JP2013505028A - 特定のグリカン構造を含有する分子を生成する方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
第1の態様では、本発明は、自然状態ではその糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有する分子を生成するための脊椎動物細胞であって、基質としてGDP−6−デオキシ−D−リキソ−4−ヘキスロースを使用するが、GDP−6−デオキシ−D−リキソ−4−ヘキスロースをGDP−L−フコースに変換する反応を触媒しない酵素を少なくとも1つ含む、自然状態ではその糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有する分子を生成するための脊椎動物細胞に関する。
i)第1の態様による脊椎動物細胞を準備する工程と、
ii)i)における該細胞からフコシルトランスフェラーゼに対する基質となることができる分子、好ましくはタンパク質又は脂質を単離する工程と、
を含む、自然状態ではその糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有する分子を生成する方法に関する。
i)70%〜95%のG0−GlcNac、G0、G1及び/又はG2の複合型N−グリカンと、
ii)5%〜30%の高マンノース型N−グリカンと、
を含む糖タンパク質を含む組成物であって、該複合型N−グリカンがフコースを含まない、又はフコースを実質的に含まない、糖タンパク質を含む組成物に関する。
i)1つ又は複数の脊椎動物発現制御配列と、
ii)基質としてGDP−6−デオキシ−D−リキソ−4−ヘキスロースを使用する酵素をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドと、
を含む発現単位であって、該酵素がGDP−6−デオキシ−D−リキソ−4−ヘキスロースをGDP−L−フコースに変換する反応を触媒しない、発現単位に関する。
i)基質としてGDP−6−デオキシ−D−リキソ−4−ヘキスロースを使用する酵素をコードする核酸配列を含む第1のポリヌクレオチドと、
ii)タンパク質をコードする核酸配列を含む第2のポリヌクレオチドと、
を含み、該酵素がGDP−6−デオキシ−D−リキソ−4−ヘキスロースをGDP−L−フコースに変換する反応を触媒しない、通常その糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有するタンパク質を生成するための真核細胞に関する。
i)第8の態様による真核細胞を準備することと、
ii)上記細胞において該第1のポリヌクレオチドによりコードされる該酵素及び該第2のポリヌクレオチドによりコードされる該タンパク質を発現することと、
iii)上記細胞から該タンパク質を単離することと、
を含む、通常その糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有するタンパク質を生成する方法に関する。
本発明を以下で詳細に説明する前に、本明細書中で説明する特定の方法論、プロトコル及び試薬は変動し得るので、本発明はこれらに限定されないと理解すべきである。本明細書中で使用される専門用語は、特定の実施の形態を説明するためのものにすぎず、添付した特許請求の範囲のみによって限定される本発明の範囲を限定することは意図されないことも理解すべきである。他に規定のない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
コア=Man3GlcNAc2
G0=GlcNAc2Man3GlcNAc2
G0−GlcNAc=1個のGlcNAcを欠くG0構造(すなわちGlcNAcMan3GlcNAc2)
G1=1個の更なるガラクトース残基を含有するG0構造(すなわちGalGlcNAc2Man3GlcNAc2)
G2=2個の更なるガラクトース残基を含有するG0構造(すなわちGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2)
G0F=五糖コアの第1のGlcNAc残基に結び付いた1個の更なるフコース残基を含有するG0構造(すなわちGlcNAc2Man3GlcNAc2Fuc)
G0F−GlcNAc=五糖コアの第1のGlcNAc残基に結び付いた1個の更なるフコース残基を含有するG0−GlcNAc構造(すなわちGlcNAcMan3GlcNAc2Fuc)
G1F=五糖コアの第1のGlcNAc残基に結び付いた1個の更なるフコース残基を含有するG1構造(すなわちGalGlcNAc2Man3GlcNAc2Fuc)
G2F=五糖コアの第1のGlcNAc残基に結び付いた1個の更なるフコース残基を含有するG2構造(すなわちGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2Fuc)
Man4=1個の更なるマンノース残基を含有するコア構造(すなわちManMan3GlcNAc2)
Man5=2個の更なるマンノース残基を含有するコア構造(すなわちMan2Man3GlcNAc2)
Man6=3個の更なるマンノース残基を含有するコア構造(すなわちMan3Man3GlcNAc2)
Man7=4個の更なるマンノース残基を含有するコア構造(すなわちMan4Man3GlcNAc2)
Man8=5個の更なるマンノース残基を含有するコア構造(すなわちMan5Man3GlcNAc2)
(i)脊椎動物特異的な発現制御配列(それぞれの酵素をコードする核酸配列の発現を可能とする)に操作可能に連結した、酵素GDP−6−デオキシ−D−リキソ−4−ヘキスロースレダクターゼ(RMD)、GDP−ペロサミンシンテターゼ(Per)、GDP−6−デオキシ−D−タロースシンテターゼ(GTS)、GDP−フコースシンテターゼCys109Ser(GFS−Cys109Ser)突然変異体、GDP−4−ケト−6−デオキシマンノース−3−デヒドラターゼ(ColD)又はGDP−L−コリトースシンターゼ(ColC)をコードする核酸配列を含む少なくとも1つのポリヌクレオチドと、
(ii)脊椎動物特異的な発現制御配列(上記細胞において対象となるタンパク質、例えばIgG1のような抗体をコードする核酸配列の発現をもたらす)に操作可能に連結した、対象となるタンパク質、すなわちプロスペクティブ糖タンパク質、例えばIgG1のような抗体をコードする核酸配列を含む少なくとも1つのポリヌクレオチドと、
を含む。
ii)魚類細胞がアメリカナマズ(Ictalurus punctatus)(チャネル・キャットフィッシュ)卵巣(CCO)細胞(ATCC CRL−2772)であり、
iii)両生類細胞がアフリカツメガエル(Xenopus laevis)腎臓細胞(ATCC CCL−102)であり、
iv)爬虫類細胞がグリーンイグアナ(Iguana iguana)心臓細胞(IgH−2)(ATCC CCL−108)であり、又は
v)鳥類細胞がトリ網膜細胞AGE1.CR、若しくはAGE1.CR.PIX、若しくはトリ体節細胞AGE1.CS(全ての細胞がノバリケン(Muscovy duck)(カイリナ・モスチャタ(Cairina moschata))から誘導される)であることが特に好ましい。
細胞株
寄託番号
起源
誘導体
野生型
ATCCによる寄託なし
マウス骨髄腫
幼ハムスターの腎臓(Kidney)
チャイニーズハムスターの卵巣
クリセツラス・グリセウス
ヒトの胚腎臓
(i)脊椎動物特異的な発現制御配列に操作可能に連結した、酵素GDP−6−デオキシ−D−リキソ−4−ヘキスロースレダクターゼ(RMD)、GDP−ペロサミンシンテターゼ(Per)、GDP−6−デオキシ−D−タロースシンテターゼ(GTS)、GDP−フコースシンテターゼCys109Ser(GFS−Cys109Ser)突然変異体、GDP−4−ケト−6−デオキシマンノース−3−デヒドラターゼ(ColD)又はGDP−L−コリトースシンターゼ(ColC)をコードする核酸配列を含む少なくとも1つのポリヌクレオチドと、
(ii)脊椎動物特異的な発現制御配列に操作可能に連結した、対象となるタンパク質、すなわちプロスペクティブ糖タンパク質、例えばIgG1のような抗体をコードする核酸配列を含む少なくとも1つのポリヌクレオチド(該発現制御配列により上記細胞において上記タンパク質をコードする核酸配列の発現が可能になる)と、
(iii)脊椎動物特異的な発現制御配列に操作可能に連結した、GDP−D−ラムノース、GDP−D−ペロサミン、GDP−デオキシ−D−タロース、GDP−6−デオキシ−D−アルトロース、GDP−4−ケト−3,6−ジデオキシ−D−マンノース又はGDP−L−コリトースに対するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含む少なくとも1つのポリヌクレオチド(該発現制御配列により上記細胞において上記タンパク質をコードする核酸配列の発現が可能になる)と、任意で
(iv)脊椎動物特異的な発現制御配列に操作可能に連結した、GDP−D−ラムノース、GDP−D−ペロサミン、GDP−デオキシ−D−タロース、GDP−6−デオキシ−D−アルトロース、GDP−4−ケト−3,6−ジデオキシ−D−マンノース又はGDP−L−コリトースに対するGDP−デオキシヘキソース糖ヌクレオチド輸送体をコードする核酸配列を含む少なくとも1つのポリヌクレオチド(該発現制御配列により上記細胞において上記タンパク質をコードする核酸配列の発現が可能になる)と、
を含む。
i)第1の態様による脊椎動物細胞を準備する工程と、
ii)i)における該細胞からフコシルトランスフェラーゼに対する基質となることができる分子、好ましくはタンパク質又は脂質を単離する工程と、
を含む、自然状態ではその糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有する分子を生成する方法に関する。
i)70%〜95%、すなわち70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%及び95%、好ましくは80%のG0−GlcNac、G0、G1及び/又はG2の複合型N−グリカンと、
ii)5%〜30%、すなわち5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%及び30%、好ましくは20%の高マンノース型N−グリカンと、
を含む糖タンパク質を含む組成物であって、該糖タンパク質の該複合型N−グリカンがフコースを含まない、又はフコースを実質的に含まない、糖タンパク質を含む組成物を提供する。好ましくは、該組成物の糖タンパク質は上記の好ましい糖タンパク質、特に抗体である。
GDP−D−ラムノース、GDP−D−ペロサミン、GDP−デオキシ−D−タロース、GDP−6−デオキシ−D−アルトロース、GDP−4−ケト−3,6−ジデオキシ−D−マンノース又はGDP−L−コリトースに対するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含む第2のポリヌクレオチドが、1つ又は複数の脊椎動物の発現制御配列に操作可能に連結することにより、脊椎動物細胞、例えばHeLa細胞又はCHO細胞において上記グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列の発現が可能になることが好ましい。GDP−D−ラムノース、GDP−D−ペロサミン、GDP−デオキシ−D−タロース、GDP−6−デオキシ−D−アルトロース、GDP−4−ケト−3,6−ジデオキシ−D−マンノース又はGDP−L−コリトースに対するGDP−デオキシヘキソース糖ヌクレオチド輸送体をコードする核酸配列を含む第3のポリヌクレオチドが、1つ又は複数の脊椎動物の発現制御配列に操作可能に連結することにより、脊椎動物細胞、例えばHeLa細胞又はCHO細胞において上記GDP−デオキシヘキソース糖ヌクレオチド輸送体をコードする核酸配列の発現が可能になることも好ましい。
i)基質としてGDP−6−デオキシ−D−リキソ−4−ヘキスロースを使用する酵素をコードする核酸配列を含む第1のポリヌクレオチドと、
ii)タンパク質をコードする核酸配列を含む第2のポリヌクレオチドと、
を含み、該酵素がGDP−6−デオキシ−D−リキソ−4−ヘキスロースをGDP−L−フコースに変換する反応を触媒しない、通常その糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有するタンパク質を生成するための(改変)真核細胞に関する。
i)第8の態様による真核細胞を準備する工程と、
ii)上記細胞において該第1のポリヌクレオチドによりコードされる該酵素及び該第2のポリヌクレオチドによりコードされる該タンパク質を発現する工程と、
iii)上記細胞から該タンパク質を単離する工程と、
を含む、通常その糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有するタンパク質を生成する方法に関する。
1.1 材料及び方法
1.1.1 細胞株
組換えCHO/DG44細胞株CHO−IgGは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損CHO細胞株、CHO/DG44(Urlaubet al., 1986, Proc Natl Acad Sci USA. 83 (2): 337-341)の、治療用モノクローナル抗体(トラスツズマブ(ハーセプチン(商標))の軽鎖及び重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む抗体発現カセットを含有する発現ベクターを用いる安定したトランスフェクションにより本発明者らの研究所で以前に樹立された。細胞株RMD−CHO−IgGの生成は既存のCHO−IgG細胞株から始めた。両方の細胞株が血清無含有培地で維持された。
オキシドレダクターゼRmdに関するアミノ酸配列(緑膿菌PAO1;304個のアミノ酸)(GenBankアクセッション番号GenBank:AAG08839.1)を逆翻訳し、得られたヌクレオチド配列を、CHO細胞(クリセツラス・グリセウス)の要件に適合するように、潜在スプライス部位及びRNA不安定化配列要素のノックアウト、RNA安定性の増大に関する最適化、並びにコドン使用頻度の適応により最適化した。
合成したRMD構築物をEcoRI及びBgl IIにより切断し、ウシ腸ホスファターゼにより脱リン酸化した(dephosphorylated)。消化及び脱リン酸化した挿入物を事前に消化させた2シストロン性の発現ベクターへとライゲートし、それにより2シストロン性のメッセージからのRMDと緑色蛍光タンパク質(gfp)との協調した同時発現が可能になる。発現プラスミドは2シストロン性の発現カセットを安定して組み込んだ細胞の直接選択を可能にするネオマイシン耐性遺伝子を備える。発現プラスミドを構築するための一般的手順は、Sambrook, J., E.F. Fritsch and T. Maniatis: Cloning I/II/III, ALaboratory Manual New York/Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, SecondEditionに記載されている。
IgG1型の治療抗体トラスツズマブを安定して発現するCHO−IgG細胞を、製造業者の取扱説明書(MicroPorator,PEQLAB Biotech, Germany)に従ってエレクトロポレーションによりRMD−gfp導入遺伝子を用いて安定にトランスフェクトした。エレクトロポレーションの24時間後、トランスフェクタントを、抗生物質G418を含有するα−MEMにおいて選択した。それからG418耐性クローンを限界希釈クローニングにより単離した。すなわちG418耐性クローンを、この選択培地中で再懸濁し、ポアソン統計に基づき単一の細胞からコロニーが得られる尤度が95%を超える希釈率で96ウェルプレートに播種した。確実に単クローン性にするために、96ウェル内で成長させた細胞を単離し、限界希釈率で96ウェルプレートに再び播種した。これらの2回の単一細胞のクローニング後、幾つかの単離された単一細胞のクローンをより大きい容量へと増殖させた。その後、それらを懸濁状態での成長に適合させた。培養皿におけるgfp蛍光分布から評価されるように、記載のエレクトロポレーションプロトコルを用いて、2×106個のエレクトロポレーションを行った細胞あたりおよそ2000個という形質転換効率が達成された(図2)。
単一細胞のクローンを96ウェルプレートに播種し、cmountアダプタを取り付けたOlympus IX−50(OlympusOptical Co., Europe)を用いたGFP蛍光のモニタリングにより、RMD組込みの成功に関してスクリーニングした。GFPスキャンに関して、200倍の倍率(extension)で蛍光フィルタを位相差に対して使用した。画像をViewfinder liteの適用により編集した。さらに、RMD導入遺伝子のmRNA発現をRT−PCR分析により確認した。RMD導入遺伝子の発現の成功を、RMD特異的なプライマーセットを使用したRT−PCRにより確認した(図3)。
RMDについて改変したCHO産生クローンにより産生される抗体(RMD−CHO−IgG)の糖構造を、非改変CHO抗体産生細胞から分泌されるIgG1型抗体(CHO−IgG)の糖構造と比較するために、両方の細胞株を使用して、培養上清においてIgG1抗体を産生した。RMD−CHO−IgG抗体産生クローン及びCHO−IgG抗体産生クローンをフコース欠損成長培地において1mlあたり2×105個の細胞で接種した。振盪管を180rpm、37℃、7.5% pCO2下でインキュベートした。細胞が依然として80%を超える生存率(vitality)を示していた場合には7日後に培養を停止させた。生存細胞密度を、トリパンブルー除去法を使用して自動細胞計数器Vi−CELL(商標)XR(Beckman Coulter, Fullerton, CA)により測定した。流加バッチアッセイの期間中の生存率の低下パターン及び流加バッチ振盪器アッセイの3日〜10日の比生産性(specific productivity)(qp)の平均は2つの異なるクローン間で同程度に維持された。それから細胞を10分間、5000rpmの遠心分離によりペレット状にし、上清を別々のバイアルに移した。RMD−CHO IgG細胞及び非改変CHOIgG細胞を同様に培養した。培養上清中の抗体濃度をヒトIgG1に特異的なサンドイッチイムノアッセイによりGyrolab Workstation(Gyros AB, Sweden)で測定した。両方のクローンが対数的に成長し、それぞれのサンプリングデータで同程度のIgG力価が得られ、同程度の初期倍増時間を有していた。両方のクローンがチャイニーズハムスター卵巣細胞に特有の形態を保持していた。
0.2μmのフィルタによる滅菌ろ過後に、上清をプロテインA−セファロースミニカラムに充填した。総容量が10mgのカラム支持材料0.5mlを使用した。カラムは重力流で5カラム体積の20mMのリン酸ナトリウム(pH7.0)で平衡化した。緩やかな流速でのタンパク質結合の後、カラムを平衡化バッファーで2回洗浄した。それから抗体を重力流で4カラム体積の0.1Mのグリシンバッファー(pH3.0)によって溶出した。画分1mlを回収し、1MのTris−HCl(pH9)によってすぐに中和した。それぞれの精製IgG1の完全性及び純度を還元型SDS−PAGE分析により確認した。溶出した抗体の純度は90%を超え、溶出した抗体の組込みは、還元型SDS−PAGE分析により確認した。
各抗体100μgをN連結型オリゴ糖の質量分析による特性化に使用した。タンパク質をトリプシンで消化した(0:2mg/ml、37℃、16時間)後、N−グリカンを37℃で18時間の1単位のペプチド−N−グリコシダーゼF(PNGaseF、Roche Diagnostics)とのインキュベーションにより放出させた。放出されたN−グリカンを、RP−(Sep−Pak C18−)カラム、その後のcarbograph抽出除去カラム上での二段階クロマトグラフィにより回収した(Wuhrer et al., 2006, Glycobiology 16 (2006), pp. 991-1006)。Ciucanu and Kerekにより記載されたように(Ciucanu andKerek, 1984, Carbohydr Res. 1984: 131 :209)、各N−グリカンプールの50%が37℃で18時間の10mUのノイラミニダーゼにより消化され、50%がヨウ化メチルにより過メチル化した。
それぞれの精製したIgG1から放出されるN−グリカンをsmartbeam−II(商標)レーザを備えたUltraFlex III TOF/TOF質量分析計(Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany)により分析した。測定を陽イオンモードで行った。陽イオンを25kVの加速電圧及び10nsの遅延引き出し(extraction delay)に供し、リフレクトロンモードで分析した。分析のために、脱シアル化グリカンをH2Oに溶解し、過メチル化グリカンを70%(v/v)アセトニトリルに溶解した。試料0.5μlを標的上で80% EtOHに溶解したアラビノサゾン(Arabinosazone)(2mg/ml)と1:1(v/v)で混合し、室温で乾燥させた。デキストランラダーによる外部較正を使用した。スペクトルをGlyco−peakfinder(Maas et al., 2007, Proteomics 7, 4435-4444)を用いて分析した。同定したグリカン構造はGlyco Workbenchソフトウェア(Ceroni et al., 2008, J. Proteome Res. 7(4) 1650-1659)を用いて構築した。最終培養培地から精製された生成物のオリゴ糖プロファイル分析により、生成物のN連結型Fcオリゴ糖が高マンノース型及び二分岐複合型のものであること、並びにRMD−CHO−IgGクローンから分泌されたIgG1生成物がコアのフコシル化を完全に欠いていることが確認された。糖構造の分析により、親CHO−IgGクローンのものと比較して、RMDを同時発現するクローンにより産生される抗体の非フコシル化オリゴ糖の割合がそれぞれの場合で、顕著に増大すること(すなわち最大99%、95%、97%及び98%)が示された(図4)。MALDI−Peak相対強度に基づくと、RMD−CHO−IgG細胞で発現されるIgG1抗体産物から得られたN−糖構造には、結合したフコース残基がほぼ完全になく、相対的により大量の高マンノース構造を含有する(図4、パネルA;主要な高マンノース構造を丸で囲った)が、非改変CHO−IgG細胞で発現した治療用IgG1抗体から得られたN糖構造はコア−フコシル化されており、高マンノース構造の含有量は顕著に少ない(フコース残基=丸で囲った三角;図4、パネルB)。
2.2 材料及び方法
2.2.1 細胞株、遺伝子最適化及び合成、RMD発現プラスミドの構築、抗体産生CHO−IgG細胞の非フコシル化抗体を分泌する細胞への変換、蛍光顕微鏡検査及びRT−PCRによるクローンのスクリーニング
RMD−CHO−IgG細胞株を産生するために使用されるCHO−IgG細胞株、RMDの遺伝子最適化及び合成、RMD発現プラスミドの構築、抗体産生CHO−IgG細胞の非フコシル化抗体を分泌する細胞への変換、RMD組込みの成功に関する蛍光顕微鏡検査及びRMD導入遺伝子のmRNA発現の成功に関するRT−PCRによるクローンのスクリーニングに関しては、上述の1.1.1項〜1.1.5項を参照する(1.実験部)。
N−グリカン構造を比較するためにCHO細胞及びRMD−CHO細胞(クローンH1、H2及びH3)の両方を用いてIgGを産生した。4mMのグルタミンを加えたが、抗生物質又はMTXを有しない血清無含有培地(ProBioGenのカスタム製剤;SAFC Bioscience, Lenexa, KA)100mlの入った500ml容の振盪フラスコに細胞を1mlあたり4×105個の細胞で播種した。培養物を180rpm、37℃及び7.5% CO2下でかき混ぜた。培養4日目に細胞に100mlの培養量あたり1.75mlのPBG−Feed Mixを与えた。細胞密度及び細胞生存率を自動ViCell細胞定量システム(Beckman Coulter, Brea, CA)を使用してトリパンブルー除去法により決定した。IgG濃度を決定するために、一定量の細胞培養上清を3日目、5日目及び7日目に回収し、これらをGyrolabサンドイッチイムノアッセイにより測定した。細胞が依然として80%を超える生存率を示していた場合には7日後に培養を停止させた。細胞培養上清を回収し、滅菌ろ過した。
IgG1濃度をGyrolab Workstation(Gyros AB, Uppsala, Sweden)で行われるサンドイッチイムノアッセイにより決定した。このアッセイには、ビオチン化捕捉抗体(IgGのFc部分上のエピトープを認識する)、細胞培養上清試料又はポリクローナルヒトIgG参照基準、及びAlexa Fluor 647標識化検出抗体(IgGのFabドメインにおいてエピトープに結合する)の連続添加が含まれた。試料及び基準を三連で測定した。平均OD、標準偏差(SD)及び変動係数%(%CV)を、それぞれの測定の後に、Gyrolab evaluatorソフトウェアにより自動算出した。記載のIgG1 Gyrolabサンドイッチイムノアッセイは、それぞれの較正基準に対する余り(residuals)が20%の相対誤差(RE)の許容限界を満たすという前提に基づき事前に正当性が認められた。
細胞培養上清を、20mMのリン酸ナトリウム(pH7.0)で予め平衡化した0.5mlのプロテインA−セファロースカラムに充填した。2ベッド体積の平衡化バッファーでカラムを洗浄した後、抗体を4カラム体積の0.1Mのグリシン(pH3.0)で溶出した。画分を回収し、すぐに1MのTris−HCl(pH9)で中和した。それぞれの精製IgG1の完全性及び純度を還元型SDS−PAGE分析により確認した。精製IgGのタンパク質濃度をGyrolabサンドイッチイムノアッセイにより決定した。
IgG(100μg)をトリプシンにより37℃で16時間消化した。95℃で5分間試料を加熱することにより反応を終結させた。抗体を1UのPNGase Fにより37℃で18時間更に消化した。放出されるN−グリカンを、逆相Sep−Pak C18カートリッジ、その後のcarbograph抽出除去カラム上で単離するとともに、脱塩処理した。それぞれのN−グリカンプールを、10mUのノイラミニダーゼにより37℃で18時間消化した。
N−グリカンをsmartbeam−II(商標)レーザ及びLIFT−MS/MS設備を備えたUltraFlex III TOF/TOF質量分析計(Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany)により分析した。スペクトルを25kVの加速電圧及び10nsの遅延引き出しでリフレクターモードで記録した。測定を陽イオンモードで行った。デキストランラダーを使用して外部較正を行った。脱シアル化N−グリカンをH2Oに溶解した。試料0.5μlをスチール標的上で70%エタノール水溶液に溶解したD−アラビノサゾン(5mg/ml)と1:1(v/v)で混合した(Chen et al. 1997)。スペクトルをGlyco−Peakfinderを用いて分析した(Maas et al., 2007)。同定したグリカン構造はGlyco Workbenchソフトウェアを用いて構築した(Ceroni et al., 2008)。
IgG試料のFcγRIIIA結合活性を、少し変更を加えたNiwaet al., 2004に記載のようなFcγRIIIA特異的な結合アッセイにより分析した。ヒスチジン(HIS)タグを付したFcγRIIIA(F158)(22kDa;158F;R&D Systems,Minneapolis, MN)を、受容体結合のために抗テトラHISモノクローナル抗体(Qiagen,Hilden, Germany)とともに使用した。イムノプレート(Maxisorp、Thermo,Waltham, MA)に抗テトラHIS抗体をコーティングし、ブロッキング試薬(RocheDiagnostics, Penzberg, Germany)を用いてブロッキングした。その後、組換えHISタグ付きFcγRIIIAをイムノプレートに加えた。それからコーティングしたプレートを段階的な試料希釈液及び対照とともにインキュベートし、それにより固定化FcγRIIIA受容体に結合させることができる。洗浄工程後、結合したIgGを抗ヒトIgGペルオキシダーゼ結合mAb(Dianova, Hamburg, Germany)により検出し、結合したIgGの量をペルオキシダーゼ活性により定量化した。各インキュベーション工程の後、イムノプレートを0.2% Tween−20を含有するPBSで3回洗浄した。テトラメチルベンジジン(TMB;Seramun, Heidesee, Germany)を発色基質として使用し、反応を1Mの硫酸を用いて終結させ、最後に吸光度を450nmで検出した(Infinite F200リーダー、Tecan, Crailsheim, Germany)。濃度依存的な吸光度データに基づき、十分な曲線の適合を、4パラメータロジスティック曲線モデル(Magellanソフトウェア6.1、Tecan)を用いて行った。このFcγRIIIA結合アッセイに関する系列内(intra-serial)正確性を、15% CV以内であると決定した。
初代ヒトNK細胞を末梢血単核細胞(PBMC)から単離した。PBMCを、密度勾配遠心分離により健常なヒトドナーの全血から分離し、続いてNK細胞を負電磁ビーズ分離により単離した(Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany)。単離したNK細胞の純度を、フローサイトメトリ(PE結合CD16抗体及びAlexa488結合CD56抗体、BD, San Jose, CA)により確認した。細胞株BT−474(Lasfargueset al., 1978、ヒトの乳房の浸潤性腺管癌、CLS、Eppelheim, Germany)及びSK−BR−3(Zabrecky et al., 1991、ヒトの乳房の腺癌、ATCC、Manassas,VA)を標的細胞として使用した。両方の細胞株がフローサイトメトリによりHer2/neuマーカーに対して陽性であることが確認された(データは示さず)。標的細胞株は接種の3日前にresearch cell bankで再活性化させた。抗体依存的なNK細胞により誘導された標的細胞の溶解を、生体染色の放出により定量化した(Calcein AM, Life Technologies, Carlsbad, CA)。標的細胞を製造業者のプロトコルに従い染色し、96ウェルマイクロタイタープレートにおいて、50μL RPMI 1640(Life Technologies)+10% FCS(Biochrom, Berlin, Germany)中、1つのウェルあたり2×104個の生存細胞で播種した。RPMI 1640+10% FCS中で抗体の1:3段階希釈液を調製した。50μL/ウェルのそれぞれの希釈液をn=3でピペッティングし、NK細胞接種前に、37℃で30分間、標的細胞とともにプレインキュベートした。抗体のプレインキュベーションの終了時に、エフェクター細胞を5:1のエフェクター細胞対標的細胞の比(E:T)で播種した。続いてプレートを200gで3分間遠心分離し、37℃で4時間、5% CO2下でインキュベートした。それぞれの細胞株に対して、自発的標的細胞溶解対照(NK細胞なし)、抗体非依存的な標的細胞溶解対照(NK細胞あり)及び総標的細胞溶解対照(サポニンにより誘導される)が誘導された。対照ウェルにおいて総溶解は、インキュベーション期間の終了の15分前にRPMI 1640+10% FCS中、1つのウェルあたり15μLの0.1mg/mLのサポニンを添加することにより誘導された。全ての他のウェルでは、15μLのRPMI 1640+10% FCSを加えた。カルセインAMの放出を培養上清における蛍光検出により定量化した。プレートを遠心分離し(150g、3分)、各ウェルから上清100μLを96ウェルの黒色の蛍光プレート(Thermo)に移した。平均蛍光強度(MFI)をInfinite F200リーダー(Tecan、485nm/535nm 励起/発光フィルタ)を用いて検出した。曲線の適合を、4パラメータロジスティック容量応答モデル(Magellanソフトウェアバージョン6.1)を用いて行った。特異的細胞溶解を以下のように算出した:特異的細胞溶解[%]=[MFI(試料)−MFI(自発的)]/[MFI(総)−MFI(自発的)]×100。MFI(試料)が特異的標的細胞溶解により放出される平均蛍光強度であり、MFI(自発的)が標的細胞による蛍光色素の段階的な放出であり、MFI(総)が洗浄剤により誘導される総標的細胞溶解後に得られた平均蛍光強度である。
細胞(3×107個)を上清から100gで5分間の遠心分離により分離した。続いて細胞を3回の凍結融解サイクルにより溶解させた。それから細胞膜を細胞質画分から4℃で30分間、21000gで分離した。細胞培養上清、細胞膜、細胞質画分及びIgG N−グリカンを100℃で4時間、2NのTFAにおいて加水分解した。還元雰囲気下での蒸発の後に、試料をDionexのICS−3000を用いてPA−1カラム上でHPAEC−PADにより分析し、2−デオキシリボースを内部標準として使用した。中性の単糖を2.25mMのNaOHを用いた定組成溶出により分離した。200mMのNaOHのポストカラム添加により、アンペロメトリ検出が可能になった。HPAEC−PADでは、エナンチオマー同一性を評価することができない(Horton, D. 2004)ため、L−ラムノースを標準として用いて、D−ラムノースで予測される保持時間を求めた。ラムノースに関するLODを、分析手順のバリデーションのためのICHの三極共通ガイドライン(harmonized tripartite guideline)(ICHQ2(R1))の第6.3章に記載のように求めた。
2.3.1 RMD導入遺伝子の異種発現
分泌されたIgGのフコシル化レベルに対するRMD導入遺伝子発現の効果を評価するために、GDP−6−デオキシ−D−リキソ−4−ヘキスロースレダクターゼ(RMD)及び緑色蛍光タンパク質(gfp)に関する遺伝子を含む2シストロン性の発現カセットを備えたベクターを生成し、バイオシミラー(biosimilar:後発生物製剤)バージョンのIgG1型治療抗体トラスツズマブ(ハーセプチン(商標)、Roche)の過剰発現及び分泌のために事前に改変されたCHO/DG44クローンに導入した。導入遺伝子を発現するG418耐性クローンをそのgfp媒介性の緑色蛍光により同定し、トランスフェクションの2週間以内に現れた。gfp蛍光分布から評価されるように、エレクトロポレーションによりおよそ80%の形質転換効率が達成された(データは示していないが、図2に示されるデータと同じようなものである)。RMD導入遺伝子の発現の成功を、RMD特異的なプライマーセットを使用したRT−PCRにより確認した(データは示していないが、図3に示されるデータと同じようなものである)。RMD導入遺伝子を発現する改変CHO細胞はRMD−CHOと呼ばれる。
非改変の親CHO細胞及びIgGを産生するトランスフェクトしたRMD−CHO細胞の血清無含有流加バッチ培養を、L−グルタミンを加えたフコース欠損成長培地の入った50ml容のバイオリアクター管において行った。バイオリアクター管を1mlあたり4×105個の細胞の出発細胞密度で接種し、その後180rpm、37℃、7.5% pCO2下でインキュベートした。流加バッチ培養の性能を14日間モニタリングし、並べて比較した。CHO細胞及びRMD−CHO細胞の並行した流加バッチ培養の比較分析では、14日間で顕著な偏差は示されなかった。それぞれのサンプリング日での初期倍増速度、増殖速度及びIgG力価は両方の細胞株で一致していた。両方のクローンはCHO細胞に特有の形態を保持していた。流加バッチアッセイの期間中の生存率の低下パターン及び流加バッチ振盪器アッセイの3日〜10日の比生産性(qp)の平均は2つの異なるクローン間で同程度に維持された(データは示さず)。
CHO細胞及びRMD−CHO細胞をバッチ培養で成長させた。IgGを産生する3つの異なるRMD−CHOクローン、すなわちH1、H2及びH3を使用した。細胞を1mLあたり4×105個の細胞の出発細胞密度で接種し、180rpm、37℃、7.5% pCO2下でバイオリアクター管において7日間成長させた。上清を7日目に収集し、IgG試料をプロテインAアフィニティクロマトグラフィにより精製した。溶出した抗体の純度及び完全性を還元型SDS−PAGEにより確認した。PNGase Fを用いて放出させたN−グリカンを脱シアル化し、続いてMALDI−TOF−MSにより分析した。N−グリカンのシグナル強度の相対的定量化を、クロマトグラフ方法と比較してより信頼性のある結果を得られることが以前に実証されたように行った(Wada et al., 2007)。高マンノース型及び複合型の二分岐(diantennary)N−グリカン構造を全ての試料で検出した(図5)。モノフコシル化された非ガラクトシル化/モノガラクトシル化/ジガラクトシル化二分岐N−グリカンは、野生型(WT)IgGで見られる3つの最も豊富なN−グリカン構造であった(図5A)。これらのピーク、すなわちm/z1485.4、1647.4及び1809.4でのコア−フコースの存在が、MALDI−TOF/TOFにより確認された。診断用の断片イオンdHex1HexNAc2は、いずれのスペクトルにおいてもm/z592.8で観察された。RMD−CHO細胞から産生されたIgG試料において、最大でN−グリカンプール全体の2%を表す(試料H2)、ごく微量のフコースが観察された(図5B、図5C、図5D)。同時に、試料H2はWT IgGよりも大量の高マンノース構造を含有していた。
IgG1とそのコグネートFc受容体FcγRIIIaとの間の比較的弱い相互作用(Kd 約1μM)がADCCエフェクター機能に寄与する主な因子の1つであるため(Sondermannet al., 2000)、FcγRIIIa結合アッセイはIgG1モノクローナル抗体試料のADCC活性を予測する間接的な評価基準である。RMD−CHO細胞から分泌される非フコシル化IgGのFcγRIIIa結合は、野生型CHO細胞から分泌されるフコシル化IgGと比較して大きく増大しており、約16倍少ないタンパク質でFcγRIIIa−158Fと同等に結合する(図6A、図6B)。データは、参照としてフコシル化IgGを用いた、非フコシル化IgGの結合の相対的な増加倍率として図6Bに報告される。
ADCC活性を分析するために、単離したNK細胞及びHER2を発現する標的細胞を、非フコシル化IgG及びフコシル化IgGの段階希釈液とともに同時インキュベートした。アッセイの必要条件として、NK細胞を73%の純度レベルで全血試料から単離した(図7)。技術的な(technical)NK細胞の細胞毒性対照は、ADCCアッセイに使用されるドナー材料に対して77%の特異的溶解活性を示した(図7)。HER2を発現する標的細胞株BT−474(ヒトの乳房の浸潤性腺管癌から単離した)をADCCアッセイに使用した。BT−474標的細胞株は、ADCC以外の機構によってもNK細胞により攻撃を受ける。BT−474細胞は平均値16%の抗体非依存的な細胞溶解を示す(データは示さず)。IgG試料により誘導される特異的細胞溶解に関するデータを図8に示す。3つ全ての非フコシル化IgG試料(H1〜H3)はWT抗体と比較してADCC応答の増大を誘導した(図8)。非フコシル化IgG試料H2は最大のADCC応答を誘導した(図8)。SK−BR−3細胞(乳房のHER2陽性腺癌)を該アッセイにおいて標的細胞として使用した場合に、同様の結果が得られた。BT−474細胞及びSK−BR−3細胞とともにインキュベートした非フコシル化IgG試料及びフコシル化IgG試料に関して算出されたEC50値を表2に要約する(下記を参照されたい)。野生型IgGと変異体H1〜H3との間で観察されるEC50シフトは、ADCCアッセイで使用される標的細胞株に関係なく同程度のままであった(図8)。HER2陽性のBT474標的細胞株及びSK−BR−3標的細胞株、並びに精製NK細胞の存在下で、非フコシル化IgGは0.443μg/ml及び0.00817μg/mlの平均EC50値で平均16倍の抗体媒介性の標的細胞枯渇活性を示し、このことはフコシル化IgGと比較してはるかに高い有効性を示していた。FcγRIIIa結合活性の増大を示した非フコシル化IgG試料が、WT IgGと比較してより高いADCC応答も誘導したことに留意されたい。
比
細胞膜、培養上清及び細胞質画分をRMD−CHO細胞から単離した。続いて単糖を放出させ、HPAEC−PADにより分析した。予想通り、フコースはCHO細胞に存在し、RMD−CHO細胞には存在しなかった。検出限界(LOD)を超えるレベルのラムノースは細胞質画分では観察されなかった(図9)。較正曲線のy切片及び傾きの標準偏差に基づくと、LODは10μlの試料注入容量あたりラムノース及びフコースに対してそれぞれ1.2pmol及び1.1pmolであった。同様に、RMD−CHO細胞を用いて産生される精製抗体から放出されたN−グリカンをTFAによって加水分解し、得られる単糖をHPAEC−PADにより分析した。TFAで加水分解したN−グリカンは、LODを超えるラムノースピークを全く生じなかった(図10)。結論として、RMD−CHO細胞も分泌された抗体も検出可能な量のラムノースを含有してない。
本発明者らは、細胞質のフコースde novo合成経路由来の重要な代謝中間体の連続除去のために改変された細胞株からのフコース欠損mAbの分泌を達成するための糖鎖改変アプローチを評価した(図1)。本発明者らのデータは、異種細菌酵素のトランスジェニック発現が、新生糖タンパク質N−グリカン上でのフコースの合成の所望の阻止を引き起こすことをはっきりと示している。この方法によるフコース枯渇の程度は、培養培地からのフコースの排除がサルベージ経路(遮断されなければ(otherwise)細胞質のGDP−フコースの代替供給源として働くことのできる)を完全に遮断するのに十分であったことも示している。
ACN、アセトニトリル;CHO、チャイニーズハムスター卵巣;CV、変動係数;dHex、デオキシヘキソース;EC50、50%最大有効濃度(すなわち、基準線応答と最大応答との中間の応答を誘起するアゴニストの濃度)、Fuc、フコース;Gal、ガラクトース;GalNAc、N−アセチルガラクトサミン;GlcNAc、N−アセチルグルコサミン;GMER、GDP−4−ケト−6−デオキシ−D−マンノース−3,5−エピメラーゼ/4−レダクターゼ;HPLC、高速液体クロマトグラフィ;HPAEC−PAD、パルスアンペロメトリ検出を伴う高pHアニオン交換クロマトグラフィ;LOD、検出限界;mAb、モノクローナル抗体;MALDI−TOF−MS、マトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析法;MEM、変法イーグル培地;PBMC、末梢血単核細胞;PBS、リン酸バッファー生理食塩水;PNGase F、ペプチド−N4−(N−アセチル−β−グルコサミニル)アスパラギンアミダーゼF;Rha、ラムノース;RMD、GDP−6−デオキシ−D−リキソ−4−ヘキスロースレダクターゼ;SDS、ドデシル硫酸ナトリウム;TFA、トリフルオロ酢酸。
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Claims (27)
- 自然状態ではその糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有する分子を生成するための脊椎動物細胞であって、
基質としてGDP−6−デオキシ−D−リキソ−4−ヘキスロースを使用するが、GDP−6−デオキシ−D−リキソ−4−ヘキスロースをGDP−L−フコースに変換する反応を触媒しない酵素を少なくとも1つ含む、自然状態ではその糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有する分子を生成するための脊椎動物細胞。 - 基質としてGDP−6−デオキシ−D−リキソ−4−ヘキスロースを使用する該酵素が、GDP−6−デオキシ−D−リキソ−4−ヘキスロースレダクターゼ(RMD)、GDP−ペロサミンシンテターゼ(Per)、GDP−6−デオキシ−D−タロースシンテターゼ(GTS)、GDP−フコースシンテターゼCys109Ser(GFS−Cys109Ser)突然変異体、GDP−4−ケト−6−デオキシマンノース−3−デヒドラターゼ(ColD)、又はGDP−L−コリトースシンターゼ(ColC)と組み合わせたGDP−4−ケト−6−デオキシマンノース−3−デヒドラターゼ(ColD)、及びそれらの変異体からなる群から選択される、請求項1に記載の脊椎動物細胞。
- GDP−6−デオキシ−D−リキソ−4−ヘキスロースレダクターゼ(RMD)が緑膿菌由来(配列番号1)である、請求項2に記載の脊椎動物細胞。
- GDP−D−ラムノース、GDP−D−ペロサミン、GDP−デオキシ−D−タロース、GDP−6−デオキシ−D−アルトロース、GDP−4−ケト−3,6−ジデオキシ−D−マンノース、及び/又はGDP−L−コリトースを更に含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の脊椎動物細胞。
- 前記細胞に一時的に存在する又は安定して維持される核酸から該酵素が発現される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の脊椎動物細胞。
- フコシルトランスフェラーゼに対する基質となることができる少なくとも1つの分子を更に含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の脊椎動物細胞。
- 分子がタンパク質又は脂質である、請求項6に記載の脊椎動物細胞。
- タンパク質が内因性タンパク質又は外因性タンパク質である、請求項7に記載の脊椎動物細胞。
- タンパク質が、抗体、若しくはIgG1抗体、抗体断片、若しくは抗体のFc領域を含む抗体断片、融合タンパク質、若しくは抗体のFc領域を含む融合タンパク質、ウイルスタンパク質、ウイルスタンパク質断片、抗原、又はホルモンである、請求項7又は8に記載の脊椎動物細胞。
- 哺乳類細胞、魚類細胞、両生類細胞、爬虫類細胞又は鳥類細胞である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の脊椎動物細胞。
- i)哺乳類細胞がヒト細胞、ハムスター細胞、イヌ細胞若しくはサル細胞、若しくはチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO−76)(ATCC CRL−1587)、ヒト子宮頸癌細胞(HELA)(ATCC CCL 2)、メイディンダービーイヌ腎臓細胞(MDCK)(ATCC CCL 34)、ヒトPER.C6細胞、若しくはヒトAGE1.HN細胞であり、
ii)魚類細胞がアメリカナマズ(チャネル・キャットフィッシュ)卵巣(CCO)細胞(ATCC CRL−2772)であり、
iii)両生類細胞がアフリカツメガエル腎臓細胞(ATCC CCL−102)であり、
iv)爬虫類細胞がグリーンイグアナ心臓細胞(IgH−2)(ATCC CCL−108)であり、又は
v)鳥類細胞がトリ網膜細胞、若しくはAGE1.CR.PIX細胞、若しくはトリ体節細胞である、請求項10に記載の脊椎動物細胞。 - GDP−D−ラムノース、GDP−D−ペロサミン、GDP−デオキシ−D−タロース、GDP−6−デオキシ−D−アルトロース、GDP−4−ケト−3,6−ジデオキシ−D−マンノース又はGDP−L−コリトースに対する少なくとも1つのグリコシルトランスフェラーゼを更に含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の脊椎動物細胞。
- 自然状態ではその糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有する分子を生成する方法であって、
i)請求項1〜12のいずれか一項に記載の脊椎動物細胞を準備する工程と、
ii)i)における該細胞からフコシルトランスフェラーゼに対する基質となることができる分子、又はタンパク質若しくは脂質を単離する工程と、
を含む、自然状態ではその糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有する分子を生成する方法。 - 請求項13に記載の方法により入手可能な、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有する分子。
- 請求項14に記載の分子の組成物。
- i)70%〜95%のG0−GlcNac、G0、G1及び/又はG2の複合型N−グリカンと、
ii)5%〜30%の高マンノース型N−グリカンと、
を含む糖タンパク質を含む組成物であって、該糖タンパク質の該複合型N−グリカンがフコースを含まない、又はフコースを実質的に含まない、糖タンパク質を含む組成物。 - 複合型N−グリカンの75%がG0の複合型N−グリカンであり、25%がG0−GlcNac、G1及び/又はG2の複合型N−グリカンである、請求項16に記載の組成物。
- 高マンノース型N−グリカンの50%がman5グリカンであり、50%がman6、man7及び/又はman8のN−グリカンである、請求項16に記載の組成物。
- 糖タンパク質が抗体、又はIgG1である、請求項16〜18のいずれか一項に記載の組成物。
- D−ラムノース、D−ペロサミン、デオキシ−D−タロース、6−デオキシ−D−アルトロース、4−ケト−3,6−ジデオキシ−D−マンノース及び/又はL−コリトースを含有する糖部分を含む、タンパク質又は脂質。
- 基質としてGDP−6−デオキシ−D−リキソ−4−ヘキスロースを使用するが、GDP−6−デオキシ−D−リキソ−4−ヘキスロースをGDP−L−フコースに変換する反応を触媒しない酵素をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドに操作可能に連結した脊椎動物の発現制御配列を1つ又は複数含む発現単位。
- 基質としてGDP−6−デオキシ−D−リキソ−4−ヘキスロースを使用する該酵素が、GDP−6−デオキシ−D−リキソ−4−ヘキスロースレダクターゼ(RMD)、GDP−ペロサミンシンテターゼ(Per)、GDP−6−デオキシ−D−タロースシンテターゼ(GTS)、GDP−フコースシンテターゼCys109Ser(GFS−Cys109Ser)突然変異体、GDP−4−ケト−6−デオキシマンノース−3−デヒドラターゼ(ColD)、又はGDP−L−コリトースシンターゼ(ColC)と組み合わせたGDP−4−ケト−6−デオキシマンノース−3−デヒドラターゼ(ColD)、及びそれらの変異体からなる群から選択される、請求項21に記載の発現単位。
- 通常その糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有するタンパク質を生成するための真核細胞であって、
i)基質としてGDP−6−デオキシ−D−リキソ−4−ヘキスロースを使用する酵素をコードする核酸配列を含む第1のポリヌクレオチドと、
ii)タンパク質をコードする核酸配列を含む第2のポリヌクレオチドと、
を含み、該酵素がGDP−6−デオキシ−D−リキソ−4−ヘキスロースをGDP−L−フコースに変換する反応を触媒しない、通常その糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有するタンパク質を生成するための真核細胞。 - 基質としてGDP−6−デオキシ−D−リキソ−4−ヘキスロースを使用する該酵素が、GDP−6−デオキシ−D−リキソ−4−ヘキスロースレダクターゼ(RMD)、GDP−ペロサミンシンテターゼ(Per)、GDP−6−デオキシ−D−タロースシンテターゼ(GTS)、GDP−フコースシンテターゼCys109Ser(GFS−Cys109Ser)突然変異体、GDP−4−ケト−6−デオキシマンノース−3−デヒドラターゼ(ColD)、又はGDP−L−コリトースシンターゼ(ColC)と組み合わせたGDP−4−ケト−6−デオキシマンノース−3−デヒドラターゼ(ColD)、及びそれらの変異体からなる群から選択される、請求項23に記載の真核細胞。
- タンパク質が、抗体、若しくはIgG1抗体、抗体断片、若しくは抗体のFc領域を含む抗体断片、抗体のFc領域を含む融合タンパク質、ウイルスタンパク質、ウイルスタンパク質断片、抗原、又はホルモンである、請求項23又は24に記載の真核細胞。
- 通常その糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有するタンパク質を生成する方法であって、
i)請求項23〜25のいずれか一項に記載の真核細胞を準備する工程と、
ii)前記細胞において該第1のポリヌクレオチドによりコードされる該酵素及び該第2のポリヌクレオチドによりコードされる該タンパク質を発現する工程と、
iii)前記細胞から該タンパク質を単離する工程と、
を含む、通常その糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有するタンパク質を生成する方法。 - 請求項26に記載の方法により入手可能な、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有するタンパク質。
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