CN113151163A - 一种使用牙髓干细胞制剂修复子宫内膜损伤的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种使用牙髓干细胞制剂修复子宫内膜损伤的方法，包括以下步骤：步骤一、牙髓干细胞的制备；使用酶消化法进行细胞原代培养，在超净工作台中，从预冷的培养基中取出牙齿，用含2％青霉素/链霉素的PBS反复冲洗三次，加入含10％FBS的完全培养基，从牙齿中取出牙髓组织并剪碎牙髓组织，将剪碎后的牙髓组织置于牙髓干细胞培养基中，离心800rpm5min，然后去掉上清液，得到牙髓组织液，向牙髓组织液中添加Ⅰ型胶原酶；本发明将PF127溶液与牙髓干细胞结合，在低温状态下，此复合物为液体状，方便注射，而在室温下，此复合物成胶状，可在子宫腔局部持续发挥作用，副反应小，有效浓度高。
Description
技术领域
本发明属于子宫内膜损伤修复技术领域，具体涉及一种使用牙髓干细胞制剂修复子宫内膜损伤的方法。
背景技术
宫腔粘连(IUA)指子宫内膜基底层损伤后、功能层再生修复障碍、纤维瘢痕组织形成导致宫腔部分或完全封闭，主要表现为月经稀发、闭经、月经量减少、不孕、反复流产等。导致IUA的原因中约90％是由于宫腔操作所致，包括自然流产清宫、人工流产术及产后清宫。在辅助生殖技术中因为宫腔粘连会导致胚胎着床率低下、反复种植失败。宫腔粘连目前临床一线治疗仍采用宫腔镜手术分离粘连，术后结合雌激素治疗以刺激内膜增生，但因内膜基底层损坏严重、内膜再生功能障碍，最终预后差，患者很难获得妊娠。严重宫腔粘连的病人因目前的治疗效果差，为了解决生育问题，不少患者选择“黑诊所”或去国外找人“代孕”，不仅给患者带来了巨大的心理、经济压力，也不利于社会秩序的维护。如何抑制子宫内膜纤维化、促进子宫内膜再生，成为众多临床医生需要解决的难题。目前虽然临床应用诸多种类的药物如芬吗通、阿司匹林、西地那非等，以改善患者子宫内膜的厚度和血流量，改善患者妊娠结局，但效果甚微。干细胞疗法是21世纪的热点研究领域，为这类患者带来了希望。已有许多种类的干细胞被证实与子宫内膜更新再生相关，可被应用于子宫内膜损伤修复，如骨髓源性干细胞(bone marrow-derived stemcells，BMDSCs、脐带间充质干细胞(human umbilicalcord-derived mesenchymal stemcells，UC-MSCs)、经血干细胞(menstrual blood-derived脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)、人胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hESCs)等。其中骨髓源性干细胞、脂肪干细、经血干细胞、脐带间充质干细胞等已经单独或联合生物材料支架用于临床试验，获得了积极成果，目前尚无牙髓干细胞用于治疗宫腔粘的报道。
现有干细胞治疗宫腔粘连存在以下问题：
骨髓源性干细胞：从骨髓中分离的干细胞具有多向分化能力，可在适宜条件下诱导分化为目的细胞。骨髓源性干细胞参与了人子宫内膜的修复再生过程，在人体内可以分化为子宫内膜间质细胞及腺上皮细胞。但骨髓采集风险较大，抽血及回输操作会对患者造成一定的感染风险，并且不利于反复操作。
经血干细胞：从女性月经中分离出来的成体干细胞，表达干性标记物OCT-4和阶段特异性表面抗原3/4(SSEA-3/4)，具有多向分化能力，因获取过程无创，而被广泛应用于基础研究。但对于严重宫腔粘连的患者，其月经量极少甚至闭经，经血干细胞数量极少，难以培养成功，这是在临床应用中需要考虑的问题。而异体源性经血干细胞需考虑临床应用安全性及伦理学问题。
脂肪干细胞：需通过抽脂获得患者的脂肪干组织，可能造成感染、皮肤疤痕等风险。且有限的临床试验证实经过脂肪干细胞治疗后患者子宫内膜厚度增加，但妊娠率并没有明显提升。
脐带间充质干细胞：其获取过程容易，体外培养技术成熟，被广泛应用于细胞实验及动物实验中。有限的临床数据提示脐带间充质干细胞治疗可改善宫腔粘连患者的妊娠结局。但由于其异体性来源，脐带间充质干细胞的临床应用存在争议。
因宫腔为开放性器官，子宫通过宫颈与阴道相通，单纯给予细胞悬液注射入宫腔时，细胞悬液容易快速从宫腔流出，从而极大的降低其治疗效果；经血管给药，无法保证细胞定植于子宫局部。因此干细胞治疗宫腔粘连时，宜选择一个载体，干细胞在其中能增殖、迁移，从而使干细胞能在宫腔持续发挥作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种使用牙髓干细胞制剂修复子宫内膜损伤的方法，以解决上述背景技术中提出的髓采集风险较大，抽血及回输操作会对患者造成一定的感染风险，不利于反复操作的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种使用牙髓干细胞制剂修复子宫内膜损伤的方法，包括以下步骤：
步骤一、牙髓干细胞的制备；
使用酶消化法进行细胞原代培养，在超净工作台中，从预冷的培养基中取出牙齿，用含2％青霉素/链霉素的PBS反复冲洗三次，加入含10％FBS的完全培养基，从牙齿中取出牙髓组织并剪碎牙髓组织，将剪碎后的牙髓组织置于牙髓干细胞培养基中，离心800rpm5min，然后去掉上清液，得到牙髓组织液，向牙髓组织液中添加Ⅰ型胶原酶，混匀后，并在37℃孵育lOmin消化，向消化后的牙髓组织液中继续添加牙髓干细胞培养基，并提纯得到牙髓干细胞单细胞悬液，移入培养瓶，使组织尽量均匀分布于瓶底，定期换液，得到牙髓干细胞。
步骤二、PF127溶液的制备；
将PF127与牙髓干细胞培养基(α-modifified Eagle’s medium(α-MEM，Gibco，USA)+20％fetal bovine serum(FBS，Gibco，USA)+100U/ml+penicillin+100μg/mlstreptomycin(Gibco，USA))按20％(W/V)混合，4℃摇床过夜，等待其充分融化后，使用Thermo ScientificTMNalgeneTM25mm过滤；过滤操作时需要在无菌操作台操作，装PF127溶液的试管需要一直放置在冰块中，以免形成凝胶，从而导致无法过滤；过滤时速度需快，操作时间不得超过2分钟，过滤液4摄氏度保存备用；
步骤三、传代至P6的细胞生长密度达到80％～90％时即可进行细胞悬液的制备；
按照细胞传代步骤操作制备细胞悬液；将细胞悬液置于15mL离心管中，取100ul的液体进行细胞计数，其余液体按1000rpm，离心5min；去掉上清；将过滤后的20％PF127溶液与干细胞按1X10^7个细胞/ml制备；悬混液制好后现配现用；若暂不使用干细胞，需将干细胞冷冻保存。
优选的，PF127(Pluronic F127)是FDA批准的聚合物，PF127溶液在不同温度下呈现出不同状态，在37℃呈现为凝胶状态，0度呈现为液体状态。
优选的，PF127扫描电镜下观察见凝胶表面呈现为多孔的网络状结构，并且细胞能够在凝胶状态下增殖、迁移。
优选的，PF127能够完全降解，基本降解时间为7天-15天左右；通过细胞实验证实，牙髓干细胞在PF127凝胶中可存活增殖。
优选的，PF127可换成PF127-HP凝胶，或将稀释PF127的溶液换用分化培养基(2％FBS+1％双抗+DMEM/F12+1×10-7mol/Lβ-雌二醇+10ng/m1TGF-β+10ng/m1EGF+1Ong/m1PDGF-BB)。
与现有技术相比，本发明提供了一种使用牙髓干细胞制剂修复子宫内膜损伤的方法，具备以下有益效果：
1、本发明将PF127溶液与牙髓干细胞结合，在低温状态下，此复合物为液体状，方便注射，而在室温下，此复合物成胶状，可在子宫腔局部持续发挥作用，副反应小，有效浓度高；
2、本发明通过动物实验，发现牙髓干细胞可促进大鼠子宫内膜修复；并发现牙髓干细胞与PF127以5X10^6个细胞/ml和1X10^7个细胞/ml的浓度配置时，宫腔粘连副反应小，治疗效果最好。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：一种使用牙髓干细胞制剂修复子宫内膜损伤的方法，包括以下步骤：
步骤一、牙髓干细胞的制备；
使用酶消化法进行细胞原代培养，在超净工作台中，从预冷的培养基中取出牙齿，用含2％青霉素/链霉素的PBS反复冲洗三次，加入含10％FBS的完全培养基，从牙齿中取出牙髓组织并剪碎牙髓组织，将剪碎后的牙髓组织置于牙髓干细胞培养基中，离心800rpm5min，然后去掉上清液，得到牙髓组织液，向牙髓组织液中添加Ⅰ型胶原酶，混匀后，并在37℃孵育lOmin消化，向消化后的牙髓组织液中继续添加牙髓干细胞培养基，并提纯得到牙髓干细胞单细胞悬液，移入培养瓶，使组织尽量均匀分布于瓶底，定期换液，得到牙髓干细胞。
步骤二、PF127溶液的制备；
将PF127与牙髓干细胞培养基(α-modifified Eagle’s medium(α-MEM，Gibco，USA)+20％fetal bovine serum(FBS，Gibco，USA)+100U/ml+penicillin+100μg/mlstreptomycin(Gibco，USA))按20％(W/V)混合，4℃摇床过夜，等待其充分融化后，使用Thermo ScientificTMNalgeneTM25mm过滤；过滤操作时需要在无菌操作台操作，装PF127溶液的试管需要一直放置在冰块中，以免形成凝胶，从而导致无法过滤；过滤时速度需快，操作时间不得超过2分钟，过滤液4摄氏度保存备用；
步骤三、传代至P6的细胞生长密度达到80％～90％时即可进行细胞悬液的制备；
按照细胞传代步骤操作制备细胞悬液；将细胞悬液置于15mL离心管中，取100ul的液体进行细胞计数，其余液体按1000rpm，离心5min；去掉上清；将过滤后的20％PF127溶液与干细胞按1X10^7个细胞/ml制备；悬混液制好后现配现用；若暂不使用干细胞，需将干细胞冷冻保存。
本发明中，优选的，PF127(Pluronic F127)是FDA批准的聚合物，PF127溶液在不同温度下呈现出不同状态，在37℃呈现为凝胶状态，0度呈现为液体状态。
本发明中，优选的，PF127扫描电镜下观察见凝胶表面呈现为多孔的网络状结构，并且细胞能够在凝胶状态下增殖、迁移。
本发明中，优选的，PF127能够完全降解，基本降解时间为7天-15天左右；通过细胞实验证实，牙髓干细胞在PF127凝胶中可存活增殖。
本发明中，优选的，PF127可换成PF127-HP凝胶，或将稀释PF127的溶液换用分化培养基(2％FBS+1％双抗+DMEM/F12+1×10-7mol/Lβ-雌二醇+10ng/m1TGF-β+10ng/m1EGF+1Ong/m1PDGF-BB)。
表一：牙髓干细胞在PF127凝胶中培养不同时间后行CCK8实验
| 培养时间 | 24小时 | 48小时 | 72小时 |
| 吸光度 | 2.05 | 2.238 | 3.112 |
随着时间的正常，行CCK8检查，其吸光度逐渐增加，提示牙髓干细胞可在PF127凝胶中增殖；
表二：不同浓度干细胞悬混治疗效果
正常组5只大鼠无一例发生梗阻，模型组大鼠梗阻发生率100％(10/10),当干细胞浓度为5X10^6/ml及1X10^7/ml时，宫腔梗阻发生率最低，为30％(3/10)。
表三：不同组别子宫内膜厚度
| 组别 | 子宫内膜厚度(um) |
| 1.25X10^6/ml | 521±109 |
| 2.5X10^6/ml | 615±142 |
| 5X10^6/ml | 668±150 |
| 1X10^7/ml | 683±143 |
| 2X10^7/ml | 719±113 |
| 正常组 | 690±116 |
| 模型组 | 522±75 |
每只大鼠子宫注射200ul，按不同浓度给药，发现随着干细胞浓度的增加，子宫内膜厚度增加。
20％PF127状态随温度变化而变化，液体状态的20％PF127在37℃5分钟环境下会变成凝胶状态的20％PF127。
给予5X10^6/ml每只大鼠子宫角注射200ul15天后大鼠子宫的变化。模型组造模段发生粘连，上段宫腔积液，干细胞组无明显宫腔积液。
大鼠宫腔粘连造模后当天给予不同浓度牙髓干细胞悬混按每子宫200ul注射后15天，大鼠子宫横切面，牙髓干细胞浓度为1x10^7/ml时，子宫内膜上皮修复效果优于其浓度为5X10^6/ml。
牙髓干细胞与骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stemcells,BMSCs)有相似的免疫表型，其起源于外胚层神经嵴细胞,具有间充质干细胞的特性,在一定的诱导条件下,能够跨胚层分化为多种组织类型的细胞，前期研究结果提示，人牙髓干细胞使用不表达ck18，但与人子宫内膜基质细胞在分化培养基中共培养后，可以表达子宫内膜上皮表面标记物CK18，提示牙髓干细胞有分化成子宫内膜上皮细胞潜能；
牙髓干细胞极易获取和培养，可以从患者智齿、乳牙和被拔掉的牙中获得牙髓干细胞，不会给患者带来额外的痛苦，因而，从理论上来讲，牙髓干细胞也是再生医学中可以考虑使用的一种有一定应用前景的细胞来，且其为自体干细胞，移植后无免疫排斥，副反应极小，干细胞存活率可能更高，治疗持续时间可能更长，其效果可能更好；
PF127(Pluronic F127)是FDA批准的聚合物，PF127溶液在不同温度下呈现出不同状态，在37℃呈现为凝胶状态，0度呈现为液体状态，PF127扫描电镜下观察见凝胶表面呈现为多孔的网络状结构，并且细胞能够在凝胶状态下增殖、迁移，另外PF127能够完全降解，基本降解时间为7天-15天左右，通过细胞实验证实，牙髓干细胞在PF127凝胶中可存活增殖【见表一】；
本专利将PF127溶液与牙髓干细胞结合，在低温状态下，此复合物为液体状，方便注射，而在室温下，此复合物成胶状，可在子宫腔局部持续发挥作用，副反应小，有效浓度高；
同时我们通过动物实验，发现牙髓干细胞可促进大鼠子宫内膜修复；并发现牙髓干细胞与PF127以5X10^6个细胞/ml和1X10^7个细胞/ml的浓度配置时，宫腔粘连副反应小，治疗效果最好【表二、表三】。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (5)
1.一种使用牙髓干细胞制剂修复子宫内膜损伤的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、牙髓干细胞的制备；
使用酶消化法进行细胞原代培养，在超净工作台中，从预冷的培养基中取出牙齿，用含2％青霉素/链霉素的PBS反复冲洗三次，加入含10％FBS的完全培养基，从牙齿中取出牙髓组织并剪碎牙髓组织，将剪碎后的牙髓组织置于牙髓干细胞培养基中，离心800rpm5min，然后去掉上清液，得到牙髓组织液，向牙髓组织液中添加Ⅰ型胶原酶，混匀后，并在37℃孵育lOmin消化，向消化后的牙髓组织液中继续添加牙髓干细胞培养基，并提纯得到牙髓干细胞单细胞悬液，移入培养瓶，使组织尽量均匀分布于瓶底，定期换液，得到牙髓干细胞。
步骤二、PF127溶液的制备；
将PF127与牙髓干细胞培养基(α-modififiedEagle’smedium(α-MEM，Gibco，USA)+20％fetal bovine serum(FBS，Gibco，USA)+100U/ml+penicillin+100μg/ml streptomycin(Gibco，USA))按20％(W/V)混合，4℃摇床过夜，等待其充分融化后，使用ThermoScientificTMNalgeneTM25mm过滤；过滤操作时需要在无菌操作台操作，装PF127溶液的试管需要一直放置在冰块中，以免形成凝胶，从而导致无法过滤；过滤时速度需快，操作时间不得超过2分钟，过滤液4摄氏度保存备用；
步骤三、传代至P6的细胞生长密度达到80％～90％时即可进行细胞悬液的制备；
按照细胞传代步骤操作制备细胞悬液；将细胞悬液置于15mL离心管中，取100ul的液体进行细胞计数，其余液体按1000rpm，离心5min；去掉上清；将过滤后的20％PF127溶液与干细胞按1X10^7个细胞/ml制备；悬混液制好后现配现用；若暂不使用干细胞，需将干细胞冷冻保存。
2.根据权利要求1所述的一种使用牙髓干细胞制剂修复子宫内膜损伤的方法，其特征在于：PF127(Pluronic F127)是FDA批准的聚合物，PF127溶液在不同温度下呈现出不同状态，在37℃呈现为凝胶状态，0度呈现为液体状态。
3.根据权利要求1所述的一种使用牙髓干细胞制剂修复子宫内膜损伤的方法，其特征在于：PF127扫描电镜下观察见凝胶表面呈现为多孔的网络状结构，并且细胞能够在凝胶状态下增殖、迁移。
4.根据权利要求1所述的一种使用牙髓干细胞制剂修复子宫内膜损伤的方法，其特征在于：PF127能够完全降解，基本降解时间为7天-15天左右；通过细胞实验证实，牙髓干细胞在PF127凝胶中可存活增殖。
5.根据权利要求1所述的一种使用牙髓干细胞制剂修复子宫内膜损伤的方法，其特征在于：PF127可换成PF127-HP凝胶，或将稀释PF127的溶液换用分化培养基(2％FBS+1％双抗+DMEM/F12+1×10-7mol/Lβ-雌二醇+10ng/m1TGF-β+10ng/m1EGF+1Ong/m1PDGF-BB)。
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