KR102505009B1 - 치료 용도를 위한 푸코실화된 세포의 제조 및 동결보존 - Google Patents
치료 용도를 위한 푸코실화된 세포의 제조 및 동결보존 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102505009B1 KR102505009B1 KR1020177003350A KR20177003350A KR102505009B1 KR 102505009 B1 KR102505009 B1 KR 102505009B1 KR 1020177003350 A KR1020177003350 A KR 1020177003350A KR 20177003350 A KR20177003350 A KR 20177003350A KR 102505009 B1 KR102505009 B1 KR 102505009B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- cells
- cell
- therapeutic
- fucosyltransferase
- tissue
- Prior art date
Links
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title claims description 107
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 title claims description 44
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 544
- 230000033581 fucosylation Effects 0.000 claims abstract description 105
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 101
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 40
- 238000011018 current good manufacturing practice Methods 0.000 claims description 67
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 60
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 57
- 108010001671 galactoside 3-fucosyltransferase Proteins 0.000 claims description 52
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 claims description 51
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 43
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 claims description 35
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 claims description 33
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims description 33
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 33
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 claims description 32
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 26
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 24
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 21
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 21
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 claims description 21
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 19
- LQEBEXMHBLQMDB-UHFFFAOYSA-N GDP-L-fucose Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C3=C(C(N=C(N)N3)=O)N=C2)O1 LQEBEXMHBLQMDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- LQEBEXMHBLQMDB-JGQUBWHWSA-N GDP-beta-L-fucose Chemical group O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)O1 LQEBEXMHBLQMDB-JGQUBWHWSA-N 0.000 claims description 17
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 16
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 15
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims description 15
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims description 13
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 13
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 12
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 12
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000003855 balanced salt solution Substances 0.000 claims description 11
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 claims description 10
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 claims description 10
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 claims description 10
- 239000008274 jelly Substances 0.000 claims description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 10
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 10
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 10
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 claims description 10
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 claims description 9
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 7
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 7
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 claims description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims description 6
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 5
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 5
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 claims description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 5
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 4
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 claims description 4
- 239000007760 Iscove's Modified Dulbecco's Medium Substances 0.000 claims description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 4
- 150000001447 alkali salts Chemical class 0.000 claims description 4
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000005168 endometrial cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 4
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 claims description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 4
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 claims description 3
- 229920002123 Pentastarch Polymers 0.000 claims description 3
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 claims description 3
- 229940050526 hydroxyethylstarch Drugs 0.000 claims description 3
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 claims description 3
- 229940101738 pentastarch Drugs 0.000 claims description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N (R)-(-)-Propylene glycol Chemical compound C[C@@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N 0.000 claims description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 claims description 2
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N monopropylene glycol Natural products CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 claims description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 claims description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 claims description 2
- 108010024212 E-Selectin Proteins 0.000 description 50
- 102100023471 E-selectin Human genes 0.000 description 50
- 108010035766 P-Selectin Proteins 0.000 description 43
- 102100023472 P-selectin Human genes 0.000 description 42
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 31
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 24
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 19
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 19
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 19
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 18
- 101001105486 Homo sapiens Proteasome subunit alpha type-7 Proteins 0.000 description 17
- 102100034925 P-selectin glycoprotein ligand 1 Human genes 0.000 description 17
- 102100021201 Proteasome subunit alpha type-7 Human genes 0.000 description 17
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 17
- 108010054395 P-selectin ligand protein Proteins 0.000 description 16
- 102000003800 Selectins Human genes 0.000 description 16
- 108090000184 Selectins Proteins 0.000 description 16
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 15
- NIGUVXFURDGQKZ-UQTBNESHSA-N alpha-Neup5Ac-(2->3)-beta-D-Galp-(1->4)-[alpha-L-Fucp-(1->3)]-beta-D-GlcpNAc Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@]3(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C3)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O NIGUVXFURDGQKZ-UQTBNESHSA-N 0.000 description 13
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 13
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 12
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 12
- AAEVYOVXGOFMJO-UHFFFAOYSA-N prometryn Chemical compound CSC1=NC(NC(C)C)=NC(NC(C)C)=N1 AAEVYOVXGOFMJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 10
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 10
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 10
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 10
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 9
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 9
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 9
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 9
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 8
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 8
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 8
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 8
- 102100027268 Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Human genes 0.000 description 8
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 8
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 8
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 8
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 7
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 7
- 101000958041 Homo sapiens Musculin Proteins 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 102000046949 human MSC Human genes 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 6
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 6
- PZNPLUBHRSSFHT-RRHRGVEJSA-N 1-hexadecanoyl-2-octadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[C@@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PZNPLUBHRSSFHT-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 5
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 description 5
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 5
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 5
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 5
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 5
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 5
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 5
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000012552 review Methods 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 5
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 5
- LAQPKDLYOBZWBT-NYLDSJSYSA-N (2s,4s,5r,6r)-5-acetamido-2-{[(2s,3r,4s,5s,6r)-2-{[(2r,3r,4r,5r)-5-acetamido-1,2-dihydroxy-6-oxo-4-{[(2s,3s,4r,5s,6s)-3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy}hexan-3-yl]oxy}-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-4-hydroxy-6-[(1r,2r)-1,2,3-trihydrox Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]([C@@H](NC(C)=O)C=O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 LAQPKDLYOBZWBT-NYLDSJSYSA-N 0.000 description 4
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 description 4
- 101001090172 Homo sapiens Kinectin Proteins 0.000 description 4
- 102100034751 Kinectin Human genes 0.000 description 4
- 108010092694 L-Selectin Proteins 0.000 description 4
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 description 4
- 241000366596 Osiris Species 0.000 description 4
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 description 4
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000005258 dental pulp stem cell Anatomy 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- -1 lactosaminyl Chemical group 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 239000012808 vapor phase Substances 0.000 description 4
- 241000795427 Anticla Species 0.000 description 3
- 241001227713 Chiron Species 0.000 description 3
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 3
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 3
- 108010019236 Fucosyltransferases Proteins 0.000 description 3
- 102000006471 Fucosyltransferases Human genes 0.000 description 3
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 102100034223 Golgi apparatus protein 1 Human genes 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 101000801254 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 16 Proteins 0.000 description 3
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 3
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 3
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 3
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 3
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 108010073382 cysteine-rich fibroblast growth factor receptor Proteins 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 238000011165 process development Methods 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 2
- 102000005369 Aldehyde Dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108020002663 Aldehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 102100021333 Alpha-(1,3)-fucosyltransferase 7 Human genes 0.000 description 2
- 101710188694 Alpha-(1,3)-fucosyltransferase 7 Proteins 0.000 description 2
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 2
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 2
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 description 2
- 101000935043 Homo sapiens Integrin beta-1 Proteins 0.000 description 2
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 2
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 2
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 2
- 101000971513 Homo sapiens Natural killer cells antigen CD94 Proteins 0.000 description 2
- 101000692455 Homo sapiens Platelet-derived growth factor receptor beta Proteins 0.000 description 2
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 2
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 2
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 2
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 102000004372 Insulin-like growth factor binding protein 2 Human genes 0.000 description 2
- 108090000964 Insulin-like growth factor binding protein 2 Proteins 0.000 description 2
- 102100025304 Integrin beta-1 Human genes 0.000 description 2
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 2
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 2
- 102100021462 Natural killer cells antigen CD94 Human genes 0.000 description 2
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 2
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 2
- 102100026547 Platelet-derived growth factor receptor beta Human genes 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 2
- 102100021669 Stromal cell-derived factor 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 2
- 102100033725 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 16 Human genes 0.000 description 2
- 102100023543 Vascular cell adhesion protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229940126587 biotherapeutics Drugs 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 2
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 229940119744 dextran 40 Drugs 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 2
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 2
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 2
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 2
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 2
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 2
- 210000001665 muscle stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- FAGUFWYHJQFNRV-UHFFFAOYSA-N tetraethylenepentamine Chemical compound NCCNCCNCCNCCN FAGUFWYHJQFNRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N (2S,5R,10R,13R)-16-{[(2R,3S,4R,5R)-3-{[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}-5-(ethylamino)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-5-(4-aminobutyl)-10-carbamoyl-2,13-dimethyl-4,7,12,15-tetraoxo-3,6,11,14-tetraazaheptadecan-1-oic acid Chemical compound NCCCC[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)C(C)O[C@@H]1[C@@H](NCC)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N 0.000 description 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- 102100035277 4-galactosyl-N-acetylglucosaminide 3-alpha-L-fucosyltransferase FUT6 Human genes 0.000 description 1
- 101710185185 4-galactosyl-N-acetylglucosaminide 3-alpha-L-fucosyltransferase FUT6 Proteins 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- FUSPCLTUKXQREV-ACZMJKKPSA-N Ala-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FUSPCLTUKXQREV-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- 102100034567 Angiopoietin-related protein 5 Human genes 0.000 description 1
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 1
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 1
- 102100022716 Atypical chemokine receptor 3 Human genes 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 101710149863 C-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100028990 C-X-C chemokine receptor type 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100031650 C-X-C chemokine receptor type 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100025279 C-X-C motif chemokine 11 Human genes 0.000 description 1
- 102100032976 CCR4-NOT transcription complex subunit 6 Human genes 0.000 description 1
- 102100025222 CD63 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 1
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- 206010007559 Cardiac failure congestive Diseases 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 1
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 102100023126 Cell surface glycoprotein MUC18 Human genes 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010026206 Conalbumin Proteins 0.000 description 1
- 208000027205 Congenital disease Diseases 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000003971 Fibroblast Growth Factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100028461 Frizzled-9 Human genes 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 1
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 1
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 1
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 102100031547 HLA class II histocompatibility antigen, DO alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 108010088729 HLA-A*02:01 antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102100034405 Headcase protein homolog Human genes 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000924346 Homo sapiens Angiopoietin-related protein 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000678890 Homo sapiens Atypical chemokine receptor 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000916050 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000922348 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000858060 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 11 Proteins 0.000 description 1
- 101100220044 Homo sapiens CD34 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000934368 Homo sapiens CD63 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000623903 Homo sapiens Cell surface glycoprotein MUC18 Proteins 0.000 description 1
- 101000622123 Homo sapiens E-selectin Proteins 0.000 description 1
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 description 1
- 101001061405 Homo sapiens Frizzled-9 Proteins 0.000 description 1
- 101000866278 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DO alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 101001066896 Homo sapiens Headcase protein homolog Proteins 0.000 description 1
- 101001078158 Homo sapiens Integrin alpha-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000994375 Homo sapiens Integrin alpha-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000945371 Homo sapiens Killer cell immunoglobulin-like receptor 2DL2 Proteins 0.000 description 1
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 description 1
- 101001109508 Homo sapiens NKG2-A/NKG2-B type II integral membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 101001109503 Homo sapiens NKG2-C type II integral membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 101001098352 Homo sapiens OX-2 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101000617130 Homo sapiens Stromal cell-derived factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101000835093 Homo sapiens Transferrin receptor protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000622304 Homo sapiens Vascular cell adhesion protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100025323 Integrin alpha-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100032818 Integrin alpha-4 Human genes 0.000 description 1
- 102100022337 Integrin alpha-V Human genes 0.000 description 1
- 102000000426 Integrin alpha6 Human genes 0.000 description 1
- 108010041100 Integrin alpha6 Proteins 0.000 description 1
- 108010040765 Integrin alphaV Proteins 0.000 description 1
- 102000003815 Interleukin-11 Human genes 0.000 description 1
- 108090000177 Interleukin-11 Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 102100033599 Killer cell immunoglobulin-like receptor 2DL2 Human genes 0.000 description 1
- 102100020880 Kit ligand Human genes 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 150000008540 L-glutamines Chemical class 0.000 description 1
- 241000270322 Lepidosauria Species 0.000 description 1
- XVZCXCTYGHPNEM-UHFFFAOYSA-N Leu-Leu-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)N1CCCC1C(O)=O XVZCXCTYGHPNEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101000622124 Mus musculus E-selectin Proteins 0.000 description 1
- 101100372761 Mus musculus Flt1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 description 1
- 208000014767 Myeloproliferative disease Diseases 0.000 description 1
- 108050000637 N-cadherin Proteins 0.000 description 1
- 102100022682 NKG2-A/NKG2-B type II integral membrane protein Human genes 0.000 description 1
- 102100022683 NKG2-C type II integral membrane protein Human genes 0.000 description 1
- 108010004217 Natural Cytotoxicity Triggering Receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100032870 Natural cytotoxicity triggering receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000008730 Nestin Human genes 0.000 description 1
- 108010088225 Nestin Proteins 0.000 description 1
- 102000019040 Nuclear Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010051791 Nuclear Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000007399 Nuclear hormone receptor Human genes 0.000 description 1
- 108020005497 Nuclear hormone receptor Proteins 0.000 description 1
- CIQHWLTYGMYQQR-QMMMGPOBSA-N O(4')-sulfo-L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 CIQHWLTYGMYQQR-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 102100037589 OX-2 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000004264 Osteopontin Human genes 0.000 description 1
- 108010081689 Osteopontin Proteins 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 108091008606 PDGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- YTILBRIUASDGBL-BZSNNMDCSA-N Phe-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 YTILBRIUASDGBL-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- DCHQYSOGURGJST-FJXKBIBVSA-N Pro-Thr-Gly Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O DCHQYSOGURGJST-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 238000003326 Quality management system Methods 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010063897 Renal ischaemia Diseases 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108010039445 Stem Cell Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 101710088580 Stromal cell-derived factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000005485 Thrombocytosis Diseases 0.000 description 1
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 1
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 description 1
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 1
- NRTOMJZYCJJWKI-UHFFFAOYSA-N Titanium nitride Chemical compound [Ti]#N NRTOMJZYCJJWKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026144 Transferrin receptor protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 229940127174 UCHT1 Drugs 0.000 description 1
- 108010000134 Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002293 adipogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 108700025316 aldesleukin Proteins 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 210000004970 cd4 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002648 chondrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 1
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N corticotropin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO)C1=CC=C(O)C=C1 IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N 0.000 description 1
- 230000002338 cryopreservative effect Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000050 cytotoxic potential Toxicity 0.000 description 1
- 210000003785 decidua Anatomy 0.000 description 1
- 108700041286 delta Proteins 0.000 description 1
- 210000003074 dental pulp Anatomy 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000009699 differential effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N dinoprostone Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N 0.000 description 1
- 229960002986 dinoprostone Drugs 0.000 description 1
- 238000011038 discontinuous diafiltration by volume reduction Methods 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010067396 dornase alfa Proteins 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 229940126534 drug product Drugs 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 201000000523 end stage renal failure Diseases 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011194 good manufacturing practice Methods 0.000 description 1
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000777 hematopoietic system Anatomy 0.000 description 1
- 229940027278 hetastarch Drugs 0.000 description 1
- 238000011540 hip replacement Methods 0.000 description 1
- 230000003284 homeostatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000010212 intracellular staining Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 201000002364 leukopenia Diseases 0.000 description 1
- 231100001022 leukopenia Toxicity 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 201000002818 limb ischemia Diseases 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000000207 lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- FVVLHONNBARESJ-NTOWJWGLSA-H magnesium;potassium;trisodium;(2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanoate;acetate;tetrachloride;nonahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[Mg+2].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[K+].CC([O-])=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O FVVLHONNBARESJ-NTOWJWGLSA-H 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000010297 mechanical methods and process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 230000002175 menstrual effect Effects 0.000 description 1
- 210000001704 mesoblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000002969 morbid Effects 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000005055 nestin Anatomy 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 108020004017 nuclear receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000033667 organ regeneration Effects 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 238000006213 oxygenation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000003668 pericyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 229940087463 proleukin Drugs 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N prostaglandin E2 Natural products CCCCCC(O)C=CC1C(O)CC(=O)C1CC=CCCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940076372 protein antagonist Drugs 0.000 description 1
- 229940107568 pulmozyme Drugs 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 201000009410 rhabdomyosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000001057 smooth muscle myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 150000004044 tetrasaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000006107 tyrosine sulfation Effects 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000004017 vitrification Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0006—Modification of the membrane of cells, e.g. cell decoration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0278—Physical preservation processes
- A01N1/0284—Temperature processes, i.e. using a designated change in temperature over time
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/44—Vessels; Vascular smooth muscle cells; Endothelial cells; Endothelial progenitor cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/48—Reproductive organs
- A61K35/51—Umbilical cord; Umbilical cord blood; Umbilical stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/48—Reproductive organs
- A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
- A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12Y204/01065—3-Galactosyl-N-acetylglucosaminide 4-alpha-L-fucosyltransferase (2.4.1.65), i.e. alpha-1-3 fucosyltransferase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
- A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
- A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
- C12N2501/724—Glycosyltransferases (EC 2.4.)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Virology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
푸코실화된 세포 집단을 제조하기 위한 조성물 및 제조 방법을 제공한다. 본 방법은 최적의 세포 표면 푸코실화 수준을 유지시키는 조건하에서 세포를 확장시키고/거나, 세포를 동결보존시키는 것을 포함할 수 있다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조/참조로 포함에 관한 진술
본 출원은 35 USC 119(e) 하에 2014년 7월 7일 출원된 미국 시리얼 번호 62/021,328의 이익을 주장한다. 상기 언급된 출원의 전체 내용이 본원에서 명확하게 참조로 포함된다.
연방 정부 지원의 연구 또는 개발에 관한 진술
적용되지 않음.
α1,3-푸코실트랜스퍼라제 및 푸코스 도너로 세포를 처리하게 되면, 셀렉틴으로 불리는 부착 단백질 부류에 결합할 수 있는 세포의 능력은 증가하게 된다. 염증, 허혈 또는 조직 손상 동안, P-셀렉틴 및 E-셀렉틴은 협력하여 혈관 표면 상의 백혈구 구름(rolling) 및 부착을 매개한다 (문헌 [Zarbock et al. (2011) Blood, 118:6743-51] 리뷰). 대부분의 조직에서, P-셀렉틴 및 E-셀렉틴은 효능제의 자극 이후에 내피 세포 상에서 발현되지만, 이들은 골수 내피 세포 상에서는 구성적으로 발현된다.
셀렉틴은 리간드로서 α2,3-시알릴화된 및 α1,3-푸코실화된 글리칸, 예컨대, 당단백질 또는 당지질 상의 시알릴 루이스 X (sLeX)를 이용한다. 예를 들어, P-셀렉틴은, 티로신 술페이트, 및 sLex로 캡핑된 O-글리칸을 함유하는 P-셀렉틴 당단백질 리간드-1 (PSGL-1)의 N-말단 영역에 결합한다. E-셀렉틴은 PSGL-1 상의 하나 이상의 상이한 부위에 결합한다. E-셀렉틴과의 상호작용을 위해, PSGL-1은 티로신 황산화는 필요로 하지 않지만, O-글리칸 상의 sLex 발현이 결합을 증진시킨다. E-셀렉틴은 또한 다른 리간드와도 상호작용한다. HSC 상의 CD44의 이소폼이 시험관내에서 E-셀렉틴에 결합하는 것으로 밝혀졌다 (Dimitroff et al. (2001) J Cell Biol., 153:1277-1286). HSC 상의, E-셀렉틴에 대한 또 다른 잠재적인 리간드는 E-셀렉틴 리간드-1 (ESL-1)이다 (Wild et al. (2001) J Biol Chem., 276:31602-31612). 각각의 이들 당단백질 리간드들이 sLeX 구조를 보유하는 것으로 여겨진다.
푸코스는 sLeX 중의 말단 탄수화물이고, 생체외 푸코실화가 세포 표면 sLeX의 수준 및 세포를 혈관계로부터 주위 조직으로 혈관외유출시킬 수 있는 능력을 증가시키는 것으로 밝혀졌다 ([Xia et al. (2004) Blood, 104:3091-6]; [Sackstein et al. (2008) Nat Med, 14:181-7]; [Sarkar et al. (2011) Blood, 118:e184-91]; [Robinson et al. (2012) Exp Hematol., 40:445-56]; 미국 특허 7,332,334; US 2006/0210558; 미국 출원 12/948,489).
현재까지 기술된 생체외 푸코실화 방법은 동물 또는 인간 내로 정맥내 주사하기 직전에 세포를 처리하는 것을 포함하였다. 예를 들어, 제대혈 세포의 골수로의 귀소 및 생착 능력을 개선시키기 위해 이식 이전에 α1,3-푸코실트랜스퍼라제 VI + GDP-푸코스로 제대혈 세포를 처리하는 것의 유용성을 시험하는 임상 시험 ("ClinicalTrials.gov" 식별자 NCT01471067)이 현재 수행되고 있다. 이 적용에서, 제대혈은 세포 집단의 확장 없이 필요 시에 푸코실화된다. 시험은 수혜자에게 유전적으로 매칭되는 제대혈을 제대혈 은행으로부터 입수하고, 세포를 해동시키고, 동결보호제 없이 세포를 세척하고, 실온에서 30분 동안 α1,3-푸코실트랜스퍼라제 VI + GDP-푸코스로 처리하고, 다시 세척하고, 세포를 정맥내 경로를 통해 환자 내로 주입하는 것을 포함한다.
그러나, 많은 적용에 있어서 처리 이전에 세포 개수를 확장시키는 것이 이롭다. 예를 들어, 제대혈 중 조혈 세포의 개수는 성인이 아닌 아동에서의 이식 후 생착에 충분한 것이다. 이러한 이유에서, 이식 이전에 다양한 조건하에서 제대혈 세포를 배양함으로써 생착가능한 세포의 개수를 확장시키기 위한 많은 시도가 진행되어 왔다 (문헌 [Dahlberg et al. (2011) Blood, 117:6083-90]; 및 [Delaney et al. (2013) Biol Blood Marrow Transplant, 19(1 Suppl):S74-8] 리뷰).
그러나, 집중적인 연구에도 불구하고, 원래의 세포 집단의 특징 모두를 보유하는 조혈 세포의 확장 방법은 현재 없다. 세포의 세포 표면 특징 뿐만 아니라, 그의 시험관내 및 생체내 효능, 둘 모두는 변할 수 있다. 예를 들어, 생체외 확장 동안, 골수 니치에 존재하는 리간드의 N-카드헤린, 오스테오폰틴 및 혈관 세포-부착 분자-1에의 부착은 빠르게 감소되고, 이는 부분적으로는 확장된 세포의 골수로 생착될 수 있는 능력 감소를 설명할 수 있다 (Kallinikou et al. (2012) Br J Haematol., 158:778-87). 그러므로, 확장된 조혈 세포 집단이 1차 또는 비확장 세포 집단과 다르다는 것은 명백하다. 현재까지, 생체외 확장 동안 부착 분자의 손실이 세포가 푸코실화될 수 있는 능력에 영향을 미치는지 여부, 또는 푸코실화가 생체외 확장과 함께 발생하는 생착 결함을 구제할 수 있는지 여부에 관해 조사한 연구는 없었다.
유사한 상황은 중간엽 기질 세포 (MSC)에도 존재한다. MSC는 골수 세포 중 작은 백분율 (전체 유핵 세포 중 0.001-0.01%)을 차지한다. 그러나, 현재 MSC의 치료학적 용량은 1-5 x 106개의 MSC/kg (체중)인 용량을 필요로 하고, 일부 적용에서는 유효성을 위해 더욱더 높은 세포 용량 (>5 x 106개의 MSC/kg (체중))이 요구될 수 있으며; 따라서, 제한된 출발 부피의 1차 물질로부터 최대 5-10 x 108개의 MSC 생성을 허용하는 MSC 확장 프로토콜을 개발하는 것이 필요하다.
그러나, MSC의 생체외 확장은 사용 조건에 따라 그의 치료학적 특성을 변경시킬 수 있다 (Menard et al. (2013) Stem Cells Dev., 22:1789-801). 추가로, 다수의 세포 표면 항원 (인테그린 α6, 인테그린 αv, CD71,CD140b, CCR4, CD200, CD271, CD349 및 CXCR7)은 5개의 GMP를 준수하는 확장 조건 중 임의의 조건하에서의 계대 접종 동안 MSC를 계대 접종함에 따라 하향조절된다 (Fekete et al. (2012) PLoS One, 7(8):e43255). 그러나, 현재까지, 생체외 확장 동안 이들 세포 표면 항원의 손실이 세포가 푸코실화될 수 있는 능력에 영향을 미치는지 여부, 또는 푸코실화가 대규모 생체외 확장 배양으로 제조되는 MSC의 귀소 및 생착을 개선시킬 수 있는지 여부에 관해 조사한 연구는 없었다.
치료용 세포 제조는 대개 살아있는 기증자 또는 사후 기증자로부터의 제한된 개수의 1차 세포를 조직 배양물 중에서 확장시키는 것을 포함한다. 상기 세포를 수득하는 데 유용한 조직으로는 골수, 제대혈, 제대, 와튼 젤리(Wharton's jelly), 말초 혈액, 림프성 조직, 자궁내막, 영양막-유래 조직, 태반, 양수, 지방 조직, 근육, 간, 연골, 신경 조직, 심장 조직, 치수 조직, 탈락 치아 또는 배아 줄기 (ES) 세포 또는 유도 만능 줄기 (iPS) 세포로부터 유래된 세포로부터 단리된 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
고체 조직으로부터 유래된 세포를 단리시키는 일반 방법은 세포를 조직 중에서 세포를 유지시키는 기질을 파괴시키고, 세포를 조직 배양 배지 내로 유리시키는 단백질 분해 효소, 예컨대, 콜라게나제로 처리하는 것이며; 대안적으로 기계적 방법, 예컨대, 초음파 처리가 사용될 수 있다.
임의적으로, 세포를 세포 표면 항원에 대한 하나 이상의 항체, 예컨대, 항-CD34 또는 항-STRO1과 접촉시키고, 관련 기술분야에 공지된 방법, 예컨대, 형광 활성 세포 분류 (FACS) 또는 자기 비드 단리에 의해 세포를 분리함으로써 세포 집단을 선별할 수 있다. 편리하게는, 항체를 특정 세포 유형이 쉽게 분리될 수 있도록 허용하는 마커, 예컨대, 직접적인 분리를 허용하는 자기 비드; 지지체에 결합된 아비딘 또는 스트렙트아비딘으로 제거될 수 있는 비오틴; 형광 활성 세포 분류기 (FACS)와 함께 사용될 수 있는 형광 색소 등과 접합시킬 수 있다. 남은 세포의 생존가능성에 과도하게 유해하지 않은 임의의 기술이 사용될 수 있다. 원하는 세포 집단에 결합하는 항체를 사용하기보다는, 원하지 않는 세포 집단에 결합하는 항체 집단을 사용함으로써 음성적으로 선별할 수 있다.
이어서, 생성된 세포를 현탁 배양물 중에서 (세포, 예컨대, 조혈, 면역 또는 림프성 세포인 경우에 전형적으로 바람직한 방법), 또는 부착된 세포 (조직 배양 플라스틱에 부착된 세포, 예컨대, MSC, 지방 줄기 세포, 신경 줄기 세포인 경우에 전형적으로 바람직한 방법)로서 성장시킨다. 부착된 세포를 플라스크, 회전 병, 세포 제작소, 또는 마이크로캐리어 비드에서 성장시킬 수 있고, 이어서, 이를 1회용 백 중 현탁액에 유지시키고, 현탁 생물반응기 또는 파동 생물반응기를 교반시킨다. 관련 기술분야에 공지된 다른 방법으로는 중공 섬유 장치에서, 강성 벽이 있는 교반 탱크일 수 있는 생물반응기에서, 회전 벽, 평행 플레이트, 또는 고정 및 유동상 반응기에서; 또는 자동 세포 프로세싱 유니트, 예컨대, 아스트롬 리플리셀® 시스템(Aastrom REPLICELL® System) (아스트롬 바이오사이언시즈(Aastrom Biosciences: 미국 미시간주 앤 아버))에서 세포를 성장시키는 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다 (이들 상이한 방법에 관한 리뷰를 위해 문헌 [Rodrigues et al. (2011) Biotechnol Adv., 29:815-29] 참조).
제조 동안에 생산된 세포의 성질은 사용된 조건에 따라 광범위하게 달라질 수 있다. MSC 확장의 경우, 대개는 우태아 혈청 (FBS)이 배양 배지 중에 포함된다. 전혈 응고 및 혈소판 및 다른 혈액 세포 생성물 유리 후 수득된 생성물로서 혈청은 상처난 상태를 제외하면, 신체에서 보통은 관찰되지 않는 병적 유체이다. 그 결과, 혈청 존재하에서 제조된 MSC 또는 다른 세포는 보통 정상적인 항상성 조건하에서 동소 (in situ)에서는 대면할 수 없는 생물학적으로 활성인 인자 (예컨대, 혈소판 유래 시토카인 및 다른 생성물)를 대면하게 된다. 세포가 cGMP 조건하에서 제조될 때, FBS에 대한 대체물로서 사용될 수 있는 인간 혈소판 용해물 중에서 성장시킨 세포의 경우에도 또한 해당된다. 그러므로, 혈청 또는 혈소판 용해물의 존재하에서 성장시킨 세포는 조직으로부터 수득된 1차 세포와 다른 특성을 가지고 있다.
MSC 및 다른 세포 유형을 성장시키기 위해 무혈청 배지 개발이 시도되어 왔지만, 이들은 다른 문제 세트를 제기한다. 세포는 보통 그의 환경으로부터 계속해서 신호를 받는 복잡한 환경에서 생체내 존재한다. 세포는 세포외 기질에 부착된 상태로 존재할 수 있고, 다른 세포 유형과 밀접하게 접촉한 상태일 수 있고, 복합 단백질성 유체 중에서 특히 그가 위치하는 기관, 혈액 또는 림프로 세척될 수 있다. 그에 비해, 현 무혈청 배지는 단백질을 거의 가지고 있지 않으며, 동소 환경을 재현하지 못한다. 또한, 부착된 세포에 대한 기판 - 보통 조직 배양 플라스틱, 유리 등은 세포가 보통 동소에서 경험하게 되는 환경과 매우 다른 환경을 제공한다. 많은 경우에서, 세포는 조직 배양 기판에의 부착을 최대화시키기 위해 평평해지고, 그 결과, 기능을 유지시키는 데 중요한, 보통 생체내에서 가지는 입방형 구조를 상실하게 된다.
상기와 같은 제조 프로세스와는 상관없이, 치료용 세포는 엄격한 규제 가이드라인을 충족시켜야 한다. 세포 확장은 최소 조작을 넘어서는 것으로 간주되는 바, 이에 확장되는 세포는 단순하게 기증자로부터 입수하고, 오직 최소한의 조작만을 가하여 수혜자에게 제공하는 세포보다는 더 엄격한 규제를 받는다. 미국에서, 치료용 세포는 미국 식품 의약국(US Food and Drug Administration: FDA)에 의해 실행되는 현행 우수 제조 관리 기준(Current Good Manufacturing Practice: cGMP) 규정과 부합되는 방식으로 제조되어야 한다. 확장된 세포는 인간 세포, 조직, 또는 세포 및 조직 기반 생성물 (HCT/P)과 관련이 있는 것으로 간주된다. 그러므로, 세포 생산은 미국 연방 규정집(The Code of Federal Regulation: CFR) 타이틀(Title) 21, 파트 1271을 준수하고, '현행 우수 조직 관리 기준(Current Good Tissue Practice: CGTP)'에 기술된 바와 같은 현행 우수 조직 관리 기준(current Good Tissue Practice: cGTP) 요건 및 인간 세포, 조직, 및 세포 및 조직 기반 생성물 제조사에 대한 추가 요건(Additional Requirements for Manufacturers of Human Cells, Tissues, and Cellular and Tissue-Based Products (HCT/Ps))에 따라 이루어져야 한다. 유럽에서, 확장된 세포는 유럽 규칙(European Regulation) EC 1394/2007에 의해 규정되는 첨단 치료 의약품 (ATMP)으로 간주된다. 공급원, 제조 프로세스 및 의도되는 적용에 의존하여, 확장된 세포는 체세포 치료용 제품 또는 조직 조작 제품인 것으로 간주될 수 있다. 유럽 규칙 EC 1394/2007은 유럽 cGMP 가이드라인을 언급하며, 이는 인간용 의약품에 관한 2003/94/EC 지시 뿐만 아니라, 인간 혈액 및 혈액 성분의 수집, 검사, 프로세싱, 보관, 및 배포를 위한 품질 및 안전성 기준을 정하는 지시 2002/98/EC를 준수한다.
cGMP를 준수하는 조건하에서 성장된 세포의 성질은 실험실 조건하에서 성장된 세포와 실질적으로 다를 수 있다. 실험실 조건하에서, 보통은 세포를, 비-당뇨 개체의 생체내에서 일반적으로 발견되는 것보다 더 높은 수준의 글루코스 및 5 - 10% 우태아 혈청을 함유하는 조직 배양 배지 중 5-10% 이산화탄소 (CO2)에서 성장시킨다. 실험실 조건하에서 사용되는 배지는 일반적으로 표준 실험실용 배지, 예컨대, 로스웰 파크 메모리얼 인스터튜트(Roswell Park Memorial Institute: RPMI) 1640, 둘베코스 변형 이글즈 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium: DMEM) 등인 배지 중 하나이고; 세포는 이들 표준 배지 중 하나에서 성장하도록 적합화된다. 실험실 조건하에서는 세포가 조직 배양 배지 중의 영양소를 고갈시키기 시작할 때까지 그 기간 동안 세포를 성장시킨 후, 이어서, 조직 배양 배지의 50%-95%를 대체함으로써 배지를 대체시킨다.
실험실 조건에서 사용되는 높은 산소 분압이 세포에 산화 스트레스를 유발할 수 있다. 실험실 조건하에서 광범위하게 변동할 수 있는 영양소 및 대사산물 농도 또한 세포 거동에 영향을 줄 수 있다.
그에 반해, cGMP 프로세스 개발은 각각의 상기 파라미터들 뿐만 아니라, 각 세포 유형에 대한 다수의 다른 파라미터들도 최적화시킨다 (리뷰를 위해 문헌 [Rodrigues et al.] (상기와 같이 포함됨) 참조). cGMP 제조를 위해 사용되는 배양 베쓸은 대개 실험실 조건하에서 사용되는 것과 매우 상이하고, 이는 대개 조직 배양 플라스크가 아닌 생물반응기를 포함한다. 조직 배양 배지 성분은 일반적으로 기성품인 조직 배양 배지를 사용하는 것보다는 그 대신에 각 세포 유형에 맞게 최적화되며, 그 자체가 cGMP 조건하에서 생산되는 성장 인자 및 다른 첨가제가 사용된다. cGMP 조건하에서 생산하는 제조사는 일반적으로, 실험실 조건하에서 보편적으로 사용되는 이종 발생성 첨가제, 예컨대, FBS를 제거하기 위하여 노력한다. cGMP 프로세스 개발 동안 각 세포 유형에 맞게 공급 파라미터, 성장 인자, 및 산소화가 최적화되고, 영양소 및 대사산물 농도 변동은 엄격한 제한 범위 내에서 유지된다. 마지막으로, cGMP 프로세스를 위한 확장 규모는 대개 일반 실험실 조건하에서 이루어지는 것보다 훨씬 더 크다.
이러한 이유에서, 치료용 세포를 제조하는 것이 단순히 실험실 기반 방법의 규모 확장에 관한 문제만은 아니다. 대신, 프로세스 개발의 모든 단계에서 상세한 최적화 연구가 수행되어야 하고, 학구적인 실험 조건하에서 이루어진 관찰 결과가 cGMP를 준수하는 조건하에서 성장시킨 세포에 반드시 적용되어야 하는 것은 아닐 수도 있다. 추가로, 상기 명시된 바와 같이 (예컨대, 문헌 [Kallinikou et al.], [Menard et al.], 및 [Fekete et al.] (이들 각각은 상기와 같이 포함됨)), 세포 성질은 심지어 cGMP를 준수하는 조건하에서도 대규모 확장에 따라 변할 수 있으며, 이는 일반적으로 기능이 아닌, 세포 성장에 맞게 최적화된다. 그러므로, 1차 세포로, 또는 실험실 조건하에서 성장된 세포로 수득된 결과는 대규모 cGMP 제조 프로세스에서 사용되는 정도로, 및 그러한 조건하에서 확장되는 세포에 적용될 수 없다.
현재까지, 확장된 세포 집단을 푸코실화하는 최적의 방법에 대해서는 확인된 바 없다. 특히, cGMP 조건하에서 성장된 세포에 대하여 최적인 푸코실화 방법은 확인된 바 없다. 의도되는 용도에 따라, 푸코실화 단계는 치료용 세포 제조 동안 상이한 시점에 도입될 수 있다. 일부 적용의 경우에서는 세포를 제조하고, 동결보존 없이 직접 환자에 전달하는 것이 이롭다. 그러한 적용의 예로는 조혈 줄기 세포 또는 면역 세포, 중간엽 줄기 세포, 지방-유래 줄기 세포, 치수-유래 줄기 세포, 근육 세포, 양막 세포, 자궁내막 세포, 신경 줄기 세포 및 유도 만능 줄기 (iPS) 세포로부터 유래된 세포의 생체외 확장을 포함하나, 이에 제한되지 않으며, 특히, 환자에게 제공하고자 하는 세포가 자가 세포일 때 (즉, 세포가 해당 환자, 또는 유전적으로 동일한 개체로부터 유래된 것일 경우)의 것이다.
일부 경우에서, 세포를 중앙 처리 센터에서 제조하는 것이 이롭다. 이 방법은 시험관내에서 큰 세포 배치를 성장시키는 단계, 이를 제어된 조건하에서 푸코실화시키는 단계, 및 그의 투여가 이루어지는 임상 센터에 배포하기 위해 분취량을 동결시키는 단계를 포함한다. 상기 적용의 예로는 중간엽 줄기 세포 (MSC), 지방-유래 줄기 세포, 치수-유래 줄기 세포, 근육 세포, 양막 세포, 자궁내막 세포 및 신경 줄기 세포 및 배아 줄기 (ES) 세포 또는 유도 만능 줄기 (iPS) 세포로부터 유래된 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않으며, 특히, 환자에게 제공하고자 하는 세포가 동종이계 세포일 때 (즉, 수혜자와 유전적으로 상이한 기증자로부터의 것일 때)의 것이다. 이러한 경우, 큰 세포 배치를 성장시킬 수 있고, 이를 벌크로 푸코실화할 수 있고, 환자에게 투여하기 위하여 의료 센터로 배포하기 이전에 이를 분취량으로 동결보존하는 데 있어 경제적으로, 품질 관리상, 및 배포상 이롭다.
세포의 동결보존은 동결보호제를 배지에 첨가하고, 조절식 동결 속도를 사용한 후, 세포를 일반적으로 액체 질소 냉동고 중 저온에서 보관하는 것을 포함한다. 동결보호제는 빙정 형성에 의해 유발되는 동결 손상으로부터 생물학적 조직을 보호하는 데 사용되는 물질이다. 동결보호제는 2가지 일반 카테고리: 세포막을 통과할 수 있는 투과성 동결보호제, 및 세포막을 투과하지 못하고, 동결 절차상에 존재한 고삼투압성 효과를 감소시킴으로써 작용하는 비-투과성 동결보호제로 나뉜다. 투과성 동결보호제의 예로는 디메틸 술폭시드 (Me2SO 또는 DMSO), 글리세롤, 수크로스, 에틸렌 글리콜, 1,2-프로판디올, 및 그의 임의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 비-투과성 동결보호제의 예로는 히드록시에틸 전분, 알부민, 수크로스, 트레할로스, 덱스트로스, 폴리비닐 피롤리돈, 및 그의 임의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
가장 널리 사용되는 투과성 동결보호제는 동결시키는 동안 빙정 형성을 막는 흡습성을 띠는 극성 화합물인 DMSO이다. DMSO는 대개 비-투과성 작용제, 예컨대, 자가 혈장, 혈청 알부민, 및/또는 히드록시에틸 전분과 함께 조합하여 사용된다. 상이한 동결보호제의 혼합물을 사용함으로써 용액의 독성을 감소시킬 수 있고, 이로써, 용액의 유효성은 단일 작용제 동결보호제보다 더 커지게 된다. 예를 들어, 세포에 대하여 가장 일반적으로 사용되는 동결보존 방법은 동물 또는 인간 혈청의 존재하에 5 - 20% DMSO로 이루어진 동결 배지를 포함한다. 1 내지 2℃/분으로 속도가 조절되는 동결 기법 및 빠른 해동을 사용하는 것이 표준인 것으로 간주된다. 이는 상기 속도로 온도를 강하시키는 속도 조절형 냉동고, 또는 속도 조절형 동결에서 채택된 것과 유시한 냉각 속도를 발생시키기 위해 일반적으로 -80℃로 세포를 냉각시키는 (소위 급속 냉각) 수동형 냉각 장치, 예컨대, 기계 냉장고를 사용하는 것을 포함할 수 있다.
뉴욕 혈액 센터(New York Blood Center)의 루빈스테인(Rubinstein)과 동료들은 제대혈 단위를 동결시키기 위해 DMSO를 사용하는 최적화된 프로토콜을 개발하였다 (Rubinstein et al. (1995) PNAS, 92:10119-22). 헤타스타치(Hetastarch)를 상기 제대혈 단위에 첨가한 후, 원심분리하여 과량의 적혈구 및 혈장을 제거하고, 본질적으로 모든 줄기 세포 및 전구 세포를 함유하는 20 mL의 균일한 최종 부피를 얻었다 (미국 특허 번호 5,789,147). 제대혈 단위의 부피 축소 후, 5 mL의 동결보존액 (0.85 NaCl, 50% DMSO [크라이오서브(Cryoserv); 리서치 인더스트리즈(Research Industries: 미국 유타주 솔트 레이크 시티)] 및 5% 덱스트란 40 [박스터 헬쓰케어(Baxter Healthcare: 미국 일리노이주 디어필드)])을 세포 현탁액에 천천히 첨가하고, 연속해서 혼합하였다. 극저온 탱크 중 액체 질소의 액상 내에서 보관된 조절형 냉동고를 이용하여 제대혈 단위를 동결시켰다. 매우 다양한 세포 유형에 대해서도 유사한 방법이 사용된다 (문헌 [Hunt (2011) Transfus Med Hemother, 38:107-123] 리뷰).
그러나, 세포 생존가능성을 유지시키기 위한 동결보존 방법에 대한 상세한 연구에도 불구하고, 동결보존 후, 세포 표면 푸코실화 유지에 관해 조사한 연구는 없었다.
α1,3-푸코실트랜스퍼라제 및 푸코스 도너를 이용한 생체외 처리 후에 푸코실화된 정확한 세포 표면 성분에 관해서는 어느 세포 유형에 대해서도 완전한 특징 규명이 이루어진 바 없다. 당지질 및 당단백질, 둘 모두를 포함하는 일부 세포에 대해서 알려져 있고, 상기 기술된 바와 같이, 푸코실화의 주요 표적 중 일부, 예컨대, PSGL-1, CD44 및 ESL-1이 확인된 바 있다. 그러나, 생체외 처리 후에 푸코실화된 전범위의 단백질 및 당지질에 관해서는 어느 세포 유형에 대해서도 잘 정의된 바 없다.
페인트(Faint) 등 (J Immunother. (2011) 34:588-96)은 림프구의 동결보존이 세포 표면 항원에 영향을 미친다고 개시하였다. 상기 저자는 해동 후, 조직으로부터의 림프구 방출에서 중요한 역할을 하는 막관통 단백질인 CD69의 수준은 감소하였고, 및 주요 화학 주성 수용체인 케모카인 수용체 CXCR4는 증가한 반면, 부착 단백질인 CD62L, 및 또 다른 화학 주성 단백질인 CXCR3은 감소하였다는 것을 관찰하였다. 이러한 변화는 시토카인의 자극을 받은 내피 단일층을 가로질러 재조합 CXCL11 및 CXCL12 쪽으로 이동할 수 있는 림프구의 능력 조절과 연관이 있었다. 따라서, 림프구의 동결보존 및 해동은 그의 부착 표현형의 변화를 유도하고, 내피 단일층을 가로지러 이동할 수 있는 그의 능력을 조절하였다.
유사하게, 쾨닝스만(Koenigsmann) 등 (Bone Marrow Transplantation (1998) 22:1077-1085)은 동결보존 전후의 CD34+ 세포 상의 부착 분자에 대해 연구하였고, 동결은 L-셀렉틴 (CD62L)이 발현된 CD34+ 세포 분획을 62%에서 11%로 현저히 감소시켰고, 이는 또한 인테그린 서브유니트 CD29 및 CD49d에 대한 형광 강도도 감소시켰다는 것을 발견하였다. L-셀렉틴 감소는 하토리(Hattori) 등 (Exp. Hemat. 29 (2001) 114-122)에 의해서도 또한 발견되었다.
캠벨(Campbell) 등 (Clin Vaccine Immunol. (2009) 16:1648-53)은 동결보존이 PBMC-유래 CD3+/CD8+ T 세포 및 CD45+/CD14+ 단핵구 상의 PD-1 및 PD-L1, 둘 모두의 발현을 유의적으로 감소시켰다는 것을 발견하였다.
아오야기(Aoyagi) 등 (J Craniofac Surg. (2010) 21:666-78)은 동결보존 후 MSC 중의 세포 표면 단백질 CD271 발현의 현저한 변화를 발견하였다. DMSO는 MSC에서 뉴런 유사 형태, 및 뉴런 마커, 예컨대, GFAP, 네스틴, 뉴런 핵 항원 (NeuN) 및 뉴런-특이 에놀라제 (NSE)의 발현 증가를 빠르게 유도할 수 있다 ([Mareschi et al. (2006) Exp Hematol., 34(11):1563-72]; 및 [Neuhuber et al. (2004) J Neurosci Res., 77:192-204]).
상기 연구들 모두 동결보존이 부착 특성 및 세포 표면 항원 발현을 변경시킬 수 있다고 개시하였지만, 그 어느 것도 이것이 세포 표면 푸코실화 수준에 영향을 미쳤는지 여부에 관해서는 조사한 것은 없었다. 동결보존이 선험적으로는 예측이 불가능한 방식으로 다양한 세포 유형 상의 세포 표면 부착 및 다른 분자를 변경시킬 수 있기 때문에, 및 α1,3-푸코실트랜스퍼라제 및 푸코스 도너를 이용한 처리 이후의 푸코실화된 세포 표면 성분의 성질이 충분히 정의되지 않았기 때문에, 동결보존이 세포 표면 푸코실화에 미치는 효과는 오직 경험적으로는 확인할 수 있다. 현재까지, 이러한 문제를 다룬 연구가 과학 문헌 또는 특허 문헌에 공개된 바 없다.
생체외 확장 후, 상이한 세포 유형이 푸코실화될 수 있는 정도, 및 세포 표면 푸코실화가 동결보존에 대하여 안정성을 띠는 정도는 각 세포 유형에 대하여 오직 경험적으로만 확인될 수 있다. 상기 논의에 의해 명시된 바와 같이, 생체외 확장 및 동결보존, 이들은 각각 다수의 세포 부착 분자 및 다른 세포 표면 성분의 발현 및 기능에 영향을 줄 수 있고; 이러한 변화는 세포 유형에 특이적이고, 선험적으로는 예측이 불가능하다. L-셀렉틴과 같은 단백질은 단기간의 인큐베이션 후에 동결보존 및 해동에 기인한 손실로부터 회복될 수 있는 반면 ([Hattori et al.] (상기와 같이 포함됨)), 외인성 효소 및 푸코스 도너에 노출되었던 것을 대체할 수 있는 푸코실화된 단백질의 내부 저장소는 없기 때문에, 생체외 푸코실화 이후 푸코실화 수준의 경우, 상기와 같은 회복이 일어날 가능성은 없다. 푸코실화 수준 증가와 함께, 세포의 제조 및 동결보존을 위한 조건을 확인하는 것이 본 출원의 대상이 된다.
도 1은 FTVI 또는 FTVII에 의한, 해동된 인간 제대혈로부터의 단핵 세포의 세포 표면 푸코실화의 동역학적 성질에 관한 비교 분석을 그래프로 도시한 것이다.
도 2는 FTVI 또는 FTVII에 의한, 인간 중간엽 줄기 세포 (MSC)의 세포 표면 푸코실화의 동역학적 성질에 관한 비교 분석을 그래프로 도시한 것이다.
도 3은 FTVI 또는 FTVII에 의한, 정제된 제대혈-유래 CD34+ 세포의 세포 표면 푸코실화의 동역학적 성질에 관한 비교 분석을 그래프로 도시한 것이다.
도 4는 FTVI 또는 FTVII에 의한, 새로 배양된 신경 줄기 세포 (NSC)의 세포 표면 푸코실화의 동역학적 성질에 관한 비교 분석을 그래프로 도시한 것이다.
도 5 및 6은 FTVI (도 5) 또는 FTVII (도 6)에 의한, 인간 해동된 제대혈-유래 단핵 세포의 세포 표면 푸코실화의 동역학적 성질에 관한 비교 분석을 그래프로 도시한 것이다.
도 7은 FTVI 처리 대 모의 처리가 인간 내피 전구 세포 (EPC)의 푸코실화에 미치는 효과에 관한 분석을 그래프로 도시한 것이다.
도 8은 FTVI 처리가 인간 양막 줄기 세포의 푸코실화에 미치는 효과에 관한 분석을 그래프로 도시한 것이다.
도 9는 FTVI 처리가 인간 지방-유래 줄기 세포의 푸코실화에 미치는 효과에 관한 분석을 도시한 것이다.
도 10은 트립신 처리 전후의 인간 MSC의 푸코실화에 미치는 효과에 관한 분석을 그래프로 도시한 것이다.
도 11은 다양한 농도의 FTVI과의 hNK 세포 인큐베이션이 푸코실화 수준 (%)에 미치는 효과를 도시한 것이다. hNK 세포를 14일 동안 확장시키고, 수거하고, 세척하고, 5 ㎍/mL 내지 25 ㎍/mL 범위의 다양한 농도의 FTVI와 인큐베이션시켰다. GDP-푸코스 (모든 샘플 중의 최종 농도 1 mM)를 첨가하면서, 세포를 실온에서 30분 동안 인큐베이션시킨 후, NK 세포의 특징인 다른 세포 표면 마커 (CD62L, CD44, CD16, CD56 및 PSGL)를 분석하는 것 이외에도, CLA-FITC 염색을 이용하여 푸코실화 정도를 분석하였다.
도 12는 대조군 및 TZ101-처리 인간 NK 세포의 인큐베이션이 E-셀렉틴 키메라에의 유체상 결합에 미치는 효과를 도시한 것이다. 확장된 hNK 세포를 2.5 x 106개의 NK 세포/mL로 5, 10, 25, 및 50 ㎍/mL TZ101의 부재하에, 또는 그와 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션시키고, 세척하고, 재현탁시켰다. 이어서, 1 ㎍/105개의 NK 세포를 인간 또는 마우스 E-셀렉틴/Fc 키메라 단백질과 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시키고, CLA, CD44, 인간 IgG, 및 아넥신 V(Annexin V)로 염색시켰다.
도 13은 TZ101 처리 후 48시간째의 푸코실화된 NK 세포의 안정성 조사에 관해 도시한 것이다. hNK 세포를 18일 동안 확장시키고, 수거하고, 세척하고, 25 ㎍/mL로 FTVI과 함께 인큐베이션시켰다. GDP-푸코스 (최종 농도 1 mM) 첨가 후, 세포를 실온에서 30분 동안 인큐베이션시킨 후, 배양 배지 중에서 유지시킨 후, 1시간 및 48시간째에 CLA-FITC 염색을 이용하여 푸코실화 정도를 분석하였다.
도 14는 대조군 대 푸코실화된 NK 세포의 세포독성 잠재능에 관한 비교 분석을 도시한 것이다. hNK 세포를 14일 동안 확장시키고, 수거하고, 세척하고, 명시된 세포주와 함께 인큐베이션시키기 이전에 24시간 동안 IL-2와 함께 인큐베이션시켰다. 대조군 또는 TZ101-푸코실화된 hNK 세포와 함께 K562 세포 및 MM1S 세포를 인큐베이션시킨 후, 독성을 측정하였다. 4시간의 인큐베이션 종료시 크로뮴 방출을 측정함으로써 세포독성을 모니터링하였다.
도 15a는 조절 T (Treg) 세포의 푸코실화를 도시한 것이다. 각 점도표의 좌측은 이소형 대조군을 나타내는 것이고, 우측은 CLA 양성 세포의 발현 퍼센트와 함께 염색을 나타낸 것이다. TZ101 (FTVI + GDP-푸코스)로 처리하였을 때, HECA-452 항-CLA 항체 염색으로 검출한 바, 세포 표면 sLeX 단위의 발현이 8.8%에서 62%로 증가하였다. 도 15b는 푸코실화된 (FT) Treg 세포가 그의 억제 기능을 유지시킨다는 것을 도시한 것이다. 2명의 기증자로부터의 PBMC를 함께 배양하여 MLR (D1+D2)을 생성하였다. Treg 세포 또는 FT-Treg 세포를 기증자 혼합물 (D1+D2)에 1:1의 비율로 첨가하였을 때, 이는 MLR을 유의적으로 억제시켰다. Y 축은 분당 계수 (CPM) (평균±SEM, n=3)를 나타낸다.
도 16은 CG1에 대한 세포독성 T 세포 (CG1-CTL)의 확장 및 그의 푸코실화를 도시한 것이다. 유세포 분석법 및 항-CLA FITC를 이용하여 푸코실화 수준을 측정하였다. 비처리된 세포는 4% 푸코실화를 보인 반면, TZ101로 처리된 세포는 100% 푸코실화를 보였다.
도 2는 FTVI 또는 FTVII에 의한, 인간 중간엽 줄기 세포 (MSC)의 세포 표면 푸코실화의 동역학적 성질에 관한 비교 분석을 그래프로 도시한 것이다.
도 3은 FTVI 또는 FTVII에 의한, 정제된 제대혈-유래 CD34+ 세포의 세포 표면 푸코실화의 동역학적 성질에 관한 비교 분석을 그래프로 도시한 것이다.
도 4는 FTVI 또는 FTVII에 의한, 새로 배양된 신경 줄기 세포 (NSC)의 세포 표면 푸코실화의 동역학적 성질에 관한 비교 분석을 그래프로 도시한 것이다.
도 5 및 6은 FTVI (도 5) 또는 FTVII (도 6)에 의한, 인간 해동된 제대혈-유래 단핵 세포의 세포 표면 푸코실화의 동역학적 성질에 관한 비교 분석을 그래프로 도시한 것이다.
도 7은 FTVI 처리 대 모의 처리가 인간 내피 전구 세포 (EPC)의 푸코실화에 미치는 효과에 관한 분석을 그래프로 도시한 것이다.
도 8은 FTVI 처리가 인간 양막 줄기 세포의 푸코실화에 미치는 효과에 관한 분석을 그래프로 도시한 것이다.
도 9는 FTVI 처리가 인간 지방-유래 줄기 세포의 푸코실화에 미치는 효과에 관한 분석을 도시한 것이다.
도 10은 트립신 처리 전후의 인간 MSC의 푸코실화에 미치는 효과에 관한 분석을 그래프로 도시한 것이다.
도 11은 다양한 농도의 FTVI과의 hNK 세포 인큐베이션이 푸코실화 수준 (%)에 미치는 효과를 도시한 것이다. hNK 세포를 14일 동안 확장시키고, 수거하고, 세척하고, 5 ㎍/mL 내지 25 ㎍/mL 범위의 다양한 농도의 FTVI와 인큐베이션시켰다. GDP-푸코스 (모든 샘플 중의 최종 농도 1 mM)를 첨가하면서, 세포를 실온에서 30분 동안 인큐베이션시킨 후, NK 세포의 특징인 다른 세포 표면 마커 (CD62L, CD44, CD16, CD56 및 PSGL)를 분석하는 것 이외에도, CLA-FITC 염색을 이용하여 푸코실화 정도를 분석하였다.
도 12는 대조군 및 TZ101-처리 인간 NK 세포의 인큐베이션이 E-셀렉틴 키메라에의 유체상 결합에 미치는 효과를 도시한 것이다. 확장된 hNK 세포를 2.5 x 106개의 NK 세포/mL로 5, 10, 25, 및 50 ㎍/mL TZ101의 부재하에, 또는 그와 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션시키고, 세척하고, 재현탁시켰다. 이어서, 1 ㎍/105개의 NK 세포를 인간 또는 마우스 E-셀렉틴/Fc 키메라 단백질과 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시키고, CLA, CD44, 인간 IgG, 및 아넥신 V(Annexin V)로 염색시켰다.
도 13은 TZ101 처리 후 48시간째의 푸코실화된 NK 세포의 안정성 조사에 관해 도시한 것이다. hNK 세포를 18일 동안 확장시키고, 수거하고, 세척하고, 25 ㎍/mL로 FTVI과 함께 인큐베이션시켰다. GDP-푸코스 (최종 농도 1 mM) 첨가 후, 세포를 실온에서 30분 동안 인큐베이션시킨 후, 배양 배지 중에서 유지시킨 후, 1시간 및 48시간째에 CLA-FITC 염색을 이용하여 푸코실화 정도를 분석하였다.
도 14는 대조군 대 푸코실화된 NK 세포의 세포독성 잠재능에 관한 비교 분석을 도시한 것이다. hNK 세포를 14일 동안 확장시키고, 수거하고, 세척하고, 명시된 세포주와 함께 인큐베이션시키기 이전에 24시간 동안 IL-2와 함께 인큐베이션시켰다. 대조군 또는 TZ101-푸코실화된 hNK 세포와 함께 K562 세포 및 MM1S 세포를 인큐베이션시킨 후, 독성을 측정하였다. 4시간의 인큐베이션 종료시 크로뮴 방출을 측정함으로써 세포독성을 모니터링하였다.
도 15a는 조절 T (Treg) 세포의 푸코실화를 도시한 것이다. 각 점도표의 좌측은 이소형 대조군을 나타내는 것이고, 우측은 CLA 양성 세포의 발현 퍼센트와 함께 염색을 나타낸 것이다. TZ101 (FTVI + GDP-푸코스)로 처리하였을 때, HECA-452 항-CLA 항체 염색으로 검출한 바, 세포 표면 sLeX 단위의 발현이 8.8%에서 62%로 증가하였다. 도 15b는 푸코실화된 (FT) Treg 세포가 그의 억제 기능을 유지시킨다는 것을 도시한 것이다. 2명의 기증자로부터의 PBMC를 함께 배양하여 MLR (D1+D2)을 생성하였다. Treg 세포 또는 FT-Treg 세포를 기증자 혼합물 (D1+D2)에 1:1의 비율로 첨가하였을 때, 이는 MLR을 유의적으로 억제시켰다. Y 축은 분당 계수 (CPM) (평균±SEM, n=3)를 나타낸다.
도 16은 CG1에 대한 세포독성 T 세포 (CG1-CTL)의 확장 및 그의 푸코실화를 도시한 것이다. 유세포 분석법 및 항-CLA FITC를 이용하여 푸코실화 수준을 측정하였다. 비처리된 세포는 4% 푸코실화를 보인 반면, TZ101로 처리된 세포는 100% 푸코실화를 보였다.
상세한 설명
예시 도면, 실험, 결과, 및 실험 방법에 의해 본 발명의 개념(들) 중 적어도 하나의 실시양태를 상세하게 설명하기 앞서, 본 발명의 개념(들)은 그의 적용에서, 하기의 설명에서 기술되거나, 또는 도면, 실험 및/또는 결과에서 예시되는 구축 및 배열에 관한 상세한 설명으로 제한되지 않음을 이해하여야 한다. 본 발명의 개념(들)은 다른 실시양태도 가능하거나, 또는 다른 방식으로 실시 또는 수행될 수 있다. 따라서, 본원에서 사용되는 용어는 가능한 가장 넓은 범위의 범주 및 의미로 제공되는 것으로 의도되고; 실시양태는 완전한 것이 아니라, 예시적인 것을 의미하는 것이다. 또한, 본원에서 사용되는 어구 및 용어는 설명하기 위한 것이며, 제한하는 것으로 간주되지 않아야 함을 이해하여야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 개시된 및/또는 청구된 발명의 개념(들)과 관련하여 사용된 과학 용어 및 기술 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 보편적으로 이해하는 의미를 가져야 한다. 추가로, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 형태의 용어는 복수 형태의 용어를 포함하여야 하고, 복수 형태의 용어는 단수 형태의 용어를 포함하여야 한다. 일반적으로, 본원에 기술된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 및 단백질 및 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드 화학법 및 하이브리드화와 관련하여 사용되는 명명법, 및 그의 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 보편적으로 사용되는 것이다. 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 및 조직 배양 및 형질전환 (예컨대, 전기천공, 리포펙션)을 위해 표준 기술이 사용된다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조사의 설명서에 따라 또는 관련 기술분야에서 보편적으로 수행되는 바와 같이, 또는 본원에 기술되어 있는 바와 같이 수행된다. 상기 기술 및 방법은 일반적으로 관련 기술분야에 널리 공지된 종래 방법에 따라, 및 본 명세서 전역에서 언급되고, 논의되는 각종의 일반 참고문헌 및 더욱 구체적인 참고문헌에 기술되어 있는 바와 같이 수행된다. 예컨대, 문헌 [Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)] 및 [Coligan et al. Current Protocols in Immunology (Current Protocols, Wiley Interscience (1994))]를 참조할 수 있다. 본원에 기술된 분석 화학법, 합성 유기 화학법, 및 의료 및 제약 화학법과 관련하여 사용되는 명명법, 및 그의 실험실 방법 및 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 보편적으로 사용되는 것이다. 화학적 합성, 화학적 분석, 제약 제조, 제제화, 및 전달, 및 환자 치료를 위해 표준 기술이 사용된다.
본 명세서에서 언급된 모든 특허, 공개된 특허 출원, 및 비특허 공개문헌은 본 개시된 및/또는 청구된 본 발명의 개념(들)이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자의 기술 수준을 나타낸다. 본 출원 중 임의 부분에서 언급된 모든 특허, 공개된 특허 출원, 및 비특허 공개문헌은, 마치 각 개별 특허 또는 공개문헌이 참조로 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 명시된 바와 같은 같은 정도로 그 전문이 명백하게 본원에서 참조로 포함된다.
본원에서 개시되고/거나 청구된 조성물 및/또는 방법 모두 본 개시내용에 비추어 과도한 실험 없이도 제조 및 수행될 수 있다. 본 발명의 개념(들)의 조성물 및 방법은 특정의 비제한적인 실시양태에 의해 기술되었지만, 본 개시된 및/또는 청구된 발명의 개념(들)의 개념, 정신 및 범주로부터 벗어남 없이, 본원에 기술된 조성물 및/또는 방법에 대하여 및 방법의 단계에서 또는 그 단계의 순서에서 변형이 적용될 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 자명한 상기의 유사한 치환 및 변형 모두 첨부된 특허청구범위에서 정의된 본 발명의 개념(들)의 정신, 범주 및 개념 범위 내에 포함되는 것으로 간주된다.
본 개시내용에 따라 사용되는 바, 달리 명시되지 않는 한, 하기 용어는 하기 의미를 가지는 것으로 이해하여야 한다:
특허청구범위 및/또는 명세서에서 "포함하는"이라는 용어와 함께 사용될 때, "하나"("a" 또는 "an")라는 단어의 사용은 "하나"를 의미할 수도 있지만, 이는 또한 "하나 이상의," "적어도 하나," 및 "하나 또는 하나 초과"의 의미와 일치한다. "하나"("a" 또는 "an") 및 "그"라는 단수 형태는 문맥상 달리 명확하게 명시되지 않는 한, 복수 개의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "한 화합물"이라고 언급한 것은 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 또는 더 많은 개수의 화합물을 지칭하는 것일 수 있다. "복수 개"라는 용어는 "2개 이상"인 것을 의미한다. 비록 본 개시내용이 오직 대안을 및 "및/또는"을 의미하는 정의를 지지하기는 하지만, 특허청구범위에서 "또는"이라는 용어의 사용은, 달리 명확하게 오직 대안만을 지칭하거나, 또는 대안이 상호 배타적인 것으로 지칭되지 않는 한, "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다. 본 출원 전역에 걸쳐, "약"이라는 용어는 값이, 상기 값을 측정하는 데 사용된 장치, 방법에 대한 내재된 오차 변동, 또는 연구 대상체 사이에 존재하는 변동을 포함한다는 것을 명시하는 것으로 사용된다. 예를 들어, 제한하는 것은 아니지만, "약"이라는 용어가 사용될 때, 지정된 값은, 변동이 개시된 방법을 수행하는 데 적절한 바와 같이, 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 명시된 값으로부터 ± 20%, 또는 ± 10%, 또는 ± 5%, 또는 ± 1%, 또는 ± 0.1% 만큼 달라질 수 있다. "적어도 하나"라는 용어의 사용은 하나인 것 뿐만 아니라, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 1 초과인 임의의 양을 포함하는 것으로 이해될 것이다. "적어도 하나"라는 용어는 이 용어가 붙은 용어에 따라 최대 100개 또는 1,000개 또는 초과까지 확장될 수 있고; 추가로, 더 높은 한계가 또한 만족스러운 결과를 초래할 수도 있는 바, 100/1,000이라는 양은 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다. 추가로, "X, Y 및 Z 중 적어도 하나"라는 용어의 사용은 X 단독, Y 단독 및 Z 단독 뿐만 아니라, X, Y 및 Z의 임의 조합을 포함하는 것으로 이해하여야 한다. 서수 용어 (즉, "제1," "제2," "제3," "제4" 등)의 사용은 단지 2개 이상의 항목을 구별짓기 위한 것이며, 예를 들어, 또 다른 항목보다는 한 항목에 대하여 임의의 차례 또는 순서 또는 중요성을 부여하는 것, 또는 임의의 첨가 순서를 의미하는 것은 아니다.
본 명세서 및 특허청구범위(들)에서 사용되는 바, "포함하는"이라는 용어 (및 포함하는이라는 것의 임의의 형태, 예컨대, "포함하다(comprise)" 및 "포함하다(comprises)"), "가지는"이라는 용어 (및 가지는이라는 것의 임의의 형태, 예컨대, "가지다(have)" 및 "가지다(has)"), "포함하는"이라는 용어 (및 포함하는이라는 것의 임의의 형태, 예컨대, "포함하다(includes)" 및 "포함하다(include)"), 또는 "함유하는"이라는 용어 (및 함유하는이라는 것의 임의의 형태, 예컨대, "함유하다(contains)" 및 "함유하다(contain)")는 포괄적이거나, 또는 양단 개방형이고, 추가의 열거되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제시키지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "또는 그의 조합"이라는 용어는 상기 용어 앞에 열거된 항목의 모든 순열 및 조합을 지칭한다. 예를 들어, "A, B, C, 또는 그의 조합"은 A, B, C, AB, AC, BC, 또는 ABC 중 적어도 하나를 포함하는 것으로 의도되며; 특정 맥락에서 순서가 중요할 경우, BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC, 또는 CAB 또한 포함한다. 계속해서 상기 예로는, 하나 이상의 항목 또는 항의 반복을 포함하는 조합, 예컨대, 예컨대, BB, AAA, AAB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB 등도 명확하게 포함된다. 문맥상 달리 명확하게 명시되지 않는 한, 임의 조합되는 항목 또는 항의 개수에 대한 제한은 없다는 것을 통상의 기술자는 이해할 것이다.
본원에서 사용되는 바, "실질적으로"라는 용어는 차후 기술된 이벤트 또는 상황이 완전하게 발생하거나, 또는 차후 기술된 이벤트 또는 상황이 크게 또는 높은 정도로 발생한다는 것을 의미한다. 예를 들어, "실질적으로"라는 용어는 차후 기술된 이벤트 또는 상황이 적어도 90%의 기간, 또는 적어도 95%의 기간, 또는 적어도 98%의 기간으로 발생한다는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "현행 우수 제조 관리 기준" 또는 "cGMP"는 미국 식품 의약국 (FDA) 또는 그와 동등한 미국 이외의 다른 국가의 규제 기관에 의해 실행되는 현행 우수 제조 관리 기준 규정을 지칭한다. cGMP 규정은 제조 프로세스 및 설비의 적절한 디자인, 모니터링, 및 관리를 보장하는 시스템을 제공한다. cGMP 규정에 대한 고수는 약물 제조사가 제조 운영을 적절히 관리하도록 요구함으로써 약물 제품의 아이덴티티, 강도, 품질, 및 순도를 보장한다. 이는 강력한 품질 관리 시스템 확립, 적절한 품질의 원료 입수, 확고한 운영 절차 확립, 제품 품질 일탈 검출 및 조사, 및 신뢰가능한 검사 실험실 유지를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "생체외 확장" 또는 "확장"이라는 용어는 세포 집단에서 세포 개수를 증가시키는, 조직 배양물 중에서 세포 집단을 성장시키는 방법을 의미한다. 생체외 확장된 세포를 "확장된" 것으로 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "푸코실화"라는 용어는 셀렉틴에 결합할 수 있는 세포의 능력을 증가시키거나, 또는 HECA-452 모노클로날 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는, sLeX에 결합하는 것으로 관련 기술분야에 알려져 있는 항체와 세포의 반응성을 증가시키는 조건하에서 세포 집단을 α1,3-푸코실트랜스퍼라제 및 푸코스 도너로 처리하는 것을 의미한다. α1,3-푸코실트랜스퍼라제 및 푸코스 도너로 처리된 후, 셀렉틴에의, 또는 HECA-452 모노클로날 항체에의, 또는 sLeX에 특이적인 또 다른 항체에의 결합이 증가된 것으로 보이는 세포를 "푸코실화된" 것으로 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, "푸코실화"는 또한 세포 집단 상에 존재하는 sLeX의 수준을 지칭할 수도 있다.
본원에서 사용되는 바, "조혈 줄기 및 전구 세포" 또는 "HSPC"란, 환자의 조혈계를 재구성하는 데 사용되는 골수, 제대혈, 또는 동원된 말초 혈액으로부터 유래된 세포 집단을 의미한다. 본원에서 사용되는 바, "조혈 줄기 세포 및 전구 세포" 또는 "HSPC"라는 용어는 카르레코르템셀-L(carlecortemcel-L)을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "중간엽 간질 세포" 또는 "MSC"라는 용어는 2006년 국제 세포 치료 학회(The International Society for Cellular Therapy: ISCT)에 의해 규정된 정의: (1) 플라스틱에의 부착, (2) CD14, CD34, CD45, 및 HLA-DR 음성이면서, CD73, CD90, 및 CD105 항원은 발현, 및 (3) 골형성, 연골형성 및 지방형성 계통으로 분화될 수 있는 능력을 충족시키는 세포를 의미한다 (Dominici et al. (2006) Cytotherapy, 8:315-317). 본원에서 사용되는 바, "중간엽 간질 세포" 또는 "MSC"는 "중간엽 줄기 세포"와 동의어이고, 따라서, 상기 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 본원에서 사용되는 바, "MSC"는 단수 또는 복수로 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "중간엽 간질 세포" 또는 "MSC"는 골수, 지방 조직, 양수, 자궁내막, 영양막-유래 조직, 제대혈, 와튼 젤리, 및 태반을 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의 조직으로부터 유래될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "중간엽 간질 세포" 또는 "MSC"는 조직으로부터의 초기 단리시에는 CD34 양성이지만, 확장 후에는 ISCT 기준을 충족시키는 세포를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "MSC"는 NGF-R, PDGF-R, EGF-R, IGF-R, CD29, CD49a, CD56, CD63, CD73, CD105, CD106, CD140b, CD146, CD271, MSCA-1, SSEA4, STRO-1 및 STRO-3 또는 그의 임의 조합으로 구성된 목록으로부터 선택되는 세포 표면 마커를 이용하여 조직으로부터 단리되고, 확장 이전 또는 그 이후에 ISCT 기준을 충족시키는 세포를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "중간엽 간질 세포" 또는 "MSC"는 문헌상에 골수 간질 줄기 세포 (BMSSC), 골수-단리된 성체 다능성 유도성 세포 (MIAMI) 세포, 다능성 성체 전구 세포 (MAPC), 중간엽 성체 줄기 세포 (MASCS), 멀티스템(MULTISTEM)® (아테르시스, 인크.(Athersys Inc.: 미국 오하이오주 클리블랜드)), 프로키말(PROCHYMAL)® (오시리스 세라퓨틱스, 인크.(Osiris Therapeutics, Inc.: 미국 메릴랜드주 콜롬비아)), 레메스템셀-L, 중간엽 전구체 세포 (MPC), 치수 줄기 세포 (DPSC), PLX 세포, PLX-PAD, 알로스템(ALLOSTEM)® (알로소스(Allosource: 미국 콜로라도주 센테니얼)), 아스트로스템(ASTROSTEM)® (오시리스 세라퓨틱스, 인크.: 미국 메릴랜드주 콜롬비아), 익스마이엘로셀-T(Ixmyelocel-T), MSC-NTF, 누르오운(NurOwn)™ (브레인스톰 셀 세라퓨틱스 인크.(Brainstorm Cell Therapeutics Inc.: 미국 뉴저지주 해컨색)), 스템다인™-MSC(STEMEDYNE™-MSC) (스테메디카 셀 테크놀러지즈 인크.(Stemedica Cell Technologies Inc.: 미국 캘리포니아주 샌디에고)), 스템퓨셀(STEMPEUCEL)® (스템퓨딕스 리서치(Stempeudics Research: 인도 방갈로르)), 스템퓨셀CLI(StempeucelCLI), 스템퓨셀OA(StempeucelOA), HiQ셀(HiQCell), 하티셀그램-AMI(Hearticellgram-AMI), 레바스코르(REVASCOR)® (메조블라스트, 인크.(Mesoblast, Inc.: 오스트레일리아 멜버른)), 카르디오렐(CARDIOREL)® (레리안스 라이프 사이언시즈(Reliance Life Sciences: 인도 나비뭄바이)), 카르티스템(CARTISTEM)® (메디포스트(Medipost: 미국 메릴랜드주 록빌)), 뉴모스템(PNEUMOSTEM)® (메디포스트: 미국 메릴랜드주 록빌), 프로모스템(PROMOSTEM)® (메디포스트: 미국 메릴랜드주 록빌), 호메오-GH(Homeo-GH), AC607, PDA001, SB623, CX601, AC607, 자궁내막 재생 세포 (ERC), 셀루션® 시스템(CELUTION® System) (시토리 세라퓨틱스, 인크.(Cytori Therapeutics, Inc.: 미국 캘리포니아주 샌디에고))을 이용하여 수득된 지방-유래 줄기 및 재생 세포 (ADRC), 혈관주위-유래 세포, 및 혈관주위세포-유래 세포로서 기술되어 있는 세포를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "중간엽 간질 세포" 또는 "MSC"는 조건들 중 한 세트하에서 배양되었을 때에는 ISCT 기준 중 하나 이상의 것만을 충족시키지만, 10% 우태아 혈청을 함유하는 조직 배양 배지의 존재하에서 플라스틱 조직 배양 플라스크 상에서 배양되었을 때에는 ISCT 기준 전체 세트를 충족시키는 세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "근육 줄기 세포"란, 횡문근, 평활근, 심장 근육, 근육 위성 세포 또는 근육을 형성하도록 재프로그램화된 골수 세포를 비롯한 근육으로부터 유래된 세포 집단을 의미한다. 본원에서 사용되는 바, "근육 줄기 세포"라는 용어는 미소셀(MyoCell)® (바이오하트, 인크.(Bioheart, Inc.: 미국 플로리다주 선라이즈)), 미소셀® SDF-1, C3BS-CQR-1, 및 CAP-1002를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "자연 킬러 세포" 또는 "NK" 세포란, CD3이 없고, CD56 및/또는 NKp46을 발현하는 세포 집단을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "신경 줄기 세포" 또는 "NSC"란, 신경 세포 또는 신경아교 세포로 분화될 수 있는 세포 집단을 의미한다. 본원에서 사용되는 바, "신경 줄기 세포"라는 용어는 Q-셀즈(Q-Cells)® (Q 세라퓨틱스 인크.(Q Therapeutics Inc.: 미국 유타주 솔트 레이크 시티)), NSI-566, HuCNS-SC® (스템 셀즈, 인크.(Stem 세포, Inc.: 미국 캘리포니아주 뉴어크)), 및 ReN001을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "환자"는 광범위하게 사용되며, 이는 병태, 질환 또는 손상을 호전시키기 위해 치료용 세포를 필요로 하는 임의의 동물을 의미한다. 동물은 포유동물, 조류, 어류, 파충류, 또는 임의의 다른 동물일 수 있다. 포유동물 중 일부 비제한적인 예로는 인간 및 다른 영장류, 말과, 예컨대, 말, 소과, 예컨대, 소, 양과, 예컨대, 양, 염소과, 예컨대, 염소, 개과, 예컨대, 개, 고양이과, 예컨대, 고양이, 설치류, 예컨대, 마우스 또는 래트, 및 다른 포유동물, 예컨대, 토끼, 기니아 피그 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "생리학상 평형 염 용액"이란, 용액 또는 배지가 대략 280 내지 310 mOsmol/L의 오스몰농도로 인간 세포와 등장성이고, pH가 생리학적 pH, 대략 pH 7.3 - 7.4가 되도록 염 및 다른 성분의 농도가 조정된, 용액 또는 배지를 지칭한다. 생리학상 평형 염 용액의 예로는 행크스 염기성 염 용액(Hank's basic salt solution), 알파 최소 필수 배지 (αMEM), 둘베코스 최소 필수 배지 (DMEM), 이스코브스 변형 둘베코스 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium: IMDM) 및 플라스말라이트(PlasmaLyte) 용액, 예컨대, 플라스말라이트 A를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "치료용 세포"란, 환자에서 병태, 질환, 및/또는 손상을 호전시키는 확장된 세포 집단을 의미한다. 치료용 세포는 자가 세포 (즉, 환자로부터 유래된 것), 동종이계 세포 (즉, 같은 종의, 환자와는 다른 개체로부터 유래된 것), 또는 이종 발생성 세포 (즉, 환자와 다른 종으로부터 유래된 것)일 수 있다. 치료용 세포는 동질성 (즉, 단일 세포 유형으로 이루어진 것), 또는 이질성 (즉, 다중 세포 유형으로 이루어진 것)일 수 있다. "치료용 세포"라는 용어는 치료학상 활성인 세포 뿐만 아니라, 치료학상 활성인 세포로 분화될 수 있는 전구 세포, 이 둘 모두를 포함한다.
이제, 본 개시된 및/또는 청구된 발명의 개념(들)으로 화제를 돌려, 그의 한 실시양태는 일반적으로, α1,3-푸코실트랜스퍼라제 및 푸코스 도너로 처리되고, 생체내 투여되었을 때, 그의 비-푸코실화된 카운터파트와 비교하여 증진된 이동 및 생착을 보이는 치료용 세포를 제조하기 위한 조성물 및 제조 방법에 관한 것이다.
본 개시된 및/또는 청구된 발명의 개념(들)의 실시양태는 또한 미국 (US) 식품 의약국 (FDA) 또는 그와 동등한 미국 이외의 다른 국가의 규제 기관에 의해 실행되는 현행 우수 제조 관리 기준 (cGMP) 규정하에서 치료용 세포를 제조하고, 임의적으로 그를 동결보존시킬 수 있는 가능성을 상업적으로 제공하는 것에 관한 것이다. 치료용 세포는 허혈성 병태 (예컨대, 사지 허혈, 울혈성 심부전, 심장 허혈, 신장 허혈 및 ESRD, 뇌졸중, 및 안구 허혈), 기관 또는 조직 재생 (예컨대, 재생 of 간, 췌장, 폐, 침샘, 혈관, 골, 피부, 연골, 건, 인대, 뇌, 모발, 신장, 근육, 심장 근육, 신경, 및 사지의 재생)을 필요로 하는 병태, 염증성 질환 (예컨대, 심장 질환, 당뇨병, 척수 손상, 류마티스 관절염, 골관절염, 고관절 치환술 또는 교정에 기인하는 염증, 크론병, 및 이식편 대 숙주 질환), 자가면역 질환 (예컨대, 1형 당뇨병, 건선, 전신 루푸스, 및 다발성 경화증), 퇴행성 질환, 선천성 질환, 혈액학적 장애, 예컨대, 빈혈, 백혈구 감소증, 혈소판 증가증, 골수증식성 장애 또는 혈액학적 신생물 및 암, 예컨대, 백혈병 및 림프종을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 각종 질환 및 장애를 치료하는 데 유용하다.
본 개시된 및/또는 청구된 발명의 개념(들)의 실시양태는 일반적으로 푸코실화된 세포 집단, 및 더욱 특히, 제한하는 것은 아니지만, 골수, 제대혈, 제대, 와튼 젤리, 말초 혈액, 림프성 조직, 자궁내막, 영양막-유래 조직, 태반, 양수, 지방 조직, 근육, 간, 연골, 신경 조직, 심장 조직, 치수 조직, 탈락 치아, 배아 줄기 (ES) 세포 또는 유도 만능 줄기 (iPS) 세포로부터 유래된 세포, 또는 그의 임의 조합으로부터 단리된 치료용 세포를 제조 및/또는 보관하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
특정 비제한적인 실시양태에서, 단리된 치료용 세포는 분화된 배아 줄기 세포 및/또는 분화된 유도 만능 줄기 세포이다.
특히, 본 개시된 및/또는 청구된 발명의 개념(들)의 한 실시양태는 상기 세포를 대량 생산하고, 상기 세포를 유효량의 α1,3-푸코실트랜스퍼라제 및 푸코스 도너 (예컨대, 푸코스 도너 GDP-푸코스와 함께 α1,3-푸코실트랜스퍼라제 VI 또는 α1,3-푸코실트랜스퍼라제 VII)로 처리한 후, 이어서, 임의적으로, 효소 처리로부터 이루어진 세포 표면 푸코실화의 증진된 수준이 세포 해동 이후에도 유지되는 조건하에서 상기 세포를 동결보존하는 방법에 관한 것이다.
인간과 동물 사이의, 셀렉틴 리간드의 푸코실화 이후 셀렉틴에의 결합 증진에 관여하는 기전 사이에 유사성이 존재하는 바, 이에 본 개시된 및/또는 청구된 발명의 개념(들)은 또한 수의학적 용도로도 사용될 수 있다.
본원에서 고려되는 본 방법에서, 푸코실트랜스퍼라제는 α1,3-푸코실트랜스퍼라제 III, α1,3-푸코실트랜스퍼라제 IV, α1,3-푸코실트랜스퍼라제 V, α1,3-푸코실트랜스퍼라제 VI, α1,3-푸코실트랜스퍼라제 VII, α1,3-푸코실트랜스퍼라제 IX, α1,3-푸코실트랜스퍼라제 X, 및 α1,3-푸코실트랜스퍼라제 XI, 또는 그의 임의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 푸코스 도너는 예를 들어, GDP-푸코스일 수 있다.
한 실시양태에서 , 본 개시된 및/또는 청구된 발명의 개념(들)은 조직 배양물 중 일정량의 치료용 세포를 제공하거나, 또는 치료용 세포를 단리시키는 단계, 치료용 세포를 확장시키는 단계, 및 일정량의 치료용 세포 또는 그 집단을 시험관내에서 유효량의 α1,3-푸코실트랜스퍼라제 및 푸코스 도너와 접촉시킴으로써 그를 푸코실화시키는 단계를 포함하는, 푸코실화된 치료용 세포를 제조하는 방법을 고려한다. 푸코실화된 치료용 세포는 P-셀렉틴 또는 E-셀렉틴에 대하여 증진된 결합을 보인다. 푸코실화된 치료용 세포를 임의적으로, 세포 해동 이후에도 P-셀렉틴 또는 E-셀렉틴에 대하여 증진된 결합을 유지하는 조건하에서 추가로 동결보존시킬 수 있다.
또 다른 비제한적인 실시양태에서, 본 개시된 및/또는 청구된 발명의 개념(들)은 푸코실화된 치료용 세포를 동결보존시키는 방법을 포함한다. 본 방법에서, 치료용 세포를 단리시키고, 이를 유효량의 α1,3-푸코실트랜스퍼라제 및 푸코스 도너와 접촉시켜 푸코실화시킨다. 이어서, 푸코실화된 치료용 세포를, 생리학상 평형 염 용액 및 동결보호제를 포함하는 치료용 세포 동결보존 조성물 중에서 동결시킨다.
본 방법은 푸코실화에 앞서 치료용 세포를 확장시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 특정의 비제한적인 실시양태에서, 세포를 확장시킬 때, 세포 동결이 이루어지는 생리학상 평형 염 용액은 세포 확장이 이루어지는 조직 배양 배지일 수 있다. 추가로, 생리학상 평형 염 용액은 단백질을 추가로 함유할 수 있다. 본 개시된 및/또는 청구된 발명의 개념(들)에 따라 사용될 수 있는 단백질의 비제한적인 예로는 우태아 혈청, 말 혈청, 인간 혈청, 인간 혈소판 용해물, 소 알부민, 인간 알부민, 및 그의 임의 조합을 포함한다.
특정 비제한적인 실시양태에서, 동결 단계는 치료용 세포를 세포 동결보존 조성물 중에서 약 1℃/분의 속도로 약 37℃에서 약 -80℃로 냉각시켜 동결된 세포 현탁액을 제조한 후, 동결된 세포 현탁액을 옮겨 액체 질소 존재하에서 보관하는 것을 포함한다. 추가로 또는 (대안적으로), 유리화 방법을 사용하여 치료용 세포를 동결시킬 수 있다.
특정 비제한적인 실시양태에서, 먼저, 부착 세포를 그의 성장이 이루어진 조직 배양 플라스틱 또는 마이크로비드 또는 다른 기판으로부터 제거하고, α1,3-푸코실트랜스퍼라제 및 푸코스 도너로 처리한 후, 임의적으로 동결보존시킨다. 세포를 트립신에 노출시켜 조직 배양 플라스틱 및 다른 기판으로부터 제거한 후, 푸코실화시키는 것이, 조직 배양 플라스틱에 부착되어 있는 동안 세포를 푸코실화한 후, 그를 트립신으로 제거하는 것보다 더욱 효과적인 방법이라는 것인 본 개시된 및/또는 청구된 발명의 개념(들)의 놀라운 발견이다.
특정 비제한적인 실시양태에서, 본 방법은 cGMP 조건하에서 수행된다.
특정 비제한적인 실시양태에서, 본 개시된 및/또는 청구된 발명의 개념(들)의 치료용 세포는 골수, 제대혈, 제대, 와튼 젤리, 말초 혈액, 림프성 조직, 자궁내막, 영양막-유래 조직, 태반, 양수, 지방 조직, 근육, 간, 연골, 신경 조직, 심장 조직, 치수 조직, 탈락 치아, 배아 줄기 (ES) 세포 또는 유도 만능 줄기 (iPS) 세포로부터 유래된 세포, 또는 그의 임의 조합으로부터 단리된 세포이다.
특정 비제한적인 실시양태에서, 본 개시된 및/또는 청구된 발명의 개념(들)의 치료용 세포는 조혈 줄기 세포, 면역 세포, 중간엽 줄기 세포, 근육 세포, 양막 세포, 자궁내막 세포, 신경 줄기 세포, 자연 킬러 (NK) 세포, T 세포, B 세포, 또는 그의 임의 조합으로부터 선택된다. 예를 들어, 제한하는 것은 아니지만, 치료용 세포는 T 세포 (조절 T 세포 및 세포독성 T 세포 (예를 들어, 제한하는 것은 아니지만, CD8+ 세포독성 T 세포)를 포함하나, 이에 제한되지 않음), NK 세포, B 세포, CD38+ 세포, 신경 줄기 세포, 또는 그의 임의 조합일 수 있고, 여기서, 상기 세포는 푸코실트랜스퍼라제 VII (FT VII)에 의해 푸코실화된다. 일부 세포는 우선적으로 FT VI 대신 FT VII로 푸코실화된다는 것이 본 개시된 및/또는 청구된 발명의 개념(들)의 놀라운 발견이다. 시험관내에서의 효소의 푸코스 도너 특이성을 고려하였을 때 - FucT-VI은 중성 및 3'-시알릴화된 푸코스 도너, 둘 모두에서 활성인 반면, FucT-VII은 오직 3'-시알릴화된 2형 쇄에 대해서만 작용한다는 것은 예상하지 못했던 것이다. 그러므로, 선험적으로 FTVI은 대략 FTVII과 같은 정도로 세포를 푸코실화시킬 것으로 예상되었고; 이는 오직 일부 세포에서만 관찰되었다.
본 개시된 및/또는 청구된 발명의 개념(들)의 한 실시양태에서, 확장된 조혈 세포를 확장되지 않은 푸코실화된 조혈 세포와 혼합한다. 푸코실화된 및 비-푸코실화된 확장된 조혈 세포의 혼합물이 단독으로 사용되는 어느 한 집단보다 더욱 효과적이라는 것은 본 개시된 및/또는 청구된 발명의 개념(들)의 놀라운 발견이다.
본 개시된 및/또는 청구된 발명의 개념(들)의 한 실시양태에서, 자연 킬러 세포를 확장시킨 후, 푸코실화시킨다. 본 출원을 출원할 때까지, 자연 킬러 세포를 생체외에서 푸코실화시킬 수 있다고 한 설명도 제안도 없었다.
본 개시된 및/또는 청구된 발명의 개념(들)이 있을 때까지, 푸코실화된 치료용 세포를 동결보존하는 방법 개발에 대한 설명도 제안도 없었다. 추가로, 본 발명자들은 놀랍게도 본 개시된 및/또는 청구된 발명의 개념(들)의 동결보존 방법을 따라 수행함으로써 푸코실화를 고도로 유지하는 치료용 세포를 동결보존 후 회수할 수 있다는 것을 발견하게 되었다.
한 실시양태에서, 본 개시된 및/또는 청구된 발명의 개념(들)은 일정량의 치료용 세포 또는 그 집단을 제공/단리시키는 단계, 조직 배양물 중에서 치료용 세포를 확장시키는 단계, 시험관내에서 일정량의 치료용 세포 또는 그 집단을 α1,3-푸코실트랜스퍼라제 및 푸코스 도너로 처리하는 단계로서, 여기서, 처리된 치료용 세포는 P-셀렉틴 및 E-셀렉틴에 대하여 증진된 결합을 보이는 것인 단계, 및 이어서, 임의적으로, 세포를 동결보존시키는 단계를 포함하는, 치료용 세포를 처리하는 방법을 고려한다. 추가로, 치료용 세포는 전형적으로 P-셀렉틴 당단백질 리간드-1 (PSGL-1), CD44, 및/또는 P-셀렉틴 또는 E-셀렉틴에 효과적으로 결합하지 않는 다른 셀렉틴 리간드를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본원에 기술된 바와 같이, 푸코실화 이전의 그의 비처리된 상태인 치료용 세포는 염증이 있는, 허혈성, 또는 손상된 조직 중에서 유지가 감소된 것으로 보인다.
본 개시된 및/또는 청구된 발명의 개념(들)의 특정 비제한적인 실시양태에서, 비록 치료용 세포가 조직 배양물 중에서 성장된 세포로부터 유래된 세포일 수 있거나, 또는 배아 줄기 (ES) 세포 또는 유도 만능 줄기 (iPS) 세포로부터 유래된 세포이지만, 치료용 세포는 골수, 제대혈, 제대, 와튼 젤리, 말초 혈액, 림프성 조직, 자궁내막, 영양막-유래 조직, 태반, 양수, 지방 조직, 근육, 간, 연골, 신경 조직, 심장 조직, 치수 조직 및 탈락 치아를 포함하는 목록으로부터 유래된 세포이다. 치료용 세포는 또한 상기의 임의 조합일 수도 있다.
본 개시된 및/또는 청구된 발명의 개념(들)의 특정 비제한적인 실시양태에서, 치료용 세포는 cGMP 조건하에서 확장된다.
상기 언급된 바와 같이, 본원에 기술된 푸코실화 처리 이후, 처리된 치료용 세포는 비처리된 치료용 세포와 비교하였을 때, P-셀렉틴 또는 E-셀렉틴에 대하여 증진된 결합을 보인다. P-셀렉틴 (또는 E-셀렉틴)에의 결합 증진은, 처리된 치료용 세포 중 적어도 10%가 P-셀렉틴 (또는 E-셀렉틴, 각각) 결합 검정법에서 (하기 정의되는 바와 같은) 미리 결정된 형광 역치보다 큰 형광을 보이는 것으로 정의된다. 또 다른 실시양태에서, 처리된 치료용 세포 중 적어도 25%가 미리 결정된 형광 역치를 초과한다. 또 다른 실시양태에서, 처리된 치료용 세포 중 적어도 50%가 미리 결정된 형광 역치를 초과한다. 또 다른 실시양태에서, 처리된 치료용 세포 중 적어도 75%가 미리 결정된 형광 역치를 초과한다. 또 다른 실시양태에서, 처리된 치료용 세포 중 적어도 90%가 미리 결정된 형광 역치를 초과한다. 또 다른 실시양태에서, 처리된 치료용 세포 중 적어도 95%가 미리 결정된 형광 역치를 초과한다.
본 개시된 및/또는 청구된 발명의 개념(들)은 일정량의 치료용 세포 또는 그 집단을 제공하는 단계, 조직 배양물 중에서 세포를 확장시키는 단계, 시험관내에서 일정량의 치료용 세포를 α1,3-푸코실트랜스퍼라제 및 푸코스 도너로 처리하는 단계로서, 여기서, 처리된 치료용 세포 대다수는 본원에 기술된 바와 같이 P-셀렉틴 (또는 E-셀렉틴)에 대하여 증진된 결합을 보이는 것인 단계, 및 임의적으로, 세포를 동결보존시키는 단계를 포함하는 치료용 세포를 처리하는 방법에 의해 제조된 치료용 세포 생성물을 추가로 고려한다. 비록 일정량의 세포가 조직 배양물 중에서 성장된 세포로부터 유래된 세포일 수 있거나, 또는 배아 줄기 (ES) 세포 또는 유도 만능 줄기 (iPS) 세포로부터 유래된 세포이지만, 일정량의 세포는 예를 들어 제한하는 것은 아니지만, 골수, 제대혈, 제대, 와튼 젤리, 말초 혈액, 림프성 조직, 자궁내막, 영양막-유래 조직, 태반, 양수, 지방 조직, 근육, 간, 연골, 신경 조직, 심장 조직, 치수 조직, 탈락 치아로부터 유래된 것일 수 있다. 치료용 세포는 또한 상기의 임의 조합일 수도 있다.
한 실시양태에서, 본 개시된 및/또는 청구된 발명의 개념(들)은 표면 단백질 CD38이 발현되지 않거나, 또는 그의 발현이 감소된 (CD38의 정상 발현 수준보다 적은) 일정량의 치료용 세포 또는 그 집단을 제공하는 단계, 및 시험관내에서 일정량의 치료용 세포 또는 그 집단을 α1,3-푸코실트랜스퍼라제 및 푸코스 도너로 처리하는 단계로서, 여기서, 그렇게 처리된 치료용 세포는 비처리된 치료용 세포에 비하여 P-셀렉틴 또는 E-셀렉틴에 대하여 증진된 결합을 보이는 것인 단계를 포함하는, 치료용 세포를 처리하는 방법을 고려한다. 추가로, 비처리된 치료용 세포는 전형적으로 대개 PSGL-1, CD44 및/또는 P-셀렉틴 또는 E-셀렉틴에 적절하게 결합하지 않는 다른 셀렉틴 리간드를 포함하는 것을 특징으로 거나, 또는 치료용 세포에서는 어떤 셀렉틴 리간드의 발현도 일어나지 않을 수 있다. PSGL-1 또는 치료용 세포 상에 존재하는 다른 셀렉틴 리간드에는 푸코실화된 글리칸, 예컨대, O-글리칸이 ?0킬?, 또는 그 개수가 감소되어 있고, 예를 들어, NeuAcα2,3Galβ1,4GlcNAc는 포함하지만, GlcNAc에의 α1,3 연결에서 푸코스는 없는 코어-2 O-글리칸을 가지는 PSGL-1을 가질 수 있다. 푸코실화 이전의 그의 비처리된 상태의 치료용 세포는 골수로, 또는 셀렉틴을 발현하는 다른 원하는 부위로의 귀소 능력이 감소된 것을 보인다. 한 특정 비제한적인 실시양태에서, 비록 치료용 세포가 배아 줄기 (ES) 세포 또는 유도 만능 줄기 (iPS) 세포로부터 유래된 세포일 수 있지만, 상기 세포가 그의 골수 귀소 능력을 증진시키기 위해 추가의 푸코실화를 필요로 하거나, 또는 추가의 푸코실화로부터 이익을 얻는 것을 특징으로 하는 한, 골수, 제대혈, 제대, 와튼 젤리, 말초 혈액, 림프성 조직, 자궁내막, 영양막-유래 조직, 태반, 양수, 지방 조직, 근육, 간, 연골, 신경 조직, 심장 조직, 치수 조직, 탈락 치아로 구성된 목록으로부터 유래된 세포이다. 본원에서 고려되는 본 방법에서, α1,3-푸코실트랜스퍼라제는 예를 들어, α1,3-푸코실트랜스퍼라제 IV, α1,3-푸코실트랜스퍼라제 VI, 또는 α1,3-푸코실트랜스퍼라제 VII일 수 있다. 푸코스 도너는 예를 들어, GDP-푸코스일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시된 및/또는 청구된 발명의 개념(들)은 cGMP를 준수하는 조건하에서 성장된 세포 집단을 포함하는 처리된 치료용 세포의 조성물로서, 여기서, 처리된 세포는 적절히 푸코실화되고 (예컨대, 시알릴 루이스 X를 포함하고), P-셀렉틴 (또는 E-셀렉틴)에 결합할 수 있는 PSGL-1 또는 다른 셀렉틴 리간드를 포함하는 것인 조성물을 고려한다. 처리된 치료용 세포를 보관 또는 환자에게로의 투여를 위해 제약상 허용되는 담체 또는 비히클에 배치할 수 있다. 임의적으로, 처리된 치료용 세포는 환자에게로의 투여 이전에 보관을 위해 동결보존될 수 있다.
특정 비제한적인 실시양태에서, 치료용 세포는 cGMP를 준수하는 조건하에서 확장된 제대혈 조혈 세포, cGMP를 준수하는 조건하에서 확장된 골수-유래 세포, cGMP를 준수하는 조건하에서 확장된 제대혈-유래 세포, cGMP를 준수하는 조건하에서 확장된 중간엽 줄기 세포, cGMP를 준수하는 조건하에서 확장된 신경 줄기 세포, cGMP를 준수하는 조건하에서 확장된 간세포, cGMP를 준수하는 조건하에서 확장된 자연 킬러 세포, 및 cGMP를 준수하는 조건하에서 확장된 T 세포로 구성된 목록으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 치료용 세포는 cGMP를 준수하는 조건하에서 확장되고, 최적의 푸코실화 수준을 유지시키는 조건하에서 동결보존된 후, 해동되고, 환자에게로 전달되기 이전에 푸코실화된다.
한 특정 비제한적인 실시양태에서, 치료용 세포는 cGMP를 준수하는 조건하에서 확장되고, 푸코실화된 후, 최적의 푸코실화 수준을 유지시키는 조건하에서 동결보존되고, 그 후, 세포는 해동된다.
특정 비제한적인 실시양태에서, cGMP를 준수하는 조건하에서 확장된 골수-유래 세포는 AMR-001® (아모르사이트, 인크.(Amorcyte, Inc.: 미국 뉴저지주 앨런데일)) ALD-301, ALD-201, ALD-401, Notch 리간드 델타1의 존재하에서 확장된 골수-유래 세포 및 MSC의 존재하에서 확장된 골수-유래 세포로 구성된 목록으로부터 선택된다.
특정 비제한적인 실시양태에서, cGMP를 준수하는 조건하에서 확장된 제대혈-유래 세포는 니코드(NiCord)® (가미다 셀 리미티드.(Gamida Cell Ltd.: 이스라엘 예루살렘)), 헤마코드(Hemacord), 프로헤마(ProHema), Notch 리간드 델타1의 존재하에서 확장된 제대혈-유래 세포, 및 MSC의 존재하에서 확장된 제대혈-유래 세포로 구성된 목록으로부터 선택된다.
특정 비제한적인 실시양태에서, cGMP를 준수하는 조건하에서 확장된 중간엽 줄기 세포는 멀티스템® (아테르시스, 인크.: 미국 오하이오주 클리블랜드), 프로키말® (오시리스 세라퓨틱스, 인크.: 미국 메릴랜드주 콜롬비아), 레메스템셀-L, 중간엽 전구체 세포 (MPC), 치수 줄기 세포 (DPSC), PLX 세포, PLX-PAD, 알로스템® (알로소스: 미국 콜로라도주 센테니얼), 아스트로스템® (오시리스 세라퓨틱스, 인크.: 미국 메릴랜드주 콜롬비아), 익스마이엘로셀-T, MSC-NTF, 누르오운™ (브레인스톰 셀 세라퓨틱스 인크.: 미국 뉴저지주 해컨색), 스템다인™-MSC (스테메디카 셀 테크놀러지즈 인크.: 미국 캘리포니아주 샌디에고), 스템퓨셀® (스템퓨딕스 리서치: 인도 방갈로르), 스템퓨셀CLI, 스템퓨셀OA, HiQ셀, 하티셀그램-AMI, 레바스코르® (메조블라스트, 인크.: 오스트레일리아 멜버른), 카르디오렐® (레리안스 라이프 사이언시즈: 인도 나비뭄바이), 카르티스템® (메디포스트: 미국 메릴랜드주 록빌), 뉴모스템® (메디포스트: 미국 메릴랜드주 록빌), 프로모스템® (메디포스트: 미국 메릴랜드주 록빌), 호메오-GH, AC607, PDA001, SB623, CX601, AC607, 자궁내막 재생 세포 (ERC), 셀루션® 시스템 (시토리 세라퓨틱스, 인크.: 미국 캘리포니아주 샌디에고)을 이용하여 수득된 지방-유래 줄기 및 재생 세포 (ADRC)로 구성된 목록으로부터 선택된다.
특정 비제한적인 실시양태에서, cGMP를 준수하는 조건하에서 확장된 신경 줄기 세포는 NSI-566, HuCNS-SC® (스템 셀즈, 인크.: 미국 캘리포니아주 뉴어크), CTX0E03, ReN001, ReN009, 스템다인™-NSC (스테메디카 셀 테크놀러지즈 인크.: 미국 캘리포니아주 샌디에고), Q-셀즈® (Q 세라퓨틱스 인크.,: 미국 유타주 솔트 레이크 시티), TBX-01, TBX-02, 리노사이트(RhinoCyte)™ 후각 줄기 세포 (리노사이트 인크.(RhinoCyte Inc.: 켄터키주 루이빌)), 모토그래프트(MOTORGRAFT)® (캘리포니아 스템 셀, 인크.(California Stem Cell, Inc.: 미국 캘리포니아주 어바인)), 및 셀비즈™ 뉴로(CellBeads™ Neuro)로 구성된 목록으로부터 선택된다.
특정 비제한적인 실시양태에서, cGMP를 준수하는 조건하에서 확장된 심장-유래 세포는 심장-유래 줄기 세포 (CDC)이다.
특정 비제한적인 실시양태에서, cGMP를 준수하는 조건하에서 확장된 간 세포는 hpSC-유래 간세포, 이종 인간 성체 간 전구 세포 (Heterologous Human Adult Liver Progenitor Cells: HHALPC), hLEC, 및 프로메쎄라® 헤파스템(PROMETHERA® HepaStem) (프로메쎄라 바이오사이언시즈 SA/NV(Promethera Biosicences SA/NV: 벨기에))이다.
한 실시양태에서, 처리된 치료용 세포의 조성물은 P-셀렉틴 (또는 E-셀렉틴)에의 결합이 증진된, cGMP를 준수하는 조건하에서 확장된 인간 HSPC 집단을 포함한다. P-셀렉틴 (또는 E-셀렉틴)에의 결합 증진은, 처리된 HSPC 중 적어도 10%가 P-셀렉틴 결합 검정법 (또는 E-셀렉틴 결합 검정법, 각각)에서 미리 결정된 형광 역치보다 큰 형광을 보이는 것으로 정의된다. 또 다른 실시양태에서, 처리된 HSPC 중 적어도 25%가 미리 결정된 형광 역치를 초과한다. 또 다른 실시양태에서, 처리된 HSPC 중 적어도 50%가 미리 결정된 형광 역치를 초과한다. 또 다른 실시양태에서, 처리된 HSPC 중 적어도 75%가 미리 결정된 형광 역치를 초과한다. 또 다른 실시양태에서, 처리된 HSPC 중 적어도 90%가 미리 결정된 형광 역치를 초과한다. 또 다른 실시양태에서, 처리된 HSPC 중 적어도 95%가 미리 결정된 형광 역치를 초과한다. 인간 HSPC의 조성물을 보관 또는 환자에게로의 투여를 위해 제약상 허용되는 담체 또는 비히클에 배치할 수 있다.
실시양태에서, 처리된 치료용 세포의 조성물은 P-셀렉틴 (또는 E-셀렉틴)에의 결합이 증진된, cGMP를 준수하는 조건하에서 확장된 인간 MSC 집단을 포함한다. P-셀렉틴 (또는 E-셀렉틴)에의 결합 증진은, 처리된 MSC 중 적어도 10%가 P-셀렉틴 결합 검정법 (또는 E-셀렉틴 결합 검정법, 각각)에서 미리 결정된 형광 역치보다 큰 형광을 보이는 것으로 정의된다. 또 다른 실시양태에서, 처리된 MSC 중 적어도 25%가 미리 결정된 형광 역치를 초과한다. 또 다른 실시양태에서, 처리된 MSC 중 적어도 50%가 미리 결정된 형광 역치를 초과한다. 또 다른 실시양태에서, 처리된 MSC 중 적어도 75%가 미리 결정된 형광 역치를 초과한다. 또 다른 실시양태에서, 처리된 MSC 중 적어도 90%가 미리 결정된 형광 역치를 초과한다. 또 다른 실시양태에서, 처리된 MSC 중 적어도 95%가 미리 결정된 형광 역치를 초과한다. 인간 MSC의 조성물을 보관 또는 환자에게로의 투여를 위해 제약상 허용되는 담체 또는 비히클에 배치할 수 있다.
한 실시양태에서, 처리된 치료용 세포의 조성물은 P-셀렉틴 (또는 E-셀렉틴)에의 결합이 증진된, cGMP를 준수하는 조건하에서 확장된 인간 신경 줄기 세포 집단을 포함한다. P-셀렉틴 (또는 E-셀렉틴)에의 결합 증진은, 처리된 신경 줄기 세포 중 적어도 10%가 P-셀렉틴 결합 검정법 (또는 E-셀렉틴 결합 검정법, 각각)에서 미리 결정된 형광 역치보다 큰 형광을 보이는 것으로 정의된다. 또 다른 실시양태에서, 처리된 신경 줄기 세포 중 적어도 25%가 미리 결정된 형광 역치를 초과한다. 또 다른 실시양태에서, 처리된 신경 줄기 세포 중 적어도 50%가 미리 결정된 형광 역치를 초과한다. 또 다른 실시양태에서, 처리된 신경 줄기 세포 중 적어도 75%가 미리 결정된 형광 역치를 초과한다. 또 다른 실시양태에서, 처리된 신경 줄기 세포 중 적어도 90%가 미리 결정된 형광 역치를 초과한다. 또 다른 실시양태에서, 처리된 신경 줄기 세포 중 적어도 95%가 미리 결정된 형광 역치를 초과한다. 인간 신경 줄기 세포의 조성물을 보관 또는 환자에게로의 투여를 위해 제약상 허용되는 담체 또는 비히클에 배치할 수 있다.
한 실시양태에서, 처리된 치료용 세포의 조성물은 P-셀렉틴 (또는 E-셀렉틴)에의 결합이 증진된, cGMP를 준수하는 조건하에서 확장된 인간 간세포 집단을 포함한다. P-셀렉틴 (또는 E-셀렉틴)에의 결합 증진은, 처리된 간세포 중 적어도 10%가 P-셀렉틴 결합 검정법 (또는 E-셀렉틴 결합 검정법, 각각)에서 미리 결정된 형광 역치보다 큰 형광을 보이는 것으로 정의된다. 또 다른 실시양태에서, 처리된 간세포 중 적어도 25%가 미리 결정된 형광 역치를 초과한다. 또 다른 실시양태에서, 처리된 간세포 중 적어도 50%가 미리 결정된 형광 역치를 초과한다. 또 다른 실시양태에서, 처리된 간세포 중 적어도 75%가 미리 결정된 형광 역치를 초과한다. 또 다른 실시양태에서, 처리된 간세포 중 적어도 90%가 미리 결정된 형광 역치를 초과한다. 또 다른 실시양태에서, 처리된 간세포 중 적어도 95%가 미리 결정된 형광 역치를 초과한다. 인간 간세포의 조성물을 보관 또는 환자에게로의 투여를 위해 제약상 허용되는 담체 또는 비히클에 배치할 수 있다.
한 실시양태에서, 처리된 치료용 세포의 조성물은 P-셀렉틴 (또는 E-셀렉틴)에의 결합이 증진된, cGMP를 준수하는 조건하에서 확장된 인간 NK 세포 집단을 포함한다. P-셀렉틴 (또는 E-셀렉틴)에의 결합 증진은, 처리된 NK 세포 중 적어도 10%가 P-셀렉틴 결합 검정법 (또는 E-셀렉틴 결합 검정법, 각각)에서 미리 결정된 형광 역치보다 큰 형광을 보이는 것으로 정의된다. 또 다른 실시양태에서, 처리된 NK 세포 중 적어도 25%가 미리 결정된 형광 역치를 초과한다. 또 다른 실시양태에서, 처리된 NK 세포 중 적어도 50%가 미리 결정된 형광 역치를 초과한다. 또 다른 실시양태에서, 처리된 NK 세포 중 적어도 75%가 미리 결정된 형광 역치를 초과한다. 또 다른 실시양태에서, 처리된 NK 세포 중 적어도 90%가 미리 결정된 형광 역치를 초과한다. 또 다른 실시양태에서, 처리된 NK 세포 중 적어도 95%가 미리 결정된 형광 역치를 초과한다. 인간 NK 세포의 조성물을 보관 또는 환자에게로의 투여를 위해 제약상 허용되는 담체 또는 비히클에 배치할 수 있다.
한 실시양태에서, 처리된 치료용 세포의 조성물은 P-셀렉틴 (또는 E-셀렉틴)에의 결합이 증진된, cGMP를 준수하는 조건하에서 확장된 인간 T 세포 (예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 조절 T 세포 및 세포독성 T 세포 (예를 들어, 제한하는 것은 아니지만, CD8+ 세포독성 T 세포)) 집단을 포함한다. P-셀렉틴 (또는 E-셀렉틴)에의 결합 증진은, 처리된 T 세포 중 적어도 10%가 P-셀렉틴 결합 검정법 (또는 E-셀렉틴 결합 검정법, 각각)에서 미리 결정된 형광 역치보다 큰 형광을 보이는 것으로 정의된다. 또 다른 실시양태에서, 처리된 T 세포 중 적어도 25%가 미리 결정된 형광 역치를 초과한다. 또 다른 실시양태에서, 처리된 T 세포 중 적어도 50%가 미리 결정된 형광 역치를 초과한다. 또 다른 실시양태에서, 처리된 T 세포 중 적어도 75%가 미리 결정된 형광 역치를 초과한다. 또 다른 실시양태에서, 처리된 T 세포 중 적어도 90%가 미리 결정된 형광 역치를 초과한다. 또 다른 실시양태에서, 처리된 T 세포 중 적어도 95%가 미리 결정된 형광 역치를 초과한다. 인간 T 세포의 조성물을 보관 또는 환자에게로의 투여를 위해 제약상 허용되는 담체 또는 비히클에 배치할 수 있다.
한 실시양태에서, 미리 결정된 형광 역치는 먼저 치료용 세포의 샘플을 수득함으로써 수득된다. 본원 다른 곳에도 기술되어 있는 P-셀렉틴 결합 검정법 (또는 E-셀렉틴 결합 검정법)을 사용하여, 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 P-셀렉틴 형광 결합 검정법 (또는 E-셀렉틴 결합 검정법, 각각)에 의해, 또는 HECA-452 항체로 염색하여 치료용 세포의 상기 대조군 (기준선) 샘플을 검정한다. 대조군 (기준선) 샘플 중 치료용 세포에 대한 P-셀렉틴 (또는 E-셀렉틴 또는 HECA-452) 결합 형광 수준을 측정한다. 한 실시양태에서, 대조군 샘플 중 치료용 세포 중의 적어도 95%의 P-셀렉틴 (또는 E-셀렉틴 또는 HECA-452) 결합 형광 수준을 초과하는 형광 값이 선택된다. 선택된 형광 값은 처리된 (즉, 푸코실화된) 치료용 세포의 P-셀렉틴 (또는 E-셀렉틴 또는 HECA-452) 결합 형광의 비교 대상이 되는 미리 결정된 형광 역치로서 지정된다.
본 개시된 및/또는 청구된 발명의 개념(들)은 일정량의 치료용 세포 또는 그 집단을 제공하는 단계, 시험관내에서 일정량의 치료용 세포를 α1,3-푸코실트랜스퍼라제 및 푸코스 도너로 처리하는 단계로서, 여기서, 처리된 치료용 세포 대다수는 P-셀렉틴 (또는 E-셀렉틴 또는 HECA-452)에 결합하는 것인 단계로 이루어진 방법에 의해 제조된 치료용 세포 생성물을 추가로 고려한다. 일정량의 치료용 세포는 골수로부터 유래된 것일 수 있지만, 이는 제대혈, 제대, 말초 혈액, 림프성 조직, 지방 조직, 신경 조직, 근육, 태반, 양수, 자궁내막, 간으로부터 유래된 세포일 수 있거나, 또는 이는 배아 줄기 (ES) 세포 또는 유도 만능 줄기 (iPS) 세포로부터 유래된 세포로부터 유래된 세포일 수 있다. 치료용 세포는 또한 상기의 임의 조합일 수도 있다.
일반적으로, 본 개시된 및/또는 청구된 발명의 개념(들)은, 치료용 세포 상에서 발현된 비-기능성 또는 차선적으로 기능성인 PSGL-1 또는 다른 셀렉틴 리간드를 시험관내 α1,3-푸코실화 기술에 의해 변형시켜 귀소 결함을 보정할 수 있는 cGMP 조건하에서 치료용 세포를 제조하는 방법을 고려하며, 이는 세포 요법에서의 상기 치료용 세포의 용도를 개선시킨다.
앞서 설명한 바와 같이, 치료용 세포는 PSGL-1 또는 다른 셀렉틴 리간드를 발현할 수 있지만, 상당량은 P-셀렉틴 (또는 E-셀렉틴)에 결합하지 않거나, 또는 오직 소량의 P-셀렉틴 (또는 E-셀렉틴, 각각)만이 결합한다. PSGL-1은 CD34+ 세포를 비롯한, 거의 모든 백혈구 상에서 발현되는 동종이량체 뮤신이다. 기능성이 되기 위해, 즉, P-셀렉틴 또는 E-셀렉틴에 결합할 수 있도록 하기 위해, PSGL-1은 수회의 번역 후 변형을 필요로 하고, 이로써, 그 위에 sLex 기를 형성하게 된다 (α1,3-푸코실화 포함). 불충분한 α1,3-푸코실화는 예를 들어, 혈관 셀렉틴과 상호작용할 수 있는 나이브 T 세포의 능력을 손상시킨다. P-셀렉틴 또는 E-셀렉틴 부착 분자에 결합하지 못하는 치료용 세포의 무능성은 동결보존 이전 또는 이후로, cGMP 조건하에서 확장 이후 생체외 푸코실화로 보정될 수 있다는 것이 본 개시된 및/또는 청구된 발명의 개념(들)에서 발견되었다. 이는 확장으로 (예컨대, 문헌 [Kallinikou et al.], [Menard et al.], [Feneke et al.] (상기 문헌은 각각 상기와 같이 포함됨)) 및 동결보존으로 (예컨대, 문헌 [Faint et al.], [Koenigsmann et al.], [Hattori et al.], [Campbell et al.], [Aoyagi et al.], [Mareschi et al.], 및 [Neuhuber et al.] (상기 문헌은 각각 상기와 같이 포함됨)) 부착 분자의 개수가 하향 조절된다는 것을 고려해 볼 때, 놀라운 발견이다.
그러므로, 본 개시된 및/또는 청구된 발명의 개념(들)의 기본 원리는 시험관내에서, sLex 구조의 합성을 촉매화시키기도 하는 α1,3-푸코실트랜스퍼라제 및 푸코스 도너 (예컨대, GDP-푸코스와 함께 FT-VI 또는 FT-VII)로 치료용 세포를 처리하는 것이 PSGL-1 또는 다른 셀렉틴 리간드의 푸코실화를 증가시킬 것이며, 이로써, 심지어는 cGMP 배양물 중에서의 대량 확장 이후에서 치료용 세포의 귀소 결함을 보정할 것이라는 것이다. 본 개시된 및/또는 청구된 발명의 개념(들)의 추가의 기본 원리는 푸코실화된 세포가 동결보존될 수 있고, 이는 해동 이후에도 그의 푸코실화 수준을 유지할 수 있다는 것이다.
α1,3 연결 중 푸코스를 GlcNAc로 전달할 수 있는 푸코실트랜스퍼라제는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, R&D 시스템즈(R&D Systems: 미국 미네소타주 미니애폴리스)로부터의 것과 같이, 수개의 것이 상업적으로 이용가능하다. 추가로, 적어도 8개의 상이한 유형의 α1,3-푸코실트랜스퍼라제 (FTIII-VII)가 인간 게놈에 의해 코딩된다. 이들은 푸코스 α (1,3) 또는 α (1,4)를 각각 Galβ4GlcNAc 또는 Galβ3GlcNAc로 전달할 수 있는 루이스 효소 (FTIII) (Kukowska-Latallo et al. (1990) Genes Dev., 4:1288); 시알릴화된 전구체를 선호하지 않는, α (1,3) 연결을 형성하는 FTIV ([Goelz, et al. (1989) Cell, 63:1349]; [Lowe, et al. (1991) J. Biol. Chem., 266:17467]); FTV (Weston, et al. (1992) J. Biol. Chem., 267:4152) 및 시알릴화된 전구체 또는 비시알릴화된 전구체를 푸코실화시킬 수 있는, α (1,3) 연결을 형성하는 FTVI (Weston, et al. (1992) J. Biol. Chem., 267:24575), 및 오직 시알릴화된 전구체만을 푸코실화시킬 수 있는 FTVII ([Sasaki, et al. (1994) J. Biol. Chem., 269:14730]; [Natsuka, et al. (1994) J. Biol. Chem., 269:16789])을 포함한다. FTIX는 우선적으로 푸코스를 폴리락토스아민 쇄의 비환원성 말단 단부의 GlcNAc 잔기에 전달하여 말단 Lex 구조를 생성하는 반면, 다른 α1,3FUT는 우선적으로 Fuc를 끝에서 두 번째 위치에 있는 GlcNAc 잔기에 전달하여 내부 Lex 구조를 생성한다 (Nishihara et al. (1999) FEBS Lett., 462:289-294). FTX 및 FTXI은, 고전적 모노엑손 알파1,3-푸코실트랜스퍼라제가 하는 것이 같이 짧은 락토스아미닐 억셉터 기질 상에서가 아니라 (Mollicone et al. (2009) J Biol Chem., 284:4723-38), 콘알부민 당펩티드 및 바이안테너리 N-글리칸 억셉터 상의 알파-l-푸코스를 연결한다.
FTIII에 대한 서열 정보는 GC19M005843에; FTIV는 GC11P094277에; FTV는 GC19M005865에; FTVI은 GC19M005830에; FTVII은 GC09M139924에, FTIX은 GC06P096463에, FTX은 GC08M033286에, 및 FTXI은 GC10P075532에 개시되어 있다 (진카즈(GeneCards)® (바이츠만 인스티튜트 오브 사이언스(Weizmann Institute of Science: 이스라엘 레호보트))는 모든 공지 및 예측 인간 유전자에 관한 간결한 게놈 관련 정보를 제공할 뿐만 아니라, 이는 다른 데이터베이스로 링크되는, 바이츠만 인스티튜트가 운영하는, 검색가능한 통합형 데이터베이스이다). 본 개시된 및/또는 청구된 발명의 개념(들)은 예를 들어, 미국 특허 번호 6,399,337 및 6,461,835에 제시되어 있는 바와 같은, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 이용가능하고, 그에게 공지되어 있는 다른, 비-인간 α1,3-푸코실트랜스퍼라제를 사용하는 것도 추가로 고려한다.
α1,3-푸코실트랜스퍼라제로 처리하기 위해 예를 들어, 제대혈, 말초 혈액, 또는 골수 공급원 중의 다른 세포로부터 분리시킴으로써 인간 HSPC를 수득할 수 있다. 밀도 구배 분리, 적혈구의 저장성 용해, 원심 세정 또는 형광 활성 세포 분류기 (FACS) 또는 자기 비드 단리 장치를 이용하는 모노클로날 항체에 의한 분리를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 관련 기술분야에 널리 공지된 각종 기술을 사용하여 HSPC를 수득할 수 있다. 특정 세포 계통 및/또는 분화 단계와 연관된 마커 (표면 막 단백질)를 확인하는 데 모노클로날 항체가 특히 유용하다. 장치, 예컨대, 밀테니 바이오테크 인크.(Miltenyi Biotec Inc.: 독일 벨기쉬 글라디바흐)로부터 입수한 클리니맥스® 시스템(CliniMACS® System)을 사용하여 자기 비드에 의해 또는 FACS에 의해 cGMP를 준수하는 조건하에서 HSPC를 단리시키는 데 항체, 예컨대, 항-CD34 또는 항-CD133이 사용될 수 있다. 대안적으로, 예컨대, 알데플루오르(ALDEFLUOR)™ (스템셀 테크놀러지즈 인크.(STEMCELL Technologies, Inc.: 캐나다 브리티시 콜럼비아주 밴쿠버))와 같이, 세포에서 알데히드 데히드로게나제 (ALDH)에 의해 하전된 형광성 생성물로 산화되고, 세포에 축적되고, HSPC를 함유하는, 밝은 형광성을 띠는 세포가 FACS에 의해 분리될 수 있도록 허용하는 시약을 사용하여 HSPC를 분리시킬 수 있다. 사용되는 분리 기술은 수집하고자 하는 분획의 생존가능성을 최대로 유지시켜야 한다. 사용되는 특정 기술은 분리 효율, 방법의 세포독성, 수행 편의성 및 수행 속도, 및 복잡한 장치 및/또는 전문적 기술에 대한 필요성에 의존할 것이다.
일단 단리시키고 나면, HSPC를 관련 기술분야에 공지된 다양한 cGMP 확장 프로토콜을 이용하여 확장시킬 수 있다 (리뷰를 위해 문헌 [Tung et al. (2010) Best Pract Res Clin Haematol., 23:245-57] 참조). 에리트로포이에틴, 키트 리간드, G-CSF, GM-CSF, IL-6, IL-11, 트롬보포이에틴, flt 리간드, FGF-1, 안지오포이에틴-유사 5, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 2 (IGFBP2), Notch 리간드 델타 1, PIXY321, 프로스타글란딘 E2, 아릴 탄화수소 핵 수용체 단백질 길항제, 예컨대, SR1, 및 테트라에틸렌펜타민 (TEPA)으로 구성된 인자 목록으로부터의 하나 이상의 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는 인자의 칵테일을 함유하는 조직 배양 배지 중에서 세포를 성장시킬 수 있다. 세포를 또한 MSC와의 공동 배양물 중에서 확장시킬 수 있으며, 이는 HSPC의 확장에 환경상 바람직한 영향을 주는 것으로 사료된다. cGMP 조건하에서의 확장이 FBS를 함유하는 조직 배양 배지 중에서 수행될 수 있지만, 이종 발생성 혈청은 피하고, 무혈청 배지, 예컨대, 스템라인® 배지(STEMLINE® Medium) (스템라인 세라퓨틱스, 인크.(StemLine Therapeutics, Inc.: 미국 뉴욕주 뉴욕)) 셀그로® 배지(CellGro® Medium) (메디아테크 인크.(배지Tech, Inc.: 미국 버지니아주 매너서스) QBSF-60 등을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포를 푸코실화 및 환자 내로의 주입 이전에 5-21일 동안 확장시킨다. 사용되는 푸코실화 방법은 하기에 기술한다.
α1,3-푸코실트랜스퍼라제로 처리하기 위해 예를 들어, 골수, 제대혈, 와튼 젤리, 지방 조직, 월경액, 양수 또는 태반 공급원 중의 다른 세포로부터 분리시킴으로써 인간 MSC를 수득할 수 있다. 세포의 공급원은 자가, 동종이계, 또는 이종 발생성일 수 있다. MSC는 배아 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 세포의 배양물로부터 수득될 수 있다. 공급원에 따라 다른 관련 기술분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 MSC를 수득할 수 있다. 와튼 젤리, 지방 조직 및 태반을 포함하나, 이에 제한되지 않는, MSC가 기질에 포획되어 있는 것인 공급원으로부터 유래되는 MSC의 경우, MSC는 콜라게나제, 히알루로니다제, 트립신 및 디스파제를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 단백질 분해 효소로의 처리에 의해 유리될 수 있다. MSC가 단일 세포의 혼합물 중에서 단리되고 나면, 이를 플라스틱에의 부착, 밀도 구배 분리, 적혈구의 저장성 용해, 원심 세정, 카네카(Kaneka)로부터의 골수 MSC 분리 장치에서와 같은, 부직 섬유에의 결합, 또는 형광 활성 세포 분류기 (FACS) 또는 자기 비드 단리 장치, 예컨대, 밀테니 바이오테크 인크. (독일 벨기쉬 글라디바흐)로부터 입수한 클리니맥스® 시스템을 이용하는 모노클로날 항체에 의한 분리를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 다른 세포 유형으로부터 분리시킬 수 있다. 상기 분리를 위해 유용한 모노클로날 항체로는 항-NGF-R, 항-PDGF-R, 항-EGF-R, 항-IGF-R, 항-CD29, 항-CD49a, 항-CD56, 항-CD63, 항-CD73, 항-CD105, 항-CD106, 항-CD140b, 항-CD146, 항-CD271, 항-MSCA-1, 항-SSEA4, 항-STRO-1 및 항-STRO-3을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 사용되는 분리 기술은 수집하고자 하는 분획의 생존가능성을 최대로 유지시켜야 한다. 사용되는 특정 기술은 분리 효율, 방법의 세포독성, 수행 편의성 및 수행 속도, 및 복잡한 장치 및/또는 전문적 기술에 대한 필요성에 의존할 것이다.
일단 단리시키고 나면, MSC를 관련 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 cGMP 조건하에 확장 배양물 중에서 확장시킨다. MSC를, FBS를 함유하는 배지 중에서 성장시킬 수 있지만, 이를 또한 FBS 대신 인간 혈소판 용해물을 함유하는 배지 중에서, 또는 무혈청 배지, 예컨대, 스템프(STEMPRO)® MSC SFM (써모 피셔 사이언티픽 인크.(Thermo Fisher Scientific Inc.: 미국 캘리포니아주 칼즈배드)), 스템라인® 중간엽 줄기 세포 확장 배지 (스템라인 세라퓨틱스, 인크.: 미국 뉴욕주 뉴욕), 셀그로® MSC 배지 (메디아테크 인크.: 미국 버지니아주 매너서스) 등의 배지 중에서도 성장시킬 수 있다. 세포를 5,000 - 5,000,000/㎠로 시딩하고, 세척하여 비-부착 세포를 제거한다. 세포를 전형적으로 7 - 28일 후 50 - 100% 전면생장률일 때, 계대접종한다. 계대접종 후, 세포를 세포 성장용 기판으로서 비드, 다공성 구조체, 섬유, 부직 섬유, 또는 중공 섬유를 사용하는, 조직 배양 플라스크, 세포 제작소, 회전 병 또는 생물반응기 (충전층 생물반응기 포함)에서 확장시킬 수 있다. MSC를 25회 정도로 안전하게 계대접종할 수 있지만, 특정 실시양태에서, 3 - 8회의 계대접종 후, MSC를 수거하고, 푸코실화시키고, 환자에게 전달하거나, 또는 동결보존시킨다. 푸코실화 및 동결보존 방법은 하기에서 논의된다.
α1,3-푸코실트랜스퍼라제로 처리하기 위해 예를 들어, 사후 뇌 조직 중의 다른 세포로부터 분리시킴으로써 인간 NSC를 수득할 수 있다. 세포의 공급원은 자가, 동종이계, 또는 이종 발생성일 수 있다. NSC는 배아 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 세포의 배양물로부터 수득될 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 NSC를 수득할 수 있다. 기계적 분해가 사용될 수 있고/거나, 세포는 콜라게나제, 히알루로니다제, 트립신 및 디스파제를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 단백질 분해 효소로의 처리에 의해 유리될 수 있다. NSC가 단일 세포의 혼합물 중에서 단리되고 나면, 이를 플라스틱에의 부착, 밀도 구배 분리, 원심 세정, 또는 형광 활성 세포 분류기 (FACS) 또는 자기 비드 단리 장치, 예컨대, 밀테니 바이오테크 인크. (독일 벨기쉬 글라디바흐)로부터 입수한 클리니맥스® 시스템을 이용하는 모노클로날 항체에 의한 분리를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 다른 세포 유형으로부터 분리시킬 수 있다. 상기 분리를 위해 유용한 모노클로날 항체로는 항-인테그린 α1β5, 항-CD15, 항-CD24, 항-CD33, 항-CXCR4, 항-EGFR, 항-Notch1 및 항-PSA-NCAM을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 사용되는 분리 기술은 수집하고자 하는 분획의 생존가능성을 최대로 유지시켜야 한다. 사용되는 특정 기술은 분리 효율, 방법의 세포독성, 수행 편의성 및 수행 속도, 및 복잡한 장치 및/또는 전문적 기술에 대한 필요성에 의존할 것이다.
일단 단리시키고 나면, NSC를 관련 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 cGMP 조건하에 확장 배양물 중에서 확장시킨다. NSC를, FBS를 함유하는 배지 중에서 성장시킬 수 있지만, 이를 또한 신 인간 혈소판 용해물을 함유하는 배지 중에서, 또는 무혈청 배지, 예컨대, 스템프로® MSC SFM (써모 피셔 사이언티픽 인크.: 미국 캘리포니아주 칼즈배드), 스템라인® 중간엽 줄기 세포 확장 배지(STEMLINE® Mesenchymal Stem Cell Expansion Medium) (스템라인 세라퓨틱스, 인크.: 미국 뉴욕주 뉴욕), 셀그로® MSC 배지 (메디아테크 인크.: 미국 버지니아주 매너서스) 등의 배지 중에서도 성장시킬 수 있다. 세포를 5,000 - 5,000,000/㎠로 시딩하고, 세척하여 비-부착 세포를 제거한다. 세포를 전형적으로 7 - 28일 후 50 - 100% 전면생장률일 때, 계대접종한다. 계대접종 후, 세포를 세포 성장용 기판으로서 비드, 다공성 구조체, 섬유, 부직 섬유, 또는 중공 섬유를 사용하는, 조직 배양 플라스크, 세포 제작소, 회전 병 또는 생물반응기 (충전층 생물반응기 포함)에서 확장시킬 수 있다. MSC를 25회 정도로 안전하게 계대접종할 수 있지만, 특정 실시양태에서, 6 - 8회의 계대접종 후, MSC를 수거하고, 푸코실화시키고, 환자에게 전달하거나, 또는 동결보존시킨다. 대안적으로, 예를 들어, CTX0E03 세포 중에서 c-mycERTAM 트랜스진을 사용하는 것과 같이, NSC를 조건부적으로 무한증식시킬 수 있다. 푸코실화 및 동결보존 방법은 하기에서 논의된다.
푸코실화 프로세스는 cGMP 조건하에서 수행된다. 이는 사용되는 모든 시약은 cGMP 조건하에서 생산되는 것을 요건으로 한다. 예를 들어, FTVI에 대한 cDNA는 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해, 예컨대, PCR을 사용하여 cDNA 라이브러리, 예컨대, 클론테크 퀵-클론(Clontech Quick-Clone) II 인간 폐 cDNA 라이브러리로부터 유전자를 증폭시킴으로써 수득할 수 있다. 일단 수득한 후, cDNA를 클로닝 벡터, 예컨대, 인비트로겐(Invitrogen) PCR-블런트 토포(PCR-Blunt Topo) PCR 클로닝 벡터로 클로닝할 수 있다. DNA 서열분석을 사용하여 수득된 서열과 DNA 데이터데이스를 비교함으로써 올바른 서열이 클로닝되었다는 것을 확인할 수 있다. 이어서, cDNA를, 친화성 태그, 예컨대, HPC4 에피토프를 함유하는 pCDNA 3.1 (+) (인비트로겐으로부터 입수)를 함유하는 벡터로 클로닝한 후, 발현 벡터, 예컨대, 론자(Lonza) pEE14.1 발현 벡터 (론자 워커스빌, 인크.(Lonza Walkersville, Inc.: 미국 메릴랜드주 워커스빌))로 서브클로닝할 수 있다. 론자 pEE14.1은 고수준의 유전자 증폭을 위해 글루타민 신테타제 (GS)를 사용하는데, 이는 전형적으로 최대 발현 수준을 달성하기 위하여 증폭시키는 데 단 1회차의 선별만을 필요로 한다. 세포, 예컨대, CHO-K1 세포 (ATCC: CCL-61)를 FTVI cDNA, 및 그의 N-말단에 HPC4를 함유하는 구축물로 형질감염시킬 수 있다. 증폭 후, FT-VI/HPC4를 고수준으로 발현하는 클론을 선별할 수 있다.
단백질 생산을 위해 CHO 세포를 선택한 경우, 이때는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 cGMP 단백질 생산을 위한 마스터 및 작업용 세포 은행을 제조할 수 있다.
원핵생물, 예컨대, 박테리아, 예컨대, E. 콜라이(E. coli), 효모, 예컨대, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 곤충 세포, 예컨대, 배큘로바이러스를 통하 곤출 세포, 및 다른 포유동물 세포주, 예컨대, NSO, HEK 등과 같은 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 관련 기술분야에 공지된 대안적인 단백질 생산 방법 또한 사용될 수 있다. FLAG-태그, V5-태그, c-myc-태그, His-태그, HA-태그 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 관련 기술분야에 공지된 다른 친화성 태그가 사용될 수 있다. 대안적으로, 단백질은 태그의 부재하에서 발현될 수 있고, 이온 교환, 겔 여과, 역상 HPLC 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 다양한 크로마토그래피 기술을 사용하여 정제될 수 있다. 친화성 정제 및 크로마토그래피의 조합 또한 사용될 수 있다. 임의의 α1,3-푸코실트랜스퍼라제의 cGMP 생산을 위해 유사한 기술이 사용될 수 있다. 전장의 α1,3-푸코실트랜스퍼라제 단백질을 발현시킬 필요가 없고; 말단절단된 단백질 뿐만 아니라, 안정성, 특이성 또는 활성을 개선시키기 위해, 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 조작된 단백질이 효소적 활성을 유지하는 바, 그 또한 치료용 세포의 생체외 푸코실화를 위해 사용될 수 있다. α1,3-푸코실트랜스퍼라제 단백질은 용액 중 유리 효소로서 사용될 수 있거나, 또는 치료용 세포로부터의 효소 제거를 용이하게 하기 위해 기판, 예컨대, 비드 또는 칼럼에 고정화될 수 있다.
실시예
본원 하기에서 실시예를 제공한다. 그러나, 본 개시된 및/또는 청구된 발명의 개념(들)은 그 적용에 있어서 구체적인 실험, 결과 및 실험으로 제한되지 않음을 이해하여야 한다. 오히려, 실시예는 단순히 다양한 실시양태 중 하나로서 제공되는 것이며, 배타적이 아닌, 예시적인 것으로 의도된다.
실시예
1
상이한 세포 유형은 상이한 푸코실화 조건을 필요로 한다. 하기 제시되는 바와 같이, 신경 줄기 세포는 FTVI으로는 푸코실화될 수 없지만, FTVII로는 완전하게 푸코실화되었다 (실험 D); 유사하게, B (CD19+), T (CD3+ 또는 CD4+), 및 CD38+ 세포는 FTVI이 아닌 FTVII로 푸코실화되었다 (본원 하기에 기술되는 실시예 5). 다른 세포 유형도 동등하게 어느 효소로든 푸코실화되었다. 어떤 효소가 어느 세포 유형을 푸코실화시킬 수 있는지 선험적으로 결정짓는 것은 불가능하다.
생체외 푸코실화가 상이한 세포 유형에 미치는 효과를 비교하기 위해, CHO 세포에서 생산되는 재조합 FTVI을 아라겐 바이오사이언스(Aragen Bioscience) (미국 캘리포니아주 모건힐; 최종 농도 1,100 ㎍/mL)에서 제조하고, 마우스 림프구 세포주에서 생산되는 FTVII은 교와 하코 기린(Kyowa Hakko Kirin) (일본, 최종 농도 150 ㎍/mL)으로부터 입수하였다. 동결된 인간 제대혈은 샌디에고 혈액 은행(San Diego Blood Bank)으로부터 구입하였다. 인간 중간엽 줄기 세포 및 인간 CD34+ 제대혈 세포는 론자 (론자 워커스빌, 인크.: 미국 메릴랜드주 워커스빌)로부터 구입하였다. 신선한 인간 신경 줄기 세포는 샌퍼드/버넘 소재의 에반 스나이더(Evan Snyder) 실험실로부터 입수하였다. 내피 전구 세포 (EPC)는 조이스 비쇼프(Joyce Bischoff) 박사 (미국 매사추세츠주 보스톤 소재의 하버드 의과 대학 소아 병동 혈관 생물학 프로그램 및 외과(Vascular Biology Program and Department of Surgery, Children's Hospital, Harvard Medical School))로부터 기증받았다. 인간 양막 줄기 세포주는 웨이크 포레스트 대학(Wake Forest University)의 세이 소커(Shay Soker)의 실험실로부터 입수하였다. 인간 지방-유래 줄기 세포는 인디애나 대학(Indiana University)의 브라이언 존스톤(Brian Johnstone)의 실험실로부터 입수하였다. 세포를 5% CO2, 37℃ 인큐베이터에서, 론자로부터 입수한 EGM-2 불렛 키트 (#CC-3162; 론자 워커스빌, 인크.: 미국 메릴랜드주 워커스빌) 중, 히드로코르티손을 배제한, EGM-2, 20% 열 불활성화된 우태아 혈청, 1% GPS, 및 모든 성장 인자 중에서 성장시켰다. 세포를 실온에서 30분 동안 1% 인간 혈청 알부민 (HSA, 박스터 헬쓰케어 코포레이션(Baxter Healthcare Corp.: 미국 캘리포니아주 웨스트레이크 빌리지))을 함유하는 포스페이트 완충처리된 염수 (PBS) 중 1 mM GDP β-푸코스 (EMD 바이오사이언시즈(EMD Biosciences: 미국 캘리포니아주 샌디에고))로 106개의 세포/mL로, 및 앞서 최적화된 농도 100 mU/mL의 FT-VI, 또는 75 ㎍/mL의 FT-VII로 처리하였다. 비처리된 세포를 상기와 같이, 단, 효소 첨가 없이 인큐베이션시켰다. 푸코실화된 (시알릴 루이스 X (sLeX)-변형된) 형태의 P-셀렉틴 당단백질 리간드 (PSGL)-1 (CD162) (이는 또한 피부 림프구 항원 (CLA)으로도 공지됨)에 대해 반응하는 직접적으로 접합된 (FITC), 래트 IgM 항체인 HECA-452 항체 (BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences))를 사용하여 유세포 분석법에 의해 푸코실화 수준을 측정하였다. CD 항원에 대한 다른 항체도 또한 BD 바이오사이언시즈로부터 입수하였다.
하기의 실험들은 모두 반복 실험에서 거의 동일한 결과를 보이지 않는다면, 유사하게 반복될 수 있다.
도 1은 명시된 시점 동안 인큐베이션된 해동된 인간 제대혈로부터의 단핵 세포를 사용하여 수행된, 세포 표면 푸코실화 (%CLA-FITC)의 동역학적 성질에 대한 FTVI (10 ㎕ = 11 ㎍/mL) 대 FTVII (100 ㎕ =15 ㎍/mL, 200 ㎕ = 30 ㎍/mL 및 400 ㎕ = 60 ㎍/mL)의 비교 분석을 도시한 것이다.
실시예
2
도 2는 인간 중간엽 줄기 세포 (MSC)를 사용하여 수행된, 푸코실화 (%CLA-FITC)의 동역학적 성질에 대한 FTVI (11 및 1.1 ㎍) 대 FTVII (15 및 60 ㎍)의 비교 분석을 도시한 것이다. 실시예 1에 기술된 것과 동일한 조건을 사용하였다.
도 2는 100 ㎕ (15 ㎍) 및 400 ㎕ (60 ㎍)의 FTVII, 둘 모두 조기 시점 (15 min)에 중간엽 줄기 세포 (MSC)의 상당한 푸코실화를 달성할 수 있었다는 것을 보여주는 것으로서, 이는 10 ㎕ (11 ㎍)의 FTVI보다 FTVII가 CLA 부위를 푸코실화하고, 생성하는 데 더욱 큰 활성을 띤다는 것을 입증하는 것이다. 30분째까지 FTVII 대 FTVI의 차별적인 효과는 더 이상 관찰되지 않았다. 반복 실험 결과, 푸코실화가 MSC에 미치는 최대 효과는 두 이소폼의 FT 사이에 유의적인 차이가 없고, 최대 달성한 CLA 발현 퍼센트는 약 70% - 80%였다는 것을 입증한다.
도 3은 정제된 제대혈-유래 CD34+ 세포를 사용하여 수행된, 푸코실화 (%CLA-FITC)의 동역학적 성질에 대한 FTVI (11 및 1.1 ㎍) 대 FTVII (15 및 60 ㎍)의 비교 분석을 도시한 것이다. 실시예 1에 기술된 것과 동일한 조건을 사용하였다.
제대혈로부터 유래된 정제된 CD34+ 세포를 사용하였을 때, 도 3의 결과는 도 1에서 CB MNC 제제를 이용하여 관찰된 결과와 유사하다; 즉, 최대 푸코실화(%)는 10 ㎕ (11 ㎍)의 FTVI, 및 400 ㎕ (60 ㎍)의 FTVII을 통해 관찰되었고, 시간에 의존하는 방식으로 더 낮은 저농도의 각 FT에서 최대 효과를 달성하였다. 도 1의 MNC 제제에서의 같은 시점에서 관찰된 것 (30%)과 비교하였을 때, 더 낮은 저용량의 FTVII (100 ㎕, 15 ㎍)을 통해 15분이라는 조기 시점에서 그보다 더 높은 수준의 푸코실화 (70%)를 달성하였다.
도 4는 새로 배양된 신경 줄기 세포 (NSC)를 사용하여 수행된, 푸코실화 (%CLA-FITC)의 동역학적 성질에 대한 FTVI (33, 11 및 3.3 ㎍) 대 FTVII (15, 30 및 60 ㎍)의 비교 분석을 도시한 것이다. 실시예 1에 기술된 것과 동일한 조건을 사용하였다.
도 4의 결과는 정제된 신경 줄기 세포 (NSC) 집단의 푸코실화의 기준선 수준을 나타내지 않는다. 상기 도면은 또한 CD34+ 세포를 완전히 푸코실화시키는 10 ㎕ (11 ㎍)의 농도, 및 그 초과의 농도 (30 ㎕, 33 ㎍)에서의 FTVI은 푸코실화의 기준선 수준을 변경시킬 수 없다는 것을 나타낸다. 두 농도 (100 ㎕ 및 400 ㎕) 모두에서의 FTVII만이 오직 상기 세포를 푸코실화시킬 수 있었고, 15분이라는 가장 이른 조기 시점에서 최대 푸코실화를 달성하였다.
도 5 및 6은 인간 해동된 제대혈-유래 단핵 세포를 사용하여 수행된, 푸코실화의 동역학적 성질에 대한 FTVI (11 ㎍; 도 5) 대 FTVII (60 ㎍; 도 6)의 비교 분석을 도시한 것이다. 실시예 1에 기술된 것과 동일한 조건을 사용하였다.
상기 결과는 FTVI (도 5)이 제대혈로부터의 혼합된 세포 집단에서 오직 최상의 세포만 푸코실화시킬 수 있다는 것을 나타낸다. B 및 T 림프구 (CD3, CD4, CD19), 둘 모두는 CD34+, CD33+, 및 CD56 세포를 완전하게 푸코실화시키는 용량 (10 ㎕, 11 ㎍)의 FTVI과의 인큐베이션 이후에 단지 중간 정도로만 영향을 받았고; 유시하게, CD38+ 세포는 FTVI에 의해 오직 최소로만 푸코실화되었다. 그에 반해, 400 ㎕ (60 ㎍; 도 6)의 FTVII은 제대혈 단핵 세포 (MNC) 제제 중의 각종 림프구 서브집단을 비롯한, 조사된 모든 세포 유형에 대해 거의 100%에 달하는 푸코실화를 달성할 수 있었다.
실시예
3
도 7은 FTVI 처리 대 모의 처리가 인간 내피 전구 세포 (EPC)의 푸코실화에 미치는 효과에 관한 분석을 도시한 것이다. 실시예 1에 기술된 것과 동일한 조건을 사용하였다. 모든 세포를 FTVI을 이용한 생체외 처리에 의해 푸코실화시켰다.
도 8은 FTVI 처리가 인간 양막 줄기 세포의 푸코실화에 미치는 효과에 관한 분석을 도시한 것이다. 실시예 1에 기술된 것과 동일한 조건을 사용하되, 단, 예외적으로, 37℃에서의 인큐베이션 (청색 선) 또한 시험하였다.
도 9는 FTVI 처리가 인간 지방-유래 줄기 세포의 푸코실화에 미치는 효과에 관한 분석을 도시한 것이다. 실시예 1에 기술된 것과 동일한 조건을 사용하였다. 도면에 제시된 바와 같이, 90% 초과의 지방-유래 줄기 세포가 FTVI에 의해 푸코실화되었다.
실시예
4
본 실시예의 실험을 수행하여 동결보존 이후 중간엽 줄기 세포 (MSC)의 푸코실화의 안정성을 시험하였다. 동결된 분취량의 MSC를 론자 (론자 워커스빌, 인크.: 미국 메릴랜드주 워커스빌)로부터 입수하고, 해동시켰다. 세포를 세척하여 동결보호제를 제거한 후, 행크스 염기성 염 용액 (HBSS) + 1% 인간 혈청 알부민 (HSA) 중에 재현탁시켰다. 한 분취물을 대조군으로서 사용하였고, 나머지 다른 것들은 하기 방법에 따라 푸코실화시켰다: MSC를 함유하는 800 ㎕의 HBSS + 1% HSA 중의 MSC에 100 ㎕ HBSS + 1% HAS, 100 ㎕ GDP-푸코스 (10 mM 스톡), 및 10 ㎕의 FTVI을 첨가하여 반응을 개시시켰고, 이는 30분 경과 후, 세척함으로써 종결시켰다. 대조군 세포는 같은 프로토콜에 따라 진행하되, 단, 예외적으로, 효소는 첨가하지 않았다.
세포를 45분 동안 온화하게 혼합시키면서 실온에서 인큐베이션시킨 후, 원심분리에 의해 세척하였다. 생성된 펠릿을 HBSS + 1% HAS 중에 재현탁시켰다. 상기와 같은 CLA-FITC, 및 특히 MSC 세포 표면 마커로서의 항-CD73을 이용하여 FACS에 의해 분석하기 위해 분취량의 세포를 제거하였다. 프로피디움 아이오다이드를 사용하여 생존가능성에 대해 측정하였다.
남은 세포는 2 mL HBSS + 1% HSA를 첨가하여 세척하고, 하기 프로토콜에 따라 동결보존시켰다: (1) 펠릿화된 세포가 같은 부피 (0.5 mL)의 100% FBS 및 20% DMSO 중에 존재하였고; (2) 세포를 2시간 동안 -70℃ 냉동고에 놓고, 이어서, 액체 질소로 옮겨 놓았다.
다음날, 세포를 해동시키고, 원심분리에 의해 세척하고, 1.0 mL HBSS + 1% HSA 중에 재현탁시키고, 상기와 같이 유세포 분석법에 의해 검정하였다. 본 검정의 결과는 하기 표 1에 제시되어 있다.
알 수 있는 바와 같이, 비록 세포 생존가능성의 손실이 있기는 했지만, 푸코실화된 세포 퍼센트 및 MFI, 둘 모두에 있어서 푸코실화 수준은 동결보존 후에도 유지되었다.
<표 1>
실시예
5
트립신 처리 전후의 인간 MSC의 푸코실화의 효과를 비교하기 위하여 하기 실험을 수행하였다. 인간 MSC를 11일 동안 무혈청 배지 중에서 확장시키고, 6-웰 플레이트에 배치하고, 수일 동안에 걸쳐 부착될 수 있도록 놔두었다. 플레이트 1 - 3의 무혈청 배지는 명시된 배지로 교체해 주었고 (플레이트 1: 배지 + 10% FBS, 플레이트 2: 무혈청 배지, 플레이트 3: HBSS), 그 이후, 최대 푸코실화 및 MFI를 달성하는 것으로 알려진 조건하에서 세포를 TZ101에 노출시켰다. 플레이트 4로부터의 세포는 TZ101에의 노출 이전에 HBSS 중에 현탁시켜 %CLA-FITC의 발현 및 MFI를 최대 수준으로 수득하였다. 본 결과는 하기 표 2에 제시되어 있으며, 이는 별개의 두 웰로부터 얻은 값의 평균이다.
도 10에 제시된 바와 같이, 푸코실화 이전에 트립신 처리를 수행함으로써 임의 조건하의 부착 세포의 푸코실화보다 더 높은 MFI 값을 얻었다. HBSS 중의 세포의 푸코실화가 무혈청 배지 중의 세포의 푸코실화보다 더 높은 MFI를 얻었다.
<표 2>
실시예
6
MSC를 cGMP 조건하에서 성장시키고, 푸코실화시킨다. 기증자의 사전 동의서 작성 후, 장골능으로부터 15 mL의 골수를 수거한다. 골수를 105개의 유핵 세포/㎠로 8% 인간 혈소판 용해물 (밀 크리크 라이프 사이언시즈(Mill Creek Life Sciences: 미국 미네소타주 로체스터)로 보충된 300 mL의 배양 배지 (αMEM (라이프 테크놀러지즈(Life Technologies: 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드)) 중 2 레벨 셀스택(CellSTACK)® 배양 챔버 (1272 ㎠, 코닝(Corning: 미국 매사추세츠주 액턴)) 상에 시딩한다. 세포가 전면생장에 도달할 때까지 (P0의 종점) 전체 배지를 매주 2회에 걸쳐 새로 교체해준다. 이어서, 트립신 (하이클론(Hyclone))을 사용하여 세포를 분리하고, 생존가능한 세포를 계수하고, 세포를 103개의 세포/㎠로 5개의 2 레벨 셀스택® 배양 챔버 상에 다시 시딩한다. 2주 경과 후 (P1의 종점), 세포를 트립신 처리에 의해 분리하고, 생존가능한 세포를 계수하고, 프로세스를 2회 반복한다 (P2 및 P3).
P3 종료시, 세포를 트립신 처리에 의해 분리하고, 행크스 염기성 염 용액 (HBSS) + 1% 재조합 인간 혈청 알부민 (HSA) (인비트리아(InVitria: 미국 콜로라도주 포트 콜린스) 중에서 세척하고, HBSS + 1% HSA 중에 107/mL의 농도로 재현탁시킨다. 세포를 실온에서 30분 동안 재조합 FTVI (0.01 mg/mL) + 1 mM GDP-푸코스 (상기 둘 모두 공급원인 아메리카 스템 셀(America Stem Cell: 미국 캘리포니아주 샌디에고)로부터 입수)와 함께 인큐베이션시켜 푸코실화시키고, 세척하고, 동결보존시킨다.
동결보존을 위해, 플라스말라이트 A 중에서 107개의 세포/mL인 총 10 mL의 MSC를, 10% DMSO, 12% 펜타스타치, 및 8% 인간 혈청 알부민 (HSA)으로 이루어진 10 mL의 동결 믹스와 혼합하고, 맞춤형 20 mL FEP 크라이오백 (AFC 크라이오슈어 VP-20f(AFC Kryosure VP-20f), 미국 메릴랜드주 게이더스버그)으로 옮겨 놓는다. 속도 조절형 냉동고 (크라이오세이브(Kryosave), 크라이오 어소시에이츠(Cryo Associates: 미국 메릴랜드주 게이더스버그))를 이용하여 세포를 동결보존시키고, 액체 질소 탱크의 증기상에서 보관한다.
실시예
7
37℃ 및 6.5% CO2에서 20 x 106개의, 100 Gy-방사선 조사되고, 세척된 엡스타인-바 바이러스로 형질전환된 림프모구양 (EBV-LCL) 세포를 직립형 75 ㎠ 조직 배양 플라스크 중 10% 열 불활성화된 인간 AB 혈청 (게미니 바이오-프로덕츠(Gemini Bio-Products: 미국 캘리포니아주 웨스터 새크라멘토)), 500 IU/mL rhIL-2 (50 ng/mL, 테신(Tecin)™, 호프만-라 로슈 인크.(Hoffmann-La Roche Inc.: 미국 뉴저지주 너틀리)), 및 2 mM GlutaMAX-1 (인비트로겐: 미국 캘리포니아주 칼즈배드)로 보충된 15 mL의 X-VIVO 20 (론자 : 미국 메릴랜드주 워커스빌)에서 106개의 자기 비드-정제된 인간 자연 킬러 (hNK) 세포와 함께 공동 배양하였다. 5일 동안 배양한 후, 배양 배지의 절반을 교체하였다. 7일째를 출발로 하여, 14일 동안 매 24 - 72시간마다 IL-2를 함유하는 성장 배지를 이용하여 NK 세포를 0.6 x 106개의 세포/mL로 희석하였다.
하기 항-인간 모노클로날 항체: 항-CD56-APC (클론 B159), 항-CD16-FITC (클론 3G8), 항-CD3-PE (클론 UCHT1), 항-CD25-PE (클론 M-A251), 항-NKG2D-APC (클론 1D11), 항-CD244-PE (2B4, 클론 2 69), 항-CD48-FITC (클론 TUE145), 항-CD11a/LFA-1-PE (클론 G43-25B), 항-FasL-비오틴 (클론 NOK-1), 항-퍼포린-FITC (클론 δG9), CD158b-PE (KIR2DL2/3, 클론 CH-L) 및 항-CLA (HECA)-FITC 항체를 이용하여 FACS칼리버(FACSCalibur)™ 유세포 분석기 (BD 바이오사이언시즈: 미국 캘리포니아주 산호세) 상에서 유세포 분석법에 의해 NK 세포의 표현형을 분석하였고; 비아-프로브(Via-Probe)™ (BD 바이오사이언시즈: 미국 캘리포니아주 산호세) (7AAD)를 이용하여 세포 생존가능성을 측정하였다. BD 바이오사이언시즈의 사이토픽스/사이토펌(Cytofix/Cytoperm)™을 이용하여 투과되고, 고정된 세포에 대해 세포내 염색을 수행하였다. 상기 항체 및 시약은 BD 바이오사이언시즈 (미국 캘리포니아주 샌디에고)로부터 구입하였고, 제조사의 설명서에 따라 사용하였다. 항-그랜자임 A-FITC (클론 CB9), 항-그랜자임 B-PE (클론 GB11), 및 항-TRAIL-PE (클론 RIK-2)는 에이비캠 인크.(Abcam Inc.: 미국 매사추세츠주 케임브리지)로부터 구입하였다. 항-NKG2A-APC (CD94/CD159a, 클론 131411) 및 항-NKG2C-PE (CD94/CD159c, 클론 134591)는 R&D 시스템즈 (미국 미네소타주 미니애폴리스)로부터 구입하였다. 항-KIR3DL1-PE (클론 DX9)는 바이오레전드 인크. (미국 캘리포니아주 샌디에고)로부터 입수하였다. 세포를 또한 그의 상응하는 이소형-매칭 대조군 모노클로날 항체로 염색하였다.
도 11의 결과는 다양한 농도의 FTVI에 따른, TZ101과의 인큐베이션 이후의 인간 확장된 hNK 세포의 푸코실화 수준을 보여주는 것이다. 푸코실화를 달성한 세포의 최대 % (CLA-FITC와의 반응성으로 반영됨)는 조사된 최저 용량의 FTVI (5 ㎍/mL)에서 관찰된 반면, 최대 MFI는 20-25 ㎍/mL인 더 높은 고용량의 FTVI에서 달성되었다 (대조군의 MFI = 36, 5 ㎍/mL FTVI의 경우, MFI = 2,033, 10 ㎍/mL FTVI의 경우, MFI = 2,097, 15 ㎍/mL FTVI의 경우, MFI = 1,943, 20 ㎍/mL FTVI의 경우, MFI = 2,205, 및 25 ㎍/mL FTVI의 경우, MFI = 2,116). 본 실시예로부터의 다른 관찰 결과는 CD16 및 CD56 염색 수준이 안정적인 것으로 반영되는 바와 같이, 표현형에 있어서는 변화가 없었고, 검출가능한 수준의 L-셀렉틴은 거의 없었고, NK 세포 상에서 CD44 및 PSGL이 높은 기준선 수준으로 존재하였다는 것을 포함한다.
NK 세포의 E-셀렉틴에의 유체상 결합은 NK 세포의 TZ101과의 사전 인큐베이션에 의해 증강된다. 확장된 hNK 세포의 TZ101에 의한 전처리가 E-셀렉틴 키메라에의 유체상 결합에 미치는 효과를 조사하였다. 도 12는 E-셀렉틴의 NK 세포에의 결합에 미치는 FTVI의 용량-반응 효과를 도시한 것으로, 최대 결합은 25 ㎍/mL의 FTVI 용량에서 인큐베이션 이후에 달성되었으며, 이는 MFI 결과와 상관관계를 가진다. 따라서, 모든 추가 연구는 25 ㎍/mL의 FTVI을 사용하여 수행하였다.
푸코실화의 안정화는 실온에서의 인큐베이션 이후에 달성되었다. 도 13의 결과는 hNK 세포가 조직 배양물 (25 ㎍/mL의 FTVI 및 1 mM GDP-푸코스) 중에서 48시간 동안 인큐베이션된 이후에 그의 푸코실화 수준을 유지한다는 것을 보여주는 것이다. 추가로, 본 데이터는 NK 세포 상의 CD44가 푸코스의, 상기 세포 표면 당단백질을 데코레이팅하는 사당류인 siLeX 모이어티로의 효소 매개 전달에서 FTVI의 지배적인 작용 부위일 수 있다는 것을 입증한다.
NK 세포의 세포독성 효능은 푸코실화 이후 유지되었다. 도 14의 결과는 푸코실화된 hNK 세포가 대조군 세포 경우에서 관찰되는 것과 유사한 시험관내 세포독성 프로파일을 보인다는 것을 입증한다. 특히, IL-2에의 노출에 의해 미리 활성화된, 대조군 또는 TZ101-처리된 (10 ㎍/mL 또는 25 ㎍/mL FTVI) NK 세포의 인큐베이션은 K562 및 MM1S (다발성 골수종) 세포, 둘 모두에 대해 강력한 세포독성 효과를 보였다.
실시예
8
현행 우수 제조 관리 기준 (cGMP) 조건하에서 NK 세포를 제조하고, 푸코실화시킨다. FTVI을 비롯한, 사용된 모든 시약은 cGMP 등급이다. 12 - 24 x 106개의 자기 비드-정제된 NK 세포를 박스터 180 ㎠ 300 mL 백 (펜월 라이프셀(Fenwal Lifecell: 박스터 헬쓰케어 코포레이션: 미국 일리노이주 디어필드) 중 셀제닉스 인크.(CellGenix Inc.: 미국 뉴햄프셔주 포츠머스)로부터 입수한, rhIL-2를 함유하는 100 - 140 mL의 배지에서 120 - 240 x 106개의 방사선 조사된 EBV-TM-LCL 세포와 함께 조합한다. 배양 개시로부터 4 내지 5일 경과 후, 배지의 절반을 교체해 준다. 2일 후, IL-2를 함유하는 성장 배지를 사용하여 NK 세포의 농도를 106개의 세포/mL로 조정한다. 확장 세포를 계수하고, 28일째까지 매 24 - 72시간마다 희석시킨다. 세포 중 일부를 속도 조절형 냉동고를 이용하여 바이알당 20 - 50 x 106개의 세포/mL로 4% 인간 혈청 알부민 (HSA, 탈레크리스 바이오쎄라퓨틱스 인크.(Talecris Biotherapeutics, Inc.: 미국 노스캐롤라이나주 리서치 트라이앵글 파크), 6% 펜타스타치 (히폭시에틸스타치(Hypoxyethylstarch), NIH PDS), 10 ㎍/mL DNase I (풀모자임(Pulmozyme), 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.: 미국 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코), 15 U/mL 헤파린 (아브라시스 파마슈티컬 프로덕츠(Abraxis Pharmaceutical Products), 일리노이주), 및 5% DMSO로 보충된 플라스말라이트 A 배지 (박스터) 중에서 동결보존시킨 후, 액체 질소 탱크의 증기상으로 옮겨 놓는다. 2주 경과 후, X-VIVO 20, 10% 인간 AB 혈청, 4% HSA, 및 10 U/mL 헤파린을 함유하는 해동 매질를 사용하여 세포를 해동시킨다. 37℃에서 세포를 해동시키고, 10 mL의 해동 매질로 천천히 희석시키고, 세포 파괴를 막기 위하여 원심분리하기 전 1-2시간 동안 실온에서 방치한다. 해동 후 2시간 경과하였을 때, 7AAD 염색을 이용하여 생존가능한 세포를 게이팅하면서, 푸코실화 수준에 대해 해동된 세포를 시험한다. (MFI에 의해 측정된) 푸코실화 수준은 동결보존 이전에 관찰된 수준의 ±10%인 것으로 관찰되어야 한다.
실시예
9
조절 T 세포 (Tregs)를 제대혈 (CB)로부터 확장시켰다. 동결보존된 CB 유니트를 해동시키고, 0.5% HSA (박스터 헬쓰케어: 미국 캘리포니아주 웨스트레이크 빌리지)를 함유하는 클리니맥스 완충제 (밀테니 바이오테크 인크.: 독일 벨기쉬 글라디바흐) 중에서 세척하여 CB 단핵 세포 (MNC)를 수득하였다. 이어서, 제조사의 설명서 (밀테니 바이오테크 인크.: 독일 벨기쉬 글라디바흐)에 따라 자기 활성 세포 분류 (MACS)를 이용하여 CB MNC에 대해 CD25+ 세포를 강화시켰다. 양성으로 선택된 세포를 CD3/28 공동 발현 다이나비즈(Dynabeads)® (클린엑스비보(ClinExVivo)™ CD3/CD28, 인비트로겐 다이날 AS(Invitrogen Dynal AS: 노르웨이 오슬로))와 함께 세포 1개당 비드 3개의 비율로 공동 배양하고, 대기 중 5% CO2에서 37℃에서 조직 배양 플라스크 중 10% 인간 AB 혈청 (게미니 바이오-프로덕츠(Gemini Bio-Products: 미국 캘리포니아주 새크라멘토)), 2 mM L-글루타민 (시그마(Sigma: 미국 미주리주 세인트 루이스)), 1% 페니실린-스트렙토마이신 (기브코/인비트로겐(Gibco/Invitrogen: 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드))] 및 200 IU/mL 인터루킨 (IL)-2 (시론 코포레이션(CHIRON Corporation: 미국 캘리포니아주 에머리빌))으로 보충된 X-VIVO 15 배지 (캠브렉스 바이오사이언스(Cambrex BioScience: 미국 메릴랜드주 워커스빌))에 1 x 106개의 세포/mL로 재현탁시켰다.
매 48 - 72시간마다 새 배지 및 IL-2 (200 IU/mL 유지)를 첨가함으로써 CB-유래 CD25+ 강화된 T-세포를 1 x 106개의 세포/mL로 유지시켰다. 한 CB로부터 단리된 CD25+ 세포의 평균 개수는 0.78 x 106개였고; 2주 확장 후, 최대 400 x 106개의 Treg 세포를 수득할 수 있었다.
항체 HECA-452 (BD 바이오사이언시즈: 미국 캘리포니아주 산호세)를 이용하여 유세포 분석법에 의해 평가한 바, 푸코실화는 sLeX 잔기의 존재를 특징으로 하였다. CLA, CD4, CD127, 및 CD25 항체를 이용하는 유동 염색을 위해 세포 중 일부를 푸코실화 이전 및 그 이후에 제거하였다.
배양된 세포를 수거한 11일째에 확장된 Treg 세포의 생체외 푸코실화를 수행하고, PBS 1% HSA 중에서 세척하였다. 이어서, 세포를 가끔식 혼합해 주면서, 실온에서 30분 동안 TZ101 (10 ㎍/mL의 FTVI + 1 mM GDP-푸코스)과 함께 인큐베이션시킨 후, 세척하고, PBS 중에 재현탁시켰다. CLA, CD4, CD127, 및 CD25 항체를 이용하는 유동 염색을 위해 세포 중 일부를 푸코실화 이전 및 그 이후에 제거하였다. 결과는 도 15a에 제시되어 있으며, 이는 FTVI이 Treg 세포에서 푸코실화 수준을 8.8%에서 62%로 증가시켰다는 것을 입증한다. 추가로, 푸코실화된 Tregs는 시험관내에서 동종 혼합형 림프구 반응 (MLR)을 억제시킬 수 있었다 (도 15b).
실시예
10
모두 cGMP 조건하에서 조절 T 세포 (Tregs)를 제대혈 (CB)로부터 확장시킨 후, 푸코실화시킨다. 동결보존된 CB 유니트를 세척액으로서 10% 덱스트란 40/5% 인간 혈청 알부민을 사용하여 37℃ 멸균 염수 배쓰 중에서 해동시킨다. 면역자기 선별 이전에 MgCl2/rHuDNAse/시트르산 나트륨 칵테일을 사용하여 응집을 막는다. 직접적으로 접합된 항-CD25 자기 마이크로비드 (밀테니 바이오테크 인크.: 독일 벨기쉬 글라디바흐) 및 클리니맥스 장치 (밀테니)를 이용하는 양성 선별에 의해 CD25+ Treg 세포를 강화시킨다. 칼럼 선별 후, CD25+ 세포를 조직 배양 플라스크 (37℃/5% CO2) 중에서 10% 인간 AB 혈청, 열 불활성화된 L-글루타민 (2 mM; 발리 바이오메디칼 프로덕츠 앤드 서비시스, 인크.(Valley Biomedical Products and Services, Inc.: 미국 버지니아주 윈체스터)), 및 2.5 mL 페니실린/겐타마이신 (10 mg/mL)으로 보충된 X-VIVO 15 (캠브렉스 바이오사이언스: 미국 메릴랜드주 워커스빌) 중에 대략 1 x 106 세포/mL의 농도로 현탁시킨다. 생성된 집단을 유세포 분석법을 사용하여 순도에 대해 특징 규명한다. 이어서, 단리된 세포를 14 ± 1일 동안 항-CD3/항-CD28 모노클로날 항체 (mAb)-코팅된 다이나비즈 (인비트로겐)와 함께 3:1의 비드 대 세포의 비로 배양한다. 0일째, 배양물에 200 IU/mL IL-2 (프로류킨(Proleukin), 시론 코포레이션: 미국 캘리포니아주 에머리빌)를 보충한다. 수거할 때까지 14일 동안 매 48 - 72시간마다 분할함으로써 1.0 x 106개의 생존가능한 유핵 세포/mL의 농도로 세포를 유지시킨다. 국가출하승인(lot release) 기준을 통과하는 모든 생성물은 하기를 포함한다: 7AAD 생존가능성 ≥70%, CD4+CD25+ 순도 ≥60%, 10% 미만의 CD4-/CD8+ 세포, 항-CD3/항-CD28 mAB 비드 계수 < 100개/3 x 106개의 세포, '어떤 유기체'에 대해서도 그람 염색을 보이지 않음, 및 내독소 <5 EU/kg. cGMP 확장된 Tregs + GDP-푸코스에 대하여 최적인 것으로 밝혀진 농도 (1 mM)로 FTVI을 이용하여 실온에서 30분 동안 푸코실화를 수행한다. 세포 중 일부를 피루베이트 (0.02 mM), 페니실린 (100 U/mL), 스트렙토마이신 (100 mg/ mL), 20% 인간 풀링된 혈청 (HPS), 및 15% 디메틸술폭시드로 보충된 RPMI 1640 중에 현탁시키고, 속도 조절형 냉동고를 사용하여 동결보존시킨 후, 액체 질소 탱크의 증기상으로 옮겨 놓는다. 2주 경과 후, 세포를 37℃ 수조에서 빠르게 해동시키고, 사용 전 2회에 걸쳐 세척한다. 해동 후 2시간 경과하였을 때, 7AAD 염색을 이용하여 생존가능한 세포를 게이팅하면서, 푸코실화 수준에 대해 해동된 세포를 시험한다. (MFI에 의해 측정된) 푸코실화 수준은 동결보존 이전에 관찰된 수준의 ±10%인 것으로 관찰되어야 한다.
실시예
11
세포독성 T 세포를 HLA-A2에 결합하는 CG1 펩티드 (아미노산 서열 FLLPTGAEA; 서열식별번호(SEQ ID NO): 1)에 대하여 확장시켰다. 부착 및 면역자극에 의해 HLA-A*0201 건강항 기증자 단핵구로부터 수지상 세포 (DC)를 생성한 후, 같은 건강한 기증자로부터의 PBMC와 함께 공동 배양하였다. 37℃에서의 부착 단계 후, 현탁액 중에 남아있는 세포 (림프구)를 제거하고, 40 ㎍/mL의 CG1 펩티드로 펄싱한 후, 5일 동안 IL-7 (10 ng/mL) 및 IL-2 (10 ng/mL)로 자극시켰다. GM-CSF (100 ng/mL), IL-4 (50 ng/mL), 및 TNF-α (25 ng/mL)를 첨가하여 초기 단계로부터의 부착 세포를 단핵구-유래 DC로 성숙화시켰다. 5일 후, DC를 분리시키고, 40 ㎍/mL의 적절한 펩티드로 펄싱한 후, 이어서, 자가림프구 집단 중 나머지와 조합하였다. 이어서, 공동 배양물을 7일 동안 IL-7 (10 ng/mL) 및 IL-2 (25 ng/mL)로 재자극시켜 CTL이 증식할 수 있도록 하였다. 12일째, 세포를 수거하고, 덱스트라머 염색 및 시험관내 세포독성 검정법에 의해 분석하여 CTL 확장 및 특이성을 확인하였다. 이어서, 세포를 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켜 TZ102 (1 mM GDP-푸코스 + 75 ㎍/mL FTVII)로 푸코실화시킨 후 세척하거나 ("FTVII 처리"), 또는 FTVII 효소의 부재하에서 모의 인큐베이션시켰다 ("비처리"). HECA-452 항체 (BD 바이오사이언시즈) 자가림프구 집단을 사용하여 유세포 분석법을 수행함으로써 푸코실화 수준을 측정하였다. 이어서, 공동 배양물을 7일 동안 IL-7 (10 ng/mL) 및 IL-2 (25 ng/mL)로 재자극시켜 CTL이 증식할 수 있도록 하였다. 12일째, 세포를 수거하고, 덱스트라머 염색 및 시험관내 세포독성 검정법에 의해 분석하여 CTL 확장 및 특이성을 확인하였다. 이어서, 세포를 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켜 TZ102 (1 mM GDP-푸코스 + 75 ㎍/mL FTVII)로 푸코실화시킨 후 세척하거나 ("FTVII 처리"), 또는 FTVII 효소의 부재하에서 모의 인큐베이션시켰다 ("비처리"). 항-CLA-FITC (HECA-452) 항체 (BD 바이오사이언시즈)를 사용하여 유세포 분석법을 수행함으로써 푸코실화 수준을 측정하였다. 도 16에서 알 수 있는 바와 같이, TZ102 처리에 의해 거의 100%의 세포가 푸코실화되었다.
실시예
12
실시예 11에 기술된 방법을 사용하여 세포독성 T 세포를 cGMP 조건하에서 제조하고, 푸코실화시킨다. CG1 펩티드 및 FTVII를 포함하는 모든 시약은 cGMP 등급이다. 실시예 11에 기술된 바와 같이 항-CLA-FITC를 사용하여 푸코실화 수준을 측정한다. 세포 중 일부를 피루베이트 (0.02 mM), 페니실린 (100 U/mL), 스트렙토마이신 (100 mg/mL), 20% 인간 풀링된 혈청 (HPS), 및 15% 디메틸술폭시드로 보충된 RPMI 1640에 현탁시키고, 속도 조절형 냉동고를 사용하여 동결보존시킨 후, 액체 질소 탱크의 증기상으로 옮겨 놓는다. 2주 경과 후, 세포를 37℃ 수조에서 빠르게 해동시키고, 사용 전 2회에 걸쳐 세척한다. 해동 후 2시간 경과하였을 때, 7AAD 염색을 이용하여 생존가능한 세포를 게이팅하면서, 푸코실화 수준에 대해 해동된 세포를 시험한다. MFI에 의해 측정된 푸코실화 수준은 동결보존 이전에 관찰된 수준의 ±10%인 것으로 관찰되어야 한다.
비록 본 개시된 및/또는 청구된 발명의 개념(들) 및 그의 이점을 상세하게 기술하기는 하였지만, 본 개시내용에서 정의된 바와 같은 본 개시된 및/또는 청구된 발명의 개념(들)의 정신 및 범주로부터 벗어남 없이 본원에서 다양한 변형, 치환 및 변경이 이루어질 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 또한, 본 출원의 범주는 본 명세서에 기술된 프로세스, 물질 조성물, 수단, 방법 및 단계의 특정, 비제한적인 실시양태로 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 본 개시된 및/또는 청구된 발명의 개념(들), 프로세스, 물질 조성물, 수단, 방법, 또는 단계에 관한 개시내용으로부터 쉽게 이해할 수 있는 바와 같이, 본원에 기술된 상응하는 실시양태와 실질적으로 동일한 기능을 수행하거나, 또는 실질적으로 동일한 결과를 달성하는, 현존하는 또는 추후 개발되는 것도 본 개시된 및/또는 청구된 발명의 개념(들)에 따라 사용될 수 있다. 따라서, 본 개시된 및/또는 청구된 발명의 개념(들)은 상기 모든 프로세스, 물질 조성물, 수단, 방법, 또는 단계를 그의 범주 내에 포함하는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Targazyme, Inc.
<120> MANUFACTURE AND CRYOPRESERVATION OF FUCOSYLATED CELLS FOR
THERAPEUTIC USE
<130> 1001.043wo
<150> 62/021,328
<151> 2014-07-07
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Phe Leu Leu Pro Thr Gly Ala Glu Ala
1 5
Claims (19)
- 치료용 세포를 단리시키는 단계;
치료용 세포를 유효량의 α1,3-푸코실트랜스퍼라제 및 푸코스 도너와 접촉시킴으로써 그를 푸코실화시키는 단계;
푸코실화된 치료용 세포와 생리학상 평형 염 용액, 적어도 하나의 투과성 동결보호제, 및 적어도 하나의 비-투과성 동결보호제를 포함하는 치료용 세포 동결보존 조성물을 혼합하여 혼합물을 형성하는 단계;
혼합물을 약 1℃/분 내지 약 2℃/분 범위의 속도로 약 -70℃ 내지 약 -80℃ 범위의 온도로 냉각시킴으로써 동결시켜 동결된 세포 현탁액을 제조하고, 동결된 세포 현탁액을 옮겨 액체 질소 존재하에서 보관하는 단계이며, 여기서 상기 "약"이라는 표현은 상기 온도 값으로부터 섭씨 온도(℃)를 기준으로 ±10%로 정의되는 것인 단계; 및
해동시 푸코실화된 치료용 세포를 동결보존하기 전에 존재하던 푸코실화 수준의 90% 내지 110%의 푸코실화 수준을 유지하는 단계를 포함하는,
푸코실화된 치료용 세포를 동결보존시키는 방법. - 치료용 세포를 단리시키는 단계;
치료용 세포를 확장시키는 단계;
치료용 세포를 유효량의 α1,3-푸코실트랜스퍼라제 및 푸코스 도너와 접촉시킴으로써 그를 푸코실화시키는 단계;
푸코실화된 치료용 세포와 생리학상 평형 염 용액, 적어도 하나의 투과성 동결보호제, 및 적어도 하나의 비-투과성 동결보호제를 포함하는 치료용 세포 동결보존 조성물을 혼합하여 혼합물을 형성하는 단계;
혼합물을 약 1℃/분 내지 약 2℃/분 범위의 속도로 약 -70℃ 내지 약 -80℃ 범위의 온도로 냉각시킴으로써 동결시켜 동결된 세포 현탁액을 제조하고, 동결된 세포 현탁액을 옮겨 액체 질소 존재하에서 보관하는 단계이며, 여기서 상기 "약"이라는 표현은 상기 온도 값으로부터 섭씨 온도(℃)를 기준으로 ±10%로 정의되는 것인 단계; 및
해동시 푸코실화된 치료용 세포를 동결보존하기 전에 존재하던 푸코실화 수준의 90% 내지 110%의 푸코실화 수준을 유지하는 단계를 포함하는,
푸코실화된 치료용 세포를 동결보존시키는 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 하나의 투과성 동결보호제가 디메틸 술폭시드, 글리세롤, 수크로스, 에틸렌 글리콜, 1,2-프로판디올 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 적어도 하나의 비-투과성 동결보호제가 히드록시에틸 전분, 알부민, 수크로스, 트레할로스, 덱스트로스, 폴리비닐 피롤리돈 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
- 제2항에 있어서, 치료용 세포를 확장시키는 단계가 현행 우수 제조 관리 기준 (cGMP) 조건하에서 치료용 세포를 확장시키는 단계로서 추가로 정의되는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, α1,3-푸코실트랜스퍼라제가 α1,3-푸코실트랜스퍼라제 III, α1,3-푸코실트랜스퍼라제 IV, α1,3-푸코실트랜스퍼라제 V, α1,3-푸코실트랜스퍼라제 VI, α1,3-푸코실트랜스퍼라제 VII, α1,3-푸코실트랜스퍼라제 IX, α1,3-푸코실트랜스퍼라제 X, α1,3-푸코실트랜스퍼라제 XI, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 푸코스 도너가 GDP-푸코스인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 치료용 세포가 골수, 제대혈, 제대, 와튼 젤리(Wharton's jelly), 말초 혈액, 림프성 조직, 자궁내막, 영양막-유래 조직, 태반, 양수, 지방 조직, 근육, 간, 연골, 신경 조직, 심장 조직, 치수 조직, 탈락 치아, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 단리된 조직으로부터 단리된 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 단리된 치료용 세포가 분화된 배아 줄기 세포 및 분화된 유도 만능 줄기 세포 중 적어도 하나인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 단리된 치료용 세포가 조혈 줄기 세포, 면역 세포, 중간엽 줄기 세포, 근육 세포, 양막 세포, 자궁내막 세포, 신경 줄기 세포, 자연 킬러 (NK) 세포, T 세포, B 세포, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, α1,3-푸코실트랜스퍼라제가 α1,3-푸코실트랜스퍼라제 VII이고, 푸코스 도너가 GDP-푸코스이고, 단리된 치료용 세포가 T 세포, NK 세포, B 세포, 신경 줄기 세포, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제2항에 있어서, 생리학상 평형 염 용액이, 세포가 확장되는 조직 배양 배지인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 생리학상 평형 염 용액이 단백질을 함유하는 것인 방법.
- 제12항에 있어서, 단백질이 우태아 혈청, 말 혈청, 인간 혈청, 인간 혈소판 용해물, 소 알부민, 인간 알부민, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 하나의 투과성 동결보호제가 디메틸 술폭시드이고, 적어도 하나의 비-투과성 동결보호제가 혈청, 알부민, 또는 혈청 및 알부민인 방법.
- 제14항에 있어서, 생리학상 평형 염 용액이 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트 (RPMI) 1640 배지, 행크스 염기성 염 용액 (HBSS), 알파 최소 필수 배지 (α MEM), 이스코브스 변형 둘베코스 배지 (IMDM), 및 플라스말라이트 (PlasmaLyte) 용액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제14항에 있어서, 생리학상 평형 염 용액이 둘베코스 최소 필수 배지 (DMEM)인 방법.
- 제15항에 있어서, 치료용 세포 동결보존 조성물이 플라스말라이트 A, 디메틸 술폭시드, 인간 혈청 알부민 (HSA), 및 펜타스타치를 포함하는 것인 방법.
- 제15항에 있어서, 치료용 세포 동결보존 조성물이 RPMI 1640 배지, 디메틸술폭시드, 인간 풀링된 혈청 (HPS) 및 피루베이트를 포함하는 것인 방법.
- 제18항에 있어서, 치료용 세포 동결보존 조성물이 페니실린 및 스트렙토마이신을 추가로 포함하는 것인 방법.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201462021328P | 2014-07-07 | 2014-07-07 | |
US62/021,328 | 2014-07-07 | ||
PCT/US2015/039370 WO2016007506A1 (en) | 2014-07-07 | 2015-07-07 | Manufacture and cryopreservation of fucosylated cells for therapeutic use |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20170041204A KR20170041204A (ko) | 2017-04-14 |
KR102505009B1 true KR102505009B1 (ko) | 2023-03-03 |
Family
ID=55064767
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020177003350A KR102505009B1 (ko) | 2014-07-07 | 2015-07-07 | 치료 용도를 위한 푸코실화된 세포의 제조 및 동결보존 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US20170121673A1 (ko) |
EP (1) | EP3167046A4 (ko) |
JP (2) | JP2017525340A (ko) |
KR (1) | KR102505009B1 (ko) |
CN (2) | CN114540266A (ko) |
AU (2) | AU2015288052B2 (ko) |
CA (1) | CA2954534C (ko) |
SG (1) | SG11201610699XA (ko) |
WO (1) | WO2016007506A1 (ko) |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7332334B2 (en) | 2003-04-18 | 2008-02-19 | Oklahoma Medical Research Foundation | Hematopoietic stem cells treated by in vitro fucosylation and methods of use |
US20140161782A1 (en) | 2008-06-09 | 2014-06-12 | Targazyme, Inc. | Augmentation of cell therapy efficacy including treatment with alpha 1-3 fucoslytransferase |
AU2013204922B2 (en) | 2012-12-20 | 2015-05-14 | Celgene Corporation | Chimeric antigen receptors |
CA2907397C (en) | 2013-03-15 | 2022-11-22 | Anthrogenesis Corporation | Modified t lymphocytes |
WO2016007506A1 (en) * | 2014-07-07 | 2016-01-14 | Targazyme, Inc. | Manufacture and cryopreservation of fucosylated cells for therapeutic use |
CA3202385A1 (en) * | 2014-12-30 | 2016-07-07 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Methods to improve cell therapy |
AU2018227801B2 (en) * | 2017-02-28 | 2024-02-22 | Research Institute At Nationwide Children's Hospital | PM21 particles to improve bone marrow homing of NK cells |
CN108617638B (zh) * | 2017-03-22 | 2020-01-24 | 拜西欧斯(北京)生物技术有限公司 | 组织和/或细胞冻存保护液及其制备与应用 |
CN108925548A (zh) * | 2017-05-24 | 2018-12-04 | 西比曼生物科技(香港)有限公司 | 一种冻存细胞制剂及细胞复苏方式 |
CN107012119B (zh) * | 2017-05-31 | 2020-03-17 | 东莞市保莱生物科技有限公司 | 一种从骨髓中提取免疫细胞的方法 |
CN108404219B (zh) * | 2018-02-11 | 2020-09-29 | 华中科技大学 | 一种基于冷冻铸造技术的小口径人工血管及其制备方法 |
AU2019226392A1 (en) * | 2018-03-01 | 2020-09-24 | Fundación Para La Investigación Biomédica Del Hospital Gregorio Marañón | Method for obtaining regulatory T cells derived from thymic tissue and use of said cells as cell immunotherapy in immune system disorders |
US20210163868A1 (en) * | 2018-05-22 | 2021-06-03 | Nantkwest, Inc. | Methods and systems for cell bed formation during bioprocessing |
JP7072147B2 (ja) * | 2018-09-13 | 2022-05-20 | 極東製薬工業株式会社 | 間葉系幹細胞の凍害保護液とその利用 |
US20220288121A1 (en) * | 2019-08-29 | 2022-09-15 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Cell cryopreservation medium |
KR20220119611A (ko) * | 2019-11-29 | 2022-08-30 | 주식회사 엔케이맥스 | 천연 살해 세포의 제조 방법 및 이의 조성물 |
US20210317414A1 (en) * | 2020-04-14 | 2021-10-14 | Tzu Chi University | Methods for mobilizing stem cells |
CN112913832A (zh) * | 2021-01-27 | 2021-06-08 | 河南省华隆生物技术有限公司 | 一种滋养层细胞的保存方法 |
JPWO2022210514A1 (ko) | 2021-03-30 | 2022-10-06 | ||
CN113151163A (zh) * | 2021-04-23 | 2021-07-23 | 优牙生物科技(上海)有限公司 | 一种使用牙髓干细胞制剂修复子宫内膜损伤的方法 |
CN113396894A (zh) * | 2021-07-06 | 2021-09-17 | 南方医科大学南方医院 | 适用于单位毛囊保存的复合冻存液及其制备方法和应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20110091434A1 (en) * | 2008-06-09 | 2011-04-21 | America Stem Cell, Inc. | Augmentation of cell therapy efficacy including treatment with alpha 1-3 fucosyltransferase |
Family Cites Families (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5789147A (en) | 1994-12-05 | 1998-08-04 | New York Blood Center, Inc. | Method for concentrating white cells from whole blood by adding a red cell sedimentation reagent to whole anticoagulated blood |
AU2730497A (en) * | 1996-04-17 | 1997-11-07 | Case Western Reserve University | Cryopreservation and extensive subculturing of human mesenchymal stem cells |
US6399337B1 (en) | 1997-06-06 | 2002-06-04 | The Governors Of The University Of Alberta | α1,3-fucosyltransferase |
WO2000014199A2 (en) | 1998-09-03 | 2000-03-16 | Cummings Richard D | Fucosyltransferases, polynucleotides encoding fucosyltransferases, and transgenic mammals incorporating same |
US20060210558A1 (en) | 2000-10-18 | 2006-09-21 | Robert Sackstein | Hematopoietic cell selectin ligand polypeptides and methods of use thereof |
CA2431901A1 (en) * | 2000-12-14 | 2002-06-20 | The University Of British Columbia | Crystal structures of retaining glycosyltransferases |
JP4223961B2 (ja) * | 2002-01-31 | 2009-02-12 | Agcテクノグラス株式会社 | 霊長類胚性幹細胞の凍結保存方法 |
US7332334B2 (en) * | 2003-04-18 | 2008-02-19 | Oklahoma Medical Research Foundation | Hematopoietic stem cells treated by in vitro fucosylation and methods of use |
WO2005017115A2 (en) * | 2003-08-11 | 2005-02-24 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Cord blood-derived hematopoietic progenitor cells |
US8137928B2 (en) * | 2005-03-24 | 2012-03-20 | BioGeneriX | Expression of soluble, active eukaryotic glycosyltransferases in prokaryotic organisms |
JP2008539796A (ja) * | 2005-05-20 | 2008-11-20 | バイレクシス コーポレイション | 初代細胞の形質導入 |
JP2009534034A (ja) * | 2006-04-19 | 2009-09-24 | ノヴォ ノルディスク アクティーゼルスカブ | 原核微生物におけるo−グリコシル化治療用タンパク質の発現 |
AU2007254777B2 (en) * | 2006-06-02 | 2014-02-20 | Robert Sackstein | Compositions and methods for modifying cell surface glycans |
JPWO2009020201A1 (ja) * | 2007-08-08 | 2010-11-04 | 協和発酵キリン株式会社 | 単離された細胞集団 |
JP5615509B2 (ja) * | 2009-03-31 | 2014-10-29 | 北海道公立大学法人 札幌医科大学 | フコシル化糖鎖産生細胞用物質送達担体 |
ES2661074T3 (es) * | 2009-06-02 | 2018-03-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Células deficientes de fucosilación |
US20100311036A1 (en) * | 2009-06-09 | 2010-12-09 | University Of South Carolina | Methods for Augmentation of Cell Cryopreservation |
CA2773240C (en) * | 2009-09-22 | 2015-11-10 | Volker Sandig | Process for producing molecules containing specialized glycan structures |
EP2507627A2 (en) * | 2009-12-04 | 2012-10-10 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Antennary fucosylation in glycoproteins from cho cells |
CN102648708B (zh) * | 2011-02-25 | 2014-08-13 | 深圳华大方舟生物技术有限公司 | 一种用于胚胎或细胞的冷冻液及其用途 |
WO2016007506A1 (en) * | 2014-07-07 | 2016-01-14 | Targazyme, Inc. | Manufacture and cryopreservation of fucosylated cells for therapeutic use |
-
2015
- 2015-07-07 WO PCT/US2015/039370 patent/WO2016007506A1/en active Application Filing
- 2015-07-07 EP EP15819508.1A patent/EP3167046A4/en active Pending
- 2015-07-07 JP JP2016576062A patent/JP2017525340A/ja active Pending
- 2015-07-07 US US15/322,565 patent/US20170121673A1/en not_active Abandoned
- 2015-07-07 CN CN202210090681.XA patent/CN114540266A/zh active Pending
- 2015-07-07 CA CA2954534A patent/CA2954534C/en active Active
- 2015-07-07 CN CN201580036891.9A patent/CN106687581A/zh active Pending
- 2015-07-07 SG SG11201610699XA patent/SG11201610699XA/en unknown
- 2015-07-07 KR KR1020177003350A patent/KR102505009B1/ko active IP Right Grant
- 2015-07-07 AU AU2015288052A patent/AU2015288052B2/en active Active
-
2018
- 2018-10-03 US US16/150,681 patent/US20190062694A1/en not_active Abandoned
-
2022
- 2022-02-07 JP JP2022017513A patent/JP2022065029A/ja active Pending
- 2022-03-09 AU AU2022201639A patent/AU2022201639A1/en not_active Abandoned
- 2022-08-01 US US17/816,616 patent/US20230014609A1/en active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20110091434A1 (en) * | 2008-06-09 | 2011-04-21 | America Stem Cell, Inc. | Augmentation of cell therapy efficacy including treatment with alpha 1-3 fucosyltransferase |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20230014609A1 (en) | 2023-01-19 |
AU2015288052B2 (en) | 2021-12-16 |
CA2954534C (en) | 2023-04-04 |
KR20170041204A (ko) | 2017-04-14 |
JP2017525340A (ja) | 2017-09-07 |
WO2016007506A1 (en) | 2016-01-14 |
CA2954534A1 (en) | 2016-01-14 |
AU2015288052A1 (en) | 2017-02-02 |
SG11201610699XA (en) | 2017-01-27 |
AU2022201639A1 (en) | 2022-03-31 |
EP3167046A1 (en) | 2017-05-17 |
CN106687581A (zh) | 2017-05-17 |
US20190062694A1 (en) | 2019-02-28 |
US20170121673A1 (en) | 2017-05-04 |
JP2022065029A (ja) | 2022-04-26 |
CN114540266A (zh) | 2022-05-27 |
EP3167046A4 (en) | 2017-12-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20230014609A1 (en) | Manufacture and cryopreservation of fucosylated cells for therapeutic use | |
Bieback et al. | Clinical protocols for the isolation and expansion of mesenchymal stromal cells | |
RU2756561C2 (ru) | Среда для формирования колоний и её применение | |
CA2668330A1 (en) | Mixed cell populations for tissue repair and separation technique for cell processing | |
US8900573B2 (en) | Immune privileged and modulatory progenitor cells | |
JP2006525013A (ja) | 血液幹細胞の数の増幅のための装置および方法 | |
JP2022084665A (ja) | 脂肪由来幹細胞に基づく幹細胞治療 | |
US20230277599A1 (en) | Methods of Preserving Mesenchymal Stem Cells | |
JP2017165757A (ja) | 間葉系間質細胞集団およびそれを作成する方法 | |
US20140205582A1 (en) | Megakaryocyte progenitor cells for production of platelets | |
Haylock et al. | Expansion of umbilical cord blood for clinical transplantation | |
AU2012255112A1 (en) | Mesenchymal stromal cell populations and methods of making same | |
JP5745419B2 (ja) | 細胞、核酸構築物、前記構築物を含む細胞、及び疾患の治療において前記細胞を利用する方法 | |
US11162074B2 (en) | Xeno-free generation of tissue-specific progenitor cells | |
Taghizadeh | Perinatal mesenchymal stem cell banking for umbilical cord blood transplantation and regenerative medicine | |
Hosing et al. | Mesenchymal stromal cells and umbilical cord blood transplantation |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A201 | Request for examination | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
AMND | Amendment | ||
E601 | Decision to refuse application | ||
AMND | Amendment | ||
X701 | Decision to grant (after re-examination) |