JP2015502144A - Alg3の発現を欠損したピキア・パストリス(Pichiapastris)株中のN−グリカン占有率を増加させ、ハイブリッドN−グリカンの産生を低減させる方法 - Google Patents
Alg3の発現を欠損したピキア・パストリス(Pichiapastris)株中のN−グリカン占有率を増加させ、ハイブリッドN−グリカンの産生を低減させる方法 Download PDFInfo
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Abstract
ドリキル−P−Man:Man5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3マンノシルトランスフェラーゼ(Alg3p)活性を欠損した組換え宿主細胞中で産生される組換え糖タンパク質のパウチマンノースまたは複合型N−グリカンの産生量およびN−グリコシル化部位占有率を増加させる方法が開示される。詳細には、宿主細胞中でのOS−9ファミリー遺伝子の発現の破壊を含む組換え宿主細胞が提供される。これらの組換え宿主細胞は、その結果、組換え糖タンパク質を生産するために用いられ得る。さらなる実施形態において、組換え宿主細胞は、少なくとも1の異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをさらに過剰発現し、これは、特定の実施形態において、酵母オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OTase)複合体の少なくとも1の必須タンパク質の突然変異の致死表現型を機能的に抑制する能力がある。【選択図】図17
Description
本発明は、ドリキル−P−Man:Man5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3マンノシルトランスフェラーゼ(Alg3p)活性を欠損した組換え宿主細胞中で産生される組換え糖タンパク質のパウチマンノース(paucimannose)または複合型N−グリカンの産生量およびN−グリコシル化部位占有率を増加させる方法に関する。詳細には、本発明は、宿主細胞中でのOS−9ファミリー遺伝子の発現の破壊を含む組換え宿主細胞を提供する。さらなる実施形態において、組換え宿主細胞は、少なくとも1の異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをさらに過剰発現し、これは、特定の実施形態において、酵母オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OTase)複合体の少なくとも1の必須タンパク質の突然変異の致死表現型を機能的に抑制する能力がある。
組換えヒトタンパク質の生産が可能になったことにより、ヒトの医療は大きく進歩しており、依然として創薬の活発な領域である。多くの治療用タンパク質は、適切な構造−機能活性およびヒト血清中でのその後の安定性を確保するため、タンパク質の特定のアスパラギン残基へのグリカンの翻訳後付加(N−グリコシル化)を必要とする。ヒトにおける治療用途の場合、糖タンパク質はヒト様のN−グリコシル化を必要とする。ヒト様の糖タンパク質プロセシングを模倣することができる哺乳動物細胞株(例として、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト網膜細胞)には、低いタンパク質力価、長い発酵時間、不均一な生産物および継続的なウイルスの封じ込めなど、いくつかの欠点がある。それ故、短い発酵時間で高いタンパク質力価を生じさせるだけでなく、ヒト様の糖タンパク質を産生することもできる発現系を用いるのが望ましい。
真菌の宿主、例えばサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)または例えばピキア・パストリスなどのメチロトローフ酵母などは、治療用タンパク質発現のための異なる利点を有しており、例えば、これらは内在性タンパク質を大量に分泌せず、異種タンパク質を産生させるための強い誘導性プロモーターが利用可能であり、動物血清の使用を伴わずに合成培地中で増殖させることができ、および高力価の組換えタンパク質を産生することができる(Cregg et al.,FEMS Microbiol.Rev.24:45−66(2000))。しかしながら、酵母中で発現したグリコシル化タンパク質は、一般に、「高マンノース」グリカンをもたらす付加的なマンノース糖を含有する。これらの高マンノースN−グリカンはある特定の個体に投与された場合に有害な応答をもたらすことがあるため、酵母は一般に、ヒトでの使用が意図される治療用糖タンパク質の生産に用いられなかった。しかしながら、ヒト様のN−グリカンを産生するように酵母を遺伝子操作する方法は、米国特許第7,029,872号および第7,449,308号中に、米国特許出願公開第20040230042号、第20040171826号、第20050170452号、第20050208617号、第20050208617号および第20060286637号中に記載されている方法と共に、記載されている。これらの方法は、酵母型N−グリカンの代わりにヒト様の複合型またはハイブリッドN−グリカンを優勢に有する治療用糖タンパク質を産生することができる組換え酵母を構築するのに用いられている。
遺伝子操作酵母は哺乳動物様またはヒト様のN−グリカンを有する糖タンパク質を産生することができるが、糖タンパク質上のN−グリカン付着部位の占有率は幅広く変動し、一般に、哺乳動物細胞中で産生される糖タンパク質におけるこれら同部位の占有率より低いことが見出されている。このことは、ピキア・パストリス中で産生される様々な組換え抗体について観察されている。しかしながら、N−グリカン付着部位の占有率の変動はまた、哺乳動物細胞においても同様に観察されている。例えば、Gawlitzek et al.,Identification of cell culture conditions to control N−glycosylation site−occupancy of recombinant glycoproteins expressed in CHO cells,Biotechnol.Bioengin.103:1164−1175(2009)は、N−グリコシル化部位占有率がCHO細胞中で産生される個別の糖タンパク質の個別の部位によって変動することがあること、および増殖条件の改変によりこれらの部位における占有率の制御が可能であることを開示した。国際出願公開第WO2006107990号は、ドリコール結合オリゴ糖の合成経路を用いて真核細胞のタンパク質N−グリコシル化を改善する方法を開示している。N−グリコシル化部位占有率の制御については、Jones et al.,Biochim.Biophys.Acta.1726:121−137(2005)により概説されている。
しかしながら、特定の遺伝的バックグラウンドを有する組換え宿主細胞中で産生される治療用タンパク質のN−グリコシル化部位占有率を増加させる方法へのニーズはなお存在する。
Cregg et al.,FEMS Microbiol.Rev.24:45−66(2000)
Gawlitzek et al.,Identification of cell culture conditions to control N−glycosylation site−occupancy of recombinant glycoproteins expressed in CHO cells,Biotechnol.Bioengin.103:1164−1175(2009)
Jones et al.,Biochim.Biophys.Acta.1726:121−137(2005)
本発明は、ドリキル−P−Man:Man5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3マンノシルトランスフェラーゼ(Alg3p)活性を欠損した組換え宿主細胞中で産生される組換え糖タンパク質のパウチマンノースまたは複合型N−グリカンの産生量およびN−グリコシル化部位占有率を増加させる方法を提供する。詳細には、本発明は、宿主細胞中でのOS−9ファミリー遺伝子の発現の破壊を含む組換え宿主細胞を提供する。これらの組換え宿主細胞は、その結果、パウチマンノースまたは複合型N−グリカンを優勢に有する組換え糖タンパク質を生産するために用いられ得る。さらなる実施形態において、組換え宿主細胞は、少なくとも1の異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをさらに過剰発現し、これは、特定の実施形態において、酵母オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OTase)複合体の少なくとも1の必須タンパク質の突然変異の致死表現型を機能的に抑制する能力がある。例えば、宿主細胞は、リーシュマニア属種(Leishmania sp.)のSTT3Aタンパク質(LmSTT3A)、STT3Bタンパク質(LmSTT3B)、STT3Dタンパク質(LmSTT3D)またはそれらの組み合わせである少なくとも1の単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをさらに発現し得る。少なくとも1のリーシュマニア属種STT3、例えばLmSTT3Dを発現する組換え宿主細胞は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼを発現しない組換え宿主細胞よりもN−グリコシル化部位占有率が高い糖タンパク質を産生する。パウチマンノースN−グリカンまたは複合型N−グリカンを優勢に産生するように遺伝子操作された組換え宿主細胞において、組換え宿主細胞により産生される糖タンパク質組成物中のハイブリッドN−グリカンのモルパーセントは、OS−9ファミリー遺伝子を発現する宿主細胞中に存在するであろう量と比べて低減するであろう。
それ故、上記の1の態様において、内在性ドリキル−P−Man:Man5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3マンノシルトランスフェラーゼ(ALG3)遺伝子の発現の破壊、内在性骨肉腫9(OS−9)ファミリー遺伝子またはそのホモログの発現の破壊、および異種糖タンパク質をコードする核酸分子を包含し、内在性OTase複合体を構成するタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子を発現する組換え宿主細胞を用意すること;ならびに異種糖タンパク質を発現させるための条件下で宿主細胞を培養して異種糖タンパク質を産生させることを含む、組換え宿主細胞中で異種糖タンパク質を生産する方法が提供される。
上記のさらなる態様において、内在性ドリキル−P−Man:Man5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3マンノシルトランスフェラーゼ(ALG3)遺伝子の発現の破壊、内在性骨肉腫9(OS−9)ファミリー遺伝子またはそのホモログの発現の破壊、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする少なくとも1の核酸分子および異種糖タンパク質をコードする核酸分子を包含する組換え宿主細胞を用意すること;ならびに異種糖タンパク質を発現させるための条件下で宿主細胞を培養して異種糖タンパク質を産生させることを含む、宿主細胞中で哺乳動物様またはヒト様の複合型またはハイブリッドN−グリカンを持つ異種糖タンパク質を生産する方法が提供される。
上記方法のさらなる態様において、宿主細胞は、ピキア・パストリス、ピキア・フィンランディカ(Pichia finlandica)、ピキア・トレハロフィラ(Pichia trehalophila)、ピキア・コクラマエ(Pichia koclamae)、ピキア・メンブラナエファシエンス(Pichia membranaefaciens)、ピキア・オプンティアエ(Pichia opuntiae)、ピキア・サーモトレランス(Pichia thermotolerans)、ピキア・サリクタリア(Pichia salictaria)、ピキア・グエルクウム(Pichia guercuum)、ピキア・ピペリ(Pichia pijperi)、ピキア・スティプティス(Pichia stiptis)、ピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)、ピキア・ミヌータ(Pichia minuta)(オガタエア・ミヌータ(Ogataea minuta)、ピキア・リンドネリ(Pichia lindneri))、ピキア属種(Pichia sp.)、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス属種(Saccharomyces sp.)、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、クリベロマイセス属種(Kluyveromyces sp.)、クリベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)、クリソスポリウム・ラクノウェンス(Chrysosporium lucknowense)、フザリウム属種(Fusarium sp.)、フザリウム・グラミネウム(Fusarium gramineum)、フザリウム・ベネナタム(Fusarium venenatum)およびニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)よりなる群から選択される。他の態様において、宿主細胞は、昆虫、植物または哺乳動物の宿主細胞である。
上記のさらなる態様において、内在性ドリキル−P−Man:Man5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3マンノシルトランスフェラーゼ(ALG3)遺伝子の発現の破壊、内在性骨肉腫9(OS−9)ファミリー遺伝子またはそのホモログの発現の破壊、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする少なくとも1の核酸分子および異種糖タンパク質をコードする核酸分子を包含し、内在性OTase複合体を構成するタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子を発現する組換え下等真核生物宿主細胞を用意すること;ならびに異種糖タンパク質を発現させるための条件下で宿主細胞を培養して異種糖タンパク質を産生させることを含む、下等真核生物宿主細胞中で異種糖タンパク質を生産する方法が提供される。
上記方法のさらなる態様において、下等真核生物宿主細胞は、ピキア・パストリス、ピキア・フィンランディカ、ピキア・トレハロフィラ、ピキア・コクラマエ、ピキア・メンブラナエファシエンス、ピキア・オプンティアエ、ピキア・サーモトレランス、ピキア・サリクタリア、ピキア・グエルクウム、ピキア・ピペリ、ピキア・スティプティス、ピキア・メタノリカ、ピキア・ミヌータ(オガタエア・ミヌータ、ピキア・リンドネリ)、ピキア属種、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス属種、ハンゼヌラ・ポリモルファ、クリベロマイセス属種、クリベロマイセス・ラクティス、カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼ、トリコデルマ・リーゼイ、クリソスポリウム・ラクノウェンス、フザリウム属種、フザリウム・グラミネウム、フザリウム・ベネナタムおよびニューロスポラ・クラッサよりなる群から選択される。
上記のさらなる態様において、内在性ドリキル−P−Man:Man5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3マンノシルトランスフェラーゼ(ALG3)遺伝子の発現の破壊、内在性YOS9遺伝子またはそのホモログの発現の破壊および異種糖タンパク質をコードする核酸分子を包含する組換え酵母宿主細胞を用意すること;ならびに異種糖タンパク質を発現させるための条件下で宿主細胞を培養して異種糖タンパク質を産生させることを含む、組換え酵母宿主細胞中で異種糖タンパク質を生産する方法が提供される。
上記方法において、組換え酵母宿主細胞は、酵母のN−グリカンパターンを持つ糖タンパク質を産生するか、または酵母は高マンノシル化(hypermannosylation)を欠くが高マンノースのN−グリカンを産生する酵母パターンを持つ糖タンパク質を産生するように遺伝子操作されている。例えば、酵母を、α1,6−マンノシルトランスフェラーゼ活性、例として、Och1p活性を欠損するように遺伝子操作することができる。さらなる態様において、酵母は、哺乳動物様またはヒト様のN−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝子操作される。
さらなる実施形態において、宿主細胞は、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする少なくとも1の核酸分子および異種糖タンパク質をコードする核酸分子をさらに包含する。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、OTase複合体、例えば、酵母OTase複合体の少なくとも1の必須タンパク質の突然変異の致死表現型を機能的に抑制する能力がある。さらなる態様において、OTase複合体の必須タンパク質は、サッカロマイセス・セレビシエおよび/またはピキア・パストリスのSTT3遺伝子座、WBP1遺伝子座、OST1遺伝子座、SWP1遺伝子座もしくはOST2遺伝子座、またはそれらのホモログによりコードされる。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア属種のSTT3Aタンパク質、STT3Bタンパク質、STT3Cタンパク質、STT3Dタンパク質またはそれらの組み合わせである。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア・メジャーのSTT3Aタンパク質、STT3Bタンパク質、STT3Dタンパク質またはそれらの組み合わせである。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア・メジャーSTT3Dタンパク質である。さらなる態様において、例としての単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア・メジャーSTT3Dタンパク質であり、これは、サッカロマイセス・セレビサエ(Saccharomyces cerevisae)OTase複合体の少なくとも1の必須タンパク質の致死表現型を機能的に抑制する(またはレスキューもしくは補完する)能力がある。さらなる態様において、内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OTase)複合体を構成するタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子が発現される。
上記方法のさらなる態様において、酵母宿主細胞は、ピキア・パストリス、ピキア・フィンランディカ、ピキア・トレハロフィラ、ピキア・コクラマエ、ピキア・メンブラナエファシエンス、ピキア・オプンティアエ、ピキア・サーモトレランス、ピキア・サリクタリア、ピキア・グエルクウム、ピキア・ピペリ、ピキア・スティプティス、ピキア・メタノリカ、ピキア・ミヌータ(オガタエア・ミヌータ、ピキア・リンドネリ)、ピキア属種、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス属種、ハンゼヌラ・ポリモルファ、クリベロマイセス属種、クリベロマイセス・ラクティスおよびカンジダ・アルビカンスよりなる群から選択される。
上記のさらなる態様において、内在性ドリキル−P−Man:Man5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3マンノシルトランスフェラーゼ(ALG3)遺伝子の発現の破壊、内在性YOS9遺伝子またはそのホモログの発現の破壊および異種糖タンパク質をコードする核酸分子を包含し、内在性OTase複合体を構成するタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子を発現する組換え宿主細胞を用意すること;ならびに異種糖タンパク質を発現させるための条件下で宿主細胞を培養して異種糖タンパク質を産生させることを含む、組換え酵母宿主細胞中で異種糖タンパク質を生産する方法が提供される。
上記方法において、組換え酵母宿主細胞は、酵母のN−グリカンパターンを持つ糖タンパク質を産生するか、または酵母は高マンノシル化を欠くが高マンノースのN−グリカンを包含する酵母パターンを持つ糖タンパク質を産生するように遺伝子操作されている。例えば、酵母を、α1,6−マンノシルトランスフェラーゼ活性、例として、Och1p活性を欠損するように遺伝子操作することができる。さらなる態様において、酵母は、哺乳動物様またはヒト様のN−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝子操作される。
さらなる実施形態において、宿主細胞は、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする少なくとも1の核酸分子および異種糖タンパク質をコードする核酸分子をさらに包含する。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、OTase複合体、例えば、酵母OTase複合体の少なくとも1の必須タンパク質の突然変異の致死表現型を機能的に抑制する能力がある。さらなる態様において、OTase複合体の必須タンパク質は、サッカロマイセス・セレビシエおよび/またはピキア・パストリスのSTT3遺伝子座、WBP1遺伝子座、OST1遺伝子座、SWP1遺伝子座もしくはOST2遺伝子座、またはそれらのホモログによりコードされる。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア属種のSTT3Aタンパク質、STT3Bタンパク質、STT3Cタンパク質、STT3Dタンパク質またはそれらの組み合わせである。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア・メジャーのSTT3Aタンパク質、STT3Bタンパク質、STT3Dタンパク質またはそれらの組み合わせである。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア・メジャーSTT3Dタンパク質である。さらなる態様において、例としての単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア・メジャーSTT3Dタンパク質であり、これは、サッカロマイセス・セレビサエOTase複合体の少なくとも1の必須タンパク質の致死表現型を機能的に抑制する(またはレスキューもしくは補完する)能力がある。さらなる態様において、内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OTase)複合体を構成するタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子が発現される。
上記方法のさらなる態様において、酵母宿主細胞は、ピキア・パストリス、ピキア・フィンランディカ、ピキア・トレハロフィラ、ピキア・コクラマエ、ピキア・メンブラナエファシエンス、ピキア・オプンティアエ、ピキア・サーモトレランス、ピキア・サリクタリア、ピキア・グエルクウム、ピキア・ピペリ、ピキア・スティプティス、ピキア・メタノリカ、ピキア・ミヌータ(オガタエア・ミヌータ、ピキア・リンドネリ)、ピキア属種、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス属種、ハンゼヌラ・ポリモルファ、クリベロマイセス属種、クリベロマイセス・ラクティスおよびカンジダ・アルビカンスよりなる群から選択される。
上記のさらなる態様において、内在性ドリキル−P−Man:Man5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3マンノシルトランスフェラーゼ(ALG3)遺伝子の発現の破壊、内在性YOS9遺伝子またはそのホモログの発現の破壊および異種糖タンパク質をコードする核酸分子を包含し、内在性OTase複合体を構成するタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子を発現する組換え糸状菌宿主細胞を用意すること;ならびに異種糖タンパク質を発現させるための条件下で宿主細胞を培養して異種糖タンパク質を産生させることを含む、糸状菌宿主細胞中で異種糖タンパク質を生産する方法が提供される。糸状菌宿主細胞は、N−グリカンが糸状菌パターンを有する糖タンパク質を産生するか、または哺乳動物様またはヒト様のN−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝子操作される。
さらなる実施形態において、宿主細胞は、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする少なくとも1の核酸分子および異種糖タンパク質をコードする核酸分子をさらに包含する。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、OTase複合体、例えば、酵母OTase複合体の少なくとも1の必須タンパク質の突然変異の致死表現型を機能的に抑制する能力がある。さらなる態様において、OTase複合体の必須タンパク質は、サッカロマイセス・セレビシエおよび/またはピキア・パストリスのSTT3遺伝子座、WBP1遺伝子座、OST1遺伝子座、SWP1遺伝子座もしくはOST2遺伝子座、またはそれらのホモログによりコードされる。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア属種のSTT3Aタンパク質、STT3Bタンパク質、STT3Cタンパク質、STT3Dタンパク質またはそれらの組み合わせである。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア・メジャーのSTT3Aタンパク質、STT3Bタンパク質、STT3Dタンパク質またはそれらの組み合わせである。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア・メジャーSTT3Dタンパク質である。さらなる態様において、例としての単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア・メジャーSTT3Dタンパク質であり、これは、サッカロマイセス・セレビサエOTase複合体の少なくとも1の必須タンパク質の致死表現型を機能的に抑制する(またはレスキューもしくは補完する)能力がある。さらなる態様において、内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OTase)複合体を構成するタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子が発現される。
上記のさらなる態様において、糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼ、トリコデルマ・リーゼイ、クリソスポリウム・ラクノウェンス、フザリウム属種、フザリウム・グラミネウム、フザリウム・ベネナタムおよびニューロスポラ・クラッサよりなる群から選択される。
上記方法のいずれか1のさらなる実施形態において、宿主細胞は、図17中に示される1または複数のN−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝子操作される。上記方法のいずれか1のさらなる態様において、宿主細胞は、G0、G1、G2、A1またはA2から選択される、示される1または複数の哺乳動物様またはヒト様の複合型N−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝子操作される。さらなる実施形態において、宿主細胞は、二分岐(bisected)N−グリカンを有するか、または多アンテナ(multiantennary)N−グリカンを有する1または複数の哺乳動物様またはヒト様の複合型N−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝子操作される。他の実施形態において、宿主細胞は、GlcNAcMan3GlcNAc2、GalGlcNAcMan3GlcNAc2およびNANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2から選択される1または複数の哺乳動物様またはヒト様のハイブリッドN−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝子操作される。さらなる実施形態において、N−グリカン構造は、パウチマンノース(G−2)構造Man3GlcNAc2またはMan5GlcNAc2(GS1.3)構造からなる。
上記方法のいずれか1の特定の実施形態において、異種糖タンパク質は、例えば、エリスロポエチン(EPO);サイトカイン、例えばインターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγおよびインターフェロンωなど;ならびに顆粒球−コロニー刺激因子(GCSF);顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子(GM−CSF);凝固因子、例えば因子VIII、因子IXおよびヒトプロテインCなど;アンチトロンビンIII;トロンビン;可溶性IgE受容体α鎖;免疫グロブリン、例えばIgG、IgG断片、IgG融合体およびIgMなど;免疫接着物質および他のFc融合タンパク質、例えば可溶性TNF受容体−Fc融合タンパク質など;RAGE−Fc融合タンパク質;インターロイキン;ウロキナーゼ;キマーゼ;尿素トリプシンインヒビター;IGF結合タンパク質;上皮増殖因子;成長ホルモン放出因子;アネキシンV融合タンパク質;アンジオスタチン;血管内皮増殖因子−2;骨芽前駆細胞抑制因子−1;オステオプロテジェリン;α−1−アンチトリプシン;α−フェトプロテイン;DNase II;ヒトプラスミノーゲンのクリングル3;グルコセレブロシダーゼ;TNF結合タンパク質1;卵胞刺激ホルモン;細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4−Ig;膜貫通アクティベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンド;グルカゴン様タンパク質1;またはIL−2受容体アゴニストであることができる。さらなる態様において、異種糖タンパク質は、1または複数のN−グリコシル化部位を含むように改変されているが、通常はN−グリコシル化されないタンパク質である。例えば、糖タンパク質は、N−グリコシル化部位がインスリンアミノ酸配列中に導入されているインスリンであり得る。
上記方法のいずれか1のさらなる実施形態において、異種タンパク質は抗体であり、その例としては、限定されるものではないが、抗Her2抗体、抗RSV(呼吸合胞体ウイルス)抗体、抗TNFα抗体、抗VEGF抗体、抗CD3受容体抗体、抗CD41 7E3抗体、抗CD25抗体、抗CD52抗体、抗CD33抗体、抗IgE抗体、抗CD11a抗体、抗EGF受容体抗体または抗CD20抗体が挙げられる。
上記方法のいずれか1の特定の態様において、宿主細胞は、UDP−GlcNAcトランスフェラーゼ(GnT)I、GnT II、GnT III、GnT IV、GnT V、GnT VI、UDP−ガラクトシルトランスフェラーゼ(GalT)、フコシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼからなる群のメンバーに由来するグリコシダーゼ、マンノシダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼ活性の1または複数の触媒ドメインをコードする1または複数の核酸分子を包含する。特定の実施形態において、マンノシダーゼは、C.エレガンス(C.elegans)マンノシダーゼIA、C.エレガンスマンノシダーゼIB、D.メラノガスター(D.melanogaster)マンノシダーゼIA、H.サピエンス(H.sapiens)マンノシダーゼIB、P.シトリナム(P.citrinum)マンノシダーゼI、マウスマンノシダーゼIA、マウスマンノシダーゼIB、A.ニデュランス(A.nidulans)マンノシダーゼIA、A.ニデュランスマンノシダーゼIB、A.ニデュランスマンノシダーゼIC、マウスマンノシダーゼII、C.エレガンスマンノシダーゼII、H.サピエンスマンノシダーゼIIおよびマンノシダーゼIIIよりなる群から選択される。
上記方法のいずれか1のある態様において、少なくとも1の触媒ドメインは、触媒ドメインおよび細胞標的化シグナルペプチドを含む融合タンパク質を形成することにより局在化される。融合タンパク質は、少なくとも1の遺伝的構築物によりコードすることができ、この遺伝的構築物は、細胞標的化シグナルペプチドをコードするDNA断片と酵素活性を有する触媒ドメインをコードするDNA断片とをインフレームでライゲーションすることにより形成される。標的化シグナルペプチドの例としては、限定されるものではないが、ERまたはゴルジの膜結合タンパク質、回収シグナル、II型膜タンパク質、I型膜タンパク質、膜貫通ヌクレオチド糖トランスポーター、マンノシダーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、グルコシダーゼ、マンノシルトランスフェラーゼおよびホスホマンノシルトランスフェラーゼが挙げられる。
上記方法のいずれか1の特定の態様において、宿主細胞は、UDP−GlcNAcトランスポーター、UDP−ガラクトーストランスポーター、GDP−フコーストランスポーター、CMP−シアル酸トランスポーターおよびヌクレオチドジホスファターゼよりなる群から選択される1または複数の酵素をコードする1または複数の核酸分子をさらに包含する。
上記方法のいずれか1のさらなる態様において、宿主細胞は、α1,2−マンノシダーゼ活性、UDP−GlcNAcトランスフェラーゼ(GnT)I活性、マンノシダーゼII活性およびGnT II活性をコードする1または複数の核酸分子を包含する。
上記方法のいずれか1のなおさらなる態様において、宿主細胞は、α1,2−マンノシダーゼ活性、UDP−GlcNAcトランスフェラーゼ(GnT)I活性、マンノシダーゼII活性、GnT II活性およびUDP−ガラクトシルトランスフェラーゼ(GalT)活性をコードする1または複数の核酸分子を包含する。
上記方法のいずれか1のさらなる態様において、宿主細胞では、マンノシルトランスフェラーゼおよびホスホマンノシルトランスフェラーゼよりなる群から選択される1または複数の酵素の活性が欠乏している。なおさらなる態様において、宿主細胞は、1,6マンノシルトランスフェラーゼ、1,3マンノシルトランスフェラーゼおよび1,2マンノシルトランスフェラーゼよりなる群から選択される酵素を発現しない。
上記方法のいずれか1の特定の態様において、宿主細胞は、ピキア・パストリスのoch1変異体である。
宿主細胞の特定の態様において、宿主細胞はα1,2−マンノシダーゼ活性および異種糖タンパク質をコードする1または複数の核酸分子を包含し、この宿主細胞は糖タンパク質上のN−グリカンに対する検出可能なホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性を欠損しまたは呈さないが、このことはα1,6−マンノシルトランスフェラーゼ活性およびβ1,2−マンノシルトランスフェラーゼ活性を惹起する。さらなる態様において、宿主細胞は、α1,2−マンノシダーゼ活性およびエンドマンノシダーゼ活性をコードする1または複数の核酸分子を包含する。
(a)内在性ドリキル−P−Man:Man5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3マンノシルトランスフェラーゼ(ALG3)遺伝子の発現の破壊および(b)内在性骨肉腫9(OS−9)ファミリー遺伝子またはそのホモログの発現の破壊を含む宿主細胞がさらに提供される。さらなる実施形態において、宿主細胞は、異種糖タンパク質をコードする第二の核酸分子を包含する。
(a)内在性ドリキル−P−Man:Man5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3マンノシルトランスフェラーゼ(ALG3)遺伝子の発現の破壊および(b)内在性骨肉腫9(OS−9)ファミリー遺伝子またはそのホモログの発現の破壊を含む下等真核生物宿主細胞がさらに提供される。さらなる実施形態において、宿主細胞は、異種糖タンパク質をコードする第二の核酸分子を包含する。
(a)内在性ドリキル−P−Man:Man5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3マンノシルトランスフェラーゼ(ALG3)遺伝子の発現の破壊および(b)内在性骨肉腫9(OS−9)ファミリー遺伝子またはそのホモログの発現の破壊を含む酵母宿主細胞がさらに提供される。さらなる実施形態において、宿主細胞は、異種糖タンパク質をコードする第二の核酸分子を包含する。
(a)内在性ドリキル−P−Man:Man5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3マンノシルトランスフェラーゼ(ALG3)遺伝子の発現の破壊および(b)内在性骨肉腫9(OS−9)ファミリー遺伝子またはそのホモログの発現の破壊を含む酵母宿主細胞がさらに提供される。さらなる実施形態において、宿主細胞は、異種糖タンパク質をコードする第二の核酸分子を包含する。
(a)内在性ドリキル−P−Man:Man5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3マンノシルトランスフェラーゼ(ALG3)遺伝子の発現の破壊および(b)内在性骨肉腫9(OS−9)ファミリー遺伝子またはそのホモログの発現の破壊を含む糸状菌宿主細胞がさらに提供される。さらなる実施形態において、宿主細胞は、異種糖タンパク質をコードする第二の核酸分子を包含する。
(a)内在性ドリキル−P−Man:Man5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3マンノシルトランスフェラーゼ(ALG3)遺伝子の発現の破壊を含む糸状菌宿主細胞がさらに提供される。さらなる実施形態において、宿主細胞は、異種糖タンパク質をコードする第二の核酸分子を包含する。
さらなる実施形態において、宿主細胞は、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする少なくとも1の核酸分子および異種糖タンパク質をコードする核酸分子をさらに包含する。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、OTase複合体、例えば、酵母OTase複合体の少なくとも1の必須タンパク質の突然変異の致死表現型を機能的に抑制する能力がある。さらなる態様において、OTase複合体の必須タンパク質は、サッカロマイセス・セレビシエおよび/またはピキア・パストリスのSTT3遺伝子座、WBP1遺伝子座、OST1遺伝子座、SWP1遺伝子座もしくはOST2遺伝子座、またはそれらのホモログによりコードされる。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア属種のSTT3Aタンパク質、STT3Bタンパク質、STT3Cタンパク質、STT3Dタンパク質またはそれらの組み合わせである。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア・メジャーのSTT3Aタンパク質、STT3Bタンパク質、STT3Dタンパク質またはそれらの組み合わせである。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア・メジャーSTT3Dタンパク質である。さらなる態様において、例としての単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア・メジャーSTT3Dタンパク質であり、これは、サッカロマイセス・セレビサエOTase複合体の少なくとも1の必須タンパク質の致死表現型を機能的に抑制する(またはレスキューもしくは補完する)能力がある。さらなる態様において、内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OTase)複合体を構成するタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子が発現される。
(a)内在性ドリキル−P−Man:Man5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3マンノシルトランスフェラーゼ(ALG3)遺伝子の発現の破壊、および(b)内在性骨肉腫9(OS−9)ファミリー遺伝子またはそのホモログの発現の破壊;および(c)異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする第一の核酸分子を含み;ならびに内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OTase)複合体を構成するタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子を発現する宿主細胞がさらに提供される。さらなる実施形態において、宿主細胞は、異種糖タンパク質をコードする第二の核酸分子を包含する。
(a)内在性ドリキル−P−Man:Man5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3マンノシルトランスフェラーゼ(ALG3)遺伝子の発現の破壊、(b)内在性骨肉腫9(OS−9)ファミリー遺伝子またはそのホモログの発現の破壊;および(c)異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする第一の核酸分子を含み;ならびに内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OTase)複合体を構成するタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子を発現する下等真核生物宿主細胞がさらに提供される。さらなる実施形態において、宿主細胞は、異種糖タンパク質をコードする第二の核酸分子を包含する。
(a)内在性ドリキル−P−Man:Man5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3マンノシルトランスフェラーゼ(ALG3)遺伝子の発現の破壊、(b)内在性YOS9遺伝子またはそのホモログの発現の破壊;および(c)異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする第一の核酸分子を含み;ならびに内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OTase)複合体を構成するタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子を発現する酵母宿主細胞がさらに提供される。さらなる実施形態において、宿主細胞は、異種糖タンパク質をコードする第二の核酸分子を包含する。
(a)内在性ドリキル−P−Man:Man5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3マンノシルトランスフェラーゼ(ALG3)遺伝子の発現の破壊、(b)内在性YOS9遺伝子またはそのホモログの発現の破壊;および(c)酵母オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OTase)複合体の少なくとも1の必須タンパク質の突然変異の致死表現型を機能的に抑制する能力がある異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする第一の核酸分子を含み;ならびに内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OTase)複合体を構成するタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子を発現する酵母宿主細胞がさらに提供される。さらなる実施形態において、宿主細胞は、異種糖タンパク質をコードする第二の核酸分子を包含する。
(a)内在性ドリキル−P−Man:Man5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3マンノシルトランスフェラーゼ(ALG3)遺伝子の発現の破壊、(b)内在性骨肉腫9(OS−9)ファミリー遺伝子またはそのホモログの発現の破壊;および(c)異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする第一の核酸分子を含み;ならびに内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OTase)複合体を構成するタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子を発現する糸状菌宿主細胞がさらに提供される。さらなる実施形態において、宿主細胞は、異種糖タンパク質をコードする第二の核酸分子を包含する。
(a)内在性ドリキル−P−Man:Man5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3マンノシルトランスフェラーゼ(ALG3)遺伝子の発現の破壊、(b)内在性骨肉腫9(OS−9)ファミリー遺伝子またはそのホモログの発現の破壊;および(c)酵母または糸状菌のオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OTase)複合体の少なくとも1の必須タンパク質の突然変異の致死表現型を機能的に抑制する能力がある異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする第一の核酸分子を含み;ならびに内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OTase)複合体を構成するタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子を発現する糸状菌宿主細胞がさらに提供される。さらなる実施形態において、宿主細胞は、異種糖タンパク質をコードする第二の核酸分子を包含する。
特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、OTase複合体、例えば、酵母OTase複合体の少なくとも1の必須タンパク質の突然変異の致死表現型を機能的に抑制する能力がある。さらなる態様において、OTase複合体の必須タンパク質は、サッカロマイセス・セレビシエおよび/またはピキア・パストリスのSTT3遺伝子座、WBP1遺伝子座、OST1遺伝子座、SWP1遺伝子座もしくはOST2遺伝子座、またはそれらのホモログによりコードされる。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア属種のSTT3Aタンパク質、STT3Bタンパク質、STT3Cタンパク質、STT3Dタンパク質またはそれらの組み合わせである。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア・メジャーのSTT3Aタンパク質、STT3Bタンパク質、STT3Dタンパク質またはそれらの組み合わせである。特定の態様において、単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア・メジャーSTT3Dタンパク質である。さらなる態様において、例としての単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア・メジャーSTT3Dタンパク質であり、これは、サッカロマイセス・セレビサエOTase複合体の少なくとも1の必須タンパク質の致死表現型を機能的に抑制する(またはレスキューもしくは補完する)能力がある。さらなる態様において、内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OTase)複合体を構成するタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子が発現される。
さらなる実施形態において、宿主細胞は、エンドマンノシダーゼ活性(例として、完全長エンドマンノシダーゼであるか、または細胞標的化シグナルペプチドと融合したエンドマンノシダーゼ触媒ドメインを含むキメラエンドマンノシダーゼであり、この細胞標的化シグナルペプチドは通常はこの触媒ドメインと関連せず、宿主細胞のERまたはゴルジ体に対してエンドマンノシダーゼ活性を標的化するように選択される。例えば、米国特許第7,332,299号を参照されたい)および/またはグルコシダーゼII活性(完全長グルコシダーゼIIであるか、または細胞標的化シグナルペプチドと融合したグルコシダーゼII触媒ドメインを含むキメラグルコシダーゼIIであり、この細胞標的化シグナルペプチドは通常はこの触媒ドメインと関連せず、宿主細胞のERまたはゴルジ体に対してグルコシダーゼII活性を標的化するように選択される。例えば、米国特許第6,803,225号を参照されたい)をさらに発現する。特定の態様において、宿主細胞は、ALG6(α1,3−グルコシラトランスフェラーゼ(α1,3−glucosylatransferase))遺伝子の欠失または破壊(alg6Δ)をさらに包含し、このalg6Δはalg3Δ宿主細胞中の糖タンパク質のN−グリカン占有率を増加させることが示されている(例えば、De Pourcq et al.,PloSOne 2012;7(6):e39976.Epub 2012 Jun 29を参照されたい。この文献は、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)をMan5GlcNAc2(GS1.3)またはパウチマンノースN−グリカン構造を有する糖タンパク質を産生するように遺伝子操作することを開示している)。ピキア・パストリスALG6をコードする核酸配列は、EMBLデータベース中で、アクセッション番号CCCA38426で開示されている。さらなる態様において、宿主細胞は、OCH1遺伝子の欠失または破壊(och1Δ)をさらに包含する。
上記方法のいずれか1のさらなる実施形態において、宿主細胞は、図17中に示される1または複数のN−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝子操作される。上記方法のいずれか1のさらなる態様において、宿主細胞は、G0、G1、G2、A1またはA2から選択される、示される1または複数の哺乳動物様またはヒト様の複合型N−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝子操作される。さらなる実施形態において、宿主細胞は、二分岐N−グリカンを有するか、または多アンテナN−グリカンを有する1または複数のヒト様の複合型N−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝子操作される。他の実施形態において、宿主細胞は、GlcNAcMan3GlcNAc2、GalGlcNAcMan3GlcNAc2およびNANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2から選択される1または複数の哺乳動物様またはヒト様のハイブリッドN−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝子操作される。さらなる実施形態において、N−グリカン構造は、パウチマンノース(G−2)構造Man3GlcNAc2またはMan5GlcNAc2(GS1.3)構造からなる。
上記宿主細胞のいずれか1の特定の実施形態において、異種糖タンパク質は、例えば、エリスロポエチン(EPO);サイトカイン、例えばインターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγおよびインターフェロンωなど;ならびに顆粒球−コロニー刺激因子(GCSF);顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子(GM−CSF);凝固因子、例えば因子VIII、因子IXおよびヒトプロテインCなど;アンチトロンビンIII;トロンビン;可溶性IgE受容体α鎖;免疫グロブリン、例えばIgG、IgG断片、IgG融合体およびIgMなど;免疫接着物質および他のFc融合タンパク質、例えば可溶性TNF受容体−Fc融合タンパク質など;RAGE−Fc融合タンパク質;インターロイキン;ウロキナーゼ;キマーゼ;尿素トリプシンインヒビター;IGF結合タンパク質;上皮増殖因子;成長ホルモン放出因子;アネキシンV融合タンパク質;アンジオスタチン;血管内皮増殖因子−2;骨芽前駆細胞抑制因子−1;オステオプロテジェリン;α−1−アンチトリプシン;α−フェトプロテイン;DNase II;ヒトプラスミノーゲンのクリングル3;グルコセレブロシダーゼ;TNF結合タンパク質1;卵胞刺激ホルモン;細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4−Ig;膜貫通アクティベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンド;グルカゴン様タンパク質1;ならびにIL−2受容体アゴニストよりなる群から選択することができる。さらなる態様において、糖タンパク質は、少なくとも1のN−結合グリコシル化部位を含むように改変されている、通常はN−グリコシル化されないタンパク質である。例えば、少なくとも1のN−結合グリコシル化部位を含むように改変されたインスリンである。
上記宿主細胞のいずれか1のさらなる実施形態において、異種タンパク質は抗体であり、その例としては、限定されるものではないが、抗Her2抗体、抗RSV(呼吸合胞体ウイルス)抗体、抗TNFα抗体、抗VEGF抗体、抗CD3受容体抗体、抗CD41 7E3抗体、抗CD25抗体、抗CD52抗体、抗CD33抗体、抗IgE抗体、抗CD11a抗体、抗EGF受容体抗体または抗CD20抗体が挙げられる。
上記宿主細胞の特定の態様において、宿主細胞は、UDP−GlcNAcトランスフェラーゼ(GnT)I、GnT II、GnT III、GnT IV、GnT V、GnT VI、UDP−ガラクトシルトランスフェラーゼ(GalT)、フコシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼからなる群のメンバーに由来するグリコシダーゼ、マンノシダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼ活性の1または複数の触媒ドメインをコードする1または複数の核酸分子を包含する。特定の実施形態において、マンノシダーゼは、C.エレガンスマンノシダーゼIA、C.エレガンスマンノシダーゼIB、D.メラノガスターマンノシダーゼIA、H.サピエンスマンノシダーゼIB、P.シトリナムマンノシダーゼI、マウスマンノシダーゼIA、マウスマンノシダーゼIB、A.ニデュランスマンノシダーゼIA、A.ニデュランスマンノシダーゼIB、A.ニデュランスマンノシダーゼIC、マウスマンノシダーゼII、C.エレガンスマンノシダーゼII、H.サピエンスマンノシダーゼIIおよびマンノシダーゼIIIよりなる群から選択される。
上記宿主細胞のいずれか1のある態様において、少なくとも1の触媒ドメインは、触媒ドメインおよび細胞標的化シグナルペプチドを含む融合タンパク質を形成することにより局在化される。融合タンパク質は、少なくとも1の遺伝的構築物によりコードすることができ、この遺伝的構築物は、細胞標的化シグナルペプチドをコードするDNA断片と酵素活性を有する触媒ドメインをコードするDNA断片とをインフレームでライゲーションすることにより形成される。標的化シグナルペプチドの例としては、限定されるものではないが、ERまたはゴルジの膜結合タンパク質、回収シグナル、例えばHDELまたはKDELなど、II型膜タンパク質、I型膜タンパク質、膜貫通ヌクレオチド糖トランスポーター、マンノシダーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、グルコシダーゼ、マンノシルトランスフェラーゼおよびホスホマンノシルトランスフェラーゼに対するものが挙げられる。
上記宿主細胞のいずれか1の特定の態様において、宿主細胞は、UDP−GlcNAcトランスポーター、UDP−ガラクトーストランスポーター、GDP−フコーストランスポーター、CMP−シアル酸トランスポーターおよびヌクレオチドジホスファターゼよりなる群から選択される1または複数の酵素をコードする1または複数の核酸分子をさらに包含する。
上記宿主細胞のいずれか1のさらなる態様において、宿主細胞は、α1,2−マンノシダーゼ活性、UDP−GlcNAcトランスフェラーゼ(GnT)I活性、マンノシダーゼII活性およびGnT II活性をコードする1または複数の核酸分子を包含する。
上記宿主細胞のいずれか1のなおさらなる態様において、宿主細胞は、α1,2−マンノシダーゼ活性、UDP−GlcNAcトランスフェラーゼ(GnT)I活性、マンノシダーゼII活性、GnT II活性およびUDP−ガラクトシルトランスフェラーゼ(GalT)活性をコードする1または複数の核酸分子を包含する。
宿主細胞の特定の態様において、宿主細胞はα1,2−マンノシダーゼ活性および異種糖タンパク質をコードする1または複数の核酸分子を包含し、この宿主細胞は糖タンパク質上のN−グリカンに対する検出可能なホスホマンノシルトランスフェラーゼ活性を欠損しまたは呈さないが、このことはα1,6−マンノシルトランスフェラーゼ活性およびβ1,2−マンノシルトランスフェラーゼ活性を惹起する。さらなる態様において、宿主細胞は、α1,2−マンノシダーゼ活性およびエンドマンノシダーゼ活性をコードする1または複数の核酸分子を包含する。
上記宿主細胞のいずれか1のさらなる態様において、宿主細胞は、ピキア・パストリス、ピキア・フィンランディカ、ピキア・トレハロフィラ、ピキア・コクラマエ、ピキア・メンブラナエファシエンス、ピキア・オプンティアエ、ピキア・サーモトレランス、ピキア・サリクタリア、ピキア・グエルクウム、ピキア・ピペリ、ピキア・スティプティス、ピキア・メタノリカ、ピキア属種、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス属種、ハンゼヌラ・ポリモルファ、クリベロマイセス属種、クリベロマイセス・ラクティス、カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼ、トリコデルマ・リーゼイ、クリソスポリウム・ラクノウェンス、フザリウム属種、フザリウム・グラミネウム、フザリウム・ベネナタム、ニューロスポラ・クラッサ、植物細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞よりなる群から選択される。
上記宿主細胞のいずれか1のなおさらなる態様において、宿主細胞は、マンノシルトランスフェラーゼおよびホスホマンノシルトランスフェラーゼよりなる群から選択される1または複数の酵素の検出可能な活性が欠乏しているか、またはこれを呈さない。なおさらなる態様において、宿主細胞は、1,6マンノシルトランスフェラーゼ、1,3マンノシルトランスフェラーゼおよび1,2マンノシルトランスフェラーゼよりなる群から選択される酵素を発現しない。
上記宿主細胞のいずれか1の特定の態様において、宿主細胞は、ピキア・パストリスである。さらなる態様において、宿主細胞は、ピキア・パストリスのoch1変異体である。
本明細書中の方法および宿主細胞は、組成物中の糖タンパク質のN−グリコシル化部位のうちの少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%または99%が占有されている糖タンパク質組成物を生産するのに用いることができる。
さらに、本明細書中の方法および宿主細胞は、組成物中の糖タンパク質のN−グリコシル化部位のうちの少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%または99%が占有されている糖タンパク質組成物であって、さらなる態様においてフコースを欠いた哺乳動物様またはヒト様のN−グリカンを有する糖タンパク質組成物を生産するのに用いることができる。
さらに、方法および酵母または糸状菌の宿主細胞は、哺乳動物様またはヒト様のN−グリカンを産生するように遺伝子操作され、これらは、組成物中の糖タンパク質のN−グリコシル化部位のうちの少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%または99%が占有されている糖タンパク質組成物であって、さらなる態様においてフコースを欠いた哺乳動物様またはヒト様のN−グリカンを有する糖タンパク質組成物を生産するのに用いることができる。
いくつかの態様において、フコシル化された哺乳動物様またはヒト様のN−グリカンを産生するように遺伝子操作された酵母または糸状菌の宿主細胞は、組成物中の糖タンパク質のN−グリコシル化部位のうちの少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%または99%が占有されている糖タンパク質組成物であって、さらなる態様においてフコースを有する哺乳動物様またはヒト様のN−グリカンを有する糖タンパク質組成物を生産するのに用いることができる。
本明細書中の方法および宿主細胞は、組成物中の少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%または99%の抗体分子が占有された両N−グリコシル化部位を有する抗体組成物を生産するのに用いることができる。
さらに、本明細書中の方法および宿主細胞は、組成物中の少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%または99%の抗体分子が占有された両N−グリコシル化部位を有し、N−グリカンがフコースを欠く抗体組成物を生産するのに用いることができる。
さらに、本明細書中の方法および酵母または糸状菌の宿主細胞は、組成物中の少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%または99%の抗体分子が占有された両N−グリコシル化部位を有し、N−グリカンがフコースを欠く抗体組成物を生産するのに用いることができる。
さらに、哺乳動物様またはヒト様のN−グリカンを産生するように遺伝子操作された方法および酵母または糸状菌の宿主細胞は、組成物中の少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%または99%の抗体分子が占有された両N−グリコシル化部位を有し、抗体がフコースを欠く哺乳動物様またはヒト様のN−グリカンを有する抗体組成物を生産するのに用いることができる。いくつかの態様において、フコシル化された哺乳動物様またはヒト様のN−グリカンを産生するように遺伝子操作された酵母または糸状菌の宿主細胞は、組成物中の少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%または99%の抗体分子が占有された両N−グリコシル化部位を有し、抗体がフコースを持つ哺乳動物様またはヒト様のN−グリカンを有する抗体組成物を生産するのに用いることができる。
特定の実施形態において、抗体は、抗Her2抗体、抗RSV(呼吸合胞体ウイルス)抗体、抗TNFα抗体、抗VEGF抗体、抗CD3受容体抗体、抗CD41 7E3抗体、抗CD25抗体、抗CD52抗体、抗CD33抗体、抗IgE抗体、抗CD11a抗体、抗EGF受容体抗体または抗CD20抗体よりなる群から選択される抗体を含む。
本明細書中に記載される宿主細胞および方法により生産される、1またはそれ以上の糖タンパク質を含む組成物がさらに提供される。
特定の実施形態において、本明細書中で提供される糖タンパク質組成物は、二分岐種および多アンテナ種などの、フコシル化されたおよびフコシル化されていないハイブリッドおよび複合型のN−グリカンを有する糖タンパク質を含み、これらとしては、限定されるものではないが、例えばGlcNAc(1−4)Man3GlcNAc2、Gal(1−4)GlcNAc(1−4)Man3GlcNAc2、NANA(1−4)Gal(1−4)GlcNAc(1−4)Man3GlcNAc2などのN−グリカンが挙げられる。
特定の実施形態において、本明細書中で提供される糖タンパク質組成物は、GlcNAcMan3GlcNAc2、GalGlcNAcMan3GlcNAc2、NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2、GlcNAcMan5GlcNAc2、GalGlcNAcMan5GlcNAc2およびNANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2よりなる群から選択される少なくとも1のハイブリッドN−グリカンを有する糖タンパク質を含む。特定の態様において、ハイブリッドN−グリカンは、組成物中の優勢なN−グリカン種である。さらなる態様において、ハイブリッドN−グリカンは、組成物中のハイブリッドN−グリカンの約30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%または100%を構成する特定のN−グリカン種である。
特定の実施形態において、本明細書中で提供される糖タンパク質組成物は、GlcNAc2Man3GlcNAc2、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2およびNANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2よりなる群から選択される少なくとも1の複合型N−グリカンを有する糖タンパク質を含む。特定の態様において、複合型N−グリカンは、組成物中の優勢なN−グリカン種である。さらなる態様において、複合型N−グリカンは、組成物中の複合型N−グリカンの約30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%または100%を構成する特定のN−グリカン種である。
特定の実施形態において、N−グリカンはフソシル化(fusosylated)されている。一般に、フコースは、N−グリカンの還元末端におけるGlcNAcとのα1,3−結合、N−グリカンの還元末端におけるGlcNAcとのα1,6−結合、N−グリカンの非還元末端におけるGalとのα1,2−結合、N−グリカンの非還元末端におけるGlcNacとのα1,3−結合、またはN−グリカンの非還元末端におけるGlcNAcとのα1,4−結合において存在する。
それ故、上記糖タンパク質組成物の特定の態様において、グリコフォームはα1,3−結合もしくはα1,6−結合フコースで存在してGlcNAcMan5GlcNAc2(Fuc)、GlcNAcMan3GlcNAc2(Fuc)、GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)およびNANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)よりなる群から選択されるグリコフォームを生じさせ;α1,3−結合もしくはα1,4−結合フコースで存在してGlcNAc(Fuc)Man5GlcNAc2、GlcNAc(Fuc)Man3GlcNAc2、GlcNAc2(Fuc1−2)Man3GlcNAc2、GalGlcNAc2(Fuc1−2)Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2(Fucl−2)Man3GlcNAc2、NANAGal2GlcNAc2(Fuc1−2)Man3GlcNAc2およびNANA2Gal2GlcNAc2(Fuc1−2)Man3GlcNAc2よりなる群から選択されるグリコフォームを生じさせ;またはα1,2−結合フコースで存在してGal(Fuc)GlcNAc2Man3GlcNAc2、Gal2(Fuc1−2)GlcNAc2Man3GlcNAc2、NANAGal2(Fuc1−2)GlcNAc2Man3GlcNAc2およびNANA2Gal2(Fuc1−2)GlcNAc2Man3GlcNAc2よりなる群から選択されるグリコフォームを生じさせる。
上記のさらなる態様において、複合型N−グリカンは、フコシル化されたおよびフコシル化されていない二分岐種および多アンテナ種をさらに包含する。
さらなる態様において、糖タンパク質は、高マンノースN−グリカンを含み、これらとしては、限定されるものではないが、Man5GlcNAc2、またはMan3GlcNAc2N−グリカン構造からなるN−グリカンが挙げられる。
本発明は、疾患治療用の薬剤の製造のための、(a)内在性ドリキル−P−Man:Man5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3マンノシルトランスフェラーゼ(ALG3)遺伝子の発現の破壊、および(b)内在性骨肉腫9(OS−9)ファミリー遺伝子またはホモログの破壊を含む宿主細胞の使用を提供する。
本発明は、疾患治療用の薬剤の製造のための、上述の宿主細胞のいずれか1の使用を提供する。
定義
本明細書中で用いられる用語「N−グリカン」および「グリコフォーム」は交換可能に用いられ、N−結合オリゴ糖、例えば、ポリペプチドのアスパラギン残基にアスパラギン−N−アセチルグルコサミン結合により付着したものを指す。N−結合糖タンパク質は、タンパク質中のアスパラギン残基のアミド窒素に結合したN−アセチルグルコサミン残基を含有する。糖タンパク質上で見出される優勢な糖は、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、N−アセチルガラクトサミン(GalNAc)、N−アセチルグルコサミン(GlcNAc)およびシアル酸(例として、N−アセチル−ノイラミン酸(NANA))である。糖基のプロセシングは、N−結合糖タンパク質の場合、翻訳と同時にERの内腔の中で起こり、翻訳後にゴルジ体中で継続する。
本明細書中で用いられる用語「N−グリカン」および「グリコフォーム」は交換可能に用いられ、N−結合オリゴ糖、例えば、ポリペプチドのアスパラギン残基にアスパラギン−N−アセチルグルコサミン結合により付着したものを指す。N−結合糖タンパク質は、タンパク質中のアスパラギン残基のアミド窒素に結合したN−アセチルグルコサミン残基を含有する。糖タンパク質上で見出される優勢な糖は、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、N−アセチルガラクトサミン(GalNAc)、N−アセチルグルコサミン(GlcNAc)およびシアル酸(例として、N−アセチル−ノイラミン酸(NANA))である。糖基のプロセシングは、N−結合糖タンパク質の場合、翻訳と同時にERの内腔の中で起こり、翻訳後にゴルジ体中で継続する。
N−グリカンは、Man3GlcNAc2の共通の五糖コアを有する(「Man」はマンノースを指し、「Glc」はグルコースを指し、および「NAc」はN−アセチルを指し、GlcNAcはN−アセチルグルコサミンを指す)。通常、N−グリカン構造は、非還元末端を左側に、還元末端を右側にして表される。N−グリカンの還元末端は、タンパク質上のグリコシル化部位を含むAsn残基に付着する末端である。N−グリカンは、「トリアムノース(triammnose)コア」、「五糖コア」または「パウチマンノースコア」とも呼ばれるMan3GlcNAc2(「Man3」)コア構造に付加される末梢の糖(例として、GlcNAc、ガラクトース、フコースおよびシアル酸)を含む分岐(アンテナ)の数に関して、異なる。N−グリカンは、その分岐した構成成分に従って分類される(例として、高マンノース、複合型またはハイブリッド)。「高マンノース」型のN−グリカンは、5またはそれより多いマンノース残基を有する。「複合」型のN−グリカンは、典型的に、「トリマンノース」コアの1,3マンノースアームに付着した少なくとも1のGlcNAcおよび1,6マンノースアームに付着した少なくとも1のGlcNAcを有する。複合型N−グリカンはまた、シアル酸または誘導体(例として、「NANA」または「NeuAc」、ここで「Neu」はノイラミン酸を指し、「Ac」はアセチルを指す)で修飾されていてもよいガラクトース(「Gal」)またはN−アセチルガラクトサミン(「GalNAc」)残基を有してもよい。複合型N−グリカンはまた、「二分岐」GlcNAcおよびコアフコース(「Fuc」)を含む鎖内置換を有してもよい。複合型N−グリカンはまた、「トリマンノースコア」上に複数のアンテナを有してもよく、これはしばしば「多アンテナグリカン」と呼ばれる。「ハイブリッド」のN−グリカンは、トリマンノースコアの1,3マンノースアームの末端上に少なくとも1のGlcNAcを、およびトリマンノースコアの1,6マンノースアーム上に0またはそれより多いマンノースを有する。これら様々なN−グリカンは、「グリコフォーム」とも呼ばれる。
複合型N−グリカンに関して、用語「G−2」、「G−1」、「G0」、「G1」、「G2」、「A1」および「A2」は、以下のことを意味する。「G−2」はMan3GlcNAc2またはパウチマンノースとして特徴付けることができるN−グリカン構造を指し、用語「G−1」はGlcNAcMan3GlcNAc2として特徴付けることができるN−グリカン構造を指し、用語「G0」はGlcNAc2Man3GlcNAc2として特徴付けることができるN−グリカン構造を指し、用語「G1」はGalGlcNAc2Man3GlcNAc2として特徴付けることができるN−グリカン構造を指し、用語「G2」はGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2として特徴付けることができるN−グリカン構造を指し、用語「A1」はNANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2として特徴付けることができるN−グリカン構造を指し、および用語「A2」はNANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2として特徴付けることができるN−グリカン構造を指す。特に指示がない限り、用語「G−2」、「G−1」、「G0」、「G1」、「G2」、「A1」および「A2」は、N−グリカンの還元末端においてGlcNAc残基に付着したフコースを欠くN−グリカン種を指す。用語が「F」を包含する場合、「F」は、N−グルシアン(glcyan)種がN−グリカンの還元末端においてGlcNAc残基上にフコース残基を含有することを指し示す。例えば、G0F、G1F、G2F、A1FおよびA2Fは全て、N−グリカンが、N−グリカンの還元末端においてGlcNAc残基に付着したフコース残基をさらに包含することを指し示す。下等真核生物、例えば酵母および糸状菌などは、通常、フコースを生じさせるN−グリカンを産生しない。
多アンテナN−グリカンに関して、用語「多アンテナN−グリカン」は、N−グリカンの1,6アームもしくは1,3アームの非還元末端を構成するマンノース残基上にGlcNAc残基を、またはN−グリカンの1,6アームおよび1,3アームの非還元末端を構成する各マンノース残基上にGlcNAc残基をさらに含むN−グリカンを指す。したがって、多アンテナN−グリカンは、式GlcNAc(2−4)Man3GlcNAc2、Gal(1−4)GlcNAc(2−4)Man3GlcNAc2またはNANA(1−4)Gal(1−4)GlcNAc(2−4)Man3GlcNAc2により特徴付けることができる。用語「1−4」は、1、2、3または4残基を指す。
二分岐N−グリカンに関して、用語「二分岐N−グリカン」は、GlcNAc残基がN−グリカンの還元末端においてマンノース残基と結合しているN−グリカンを指す。二分岐N−グリカンは、式GlcNAc3Man3GlcNAc2により特徴付けることができ、ここで各マンノース残基はその非還元末端においてGlcNAc残基と結合している。対照的に、多アンテナN−グリカンがGlcNAc3Man3GlcNAc2として特徴付けられる場合、この式は、2つのGlcNAc残基がN−グリカンの2つのアームのうちの一方の非還元末端においてマンノース残基と結合しており、1つのGlcNAc残基がN−グリカンの他方のアームの非還元末端においてマンノース残基と結合していることを指し示す。
本明細書中で用いられる略語は、当該技術分野において一般的に用いられるものであり、例としては、上記の糖の略語を参照されたい。他の一般的な略語としては、「PNGase」または「グリカナーゼ」または「グルコシダーゼ」が挙げられ、これらは全てペプチドN−グリコシダーゼF(EC3.2.2.18)を指す。
本明細書中で用いられる用語「糖タンパク質」は、1または複数のN−グリカンが付着した任意のタンパク質を指す。したがって、この用語は、当該技術分野において糖タンパク質として一般に認識されるタンパク質、および、例えば1または複数のN−結合グリコシル化部位を含むように改変されたインスリンといった1または複数のN−結合グリコシル化部位を含有するように遺伝子操作されているタンパク質の両方を指す。
本明細書中で用いられる「ヒト化糖タンパク質」または「ヒト様の糖タンパク質」は、4個より少ないマンノース残基を有するN−グリカンが付着したタンパク質および少なくとも5個のマンノース残基を有する合成糖タンパク質中間体(これもまた有用であり、さらにインビトロまたはインビボで扱うことができる)を二者択一的に指す。好ましくは、本発明によって生産される糖タンパク質は、少なくとも30モル%、好ましくは少なくとも40モル%、より好ましくは50、60、70、80、90またはさらには100モル%のMan5GlcNAc2中間体を、少なくとも一時的に含有する。これは、例として、本発明の宿主細胞を「より良い」、すなわち、より効率的なグリコシル化酵素を発現するように操作することにより達成し得る。例えば、マンノシダーゼは、タンパク質がグリコシル化される宿主細胞中の部位において存在する条件下で最適な活性を有するように選択され、好ましくは、活性が望まれる宿主細胞の細胞小器官に対して酵素を標的化することにより、宿主細胞内に導入される。
本明細書中で用いられる用語「組換え宿主細胞」(「発現宿主細胞」、「発現宿主系」、「発現系」または単に「宿主細胞」)は、組換えベクターが導入されている細胞を指すことが意図される。かかる用語は、特定の対象細胞だけでなく、かかる細胞の後代をも指すことを意図するものであることが理解されるべきである。突然変異または環境の影響のいずれかに起因して後続の世代においてある改変が生じることがあるため、かかる後代は、実際には親細胞と同一でないこともあるが、本明細書中で用いられる用語「宿主細胞」の範囲内に依然として包含される。組換え宿主細胞は、培地中で増殖された単離細胞または細胞株であってもよく、または生きた組織もしくは生物中に存在する細胞であってもよい。好ましい宿主細胞は、酵母および真菌である。
糖タンパク質の調製物中に存在するグリカンの「モルパーセント」を指す場合、この用語は、N−結合オリゴ糖のプール中に存在する特定のグリカンのモルパーセントを意味し、このN−結合オリゴ糖は、タンパク質調製物をPNGaseで処理し、次いでグリコフォーム組成物により影響されない方法により定量する(例えば、PNGaseで放出されたグリカンプールを蛍光タグ、例えば2−アミノベンズアミドなどで標識し、次いで高速液体クロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動により分離して、次いで蛍光強度によりグリカンを定量する)場合に放出されるものである。例えば、50モルパーセントのGlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2NANA2は、放出されたグリカンの50パーセントがGlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2NANA2であり、残りの50パーセントが他のN−結合オリゴ糖からなることを意味する。実施形態において、糖タンパク質の調整物中の特定グリカンのモルパーセントは、20%から100%の間であり、好ましくは25%超、30%超、35%超、40%超または45%超であり、より好ましくは50%超、55%超、60%超、65%超または70%超であり、最も好ましくは75%超、80%超、85%超、90%超または95%超である。
用語「操作可能に連結された」発現制御配列は、発現制御配列が目的の遺伝子を制御するように目的の遺伝子と近接している結合を指し、同様に目的の遺伝子を制御するようにトランスで(in trans)または距離をおいて作用する発現制御配列を指す。
用語「発現制御配列」または「制御性配列」は交換可能に用いられ、本明細書中で用いられる場合、操作可能に連結されたコーディング配列の発現に影響を与えるのに必要なポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列は、核酸配列の転写、転写後イベントおよび翻訳を制御する配列である。発現制御配列としては、適当な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列;効率的なRNAプロセシングシグナル、例えばスプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナルなど;細胞質のmRNAを安定化させる配列;翻訳効率を高める配列(例として、リボソーム結合部位);タンパク質の安定性を高める配列;ならびに望まれる場合、タンパク質の分泌を高める配列が挙げられる。かかる制御配列の性質は宿主生物によって異なり、原核生物において、かかる制御配列は一般に、プロモーター、リボソーム結合部位および転写終結配列を包含する。用語「制御配列」は、最小限、その存在が発現のために必須である全ての成分を包含することが意図され、さらにその存在が有利である付加的な成分、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列を包含することもできる。
用語「トランスフェクトする」、「トランスフェクション」、「トランスフェクトすること」などは、真核生物細胞内への異種核酸の導入を指し、この真核生物細胞は高等および下等真核生物細胞の両方である。歴史的に、用語「形質転換」が酵母または真菌細胞内への核酸の導入を記述するのに用いられているが、しかしながら、本明細書中の用語「トランスフェクション」は、酵母および真菌細胞などの任意の真核細胞内への核酸の導入を指すのに用いられる。
用語「真核性」は、有核の細胞または生物を指し、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、動物細胞および下等真核生物細胞を包含する。
用語「下等真核生物細胞」は、酵母および糸状菌を包含する。酵母および糸状菌としては、限定されるものではないが、ピキア・パストリス、ピキア・フィンランディカ、ピキア・トレハロフィラ、ピキア・コクラマエ、ピキア・メンブラナエファシエンス、ピキア・ミヌータ(オガタエア・ミヌータ、ピキア・リンドネリ)、ピキア・オプンティアエ、ピキア・サーモトレランス、ピキア・サリクタリア、ピキア・グエルクウム、ピキア・ピペリ、ピキア・スティプティス、ピキア・メタノリカ、ピキア属種、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス属種、ハンゼヌラ・ポリモルファ、クリベロマイセス属種、クリベロマイセス・ラクティス、カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼ、トリコデルマ・リーゼイ、クリソスポリウム・ラクノウェンス、フザリウム属種、フザリウム・グラミネウム、フザリウム・ベネナタム、フィスコミトレラ・パテンス(Physcomitrella patens)およびニューロスポラ・クラッサ、ピキア属種、任意のサッカロマイセス属種、ハンゼヌラ・ポリモルファ、任意のクリベロマイセス属種、カンジダ・アルビカンス、任意のアスペルギルス属種(Aspergillus sp.)、トリコデルマ・リーゼイ、クリソスポリウム・ラクノウェンス、任意のフザリウム属種およびニューロスポラ・クラッサが挙げられる。
本明細書中で用いられる用語「抗体」、「免疫グロブリン」、「免疫グロブリン(複数)」および「免疫グロブリン分子」は交換可能に用いられる。各免疫グロブリン分子は、その特異的な抗原に結合することを可能にする固有の構造を有するが、全ての免疫グロブリンは本明細書中で記載されるものと同じ全体構造を有する。基本的な免疫グロブリン構造単位は、サブユニットの四量体を含むことが知られている。各四量体は2つの同一なポリペプチド鎖ペアを有し、各ペアは1つの「軽」鎖(約25kDa)および1つの「重」鎖(約50〜70kDa)を有する。各鎖のアミノ末端部は、抗原認識に主に関与する約100から110個またはそれより多いアミノ酸の可変領域を包含する。各鎖のカルボキシ末端部は、エフェクター機能に主に関与する定常領域を規定する。軽鎖はカッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンとして分類され、それぞれIgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEとしての抗体のアイソタイプを規定する。
軽鎖および重鎖は、可変領域および定常領域に細分される(全般的には、Fundamental Immunology(Paul,W.,ed.,2nd ed.Raven Press,N.Y.,1989),Ch.7を参照されたい)。各軽鎖/重鎖ペアの可変領域は、抗体結合部位を形成する。したがって、インタクトな抗体は2つの結合部位を有する。二官能性抗体または二重特異性抗体におけるものを除いて、2つの結合部位は同一である。鎖は全て比較的保存されたフレームワーク領域(FR)の同一の一般構造を示し、これは、3つの高頻度可変領域によりつなげられたもので、相補性決定領域またはCDRとも呼ばれる。各ペアの2つの鎖からのCDRは、フレームワーク領域により整列され、特異的なエピトープへの結合を可能にする。この用語は自然に存在する形態を包含し、同様に断片および誘導体を包含する。この用語の範囲内には、免疫グロブリン(Ig)のクラス、すなわち、IgG、IgA、IgE、IgMおよびIgDが包含される。また、この用語の範囲内には、IgGのサブタイプ、すなわち、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4が包含される。この用語は最も広い意味で用いられ、単一のモノクローナル抗体(アゴニスト抗体およびアンタゴニスト抗体を包含する)を包含し、同様に複数のエピトープまたは抗原と結合する抗体組成物を包含する。この用語は、具体的には、モノクローナル抗体(完全長モノクローナル抗体を包含する)、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)に及び、およびCH2ドメインのN−結合グリコシル化部位を含む重鎖免疫グロブリン定常領域のCH2ドメインの少なくとも一部またはその変異体を含有する、または含有するように改変されるかぎりにおいて、抗体断片に及ぶ。この用語内には、Fc領域のみを含む分子、例えば免疫接着物質(米国特許出願公開第2004/0136986号、この開示は参照により本明細書中に組み込まれる)、Fc融合体および抗体様分子などが包含される。
用語「Fc断片」は、CH2およびCH3ドメインを含有する抗体の「結晶性断片」C末端領域を指す。用語「Fab断片」は、VH、CH1、VLおよびCLドメインを含有する抗体の「抗原結合断片」領域を指す。
本明細書中で用いられる用語「モノクローナル抗体(mAb)」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量存在し得る、可能な自然に存在する突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であるが、これは単一の抗原部位に対するものであるからである。そのうえ、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的に包含する従来の(ポリクローナル)抗体調製物と対照的に、各mAbは、抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、例えばハイブリドーマ培養により他の免疫グロブリンを混入させずに生産することができる点で有利である。用語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるという抗体の特性を指し示しており、何らかの特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるものではない。例えば、本発明によって用いられるモノクローナル抗体は、Kohler et al.,(1975)Nature,256:495により最初に記述されたハイブリドーマ法によって作成してもよく、または組換えDNA法(例えば、米国特許第4,816,567号を参照されたい。この開示は参照により本明細書中に組み込まれる)により作成してもよい。
用語「抗体」または「免疫グロブリン」の範囲内の用語「断片」は、その断片が標的分子に特異的に結合する能力を維持するかぎりにおいて、様々なプロテアーゼでの消化により生産されるもの、化学的な切断および/または化学的な解離により生産されるもの、ならびに組換えで生産されるものを包含する。かかる断片のなかには、Fc、Fab、Fab’、Fv、F(ab’)2および一本鎖Fv(scFv)断片がある。以下、用語「免疫グロブリン」はまた、用語「断片」も同様に包含する。
免疫グロブリンは、配列が改変されているが標的分子に特異的に結合する能力を維持している免疫グロブリンまたは断片をさらに包含し、これらとしては、種間キメラ抗体およびヒト化抗体;抗体融合体;ヘテロマー抗体複合体および抗体融合体、例えばジアボディ(diabody)(二重特異性抗体)、一本鎖ジアボディおよびイントラボディ(intrabody)が挙げられる(例えば、Intracellular Antibodies:Research and Disease Applications,(Marasco,ed.,Springer−Verlag New York,Inc.,1998を参照されたい)。
用語「触媒抗体」は、生化学反応を触媒する能力がある免疫グロブリン分子を指す。触媒抗体は当該技術分野で周知であり、Schochetman et al.の米国特許出願第7,205,136号;第4,888,281号;第5,037,750号、Barbas,III et al.の米国特許出願第5,733,757号;第5,985,626号;および第6,368,839中に記載されている(これらの開示は全て、参照により本明細書に組み込まれる)。
抗体および抗体−抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用、ならびに抗体依存性細胞介在性細胞傷害(ADCC)および補体依存性細胞傷害(CDC)、免疫複合体のクリアランス(食作用)、B細胞による抗体産生ならびにIgG血清半減期などの種々の応答は、それぞれ以下に規定される:Daeron et al.,Annu.Rev.Immunol.15:203−234(1997);Ward and Ghetie,Therapeutic Immunol.2:77−94(1995);Cox and Greenberg,Semin.Immunol.13:339−345(2001);Heyman,Immunol.Lett.88:157−161(2003);およびRavetch,Curr.Opin.Immunol.9:121−125(1997)。
本明細書中で用いられる用語「から本質的になること」は、述べられた整数または整数の群の包含を示唆するが、その述べられた整数に大幅に影響もしくは変化を与える改変または他の整数を除外するものと理解される。N−グリカンの種に関して、述べられたN−グリカン「から本質的になること」という用語は、N−グリカンが糖タンパク質のアスパラギン残基に直接的に結合するN−アセチルグルコサミン(GlcNAc)においてフコシル化されているか否かにかかわらず、そのN−グリカンを包含すると理解されるものである。
本明細書中で用いられる用語「優勢に」またはその変形、例えば「優勢」または「優勢である」は、糖タンパク質をPNGaseで処理し、放出されたグリカンを質量分析、例えば、MALDI−TOF MSまたはHPLCにより分析した後の全中性N−グリカンのモルパーセント(%)が最も高いグリカン種を意味すると理解されるものである。言い換えれば、句「優勢に」は、個々の実体、例えば、特定のグリコフォームが、いずれの他の個々の実体よりも高いモルパーセントで存在することとして定義される。例えば、組成物が40モルパーセントの種A、35モルパーセントの種Bおよび25モルパーセントの種Cからなる場合、この組成物は種Aを優勢に含み、種Bは次に優勢な種となる。いくつかの宿主細胞は、中性N−グリカン、および荷電N−グリカン、例えばマンノシルホスフェートなどを含む組成物を産生し得る。それ故、糖タンパク質の組成物は、複数の荷電N−グリカンおよび非荷電または中性のN−グリカンを包含することができる。本発明において、優勢なN−グリカンが決定されるのは、組成物中の全ての複数の中性N−グリカンの状況においてである。したがって、本明細書中で用いられる「優勢なN−グリカン」は、組成物中の全ての複数の中性N−グリカンのうち、優勢なN−グリカンが特定の構造であることを意味する。
本明細書中で用いられる、特定の糖残基、例えばフコースまたはガラクトースなど「を本質的に含まない」という用語は、糖タンパク質組成物がかかる残基を含有するN−グリカンを実質的に欠くことを指し示すのに用いられる。純度の点で表現すると、本質的に含まないとは、かかる糖残基を含有するN−グリカン構造の量が10%を超えず、好ましくは5%未満であり、より好ましくは1%未満であり、最も好ましくは0.5%未満であることを意味し、ここでパーセンテージは重量パーセント、またはモルパーセントである。したがって、本発明による糖タンパク質組成物中のN−グリカン構造の実質的に全てが、例えば、フコース、もしくはガラクトース、またはそれらの両方を含まない。
本明細書中で用いられるように、糖タンパク質組成物が特定の糖残基、例えばフコースまたはガラクトースなどを「欠く」または「欠いている」のは、検出可能な量のかかる糖残基がいずれの時点においてもN−グリカン構造上に存在しない場合である。例えば、本発明の好ましい実施形態において、糖タンパク質組成物は、上で定義するような酵母などの下等真核生物(例えば、ピキア属種、サッカロマイセス属種、クリベロマイセス属種、アスペルギルス属種)により産生されるが、これらの生物の細胞はフコシル化N−グリカン構造を産生するのに必要とされる酵素を持たないため、糖タンパク質組成物は「フコースを欠く」ものとなる。したがって、用語「フコースを本質的に含まない」は、用語「フコースを欠いている」を包含する。しかしながら、組成物は、組成物が一時的にフコシル化N−グリカン構造を含有した場合、または限定的であるが検出可能な量の上記のようなフコシル化Ν−グリカン構造を含有する場合であっても、「フコースを実質的に含まない」ものであり得る。
本発明は、ドリキル−P−Man:Man5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3マンノシルトランスフェラーゼ活性(Alg3p)をコードするALG3遺伝子の発現を欠く組換え宿主細胞中で産生量およびN−グリコシル化部位占有率を増加させる、同様に複合型またはパウチマンノース(Man3GlcNAc2)のいずれかといったN−グリカンの質を向上させる、宿主細胞および方法を提供する。ALG3発現を欠く組換え宿主細胞中のN−グリコシル化部位占有率の増加およびN−グリカンの質の向上は、組換え宿主細胞中の骨肉腫9(OS−9)ファミリー遺伝子またはそのホモログの発現を破壊することにより達成される。OS−9遺伝子に対するホモログとしては、限定されるものではないがサッカロマイセス・セレビシエ、ピキア・パストリス、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、カエノラブディティス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)およびホモ・サピエンス(Homo sapiens)などの生物のゲノム中で見出される類似構造のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを包含する。
YOS9はヒト遺伝子OS−9の酵母ホモログであり、骨肉腫において過剰発現している(Friedman et al,J.Biol.Chem.277:35274−35281(2002);GenBankアクセッション番号CAY70383)。YOS9遺伝子は、レクチンタンパク質であるYos9pをコードするが、これは、サッカロマイセス・セレビシエ中でER関連分解(ERAD)経路に関わることが示されており、この経路は、サイトゾル中でミスフォールドされた糖タンパク質を検出して分解の標的とする、ER中の品質管理経路である(Kim et al,Mol.Cell.16:741−751(2005)を参照されたい)。Quan et al,Mol.Cell 32:870−877(2008)は、ERAD経路において、ミスフォールドされた糖タンパク質は末端のα1,6−結合マンノースを有するN−グリカンを含有するように修飾されることを示した。Yos9pは、これらの末端α1,6−結合マンノース残基を含有するN−グリカンを認識し、それらを有する糖タンパク質を分解の標的とするセンサータンパク質である。alg3Δ株において、N−結合グリコシル化部位に転移されるMan5GlcNAc2オリゴ糖もまた末端のα1,6−結合マンノース残基を有し、これが糖タンパク質をERAD経路の基質にし得る(Clerc et al,J.Cell Biol.184:159−172(2009))。サッカロマイセス・セレビシエYos9pタンパク質は配列番号43中に示されるアミノ酸配列を有し、これは配列番号44中に示されるYOS9ヌクレオチド配列によりコードされる。ピキア・パストリスYos9pタンパク質は配列番号45中に示されるアミノ酸配列を有し、これは配列番号46中に示されるYOS9ヌクレオチド配列によりコードされる。アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigates)Yos9pタンパク質は配列番号47中に示されるアミノ酸配列を有し、これは配列番号48中に示されるYOS9ヌクレオチド配列によりコードされる。シゾサッカロマイセス・ポンベYos9pタンパク質は配列番号49中に示されるアミノ酸配列を有し、これは配列番号50中に示されるYOS9ヌクレオチド配列によりコードされる。
本発明において、ALG3遺伝子発現を欠く組換え宿主細胞中でのYOS9遺伝子発現の破壊は、組換え糖タンパク質の産生量を増加させ、したがって、ERまたはゴルジ体に対して標的化されたα1,2−マンノシダーゼ活性を包含するようにさらに改変された宿主細胞中のパウチマンノースN−グリカンの産生量を改善し、またはこれらの宿主細胞が、宿主細胞にヒト様N−グリコシル化パターンを有する、または特定のN−グリカン構造を優勢に有する糖たんぱく質を産生させることを可能にするもう1つのグリコシル化酵素を包含するようにさらに改変される場合に複合型N−グリカンの産生量を改善する。
Alg3pタンパク質活性を呈さない、またはALG3遺伝子からの発現が破壊された宿主細胞の構築は、米国特許出願公開第20050170452号または第20100227363号中に記載されており、これらの文献は参照により本明細書中に組み込まれる。Alg3pはMan5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3マンノシルトランスフェラーゼであり、これは、マンノース残基をアルファ−1,3結合中の脂質結合Man5GlcNAc2(図17、GS1.3)のアルファ−1,6アームのマンノース残基にトランスフェラーゼすることで脂質結合Glc3Man9GlcNAc2の合成のための前駆体である脂質結合Man6GlcNAc2(図17、GS1.4)を産生し、この脂質結合Man6GlcNAc2は次いでオリゴサッカリルトランスフェラーゼにより糖タンパク質のアスパラギン残基に転移され、その後にグルコース(Glc)残基が取り除かれる。Alg3pタンパク質活性を欠く宿主細胞において、脂質結合Man5GlcNAc2オリゴ糖は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼにより糖タンパク質のアスパラギン残基に転移され得る。α1,2−マンノシダーゼをさらに包含するかかる宿主細胞において、糖タンパク質に付着したMan5GlcNAc2オリゴ糖は、トリマンノース(パウチマンノース)Man3GlcNAc2構造(図17、GS2.1)に切り取られる。Man5GlcNAc2(GS1.3)構造は、図17中に示されるMan5GlcNAc2(GS2.0)と区別可能であり、Man5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3マンノシルトランスフェラーゼ(Alg3p)を発現する宿主細胞中で産生される。
alg3Δyos9Δ宿主細胞中で産生されるパウチマンノースN−グリカンまたは複合型N−グリカンを含む糖タンパク質のN−グリコシル化部位占有率は、宿主細胞中で1または複数の異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼを発現させることにより実質的に増加され得るものであり、特定の実施形態において、これら異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼのうちの少なくとも1は酵母オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OTase)複合体の少なくとも1の必須タンパク質の突然変異の致死表現型を機能的に抑制する能力がある。参照により本明細書中に組み込まれる国際出願公開第WO2011106389号は、糖タンパク質を発現するように遺伝子操作された組換え下等真核生物宿主細胞中で産生される糖タンパク質のN−グリコシル化部位占有率を増加させる方法を開示する。詳細には、この方法は、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼを過剰発現する組換え宿主細胞を提供するものであり、特定の実施形態において、この異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは酵母オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OTase)複合体の少なくとも1の必須タンパク質の突然変異の致死表現型を機能的に抑制する能力がある。
Nasab et al,Molecular Biology of the Cell 19:3758−3768 (2008)は、4つのリーシュマニア・メジャーのSTT3タンパク質の各々を個別にサッカロマイセス・セレビシエ中で発現させたところ、それらのうちの3つ、LmSTT3Aタンパク質、LmSTT3Bタンパク質およびLmSTT3Dタンパク質は酵母STT3遺伝子座の欠失を補完することができることを見出した。加えて、LmSTT3D発現は、様々な必須OTaseサブユニットをコードする遺伝子の一重および二重の欠失の致死表現型を抑制した。LmSTT3タンパク質は酵母OTase複合体内に取り込まれなかったが、代わりに、酵母細胞の内在性多量体酵素を置き換える能力があるホモダイマー酵素を形成した。この結果は、これらの単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは原核生物の酵素に似ている一方で、これらは真核生物のグリコシル化のための典型的な基質、すなわち、N−X−S/T N−グリコシル化認識部位およびドリコールピロリン酸結合高マンノースオリゴ糖を用いることを指し示す。
それ故、本発明の特定の実施形態において、少なくとも1の異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(例えば、LmSTT3Aタンパク質、LmSTT3Bタンパク質またはLmSTT3Dよりなる群から選択されるもの)をコードするオープンリーディングフレームは、組換えalg3Δyos9Δ宿主細胞中で恒常的にまたは誘導されて過剰発現し、この宿主細胞中では、内在性宿主細胞STT3遺伝子の発現などの、その細胞自身のオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OTase)複合体を構成するタンパク質をコードするその細胞自身の内在性遺伝子の発現が引き続き起こっている。したがって、宿主細胞は、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ、および内在性宿主細胞SST3タンパク質などの内在性宿主細胞OTase複合体の両方を発現する。そのうえ、組換え酵母、糸状菌、藻類または植物の宿主細胞に関して、宿主細胞は、複合型および/またはハイブリッドN−グリカンを含む哺乳動物様またはヒト様のグリコシル化パターンを含む糖タンパク質を産生し、宿主細胞の内在性グリコシル化パターンを有する糖タンパク質を産生しないようにさらに遺伝子操作することができる。
本発明は、哺乳動物様またはヒト様の複合型N−グリカンを産生するように遺伝子操作されたピキア・パストリスalg3Δyos9Δ宿主細胞を用いて本明細書中で例示されている。しかしながら、本発明は、他の酵母ost細胞(限定されるものではないが、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ、オガタエア・ミヌータおよびピキア・パストリスなど)または糸状菌(限定されるものではないが、トリコデルマ・リーゼイ(Tricoderma reesei)など)に適用することができるが、これらは、酵母もしくは真菌のN−グリカン(高マンノシル化N−グリカンもしくは高マンノースN−グリカンのいずれか)を有する糖タンパク質を産生するか、または宿主細胞中で産生される糖タンパク質の全体的なN−グリコシル化部位占有率を改善するために哺乳動物様もしくはヒト様の高マンノース、複合型もしくはハイブリッドN−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝子操作されている。そのうえ、本発明はまた、これらの植物または哺乳動物発現系中で産生される糖タンパク質、とりわけ2より多いN−結合グリコシル化部位を有する糖タンパク質の全体的なN−グリコシル化部位占有率を改善するために、植物および哺乳動物の発現系に適用することもできる。
オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OTase)複合体を構成するタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子の発現としては、内在性STT3タンパク質またはホモログをコードする内在性宿主細胞遺伝子の発現が挙げられる。酵母宿主細胞の場合、OTase複合体を構成するタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子が発現しており、これは内在性STT3遺伝子の発現を包含する。現在、サッカロマイセス・セレビシエOTase複合体を構成するタンパク質をコードする遺伝子としては、OST1、OST2、OST3、OST4、OST5、OST6、WBP1、SWP1およびSTT3が挙げられることが知られており(例えば、Spirig et al,Molec.Gen.Genet.256:628−637(1997)を参照されたい)、ピキア・パストリスにおいては、OTase複合体としては、少なくともOst1p、Ost2p、Ost3p、Ost4p、Ost6p、Wbp1、Swp1pおよびStt3pが挙げられるように思われる(前掲したShutter et al.,op.cit.を参照されたい)。
一般に、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、OTase複合体、例えば、酵母OTase複合体の少なくとも1の必須タンパク質の突然変異の致死表現型を機能的に抑制する能力がある。したがって、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、OTase複合体の少なくとも1の必須タンパク質の致死突然変異を機能的に補完またはレスキューする能力がある。さらなる態様において、OTase複合体の必須タンパク質は、サッカロマイセス・セレビシエおよび/またはピキア・パストリスのSTT3遺伝子座、WBP1遺伝子座、OST1遺伝子座、SWP1遺伝子座もしくはOST2遺伝子座、またはそれらのホモログによりコードされる。一般に、本明細書中のN−グリコシル化部位占有率を増加させる方法において用いることができる異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、特定の実施形態においてサッカロマイセス・セレビシエおよび/またはピキア・パストリスOTase複合体の少なくとも1の必須タンパク質の致死表現型を機能的に抑制する(またはレスキューもしくは補完する)能力がある異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼである。例えば、さらなる態様において、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、リーシュマニア・メジャーSTT3Dタンパク質であり、これは、サッカロマイセス・セレビシエまたはピキア・パストリスOTase複合体の少なくとも1の必須タンパク質の致死表現型を機能的に抑制する(またはレスキューもしくは補完する)能力がある。それ故、特定の宿主細胞の場合、特定の異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、その単一サブユニット異種オリゴサッカリルトランスフェラーゼが酵母OTase複合体の少なくとも1の必須タンパク質の致死表現型を抑制する能力があるという条件で、特定の宿主細胞中での発現に好適である。さらなる態様において、異種単一サブユニット異種オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、その単一サブユニット異種オリゴサッカリルトランスフェラーゼがサッカロマイセス・セレビシエおよび/またはピキア・パストリスOTase複合体の少なくとも1の必須タンパク質の致死表現型を抑制する能力があるという条件で、特定の宿主細胞中での発現のために選択される。必須タンパク質としては、OST1、OST2、WBP1、SWP1およびSTT3が挙げられる。
本明細書中で用いられる致死突然変異としては、OTase複合体の必須タンパク質をコードする遺伝子の欠失もしくは破壊、または必須タンパク質を機能しなくするコーディング配列中の突然変異が挙げられる。この用語は、shRNAまたはRNAiを用いて機能的必須タンパク質の産生を抑止するノックダウン変異をさらに包含することができる。
それ故、本発明は、ドリキル−P−Man:Man5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3マンノシルトランスフェラーゼ活性(Alg3p)活性および骨肉腫9(OS−9)ファミリー遺伝子またはそのホモログの活性を呈さず、異種組換えタンパク質をコードする核酸分子をさらに包含する組換え宿主細胞を提供する。さらなる実施形態において、宿主細胞は、恒常的なまたは誘導性のプロモーターに操作可能に連結された少なくとも1の異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(例えば、LmSTT3Aタンパク質、LmSTT3Bタンパク質およびLmSTT3Dよりなる群から選択されるもの)をコードする核酸分子をさらに包含する。
特定の態様において、組換え宿主細胞は、ドリキル−P−Man:Man5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3マンノシルトランスフェラーゼ活性(ALG3)遺伝子および骨肉腫9(OS−9)ファミリー遺伝子またはそのホモログの遺伝子を発現せず、異種組換えタンパク質をコードする核酸分子をさらに包含する。さらなる実施形態において、宿主細胞は、恒常的なまたは誘導性のプロモーターに操作可能に連結された少なくとも1の異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(例えば、LmSTT3Aタンパク質、LmSTT3Bタンパク質およびLmSTT3Dよりなる群から選択されるもの)をコードする核酸分子をさらに包含する。
上記の特定の態様において、宿主細胞は下等真核生物である。さらなる態様において、下等真核生物は、ピキア・パストリス、ピキア・フィンランディカ、ピキア・トレハロフィラ、ピキア・コクラマエ、ピキア・メンブラナエファシエンス、ピキア・オプンティアエ、ピキア・サーモトレランス、ピキア・サリクタリア、ピキア・グエルクウム、ピキア・ピペリ、ピキア・スティプティス、ピキア・メタノリカ、ピキア属種、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス属種、ハンゼヌラ・ポリモルファ、オガタエア・ミヌータ、クリベロマイセス属種、クリベロマイセス・ラクティス、カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼ、トリコデルマ・リーゼイ、クリソスポリウム・ラクノウェンス、フザリウム属種、フザリウム・グラミネウム、フザリウム・ベネナタムおよびニューロスポラ・クラッサよりなる群から選択される。様々な酵母、例えばオガタエア・ミヌータ、クリベロマイセス・ラクティス、ピキア・パストリス、ピキア・メタノリカおよびハンゼヌラ・ポリモルファなどは細胞培養にとりわけ好適であり、その理由は、これらは高細胞密度まで増殖させることができ、大量の組換えタンパク質を分泌するからである。同じく、糸状菌、例えばアスペルギルス・ニガー、フザリウム属種、ニューロスポラ・クラッサおよび他のものなどは、本発明の糖タンパク質を工業スケールで生産するのに用いることができる。
なおさらなる態様において、宿主細胞は、マンノシルトランスフェラーゼおよびホスホマンノシルトランスフェラーゼよりなる群から選択される1または複数の酵素の活性が欠乏している。なおさらなる態様において、宿主細胞は、1,6マンノシルトランスフェラーゼ、1,3マンノシルトランスフェラーゼおよび1,2マンノシルトランスフェラーゼよりなる群から選択される酵素を発現しない。
上記宿主細胞のいずれか1の特定の態様において、宿主細胞は酵母宿主細胞であり、これらとしては、限定されるものではないが、ピキア・パストリス、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Shizosaccharomyces pombe)、オガタエア・ミヌータおよびサッカロマイセス・セレビシエが挙げられる。特定の態様において、宿主細胞は、ピキア・パストリス、シゾサッカロマイセス・ポンベ、オガタエア・ミヌータまたはサッカロマイセス・セレビシエのoch1変異体である。酵母において、骨肉腫9(OS−9)ファミリー遺伝子はYOS9遺伝子であり、これはYos9pタンパク質をコードする。したがって、本発明は、Man5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3マンノシルトランスフェラーゼ活性(Alg3p)活性およびYos9pタンパク質またはそのホモログの活性を呈さず、異種組換えタンパク質をコードする核酸分子をさらに包含する組換え酵母宿主細胞を提供する。さらなる実施形態において、宿主細胞は、恒常的なまたは誘導性のプロモーターに操作可能に連結された少なくとも1の異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(例えば、LmSTT3Aタンパク質、LmSTT3Bタンパク質またはLmSTT3Dよりなる群から選択されるもの)をコードする核酸分子をさらに包含する。
組換え酵母宿主細胞の特定の態様において、ドリキル−P−Man:Man5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3 マンノシルトランスフェラーゼ活性(ALG3)遺伝子およびYOS9遺伝子またはそのホモログの発現は破壊されており、宿主細胞は異種組換えタンパク質をコードする核酸分子をさらに包含する。さらなる実施形態において、宿主細胞は、恒常的なまたは誘導性のプロモーターに操作可能に連結された少なくとも1の異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(例えば、LmSTT3Aタンパク質、LmSTT3Bタンパク質またはLmSTT3Dよりなる群から選択されるもの)をコードする核酸分子をさらに包含する。
本明細書中で開示される宿主細胞を用いて組換え糖タンパク質を生産する方法がさらに提供される。一般に、この方法は、Alg3p活性および骨肉腫9(OS−9)ファミリー遺伝子またはそのホモログの活性を呈さない組換え宿主細胞を用意すること、ならびに組換え糖タンパク質をコードする核酸分子を宿主細胞内に導入することを含む。組換え宿主細胞は培地中で、組換え糖タンパク質を発現させるのに十分な時間、培養または発酵される。さらなる実施形態において、組換え糖タンパク質は培地中に分泌され、この培地から組換え糖タンパク質を回収して培地中の他の成分から精製することができる。特定の態様において、宿主細胞は、恒常的なまたは誘導性のプロモーターに操作可能に連結された少なくとも1の異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(例えば、LmSTT3Aタンパク質、LmSTT3Bタンパク質またはLmSTT3Dよりなる群から選択されるもの)をコードする核酸分子をさらに包含する。
方法の特定の態様において、宿主細胞は下等真核生物である。さらなる態様において、下等真核生物は、ピキア・パストリス、ピキア・フィンランディカ、ピキア・トレハロフィラ、ピキア・コクラマエ、ピキア・メンブラナエファシエンス、ピキア・オプンティアエ、ピキア・サーモトレランス、ピキア・サリクタリア、ピキア・グエルクウム、ピキア・ピペリ、ピキア・スティプティス、ピキア・メタノリカ、ピキア属種、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス属種、ハンゼヌラ・ポリモルファ、オガタエア・ミヌータ、クリベロマイセス属種、クリベロマイセス・ラクティス、カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼ、トリコデルマ・リーゼイ、クリソスポリウム・ラクノウェンス、フザリウム属種、フザリウム・グラミネウム、フザリウム・ベネナタムおよびニューロスポラ・クラッサよりなる群から選択される。様々な酵母、例えばオガタエア・ミヌータ、クリベロマイセス・ラクティス、ピキア・パストリス、ピキア・メタノリカおよびハンゼヌラ・ポリモルファなどは、細胞培養にとりわけ好適であり、その理由は、これらは高細胞密度まで増殖させることができ、大量の組換えタンパク質を分泌するからである。同じく、糸状菌、例えばアスペルギルス・ニガー、フザリウム属種、ニューロスポラ・クラッサおよび他のものなどは、本発明の糖タンパク質を工業スケールで生産するのに用いることができる。
なおさらなる態様において、宿主細胞は、マンノシルトランスフェラーゼおよびホスホマンノシルトランスフェラーゼよりなる群から選択される1または複数の酵素の活性が欠乏している。なおさらなる態様において、宿主細胞は、1,6マンノシルトランスフェラーゼ、1,3マンノシルトランスフェラーゼおよび1,2マンノシルトランスフェラーゼよりなる群から選択される酵素を発現しない。
上記方法のいずれか1の特定の態様において、宿主細胞は酵母宿主細胞であり、これらとしては、限定されるものではないが、ピキア・パストリス、シゾサッカロマイセス・ポンベ、オガタエア・ミヌータおよびサッカロマイセス・セレビシエが挙げられる。特定の態様において、宿主細胞は、ピキア・パストリス、シゾサッカロマイセス・ポンベ、オガタエア・ミヌータまたはサッカロマイセス・セレビシエのoch1変異体である。酵母において、骨肉腫9(OS−9)ファミリー遺伝子はYOS9遺伝子であり、これはYos9pタンパク質をコードする。
したがって、本発明は、Man5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3マンノシルトランスフェラーゼ活性(Alg3p)活性およびYos9pタンパク質またはそのホモログの活性を呈さず、異種組換えタンパク質をコードする核酸分子をさらに包含する組換え酵母宿主細胞を用意することを含む、組換え糖タンパク質を生産する方法をさらに提供する。組換え宿主細胞は培地中で、組換え糖タンパク質を発現させるのに十分な時間、培養または発酵される。さらなる実施形態において、組換え糖タンパク質は培地中に分泌され、この培地から組換え糖タンパク質を回収して培地中の他の成分から精製することができる。さらなる実施形態において、宿主細胞は、恒常的なまたは誘導性のプロモーターに操作可能に連結された少なくとも1の異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(例えば、LmSTT3Aタンパク質、LmSTT3Bタンパク質またはLmSTT3Dよりなる群から選択されるもの)をコードする核酸分子をさらに包含する。
方法の特定の態様において、ドリキル−P−Man:Man5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3マンノシルトランスフェラーゼ活性(ALG3)遺伝子およびYOS9遺伝子またはそのホモログの遺伝子の発現が破壊されている組換え酵母宿主細胞が提供され、この宿主細胞は、異種組換えタンパク質をコードする核酸分子をさらに包含する。組換え宿主細胞は培地中で、組換え糖タンパク質を発現させるのに十分な時間、培養または発酵される。さらなる実施形態において、組換え糖タンパク質は培地中に分泌され、この培地から組換え糖タンパク質を回収して培地中の他の成分から精製することができる。さらなる実施形態において、宿主細胞は、恒常的なまたは誘導性のプロモーターに操作可能に連結された少なくとも1の異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(例えば、LmSTT3Aタンパク質、LmSTT3Bタンパク質またはLmSTT3Dよりなる群から選択されるもの)をコードする核酸分子をさらに包含する。
上記の組換え宿主細胞は、N−グリコシル化パターンが哺乳動物様であるか、またはヒト様であるか、またはヒト化しているか、または特定のN−グリカン種が優勢である糖タンパク質を発現する能力がある宿主細胞を提供するための、以下の遺伝子操作の任意の組み合わせをさらに包含し得る。このことは、選択された内在性グリコシル化酵素を除去すること、および/またはGerngross et al.により米国特許第7,449,308号中に記載されているように外来性酵素を供給することにより達成され得るものであり、この開示は参照により本明細書中に組み込まれる。酵母中のO−グリコシル化を低減させる一般的方法は、国際出願第WO2007061631号中に記載されている。このように、特定の望まれるグリコフォームが組成物中で優勢である糖タンパク質組成物を生産することができる。望まれる場合、グリコシル化の付加的な遺伝的操作を、コアフコシル化を伴ってまたは伴わずに糖タンパク質を産生することができるように、行うことができる。下等真核生物宿主細胞、例えば酵母などの使用は、これらの細胞が糖タンパク質の優勢なグリコフォームが組成物中で糖タンパク質のうちの30モルパーセント超のものとして存在し得るように糖タンパク質の比較的均質な組成物を産生することができるという点でさらに有利である。特定の態様において、優勢なグリコフォームは、組成物中に存在する糖タンパク質の40モルパーセント超、50モルパーセント超、60モルパーセント超、70モルパーセント超、最も好ましくは80モルパーセント超で存在し得る。かかるものは、選択された内在性グリコシル化酵素を除去すること、および/またはGerngross et al.により米国特許第7,029,872号および米国特許第7,449,308号中に記載されているように外来性酵素を供給することにより達成することができ、これらの開示は参照により本明細書中に組み込まれる。例えば、宿主細胞は、α1,6−マンノシルトランスフェラーゼ活性を枯渇させるように選択または操作することができ、この活性はそうでなければ糖タンパク質上のN−グリカン上にマンノース残基を付加する。例えば、酵母において、かかるα1,6−マンノシルトランスフェラーゼ活性はOCH1遺伝子によりコードされ、OCH1の欠失または破壊は、酵母、例えばピキア・パストリスまたはサッカロマイセス・セレビシエなどにおける高マンノースまたは高マンノシル化N−グリカンの産生を阻害する(例えば、Gerngross et al.、米国特許第7,029,872号;Contreras et al.、米国特許第6,803,225号;およびChiba et al.、EP1211310B1を参照されたい。これらの開示は参照により本明細書中に組み込まれる)。
1の実施形態において、宿主細胞は、細胞標的化シグナルペプチドと融合したα1,2−マンノシダーゼ触媒ドメインをさらに包含し、この細胞標的化シグナルペプチドは通常はこの触媒ドメインと関連せず、宿主細胞のERまたはゴルジ体に対してα1,2−マンノシダーゼ活性を標的化するように選択される。組換え糖タンパク質が宿主細胞のERまたはゴルジ体を通過することで、Man3GlcNAc2グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、Man3GlcNAc2グリコフォームを優勢に含む組換え糖タンパク質組成物が生産される。例えば、その開示が参照により本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第2005/0170452号は、Man3GlcNAc2グリコフォームを含む糖タンパク質を産生する能力がある下等真核生物宿主細胞を開示する。
さらなる実施形態において、直前の宿主細胞は、細胞標的化シグナルペプチドと融合したN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI(GlcNAcトランスフェラーゼIまたはGnT I)触媒ドメインをさらに包含し、この細胞標的化シグナルペプチドは通常はこの触媒ドメインと関連せず、宿主細胞のERまたはゴルジ体に対してGlcNAcトランスフェラーゼI活性を標的化するように選択される。組換え糖タンパク質が宿主細胞のERまたはゴルジ体を通過することで、GlcNAcMan3GlcNAc2グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えばGlcNAcMan3GlcNAc2グリコフォームを優勢に含む組換え糖タンパク質組成物が生産される。その開示が参照により本明細書中に全て組み込まれる米国特許第7,029,872号、米国特許第7,449,308号および米国特許出願公開第2005/0170452号は、GlcNAcMan3GlcNAc2グリコフォームを含む糖タンパク質を産生する能力がある下等真核生物宿主細胞を開示する。上記細胞中で産生される糖タンパク質をヘキサミニダーゼを使用してインビトロで処理することで、Man3GlcNAc2グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を生産することができる。
さらなる実施形態において、直前の宿主細胞は、細胞標的化シグナルペプチドと融合したN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼII(GlcNAcトランスフェラーゼIIまたはGnT II)触媒ドメインをさらに包含し、この細胞標的化シグナルペプチドは通常はこの触媒ドメインと関連せず、宿主細胞のERまたはゴルジ体に対してGlcNAcトランスフェラーゼII活性を標的化するように選択される。組換え糖タンパク質が宿主細胞のERまたはゴルジ体を通過することで、GlcNAc2Man3GlcNAc2グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えばGlcNAc2Man3GlcNAc2グリコフォームを優勢に含む組換え糖タンパク質組成物が生産される。その開示が参照により本明細書中に全て組み込まれる米国特許第7,029,872号および第7,449,308号ならびに米国特許出願公開第2005/0170452号は、GlcNAc2Man3GlcNAc2グリコフォームを含む糖タンパク質を産生する能力がある下等真核生物宿主細胞を開示する。上記細胞中で産生される糖タンパク質を末端のGlcNAc残基を取り除くヘキソサミニダーゼを使用してインビトロで処理することで、Man3GlcNAc2グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を生産することができ、または、ヘキソサミニダーゼを宿主細胞中で糖タンパク質と共発現させることで、Man3GlcNAc2グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を生産することができる。
さらなる実施形態において、直前の宿主細胞は、細胞標的化シグナルペプチドと融合したガラクトシルトランスフェラーゼ触媒ドメインをさらに包含し、この細胞標的化シグナルペプチドは通常はこの触媒ドメインと関連せず、宿主細胞のERまたはゴルジ体に対してガラクトシルトランスフェラーゼ活性を標的化するように選択される。組換え糖タンパク質が宿主細胞のERまたはゴルジ体を通過することで、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2もしくはGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2グリコフォームまたはそれらの混合物を含む組換え糖タンパク質、例えばGalGlcNAc2Man3GlcNAc2グリコフォームもしくはGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2グリコフォームまたはそれらの混合物を優勢に含む組換え糖タンパク質組成物が生産される。その開示が参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第7,029,872号および米国特許出願公開第2006/0040353号は、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2グリコフォームを含む糖タンパク質を産生する能力がある下等真核生物宿主細胞を開示する。上記細胞中で産生される糖タンパク質をガラクトシダーゼを使用してインビトロで処理することで、GlcNAc2Man3GlcNAc2グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えばGlcNAc2Man3GlcNAc2グリコフォームを優勢に含む組換え糖タンパク質組成物を生産することができ、または、ガラクトシダーゼを宿主細胞中で糖タンパク質と共発現させることで、GlcNAc2Man3GlcNAc2グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えばGlcNAc2Man3GlcNAc2グリコフォームを優勢に含む組換え糖タンパク質組成物を生産することができる。
さらなる実施形態において、直前の宿主細胞は、細胞標的化シグナルペプチドと融合したシアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインをさらに包含し、この細胞標的化シグナルペプチドは通常はこの触媒ドメインと関連せず、宿主細胞のERまたはゴルジ体に対してシアリルトランスフェラーゼ活性を標的化するように選択される。組換え糖タンパク質が宿主細胞のERまたはゴルジ体を通過することで、Sia2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2グリコフォームもしくはSiaGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2グリコフォームまたはそれらの混合物を優勢に含む組換え糖タンパク質が生産される。下等真核生物宿主細胞、例えば酵母および糸状菌などの場合、宿主細胞は、N−グリカンに転移させるためのCMP−シアル酸を提供する手段をさらに包含することが有用である。その開示が参照により本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第2005/0260729号は、CMP−シアル酸合成経路を有するように下等真核生物を遺伝子操作する方法を開示し、その開示が参照により本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第2006/0286637号は、シアル化糖タンパク質を産生させるように下等真核生物を遺伝子操作する方法を開示する。上記細胞中で産生される糖タンパク質をノイラミニダーゼを使用してインビトロで処理することで、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2グリコフォームもしくはGalGlcNAc2Man3GlcNAc2グリコフォームまたはそれらの混合物を優勢に含む組換え糖タンパク質を生産することができ、または、ノイラミニダーゼを宿主細胞中で糖タンパク質と共発現させることで、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2グリコフォームもしくはGalGlcNAc2Man3GlcNAc2グリコフォームまたはそれらの混合物を優勢に含む組換え糖タンパク質を生産することができる。
さらなる態様において、Man5GlcNAc2グリコフォームを有する糖タンパク質を作る能力がある上記の宿主細胞は、細胞標的化シグナルペプチドと融合したマンノシダーゼIII触媒ドメインをさらに包含することができ、この細胞標的化シグナルペプチドは通常はこの触媒ドメインと関連せず、宿主細胞のERまたはゴルジ体に対してマンノシダーゼIII活性を標的化するように選択される。組換え糖タンパク質が宿主細胞のERまたはゴルジ体を通過することで、Man3GlcNAc2グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えばMan3GlcNAc2グリコフォームを優勢に含む組換え糖タンパク質組成物が生産される。その開示が参照により本明細書中に全て組み込まれる米国特許第7,625,756号は、マンノシダーゼIII酵素を発現し、Man3GlcNAc2グリコフォームを優勢に有する糖タンパク質を産生する能力がある下等真核生物宿主細胞の使用を開示する。
前述の宿主細胞のいずれか1は、GnT III、GnT IV、GnT V、GnT VIおよびGnT IXよりなる群から選択される1または複数のGlcNAcトランスフェラーゼをさらに包含することで、二分岐(GnT III)および/または多アンテナ(GnT IV、V、VIおよびIX)のN−グリカン構造を有する糖タンパク質、例えば米国特許第7,598,055号および米国特許出願公開第2007/0037248号中に開示されているものなどを産生することができ、これらの開示は参照により本明細書中に全て組み込まれる。
一般に、酵母および糸状菌は、フコースを包含するN−グリカンを有する糖タンパク質を作ることができない。それ故、本明細書中で開示されるN−グリカンは、宿主細胞がGDP−フコースを合成するための経路およびフコシルトランスフェラーゼを包含するように特に改変されていないかぎり、フコースを欠くものとなる。それ故、N−グリカンがフコースを包含する糖タンパク質を有することが望ましい特定の態様において、上述の宿主細胞のいずれか1は、フコシルトランスフェラーゼ、およびフコースを産生してERまたはゴルジにフコースを転移させるための経路を包含するようにさらに改変される。そのN−グリカンのうちの1または複数がフコシル化されている糖タンパク質を産生する能力を持つようにピキア・パストリスを改変する方法の例は、国際出願公開第WO2008112092号中に開示されており、この開示は参照により本明細書中に組み込まれる。本発明の特定の態様において、ピキア・パストリス宿主細胞は、GDP−マンノース−4,6−デヒドラターゼ、GDP−ケト−デオキシ−マンノース−エピメラーゼ/GDP−ケト−デオキシ−ガラクトース−レダクターゼ、GDP−フコーストランスポーターおよびフコシルトランスフェラーゼを含むフコシル化経路を包含するようにさらに改変される。特定の態様において、フコシルトランスフェラーゼは、α1,2−フコシルトランスフェラーゼ、α1,3−フコシルトランスフェラーゼ、α1,4−フコシルトランスフェラーゼおよびα1,6−フコシルトランスフェラーゼよりなる群から選択される。
様々な前述の宿主細胞が、1または複数の糖トランスポーター、例えばUDP−GlcNAcトランスポーター(例えば、クリベロマイセス・ラクティスおよびムス・ムスクルス(Mus musculus)UDP−GlcNAcトランスポーター)、UDP−ガラクトーストランスポーター(例えば、ドロソフィラ・メラノガスター(Drosophila melanogaster)UDP−ガラクトーストランスポーター)およびCMP−シアル酸トランスポーター(例えば、ヒトシアル酸トランスポーター)などをさらに包含する。下等真核生物宿主細胞、例えば酵母および糸状菌などは上記トランスポーターを欠くため、下等真核生物宿主細胞、例えば酵母および糸状菌などは上記トランスポーターを包含するように遺伝子操作するのが好ましい。
宿主細胞としては、ホスホマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子PNO1およびMNN4B(例えば、米国特許第7,198,921号および第7,259,007号を参照されたい。これらの開示は参照により本明細書中に全て組み込まれる)の一方または両方を欠失させることまたは破壊することによりホスホマンノース残基を有する糖タンパク質を除去するように遺伝子操作されたピキア・パストリスがさらに挙げられ、これは、さらなる態様において、MNN4A遺伝子を欠失させることまたは破壊することをも包含することができる。破壊としては、特定の酵素をコードするオープンリーディングフレームを破壊すること、またはオープンリーディングフレームの発現を破壊すること、またはアンチセンスRNAなどの干渉RNAを用いてβ−マンノシルトランスフェラーゼおよび/もしくはホスホマンノシルトランスフェラーゼのうちの1もしくは複数をコードするRNAの翻訳を抑止することが挙げられる。宿主細胞としては、特定のN−グリカン構造を産生するように改変された上述の宿主細胞のいずれか1をさらに挙げることができる。
宿主細胞としては、タンパク質O−マンノシルトランスフェラーゼ(Dol−P−Man:タンパク質(Ser/Thr)マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子)(PMT)(米国特許第5,714,377号を参照されたい。この開示は参照により本明細書中に組み込まれる)のうちの1もしくは複数を欠失させることもしくは破壊することにより糖タンパク質のO−グリコシル化を制御するように遺伝子操作された、または、その開示が参照により本明細書中に組み込まれる国際出願公開第WO2007061631号中で開示されているように、Pmtp阻害剤および/もしくはα1,2マンノシダーゼの存在下で増殖させた下等真核生物細胞(例として、酵母、例えばピキア・パストリスなど)がさらに挙げられる。破壊としては、Pmtpをコードするオープンリーディングフレームを破壊すること、またはオープンリーディングフレームの発現を破壊すること、またはアンチセンスRNAなどの干渉RNAを用いてPmtpのうちの1もしくは複数をコードするRNAの翻訳を抑止することが挙げられる。宿主細胞としては、特定のN−グリカン構造を産生するように改変された上述の宿主細胞のいずれか1をさらに挙げることができる。
Pmtp阻害剤としては、限定されるものではないが、ベンジリデンチアゾリジンジオンが挙げられる。用いることができるベンジリデンチアゾリジンジオンの例は、5−[[3,4−ビス(フェニルメトキシ)フェニル]メチレン]−4−オキソ−2−チオキソ−3−チアゾリジン酢酸、5−[[3−(1−フェニルエトキシ)−4−(2−フェニルエトキシ)]フェニル]メチレン]−4−オキソ−2−チオキソ−3−チアゾリジン酢酸および5−[[3−(1−フェニル−2−ヒドロキシ)エトキシ)−4−(2−フェニルエトキシ)]フェニル]メチレン]−4−オキソ−2−チオキソ−3−チアゾリジン酢酸である。
特定の実施形態において、少なくとも1の内在性PMT遺伝子の機能または発現が低減され、破壊されまたは欠失される。例えば、特定の実施形態において、PMT1、PMT2、PMT3およびPMT4遺伝子よりなる群から選択される少なくとも1の内在性PMT遺伝子の機能もしくは発現は低減され、破壊されもしくは欠失され、または宿主細胞は1もしくは複数のPMT阻害剤の存在下で培養される。さらなる実施形態において、宿主細胞は1または複数のPMT遺伝子欠失または破壊を包含し、この宿主細胞は1または複数のPmtp阻害剤の存在下で培養される。これらの実施形態の特定の態様において、宿主細胞はまた、分泌型α−1,2−マンノシダーゼを発現する。
PMT欠失もしくは破壊および/またはPmtp阻害剤は、O−グリコシル化占有率を低減させることにより、すなわち、グリコシル化された糖タンパク質上のO−グリコシル化部位の総数を低減させることにより、O−グリコシル化を制御する。細胞により分泌されるα−1,2−マンノシダーゼをさらに追加することは、糖タンパク質上にあるO−グリカンのマンノース鎖長を低減させることにより、O−グリコシル化を制御する。したがって、PMT欠失もしくは破壊および/またはPmtp阻害剤を分泌型α−1,2−マンノシダーゼの発現と組み合わせることは、占有率および鎖長を低減させることにより、O−グリコシル化を制御する。特定の環境において、PMT欠失または破壊、Pmtp阻害剤およびα−1,2−マンノシダーゼの特定の組み合わせは経験的に決定されるが、それは、特定の異種糖タンパク質(例えば抗体)は異なる効率で発現してゴルジ体を通じて輸送され得るものであり、したがってPMT欠失または破壊、Pmtp阻害剤およびα−1,2−マンノシダーゼの特定の組み合わせを必要し得るためである。別の態様において、1または複数の内在性マンノシルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子が欠失される。欠失(複数可)は、分泌型α−1,2−マンノシダーゼおよび/もしくはPMT阻害剤を提供することと組み合わせることができ、または分泌型α−1,2−マンノシダーゼおよび/もしくはPMT阻害剤を提供することの代わりであることもできる。
したがって、O−グリコシル化の制御は、本明細書中に開示される宿主細胞中で特定の糖タンパク質を、より良好な総産生量で、または適切に組み立てられた糖タンパク質の産生量で、産生するのに有用であることができる。O−グリコシル化の低減または除去は、糖タンパク質、例えば全抗体などの組み立ておよび輸送に有益な効果があるように思われるが、それは、これらが分泌経路を通過して細胞表面に輸送されるためである。したがって、O−グリコシル化が制御されている細胞において、適切に組み立てられた糖タンパク質、例えば抗体断片などの産生量は、O−グリコシル化が制御されていない宿主細胞において得られる産生量と比べて増加する。
α−マンノシダーゼに抵抗性である、β−結合マンノース残基を持つN−グリカンおよびO−グリカンの可能性を低減させるまたは除去するため、組換えの糖鎖操作されたピキア・パストリス宿主細胞は、β−マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子(例として、BMT1、BMT2、BMT3およびBMT4)のうちの1または複数を欠失させるまたは破壊することにより、α−マンノシダーゼ抵抗性N−グリカンを有する糖タンパク質を除去するように遺伝子操作される(米国特許第7,465,577号、米国特許第7,713,719号および国際出願公開第WO2011046855号を参照されたい。これらの各々は参照により本明細書中に組み込まれる)。BMT2ならびにBMT1、BMT3およびBMT4のうちの1または複数の欠失または破壊もまた、宿主細胞タンパク質に対する抗体への検出可能な交差反応性を低減させ、または除去する。
特定の実施形態において、宿主細胞は、米国特許出願公開第20050170452号またはUS20100227363中に記載されるように、Alg3pタンパク質活性を呈さないか、またはALG3遺伝子からの発現の欠失または破壊(例として、宿主細胞をalg3Δにするための、Alg3pをコードするオープンリーディングフレームの欠失または破壊)を有し、これらの文献は参照により本明細書中に組み込まれる。Alg3pはMan5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3マンノシルトランスフェラーゼであり、これは、マンノース残基をアルファ−1,3結合中の脂質結合Man5GlcNAc2(図17、GS1.3)のアルファ−1,6アームのマンノース残基にトランスフェラーゼすることで脂質結合Glc3Man9GlcNAc2の合成のための前駆体である脂質結合Man6GlcNAc2(図17、GS1.4)を産生し、この脂質結合Man6GlcNAc2は次いでオリゴサッカリルトランスフェラーゼにより糖タンパク質のアスパラギン残基に転移され、その後にグルコース(Glc)残基が取り除かれる。Alg3pタンパク質活性を欠く宿主細胞において、脂質結合Man5GlcNAc2オリゴ糖は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼにより糖タンパク質のアスパラギン残基に転移され得る。α1,2−マンノシダーゼをさらに包含するかかる宿主細胞において、糖タンパク質に付着したMan5GlcNAc2オリゴ糖は、トリマンノース(パウチマンノース)Man3GlcNAc2構造(図17、GS2.1)に切り取られる。Man5GlcNAc2(GS1.3)構造は、図17中に示されるMan5GlcNAc2(GS2.0)と区別可能であり、Man5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3マンノシルトランスフェラーゼ(Alg3p)を発現する宿主細胞中で産生される。
それ故、欠失または破壊ALG3遺伝子(alg3Δ)および少なくとも1のN−グリコシル化部位を有するインスリンまたはインスリンアナログをコードする核酸分子の包含;ならびにインスリンまたはインスリンアナログを発現させるための条件下で宿主細胞を培養してMan5GlcNAc2(GS1.3)構造を優勢に有するN−グリコシル化されたインスリンまたはインスリンアナログを産生させることを含む、下等真核生物宿主細胞中でN−グリコシル化されたインスリンまたはインスリンアナログおよびこれらの組成物を生産する方法が提供される。さらなる実施形態において、宿主細胞は、エンドマンノシダーゼ活性(例として、完全長エンドマンノシダーゼであるか、または細胞標的化シグナルペプチドと融合したエンドマンノシダーゼ触媒ドメインを含むキメラエンドマンノシダーゼであり、この細胞標的化シグナルペプチドは通常はこの触媒ドメインと関連せず、宿主細胞のERまたはゴルジ体に対してエンドマンノシダーゼ活性を標的化するように選択される。例えば、米国特許第7,332,299号を参照されたい)および/またはグルコシダーゼII活性(完全長グルコシダーゼIIであるか、または細胞標的化シグナルペプチドと融合したグルコシダーゼII触媒ドメインを含むキメラグルコシダーゼIIであり、この細胞標的化シグナルペプチドは通常はこの触媒ドメインと関連せず、宿主細胞のERまたはゴルジ体に対してグルコシダーゼII活性を標的化するように選択される。例えば、米国特許第6,803,225号を参照されたい)をさらに発現する。特定の態様において、宿主細胞は、ALG6(α1,3−グルコシラトランスフェラーゼ)遺伝子の欠失または破壊(alg6Δ)をさらに包含し、このalg6Δはalg3Δ宿主細胞中の糖タンパク質のN−グリカン占有率を増加させることが示されている(例えば、De Pourcq et al.,PloSOne 2012;7(6):e39976.Epub 2012 Jun 29を参照されたい。この文献は、ヤロウィア・リポリティカをMan5GlcNAc2(GS1.3)またはパウチマンノースN−グリカンの構造を有する糖タンパク質を産生するように遺伝子操作することを開示している)。ピキア・パストリスALG6をコードする核酸配列は、EMBLデータベース中で、アクセッション番号CCCA38426で開示されている。さらなる態様において、宿主細胞は、OCH1遺伝子の欠失または破壊(och1Δ)をさらに包含する。
ALG3遺伝子の欠失または破壊(alg3Δ)、ならびに細胞標的化シグナルペプチドと融合したα1,2−マンノシダーゼ触媒ドメインを含むキメラα1,2−マンノシダーゼをコードする核酸分子であって、この細胞標的化シグナルペプチドが通常はこの触媒ドメインと関連せず、宿主細胞のERまたはゴルジ体に対してα1,2−マンノシダーゼ活性を標的化してキメラα1,2−マンノシダーゼを過剰発現させるように選択される核酸分子および少なくとも1のN−グリコシル化部位を有するインスリンまたはインスリンアナログをコードする核酸分子の包含;ならびにインスリンまたはインスリンアナログを発現させるための条件下で宿主細胞を培養してMan3GlcNAc2構造を優勢に有するN−グリコシル化されたインスリンまたはインスリンアナログを産生させることを含む、下等真核生物宿主細胞中でN−グリコシル化されたインスリンまたはインスリンアナログおよびこれらの組成物を生産する方法がさらに提供される。さらなる実施形態において、宿主細胞は、エンドマンノシダーゼ活性(例として、完全長エンドマンノシダーゼであるか、または細胞標的化シグナルペプチドと融合したエンドマンノシダーゼ触媒ドメインを含むキメラエンドマンノシダーゼであり、この細胞標的化シグナルペプチドは通常はこの触媒ドメインと関連せず、宿主細胞のERまたはゴルジ体に対してエンドマンノシダーゼ活性を標的化するように選択される)および/またはグルコシダーゼII活性(完全長グルコシダーゼIIであるか、または細胞標的化シグナルペプチドと融合したグルコシダーゼII触媒ドメインを含むキメラグルコシダーゼIIであり、この細胞標的化シグナルペプチドは通常はこの触媒ドメインと関連せず、宿主細胞のERまたはゴルジ体に対してグルコシダーゼII活性を標的化するように選択される)をさらに発現または過剰発現する。特定の態様において、宿主細胞は、ALG6遺伝子の欠失または破壊(alg6Δ)をさらに包含する。さらなる態様において、宿主細胞は、OCH1遺伝子の欠失または破壊(och1Δ)をさらに包含する。実施例6は、完全長エンドマンノシダーゼを過剰発現するalg3Δピキア・パストリス宿主細胞の構築を示し、これはパウチマンノースN−グリカンを有するインスリンアナログを産生した。同様の宿主細胞は、他の酵母または糸状菌においても構築し得る。
さらなる実施形態において、上記のalg3Δ宿主細胞は、先に開示されるような付加的な哺乳動物またはヒトのグリコシル化酵素(例として、GnT I、GnT II、ガラクトシラトランスフェラーゼ(galactosylatransferase)、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ)をさらに包含して、特定のハイブリッドまたは複合型のN−グリカンを優勢に有するN−グリコシル化されたインスリンまたはインスリンアナログを産生し得る。
糖タンパク質の産生量は、場合により、哺乳動物もしくはヒトのシャペロンタンパク質をコードする核酸分子を過剰発現させることにより、または1もしくは複数の内在性シャペロンタンパク質をコードする遺伝子を1もしくは複数の哺乳動物もしくはヒトのシャペロンタンパク質をコードする核酸分子で置き換えることにより、改善することができる。加えて、宿主細胞中の哺乳動物またはヒトのシャペロンタンパク質の発現はまた、細胞中のO−グリコシル化を制御するように思われる。したがって、シャペロンタンパク質をコードする少なくとも1の内在性遺伝子の機能が低減または除去されている宿主細胞が本明細書中にさらに包含され、少なくとも1の哺乳動物またはヒトのシャペロンタンパク質ホモログをコードするベクターが宿主細胞中で発現される。内在性宿主細胞シャペロンおよび哺乳動物またはヒトのシャペロンタンパク質を発現する宿主細胞もまた包含される。さらなる態様において、下等真核生物宿主細胞は、酵母または糸状菌の宿主細胞である。産生量を改善するため、および組換えタンパク質のO−グリコシル化を低減または制御するためにヒトシャペロンタンパク質が導入された宿主細胞のシャペロンの使用の例は、国際出願公開第WO2009105357号および第WO2010019487号中に開示されている(この開示は参照により本明細書中に組み込まれる)。
それ故、本明細書中で開示される方法は、図17中に示される少なくともN−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝子操作された任意の宿主細胞を用いることができる。本明細書中で開示される方法は、優勢なN−グリカンが複合型N−グリカン、ハイブリッドN−グリカンおよび高マンノースN−グリカンよりなる群から選択される糖タンパク質を産生するように遺伝子操作された任意の宿主細胞を用いることができ、ここで複合型N−グリカンは、Man3GlcNAc2(パウチマンノース)、GlcNAc(1−4)Man3GlcNAc2、Gal(1−4)GlcNAc(1−4)Man3GlcNAc2およびSia(1−4)Gal(1−4)Man3GlcNAc2よりなる群から選択される。さらなる実施形態において、宿主細胞は、Man5GlcNAc2(GS1.3)構造からなるN−グリカン構造を優勢に有する糖タンパク質を産生する。一般に、この株は、図17中に示されるMan5GlcNAc2(GS2.0)構造を産生するものと予想されないものである。
酵母を遺伝子操作する場合、選択マーカーは、薬剤抵抗性マーカーおよび酵母宿主細胞に必須細胞栄養分、例としてアミノ酸を合成させる遺伝機能を包含する組換え宿主細胞を構築するのに用いることができる。酵母中で一般に用いられる薬剤抵抗性マーカーとしては、クロラムフェニコール、カナマイシン、メトトレキサート、G418(ジェネテシン)、ゼオシンなどが挙げられる。酵母宿主細胞に必須細胞栄養分を合成させる遺伝機能は、対応するゲノム機能において栄養要求性変異を有する利用可能な酵母株と共に用いられる。一般的な酵母選択マーカーは、ロイシン(LEU2)、トリプトファン(TRP1およびTRP2)、プロリン(PRO1)、ウラシル(URA3、URA5、URA6)、ヒスチジン(HIS3)、リジン(LYS2)、アデニン(ADE1またはADE2)などを合成するための遺伝機能をもたらす。他の酵母選択マーカーとしてはS.セレビシエからのARR3遺伝子が挙げられ、この遺伝子は、亜ヒ酸塩の存在下で増殖される酵母細胞に亜ヒ酸塩抵抗性を付与する(Bobrowicz et al.,Yeast,13:819−828(1997);Wysocki et al,J.Biol.Chem.272:30061−30066(1997))。いくつかの好適な組み込み部位として米国特許第7,479,389号(この開示は参照により本明細書中に組み込まれる)中に列挙されているものが挙げられ、これは、サッカロマイセス・セレビシエおよび他の酵母または真菌について公知の遺伝子座に対するホモログを包含する。酵母内にベクターを組み込む方法は周知である(例えば、米国特許第7,479,389号、米国特許第7,514,253号、米国特許出願公開第2009012400号およびWO2009/085135を参照されたい。これらの開示は参照により本明細書中に全て組み込まれる)。挿入部位の例としては、限定されるものではないが、ピキアADE遺伝子、ピキアTRP(TRP1からTRP2を包含する)遺伝子、ピキアMCA遺伝子、ピキアCYM遺伝子、ピキアPEP遺伝子、ピキアPRB遺伝子およびピキアLEU遺伝子が挙げられる。ピキアのADE1およびARG4遺伝子はLin Cereghino et al.,Gene 263:159−169(2001)および米国特許第4,818,700号中に記載されており(これらの開示は参照により本明細書中に組み込まれる)、HIS3およびTRP1遺伝子はCosano et al.,Yeast 14:861−867(1998)中に記載されており、HIS4はGenBankアクセッション番号X56180中に記載されている。
酵母細胞の形質転換は当該技術分野で周知であり、例えば、それ自体公知の方法でのプロトプラスト形成およびその後の形質転換により達せられ得る。細胞を培養するのに用いられる培地は、酵母生物を増殖させるのに好適な任意の従来の培地であり得る。
上記宿主細胞および宿主細胞を用いる方法のいずれか1の特定の実施形態において、組換え異種タンパク質は治療用のタンパク質または糖タンパク質であり、これは、特定の実施形態において、例えば、エリスロポエチン(EPO);サイトカイン、例えばインターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγおよびインターフェロンωなど;ならびに顆粒球−コロニー刺激因子(GCSF);顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子(GM−CSF);凝固因子、例えば因子VIII、因子IXおよびヒトプロテインCなど;アンチトロンビンIII;トロンビン;可溶性IgE受容体α鎖;免疫グロブリン、例えばIgG、IgG断片、IgG融合体およびIgMなど;免疫接着物質および他のFc融合タンパク質、例えば可溶性TNF受容体−Fc融合タンパク質など;RAGE−Fc融合タンパク質;インターロイキン;ウロキナーゼ;キマーゼ;尿素トリプシンインヒビター;IGF結合タンパク質;上皮増殖因子;成長ホルモン放出因子;アネキシンV融合タンパク質;アンジオスタチン;血管内皮増殖因子−2;骨芽前駆細胞抑制因子−1;オステオプロテジェリン;α−1−アンチトリプシン;α−フェトプロテイン;DNase II;ヒトプラスミノーゲンのクリングル3;グルコセレブロシダーゼ;TNF結合タンパク質1;卵胞刺激ホルモン;細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4−Ig;膜貫通アクティベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンド;グルカゴン様タンパク質1;インスリン、ならびにIL−2受容体アゴニストよりなる群から選択され得る。
上記宿主細胞のいずれか1のさらなる実施形態において、治療用糖タンパク質は抗体であり、その例としては、限定されるものではないが、抗Her2抗体、抗RSV(呼吸合胞体ウイルス)抗体、抗TNFα抗体、抗VEGF抗体、抗CD3受容体抗体、抗CD41 7E3抗体、抗CD25抗体、抗CD52抗体、抗CD33抗体、抗IgE抗体、抗CD11a抗体、抗EGF受容体抗体または抗CD20抗体が挙げられる。
以下の実施例は、本発明のさらなる理解を促すことを意図したものである。
実施例1
誘導性のまたは恒常的なプロモーターに操作可能に連結されたリーシュマニア・メジャーSTT3D(LmSTT3D)オープンリーディングフレーム(ORF)をコードする発現カセットを含むプラスミドを以下のように構築した。
誘導性のまたは恒常的なプロモーターに操作可能に連結されたリーシュマニア・メジャーSTT3D(LmSTT3D)オープンリーディングフレーム(ORF)をコードする発現カセットを含むプラスミドを以下のように構築した。
LmSTT3Dをコードするオープンリーディングフレーム(配列番号1)は、GeneArt AG,Brandenburg,Germanyにより、P.パストリス中での最適な発現のためにコドン最適化され、合成された。LmSTT3Dをコードするコドン最適化された核酸分子はpGLY6287と命名され、配列番号2中に示されるヌクレオチド配列を有する。
プラスミドpGLY6301(図2)は、P.パストリス中のURA6遺伝子座を標的とするロールイン組み込みプラスミドである。LmSTT3Dをコードする発現カセットは、P.パストリス中での有効な発現のためにコドン最適化されたLmSTT3D ORFをコードする核酸分子を含み、この核酸分子は、5’末端において誘導性P.パストリスAOX1プロモーター配列を有する核酸分子(配列番号3)に、および3’末端においてS.セレビシエCYC転写終結配列を有する核酸分子(配列番号4)に操作可能に連結されている。形質転換体を選択するため、このプラスミドはS.セレビシエARR3 ORFをコードする発現カセットを含み、ここでORFをコードする核酸分子(配列番号5)は、5’末端においてP.パストリスRPL10プロモーター配列を有する核酸分子(配列番号6)に、および3’末端においてS.セレビシエCYC転写終結配列を有する核酸分子に操作可能に連結されている。このプラスミドは、URA6遺伝子座を標的とする核酸分子(配列番号7)をさらに包含する。5’末端においてEcoRI部位に、および3’末端においてFseI部位に隣接したコドン最適化されたLmSTT3D ORF(pGLY6287)をコードするDNA断片を、EcoRIおよびFseIで消化されたプラスミドpGFI30t内にクローニングすることにより、プラスミドpGLY6301を構築した。
プラスミドpGLY6294(図3)は、TRP1遺伝子座の発現を破壊することなく、P.パストリス中のこの遺伝子座を標的とするKINKO組み込みベクターである。KINKO(ノックアウトをほとんどまたは全く伴わないノックイン(Knock−In with little or No Knock−Out))組み込みベクターは、標的の遺伝子座において遺伝子の発現を破壊することなく、この標的の遺伝子座内への異種DNAの挿入を可能にするものであり、米国特許出願公開第20090124000号中に記載されている。LmSTT3Dをコードする発現カセットは、LmSTT3D ORFをコードする核酸分子を含み、この核酸分子は、5’末端において恒常的P.パストリスGAPDHプロモーター配列を有する核酸分子(配列番号8)に、および3’末端においてS.セレビシエCYC転写終結配列を有する核酸分子に操作可能に連結されている。形質転換体を選択するため、このプラスミドは、ノーセオトリシン抵抗性(NATR)ORF(元々はEROSCARF,Scientific Research and Development GmbH,Daimlerstrasse 13a,D−61352 Bad Homburg,GermanyからのpAG25に由来するものであり、Goldstein et al.,Yeast 15:1541(1999)を参照されたい。GenBankアクセッション番号CAR31387.1およびCAR31383.1)をコードする発現カセットを含み、ここでORFをコードする核酸分子(配列番号9)は、5’末端においてアシュビア・ゴシピーTEF1プロモーター配列を有する核酸分子(配列番号10)に、および3’末端においてアシュビア・ゴシピーTEF1終結配列を有する核酸配列(配列番号11)に操作可能に連結されている。この2つの発現カセットは、一方の側ではP.パストリスALG3終結配列を有する核酸分子(配列番号13)に連結された停止コドンで終わるTrp1pをコードするORFの5’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子(配列番号12)に、他方の側ではTRP1遺伝子の3’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子(配列番号14)に隣接している。5’末端においてNotI部位に、および3’末端においてPacI部位に隣接したコドン最適化されたLmSTT3D ORF(pGLY6287)をコードするDNA断片をNotIおよびFseIで消化されたプラスミドpGLY597内にクローニングすることにより、プラスミドpGLY6294を構築した。ノーセオトリシン抵抗性ORF(NAT)をコードする核酸分子を含む発現カセットを、アシュビア・ゴシピーTEF1プロモーター(PTEF)およびアシュビア・ゴシピーTEF1終結配列(TTEF)に操作可能に連結した。
上記プラスミドは、以下の実施例中で示されるように、LmSTT3D発現カセットをP.パストリス内に導入して、ここで産生される糖タンパク質上のN−グリコシル化部位占有率を増加させるのに用いることができる。
実施例2
遺伝子操作されたピキア・パストリス株YGLY14401、YGLY18445、YGLY28158およびYGLY20228は、全て、ガラクトース末端の複合型N−グリカンを産生する能力を持つように遺伝子操作された宿主細胞中で組換えヒト抗RSV抗体を産生する株である。株YGLY18445はLmSTT3Dを過剰発現し、株YGLY28158はゲノム内に組み込まれた遺伝子の2つのコピーからLmSTT3Dを過剰発現し、YGLY20228はLmSTT3DおよびLmSTT3Aを発現する。これらの株の構築を図1A〜1L中に模式的に図示する。簡潔には、これらの株を以下のように構築した。
遺伝子操作されたピキア・パストリス株YGLY14401、YGLY18445、YGLY28158およびYGLY20228は、全て、ガラクトース末端の複合型N−グリカンを産生する能力を持つように遺伝子操作された宿主細胞中で組換えヒト抗RSV抗体を産生する株である。株YGLY18445はLmSTT3Dを過剰発現し、株YGLY28158はゲノム内に組み込まれた遺伝子の2つのコピーからLmSTT3Dを過剰発現し、YGLY20228はLmSTT3DおよびLmSTT3Aを発現する。これらの株の構築を図1A〜1L中に模式的に図示する。簡潔には、これらの株を以下のように構築した。
一般に、これらの株は、以前に記載された方法を用いて野生型ピキア・パストリス株NRRL−Y11430から構築した(例えば、米国特許第7,449,308号;米国特許第7,479,389号;米国特許出願公開第20090124000号;PCT出願公開第WO2009085135号;Nett and Gerngross,Yeast 20:1279(2003);Choi et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:5022(2003);Hamilton et al,Science 301:1244(2003)を参照されたい)。全てのプラスミドは、標準的な分子生物学的手法を用いて、pUC19プラスミド中で作られた。P.パストリス中での発現のために最適化されたヌクレオチド配列の場合、天然のヌクレオチド配列をGENEOPTIMIZERソフトウェア(GeneArt,Regensburg,Germany)により解析して、その結果をP.パストリス発現のためにコドンが最適化されたヌクレオチド配列を作成するのに用いた。酵母株をエレクトロポレーション(エレクトロポレーターの製造業者BioRadにより推奨される標準的な技術を用いたもの)により形質転換した。株NRRL−Y11430で始まる一連の形質転換から、株YGLY8323を生み出した。株YGLY8323は、ガラクトース末端のN−グリカンを優勢に有する糖タンパク質を産生する能力がある。野生型NRRL−Y11430株からのこの株の構築は、国際出願公開第WO2011106389号の実施例2中に詳細に記載されており、この文献は参照により本明細書中に組み込まれる。
プラスミドpGLY6564(図4)は、P.パストリス中のTRP2遺伝子座を標的とする、抗RSV抗体の軽鎖および重鎖をコードするロールイン組み込みプラスミドである。抗RSV重鎖をコードする発現カセットは、P.パストリス中での有効な発現のためにコドン最適化された重鎖ORFをコードする核酸分子(配列番号15)を含み、この核酸分子は、5’末端においてサッカロマイセス・セレビシエ接合因子プレシグナル配列をコードする核酸分子(配列番号33)に操作可能に連結されて今度はそのN末端において誘導性P.パストリスAOX1プロモーター配列を有する核酸分子と融合しており、および3’末端においてS.セレビシエCYC転写終結を有する核酸分子に操作可能に連結されている。抗RSV軽鎖をコードする発現カセットは、P.パストリス中での有効な発現のためにコドン最適化された軽鎖ORFをコードする核酸分子(配列番号16)を含み、この核酸分子は、5’末端においてサッカロマイセス・セレビシエ接合因子プレシグナル配列をコードする核酸分子に操作可能に連結されて今度はそのN末端において誘導性P.パストリスAOX1プロモーター配列を有する核酸分子と融合しており、および3’末端においてP.パストリスAOX1転写終結配列を有する核酸分子(配列番号17)に操作可能に連結されている。形質転換体を選択するため、このプラスミドはゼオシンORFをコードする発現カセットを含み、ここではORFをコードする核酸分子(配列番号18)が5’末端においてS.セレビシエTEFプロモーター配列を有する核酸分子(配列番号36)に、および3’末端においてS.セレビシエCYC転写終結配列を有する核酸分子に操作可能に連結されている。このプラスミドは、TRP2遺伝子座を標的化するための核酸分子をさらに包含する。
株YGLY14401は、抗RSV抗体をコードするプラスミドpGLY6564をYGLY8323内に形質転換することにより、作成した。得られた株から株YGLY14401を選択した。この株において、抗RSV重鎖および軽鎖をコードする発現カセットは、ピキア・パストリスTRP2遺伝子座(PpTRP2)に対して標的化される。この株は、LmSTT3D発現カセットを包含しない。株YGLY14401を5−FOAの存在下で対抗選択して、URA5遺伝子を喪失してlacZリピートのみを残している株YGLY15820を得た。
株YGLY15820をプラスミドpGLY7140(図5)で形質転換したが、このプラスミドは、YOS9遺伝子座を標的とし、lacZリピートを含む核酸分子(配列番号42)に隣接したP.パストリスURA5遺伝子を含む核酸分子(配列番号41)または転写単位を含有するノックアウトベクターであり、これは今度は一方の側ではYOS9遺伝子の5’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子(配列番号19)に、他方の側ではYOS9遺伝子の3’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子(配列番号20)に隣接している。プラスミドpGLY7140をSfiIで線状化し、線状化されたプラスミドを株YGLY15820内に形質転換して、lacZリピートに隣接したURA5遺伝子が二重交差相同組換えによりYOS9遺伝子座内に挿入されているいくつかの株を得た。得られた株から株YGLY15019を選択した。
株YGLY17327は、P.パストリスGAPDHプロモーターの制御下にあるLmSTT3D ORFをコードするKINKOプラスミドであるプラスミドpGLY6294を株YGLY15019内に形質転換することにより作成したが、ここでLmSTT3DはP.パストリス中のTRP1遺伝子座を標的とする。株YGLY17327を5−FOAの存在下で対抗選択して、URA5遺伝子を喪失してlacZリピートのみを残している株YGLY17331を得た。
株YGLY18445は、ALG3遺伝子座を標的とし、lacZリピートを含む核酸分子に隣接したP.パストリスURA5遺伝子または転写単位を含む核酸分子を含有するノックアウトベクターであるプラスミドpGLY5508(図6)を形質転換することにより作成したが、この核酸分子は、今度は一方の側ではALG3遺伝子の5’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子(配列番号21)に、他方の側ではALG3遺伝子の3’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子(配列番号22)に隣接している。プラスミドpGLY5508をSfiIで線状化し、線状化されたプラスミドを株YGLY17331内に形質転換して、lacZリピートに隣接したURA5遺伝子が二重交差相同組換えによりALG3遺伝子座内に挿入されているいくつかの株を得た。得られた株から株YGLY18445を選択した。
本明細書中に開示される適当な株の、上記LmSTT3D発現/組み込みプラスミドベクターでの形質転換は、基本的に以下のように行った。適当なピキア・パストリス株を50mLのYPD培地(酵母エキス(1%)、ペプトン(2%)およびブドウ糖(2%))中で、ODが約0.2から6になるまで一晩増殖させた。氷上で30分間のインキュベーションの後、細胞を2500〜3000rpmで5分間の遠心分離によりペレット化した。培地を取り除き、細胞を氷冷滅菌1Mソルビトールで3回洗浄し、その後に0.5mLの氷冷滅菌1Mソルビトール中に再懸濁した。10μLの線状化DNA(5〜20μg)および100μLの細胞懸濁液をエレクトロポレーションキュベット中で合わせて、氷上で5分間インキュベートした。エレクトロポレーションは予め設定されたピキア・パストリスプロトコール(2kV、25μF、200Ω)に従ってBio−Rad GenePulser Xcell中で行い、直後に1mLのYPDS回収培地(YPD培地+1Mソルビトール)を加えた。形質転換された細胞を室温(24℃)で4時間から一晩の間、回収し、その後に選択培地上に細胞を蒔いた。
株YGLY18445を次いで上記のように、誘導性AOX1プロモーターの制御下にあるLmSTT3DをコードするpGLY6301で、または誘導性AOX1プロモーターの制御下にあるLmSTT3AをコードするpGLY6299で形質転換して、実施例3中に記載されるように株YGLY28158およびYGLY20228をそれぞれ得た。
実施例3
LmSTT3AをコードするORFが誘導性PpAOX1プロモーターに操作可能に連結された発現カセットを含む組み込み/発現プラスミドpGLY6299、またはLmSTT3DをコードするORFが誘導性PpAOX1プロモーターに操作可能に連結された発現カセットを含むpGLY6301を、それぞれSpeIで線状化し、線状化されたプラスミドをピキア・パストリス株YGLY18445内に形質転換して、表1中に示されるように、株YGLY20228およびYGLY28158をそれぞれ得た。形質転換は、基本的に実施例2中に記載されるように行った。
LmSTT3AをコードするORFが誘導性PpAOX1プロモーターに操作可能に連結された発現カセットを含む組み込み/発現プラスミドpGLY6299、またはLmSTT3DをコードするORFが誘導性PpAOX1プロモーターに操作可能に連結された発現カセットを含むpGLY6301を、それぞれSpeIで線状化し、線状化されたプラスミドをピキア・パストリス株YGLY18445内に形質転換して、表1中に示されるように、株YGLY20228およびYGLY28158をそれぞれ得た。形質転換は、基本的に実施例2中に記載されるように行った。
表1は、PpYOS9およびPpALG3のORFが欠失し、LmSTT3Dが恒常的GAPDHプロモーターの制御下にある株YGLY18445、YGLY20228およびYGLY28158から得られた抗RSV抗体組成物のパーセントN−グリカン部位占有率を示す。株YGLY20228は誘導性AOX1プロモーターの制御下にあるLmSTT3Aを包含し、株YGLY28158はLmSTT3Dの付加的なコピーを包含するが誘導性AOX1プロモーターの制御下にある。
表2は、株YGLY14401および株YGLY20228から得られた抗RSV抗体組成物のN−グリカンの比較を示す。株YGLY14401はLmSTT3DおよびLmSTT3Aをコードする発現カセットを包含しない一方、株YGLY20228は恒常的GAPDHプロモーターの制御下にあるLmSTT3Dおよび誘導性AOX1プロモーターの制御下にあるLmSTT3Aを包含し、PpYOS9 ORFおよびPpALG3 ORFが欠失している。株YGLY20228はMan5GlcNAc2(GS1.3)N−グリカンを産生することが予想される一方、Man5GlcNAc2(GS2.0)N−グリカンを例えあったとしてもほとんど産生しないと予想されるが、これは、ALG3破壊が、糖タンパク質中のN−結合グリコシル化部位に転移された後にα1,2−マンノシダーゼによりMan5GlcNAc2(GS2.0)に変換することができる脂質結合構造の形成を妨げるためである(GS2.0およびGS1.3の構造について図17を参照されたい)。この図は、YGLY20228が検出可能なMan5GlcNAc2(GS2.0)N−グリカンをほとんどまたは全く産生しなかったことを示す。しかしながら、YGLY20228から得られた抗体組成物中のN−グリカンは、それぞれ約4.5モル%のM3(GS2.1)およびM4 N−グリカン(アルファ1,2−結合マンノースが1個少ないGS1.3)、1.5モル%のGS3.1+1個のグルコースが1,3アームの末端に結合したもの、ならびに2.9モル%のGS3.1+2個のグルコースが1,3アームの末端に結合したものを包含した。
実施例4
パウチマンノースMan3GlcNAc2(GS2.1)構造を産生する能力がある株を構築し、LmSTTオリゴサッカリルトランスフェラーゼの様々な組み合わせの存在下で株中で発現された抗体のN−グリコシル化の産生量および質の評価において用いた。この株をYGLY24541と命名した。その構築を図7A〜E中に模式的に図示する。簡潔には、これらの株は以下のように構築した。
パウチマンノースMan3GlcNAc2(GS2.1)構造を産生する能力がある株を構築し、LmSTTオリゴサッカリルトランスフェラーゼの様々な組み合わせの存在下で株中で発現された抗体のN−グリコシル化の産生量および質の評価において用いた。この株をYGLY24541と命名した。その構築を図7A〜E中に模式的に図示する。簡潔には、これらの株は以下のように構築した。
開始株YGLY16−3の構築は、国際出願公開第WO2011106389号の実施例2中に詳細に記載されており、この文献は参照により本明細書中に組み込まれる。プラスミドpGLY3419(図8)は、lacZリピートに隣接したP.パストリスURA5遺伝子を含む発現カセットを含有する組み込みベクターであり、この発現カセットは、一方の側ではP.パストリスBMT1遺伝子の5’ヌクレオチド配列(配列番号23)と、他方の側ではP.パストリスBMT1遺伝子の3’ヌクレオチド配列(配列番号24)と隣接している。プラスミドpGLY3419を線状化し、線状化されたプラスミドを株YGLY16−3内に形質転換して、URA5発現カセットが二重交差相同組換えによりBMT4遺伝子座内に挿入されているいくつかの株を得た。得られた株から株YGLY6697を選択し、5−FOAの存在下で対抗選択して、URA5遺伝子を喪失してlacZリピートのみを残している株YGLY6719を得た。この株は、BMT2遺伝子およびBMT1遺伝子が破壊されている。
プラスミドpGLY3411(図9)は、lacZリピートに隣接したP.パストリスURA5遺伝子を含む発現カセットを含有する組み込みベクターであり、この発現カセットは、一方の側ではP.パストリスBMT4遺伝子の5’ヌクレオチド配列(配列番号25)と、他方の側ではP.パストリスBMT4遺伝子の3’ヌクレオチド配列(配列番号26)と隣接している。プラスミドpGLY3411を線状化し、線状化されたプラスミドを株YGLY6719内に形質転換して、URA5発現カセットが二重交差相同組換えによりBMT4遺伝子座内に挿入されているいくつかの株を得た。得られた株から株YGLY6743を選択し、5−FOAの存在下で対抗選択して、URA5遺伝子を喪失してlacZリピートのみを残している株YGLY6773を得た。この株は、BMT2遺伝子、BMT1遺伝子およびBMT4遺伝子が破壊されている。
プラスミドpGLY3421(図10)は、lacZリピートに隣接したP.パストリスURA5遺伝子を含む発現カセットを含有する組み込みベクターであり、この発現カセットは、一方の側ではP.パストリスBMT3遺伝子の5’ヌクレオチド配列(配列番号27)と、他方の側ではP.パストリスBMT3遺伝子の3’ヌクレオチド配列(配列番号28)と隣接している。プラスミドpGLY3421を線状化し、線状化されたプラスミドを株YGLY6733内に形質転換して、URA5発現カセットが二重交差相同組換えによりBMT4遺伝子座内に挿入されているいくつかの株を得た。得られた株から株YGLY7754を選択し、5−FOAの存在下で対抗選択して、URA5遺伝子を喪失してlacZリピートのみを残している株YGLY8252を得た。この株は、BMT2遺伝子、BMT1遺伝子、BMT4遺伝子およびBMT3遺伝子が破壊されている。
プラスミドpGLY1162(図11)は、PRO1遺伝子座の発現を破壊することなくこの遺伝子座を標的とし、N末端においてキメラタンパク質を分泌経路および細胞からの分泌物に標的化するためのS.セレビシエαMATpreシグナルペプチド(aMATTrMan)と融合したT.リーゼイα−1,2−マンノシダーゼ触媒ドメインをコードする発現カセットを含有するKINKO組み込みベクターである。aMATTrManをコードする発現カセットは、5’末端においてS.セレビシエaMATpreシグナルペプチドをコードする核酸分子(配列番号33)と融合したT.リーゼイ触媒ドメインをコードする核酸分子(配列番号29)を含み、この核酸分子は、5’末端においてP.パストリスAOX1プロモーターを含む核酸分子に、および3’末端においてS.セレビシエCYC転写終結配列を含む核酸分子に操作可能に連結されている。このカセットは、一方の側ではPRO1遺伝子の完全ORFの5’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子(配列番号30)であって、その後にP.パストリスALG3終結配列が続く核酸分子に隣接しており、および他方の側ではPRO1遺伝子の3’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子(配列番号31)に隣接している。
プラスミドpGLY1162を線状化し、線状化されたプラスミドを株YGLY8252内に形質転換して、URA5発現カセットが二重交差相同組換えによりPRO1遺伝子座内に挿入されているいくつかの株を得た。得られた株から株YGLY8292を選択し、5−FOAの存在下で対抗選択して、URA5遺伝子を喪失してlacZリピートのみを残している株YGLY9060を得た。
株YGLY9060をプラスミドpGLY7140で形質転換して、lacZリピートに隣接したURA5遺伝子が二重交差相同組換えによりYOS9遺伝子座内に挿入されているいくつかの株を得た。得られた株から株YGLY23328を選択した。この株を5−FOAの存在下で対抗選択して、URA5遺伝子を喪失してlacZリピートのみを残している株YGLY23360を得た。
株YGLY24541は、pGLY5508を株YGLY23360内に形質転換することにより作成し、lacZリピートに隣接したURA5遺伝子が二重交差相同組換えによりALG3遺伝子座内に挿入されているいくつかの株を得た。得られた株から株YGLY24541を選択した。
実施例5
実施例4中で得られた株YGLY24541を、様々なLmSTT3オリゴサッカリルトランスフェラーゼの存在下で産生された抗体のN−グリコシル化を評価するための抗体を発現するいくつかの株の構築に用いた。これらの株の構築は以下のようなものである。
実施例4中で得られた株YGLY24541を、様々なLmSTT3オリゴサッカリルトランスフェラーゼの存在下で産生された抗体のN−グリコシル化を評価するための抗体を発現するいくつかの株の構築に用いた。これらの株の構築は以下のようなものである。
プラスミドpGLY6833(図12)は、P.パストリス中のTRP2遺伝子座を標的とする、抗Her2抗体の軽鎖および重鎖をコードするロールイン組み込みプラスミドである。抗Her2重鎖をコードする発現カセットは、P.パストリス中での有効な発現のためにコドン最適化された重鎖ORFをコードする核酸分子(配列番号32)を含み、この核酸分子は、5’末端においてサッカロマイセス・セレビシエ接合因子プレシグナル配列をコードする核酸分子(配列番号33)に操作可能に連結されて今度はそのN末端において誘導性P.パストリスAOX1プロモーター配列を有する核酸分子と融合しており、および3’末端においてP.パストリスCIT1転写終結配列を有する核酸分子(配列番号34)に操作可能に連結されている。抗Her2軽鎖をコードする発現カセットは、P.パストリス中での有効な発現のためにコドン最適化された軽鎖ORFをコードする核酸分子(配列番号35)を含み、この核酸分子は、5’末端においてサッカロマイセス・セレビシエ接合因子プレシグナル配列をコードする核酸分子に操作可能に連結されて今度はそのN末端において誘導性P.パストリスAOX1プロモーター配列を有する核酸分子と融合しており、および3’末端においてP.パストリスCIT1転写終結配列を有する核酸分子に操作可能に連結されている。形質転換体を選択するため、このプラスミドはゼオシンORFをコードする発現カセットを含み、ここではORFをコードする核酸分子(配列番号18)が5’末端においてS.セレビシエTEFプロモーター配列を有する核酸分子(配列番号36)に、および3’末端においてS.セレビシエCYC転写終結配列を有する核酸分子に操作可能に連結されている。このプラスミドは、TRP2遺伝子座を標的化するための核酸分子(配列番号37)をさらに包含する。プラスミドpGLY6833を株YGLY24541内に形質転換し、抗Her2抗体を発現するいくつかの株を得て、それらから株YGLY26362を選択した。
プラスミドpGLY6299(図13)は、P.パストリス中のURA6遺伝子座を標的とするロールイン組み込みプラスミドである。LmSTT3Aをコードする発現カセットは、P.パストリス中での有効な発現のためにコドン最適化されたLmSTT3D ORFをコードする核酸分子(配列番号38)を含み、この核酸分子は、5’末端において誘導性P.パストリスAOX1プロモーター配列を有する核酸分子に、および3’末端においてS.セレビシエCYC転写終結配列を有する核酸分子に操作可能に連結されている。形質転換体を選択するため、このプラスミドはS.セレビシエARR3 ORFをコードする発現カセット(配列番号5)を含み、ここではORFをコードする核酸分子は5’末端においてP.パストリスRPL10プロモーター配列を有する核酸分子(配列番号6)に、および3’末端においてS.セレビシエCYC転写終結配列を有する核酸分子に操作可能に連結されている。プラスミドpGLY6299を株YGLY26362内に形質転換し、抗Her2抗体およびLmSTT3Aを発現するいくつかの株を得て、それらから株YGLY27294〜27296を選択した。
プラスミドpGLY6300(図14)は、P.パストリス中のURA6遺伝子座を標的とするロールイン組み込みプラスミドである。LmSTT3Bをコードする発現カセットは、P.パストリス中での有効な発現のためにコドン最適化されたLmSTT3B ORFをコードする核酸分子(配列番号39)を含み、この核酸分子は、5’末端において誘導性P.パストリスAOX1プロモーター配列を有する核酸分子に、および3’末端においてS.セレビシエCYC転写終結配列を有する核酸分子に操作可能に連結されている。形質転換体を選択するため、このプラスミドはS.セレビシエARR3 ORFをコードする発現カセット(配列番号5)を含み、ここではORFをコードする核酸分子は5’末端においてP.パストリスRPL10プロモーター配列を有する核酸分子(配列番号6)に、および3’末端においてS.セレビシエCYC転写終結配列を有する核酸分子に操作可能に連結されている。プラスミドpGLY6300を株YGLY26362内に形質転換し、抗Her2抗体およびLmSTT3Bを発現するいくつかの株を得て、それらから株YGLY27297〜27299を選択した。
プラスミドpGLY11191(図15)は、P.パストリス中のURA6遺伝子座を標的とするロールイン組み込みプラスミドである。LmSTT3Cをコードする発現カセットは、P.パストリス中での有効な発現のためにコドン最適化されたLmSTT3C ORFをコードする核酸分子(配列番号40)を含み、この核酸分子は、5’末端において誘導性P.パストリスAOX1プロモーター配列を有する核酸分子に、および3’末端においてS.セレビシエCYC転写終結配列を有する核酸分子に操作可能に連結されている。形質転換体を選択するため、このプラスミドはS.セレビシエARR3 ORFをコードする発現カセット(配列番号5)を含み、ここではORFをコードする核酸分子は5’末端においてP.パストリスRPL10プロモーター配列を有する核酸分子(配列番号6)に、および3’末端においてS.セレビシエCYC転写終結配列を有する核酸分子に操作可能に連結されている。プラスミドpGLY11191を株YGLY26362内に形質転換し、抗Her2抗体およびLmSTT3Cを発現するいくつかの株を得て、それらから株YGLY27300〜27302を選択した。
プラスミドpGLY10153(図16)は、P.パストリス中のURA6遺伝子座を標的とし、それぞれピキア・パストリスAOX1プロモーターおよびS.セレビシエCYC転写終結配列の制御下にあるLmSTT3A、LmSTT3BおよびLmSTT3D ORFをコードするロールイン組み込みプラスミドである。形質転換体を選択するため、このプラスミドはS.セレビシエARR3 ORFをコードする発現カセットを含み、ここではORFをコードする核酸分子は5’末端においてP.パストリスRPL10プロモーター配列を有する核酸分子に、および3’末端においてS.セレビシエCYC転写終結配列を有する核酸分子に操作可能に連結されている。プラスミドpGLY10153を株YGLY24541内に形質転換し、いくつかの株を得て、それらから株YGLY24558を選択した。株YGLY24558をプラスミドpGLY6833で形質転換し、抗Her2抗体およびLmSTT3A、LmSTT3B、LmSTT3Dを発現するいくつかの株を得て、それらから株YGLY26363〜26364を選択した。
株YGLY24541をプラスミドpGLY6301で形質転換し、いくつかの株を得て、それらから株YGLY25636を選択した。この株をプラスミドpGLY6833で形質転換し、抗Her2抗体およびLmSTT3Dを発現するいくつかの株を得て、それらから株YGLY26365を選択した。
表3は、AOX1プロモーターの制御下にある個々のLmSTT3を保持するalg株から得られた抗HER2抗体組成物のN−グリカン部位占有率の比較を示す。LmSTT3Dはalg株バックグラウンドにおいてN−グリカン部位占有率が100%にまで改善されることを実証し、LmSTT3Aもまた顕著にN−グリカン部位占有率を改善する。
表4は、AOX1プロモーターの制御下にある個々のLmSTT3を保持するalg株中で産生された抗HER2抗体組成物のN−グリカン分析を示す。優勢なN−グリカン構造はMan3GlcNAc2であるが、ここではMan5GlcNAc2(alg3ノックアウト)がT.リーゼイα−1,2−マンノシダーゼキメラ酵素によりMan3GlcNAc2に変換されるが、この酵素は、N末端においてキメラタンパク質を分泌経路および細胞からの分泌物に標的化するためのS.セレビシエαMATpreシグナルペプチド(aMATTrMan)と融合したその触媒ドメインを含む。
マイクロチップCE−SDS試料の調製は以下のようなものであった。IgG試料(100〜200μg)を約100μLに濃縮し、1% SDSを添加した100mM Tris−HCl pH9.0でバッファーを交換した。次いで試料を2μLのBeckmanより提供された10kDa内部標準と共に、5μLのベータメルカプトエタノールを加えて還元し、3分間沸騰させた。
Labchip GXII(Caliper Life Science,CA)による分離方法は以下のようなものであった。
還元した試料は、裸溶融シリカキャピラリー(30.2cm、50μm I.D.)で、還元されたIgGのために製造業者が推奨する方法に従って、逆極性方向で、注入口から20.2cmの検出ウインドウを使用して、分析した。各サイクルについて、キャピラリーは、0.1N NaOH、0.1N HCl、HPLCグレード水および製造業者が提供するSDSMWゲルバッファーで最初にプレコンディショニングを行う。5kVの電圧を20秒間かけることにより、試料を動電学的に導入する。電気泳動は、定圧で、497ボルト/cmの場の強度で、再循環液体冷却剤を用いて25℃に維持したキャピラリー温度で行う。生成する電流は約27μampである。10nmバンド幅の220nm、2Hzでピーク検出を記録した。占有率は、グリコシル化重鎖に相当する補正ピーク面積のパーセンテージにより決定した。
N−グリコシル化占有率分析は、以下のようなものであった。
約1〜2mg/mLの抗体試料(5μL)を、50mM 2−メルカプトエタノール(Sigma−Aldrich;St.Louis,MO,USA)を補充したHT Protein Express Labchip(登録商標)キットに備えられた7μLの試料バッファーに加えた。試料混合物を次いで75℃で15分間インキュベートした。マイクロチップ分析の前に、脱イオン化HPLCグレード水(35μL)を試料混合物に加え、サイズ分離用装置に入れた。N−グリコシル化占有率は、グリコシル化重鎖(GHC)に相当する補正ピーク面積のパーセンテージにより決定した。重鎖および軽鎖の比(H:L)は、軽鎖の補正ピーク面積に対するGHCおよび非グリコシル化重鎖(NGHC)の総補正ピーク面積から計算した。不純物は、GHC、NGHCまたは軽鎖に属さないタンパク質バンドの総補正ピーク面積として報告した。
組換え宿主細胞を増殖させるためのDasGipプロトコールは実質的に以下のようなものである。
アガープレート上の酵母パッチ(単一コロニーから単離されたもの)から0.5Lバッフル付フラスコ中の0.1Lの4% BSGYに、接種シードフラスコを接種した。シードフラスコを180rpm、24℃(Innova 44,New Brunswick Scientific)で48時間増殖させた。培養は、1L(fedbatch−pro,DASGIP BioTools)バイオリアクタ中で行った。容器に0.22μmでろ過した4% BSGY培地を0.54L充填し、121℃で45分間オートクレーブした。滅菌および冷却の後、通気、撹拌および温度をそれぞれ0.7vvm、400rpmおよび24℃に設定した。30%水酸化アンモニウムを用いてpHを6.5に調整し、制御した。準備が整ったバイオリアクタの接種は、シードフラスコからの60mLを使用して無菌的に行った。撹拌を徐々に上げて20%の溶存酸素(DO)飽和度を維持した。溶存酸素の鋭い上昇により示される最初のグリセロール負荷の消費後、5mg/Lビオチンおよび32.3mg/L PMTi−4を含有する50重量/重量%のグリセロール溶液の供給を始動し、3.68mL/時で8時間行った。グリセロール流加回分期の間、0.375mLのPTM2塩を手作業で注入した。 グリセロール流加回分の終了後に、0.5時間の飢餓期間および誘導期の開始が続いた。2.5mg/Lのビオチンおよび6.25mL/LのPTM2塩を含有する50容積/容積%のメタノール溶液の連続供給を、2.16mL/時の定速で始めた。0.25mLの1.9mg/mL PMTi−4(メタノール溶液)の注入を、各々誘導の24時間後に加えた。一般に、誘導の36〜110時間以内に個々の発酵物を回収した。培養液を8500rpmで40分間の遠心分離(Sorvall Evolution RC,Thermo Scientific)により清澄化させ、結果として得られた上清を精製に供した。
実施例6
本実施例では、株YGLY29365の構築を記述する。株YGLY29365は、B(−2)位およびB28位においてGS2.1(Man3GlcNAc2)N−グリカンを持つグリコシル化されたインスリンアナログ前駆体を産生する能力がある。グリコシル化されたインスリン前駆体は、インビトロでプロセシングして、グリコシル化されたインスリンアナログ210−2−Bにすることができる。210−B−2は、アミノ酸配列N*GTFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTN*K(配列番号56)を有する天然のインスリンA鎖およびB鎖(des(B30))を含むヘテロダイマーであり、1位および31位におけるAsn残基N*(B−2およびB28)はMan3GlcNAc2(パウチマンノース)N−グリカンとβ1結合中で各々共有結合する。
本実施例では、株YGLY29365の構築を記述する。株YGLY29365は、B(−2)位およびB28位においてGS2.1(Man3GlcNAc2)N−グリカンを持つグリコシル化されたインスリンアナログ前駆体を産生する能力がある。グリコシル化されたインスリン前駆体は、インビトロでプロセシングして、グリコシル化されたインスリンアナログ210−2−Bにすることができる。210−B−2は、アミノ酸配列N*GTFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTN*K(配列番号56)を有する天然のインスリンA鎖およびB鎖(des(B30))を含むヘテロダイマーであり、1位および31位におけるAsn残基N*(B−2およびB28)はMan3GlcNAc2(パウチマンノース)N−グリカンとβ1結合中で各々共有結合する。
株YGLY29365の構築は、株YGLY9060で始まる多数の遺伝的改変の産物である。
株YGLY24542は、プラスミドpGLY5508を形質転換することにより作成したが、このプラスミドは、ALG3遺伝子座を標的とし、lacZリピートを含む核酸分子に隣接したP.パストリスURA5遺伝子または転写単位を含む核酸分子を含有するノックアウトベクターであり、これは今度は一方の側ではALG3遺伝子の5’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子に、他方の側ではALG3遺伝子の3’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子に隣接している。プラスミドpGLY5508をSfiIで線状化し、線状化されたプラスミドを株YGLY23360内に形質転換して、lacZリピートに隣接したURA5遺伝子が二重交差相同組換えによりALG3遺伝子座内に挿入されているいくつかの株を得た。得られた株から株YGLY24542を選択した。
プラスミドpGLY10153は、P.パストリス中のURA6遺伝子座を標的とし、LmSTT3A、LmSTT3BおよびLmSTT3D ORFをコードするロールイン組み込みプラスミドである。LmSTT3タンパク質の過剰発現は、インスリンアナログのN−グリコシル化部位占有率を高め得る。LmSTT3Aをコードする発現カセットは、P.パストリス中での有効な発現のためにコドン最適化されたLmSTT3D ORFをコードする核酸分子を含み、この核酸分子は、5’末端において誘導性P.パストリスAOX1プロモーター配列を有する核酸分子に、および3’末端においてS.セレビシエCYC転写終結配列を有する核酸分子に操作可能に連結されている。LmSTT3Bをコードする発現カセットは、P.パストリス中での有効な発現のためにコドン最適化されたLmSTT3B ORFをコードする核酸分子を含み、この核酸分子は、5’末端において誘導性P.パストリスAOX1プロモーター配列を有する核酸分子に、および3’末端においてS.セレビシエCYC転写終結配列を有する核酸分子に操作可能に連結されている。LmSTT3Dをコードする発現カセットは、P.パストリス中での有効な発現のためにコドン最適化されたLmSTT3D ORFをコードする核酸分子を含み、この核酸分子は、5’末端において誘導性P.パストリスAOX1プロモーター配列を有する核酸分子に、および3’末端においてS.セレビシエCYC転写終結配列を有する核酸分子に操作可能に連結されている。形質転換体を選択するため、このプラスミドはS.セレビシエARR3 ORFをコードする発現カセットを含み、ここではORFをコードする核酸分子は5’末端においてP.パストリスRPL10プロモーター配列を有する核酸分子に、および3’末端においてS.セレビシエCYC転写終結配列を有する核酸分子に操作可能に連結されている。プラスミドpGLY10153を株YGLY24542内に形質転換し、いくつかの株を得て、それらから株YGLY24561を選択した。株YGLY24561を5−FOAの存在下で対抗選択して、URA5遺伝子を喪失してlacZリピートのみを残している株YGLY24586を得た。
株YGLY24586を、ATT1遺伝子を破壊するプラスミドpGLY5933で形質転換した。ATT1遺伝子の破壊は、発酵中の細胞の適応度の改善をもたらし得る。このプラスミドの顕著な特徴は、一方の末端ではATT1遺伝子の5’すなわち上流領域を含む核酸分子(配列番号51)と、他の末端ではATT1遺伝子の3’すなわち下流領域を含む核酸分子(配列番号52)と隣接した上記のURA5発現カセットを含むことである。YGLY24586をプラスミドpGLY5933で形質転換して、いくつかの株を結果として得て、それらから株YGLY27303を選択した。
プラスミドpGLY11099は、TRP2またはAOX1p遺伝子座を標的とし、インスリン前駆体融合タンパク質をコードする発現カセットを包含するロールイン組み込みプラスミドであり、このプラスミドはS.セレビシエアルファ接合因子シグナル配列およびプロペプチドを含むが、これらはNGT(−2)トリペプチド付加およびP28N置換を持つヒトインスリンB鎖と融合したN末端スペーサーペプチドと融合しており、このヒトインスリンB鎖はヒトインスリンA鎖(配列番号55)と融合したアミノ酸配列AAKからなるC−ペプチドと融合している。株YGLY27303をプラスミドpGLY11099で形質転換し、いくつかの株を得て、それらから株YGLY28137を選択した。
プラスミドpGLY12027は、P.パストリス中のURA6遺伝子座を標的とし、マウスエンドマンノシダーゼORFをコードするロールイン組み込みプラスミドである。完全長マウスエンドマンノシダーゼをコードする発現カセットは、P.パストリス中での有効な発現のためにコドン最適化された完全長マウスエンドマンノシダーゼORFをコードする核酸分子(配列番号53)を含み、この核酸分子は、5’末端において誘導性P.パストリスAOX1プロモーター配列を有する核酸分子に、および3’末端において転写終結配列、例えばピキア・パストリスAOX1転写終結配列(配列番号54)に操作可能に連結されている。形質転換体を選択するため、このプラスミドは、アシュビア・ゴシピーTEF1プロモーター(配列番号10)およびA.ゴシピーTEF1終結配列(配列番号11)に操作可能に調節されたNATR発現カセット(配列番号9)を包含する。このプラスミドは、URA6遺伝子座を標的とするための前述のような核酸分子をさらに包含する。株YGLY28137をプラスミドpGLY12027で形質転換し、いくつかの株を作成して、それらから株YGLY29365を選択した。
株YGLY29365の発酵の後、インスリンアナログ前駆体を細胞を含まない発酵上清から精製し、LysCエンドプロテイナーゼでプロセシングして、インビトロおよびインビボでの試験用のdes(B30)ヘテロダイマー210−2−Bを得た。
210−B−2ヘテロダイマーを培養培地から得て、N−グリカン組成を決定した。210−B−2アナログを含む組成物は、約93〜100%のMan3GlcNAc2および約0から7%のMan4GlcNAc2を含有した。
本発明は例示された実施形態を参照して本明細書中に記載されるが、本発明はこれらに限定されないと理解されるべきである。当該技術分野における通常の技量を有し本明細書中の教示を利用する当業者は、その範囲内の付加的な改変および実施形態を認識するものである。それ故、本発明は、本明細書に添付された特許請求の範囲によってのみ限定される。
Claims (23)
- (a)内在性ドリキル−P−Man:Man5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3マンノシルトランスフェラーゼ(ALG3)遺伝子の発現の破壊、および
(b)内在性骨肉腫9(OS−9)ファミリー遺伝子またはホモログの破壊
を含む、宿主細胞。 - 宿主細胞が酵母または糸状菌である、請求項1に記載の宿主細胞。
- 宿主細胞がP.パストリスのoch1変異体である、請求項1に記載の方法。
- OS−9ファミリー遺伝子がYOS9遺伝子である、請求項1に記載の宿主細胞。
- 内在性ドリキル−P−Man:Man5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3マンノシルトランスフェラーゼ(ALG3)および内在性骨肉腫9(OS−9)ファミリー遺伝子またはホモログの発現の破壊が、遺伝子を欠失させることまたは破壊することにより達成される、請求項1に記載の宿主細胞。
- 宿主細胞が、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする少なくとも1の核酸分子および異種糖タンパク質をコードする核酸分子をさらに包含する、請求項1に記載の宿主細胞。
- 単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼがリーシュマニア属種のSTT3Aタンパク質、STT3Bタンパク質、STT3Cタンパク質、STT3Dタンパク質またはそれらの組み合わせである、請求項6に記載の宿主細胞。
- 単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼがリーシュマニア・メジャーSTT3Dタンパク質である、請求項6に記載の宿主細胞。
- 宿主細胞が異種タンパク質をコードする核酸分子をさらに包含する、請求項1に記載の宿主細胞。
- 宿主細胞が1または複数の哺乳動物様またはヒト様のN−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝子操作されている、請求項1に記載の宿主細胞。
- (a)内在性ドリキル−P−Man:Man5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3マンノシルトランスフェラーゼ(ALG3)遺伝子の発現の破壊、内在性骨肉腫9(OS−9)ファミリー遺伝子またはホモログの発現の破壊および異種糖タンパク質をコードする核酸分子を包含する宿主細胞を用意すること、ならびに
(b)異種糖タンパク質を発現させるための条件下で宿主細胞を培養して異種糖タンパク質を産生させること
を含む、異種糖タンパク質を生産する方法。 - 宿主細胞が異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする少なくとも1の核酸分子をさらに包含する、請求項11に記載の方法。
- 単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼが、リーシュマニア属種のSTT3Aタンパク質、STT3Bタンパク質、STT3Cタンパク質、STT3Dタンパク質またはそれらの組み合わせである、請求項12に記載の方法。
- 単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼが、リーシュマニア・メジャーSTT3Dタンパク質である、請求項12に記載の方法。
- 宿主細胞が酵母または糸状菌である、請求項11に記載の宿主細胞。
- 宿主細胞がP.パストリスのoch1変異体である、請求項1に記載の方法。
- OS−9ファミリー遺伝子がYOS9遺伝子である、請求項1に記載の宿主細胞。
- 内在性ドリキル−P−Man:Man5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3マンノシルトランスフェラーゼ(ALG3)および内在性骨肉腫9(OS−9)ファミリー遺伝子またはホモログの発現の破壊が、遺伝子を欠失させることまたは破壊することにより達成される、請求項1に記載の宿主細胞。
- 宿主細胞が1または複数の哺乳動物様またはヒト様のN−グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝子操作されている、請求項1に記載の方法。
- 疾患治療用の薬剤の製造のための、
(a)内在性ドリキル−P−Man:Man5GlcNAc2−PP−ドリキルアルファ−1,3マンノシルトランスフェラーゼ(ALG3)遺伝子の発現の破壊、および
(b)内在性骨肉腫9(OS−9)ファミリー遺伝子またはホモログの破壊
を含む宿主細胞の使用。 - 宿主細胞がエンドマンノシダーゼ活性をさらに発現する、請求項20に記載の使用。
- 宿主細胞がエンドマンノシダーゼ活性をさらに発現する、請求項1に記載の宿主細胞。
- 宿主細胞がエンドマンノシダーゼ活性をさらに発現する、請求項11に記載の方法。
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