어 있는 분자의 생산을 유도한다. 재조합체 단백질의 장기간의, 고-수율 생산을 위해, 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들면, 기질로서 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 사용하며, GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 GDP-L-푸코즈 및 단백질, 예를 들면, 항체로 전환시키는 반응을 촉매하지 않는 효소를 암호화하는 핵산을 안정하게 발현하는 진핵 세포(예: 척추동물 세포)가 가공될 수 있다. 바이러스 복제 오리진을 함유하는 발현 벡터를 사용하기 보다는, 진핵 세포(예: 척추동물 세포)를 적절한 발현 조절 서열(예: 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결인자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 임의로 선택가능한 마커로 조절된 벡터로 형질전환시킬 수 있다. 외부 DNA를 도입한 후, 형질전환된 세포는 이러한 세포로부터 핵산을 분석하거나, 발현 효과(예: 렉틴 결합을 사용한 푸코즈의 결여)를 검출함으로써 검출할 수 있거나 선택적 압력을 적용시켜 선택할 수 있다. 적합한 선택 시스템은 당해 분야에 잘 공지되어 있다.
바람직하게는, 척추동물 세포는 푸코실트랜스퍼라제에 대한 기질일 수 있는 적어도 하나의(수용기) 분자를 추가로 포함한다. 본 발명의 내용에서 사용된 것으로서 용어 "푸코실트랜스퍼라제에 대한 기질일 수 있는 (수용기) 분자"는, 변경되지 않은 푸코실화 활성을 갖는 세포내에서 생산되는 경우, 어떠한 목적한 화합물, 예를 들면, 적어도 하나의 푸코즈 잔기가 부착된 당부분을 가지거나 포함하는, 단백질, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 지질, 지질 단편 또는 융합 단백질을 말한다. 이러한 화합물은 푸코실트랜스퍼라제에 대한 적합한 기질이다. 따라서, 바람직한 수용기 분자는 당단백질, 당폴리펩타이드, 당올리고펩타이드, 당지질, 당지질 단편, 또는 당화된 융합 단백질이다. 본 발명의 내용에서 사용된 것으로서 용어 "푸코실트랜스퍼라제에 대한 기질일 수 있는 (수용기) 분자"는 또한 이것이 적어도 하나의 푸코즈 잔기가 부착될 수 있는 유망한 당단백질 또는 당지질, 즉, 푸코즈가 척추동물 세포에 의한 이의 생산 후 푸코실트랜스퍼라제에 의해 부착될 수 있는 단당류를 포함하는 올리고당류 구조물이 결합된 단백질 또는 지질인 한, 모든 단백질 또는 지질을 말한다. 바람직하게는, 단백질은 원핵세포 기원이 아니다. 단백질이 포유동물 단백질이거나, 이로부터 기원하는 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 척추동물 세포내에서 푸코실트랜스퍼라제에 대한 기질일 수 있는 분자, 예를 들면, 적어도 하나의 푸코즈 잔기가 부착될 수 있는 당부분을 포함하는 단백질 또는 지질의 존재는 분자의 당부분에 푸코즈를 포함하지 않거나 푸코즈 잔기가 부착될 수 있는 사실에도 불구하고, 이의 당부분에 푸코즈의 양이 감소된 당해 분자의 생산을 가져온다.
푸코실트랜스퍼라제에 대한 기질일 수 있는 분자는 단백질, 바람직하게는 내인성 또는 외인성 단백질인 것이 바람직하다. 용어 "외인성 단백질"은 각각의 세포의 외부로부터 오거나 각각의 세포내로 도입된 핵산으로부터 세포의 내부에서 발현된 특정 단백질을 의미한다. 용어 "내인성 단백질"은 세포의 게놈에 의해 암호화된 특정 단백질을 말한다. 바람직하게는, 목적 단백질, 즉, 유망한 당단백질은 척추동물 세포내에서 재조합적으로 발현된다. 상기 단백질은 척추동물 세포내에서 일시적으로 존재하거나 안정하게 유지된 핵산 서열로부터 발현된다. 적합한 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 효소와 관련하여 상기 기술되어 있다. 이들은 목적 단백질을 암호화하는 핵산의 발현 측면에서 동일하게 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 바람직한 양태에서, 척추동물 세포는
(i) 척추동물 특이적인 발현 조절 서열에 작동적으로 결합하여, 각각의 효소를 암호화하는 핵산 서열의 발현을 허용하는 효소 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈 리덕타제(RMD), GDP-페로사민 신테타제(Per), GDP-6-데옥시-D-탈로즈 신테타제(GTS), GDP-푸코즈 신테타제 Cys109Ser-(GFS-Cys109Ser) 돌연변이체, GDP-4-케토-6-데옥시만노즈-3-데하이드라타제(ColD), 또는 GDP-L-콜리토즈 신테타제(ColC)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및
(ii) 상기 세포내에서 목적 단백질, 예를 들면, IgG1과 같은 항체를 암호화하는 핵산 서열의 발현을 가져오는, 목적 단백질, 즉, 척추동물 특이적인 발현 조절 서열에 작동적으로 결합된 유망한 당단백질, 예를 들면, IgG1과 같은 항체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
그 결과, (i) 효소(들) RMD, Per, GTS, GFS-Cys109Ser, 및/또는 ColD, 바람직하게는 ColC와 결합된 ColD, 및 (ii) 목적 단백질, 즉, 유망한 당단백질(들), 예를 들면, IgG1과 같은 항체가 본 발명의 척추동물 세포내에서 발현된다.
바람직하게는, 본 발명의 제1 국면에서, 단백질은 항체, 항체 단편, 융합 단백질, 바이러스 단백질, 바이러스 단백질 단편, 항원 또는 호르몬이다. 가장 바람직하게는, 항체 또는 항체 단편은 IgG, 바람직하게는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD 및 IgE로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 가장 바람직하게는, 융합 단백질은 항체의 Fc 영역, 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD 또는 IgE의 Fc 영역과 같은 IgG의 Fc 영역을 포함한다. 가장 바람직하게는, 호르몬은 난포-자극 호르몬(FSH), 생식샘자극 호르몬, 갑상선-자극 호르몬, 인터루킨-2, 인터루킨-6, 인터루킨-10, 인터루킨-11, 가용성 인터루킨-4, 에리트로포이에틴 또는 트롬보포이에틴이다. 바람직하게는, 바이러스 단백질 또는 바이러스 단백질 단편은 외피보유 바이러스의 외피 막(envelope membrane)내에 포함된다. 바이러스 단백질이 호흡기세포융합 바이러스로부터의 G 또는 F 단백질이고, 바이러스 단백질 단편이 상기 단백질의 세포외 단편인 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 추가의 양태는 상기 바이러스 단백질 또는 바이러스 단백질 단편을 포함하는 바이러스이다.
푸코실트랜스퍼라제에 대한 기질일 수 있는 분자가 지질인 것이 바람직하다. 바람직하게는, 지질은 글리세로당지질, 가장 바람직하게는 갈락토지질, 설포지질(SQDG), 또는 글리코스핀고지질, 가장 바람직하게는 세레브로시드(예: 갈락토세레브로시드 또는 글루코세레브로시드), 강글리오시드, 글로보시드, 설파타이드 또는 당포스포스핑고지질이다. 지질이 외피보유 바이러스의 외피 막내에 포함되는 것이 특히 바람직하다.
글리코스핑고지질(GSL)이 특히 바람직하다. 글리코스핑고지질은 소수성 세라미드 앵커(anchor) N-아실스핀고신 및, 사카라이드로 구성된 친수성 헤드-그룹을 함유한다. 이들은 일반적으로 세포 막의 외부 표면에서 발견된다. 사카라이드-잔기의 조성은 세포 유형 특이적이며 유기체의 발달 단계에 의존하거나 세포의 종양유전자성 상태로 변할 수 있다.
가장 바람직하게는, 바이러스 단백질 및/또는 지질은 외피보유 바이러스의 외피내에 포함된다.
위에서 이미 언급한 바와 같이, 단백질은 외피보유 바이러스의 외피 막내에 포함된 바이러스 단백질일 수 있다. 지질은 또한 외피보유 바이러스의 외피 막내에 포함된 지질일 수 있다.
본 발명의 추가의 국면은 상기 지질을 포함하는 바이러스이다.
상기 언급된 바이러스는 바이러스 감염을 통해 척추동물 세포내로 도입될 수 있다. 바이러스는 또한 생산될 바이러스 모두 또는 일부를 암호화하는 핵산을 도입시킴으로써 척추동물 세포내로 도입될 수 있다. 복제, 조립 등에 요구되는 단백질을 제공하는 것이 필수적인 경우, 이는 일반적으로 하나 이상의 바이러스 단백질을 발현할 수 있는 바이러스 생산자 세포주를 사용함으로써 달성된다. 예를 들어, HEK293, Per.C6 및 AGE1.HN 세포는 아데노바이러스 E1A 단백질을 발현함으로써 E1 암호화 영역을 결여하는 DNA를 보충할 수 있다.
바람직하게는, 척추동물 세포는 포유동물, 어류, 양서류, 파충류 세포 또는 조류 세포이다.
i) 포유동물 세포가 사람, 햄스터, 개 또는 원숭이 세포, 바람직하게는 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76)(ATCC CRL-1587), 사람 경부 암종 세포(HeLa)(ATCC CCL 2), 마딘 다빈(Madin Darbin) 개 신장 세포(MDCK)(ATCC CCL 34), 사람 PER.C6 세포(Crucell(네덜란드 라이덴 소재)의 시판되는 세포), 또는 사람(호모 사피엔스) AGE1.HN 세포(ProBioGen(독일 베를린 소재)의 시판되는 세포)이거나;
ii) 어류 세포가 익탈루루스 푼크타투스(Ictalurus punctatus)(얼룩메기) 난소(CCO) 세포(ATCC CRL-2772)이거나;
iii) 양서류 세포가 제노푸스 래비스(Xenopus laevis) 신장 세포(ATCC CCL-102)이거나;
iv) 파충류 세포가 이구아나 심장 세포(IgH-2)(ATCC CCL-108)이거나; 또는
v) 조류 세포가 조류 망막 세포 AGE1.CR 또는 AGE1.CR.PIX, 또는 조류 체절 세포 AGE1.CS[대만 오리, 카이리나 모스차타(Cairina moschata)로 부터 기원한 모든 세포]인 것이 특히 바람직하다. 이들 세포주는 모두 ProBioGen AG로부터 시판된다.
세포 주 AGE1.CR.PIX(17a11b)는 ProBioGen AG(독일 베를린 13086 괴테슈트라쎄 54 소재)에 의해 2005년 11월 24일자로 기탁기관(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH: 38124 독일 부라운슈바이크, 마체로더 벡 1비 소재)]에 수탁번호 제DSM ACC2749호하에 기탁되었다. 세포주 AGE1.HN(NC5T11#34)는 ProBioGen AG(독일 13086 베를린 괴테슈트라쎄 54 소재)에 의해 기탁기관(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH: 독일 브라운슈바이크 38124, 마체로더 벡 1비 소재)에 2005년 11월 4일로 수탁 번호 제DSM ACC2744호하에 기탁되었다. 세포주 AGE1.CR.PIX(17a11b)는 대만 오리(카이리나 모스차타)의 배아 망막 세포로부터 기원한다. 세포주 AGE1.HN(NC5T11#34)은 사람(호모 사피엔스) 신생아의 뇌실주위 신경 영역으로부터 기원한다. 세포주 둘다는 아데노바이러스 E1A 및 E1B 단백질의 안정한 통합 및 발현에 의해 무한증식된다.
다른 바람직한 척추동물 세포는 VIVALIS(프랑스 낭떼 소재)의 시판 세포인 조류 EB14 세포이다. 다른 바람직한 척추동물 세포는 하기 표 1에 요약되어 있다:
| 세포 주 | 기탁 번호 | 기원 |
| NS0 | ECACC 제85110503호 | 마우스 골수종 |
| Sp2/0-Ag14 | ATCC 제CRL-1581호 | 마우스 골수종 |
| BHK21 | ATCC 제CCL-10호 | 햄스터 새끼 신장 |
| BHK TK - | ECACC 제85011423호 | 햄스터 새끼 신장 |
| HaK | ATCC 제CCL-15호 | |
| 2254-62.2 (BHK-21 유도체) |
ATCC 제CRL-8544호 | 햄스터 새끼 신장 |
| CHO 야생형 | ECACC 제00102307호 | 차이니즈 햄스터 난소; 크리세툴루스 그리세우스(Cricetulus griseus ) |
| CHO-K1 | ATCC 제CCL-61호 | 차이니즈 햄스터 난소; 크리세툴루스 그리세우스 |
| CHO-DUKX(= CHO duk-, CHO/dhfr-) | ATCC 제CRL-9096호 | 차이니즈 햄스터 난소; 크리세툴루스 그리세우스 |
| CHO-DUKX B11 | ATCC 제CRL-9010호 | 차이니즈 햄스터 난소; 크리세툴루스 그리세우스 |
| CHO-DG44 | ATCC에 기탁되지 않음(참조: Urlaub et al., 1983) | 차이니즈 햄스터 난소; 크리세툴루스 그리세우스 |
| CHO Pro-5 | ATCC 제CRL-1781호 | 차이니즈 햄스터 난소; 크리세툴루스 그리세우스 |
| V79 | ATCC 제CCC-93호 | |
| B14AF28-G3 | ATCC 제CCL-14호 | |
| HEK 293 | ATCC 제CRL-1573호 | 사람 배아 신장 |
| COS-7 | ATCC 제CRL-1651호 | |
| U266 | ATCC 제TIB-196호 | |
| HuNS1 | ATCC 제CRL-8644호 | |
| CHL | ECACC 제87111906호 |
척추동물 세포는, 상기 당이 척추동물 세포내에서 정상적으로 합성되거나 존재하지 않으므로, 척추동물 세포는 GDP-D-람노즈, GDP-D-페로사민, GDP-데옥시-D-탈로즈, GDP-6-데옥시-D-알트로즈, GDP-4-케토-3,6-디데옥시-D-만노즈, 또는 GDP-L-콜리토즈에 대한 글리코실트랜스퍼라제를 천연적으로 포함하지 않는다. 따라서, 인공 당 GDP-D-람노즈, GDP-D-페로사민, GDP-데옥시-D-탈로즈, GDP-6-데옥시-D-알트로즈, GDP-4-케토-3,6-디데옥시-D-만노즈, 또는 GDP-L-콜리토즈가 본 발명의 제1 국면에 따라 척추동물 세포내에서 인공적으로 생산되는 경우에서조차, 이들은 단백질 또는 지질의 초기 당구조물내로 혼입될 수 없다.
그러나, 본 발명의 발명자들은 예상치못하게도, 인공 당 GDP-D-람노즈, GDP-D-페로사민, GDP-데옥시-D-탈로즈, GDP-6-데옥시-D-알트로즈, GDP-4-케토-3,6-디데옥시-D-만노즈, 또는 GDP-L-콜리토즈가, 각각의 이종 글리코실트랜스퍼라제, 및 임의로 각각의 이종 GDP-데옥시헥소즈 당 뉴클레오타이드 수송인자가(들이) 또한 척추동물 세포내에 존재하는 단서하에서 단백질 또는 지질의 글리칸 구조물내로 통합될 수 있음을 발견하였다.
따라서, 바람직한 양태에서, 본 발명의 제1 국면에 따른 척추동물 세포는, 바람직하게는 척추동물 세포내에 포함된 핵산에 의해 암호화되고 척추동물 특이적인 발현 조절 서열에 작동적으로 연결된 GDP-D-람노즈, GDP-D-페로사민, GDP-데옥시-D-탈로즈, GDP-6-데옥시-D-알트로즈, GDP-4-케토-3,6-디데옥시-D-만노즈, 또는 GDP-L-콜리토즈에 대한 적어도 하나의 글리코실트랜스퍼제를 추가로 포함하며, 상기 척추동물 특이적인 발현 조절 서열은 상기 핵산 서열, 및 바람직하게는 척추동물 세포내 포함된 핵산에 의해 암호화되고 상기 핵산 서열의 발현을 허용하는 척추동물 특이적인 발현 조절 서열에 작동적으로 결합된 GDP-D-람노즈, GDP-D-페로사민, GDP-데옥시-D-탈로즈, GDP-6-데옥시-D-알트로즈, GDP-4-케토-3,6-디데옥시-D-만노즈, 또는 GDP-L-콜리토즈에 대한 임의로 적어도 하나의 GDP-데옥시헥소즈 당 뉴클레오타이드 수송인자의 발현을 허용한다. 보다 바람직한 양태에서, 본 발명의 제1 국면에 따른 척추동물 세포는 GDP-D-람노즈, GDP-D-페로사민, 및/또는 GDP-6-데옥시-D-알트로즈에 대한 글리코실트랜스퍼라제를 추가로 포함한다.
상기 언급한 글리코실트랜스퍼라제중 2개 이상, 예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개, 및 상기 언급한 GDP-데옥시헥소즈 당 뉴클레오타이드 수송인자중 임의로 2개 이상, 예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개가 척추동물 세포, 예를 들면, 진핵 세포내에 존재하는 것이 특히 바람직하다.
이러한 핵산의 일시적이거나 안정한 발현에 적합한 시스템은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며 바람직한 것들은 상기 기술되어 있고 글리코실트랜스퍼라제, 및 임의로 GDP-데옥시헥소즈 당 뉴클레오타이드 수송인자를 나타내는 문맥에서 유사하게 사용될 수 있다.
바람직하게는, GDP-D-람노즈, GDP-D-페로사민, GDP-데옥시-D-탈로즈, GDP-6-데옥시-D-알트로즈, GDP-4-케토-3,6-디데옥시-D-만노즈, 또는 GDP-L-콜리토즈에 대한 글리코실트랜스퍼라제는 척추동물 세포내에서 재조합적으로 발현된다. GDP-D-람노즈, GDP-D-페로사민, GDP-데옥시-D-탈로즈, GDP-6-데옥시-D-알트로즈, GDP-4-케토-3,6-디데옥시-D-만노즈, 또는 GDP-L-콜리토즈에 대한 글리코실트랜스퍼라제는 척추동물 세포내에 일시적으로 존재하거나 안정하게 유지된 핵산 서열로부터 발현될 수 있다. 상기 언급한 GDP-데옥시헥소즈 당 뉴클레오타이드 수송인자가 척추동물 세포내에서 재조합적으로 발현되는 것이 또한 바람직하다. 상기 GDP-데옥시헥소즈 당 뉴클레오타이드 수송인자는 척추동물 세포내에 일시적으로 존재하거나 안정하게 유지된 핵산으로부터 발현될 수 있다.
따라서, 본 발명의 또다른 바람직한 양태에서, 척추동물 세포는
(i) 척추동물 특이적인 발현 조절 서열에 작동적으로 결합된 효소 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈 리덕타제(RMD), GDP-페로사민 신테타제(Per), GDP-6-데옥시-D-탈로즈 신테타제(GTS), GDP-푸코즈 신테타제 Cys109Ser-(GFS-Cys109Ser) 돌연변이체, GDP-4-케토-6-데옥시만노즈-3-데하이드라타제(ColD), 또는 GDP-L-콜리토즈 신테타제(ColC)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드,
(ii) 상기 세포내에서 상기 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 발현을 허용하는 척추동물 특이적인 발현 조절 서열에 작동적으로 결합된 목적한 단백질, 즉 유망한 당단백질, 예를 들면, IgG1과 같은 항체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및
(iii) 상기 세포내에서 상기 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 발현을 허용하는 척추동물 특이적인 발현 조절 서열에 작동적으로 결합된 GDP-D-람노즈, GDP-D-페로사민, GDP-데옥시-D-탈로즈, GDP-6-데옥시-D-알트로즈, GDP-4-케토-3,6-디데옥시-D-만노즈, 또는 GDP-L-콜리토즈에 대한 글리코실트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 임의로
(iv) 상기 세포내에서 상기 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 발현을 허용하는, 척추동물 특이적인 발현 조절 서열에 작동적으로 결합된 GDP-D-람노즈, GDP-D-페로사민, GDP-데옥시-D-탈로즈, GDP-6-데옥시-D-알트로즈, GDP-4-케토-3,6-디데옥시-D-만노즈, 또는 GDP-L-콜리토즈에 대한 GDP-데옥시헥소즈 당 뉴클레오타이드 수송인자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
그 결과, (i) 효소(들), (ii) 목적 단백질(들), (iii) 글리코실트랜스퍼라제(들), 및 임의로 (iv) GDP-데옥시헥소즈 당 뉴클레오타이드 수송인자가 본 발명의 척추동물 세포내에서 과발현된다.
상기 단백질(들)은 효소(들), 즉, GDP-D-람노즈, GDP-D-페로사민, GDP-데옥시-D-탈로즈, GDP-6-데옥시-D-알트로즈, GDP-4-케토-3,6-디데옥시-D-만노즈, 및/또는 GDP-L-콜리토즈의 최종-생성물(들)의 사용을 가능하도록 하고, 푸코즈가 결여되거나 이들을 이의 당부분에 푸코즈의 양이 감소된 단백질(들)의 당구조물내로 통합시키는 동시-발현된 글리코실트랜스퍼라제(들)에 의해 추가로 변형된다. 이는 이의 당부분에 D-람노즈, D-페로사민, 데옥시-D-탈로즈, 6-데옥시-D-알트로즈, 4-케토-3,6-디데옥시-D-만노즈, 및/또는 L-콜리토즈를 포함하는 새로운 인공 단백질(들)의 생성을 초래한다.
바람직하게는, 상술한 GDP-데옥시헥소즈 당 뉴클레오타이드 수송인자는 골지 GDP-데옥시헥소즈 당 뉴클레오타이드 수송인자, 즉, 척추동물 세포, 예를 들면, 진핵 세포의 골지 막을 통과하는 상기 언급한 뉴클레오타이드 당의 수송을 허용하는 수송인자이다.
본 발명에 따른 (변형된) 척추동물 세포는 이의 당부분에 푸코즈를 함유하지 않거나 이의 당부분에 푸코즈 양이 감소된 외피 표면 당단백질을 포함하는 외피보유 바이러스를 생산하는데 사용될 수 있다.
바람직하게는, 외피보유 바이러스는 바이러스 백신의 활성 성분으로서 전적으로 또는 부분적으로 사용된다. 용어 "바이러스 백신"은, 투여시 바이러스에 대해 항체 생산 또는 세포 면역성을 자극시키지만 심각한 감염은 유발할 수 없는 약화되거나 사멸된 바이러스의 제제를 의미한다.
본 발명에 따른 (변형된) 척추동물 세포는 또한 이의 당부분에 D-람노즈, D-페로사민, 데옥시-D-탈로즈, 6-데옥시-D-알트로즈, 4-케토-3,6-디데옥시-D-만노즈, 및/또는 L-콜리토즈를 포함하는 외피 표면 당단백질 또는 당지질을 포함하는 외피보유 바이러스를 생산하는데 또한 사용될 수 있다.
제2 국면에서, 본 발명은
i) 제1 국면에 따른 척추동물 세포를 제공하는 단계,
ii) 푸코실트랜스퍼라제에 대한 기질일 수 있는 분자, 바람직하게는 단백질 또는 지질을 단계 i)에서의 세포로부터 분리하는 단계를 포함하여, 당부분에 푸코즈를 천연적으로 포함하는 분자에서 상기 당부분에 푸코즈가 결여되거나 푸코즈 양이 감소된 분자를 생산하는 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 단계 i)시, 푸코실프랜트퍼라제에 대한 기질일 수 있는 분자, 예를 들면, 단백질이 단계 i)에서의 세포내에서 발현된다.
상기 분자, 예를 들면, 푸코즈가 결여되거나 이들의 당부분에 푸코즈의 양이 감소된 단백질 또는 지질을 척추동물 세포로부터 단계 ii)에서 용이하게 분리될 수 있다.
진핵세포(예: 척추동물 세포) 내부에 포함되거나 변형된 분자, 예를 들면, 푸코즈가 결여되거나 이의 당부분에 푸조즈의 양이 감소된 단백질을 포함하는 세포로부터 분비된 분자에 대한 각종 분리 과정은 당해 분야에 공지되어 있다. 이러한 방법은 세포내 분자의 경우에 세포 수거, 붕해 및 분획화/정제 및 세포 유리된 배양물 상층액의 생성에 이은 분비된 분자의 정제를 전형적으로 포함한다.
본 발명에 따라 유용한 추출 과정은 분리될 변형된 분자를 방해하지 않는다. 예를 들어, 추출은 바람직하게는 강력한 세제 및 환원제, 또는 단백질 변성을 유도할 수 있는 어떠한 제제의 부재하에서도 수행된다.
제3 국면에서, 본 발명은 제2 국면의 방법에 의해 수득가능한 푸코즈가 결여된 분자 또는 이의 당부분에 푸코즈 양이 감소된 분자를 제공한다. 바람직하게는, 당해 분자는 지질 또는 단백질이다.
단백질은 제1 국면과 관련하여 상기 설정된 바와 같은 항체, 호르몬, 항원 또는 바이러스 단백질인 것이 특히 바람직하다.
지질이 글리세로당지질, 가장 바람직하게는 갈락토지질, 황지질(SQDG), 또는 글리코스핑고지질, 가장 바람직하게는 세레브로시드(예를 들면, 갈락토세레브로시드 또는 글루코세레브로시드), 강글리오시드, 글로보시드, 설파타이드 또는 글리코포스포스핑고지질인 것이 특히 바람직하다. 바람직하게는, 지질, 예를 들면, 강글리오시드는 외피보유 바이러스의 막 내에 포함된다.
가장 바람직하게는, 바이러스 단백질 및/또는 지질은 외피보유 바이러스의 외피내에 포함된다.
추가의 국면에서, 본 발명은 제3 국면에 따른 분자의 조성물을 제공한다.
제4 국면에서, 본 발명은 제2 국면의 방법에 의해 수득가능한 D-람노즈, D-페로사민, 데옥시-D-탈로즈, 6-데옥시-D-알트로즈, 4-케토-3,6-디데옥시-D-만노즈, 및/또는 L-콜리토즈를 함유하는 당부분을 포함하는 분자를 제공한다.
분자의 당잔기에 L-푸코즈가 없거나 L-푸코즈 양이 감소된 분자가 바람직하다. 바람직하게는, 당해 분자는 지질 또는 단백질이다. 또한, 척추동물 세포, 바람직하게는 변형된 분자, 바람직하게는 지질 및/또는 단백질을 발현하는 종양 세포가 제공된다. D-람노즈를 포함하는 글리칸을 함유하는 종양 세포가 특히 바람직하다. D-람노즈는 영지(Ganoderma lucidum) 다당류의 구성 블록(building block)이다. 이들 다당류는 전통적인 중국 의약에서 면역학적 효과기 세포의 활성을 향상시키기 위해 사용되며: NK 세포 및 림포카인 활성화된 킬러 세포는 활성화되고 대식세포의 포식작용 및 세포독성은 증가된다[참조: Zhu et al., 2007, Journal of Ethnopharmacology 111 (2), 219-226]. 이러한 세포는 예를 들면, 활성 면역화 시도에서와 같이 제공된 종양 세포에 대해 면역반응을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
추가의 국면에서, 본 발명은 제4 국면에 따른 분자의 조성물을 제공한다.
제5 국면에서, 본 발명은
i) 70 내지 95%, 즉, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 및 95%, 바람직하게는 80%의 G0-GlcNac, G0, G1, 및/또는 G2 복합체 유형 N-글리칸, 및
ii) 5 내지 30%, 즉, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 및 30%, 바람직하게는 20%의 고 만노즈 유형 N-글리칸을 포함하는 당단백질을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서, 당단백질의 복합체 유형 N-글리칸은, 푸코즈를 함유하지 않거나 푸코즈를 실질적으로 함유하지 않는다. 바람직하게는 조성물의 당단백질은 특수한 항체에서 상기 나타낸 바람직한 당단백질이다.
조성물내에 복합체 유형의 N-글리칸 중 70% 내지 80%, 바람직하게는 약 75%가 G0이고 20% 내지 30%, 바람직하게는 약 25%가 G0-GlcNac, G1 및/또는 G2 복합체 유형 N-글리칸이며/이거나, 고 만노즈 유형 N-글리칸 중 45% 내지 55%, 바람직하게는 약 50%가 man5 글리칸이고 45 내지 55%, 바람직하게는 약 50%가 man6, man7 및/또는 man8 N-글리칸인 것이 특히 바람직하다. 각각의 경우에 구성원은 100%까지 가해진 것으로 이해된다.
조성물내 복합체 유형 N-글리칸중 70% 내지 90%, 바람직하게는 약 80%가 G0이고 10% 내지 30%, 바람직하게는 약 20%가 G0-GlcNac, G1 및/또는 G2 복합체 유형 N-글리칸이고/이거나 고 만노즈 유형 N-글리칸중 60% 내지 85%, 바람직하게는 약 70%가 man5 글리칸이며 15 내지 40%, 바람직하게는 약 30%가 man6, man7 및/또는 man8 N-글리칸인 것이 또한 특히 바람직하다. 각 경우에 구성원은 100%까지 가해진 것으로 이해된다.
당단백질은 본 발명의 제1 국면과 관련하여 바람직한 것으로 나타낸 것들, 특히 항체, 예를 들면, IgG1s, IgG2s, IgG3s 또는 IgG4가 바람직하며, 여기서, 이들 항체는 바람직하게는 모, 비-변형된 세포(예를 들면, 척추동물 세포와 같은 진핵 세포)내에서 생산된 항체 조성물보다 더 높은 ADCC 활성을 갖는다.
ADCC는 종양(암) 세포에 대해 지시된 항체가 이들의 효과를 억제하는 우세한 메카니즘이다. ADCC는 또한 특이적인 면역 세포를 제거하여 자가면역질병에서 발병을 차단하기 위해 사용될 수 있다.
바이러스 및 세균 감염을 포함하는 각종의 질병은 본 발명에 따른 고 ADCC 활성을 갖는 항체를 사용하여 바이러스 또는 세균으로 감염된 세포의 증식을 억제함으로써 예방하고 치료할 수 있다.
제6 국면에서, 본 발명은 단백질, 바람직하게는 비-원핵세포 단백질, 바람직하게는 바이러스 또는 포유동물 단백질, 또는 지질, 바람직하게는 비-원핵세포 지질, 예를 들면, D-람노즈, D-페로사민, 데옥시-D-탈로즈, 6-데옥시-D-알트로즈, 4-케토-3,6-디데옥시-D-만노즈, 및/또는 L-콜리토즈를 함유하는 당부분을 포함하는 글리코스핑고지질을 제공한다. 바람직하게는, 바이러스 단백질 및/또는 지질은 외피보유 바이러스의 외피내에 포함된다. 또한, 이러한 단백질 및/또는 지질을 포함하는 진핵세포, 바람직하게는 척추동물, 보다 바람직하게는 포유동물 및 가장 바람직하게는 사람 세포(동종이계 또는 자가 종양 세포)가 제공된다.
바람직하게는, 단백질 또는 지질은 이의 당부분에 D-람노즈, D-페로사민, 데옥시-D-탈로즈, 6-데옥시-D-알트로즈, 4-케토-3,6-디데옥시-D-만노즈, 및/또는 L-콜리토즈, 보다 바람직하게는 D-람노즈 및/또는 D-페로사민, 및 이의 당부분에 없거나 또는 감소된 양의 L-푸코즈를 포함한다. 제6 국면의 단백질은 또한 본 발명의 방법의 바람직하고 특히 바람직한 국면을 사용한 결과인 모든 특성들을 가질 수 있다.
D-람노즈, D-페로사민, 데옥시-D-탈로즈, 6-데옥시-D-알트로즈, 4-케토-3,6-디데옥시-D-만노즈, 및/또는 L-콜리토즈와 같은 인공 당은 예를 들면, 세균 표면상의 전하를 중화시킴으로써 양이온성 펩타이드, 예를 들면, 폴리믹신 B, 데펜신 등에 대해 내성을 부여한다는 것이 알려져 있다(참조: Breazeale et al., 2003, The Journal of Biological Chemistry, 278, 24731-24739).
데펜신은 예를 들면, 진핵세포(예: 척추동물)에서 발견된 작은, 시스테인이 풍부한 양이온성 단백질이다. 이들은 세균, 진균 및 많은 외피보유 및 비-외피보유 바이러스에 대해 활성이다. 이들은 6개(척추동물에서) 내지 8개의 보존된 시스테인 잔기를 포함하는 18 내지 45개 아미노산으로 이루어진다. 면역계의 진핵 세포(예: 척추동물)는, 예를 들면, 호중구 과립구 및 거의 모든 상피 세포내에서 식세포된 세균을 사멸하는데 있어 보조하기 위해 이들 펩타이드를 함유한다.
따라서, 이들의 당부분에 D-람노즈, D-페로사민, 데옥시-D-탈로즈, 6-데옥시-D-알트로즈, 4-케토-3,6-디데옥시-D-만노즈, 및/또는 L-콜리토즈, 바람직하게는 양이온성 아미노 당 D-페로사민을 함유하는 바이러스 단백질을 포함하는 외피보유 바이러스의 확립이 예를 들면, 벡터로서 유전자 치료요법에서 매우 유용한데, 이는, 이들 바이러스가 데펜신 및, 선천적인 면역 방어의 다른 양이온성 펩타이드의 공격에 대해 내성일 수 있기 때문이다. 이의 당부분에 하나 이상의 당 잔기 D-람노즈, D-페로사민, 데옥시-D-탈로즈, 6-데옥시-D-알트로즈, 4-케토-3,6-디데옥시-D-만노즈, 및/또는 L-콜리토즈를 함유하는 바이러스 또는 바이러스 당단백질의 생산이 우수한 면역 반응을 유도하는데 매우 유용할 수 있다. 이들 당 잔기는 천연적으로 포유동물 당단백질에 존재하지 않는다. 그러나, 이들은 세균의 당단백질 및 지다당류에서 흔하다. 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) RMD 서열의 기원은 낭성 섬유증(CF)을 지닌 환자 및 면역약화된 숙주에 의해 직면된 가장 중요한 세균 병원체 중 하나이다.
특히, 당 잔기 D-페로사민을 함유하는 단백질 또는 당 잔기 D-페로사민을 함유하는 바이러스 단백질을 포함하는 외피보유 바이러스의 확립이, D-페로사민의 양이온성으로 인하여 유리하다. 이의 외피내에 당 잔기 D-페로사민을 함유하는 당단백질을 포함하는 바이러스는 선천적인 면역 방어에 대해 상기 바이러스를 보호할 수 있는 양이온성 표면 전하를 갖는다.
제7 국면에서, 본 발명은 기질로서 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 사용하는 효소를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 (제1의) 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 결합된 하나 이상의 척추동물 발현 조절 서열을 포함하는 발현 단위를 제공하며, 여기서, 효소는 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 GDP-L-푸코즈로 전환하는 반응을 촉매하지 않는다.
발현 단위는, 하나 이상의 척추동물 발현 조절 서열 및 기질로서 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 사용하는 효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 (제1의) 폴리뉴클레오타이드가 예를 들면, 플라스미드, 코스미드(cosmid), 바이러스 등에 통합될 수 있는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 어떠한 발현 시스템일 수 있다.
바람직하게는, 발현 단위내에 포함된 하나 이상의 척추동물 발현 조절 서열은 기질로서 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 사용하는 효소를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 (제1의) 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 결합하여 척추동물 세포, 예를 들면, CHO 또는 HeLa 세포내에서 기질로서 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 사용하는 효소를 암호화하는 핵산 서열의 발현을 허용한다.
바람직하게는, 발현 벡터, 예를 들어, 플라스미드 벡터는 척추동물 세포의 세포질내에서 기질로서 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 사용하는 효소를 암호화하는 핵산 서열의 일시적인 발현을 허용하거나 상기 세포의 게놈내로 상기 서열의 통합 후 척추동물 세포내에서 기질로서 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 사용하는 효소를 암호화하는 핵산 서열의 안정한 발현을 허용한다.
기질로서 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 사용하는 효소가 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈 리덕타제(RMD), GDP-페로사민 신테타제(Per), GDP-6-데옥시-D-탈로즈 신테타제(GTS), GDP-푸코즈 신테타제 Cys109Ser-(GFS-Cys109Ser) 돌연변이체, GDP-4-케토-6-데옥시만노즈-3-데하이드라타제(ColD), 바람직하게는 GDP-L-콜리토즈 신테타제(ColC)와 결합하는 GDP-4-케토-6-데옥시만노즈-3-데하이드라타제(ColD), 및 이의 변이체로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 특히 바람직하다.
바람직하게는, 발현 단위는 또한 바람직하게는 하나 이상의 척추동물 발현 조절 성분, 예를 들면, 프로모터에 작동적으로 결합되고, 바람직하게는 발현 벡터, 예를 들면, 플라스미드 벡터에 포함됨으로써, 척추동물 세포, 예를 들면, CHO 세포 HeLa 세포 또는 종양 세포, 바람직하게는 자가 종양 세포내에서 상기 글리코실트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산 서열의 발현을 허용하는, GDP-D-람노즈, GDP-D-페로사민, GDP-데옥시-D-탈로즈, GDP-6-데옥시-D-알트로즈, GDP-4-케토-3,6-디데옥시-D-만노즈, 또는 GDP-L-콜리토즈에 대한 글리코실트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 (제2의) 폴리뉴클레오타이드, 및 임의로 바람직하게는 하나 이상의 척추동물 발현 조절 성분, 예를 들면, 프로모터에 작동적으로 결합되고, 바람직하게는 발현 벡터, 예를 들면, 플라스미드 벡터에 포함됨으로써 척추동물 세포, 예를 들면, CHO 세포, HeLa 세포 또는 종양 세포, 바람직하게는 자가 종양 세포내에서 상기 GDP-데옥시헥소즈 당 뉴클레오타이드 수송인자를 암호화하는 핵산 서열의 발현을 허용하는, GDP-D-람노즈, GDP-D-페로사민, GDP-데옥시-D-탈로즈, GDP-6-데옥시-D-알트로즈, GDP-4-케토-3,6-디데옥시-D-만노즈, 또는 GDP-L-콜리토즈에 대한 GDP-데옥시헥소즈 당 뉴클레오타이드 수송인자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 (제3의) 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다.
상기 제1, 제2 및 임의로 제3의 폴리뉴클레오타이드는 발현 벡터, 예를 들면, 일시적인 발현 벡터 또는 세포의 게놈내로 통합되는 벡터내로 별개로 통합될 수 있다. 달리는, 상기 제1, 제2 및 임의로 제3의 폴리뉴클레오타이드는 하나의 발현 벡터에 포함될 수 있다. 발현은 1개의 프로모터, 2개의 프로모터, 또는 3개의 프로모터로부터 기원할 수 있다. 앞서의 경우에서, 제1, 제2, 및 임의로 제3의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질이 단일 전사체로서 전사되고 IRES에 의해서만 분리되는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 발현 단위는 효소 RMD를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제1의 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 결합된 하나 이상의 척추동물 발현 조절 서열, GDP-D-람노즈에 대한 글리코실트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제2의 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 결합된 하나 이상의 척추동물 발현 조절 서열, 및 임의로 바람직하게는 1개의 발현 벡터, 2개의 발현 벡터 또는 3개의 발현 벡터 각각에 포함된, GDP-D-람노즈에 대한 GDP-데옥시헥소즈 당 뉴클레오타이드 수송인자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제3의 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 결합된 하나 이상의 척추동물 발현 조절 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 양태에서, 발현 단위는 제1 폴리뉴클레오타이드내에 포함된 효소 RMD를 암호화하는 핵산 서열, 제2 폴리뉴클레오타이드내에 포함된 GDP-D-람노즈에 대한 글리코실트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산 서열, 및 임의로 제3 폴리뉴클레오타이드내에 GDP-D-람노즈에 대한 GDP-데옥시헥소즈 당 뉴클레오타이드 수송인자를 암호화하는 핵산 서열의 발현을 조절하는 하나 이상의 척추동물 발현 조절 서열을 포함하며, 여기서, 제1, 제2, 및 임의로 제3의 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는 발현 벡터에 포함된 IRES에 의해 서로로부터 분리된다.
본 발명의 제7 국면에 따른 발현 단위는 의약에서, 특히 면역 자극으로부터 유리한 질병, 특히 종양의 치료요법 또는 예방용 백신의 제조시 사용될 수 있다.
추가로, 제7 국면과 관련하여, 특히 발현될 각종 핵산, 예를 들면, GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 사용하는 효소의 중간 또는 낮은 발현을 구동시키는 발현 조절 성분을 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 관련된, 본 발명의 제1 국면의 모든 추가의 바람직한 및 특히 바람직한 양태가 제7 국면과 관련하여 동등하게 바람직하다.
많은 경우에, 생약 회사는 목적한 삽입유전자를 바람직한 수준에서 발현하는 효과적인 약제학적 생산자 세포주를 생성하고 개발하기 위해 유의적인 시간을 사용하고 큰 노력을 해왔다. 목적한 삽입유전자가 향상된 ADCC 효과기로부터 유리할 수 있는 치료학적 항체인 경우, 고 생산자 세포가 N-당부분에 코어-푸코즈를 부착시킬 수 없거나 인공 당을 N-당부분에 부착시킬 수 있는 방식으로 생산자 세포주를 추가로 조작하는 것이 매우 바람직하다.
바람직하게는, 위에서 이미 언급한 바와 같이, 발현 단위는 GDP-D-람노즈, GDP-D-페로사민, GDP-데옥시-D-탈로즈, GDP-6-데옥시-D-알트로즈, GDP-4-케토-3,6-디데옥시-D-만노즈, 또는 GDP-L-콜리토즈에 대한 글리코실트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제2의 폴리뉴클레오타이드, 및 임의로 GDP-D-람노즈, GDP-D-페로사민, GDP-데옥시-D-탈로즈, GDP-6-데옥시-D-알트로즈, GDP-4-케토-3,6-디데옥시-D-만노즈, 또는 GDP-L-콜리토즈에 대한 GDP-데옥시헥소즈 당 뉴클레오타이드 수송인자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제3의 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. GDP-D-람노즈, GDP-D-페로사민, GDP-데옥시-D-탈로즈, GDP-6-데옥시-D-알트로즈, GDP-4-케토-3,6-디데옥시-D-만노즈, 또는 GDP-L-콜리토즈에 대한 글리코실트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제2의 폴리뉴클레오타이드가 하나 이상의 척추동물 발현 조절 서열에 작동적으로 결합되어 척추동물 세포, 예를 들면, HeLa 또는 CHO 세포내에서 상기 글리코실트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산 서열의 발현을 허용하는 것이 바람직하다. GDP-D-람노즈, GDP-D-페로사민, GDP-데옥시-D-탈로즈, GDP-6-데옥시-D-알트로즈, GDP-4-케토-3,6-디데옥시-D-만노즈, 또는 GDP-L-콜리토즈에 대한 GDP-데옥시헥소즈 당 뉴클레오타이드 수송인자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제3의 폴리뉴클레오타이드를 하나 이상의 척추동물 발현 조절 서열에 작동적으로 결합시켜 척추동물 세포, 예를 들면, HeLa 또는 CHO 세포내에서 상기 GDP-데옥시헥소즈 당 뉴클레오타이드 수송인자를 암호화하는 핵산 서열의 발현을 허용하는 것이 또한 바람직하다.
서로에 대한 상이한 핵산 서열의 발현 비는 카피 수 및 척추동물 세포의 게놈내 통합의 부위 둘다에 의존한다. 표준 스크리닝 공정에 의해, 개개의 유전자 생성물을 바람직한 비로 발현하는 세포 클론을 분리하는 것도 가능하다.
상기 바람직한 발현 단위는 이들이 푸코즈(예를 들면, D-람노즈, D-페로사민, 데옥시-D-탈로즈, 또는 6-데옥시-D-알트로즈)외 다른 인공 당을 당단백질 또는 당지질의 초기의 당구조물에 부착할 수 있도록 하는 방식으로 기존의 세포주(예: CHO, HeLa)에 용이하게 적용시킬 수 있다. 이러한 발현 단위는 또한 이들 푸코즈외 다른 인공 당(예: D-람노즈)을 당단백질의 초기의 당구조물에 부착할 수 있도록 함으로써, 예를 들면, IgG1/+D-람노즈와 같은 인공의 당화 구조를 갖는 항체를 생산하는 방식으로 이미 유전적으로 가공된 세포주(예: CHO IgG1)에 용이하게 적용할 수 있다.
바람직하게는, 발현 단위는 목적 단백질, 예를 들면, IgG1을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 추가의 폴리뉴클레오타이드(제2, 제3, 또는 제4의 폴리뉴클레오타이드로서)를 포함한다. 목적 단백질, 예를 들면, IgG1을 암호화하는 핵산을 포함하는 추가의 폴리펩타이드를 발현 조절 서열에 작동적으로 결합시켜 척추동물 세포, 예를 들면, HeLa 또는 CHO 세포내에서 상기 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 발현을 허용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 제7 국면의 발현 단위와 관련하여, 본 발명의 제1 및 제2 국면에서 교시된, 모든 성분들, 바람직하게는 핵산을 암호화하는 효소, 발현 조절 성분, 기질로서 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 사용하고 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 GDP-L-푸코즈로 전환하는 반응을 촉매하지 않는 효소를 암호화하는 핵산 서열이 유사하게 바람직하다.
제8 국면에서, 본 발명은,
i) 기질로서 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 사용하는 효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 제1의 폴리뉴클레오타이드, 및
ii) 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제2의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 당부분에 푸코즈를 정상적으로 포함하는 단백질에서 상기 당부분에 푸코즈가 결여되거나 푸코즈 양이 감소된, 단백질을 생산하기 위한 (변형된) 진핵 세포에 관한 것이며, 여기서, 효소는 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 GDP-L-푸코즈로 전환시키는 반응을 촉매하지 않는다.
진핵 세포와 관련하여, 본 발명의 제1의 국면의 척추동물 세포와 관련하여 앞서 기술된 모든 바람직한 및 특히 바람직한 양태가 유사하게 바람직하다.
바람직하게는, 진핵 세포는 바람직하게는 본 발명의 제1 국면과 관련하여 위에서 요약한 바와 같은 척추동물, 예를 들면, 포유동물, 어류, 양서류, 파충류 세포 또는 조류 세포, 또는 곤충 세포이다. 바큘로바이러스 발현 시스템과 함께 사용된 곤충 세포, 예를 들면, Sf9 또는 Hi5 세포가 고 수율 및 속도로 인하여 당단백질을 생산하는데 바람직하다. 그러나, 곤충 세포로부터의 당단백질은 코어 알파 1,3-푸코즈를 함유할 수 있다. 당 잔기는 곤충 기원한 당단백질에 대한 항체, 특히 IgE 항체에 대한 주요 확대에 기여한다. 이들은 곤충 당단백질에 대한 알레르기 반응의 기초이다.
기질로서 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 사용하고, GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 GDP-L-푸코즈로 전환하는 반응을 촉매하지 않는 적어도 하나의 효소를 포함하는 곤충세포는 이의 글리칸에서 푸코즈가 결여되거나 푸코즈가 감소될 것이다. 이는 이러한 당단백질에 대한 알레르기 반응을 감소시키거나 제거할 것이다.
위에서 언급한(변형된) 진핵 세포는 또한 기질로서 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 사용하는 효소를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 예를 들면, 기질로서 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈를 사용하는 상이한 효소를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다(본 발명의 제1 국면 참조).
제9 국면에서, 본 발명은
i) 제8 국면에 따른 진핵 세포를 제공하는 단계,
ii) 상기 세포내에서 제1의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 효소 및 제2의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질을 발현시키는 단계, 및
iii) 상기 세포로부터 단백질을 분리하는 단계를 포함하여, 당부분에 푸코즈를 정상적으로 포함하는 단백질에서 상기 당부분에 푸코즈가 결여되거나 푸코즈 양이 감소된, 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 진핵 세포를 사용하는 방법과 관련하여, 본 발명의 제1의 국면의 척추동물 세포 및 본 발명의 제2의 국면의 방법과 관련하여 앞서 기술된 모든 바람직한 및 특히 바람직한 양태들은 본 발명의 제9의 국면과 관련하여 유사하게 바람직하다.
본 발명의 제10의 국면은 제9의 국면의 방법에 의해 수득가능한, 단백질의 당부분에 푸코즈가 결여되거나 푸코즈의 양이 감소된 단백질에 관한 것이다.
본 발명의 각종 변형 및 변화는 본 발명의 영역으로부터 벗어남이 없이 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 비록 본 발명이 구체적인 바람직한 양태와 관련하여 기술되어 있다고 해도, 특허청구된 본 발명은 이러한 구체적인 양태에 과도하게 한정되지 않아야 함이 이해되어야 한다. 사실상, 관련 분야에서 당해 분야의 숙련가에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 기술된 방식의 각종 변형은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
다음 도면 및 실시예들은 본 발명을 단지 나열하기 위함이며 어떠한 방식으로도 첨부된 특허청구범위에 의해 나타난 바와 같은 본 발명의 영역을 제한하는 것으로 고려되어서는 안된다.
도 1은 진핵 세포(예: 척추동물 세포)에서 푸코즈 구조 경로 및 드 노보 경로의 개관을 나타낸다. 푸코즈의 부재하에서, 세포는 구조 경로를 통해 GDP-푸코즈를 합성할 수 없다(참조: 우측 패널). 드 노보 경로는 중간체 GDP-4-케토-6-데옥시만노즈의 척추동물 세포내에 전형적으로 발생하지 않는 막다른(dead end) 생성물로의 효소적 전환에 의해 차단될 수 있다(참조: 좌측 패널). 편향하는 효소(deflecting enzyme)가 RMD인 경우, 예를 들면, 막다른 생성물은 GDP-D-람노즈이다. GDP-D-람노즈와 같은 GDP-데옥시헥소즈는 GMD-효소에서 피드백 억제(feedback inhibition)를 발휘함으로써 푸코즈 드 노보 경로 및 대안의 GDP-람노즈 합성을 추가로 차단할 수 있다.
도 2는 RMD 삽입유전자를 안정하게 과발현하는 RMD-CHO-IgG 세포의 GFP-형광성을 나타낸다.
도 3은 RMD-삽입유전자를 발현하는 클론의 RT-PCR 분석을 나타낸다. 레인 M= bp-DNA-마커, 레인 1: RMD-CHO-IgG 클론 1; 레인 2: RMD-CHO-IgG 클론 2; 레인 3: RMD-CHO-IgG 클론 3; 레인 4: RMD-CHO-IgG 클론 4; 레인 5: RMD-CHO-IgG 클론 5; 레인 6: RMD-CHO-IgG 클론 6; 레인 7: CHO-IgG 모 클론; 레인 8: 음성 PCR 대조군. RMD 밴드는 모든 RMD-형질감염된 클론에서 가시적이다.
도 4는 CHO-IgG (B) 및 RMD-CHO-IgG (A) 세포의 IgG1으로부터 방출된 과메틸화된 N-글리칸의 MALDI MS 프로파일의 개요적 비교를 나타낸다. PNGase F 분해에 의해 방출된 항체 Fc 올리고당류는 smartbeam-IITM 레이저가 장착된 UltraFlex III TOF/TOF 질량 분광계를 사용하여 분석하였다. m/z 값 피크는 나트륨-관련된 올리고당류 이온에 상응한다. 모든 표지된 [M + Na]+ 분자 이온 시그날은 주석달린 바와 같이 지정될 수 있다. 패널 A에 나타낸 MALDI-스펙트럼에서 주요 m/z-피크의 164Da 이동은 푸코즈 손실의 지표이다. 각각의 피크의 개략적인 올리고당류 구조는 상기 각각의 주석달린 피크에 나열된다. RMD 삽입유전자를 안정하게 과발현하는 RMD-CHO-IgG 세포에서 발현된 치료학적 IgG1 항체로부터 수득된 N-당구조물은 부착된 푸코즈-잔기를 완전히 비우며 MALDI-Peak 상대적 강도를 기준으로 하여 비교적 보다 많은 양의 고 만노즈 구조를 함유하는 반면(패널 A; 둘러싸인 우세한 고 만노즈 구조), 변형되지 않은 CHO-IgG 모 세포에서 발현된 치료학적 IgG1 항체로부터 수득된 N-당구조물은 코어-푸코실화되어 있고 유의적으로 보다 적은 양의 고 만노즈 구조물을 함유한다(푸코즈 잔기 = 둘러싸인 검은색 삼각형; 패널 B).
도 5는 (A) WT CHO 세포; (B) RMD-CHO 클론 H1; (C) RMD-CHO 클론 H2; (D) RMD-CHO 클론 H3을 사용하여 생산된 데시알릴화된 IgG N-글리칸의 MALDI-TOF 스펙트럼을 나타낸다. 모든 분자 이온은 나트륨화된 [M+Na+] 또는 칼륨화된 [M+K+] 형태로 존재한다(검은색 교차). 암 회색 원, Man; 담회색 원, Gal; 검은색 사각형, GlcNAc; 검은색 삼각형, Fuc; 백색 교차는 어떠한 탄수화물 물질도 함유하지 않는다.
도 6은 (A)에서 혈장의 부재하에서 WT IgG 및 아푸코실화된 IgG에 대한 FcgRIIIa-His(Phe158)의 결합 곡선을 나타낸다. FcγRIIIa-결합은 ELISA에 의해 포획 시약으로서 FcγRIIIa-His, 검출 시약으로서 항-사람 IgG 퍼옥시다제-접합된 항체 및 색원체 기질로서 테트라메틸벤지딘(TMB)에 의해 검출되었다. 점들은 450 nm, n=2에서 퍼옥시다제 반응한 TMB의 중간 흡수를 나타낸다. 바아는 SD를 나타낸다. 개방 원 = 야생형 푸코실화된 IgG(WT), 밀폐된 원 = 클론 H1(H1)으로부터 기원한 아푸코실화된 IgG; 밀폐된 사각형 - 클론 H2(H2)로부터 기원한 푸코실화된 IgG; 위쪽에 꼭지점이 있는 밀폐된 삼각형 = 클론 H3(H3)로부터 기원한 아푸코실화된 IgG. (B)에서 WT IgG에 걸쳐 아푸코실화된 IgG의 FcγRIII-결합에 있어서 상대적인 배 증가가 나타나 있다. FcγRIII-결합에 있어서 상대적인 배 증가는 EC50 값으로부터 계산되었다. WT, 야생형 푸코실화된 IgG; H1, 클론 H1으로부터 기원한 아푸코실화된 IgG; H2, 클론 H2로부터 기원한 아푸코실화된 IgG; H3, 클론 H3으로부터 기원한 아푸코실화된 IgG.
도 7은 ADCC-활성 검정을 위한 NK-세포의 제조 및 분석을 나타낸다. (A) ADCC 검정에서 사용된 분리된 원시 NK 세포의 순도의 수준을 나타내는 도트 플롯. 원시 NK 세포는 자기 비드 분리에 의해 건강한 사람 공여자의 전혈로부터 분리하였다. 이후에, 분리된 NK 세포를 유동 세포분석법에 의해 NK-세포 마커 CD16 및 CD56에 대한 항체를 사용하여 분석하였다. (B) 분리된 NK 세포의 수행능. 분리된 NK 세포의 세포분해 활성을 측정하기 위하여, 칼세인 AM 염색된 K562 표적 세포를 단독으로, NK-세포와 함께 또는 세포 분해제 사포닌과 함께 4시간 동안 항온처리하였다. 항온처리된 표적 세포로부터 방출된 평균 형광성 강도(MFI)는 세포 분해 정도를 간접적으로 나타낸다. 자발적인 세포 분해를 위해 수득된 MFI로부터 감해진 NK-매개된 세포 분해에 대해 관측된 MFI는 ADCC 검정에서 관측될 최대의 가능한 특이적인 MFI를 나타낸다. NK-매개된 분해가 총 분해로부터 수득된 MFI-수준에 완전히 도달하지 않음에 주목한다.
도 8은 CHO 및 RMD-CHO로부터 기원한 아푸코실화된 및 푸코실화된 IgG의 시험관내 ADCC-활성을 나타낸다. 점들은 제공된 IgG 농도(%)에서 평균 특이적인 세포 분해(%)를 나타낸다, n=4; 바들은 +/-SD를 나타낸다, 야생형 IgG(개방 사각형), 클론 H1으로부터 기원한 아푸코실화된 IgG(밀폐된 원), 클론 H2로부터 기원한 아푸코실화된 IgG(아래쪽에 꼭지점이 있는 밀폐된 삼각형) 및 클론 H3으로부터 기원한 아푸코실화된 IgG(위쪽에 꼭지점이 있는 밀폐된 삼각형). 비교가능한 데이타는, SK-BR-3 세포가 표적 세포로 사용된 경우 수득되었다(데이타는 나타내지 않음).
도 9는 (A) 변형되지 않은 CHO 세포 및 (C) RMD-CHO 클론 H2의 세포질성 분획으로부터 가수분해된 단당류의 HPAEC-PAD 프로파일을 나타낸다. (B), 10 pmol/μl L-람노즈로 스파이크된 (A), 및 (D), 10 pmol/μl L-람노즈로 스파이크된 (C). 단당류는 TFA 가수분해 후 재-N-아세틸화되지 않았으므로, GlcNAc는 GlcNH2로서 측정하였다. 선택된 조건하에서, L-람노즈 피크는 약 15.5분의 보유 시간에서 용출한다. 변형된 클론 H2로부터의 세포 분해물의 HPAEC-PAD 크로마토그램으로부터 푸코즈 피크의 부재에 주목한다.
도 10은 (A), WT CHO 및 (C), 변형된 RMD-CHO 클론 H2, (B), 10 pmol/μl L-람노즈로 스파이크된 (A) 및 (D), 10 pmol/μl L-람노즈로 스파이크된 (C)로부터의 IgG N-글리칸으로부터 방출된 단당류의 HPAEC-PAD 프로파일을 나타낸다. 단당류는 TFA 가수분해 후 재-N-아세틸화되지 않았으므로, GlcNAc는 GlcNH2로서 측정되었다. 선택된 조건하에서, L-람노즈 피크는 약 15.5 분의 보유 시간에서 용출한다. RMD-CHO 클론 H2로부터 기원한 IgG N-글리칸 시료의 HPAEC-PAD 크로마토그램으로부터의 푸코즈 피크의 부재에 주목한다.
도 2는 RMD 삽입유전자를 안정하게 과발현하는 RMD-CHO-IgG 세포의 GFP-형광성을 나타낸다.
도 3은 RMD-삽입유전자를 발현하는 클론의 RT-PCR 분석을 나타낸다. 레인 M= bp-DNA-마커, 레인 1: RMD-CHO-IgG 클론 1; 레인 2: RMD-CHO-IgG 클론 2; 레인 3: RMD-CHO-IgG 클론 3; 레인 4: RMD-CHO-IgG 클론 4; 레인 5: RMD-CHO-IgG 클론 5; 레인 6: RMD-CHO-IgG 클론 6; 레인 7: CHO-IgG 모 클론; 레인 8: 음성 PCR 대조군. RMD 밴드는 모든 RMD-형질감염된 클론에서 가시적이다.
도 4는 CHO-IgG (B) 및 RMD-CHO-IgG (A) 세포의 IgG1으로부터 방출된 과메틸화된 N-글리칸의 MALDI MS 프로파일의 개요적 비교를 나타낸다. PNGase F 분해에 의해 방출된 항체 Fc 올리고당류는 smartbeam-IITM 레이저가 장착된 UltraFlex III TOF/TOF 질량 분광계를 사용하여 분석하였다. m/z 값 피크는 나트륨-관련된 올리고당류 이온에 상응한다. 모든 표지된 [M + Na]+ 분자 이온 시그날은 주석달린 바와 같이 지정될 수 있다. 패널 A에 나타낸 MALDI-스펙트럼에서 주요 m/z-피크의 164Da 이동은 푸코즈 손실의 지표이다. 각각의 피크의 개략적인 올리고당류 구조는 상기 각각의 주석달린 피크에 나열된다. RMD 삽입유전자를 안정하게 과발현하는 RMD-CHO-IgG 세포에서 발현된 치료학적 IgG1 항체로부터 수득된 N-당구조물은 부착된 푸코즈-잔기를 완전히 비우며 MALDI-Peak 상대적 강도를 기준으로 하여 비교적 보다 많은 양의 고 만노즈 구조를 함유하는 반면(패널 A; 둘러싸인 우세한 고 만노즈 구조), 변형되지 않은 CHO-IgG 모 세포에서 발현된 치료학적 IgG1 항체로부터 수득된 N-당구조물은 코어-푸코실화되어 있고 유의적으로 보다 적은 양의 고 만노즈 구조물을 함유한다(푸코즈 잔기 = 둘러싸인 검은색 삼각형; 패널 B).
도 5는 (A) WT CHO 세포; (B) RMD-CHO 클론 H1; (C) RMD-CHO 클론 H2; (D) RMD-CHO 클론 H3을 사용하여 생산된 데시알릴화된 IgG N-글리칸의 MALDI-TOF 스펙트럼을 나타낸다. 모든 분자 이온은 나트륨화된 [M+Na+] 또는 칼륨화된 [M+K+] 형태로 존재한다(검은색 교차). 암 회색 원, Man; 담회색 원, Gal; 검은색 사각형, GlcNAc; 검은색 삼각형, Fuc; 백색 교차는 어떠한 탄수화물 물질도 함유하지 않는다.
도 6은 (A)에서 혈장의 부재하에서 WT IgG 및 아푸코실화된 IgG에 대한 FcgRIIIa-His(Phe158)의 결합 곡선을 나타낸다. FcγRIIIa-결합은 ELISA에 의해 포획 시약으로서 FcγRIIIa-His, 검출 시약으로서 항-사람 IgG 퍼옥시다제-접합된 항체 및 색원체 기질로서 테트라메틸벤지딘(TMB)에 의해 검출되었다. 점들은 450 nm, n=2에서 퍼옥시다제 반응한 TMB의 중간 흡수를 나타낸다. 바아는 SD를 나타낸다. 개방 원 = 야생형 푸코실화된 IgG(WT), 밀폐된 원 = 클론 H1(H1)으로부터 기원한 아푸코실화된 IgG; 밀폐된 사각형 - 클론 H2(H2)로부터 기원한 푸코실화된 IgG; 위쪽에 꼭지점이 있는 밀폐된 삼각형 = 클론 H3(H3)로부터 기원한 아푸코실화된 IgG. (B)에서 WT IgG에 걸쳐 아푸코실화된 IgG의 FcγRIII-결합에 있어서 상대적인 배 증가가 나타나 있다. FcγRIII-결합에 있어서 상대적인 배 증가는 EC50 값으로부터 계산되었다. WT, 야생형 푸코실화된 IgG; H1, 클론 H1으로부터 기원한 아푸코실화된 IgG; H2, 클론 H2로부터 기원한 아푸코실화된 IgG; H3, 클론 H3으로부터 기원한 아푸코실화된 IgG.
도 7은 ADCC-활성 검정을 위한 NK-세포의 제조 및 분석을 나타낸다. (A) ADCC 검정에서 사용된 분리된 원시 NK 세포의 순도의 수준을 나타내는 도트 플롯. 원시 NK 세포는 자기 비드 분리에 의해 건강한 사람 공여자의 전혈로부터 분리하였다. 이후에, 분리된 NK 세포를 유동 세포분석법에 의해 NK-세포 마커 CD16 및 CD56에 대한 항체를 사용하여 분석하였다. (B) 분리된 NK 세포의 수행능. 분리된 NK 세포의 세포분해 활성을 측정하기 위하여, 칼세인 AM 염색된 K562 표적 세포를 단독으로, NK-세포와 함께 또는 세포 분해제 사포닌과 함께 4시간 동안 항온처리하였다. 항온처리된 표적 세포로부터 방출된 평균 형광성 강도(MFI)는 세포 분해 정도를 간접적으로 나타낸다. 자발적인 세포 분해를 위해 수득된 MFI로부터 감해진 NK-매개된 세포 분해에 대해 관측된 MFI는 ADCC 검정에서 관측될 최대의 가능한 특이적인 MFI를 나타낸다. NK-매개된 분해가 총 분해로부터 수득된 MFI-수준에 완전히 도달하지 않음에 주목한다.
도 8은 CHO 및 RMD-CHO로부터 기원한 아푸코실화된 및 푸코실화된 IgG의 시험관내 ADCC-활성을 나타낸다. 점들은 제공된 IgG 농도(%)에서 평균 특이적인 세포 분해(%)를 나타낸다, n=4; 바들은 +/-SD를 나타낸다, 야생형 IgG(개방 사각형), 클론 H1으로부터 기원한 아푸코실화된 IgG(밀폐된 원), 클론 H2로부터 기원한 아푸코실화된 IgG(아래쪽에 꼭지점이 있는 밀폐된 삼각형) 및 클론 H3으로부터 기원한 아푸코실화된 IgG(위쪽에 꼭지점이 있는 밀폐된 삼각형). 비교가능한 데이타는, SK-BR-3 세포가 표적 세포로 사용된 경우 수득되었다(데이타는 나타내지 않음).
도 9는 (A) 변형되지 않은 CHO 세포 및 (C) RMD-CHO 클론 H2의 세포질성 분획으로부터 가수분해된 단당류의 HPAEC-PAD 프로파일을 나타낸다. (B), 10 pmol/μl L-람노즈로 스파이크된 (A), 및 (D), 10 pmol/μl L-람노즈로 스파이크된 (C). 단당류는 TFA 가수분해 후 재-N-아세틸화되지 않았으므로, GlcNAc는 GlcNH2로서 측정하였다. 선택된 조건하에서, L-람노즈 피크는 약 15.5분의 보유 시간에서 용출한다. 변형된 클론 H2로부터의 세포 분해물의 HPAEC-PAD 크로마토그램으로부터 푸코즈 피크의 부재에 주목한다.
도 10은 (A), WT CHO 및 (C), 변형된 RMD-CHO 클론 H2, (B), 10 pmol/μl L-람노즈로 스파이크된 (A) 및 (D), 10 pmol/μl L-람노즈로 스파이크된 (C)로부터의 IgG N-글리칸으로부터 방출된 단당류의 HPAEC-PAD 프로파일을 나타낸다. 단당류는 TFA 가수분해 후 재-N-아세틸화되지 않았으므로, GlcNAc는 GlcNH2로서 측정되었다. 선택된 조건하에서, L-람노즈 피크는 약 15.5 분의 보유 시간에서 용출한다. RMD-CHO 클론 H2로부터 기원한 IgG N-글리칸 시료의 HPAEC-PAD 크로마토그램으로부터의 푸코즈 피크의 부재에 주목한다.
실시예
1. 실험 부분
1.1 재료 및 방법
1.1.1 세포주
재조합체 CHO/DG44 세포주 CHO-IgG를 디하이드로폴레이트 리덕타제-결핍성 CHO 세포주, CHO/DG44[참조: Urlaub et al ., 1986, Proc Natl Acad Sci USA. 83 (2): 337-341]를 치료학적 모노클로날 항체(Trastuzumab(Herceptin®))의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 항체 발현 카세트를 함유하는 발현 벡터를 사용한 안정한 형질감염에 의해 본 연구실에서 앞서 확립하였다. 세포주 RMD-CHO-IgG의 생성은 존재하는 CHO-IgG 세포주로부터 출발하였다. 세포주 둘다는 혈청-유리된 배지 속에서 유지되었다.
1.1.2 유전자 최적화 및 합성
옥시도리덕타제 Rmd[슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) PAO1; 304 아미노산](진뱅크 수탁 번호 GenBank: AAG08839.1)에 대한 아미노산 서열을 역 해독하여 수득되는 뉴클레오타이드 서열을 잠재 스플라이스 부위(cryptic splice site), RNA 탈안정화 서열 성분의 녹아웃, 증가된 RNA 안정성의 최적화 및 CHO 세포[크리세툴루스 그리세우스(Cricetulus griseus)]의 요건에 조화되는 코돈 사용의 적응에 의해 최적화하였다.
1.1.3
RMD
발현 플라스미드의
작제
합성된 RMD-작제물을 EcoRI 및 Bgl II로 절단하고 송아지 장 포스파타제로 탈포스포릴화하였다. 분해되고 탈포스포릴화된 삽입물을 비시스트론성 전령(gfp)으로부터 RMD 및 녹색 형광성 단백질의 조화된 동시-발현을 허용하는 예비-분해된 비시스트론성 발현 벡터내로 연결하였다. 발현 플라스미드는 비시스트론성 발현 카세트에 안정하게 통합된 세포의 직접적인 선택을 허용하는 네오마이신 내성 유전자가 구비되어 있다. 발현 플라스미드를 작제하기 위한 일반적인 과정은 문헌[참조: Sambrook, J., E.F. Fritsch and T. Maniatis: Cloning I/II/III, A Laboratory Manual New York/Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Second Edition]에 기술되어 있다.
1.1.4 항체-생산
CHO
-
IgG
세포의
푸코실화되지
않은 항체를 분비하는 세포로의 전환
IgG1-유형 치료학적 항체 트라스투주마브를 안정하게 발현하는 CHO-IgG 세포를 제조업자의 지시(MicroPorator, PEQLAB Biotech, 독일 소재)에 따른 전기천공(electroporation)에 의해 RMD-gfp 삽입유전자로 안정하게 형질감염시켰다. 전기천공 24시간 후, 형질감염체를 항생제 G418을 함유하는 알파-MEM 속에서 선택하였다. 이후에, G418-내성 클론을 제한 희석 클로닝으로 분리하는데, 즉, 이들을 당해 선택 배지 속에 재현탁시키고 단일 세포로부터 콜로니를 수득하는 경향성이 포아송 통계(poisson statistics)를 기초로 하여 95% 를 초과하는 희석에서 96 웰 플레이트내로 씨드(seed)하였다. 모노클로날성(monoclonality)을 보증하기 위해, 96웰 내에서 성장한 세포를 분리하고 다시 제한 희석으로 96 웰 플레이트내로 씨드하였다. 이들 2회 단일 세포 클로닝 후, 분리된 단일 세포 클론의 커플을 보다 큰 용적으로 확장시켰다. 이후에, 이들을 현탁액 속에서 성장하도록 조정하였다. 기술된 전기천공 프로토콜을 사용하여, 배양 접시내 gfp-형광성 분포로부터 평가된 것으로서 2 x 106개의 전기천공된 세포 당 약 2000개의 형질전환 효능을 달성하였다(도 2).
1.1.5 형광성 현미경에 의한 클론 스크리닝
단일 세포 클론을 96웰 플레이트내로 씨드하고 씨마운트 어댑터(cmount adapter)가 장착된 Olympus IX-50(제조원: Olympus Optical Co., 유럽 소재)를 사용하여 GFP-형광성을 모니터링함으로써 성공적인 RMD-통합에 대해 스크리닝하였다. GFP-스캔을 위해 200-배 확대에서 형광성 여과기를 상 대조에 대해 사용하였다. 영상을 Viewfinder lite 애플리케이션(Viewfinder lite application)으로 편집하였다. 또한, RMD 삽입유전자의 mRNA 발현을 RT-PCR 분석으로 확인하였다. RMD 삽입유전자의 성공적인 발현은 프라이머의 RMD-특이적인 세트를 사용하여 RT-PCR로 확인하였다(도 3).
1.1.6 진탕 튜브 속에서 혈청-유리된
뱃치
배양에 의한 변형되지 않고
당가공된
IgG1
의 생산
RMD-변형된 CHO 생산자 클론(RMD-CHO-IgG)에 의해 생산된 항체의 당구조물을 변형되지 않은 CHO 항체 생산자 세포(CHO-IgG)로부터 분비된 IgG1-유형 항체의 당구조물과 비교하기 위하여, 세포주 둘다를 사용하여 배양 상층액내 IgG1 항체를 생산하였다. RMD-CHO-IgG 및 CHO-IgG 항체 생산자 클론을 푸코즈-결핍된 성장 배지 속에서 2 x 105 세포/ml로 접종하였다. 진탕기 튜브를 180 rpm, 37℃, 7.5% pCO2에서 항온처리하였다. 세포가 여전히 > 80 %의 생명력을 나타낼 때 7일 후에 배양을 중지하였다. 생존가능한 세포 밀도를 자동 세포 계수기, Vi-CELLTM XR(제조원: Beckman Coulter, 캘리포니아주 풀레르톤 소재)로, 트립판 블루 배제를 사용하여 측정하였다. 유가 뱃치 검정(fed batch assay)의 기간동안에 걸쳐 쇠퇴하는 생존능 패턴 및 유가 뱃치 진탕기 검정의 3일 내지 10일 사이의 평균 특이적인 생산성(qp)는 2개의 상이한 클론 사이에서 비교가능하게 잔류하였다. 이후에, 세포를 5000 rpm에서 10초 동안 원심분리하여 펠렛화하고 상층액을 별개의 바이알로 이전하였다. RMD-CHO IgG 및 변형되지 않은 CHOIgG 세포를 유사하게 배양하였다. 배양 상층액 중 항체 농도를 Gyrolab Workstation(제조원: Gyros AB, 스웨덴 소재)에서 사람 IgG1에 대해 특이적인 샌드위치 면역 검정(Sandwich Immuno Assay)으로 측정하였다. 클론들 둘다는 대수적으로 성장하여, 각각의 시료채취일에 비교가능한 IgG-역가를 수득하였고 비교가능한 초기 배가 시간(initial doubling time)을 가졌다. 클론들 둘다는 차이니즈 햄스터 난소 세포의 전형적인 형태학을 유지하였다.
1.1.7 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의한
IgG1
의 정제
0.2μm 여과기에 의한 멸균 여과 후, 상층액을 단백질-A-세파로즈 미니 컬럼에 로딩하였다. 총 용량이 10mg인 0.5 ml 컬럼 지지체 물질을 사용하였다. 당해 컬럼을 20 mM 인산나트륨, pH 7.0의 5개 컬럼 용적을 사용하여 중력식 유동으로 평형화하였다. 낮은 유속에서 단백질 결합 후, 컬럼을 평형 완충액으로 2회 세척하였다. 이후에, 항체를 0.1 M 글리신 완충액, pH 3.0을 사용하여 중력식 유동으로 용출시켰다. 1ml의 분획을 수집하고 1M 트리스-HCl, pH 9를 사용하여 즉시 중화시켰다. 각각의 정제된 IgG1의 완전성 및 순도는 감소하는 SDS-PAGE 분석으로 확인하였다. 순도는 >90%이었으며 용출된 항체의 완전성은 감소하는 SDS-PAGE 분석으로 확인하였다.
1.1.8 항체 기원한 N-
결합된
올리고당류의 제조
100㎍의 각각의 항체를 N-결합된 올리고당류의 질량 분광계적 특성화에 사용하였다. 단백질을 트립신(0:2 mg/ml, 16 시간, 37℃)으로 분해한 후 N-글리칸을 1 단위의 펩타이드-N-글리코시다제 F(PNGaseF, 제조원: Roche Diagnostics)을 사용하여 18시간 동안 37℃에서 항온처리함으로써 방출시켰다. 방출된 N-글리칸을 RP-(Sep-Pak C18-) 컬럼에 이어 카보그래프 추출물-정화 컬럼(carbograph extract-clean column)에서 2-단계 크로마토그래피로 회수하였다[참조: Wuhrer et al., 2006, Glycobiology 16 (2006), pp. 991-1006]. 50%의 각각의 N-글리칸 혼주물을 10 mU 뉴라미니다제로 18시간동안 37℃에서 분해하고 50%를 문헌(참조: Ciucanu and Kerek, Ciucanu and Kerek, 1984, Carbohydr Res. 1984: 131:209)에 기술된 바와 같이 요오드화메틸로 과메틸화하였다.
1.1.9
MALDI
-
TOF
-
MS
에 의한 N-
결합된
올리고당류의 분석
각각의 정제된 IgG1으로부터 방출된 N-글리칸을 smartbeam-IITM 레이저가 장착된 UltraFlex III TOF/TOF 질량 분광기(제조원: Bruker Daltonik GmbH, 독일 브레멘 소재)로 분석하였다. 측정을 양이온 방식으로 수행하였다. 양이온을 25 kV의 가속화 전압 및 10ns의 추출 지연에 적용하고 반사 방식으로 분석하였다. 분석을 위해, 탈시알릴화된 글리칸을 H2O 속에 용해하고 과메틸화된 글리칸을 70%(v/v) 아세토니트릴 속에 용해하였다. 0.5μl의 시료를 표적에 80% EtOH 속에 용해된 아라비노사존(2 mg/ml)과 1:1(v/v)로 혼합하고 실온에서 건조되도록 하였다. 덱스트란 래더(dextran ladder)를 사용한 외부 교정을 사용하였다. 스펙트럼을 당-피크파인더(Glyco-peakfinder)를 사용하여 분석하였다(참조: Maas et al., 2007, Proteomics 7, 4435-4444). 확인된 글리칸 구조물을 GlycoWorkbench 소프트웨어로 구축하였다[참조: Ceroni et al., 2008, J. Proteome Res. 7(4) 1650-1659]. 최종 배양 배지로부터 정제된 생성물의 올리고당류 프로파일 분석은, 생성물의 N-결합된 Fc 올리고당류가 고-만노즈 및 이중촉각 복합체 유형이며, RMD-CHO-IgG 클론으로부터 분비된 IgG1 생성물이 코어 푸코실화를 완전히 결여하였음을 입증하였다. 당구조물 분석은, RMD 동시-발현하는 클론에 의해 생산된 항체의 푸코실화되지 않은 올리고당류의 비가 모 CHO-IgG 클론의 것과 비교하여, 각각의 경우에 유의적으로 증가하였음을(즉, 99%, 95%, 97%, 및 98% 이하) 나타내었다(도 4). RMD-CHO-IgG 세포내에서 발현된 IgG1 항체 생성물로부터 수득한 N-당구조물은, 부착된 푸코즈-잔기가 거의 완전히 비어 있으며 MALDI-피크 상대적인 강도를 기준으로 비교적 다량의 고 만노즈 구조물을 함유한 반면(도 4, 패널 A; 둘러싸인 우세한 고 만노즈 구조물), 변형되지 않은 CHO-IgG 세포에서 발현된 치료학적 IgG1 항체로부터 수득된 N당구조물은 코어-푸코실화되고 유의적으로 보다 적은 양의 고 만노즈 구조물을 함유한다(푸코즈 잔기 = 둘러싸인 삼각형; 도 4, 패널 B).
2. 실험 부분
2.2 재료 및 방법
2.2.1 세포주, 유전자 최적화 및 합성,
RMD
발현 플라스미드의
작제
, 항체-생산
CHO
-
IgG
세포의
푸코실화되지
않은 항체를 분비하는 세포로의 전환, 형광성 현미경 및
RT
-
PCR
에 의한 클론 스크리닝
RMD-CHO-IgG 세포주를 생산하기 위해 사용된 CHO-IgG 세포주, RMD의 유전자 최적화 및 합성, RMD 발현 플라스미드의 작제, 항체-생산 CHO-IgG 세포의 푸코실화되지 않은 항체를 분비하는 세포의 전환, 성공적인 RMD-통합을 위한 형광성 현미경 및 RMD 삽입유전자의 성공적인 mRNA 발현을 위한 RT-PCT에 의한 클론 스크리닝과 관련하여, 위에서 언급한 항목 1.1.1 내지 1.1.5가 참조된다(1. 실험 부분).
2.2.2 유가-
뱃치
배양
IgG를 CHO 및 RMD-CHO 세포(클론 H1, H2 및 H3) 둘다를 사용하여 생산함으로써 이들의 N-글리칸 구조물을 비교하였다. 세포를 4 x 105세포/ml에서 500 ml 진탕 플라스크내로 4 mM 글루타민이 보충되어 있지만 항생제 또는 MTX가 없는 100 ml의 혈청-유리된 배지(ProBioGen용의 통상의 제형; 제조원: SAFC Bioscience, 칸사스주 르넥사 소재) 속에 씨드하였다. 배양물을 180 rpm으로 37℃ 및 7.5% CO2에서 교반하였다. 세포에 100 ml의 배양물 용적 당 1.75 ml의 PBG-Feed Mix를 배양 4일째에 공급하였다. 세포 밀도 및 생존능을 트립판-블루 배제에 의해 자동화된 ViCell 세포 정량 시스템(제조원: Beckman Coulter, 캘리포니아주 브레아 소재)을 사용하여 측정하였다. 세포 배양 상층액의 분취량을 3, 5 및 7일째에 수집하여 IgG 농도를 측정하였으며, 이는 Gyrolab 샌드위치 면역 검정으로 측정하였다. 배양은, 세포가 여전히 80%보다 높은 생명력을 나타낸 경우 7일 후에 중지시켰다. 세포 배양 상층액을 수집하고 멸균-여과하였다.
2.2.3
IgG1
특이적인
Gyrolab
샌드위치 면역 검정
IgG1 농도를 Gyrolab Workstation(제조원: Gyros AB, 스웨덴 업살라 소재)에서 수행된 샌드위치 면역 검정으로 측정하였다. 당해 검정은 IgG의 Fc-부분의 에피토프, 세포 배양 상층액 시료 또는 폴리클로날 사람 IgG 참조 표준물 상의 에피토프를 인지하는 바이오티닐화된 포획 항체 및 IgG의 Fab 도메인내 에피토프에 결합하는, Alexa Fluor 647-표지된 검출 항체의 일련의 첨가를 포함한다. 시료 및 표준물은 3회 측정하였다. 평균 OD, 표준 편차(SD), 및 변이의 계수 %(% CV)를 각각의 수행 후 Gyrolab evaluator 소프트웨어로 자동적으로 계산하였다. 기술된 IgG1 Gyrolab 샌드위치 면역 검정은, 각각의 계산 표준물에 대한 잔사가 20% 상대 오차(RE)의 허용성 한계를 충족한다는 전제를 기준으로 하여 사전-승인되었다.
2.2.4 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용한
IgG
정제
세포 배양물 상층액을 20 mM 인산나트륨, pH 7.0으로 예비-평형화시킨 0.5 ml 단백질 A-세파로즈 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼을 2개 층 용적의 평형 완충액으로 세척한 후, 항체를 4-컬럼 용적 0.1 M 글리신 pH 3.0으로 용출시켰다. 분획을 수집하고 1M 트리스-HCl, pH 9로 즉시 중화하였다. 각각의 정제된 IgG의 완전성 및 순도는 SDS-PAGE 분석을 감소시켜 확인하였다. 정제된 IgG의 단백질 농도는 Gyrolab 샌드위치 면역 검정으로 측정하였다.
2.2.5
IgG
N-
글리칸의
가공
IgG(100㎍)을 트립신으로 16시간 동안 37℃에서 분해하였다. 시료를 5분 동안 95℃에서 가열함으로써 반응을 종결시켰다. 항체를 1U PNGase F를 사용하여 18시간 동안 37℃에서 추가로 분해하였다. 방출된 N-글리칸을 분리하고 역상 Sep-Pak C18 카트릿지에 이어 카보그래프 추출물-정화 컬럼(carbograph extract-clean column) 위에서 탈염시켰다. 각각의 N-글리칸 혼주물을 10 mU 뉴라미니다제를 사용하여 18시간 동안 37℃에서 분해하였다.
2.2.6 질량 분광법
N-글리칸을 smartbeam-IITM 레이저 및 LIFT-MS/MS 시설이 장착된 UltraFlex III TOF/TOF 질량 분광계(제조원: Bruker Daltonik GmbH, 독일 브레멘 소재) 상에서 분석하였다. 스펙트럼을 반사 방식으로 25 kV의 가속화 전압 및 10 ns의 추출 지연에서 기록하였다. 측정을 양이온 방식으로 수행하였다. 외부 교정은 덱스트란 래더를 사용하여 수행하였다. 탈시알릴화된(desialylated) N-글리칸을 H2O 속에 용해하였다. 0.5μl의 시료를 강철 표적에서 70% 수성 에탄올 속에 용해된 D-아라비노사존(5 mg/ml)과 1:1(v/v)로 혼합하였다(참조: Chen et al. 1997). 스펙트럼을 Glyco-Peakfinder를 사용하여 분석하였다(참조: Maas et al., 2007). 확인된 글리칸 구조물을 GlycoWorkbench 소프트웨어를 사용하여 구축하였다(참조: Ceroni et al., 2008).
2.2.7
Fc
-감마 수용체
IIIA
(
Fc
γ
RIIIA
) 특이적인 결합 검정
IgG 시료의 FcγRIIIA-결합 활성을 문헌(참조: Niwa et al., 2004)에 기술된 바와 같이 FcγRIIIA 특이적인 결합 검정을 약간 변형시켜 분석하였다. 히스티딘(HIS)-태그된 FcγRIIIA(F158)(22 kDa; 158F; 제조원: R&D Systems, 미네소타주 미네아폴리스 소재)를 수용체 결합용 항-테트라HIS 모노클로날 항체(제조원: Qiagen, 독일 힐덴 소재)와 함께 사용하였다. 면역플레이트(Maxisorp, 제조원: Thermo, 메사츄세츠주 왈탐 소재)를 항-테트라HIS 항체로 피복하고 차단 시약(제조원: Roche Diagnostics, 독일 펜츠베르크 소재)으로 차단하였다. 후속적으로, 재조합체 HIS-태그된 FcγRIIIA를 면역플레이트에 가하였다. 이후에, 피복된 플레이트를 일련의 시료 희석 및 대조군과 함께 배양하여 이들이 고정된 FcγRIIIA 수용체에 결합할 수 있도록 하였다. 세척 단계 후, 결합된 IgG를 항-사람 IgG 퍼옥시다제-접합된 mAb(제조원: Dianova, 독일 함부르크 소재)로 검출하고 결합된 IgG의 양을 퍼옥시다제 활성을 통해 적량하였다. 각각의 항온처리 단계 후, 면역플레이트를 0.2% 트윈-20을 함유하는 PBS로 3회 세척하였다. 테트라메틸벤지딘(TMB; 제조원: Seramun, 독일 하이데세 소재)을 색원체성 기질로서 사용하여, 반응을 1M 황산을 사용하여 종결시키고, 최종적으로, 흡수를 450 nm(Infinite F200 Reader, 제조원: Tecan, 독일 크라일슈하임 소재)에서 검출하였다. 농도 의존성 흡수 데이타를 기준으로 하여, 완전한 곡선 맞춤(curve fit)을 4-매개변수 산정 곡선 모델(Magellan Software 6.1, 제조원: Tecan)을 사용하여 수행하였다. 당해 FcγRIIIA 결합 검정에 대한 내부-일련의 정밀성은 15% CV내에서 측정되었다.
2.2.8 항체-의존성 세포 세포독성(
ADCC
) 검정
원시 사람 NK 세포를 말초혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 분리하였다. PBMC를 건강한 사람 공여자의 전혈로부터 밀도 구배 원심분리에 의해 분리하고, NK 세포를 후속적으로 음성 자기 비드 분리(제조원: Miltenyi, 독일 베르기슈 글라트바흐 소재)로 분리하였다. 분리된 NK 세포의 순도를 유동 혈구계산법(PE-접합된 CD16 및 Alexa488-접합된 CD56 항체, 제조원: BD, 캘리포니아주 산 조세 소재)로 확인하였다. 세포주 BT-474(참조: Lasfargues et al., 1978, 유방의 침입성 관상 암종, 사람, 공급원: CLS, 독일 에펠하임 소재) 및 SK-BR-3(참조; Zabrecky et al., 1991, 유방의 샘암종, 사람, 공급원: ATCC, 버지니아주 마나사스)를 표적 세포로 사용하였다. 세포주 둘다는 유동 세포분석법에 의해 Her2/neu 마커에 대해 양성으로 확인되었다(데이타는 나타내지 않음). 표적 세포주를 조사 세포 뱅크로부터 접종 3일 전에 재활시켰다. 항체-의존성NK 세포 유도된 표적 세포 분해를 생체 염색((Calcein AM, 제조원: Life Technologies, 캘리포니아주 칼스바드 소재)의 방출로 정량화하였다. 표적 세포를 제조업자의 프로토콜에 따라 염색하고 96-웰 미세역가 플레이트 속에서 50 μL RPMI1640(제조원: Life Technologies) + 10% FCS(제조원: Biochrom, 독일 베를린 소재) 중에서 2 x 104 생존 세포/웰로 씨드하였다. RPMI1640 + 10% FCS 속에서 항체의 일련의 1:3 희석물을 제조하였다. 50 μL/각각의 희석물의 웰을 n = 3으로 피펫팅하고 표적 세포와 함께 30분 동안 37℃에서 NK 세포 접종 전에 예비-항온처리하였다. 항체 예비-항온처리의 말기에, 효과기 세포를 5:1의 효과기 대 표적 세포 비에서 씨드하였다. 플레이트를 후속적으로 200 g에서 3분 동안 원심분리하고 4시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 항온처리하였다. 각각의 세포주에 대해, 자발적인 표적 세포 분해 대조군(w/o NK 세포), 항체-독립적인 표적 세포 분해 대조군(w/ NK 세포) 및 총 표적 세포 분해 대조군(사포닌으로 유도됨)을 유도하였다. 대조군 웰내 총 분해는 RPMI1640 + 10% FCS 중 15 μL/웰의 0.1 mg/mL 사포닌을 항온처리 기간의 종결 15분 전에 가함으로써 유도하였다. 모든 다른 웰에서, 15 μL RPMI1640 + 10% FCS를 가하였다. 칼세인 AM의 방출은 배양 상층액 속에서 형광성 검출로 적량하였다. 플레이트를 원심분리(150 g; 3분)하고 각각의 웰로부터의 100-μL 상층액을 96-웰 블랙 형광성 플레이트(제조원: Thermo)내로 이전시켰다. 평균 형광성 강도(MFI)를 Infinite F200 판독기(Tecan, 485/535 nm 여기/방출 여과기)를 사용하여 검출하였다. 곡선 맞춤을 4-매개변수 산정 투여량-반응 모델(Magellan software version 6.1)을 사용하여 수행하였다. 특이적인 세포 분해는 다음과 같이 계산하였다: 특이적인 세포 분해[%] = [MFI(시료) - MFI(자발적)] / [MFI(총) - MFI(자발적)] x 100. MFI(시료)는 특이적인 표적 세포 분해에 의해 방출된 평균 형광성 강도인 반면, MFI(자발적)는 표적 세포에 의한 형광성 염료의 점진적인 방출이며, MFI(총)는 세제 유도된 총 표적 세포 분해 후 수득된 평균 형광성 강도이다.
2.2.9 단당류 분석 및
람노즈
측정
세포(3x107)를 100 g에서 5분 동안 원심분리에 의해 상층액으로부터 분리하였다. 이들을 후속적으로 3회의 동결-해동 주기로 분해하였다. 이후에, 세포 막을 세포질 분획으로부터 21 000g에서 30분 동안 4℃에서 분리하였다. 세포 배양 상층액, 세포막, 세포질 분획 및 IgG N-글리칸을 2N TFA 속에서 4시간 동안 100℃에서 가수분해하였다. 감압 대기하에서 증발시킨 후, 시료를 HPAEC-PAD로 PA-1 컬럼 상에서 Dionex ICS-3000을 사용하여 분석하고 2-데옥시리보즈를 내부 표준물로서 사용하였다. 중성 단당류를 2.25 mM NaOH를 사용하는 등용매 용출에 의해 분리하였다. 200 mM NaOH의 후컬럼 첨가는 전류측정 검출을 가능하도록 하였다. HPAEC-PAD는 거울상이성체성 동일성의 지정을 허용하지 않으므로(참조: Horton, D. 2004), L-람노즈를 표준물로 사용하여 D-람노즈에 대해 예측된 보유 시간을 측정하였다. 람노즈에 대한 LOD는 분석 과정의 확인(ICHQ2(R1))을 위한 ICH 조화된 3부 안내서의 6.3장에 기술된 바와 같이 측정하였다.
2.3 결과
2.3.1
RMD
삽입유전자의 이종 발현
분비된 IgG의 푸코실화의 수준에 있어서 RMD-삽입유전자 발현의 효과를 평가하기 위해서, GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈 리덕타제(RMD) 및 녹색 형광성 단백질(gfp)에 대한 유전자를 포함하는 비시스트론성 발현 카세트를 생성하고 IgG1-유형 치료학적 항체 트라스투주마브(Herceptin®, 제조원: Roche)의 바이오시밀러 버젼의 과발현 및 분비를 위해 이미 가공된 CHO/DG44 클론내로 도입하였다. 삽입유전자를 발현하는 G418-내성 클론을 이들의 gfp-매개된 녹색 형광성에 의해 확인하였으며 형질감염 2주내에 나타났다. 약 80%의 형질전환 효능이 gfp-형광성 분포로부터 평가된 바와 같이 전기천공에 의해 달성되었다(데이타는 나타내지 않았으나 도 2에 나타낸 데이타와 비교가능하다). RMD 삽입유전자의 성공적인 발현은 프라이머의 RMD-특이적인 세트를 사용하여 RT-PCR로 확인하였다(데이타는 나타내지 않으나 도 3에 나타낸 데이타와 비교가능하다). RMD 삽입유전자를 발현하는 변형된 CHO 세포를 RMD-CHO로 명명한다.
2.3.2
CHO
및
RMD
-
CHO
항체 생산 세포의 혈청-유리된 유가-
뱃치
배양
IgG를 생산하는 변형되지 않은 모 CHO 및 형질감염된 RMD-CHO 세포의 혈청-유리된 유가 뱃치 배양을 L-글루타민이 보충된 푸코즈-결핍된 성장 배지를 함유하는 50ml 들이 생반응기 튜브 속에서 수행하였다. 생반응기 튜브를 4 x 105 세포/ml의 출발하는 세포 밀도에서 접종한 후 180 rpm, 37℃, 7.5% pCO2에서 항온처리하였다. 유가-뱃치 배양의 수행능을 14일 동안 모니터하고 나란히 비교하였다. CHO 및 RMD-CHO 세포의 평행한 유가 뱃치 배양물의 비교 분석은 14일의 과정에 걸쳐 유의적인 편차가 없음을 나타내었다. 초기 배가 비율, 증식 속도 및 각각의 시료채취일에서 IgG-역가는 모든 세포주에 대해 적절하였다. 클론들 둘다는 CHO 세포의 전형적인 형태학을 유지하였다. 유가 뱃치 배양 검정의 과정에 걸쳐 쇠퇴하는 생존능의 양식 및 유가 뱃치 진탕기 검정의 3 내지 10일 사이의 평균 특이적인 생산성(qp)은 2개의 상이한 클론에 대해 비교가능하게 남았다(데이타는 나타내지 않음).
2.3.3
CHO
및
RMD
-
CHO
세포로부터 생산된
IgG
의 N-
글리칸
분석
CHO 및 RMD-CHO 세포를 뱃치 배양으로 성장시켰다. IgG를 생산하는 3개의 상이한 RMD-CHO 클론, 즉, H1, H2 및 H3을 사용하였다. 세포를 4 x 105 세포/mL의 출발하는 세포 밀도에서 접종하고 생반응기 튜브 속에서 7일 동안 180 rpm, 37℃, 7.5 % pCO2에서 성장시켰다. 상층액을 7일째에 수거하고 IgG 시료를 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 용출된 항체의 순도 및 완전성을 감소하는 SDS-PAGE로 확인하였다. PNGase F를 사용하여 방출된 N-글리칸을 탈시알릴화하고 MALDI-TOF-MS로 후속적으로 분석하였다. N-글리칸의 시그날 강도의 상대적 정량이 크로마토그래피 방법과 비교하는 경우 안정한 결과를 제공하는 것으로 일찌기 입증되었으므로(참조: Wada et al., 2007), 당해 정량을 수행하였다. 고-만노즈 및 복합체-유형 이중촉각 N-글리칸 구조물을 모든 시료에서 검출하였다(도 5). 모노푸코실화된 아갈락토실화된/모노갈락토실화된/디갈락토실화된 이중촉각 N-글리칸은 야생형(WT) IgG에서 발견된 3개의 가장 풍부한 N-글리칸 구조물이었다(도 5A). 이들 피크, 즉 m/z 1485.4, 1647.4 및 1809.4에서 코어-푸코즈의 존재는 MALDI-TOF/TOF에 의해 확인하였다. 진단적 단편 이온 dHex1HexNAc2이 m/z 592.8에서의 모든 스펙트럼에서 검출되었다. RMD-CHO 세포로부터 생산된 IgG 시료에서, 단지 미량의 푸코즈가 관측되었으며(도 5B, C, D), 최대 2%의 총 N-글리칸 혼주물(시료 H2)을 나타내었다. 동시에, 시료 H2는 WT IgG보다 더 많은 양의 고-만노즈 구조물을 함유하였다.
2.3.4
CHO
및
RMD
-
CHO
세포로부터 생산된
IgG
의
IgG1
-
Fc
결합 활성
IgG1와 이의 인지체 Fc 수용체 FcγRIIIa 사이의 비교적 약한 상호작용(Kd ~1μM)은 ADCC 효과기 기능에 기여하는 주요 인자들 중 하나이므로(참조: Sondermann et al., 2000), FcγRIIIa 결합 검정은 IgG1 모노클로날 항체 시료의 ADCC 활성을 예측하기 위한 간접적인 척도이다. RMD-CHO 세포로부터 분비된 아푸코실화된 IgG의 FcγRIIIa 결합은 야생형 CHO 세포로부터 분비된 푸코실화된 IgG와 비교하여 FcγRIIIa-158F에 대해 ~16-배 적은 단백질에서 동등한 결합으로 크게 증가하였다(도 6A, B). 당해 데이타는 참조물로서 푸코실화된 IgG를 사용하여 아푸코실화된 IgG의 결합에 있어 상대적인 배가 증가로서 도 6B에 보고되어 있다.
2.3.5
RMD
-
CHO
세포를 사용하여 생산된
아푸코실화된
IgG
의
ADCC
활성
ADCC 활성을 분석하기 위하여, 분리된 NK-세포 및 HER2-발현 표적 세포를 아푸코실화된 및 푸코실화된 IgG의 일련 희석물과 함께 공-항온처리하였다. 검정의 사전필수 과정으로서, NK 세포를 전혈 시료로부터 73%의 순도 수준으로 분리하였다(도 7). 기술적 NK 세포 세포독성 대조군은 ADCC-검정에 사용된 공여체 물질에 대해 77%의 특이적인 분해 활성을 나타내었다(도 7). HER2-발현 표적 세포주 BT-474(사람, 유방의 침입성 관상 암종으로부터 분리)를 ADCC 검정에 사용하였다. BT-474 표적 세포주는 또한 NK 세포에 의해 ADCC 이외의 메카니즘으로 공격받았다. BT-474 세포는 평균값 16% 항체-독립적인 세포 분해를 나타낸다(데이타는 나타내지 않음). IgG 시료에 의해 유도된 특이적인 세포 분해에 대한 데이타는 도 8에 나타낸다. 모든 3개의 아푸코실화된 IgG 시료(H1-H3)는 WT 항체와 비교하여 증가된 ADCC-반응을 유도하였다(도 8). 아푸코실화된 IgG 시료 H2는 최대 ADCC-반응을 유도하였다(도 8). 유사한 결과가, SK-BR-3 세포(유방의 HER2 양성 샘암종)을 검정에서 표적 세포로 사용하는 경우 수득되었다. BT-474 및 SK-BR-3 세포와 함께 항온처리한 아푸코실화된 및 푸코실화된 IgG 시료에 대해 계산된 EC50 값을 표 2에 요약한다(하기 참조). 야생형 IgG와 변이체 H1 내지 H3 사이의 EC50에 있어서 관측된 이동은 ADCC 검정에 사용된 표적 세포주와 관계없이 비교가능하게 남았다(도 8). HER2-양성 BT474 및 SK-BR-3 표적 세포주 및 정제된 NK-세포의 존재하에서, 아푸코실화된 IgG는 푸코실화된 IgG와 비교하여 훨씬 더 높은 효능을 나타낸 0.443 ㎍/ml 및 0.00817 ㎍/ml의 평균 EC50 값을 갖는 평균 16-배의 항체-매개된 표적 세포 고갈 활성을 나타내었다. 증가된 FcγRIIIa-결합 활성을 나타낸 아푸코실화된 IgG 시료가 또한 WT IgG와 비교하여 보다 높은 ADCC-반응을 유도하였음에 주목하여야 한다.
| 시료명 | BT-474 EC50 [ng/mL] |
BT-474 비 (WT/H) |
SK-BR-3 EC50 [ng/mL] |
SK-BR-3 비 (WT/H) |
| WT | 6.03 | --- | 1.31 | --- |
| H1 | 0.454 | 13 | 0.0932 | 14 |
| H2 | 0.227 | 27 | 0.0602 | 22 |
| H3 | 0.647 | 9 | 0.0917 | 14 |
2.3.6 단당류 분석 - 세포 분해물 및 IgG N- 글리칸에서 D-람노즈의 검출가능한 양의 부재
세포막, 배양 상층액 및 세포질성 분획을 RMD-CHO 세포로부터 분리하였다. 단당류를 후속적으로 방출시키고 HPAEC-PAD로 분석하였다. 예측한 바와 같이, 푸코즈는 CHO 세포내에 존재하였으며 RMD-CHO 세포내에는 존재하지 않았다. 검출 한계(LOD)를 초과하는 람노즈의 수준은 세포질 분획에서 검출되지 않았다(도 9). 교정 곡선의 y-차단(y-intercept) 및 기울기의 표준 편차를 기준으로 하여, LOD는 람노즈 및 푸코즈 각각에 대해 10 μl의 시료 주입 용적 당 1.2 pmol 및 1.1 pmol이었다. 유사하게, RMD-CHO 세포를 사용하여 생산된 정제된 항체로부터 방출된 N-글리칸을 TFA로 가수분해하고 수득되는 단당류를 HPAEC-PAD로 분석하였다. TFA-가수분해된 N-글리칸은 LOD를 초과하는 어떠한 람노즈 피크도 산출하지 않았다(도 10). 결론적으로, 어떠한 RMD-CHO 세포 또는 분비된 항체도 검출가능한 양의 람노즈를 함유하지 않았다.
2.4 최종 설명
본 발명자들은 세포질성 푸코즈 드 노보(de novo) 합성 경로로부터 주요 대사 중간체의 연속적인 제거를 위해 변형된 세포주로부터 푸코즈-결핍성 mAb의 분비를 달성하기 위한 당가공 시도를 평가하였다(도 1). 본 발명자들의 데이타는, 이종 세균 효소의 삽입유전자성 발현이 초기의 당단백질 N-글리칸에서 푸코즈의 합성에 있어 바람직한 차단을 초래함을 나타낸다. 당해 방법에 의한 푸코즈-결핍 정도는 또한, 배양 배지로부터 푸코즈의 제거가 구조 경로를 완전 차단하는데 충분하였으며, 이는 한편 세포질성 GDP-푸코즈의 대안적인 공급원으로서 제공될 수 있음을 나타낸다.
본 발명자의 시도에서 주요 대사 표적은 GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노즈이며, 이는 예를 들면, 세균에서 GDP-L-푸코즈, GDP-4-데옥시-D-탈로즈, GDP-콜리토즈, 및 GDP-D-페로사민을 포함하는 몇가지 상이한 GDP-모노데옥시헥소즈의 합성을 위한 일반적인 중간체이다. 또한, GDP-푸코즈 신테타제의 활성 부위 Cys109Ser 돌연변이체는 GDP-푸코즈 대신 GDP-6-데옥시-D-알트로즈를 생산한다(참조: Lau and Tanner, 2008).
본 발명자들이 본 발명자들의 시도를 위해 예시적으로 선택한 구체적인 원핵세포 효소는 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈 리덕타제(GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노즈 리덕타제와 동의어, RMD로 약칭)(참조: Kneidinger et al., 2001; Maki et al., 2002)였다. 본 발명자들은 본원에서, 세포질내 원핵세포 효소 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈 리덕타제(RMD)의 이종 발현이 푸코즈 드 노보 경로를 충분히 차단할 수 있음을 입증하였다. 상기 효소는 수소 공여체로서 NADH 및 NADPH를 이용하며 푸코즈 경로 중간체 GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노즈의 4-케토 그룹의 표적화된 환원을 촉매함으로써 GDP-D-람노즈를 수득한다. RMD에 의한 GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노즈의 GDP-D-람노즈로의 전환은, 역 반응이 검출되지 않았으므로, 정량적으로 진행되는 것으로 여겨진다(참조: Kneidinger et al., 2001).
본 발명자의 데이타는 또한, 동물이 아닌 특정 세균의 당접합체에서만 발견된 GDP-람노즈, 6-데옥시헥소즈(참조: Webb et al., 2004)가 척추동물 세포질의 맥락에서 막다른 생성물임을 나타낸다. 변형되지 않은 척추동물 세포는 람노실트랜스퍼라제(참조: Webb et al., 2004) 및 막 수송인자를 결여함으로써 GDP-D-람노즈의 초기의 글리칸으로의 혼입이 척추동물 세포내에서 매우 상이하도록 한다. 본 발명자들의 데이타는 이를 입증할 수 있었다. 이들은, 인공 D-람노즈가 분비된 IgG내로 또는 또한 세포내에서 혼입되지 않았음을 명확히 나타낸다(도 9 및 도 10).
글루칸 구조물에서 푸코즈의 결여 외에, 유전적으로 가공된 클론으로부터 분비된 IgG는 보다 높은 수준의 고-만노즈 구조를 나타내었다. 이는 GDP-D-람노즈에 의해 GMD의 피드백-억제로부터 발생할 수 있다. GDP-만노즈에 대한 대안의 대사 약하(metabolic sink)로서 GMD-활성의 결여는 세포질성 GDP-D-만노즈의 상승된 혼주물에 기여할 수 있으며, 이는 최종적으로 RMD-변형된 숙주 세포로부터 분비된 생성물에서 관측된 고-만노즈 구조물의 상승을 유발할 수 있다(도 4 및 도 5).
FcγRIII-결합 검정 및 시험관내 ADCC-검정에 대한 본 발명자들의 결과는 또한, 아푸코실화된 IgG가 FcγRIIIa 및 향상된 ADCC-반응에 대한 유의적으로 보다 높은 결합 활성을 가짐을 나타낸다. 표적 세포 고갈 활성에 있어서 배가 증가 및 관측된 EC50 이동(표 2, 도 8)은, 검정이 전혈, 혈청 또는 혈장의 존재하에서 수행되는 경우 심지어 보다 더 높을 수 있다. 흥미롭게도, 본 발명자들은, 최대 수준의 고-만노즈 구조를 지닌 아푸코실화된 IgG 시료 H2가 또한 검정에 사용된 표적 세포(BT474 또는 SK-BR-3)와 상관없이, 최대 ADCC-활성을 나타내었음을 관측하였다(표 2).
이와 함께, 본 연구는, 척추동물 숙주 세포내에서 RMD의 과발현이 세포질성 GDP-푸코즈, GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노즈의 합성을 위한 중요한 주요 중간체의 고갈을 유발함을 입증한다. 당해 시도는 대사적으로 가공된 세포주의 생성을 허용하지만 또한 푸코즈-고갈된 치료요법을 위해 존재하는 항체 발현 세포 클론을 생산자 세포로 전환시키기 위한 고도의 촉망되는 새로운 방법론을 제공한다. 기존의 세포주에서 푸코즈 결핍성을 안정하게 가공하는 능력은 차세대 모노클로날 항체에 대한 약물 개발을 가속화하는데 도움을 줄 수 있다.
3. 약어
ACN, 아세토니트릴; CHO, 차이니즈 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary); CV, 변이 계수; dHex, 데옥시헥소즈; EC50, 최대 유효 농도의 1/2(즉: 기본선과 최대 반응 사이의 반응 중간을 유발하는 작용제의 농도), Fuc, 푸코즈; Gal, 갈락토즈; GalNAc, N-아세틸갈락토사민; GlcNAc, N-아세틸글루코사민; GMER, GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노즈-3,5-에피머라제/4-리덕타제; HPLC, 고-성능 액체 크로마토그래피; HPAEC-PAD, 펄스된 전류측정 검출을 사용한 고-pH 이온-교환 크로마토그래피; LOD 검출 한계; mAb, 모노클로날 항체; MALDI-TOF-MS 매트릭스-보조된 레이저 흡착 이온화 전파시간(time-of-flight) 질량 분광법; MEM, 변형된 이글스 배지; PBMC, 말초 혈액 단핵 세포; PBS, 인산염 완충제 염수; PNGase F, 펩타이드-N4-(N-아세틸-β-글루코사미닐)아스파라긴 아미다제 F; Rha, 람노즈; RMD, GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈 리덕타제; SDS, 나트륨 도데실 설페이트; TFA, 트리플루오로아세트산.
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<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 304
<212> PRT
<213> Pseudomonas aeruginosa
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(304)
<223> GDP-6-deoxy-D-lyxo-4-hexulose reductase (RMD)
<400> 1
Met Thr Gln Arg Leu Phe Val Thr Gly Leu Ser Gly Phe Val Gly Lys
1 5 10 15
His Leu Gln Ala Tyr Leu Ala Ala Ala His Thr Pro Trp Ala Leu Leu
20 25 30
Pro Val Pro His Arg Tyr Asp Leu Leu Glu Pro Asp Ser Leu Gly Asp
35 40 45
Leu Trp Pro Glu Leu Pro Asp Ala Val Ile His Leu Ala Gly Gln Thr
50 55 60
Tyr Val Pro Glu Ala Phe Arg Asp Pro Ala Arg Thr Leu Gln Ile Asn
65 70 75 80
Leu Leu Gly Thr Leu Asn Leu Leu Gln Ala Leu Lys Ala Arg Gly Phe
85 90 95
Ser Gly Thr Phe Leu Tyr Ile Ser Ser Gly Asp Val Tyr Gly Gln Val
100 105 110
Ala Glu Ala Ala Leu Pro Ile His Glu Glu Leu Ile Pro His Pro Arg
115 120 125
Asn Pro Tyr Ala Val Ser Lys Leu Ala Ala Glu Ser Leu Cys Leu Gln
130 135 140
Trp Gly Ile Thr Glu Gly Trp Arg Val Leu Val Ala Arg Pro Phe Asn
145 150 155 160
His Ile Gly Pro Gly Gln Lys Asp Ser Phe Val Ile Ala Ser Ala Ala
165 170 175
Arg Gln Ile Ala Arg Met Lys Gln Gly Leu Gln Ala Asn Arg Leu Glu
180 185 190
Val Gly Asp Ile Asp Val Ser Arg Asp Phe Leu Asp Val Gln Asp Val
195 200 205
Leu Ser Ala Tyr Leu Arg Leu Leu Ser His Gly Glu Ala Gly Ala Val
210 215 220
Tyr Asn Val Cys Ser Gly Gln Glu Gln Lys Ile Arg Glu Leu Ile Glu
225 230 235 240
Leu Leu Ala Asp Ile Ala Gln Val Glu Leu Glu Ile Val Gln Asp Pro
245 250 255
Ala Arg Met Arg Arg Ala Glu Gln Arg Arg Val Arg Gly Ser His Ala
260 265 270
Arg Leu His Asp Thr Thr Gly Trp Lys Pro Glu Ile Thr Ile Lys Gln
275 280 285
Ser Leu Arg Ala Ile Leu Ser Asp Trp Glu Ser Arg Val Arg Glu Glu
290 295 300
<210> 2
<211> 294
<212> PRT
<213> Actinobacillus actinomycetemcomitans
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(294)
<223> GDP-6-deoxy-D-talose synthetase (GTS)
<400> 2
Met Lys Ile Leu Val Thr Gly Gly Ser Gly Phe Ile Gly Lys Asn Leu
1 5 10 15
Ile Tyr Leu Leu Arg Glu Lys Arg Glu Phe Glu Val Phe Gly Ala Thr
20 25 30
Val Glu Glu Thr Met Asp Leu Thr Asn Pro Cys Ser Val Gln Ser Val
35 40 45
Leu Glu Lys Thr Lys Pro Asp Phe Ile Val His Leu Ala Ala Leu Thr
50 55 60
Phe Val Pro Asn Asn Asn Pro Ile Thr Phe Tyr Leu Val Asn Thr Ile
65 70 75 80
Gly Thr Glu Asn Leu Leu Arg Ser Ile Val Asp Leu Asn Val Ala Lys
85 90 95
Leu Gly Val Leu Cys Phe Ser Thr Ala Gly Ile Tyr Gly Ile Gln Glu
100 105 110
Thr Lys Leu Leu Ser Glu Ser Leu Thr Pro Lys Pro Val Asn His Tyr
115 120 125
Ser Met Ser Lys His Cys Met Glu His Ile Val Asn Lys Tyr Arg Cys
130 135 140
Phe Arg Gly Ile Thr Val Val Arg Pro Phe Asn Val Leu Gly Leu Gly
145 150 155 160
Gln Asn Ile Asn Phe Leu Val Pro Lys Met Val Ser Ala Phe Val Lys
165 170 175
Lys Asp Lys Thr Ile Glu Leu Gly Asn Leu Asp Ser Val Arg Asp Phe
180 185 190
Ile Ser Val Asn Asp Cys Cys Asp Ile Ile Tyr Arg Leu Ile Ser Lys
195 200 205
Leu Ile Glu Asn Glu Thr Ile Asn Ile Cys Thr Gly Ile Gly Tyr Ser
210 215 220
Val Tyr Gln Ile Phe Gln Leu Leu Cys Glu Ile Ser Met His Gln Met
225 230 235 240
Glu Ile Lys Gln Asn Glu Leu Phe Val Arg His Asp Asp Ile Pro Gln
245 250 255
Met Ile Gly Asp Pro Ser Lys Leu Leu Asn Val Leu Gly Asn Asp Tyr
260 265 270
Arg Phe Thr Ser Val Arg Ala Ile Leu Glu Glu Met Tyr Lys Asn Arg
275 280 285
Leu Leu Glu Leu Ser Ile
290
<210> 3
<211> 367
<212> PRT
<213> Vibrio cholerae
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(367)
<223> GDP-perosamine synthetase (Per)
<400> 3
Met Ile Pro Val Tyr Glu Pro Ser Leu Asp Gly Asn Glu Arg Lys Tyr
1 5 10 15
Leu Asn Asp Cys Ile Asp Ser Gly Trp Val Ser Ser Arg Gly Lys Tyr
20 25 30
Ile Asp Arg Phe Glu Thr Glu Phe Ala Glu Phe Leu Lys Val Lys His
35 40 45
Ala Thr Thr Val Ser Asn Gly Thr Val Ala Leu His Leu Ala Met Ser
50 55 60
Ala Leu Gly Ile Thr Gln Gly Asp Glu Val Ile Val Pro Thr Phe Thr
65 70 75 80
Tyr Val Ala Ser Val Asn Thr Ile Val Gln Cys Gly Ala Leu Pro Val
85 90 95
Phe Ala Glu Ile Glu Gly Glu Ser Leu Gln Val Ser Val Glu Asp Val
100 105 110
Lys Arg Lys Ile Asn Lys Lys Thr Lys Ala Val Met Ala Val His Ile
115 120 125
Tyr Gly Gln Ala Cys Asp Ile Gln Ser Leu Arg Asp Leu Cys Asp Glu
130 135 140
His Gly Leu Tyr Leu Ile Glu Asp Cys Ala Glu Ala Ile Gly Thr Ala
145 150 155 160
Val Asn Gly Lys Lys Val Gly Thr Phe Gly Asp Val Ser Thr Phe Ser
165 170 175
Phe Phe Gly Asn Lys Thr Ile Thr Ser Gly Glu Gly Gly Met Val Val
180 185 190
Ser Asn Ser Asp Ile Ile Ile Asp Lys Cys Leu Arg Leu Lys Asn Gln
195 200 205
Gly Val Val Ala Gly Lys Arg Tyr Trp His Asp Leu Val Ala Tyr Asn
210 215 220
Tyr Arg Met Thr Asn Leu Cys Ala Ala Ile Gly Val Ala Gln Leu Glu
225 230 235 240
Arg Val Asp Lys Ile Ile Lys Arg Lys Arg Asp Ile Ala Glu Ile Tyr
245 250 255
Arg Ser Glu Leu Ala Gly Leu Pro Met Gln Val His Lys Glu Ser Asn
260 265 270
Gly Thr Phe His Ser Tyr Trp Leu Thr Ser Ile Ile Leu Asp Gln Glu
275 280 285
Phe Glu Val His Arg Asp Gly Leu Met Thr Phe Leu Glu Asn Asn Asp
290 295 300
Ile Glu Ser Arg Pro Phe Phe Tyr Pro Ala His Thr Leu Pro Met Tyr
305 310 315 320
Glu His Leu Ala Glu Lys Thr Ala Phe Pro Leu Ser Asn Ser Tyr Ser
325 330 335
His Arg Gly Ile Asn Leu Pro Ser Trp Pro Gly Leu Cys Asp Asp Gln
340 345 350
Val Lys Glu Ile Cys Asn Cys Ile Lys Asn Tyr Phe Asn Cys Ile
355 360 365
<210> 4
<211> 388
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(388)
<223> GDP-4-keto-6-deoxymannose-3-dehydratase (ColD)
<400> 4
Met Ile Asn Tyr Pro Leu Ala Ser Ser Thr Trp Asp Asp Leu Glu Tyr
1 5 10 15
Lys Ala Ile Gln Ser Val Leu Asp Ser Lys Met Phe Thr Met Gly Glu
20 25 30
Tyr Val Lys Gln Tyr Glu Thr Gln Phe Ala Lys Thr Phe Gly Ser Lys
35 40 45
Tyr Ala Val Met Val Ser Ser Gly Ser Thr Ala Asn Leu Leu Met Ile
50 55 60
Ala Ala Leu Phe Phe Thr Lys Lys Pro Arg Leu Lys Lys Gly Asp Glu
65 70 75 80
Ile Ile Val Pro Ala Val Ser Trp Ser Thr Thr Tyr Tyr Pro Leu Gln
85 90 95
Gln Tyr Gly Leu Arg Val Lys Phe Val Asp Ile Asp Ile Asn Thr Leu
100 105 110
Asn Ile Asp Ile Glu Ser Leu Lys Glu Ala Val Thr Asp Ser Thr Lys
115 120 125
Ala Ile Leu Thr Val Asn Leu Leu Gly Asn Pro Asn Asn Phe Asp Glu
130 135 140
Ile Asn Lys Ile Ile Gly Gly Arg Asp Ile Ile Leu Leu Glu Asp Asn
145 150 155 160
Cys Glu Ser Met Gly Ala Thr Phe Asn Asn Lys Cys Ala Gly Thr Phe
165 170 175
Gly Leu Met Gly Thr Phe Ser Ser Phe Tyr Ser His His Ile Ala Thr
180 185 190
Met Glu Gly Gly Cys Ile Val Thr Asp Asp Glu Glu Ile Tyr His Ile
195 200 205
Leu Leu Cys Ile Arg Ala His Gly Trp Thr Arg Asn Leu Pro Lys Lys
210 215 220
Asn Lys Val Thr Gly Val Lys Ser Asp Asp Gln Phe Glu Glu Ser Phe
225 230 235 240
Lys Phe Val Leu Pro Gly Tyr Asn Val Arg Pro Leu Glu Met Ser Gly
245 250 255
Ala Ile Gly Ile Glu Gln Leu Lys Lys Leu Pro Arg Phe Ile Ser Val
260 265 270
Arg Arg Lys Asn Ala Glu Tyr Phe Leu Asp Lys Phe Lys Asp His Pro
275 280 285
Tyr Leu Asp Val Gln Gln Glu Thr Gly Glu Ser Ser Trp Phe Gly Phe
290 295 300
Ser Phe Ile Ile Lys Lys Asp Ser Gly Val Ile Arg Lys Gln Leu Val
305 310 315 320
Glu Asn Leu Asn Ser Ala Gly Ile Glu Cys Arg Pro Ile Val Thr Gly
325 330 335
Asn Phe Leu Lys Asn Thr Asp Val Leu Lys Tyr Phe Asp Tyr Thr Val
340 345 350
His Asn Asn Val Asp Asn Ala Glu Tyr Leu Asp Lys Asn Gly Leu Phe
355 360 365
Val Gly Asn His Gln Ile Glu Leu Phe Asp Glu Ile Asp Tyr Leu Arg
370 375 380
Glu Val Leu Lys
385
<210> 5
<211> 321
<212> PRT
<213> Cricetulus griseus
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(321)
<223> GDP-Fucose synthetase (GST) (Fx protein)
<400> 5
Met Gly Glu Pro Gln Gly Ser Arg Arg Ile Leu Val Thr Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Leu Val Gly Arg Ala Ile Gln Lys Val Val Ala Asp Gly Ala Gly
20 25 30
Leu Pro Gly Glu Glu Trp Val Phe Val Ser Ser Lys Asp Ala Asp Leu
35 40 45
Thr Asp Ala Ala Gln Thr Gln Ala Leu Phe Gln Lys Val Gln Pro Thr
50 55 60
His Val Ile His Leu Ala Ala Met Val Gly Gly Leu Phe Arg Asn Ile
65 70 75 80
Lys Tyr Asn Leu Asp Phe Trp Arg Lys Asn Val His Ile Asn Asp Asn
85 90 95
Val Leu His Ser Ala Phe Glu Val Gly Thr Arg Lys Val Val Ser Cys
100 105 110
Leu Ser Thr Cys Ile Phe Pro Asp Lys Thr Thr Tyr Pro Ile Asp Glu
115 120 125
Thr Met Ile His Asn Gly Pro Pro His Ser Ser Asn Phe Gly Tyr Ser
130 135 140
Tyr Ala Lys Arg Met Ile Asp Val Gln Asn Arg Ala Tyr Phe Gln Gln
145 150 155 160
His Gly Cys Thr Phe Thr Ala Val Ile Pro Thr Asn Val Phe Gly Pro
165 170 175
His Asp Asn Phe Asn Ile Glu Asp Gly His Val Leu Pro Gly Leu Ile
180 185 190
His Lys Val His Leu Ala Lys Ser Asn Gly Ser Ala Leu Thr Val Trp
195 200 205
Gly Thr Gly Lys Pro Arg Arg Gln Phe Ile Tyr Ser Leu Asp Leu Ala
210 215 220
Arg Leu Phe Ile Trp Val Leu Arg Glu Tyr Asn Glu Val Glu Pro Ile
225 230 235 240
Ile Leu Ser Val Gly Glu Glu Asp Glu Val Ser Ile Lys Glu Ala Ala
245 250 255
Glu Ala Val Val Glu Ala Met Asp Phe Cys Gly Glu Val Thr Phe Asp
260 265 270
Ser Thr Lys Ser Asp Gly Gln Tyr Lys Lys Thr Ala Ser Asn Gly Lys
275 280 285
Leu Arg Ala Tyr Leu Pro Asp Phe Arg Phe Thr Pro Phe Lys Gln Ala
290 295 300
Val Lys Glu Thr Cys Ala Trp Phe Thr Asp Asn Tyr Glu Gln Ala Arg
305 310 315 320
Lys
<210> 6
<211> 314
<212> PRT
<213> Cricetulus griseus
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(314)
<223> GDP-Fucose synthetase Cys109Ser- (GFS-Cys109Ser) mutant
<400> 6
Met Arg Ile Leu Val Thr Gly Gly Ser Gly Leu Val Gly Arg Ala Ile
1 5 10 15
Gln Lys Val Val Ala Asp Gly Ala Gly Leu Pro Gly Glu Glu Trp Val
20 25 30
Phe Val Ser Ser Lys Asp Ala Asp Leu Thr Asp Ala Ala Gln Thr Gln
35 40 45
Ala Leu Phe Gln Lys Val Gln Pro Thr His Val Ile His Leu Ala Ala
50 55 60
Met Val Gly Gly Leu Phe Arg Asn Ile Lys Tyr Asn Leu Asp Phe Trp
65 70 75 80
Arg Lys Asn Val His Ile Asn Asp Asn Val Leu His Ser Ala Phe Glu
85 90 95
Val Gly Thr Arg Lys Val Val Ser Cys Leu Ser Thr Ser Ile Phe Pro
100 105 110
Asp Lys Thr Thr Tyr Pro Ile Asp Glu Thr Met Ile His Asn Gly Pro
115 120 125
Pro His Ser Ser Asn Phe Gly Tyr Ser Tyr Ala Lys Arg Met Ile Asp
130 135 140
Val Gln Asn Arg Ala Tyr Phe Gln Gln His Gly Cys Thr Phe Thr Ala
145 150 155 160
Val Ile Pro Thr Asn Val Phe Gly Pro His Asp Asn Phe Asn Ile Glu
165 170 175
Asp Gly His Val Leu Pro Gly Leu Ile His Lys Val His Leu Ala Lys
180 185 190
Ser Asn Gly Ser Ala Leu Thr Val Trp Gly Thr Gly Lys Pro Arg Arg
195 200 205
Gln Phe Ile Tyr Ser Leu Asp Leu Ala Arg Leu Phe Ile Trp Val Leu
210 215 220
Arg Glu Tyr Asn Glu Val Glu Pro Ile Ile Leu Ser Val Gly Glu Glu
225 230 235 240
Asp Glu Val Ser Ile Lys Glu Ala Ala Glu Ala Val Val Glu Ala Met
245 250 255
Asp Phe Cys Gly Glu Val Thr Phe Asp Ser Thr Lys Ser Asp Gly Gln
260 265 270
Tyr Lys Lys Thr Ala Ser Asn Gly Lys Leu Arg Ala Tyr Leu Pro Asp
275 280 285
Phe Arg Phe Thr Pro Phe Lys Gln Ala Val Lys Glu Thr Cys Ala Trp
290 295 300
Phe Thr Asp Asn Tyr Glu Gln Ala Arg Lys
305 310
<210> 7
<211> 307
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(307)
<223> GDP-L-colitose synthase (ColC)
<400> 7
Met Lys Ile Leu Leu Thr Gly Ser Thr Gly Met Val Gly Arg Asn Ile
1 5 10 15
Val Asp Asn Asn Asn Ser Asn Lys Tyr Glu Leu Leu Cys Pro Thr Ser
20 25 30
Ser Glu Leu Asn Leu Leu Asp Asn Lys Ala Val His Asp Tyr Ile Thr
35 40 45
Cys His Ser Pro Asp Leu Ile Ile His Ala Ala Gly Leu Val Gly Gly
50 55 60
Ile Gln Ala Asn Ile Lys Arg Pro Val Asp Phe Leu Val Ser Asn Leu
65 70 75 80
Lys Met Gly Val Asn Ile Val Asn Glu Ala Lys Asn Cys Gly Val Lys
85 90 95
Asn Phe Ile Asn Leu Gly Ser Ser Cys Met Tyr Pro Lys Gly Ile Asp
100 105 110
Thr Ala Ile Ser Glu Asp Ala Leu Leu Thr Gly Lys Leu Glu His Thr
115 120 125
Asn Glu Gly Tyr Ala Leu Ala Lys Ile Thr Val Ala Lys Leu Cys Glu
130 135 140
Tyr Ile Thr Lys Glu Ser Glu Gly Tyr His Tyr Lys Thr Ile Ile Pro
145 150 155 160
Cys Asn Leu Tyr Gly Lys Tyr Asp Lys Phe Asp Glu His Ser Ser His
165 170 175
Met Ile Pro Ala Val Ile Asn Arg Ile His Asn Ala Lys Val Asn Asn
180 185 190
Ile Lys Leu Ile Glu Ile Trp Gly Asp Gly Glu Ser Arg Arg Glu Phe
195 200 205
Met Tyr Ala Glu Asp Phe Ala Asn Phe Ile Tyr Gln Ala Ile Pro Asn
210 215 220
Ile Gln Arg Leu Pro Cys Met Leu Asn Val Gly Leu Gly His Asp Phe
225 230 235 240
Ser Ile Asn Asp Tyr Tyr Lys Val Ile Ala Glu Glu Ile Gly Tyr Lys
245 250 255
Gly Ser Phe Thr His Asp Leu Thr Lys Pro Val Gly Met Arg Arg Lys
260 265 270
Leu Val Asp Ile Thr Leu Leu Ser Glu Phe Gly Trp Lys Tyr Gln Phe
275 280 285
Glu Leu Arg Asp Gly Ile Lys Glu Thr Tyr Lys Tyr Tyr Leu Glu Asn
290 295 300
Val Tyr Lys
305
Claims (27)
- GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈 리덕타제(RMD), GDP-페로사민 신테타제(Per), GDP-6-데옥시-D-탈로즈 신테타제(GTS), GDP-푸코즈 신테타제 Cys109Ser-(GFS-Cys109Ser) 돌연변이체, GDP-4-케토-6-데옥시만노즈-3-데하이드라타제(ColD), GDP-L-콜리토즈 신테타제(ColC)와 결합한 GDP-4-케토-6-데옥시만노즈-3-데하이드라제(ColD), 및 이들의 조합들로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 효소를 포함하는, 당부분에 푸코즈를 천연적으로 포함하는 분자에서, 상기 당부분에 푸코즈가 결여되거나, 또는 푸코즈를 당부분에 첨가할 수 있는 척추동물 세포 내에서 상기 분자가 발현되고/또는 생산될 때의 상기 당부분의 푸코즈의 양과 비교하여 푸코즈의 양이 감소된 분자를 생산하기 위한, 척추동물 세포.
- 제1항에 있어서, 상기 효소가 마커 태그 또는 친화성 태그를 추가로 포함하는 것인, 척추동물 세포.
- 제2항에 있어서, 상기 마커 태그가 형광성 단백질인 것인, 척추동물 세포.
- 제1항에 있어서, 상기 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈 리덕타제(RMD)가 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래이고 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것인, 척추동물 세포.
- 제1항에 있어서, GDP-D-람노즈, GDP-D-페로사민, GDP-데옥시-D-탈로즈, GDP-6-데옥시-D-알트로즈, GDP-4-케토-3,6-디데옥시-D-만노즈, 및 GDP-L-콜리토즈로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 당을 추가로 포함하는 것인, 척추동물 세포.
- 제1항에 있어서, 상기 효소가 상기 세포내에서 일시적으로 존재하거나 안정하게 유지된 핵산 서열로부터 발현되는 것인, 척추동물 세포.
- 제1항에 있어서, 상기 세포가 푸코실트랜스퍼라제에 대한 기질인 분자를 추가로 포함하는 것인, 척추동물 세포.
- 제7항에 있어서, 상기 분자가 단백질 또는 지질인 것인, 척추동물 세포.
- 제8항에 있어서, 상기 단백질이 내인성 또는 외인성 단백질인 것인, 척추동물 세포.
- 제8항에 있어서, 상기 단백질이 항체, 항체의 Fc 영역을 포함하는 항체 단편, 융합 단백질, 바이러스 단백질, 항원, 또는 호르몬인 것인, 척추동물 세포.
- 제1항에 있어서, 상기 척추동물 세포가 포유동물, 어류, 양서류, 파충류 세포 또는 조류 세포인 것인, 척추동물 세포.
- 제11항에 있어서,
i) 상기 포유동물 세포가 사람, 햄스터, 개 또는 원숭이 세포이거나;
ii) 상기 어류 세포가 익탈루루스 푼크타투스(Ictalurus punctatus)(얼룩메기) 난소(CCO) 세포이거나;
iii) 상기 양서류 세포가 제노푸스 래비스(Xenopus laevis) 신장 세포이거나;
iv) 상기 파충류 세포가 이구아나 이구아나(Iguana iguana) 심장 세포(IgH-2)이거나; 또는
v) 상기 조류 세포가 조류 망막 세포, 또는 조류 체절 세포인 것인, 척추동물 세포. - 제12항에 있어서,
i) 상기 사람 세포가 사람 경부 암종 세포 (ATCC CCL 2), 사람 PER.C6 세포, 또는 사람 AGE1.HN 세포이거나;
ii) 상기 햄스터 세포가 차이니즈 햄스터 난소 세포(Chinese hamster ovary cell)(CHO)이거나;
iii) 상기 원숭이 세포가 아프리카 녹색 원숭이 신장(VERO-76) 세포이거나;
iv) 상기 개 세포가 마딘 다빈 개 신장(Madin Darbin canine kidney cell)(MDCK) 세포이거나; 또는
v) 상기 조류 망막 세포가 AGE1.CR.PIX 세포인 것인, 척추동물 세포. - 제1항에 있어서, GDP-D-람노즈, GDP-D-페로사민, GDP-데옥시-D-탈로즈, GDP-6-데옥시-D-알트로즈, GDP-4-케토-3,6-디데옥시-D-만노즈, 또는 GDP-L-콜리토즈에 대한 글리코실트랜스퍼라제를 추가로 포함하는 것인, 척추동물 세포.
- i) 제1항에 따른 척추동물 세포를 제공하는 단계,
ii) 푸코실트랜스퍼라제에 대한 기질인 분자를 단계 i)에서의 세포로부터 분리하는 단계를 포함하는,
당부분에 푸코즈를 천연적으로 포함하는 분자에서, 상기 당부분에 푸코즈가 결여되거나, 또는 푸코즈를 당부분에 첨가할 수 있는 척추동물 세포 내에서 상기 분자가 발현되고/또는 생산될 때의 상기 당부분의 푸코즈의 양과 비교하여 푸코즈 양이 감소된 분자를 생산하는 방법. - 제15항에 따른 방법에 의해 수득된, 분자의 당부분에 푸코즈가 결여되어 있거나, 또는 푸코즈를 당부분에 첨가할 수 있는 척추동물 세포 내에서 상기 당부분에 푸코즈를 천연적으로 포함하는 분자가 발현되고/또는 생산될 때의 상기 당부분의 푸코즈의 양과 비교하여 푸코즈의 양이 감소된 분자.
- 제16항에 따른 분자의 조성물.
- GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈 리덕타제(RMD), GDP-페로사민 신테타제(Per), GDP-6-데옥시-D-탈로즈 신테타제(GTS), GDP-푸코즈 신테타제 Cys109Ser-(GFS-Cys109Ser) 돌연변이체, GDP-4-케토-6-데옥시만노즈-3-데하이드라타제(ColD), GDP-L-콜리토즈 신테타제(ColC)와 결합한 GDP-4-케토-6-데옥시만노즈-3-데하이드라제(ColD), 및 이들의 조합들로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 효소를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결된 하나 이상의 척추동물 발현 조절 서열을 포함하는, 당부분에 푸코즈를 천연적으로 포함하는 분자에서, 상기 당부분에 푸코즈가 결여되거나, 또는 푸코즈를 당부분에 첨가할 수 있는 척추동물 세포 내에서 상기 분자가 발현되고/또는 생산될 때의 상기 당부분의 푸코즈의 양과 비교하여 푸코즈의 양이 감소된 분자 생산용 발현 벡터.
- 제18항에 있어서, 상기 효소가 마커 태그 또는 친화성 태그를 추가로 포함하는 것인, 발현 벡터.
- 제19항에 있어서, 상기 마커 태그가 형광성 단백질인 것인, 발현 벡터.
- i) GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥술로즈 리덕타제(RMD), GDP-페로사민 신테타제(Per), GDP-6-데옥시-D-탈로즈 신테타제(GTS), GDP-푸코즈 신테타제 Cys109Ser-(GFS-Cys109Ser) 돌연변이체, GDP-4-케토-6-데옥시만노즈-3-데하이드라타제(ColD), GDP-L-콜리토즈 신테타제(ColC)와 결합한 GDP-4-케토-6-데옥시만노즈-3-데하이드라제(ColD), 및 이들의 조합들로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 제1의 폴리뉴클레오타이드, 및
ii) 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제2의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는,
당부분에 푸코즈를 천연적으로 포함하는 단백질에서, 상기 당부분에 푸코즈가 결여되거나, 또는 푸코즈를 당부분에 첨가할 수 있는 진핵 세포 내에서 상기 단백질이 발현될 때의 상기 당부분의 푸코즈의 양과 비교하여 푸코즈의 양이 감소된 단백질을 생산하기 위한 진핵 세포. - 제21항에 있어서, 상기 효소가 마커 태그 또는 친화성 태그를 추가로 포함하는 것인, 진핵 세포.
- 제22항에 있어서, 상기 마커 태그가 형광성 단백질인 것인, 진핵 세포.
- 제21항에 있어서, 상기 단백질이, 항체, 항체의 Fc 영역을 포함하는 항체 단편, 융합 단백질, 바이러스 단백질, 항원, 또는 호르몬인 것인, 진핵 세포.
- i) 제21항에 따른 진핵 세포를 제공하는 단계,
ii) 상기 세포내에서 제1의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 효소 및 제2의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질을 발현시키는 단계, 및
iii) 상기 세포로부터 단백질을 분리하는 단계를 포함하는,
당부분에 푸코즈를 천연적으로 포함하는 단백질에서, 상기 당부분에 푸코즈가 결여되거나, 또는 푸코즈를 당부분에 첨가할 수 있는 진핵 세포 내에서 상기 단백질이 발현될 때의 상기 당부분의 푸코즈의 양과 비교하여 푸코즈 양이 감소된 단백질을 생산하는 방법. - 제25항에 따른 방법으로 수득된, 당부분에 푸코즈가 결여되거나, 또는 푸코즈를 당부분에 첨가할 수 있는 진핵 세포 내에서 상기 당부분에 푸코즈를 천연적으로 포함하는 단백질이 발현될 때의 상기 당부분의 푸코즈의 양과 비교하여 푸코즈의 양이 감소된 단백질.
- 삭제
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