CN112587550B - 使用干细胞治疗宫腔粘连的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用干细胞治疗宫腔粘连的方法。该方法中涉及到一种细胞制剂，其中包含羊膜间充质干细胞和药用溶媒。所述药用溶媒是水；该细胞制剂是供注射方式使用的制剂。所述羊膜间充质干细胞是经传代培养至1～20代的细胞，所述羊膜间充质干细胞的浓度为(1～8)×106个/ml，其中还包含氯化钠，例如其浓度为7～10mg/ml。该细胞制剂是照包括如下步骤的方法制备得到的：将氯化钠等药用辅料用适量水溶解，得到盐水溶液；将传代培养所得间充质干细胞转移至离心管中离心，弃上清，加盐水溶液使细胞重悬，制得细胞制剂。本发明还涉及所述细胞制剂在制备用于治疗宫腔粘连的药物中的用途。本发明的方法、细胞制剂和制药用途使用羊膜间充质干细胞的细胞制剂治疗宫腔粘连，促进子宫内膜修复，呈现如说明书所述优异技术效果。

Description

使用干细胞治疗宫腔粘连的方法
技术领域
本发明属于干细胞治疗技术领域，涉及从人羊膜制备羊膜间充质干细胞的方法，还涉及由该方法制备获得的羊膜间充质干细胞，以及它们的治疗用途。具体涉及的治疗用途是使用干细胞治疗宫腔粘连，促进子宫内膜修复的细胞制剂。尤其是涉及使用羊膜间充质干细胞配制成的制剂，将其用于治疗宫腔粘连的用途。
背景技术
宫腔粘连(intrauterine adhesions，IUA)又称Asherman综合征，是严重危害女性身心健康的临床常见疾病之一。任何形式的宫腔内手术操作，感染等均可引起的子宫内膜损伤，进而导致子宫内膜粘连和纤维化，宫腔部分或全部闭塞，表现为月经稀发、闭经、反复流产、不孕症等一系列临床症候。文献报道。我国不孕症的发病率6～15％，其中包括着床障碍等宫腔环境因素占全部病因学的15～31％，且有上升趋势。如何预防，逆转，修复子宫内膜损伤，是治疗宫腔粘连的关键因素。
现有的治疗手段局限，治疗效果差复发率高。临床治疗措施主要是基于粘连松解术后刺激子宫内膜再生，以及防治术后再粘连。包括雌激素疗法、宫腔内球囊、可吸收防粘连物质置放、羊膜宫腔移植等等。雌激素可刺激子宫内膜再生，加速祼露区的上皮化，覆盖子宫创面，防止新的粘连形成。因此，粘连松解术后联合使用雌激素成为主要的治疗手段，是公认的最佳治疗方案。但治疗后有效率不足30％，且复发率超过23.5％，其中20.0％～62.5％为重度粘连。因此，研究开发安全、有效的新的临床治疗方案一直是该领域的热点和难点问题。
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有自我复制和多向分化潜能的成体干细胞，在再生医学领域发挥着非常广泛的作用。MSCs具有多向分化潜能、抑制炎症、归巢能力、免疫原性低、来源广泛、易于分离、培养扩增和无伦理学限制等优势，成为再生医学理想的细胞来源。近年来，国内外初步研究结果显示，MSCs能修复受损子宫内膜，改善其功能，并恢复部分生育能力，为宫腔粘连的治疗提供了新的治疗策略，为IUA患者带来新的希望。
干细胞是再生医学发展的基础，其有效的应用是实现人类健康长寿、防癌抗衰、永保年轻状态、持续提高生活质量等终极梦想的有效方法。近年来，胚胎干细胞与成体干细胞在细胞生物学以及再生医学研究领域倍受重视。然而，尽管胚胎干细胞具有其他细胞无法企及的全能性，但致瘤性、同种异体移植后的免疫排斥性以及无法避免的伦理争议等因素在很大程度上限制了其在临床的应用，而成体干细胞在组织中含量较少，缺乏特异性的表面标志的特点也成为其临床应用的桎梏。
由于干细胞的多项分化潜能及其分泌多种细胞因子的功能，备受研究者的青睐。近年来，干细胞在组织损伤与修复中的应用越来越广泛，而干细胞的来源一直是人们关注的焦点。骨髓间充质干细胞是较早被认识的成体干细胞之一。但由于抽取骨髓给患者带来痛苦，而且骨髓干细胞的含量极少，使大量获得受到限制。其他来源如脂肪组织，皮肤组织等都需取材于人体自体或异体组织，也不易取材或可能涉及伦理问题。
人羊膜来源于人胎盘组织，无血管、神经及淋巴，具有一定的弹性，厚0.02-0.5mm，在电镜下，其分为5层：上皮层、基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层。羊膜属于孕妇生产后的废弃物，一个胎盘的羊膜面积大约有600cm2，而且羊膜易于从胎盘上剥离，所以因羊膜具有取材方便，原料充足的特点而被认为是目前间充质干细胞的最佳来源之一。
人羊膜为半透明的薄膜，有多种促进细胞增殖的营养成分。羊膜基底膜和羊膜基质层含有大量不同的胶元，主要为Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型胶原和纤维粘连蛋白、层粘连蛋白等成分。新鲜羊膜能产生一些生长因子，如：碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子和转化生长因子β等。目前，正在研究利用羊膜干细胞治疗多种疾病，包括神经系统疾病、心肌梗死、肌萎缩症、糖尿病及肝纤维化等。有研究表明羊膜间充质干细胞通过有高的血管生成能力和移植成活力，能促进糖尿病大鼠伤口的愈合。
人羊膜来源的干细胞包括人羊膜上皮细胞(humanamnioticepithelialcells，hAEC)和人羊膜间充质干细胞(humanamnioticmes-enchymalstromalcells，hAMSC)，它们均能够表达多种胚胎干细胞标记物，并且均具有较全面的多向分化潜能。
已有研究发现，培养的人羊膜间充质干细胞除表达神经干细胞的特异性标志蛋白nestin外，还表达干细胞特异性转录因子八聚体连接蛋白4(octamer-binding protein4，Oct-4)，且表达能力比骨髓间充质干细胞更强。近来报道证实了其有向三胚层细胞分化的潜能：外胚层(神经)、中胚层(骨骼肌、心肌、内皮等)、内胚层(胰腺、肝)。有研究表明，培养3～4周后得到大量的贴壁间充质干细胞，形态学类似于骨髓间充质干细胞，且其比骨髓来源的MSCs具有更强的增殖能力。试验中流式细胞仪检测的结果符合以上结论，说明羊膜细胞具有与间充质干细胞相似的表面标志。在体外至少可以传到第15代而保持其形态不变。
现有技术已公开了诸多制备人羊膜间充质干细胞的方法，例如CN106754674B(中国专利号ZL2016111295528)，其全部内容通过引用并入本文。
利用围产组织来源的间充质干细胞，尤其是羊膜来源的间充质干细胞，制备一种干细胞制剂，在粘连松解术后，通过子宫内膜进行肌肉注射间充质干细胞制剂，促进子宫内膜再生修复，治疗宫腔粘连，仍然是本领域技术人员迫切期待的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种围产组织来源的间充质干细胞，尤其是羊膜来源的间充质干细胞，制备成的干细胞制剂，在粘连松解术后，通过子宫内膜进行肌肉注射间充质干细胞制剂，促进子宫内膜再生修复，治疗宫腔粘连。已经出人意料地发现，使用本发明的干细胞制剂治疗宫腔粘连呈现令人满意的效果。本发明基于此类发现而得以完成。
为此，本发明第一方面提供了一种细胞制剂，其中包含羊膜间充质干细胞和药用溶媒。
根据本发明第一方面所述的细胞制剂，其中所述羊膜间充质干细胞是通过包括如下步骤的方法制备得到的：
(1)从胎盘样品采集盒中取出胎盘，置于白瓷盘中，使用基础平衡盐溶液反复冲洗表面，对胎盘进行消毒处理；
(2)用手术镊慢慢撕取胎膜外层羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基础平衡盐溶液反复清洗表面污血，剪碎成直径为5mm的羊膜组织小块；用300目滤网过滤，生理盐水冲洗残血，组织块转移至50ml离心管；
(3)组织消化：在37℃恒温摇床中，将组织块用1倍组织体积的混合酶消化液以100rpm振荡消化30～60min；消化结束后，加2ml胎牛血清混匀终止；用200目滤网过滤并用大量生理盐水清洗，收集滤液；
(4)分别对滤液部分和组织块部分进行细胞培养：
滤液部分：收集的滤液以1500rpm离心5min，去上清，用生理盐水重悬清洗细胞沉淀；以1500rpm离心5min，去上清，将细胞沉淀用完全培养基重悬；计数仪计取有核细胞数并用台盼兰染色测定细胞活率；以每瓶2×106个细胞接种于75cm2培养瓶中，添加20ml完全培养基，晃匀后在5％CO2、37℃培养箱中培养；定期换液；培养10～15天(通常可以是12天左右)后传代至P1代，继续用完全培养基培养；
组织块部分：将收集的组织块置于75cm2培养瓶中，使组织块能够覆盖培养瓶中一半的培养面积，添加完全培养基没过组织，晃匀后于5％CO2、37℃培养箱中培养；2d后补液10ml完全培养基，继续培养；较多间充质干细胞爬出后去组织，定期换液；培养10～15天(通常可以是12天左右)后传代至P1代，继续用完全培养基培养；
(5)P1代细胞收获：用胰酶消化液将上一步骤中的两部分合并后的P1代细胞消化后，收集细胞，计数并测定细胞活率，冻存，即得P1代的羊膜间充质干细胞，完成从P0代至P1代的细胞传代；依次重复上述从P0代到P1代的传代操作以分别进行P1代至P2代、P2代至P3代直至P15代的细胞传代，得到P1代至P15代的羊膜间充质干细胞。
根据本发明第一方面所述的细胞制剂，制备所述羊膜间充质干细胞的步骤中，所述基础平衡盐溶液中包括链霉素和青霉素两种抗生素。
根据本发明第一方面所述的细胞制剂，制备所述羊膜间充质干细胞的步骤中，所述基础平衡盐溶液是通过如下方式配制得到的：将0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的链霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液。
根据本发明第一方面所述的细胞制剂，制备所述羊膜间充质干细胞的步骤中，所述混合酶消化液中包含：0.1mg/ml的I型胶原酶，0.3mg/ml的II型胶原酶，0.1mg/ml的透明质酸酶和0.05mg/ml的中性蛋白酶。
根据本发明第一方面所述的细胞制剂，制备所述羊膜间充质干细胞的步骤中，所述完全培养基包括：DMEM-F12培养基、FBS、青霉素、链霉素。
根据本发明第一方面所述的细胞制剂，制备所述羊膜间充质干细胞的步骤中，所述DMEM-F12培养基是DMEM-F12以体积比1：1配制的培养基。
根据本发明第一方面所述的细胞制剂，制备所述羊膜间充质干细胞的步骤中，所述完全培养基包括：DMEM-F12(1：1)培养基、10％FBS、100μg/mL青霉素、50μg/mL链霉素。在一个实施方案中，所述的完全培养基中还添加了0.01～0.05％(例如0.01～0.04％、例如0.01～0.03％)硝酸硫胺和0.05～0.1％(例如0.06～0.1％、例如0.07～0.1％)麦芽糖。已经出人意料地发现，向培养基中添加微量的硝酸硫胺和麦芽糖两者后，可以显著地提高人羊膜间充质干细胞的产量，而不使用它们二者或者仅增添其中之一时无法获得这种效果。
根据本发明第一方面所述的细胞制剂，制备所述羊膜间充质干细胞的步骤中，步骤(4)中，通常是培养10～15天(通常可以是12天左右)后传代至P1代。
根据本发明第一方面所述的细胞制剂，制备所述羊膜间充质干细胞的步骤中，步骤(5)中，胰酶消化液是包括0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液。
根据本发明第一方面所述的细胞制剂，其中所述羊膜间充质干细胞是通过包括如下步骤的方法制备得到的：
(1)从胎盘样品采集盒中取出胎盘，置于白瓷盘中，使用基础平衡盐溶液反复冲洗表面，对胎盘进行消毒处理；
(2)用手术镊慢慢撕取胎膜外层羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基础平衡盐溶液反复清洗表面污血，剪碎成直径为5mm的羊膜组织小块；用300目滤网过滤，生理盐水冲洗残血，组织块转移至50ml离心管；
(3)组织消化：在37℃恒温摇床中，将组织块用1倍组织体积的混合酶消化液以100rpm振荡消化30～60min；消化结束后，加2ml胎牛血清混匀终止；用200目滤网过滤并用大量生理盐水清洗，收集滤液；
(4)分别对滤液部分和组织块部分进行细胞培养：
滤液部分：收集的滤液以1500rpm离心5min，去上清，用生理盐水重悬清洗细胞沉淀；以1500rpm离心5min，去上清，将细胞沉淀用完全培养基重悬；计数仪计取有核细胞数并用台盼兰染色测定细胞活率；以每瓶2×106个细胞接种于75cm2培养瓶中，添加20ml完全培养基，晃匀后在5％CO2、37℃培养箱中培养；定期换液；培养10～15天后传代至P1代，继续用完全培养基培养；所述完全培养基包括：DMEM-F12培养基、10％FBS、100μg/mL青霉素、50μg/mL链霉素、0.01～0.05％硝酸硫胺、0.05～0.1％麦芽糖，所述DMEM-F12培养基是DMEM-F12以体积比1：1配制的培养基；
组织块部分：将收集的组织块置于75cm2培养瓶中，使组织块能够覆盖培养瓶中一半的培养面积，添加完全培养基没过组织，晃匀后于5％CO2、37℃培养箱中培养；2d后补液10ml完全培养基，继续培养；较多间充质干细胞爬出后去组织，定期换液；培养10～15天后传代至P1代，继续用完全培养基培养；
(5)P1代细胞收获：用胰酶消化液将上一步骤中的两部分合并后的P1代细胞消化后，收集细胞，计数并测定细胞活率，冻存，即得P1代的羊膜间充质干细胞，完成从P0代至P1代的细胞传代；依次重复上述从P0代到P1代的传代操作以分别进行P1代至P2代、P2代至P3代直至P15代的细胞传代，得到P1代至P15代的羊膜间充质干细胞。
根据本发明第一方面所述的细胞制剂，制备所述羊膜间充质干细胞的步骤中，所述基础平衡盐溶液是通过如下方式配制得到的：将0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的链霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液。
根据本发明第一方面所述的细胞制剂，制备所述羊膜间充质干细胞的步骤中，所述混合酶消化液中包含：0.1mg/ml的I型胶原酶，0.3mg/ml的II型胶原酶，0.1mg/ml的透明质酸酶和0.05mg/ml的中性蛋白酶。
根据本发明第一方面所述的细胞制剂，制备所述羊膜间充质干细胞的步骤中，步骤(5)中，胰酶消化液是包括0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液。
根据本发明第一方面所述的细胞制剂，其中所述药用溶媒是水。
根据本发明第一方面所述的细胞制剂，其是供注射方式使用的制剂。
根据本发明第一方面所述的细胞制剂，其中所述羊膜间充质干细胞是经传代培养至1～20代的细胞，例如是经传代培养至1～15代的细胞，例如是经传代培养至1～12代的细胞。
根据本发明第一方面所述的细胞制剂，其中所述羊膜间充质干细胞的浓度为(1～8)×106个/ml。
根据本发明第一方面所述的细胞制剂，其中所述羊膜间充质干细胞的浓度为(1.5～6)×106个/ml。
根据本发明第一方面所述的细胞制剂，其中所述羊膜间充质干细胞的浓度为(2～4)×106个/ml。
根据本发明第一方面所述的细胞制剂，其中还包含氯化钠。
根据本发明第一方面所述的细胞制剂，其中还包含氯化钠，其浓度为7～10mg/ml。
根据本发明第一方面所述的细胞制剂，其中还包含氯化钠，其浓度为7.5～9.5mg/ml。
根据本发明第一方面所述的细胞制剂，其中还包含氯化钠，其浓度为8～9mg/ml。
根据本发明第一方面所述的细胞制剂，其中还包含泛酸钙。
根据本发明第一方面所述的细胞制剂，其中还包含泛酸钙，其浓度为0.5～5mg/ml。
根据本发明第一方面所述的细胞制剂，其中还包含泛酸钙，其浓度为1～4mg/ml。
根据本发明第一方面所述的细胞制剂，其中还包含泛酸钙，其浓度为1.5～3.5mg/ml。
根据本发明第一方面所述的细胞制剂，其中还包含鸟氨酸。
根据本发明第一方面所述的细胞制剂，其中还包含鸟氨酸，其浓度为5～35mg/ml。
根据本发明第一方面所述的细胞制剂，其中还包含鸟氨酸，其浓度为10～30mg/ml。
根据本发明第一方面所述的细胞制剂，其中还包含鸟氨酸，其浓度为15～25mg/ml。
根据本发明第一方面所述的细胞制剂，其具有如本发明实施例任一项所述配方。
在本发明中，氯化钠、泛酸钙、鸟氨酸等均可称为药用辅料。
根据本发明第一方面所述的细胞制剂，其是照包括如下步骤的方法制备得到的：将氯化钠等药用辅料用适量水溶解，得到盐水溶液；将传代培养所得间充质干细胞转移至离心管中离心(例如2000rpm离心5min)，弃上清，加盐水溶液使细胞重悬，制得细胞制剂。
根据本发明第一方面所述的细胞制剂，其是用于治疗宫腔粘连的细胞制剂。
进一步的，本发明第二方面涉及细胞制剂在制备用于治疗宫腔粘连的药物中的用途，所述细胞制剂中包含羊膜间充质干细胞和药用溶媒。
根据本发明第二方面所述的用途，其中所述羊膜间充质干细胞是通过包括如下步骤的方法制备得到的：
(1)从胎盘样品采集盒中取出胎盘，置于白瓷盘中，使用基础平衡盐溶液反复冲洗表面，对胎盘进行消毒处理；
(2)用手术镊慢慢撕取胎膜外层羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基础平衡盐溶液反复清洗表面污血，剪碎成直径为5mm的羊膜组织小块；用300目滤网过滤，生理盐水冲洗残血，组织块转移至50ml离心管；
(3)组织消化：在37℃恒温摇床中，将组织块用1倍组织体积的混合酶消化液以100rpm振荡消化30～60min；消化结束后，加2ml胎牛血清混匀终止；用200目滤网过滤并用大量生理盐水清洗，收集滤液；
(4)分别对滤液部分和组织块部分进行细胞培养：
滤液部分：收集的滤液以1500rpm离心5min，去上清，用生理盐水重悬清洗细胞沉淀；以1500rpm离心5min，去上清，将细胞沉淀用完全培养基重悬；计数仪计取有核细胞数并用台盼兰染色测定细胞活率；以每瓶2×106个细胞接种于75cm2培养瓶中，添加20ml完全培养基，晃匀后在5％CO2、37℃培养箱中培养；定期换液；培养10～15天(通常可以是12天左右)后传代至P1代，继续用完全培养基培养；
组织块部分：将收集的组织块置于75cm2培养瓶中，使组织块能够覆盖培养瓶中一半的培养面积，添加完全培养基没过组织，晃匀后于5％CO2、37℃培养箱中培养；2d后补液10ml完全培养基，继续培养；较多间充质干细胞爬出后去组织，定期换液；培养10～15天(通常可以是12天左右)后传代至P1代，继续用完全培养基培养；
(5)P1代细胞收获：用胰酶消化液将上一步骤中的两部分合并后的P1代细胞消化后，收集细胞，计数并测定细胞活率，冻存，即得P1代的羊膜间充质干细胞，完成从P0代至P1代的细胞传代；依次重复上述从P0代到P1代的传代操作以分别进行P1代至P2代、P2代至P3代直至P15代的细胞传代，得到P1代至P15代的羊膜间充质干细胞。
根据本发明第二方面所述的用途，制备所述羊膜间充质干细胞的步骤中，所述基础平衡盐溶液中包括链霉素和青霉素两种抗生素。
根据本发明第二方面所述的用途，制备所述羊膜间充质干细胞的步骤中，所述基础平衡盐溶液是通过如下方式配制得到的：将0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的链霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液。
根据本发明第二方面所述的用途，制备所述羊膜间充质干细胞的步骤中，所述混合酶消化液中包含：0.1mg/ml的I型胶原酶，0.3mg/ml的II型胶原酶，0.1mg/ml的透明质酸酶和0.05mg/ml的中性蛋白酶。
根据本发明第二方面所述的用途，制备所述羊膜间充质干细胞的步骤中，所述完全培养基包括：DMEM-F12培养基、FBS、青霉素、链霉素。
根据本发明第二方面所述的用途，制备所述羊膜间充质干细胞的步骤中，所述DMEM-F12培养基是DMEM-F12以体积比1：1配制的培养基。
根据本发明第二方面所述的用途，制备所述羊膜间充质干细胞的步骤中，所述完全培养基包括：DMEM-F12(1：1)培养基、10％FBS、100μg/mL青霉素、50μg/mL链霉素。在一个实施方案中，所述的完全培养基中还添加了0.01～0.05％(例如0.01～0.04％、例如0.01～0.03％)硝酸硫胺和0.05～0.1％(例如0.06～0.1％、例如0.07～0.1％)麦芽糖。已经出人意料地发现，向培养基中添加微量的硝酸硫胺和麦芽糖两者后，可以显著地提高人羊膜间充质干细胞的产量，而不使用它们二者或者仅增添其中之一时无法获得这种效果。
根据本发明第二方面所述的用途，制备所述羊膜间充质干细胞的步骤中，步骤(4)中，通常是培养10～15天(通常可以是12天左右)后传代至P1代。
根据本发明第二方面所述的用途，制备所述羊膜间充质干细胞的步骤中，步骤(5)中，胰酶消化液是包括0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液。
根据本发明第二方面所述的用途，其中所述羊膜间充质干细胞是通过包括如下步骤的方法制备得到的：
(1)从胎盘样品采集盒中取出胎盘，置于白瓷盘中，使用基础平衡盐溶液反复冲洗表面，对胎盘进行消毒处理；
(2)用手术镊慢慢撕取胎膜外层羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基础平衡盐溶液反复清洗表面污血，剪碎成直径为5mm的羊膜组织小块；用300目滤网过滤，生理盐水冲洗残血，组织块转移至50ml离心管；
(3)组织消化：在37℃恒温摇床中，将组织块用1倍组织体积的混合酶消化液以100rpm振荡消化30～60min；消化结束后，加2ml胎牛血清混匀终止；用200目滤网过滤并用大量生理盐水清洗，收集滤液；
(4)分别对滤液部分和组织块部分进行细胞培养：
滤液部分：收集的滤液以1500rpm离心5min，去上清，用生理盐水重悬清洗细胞沉淀；以1500rpm离心5min，去上清，将细胞沉淀用完全培养基重悬；计数仪计取有核细胞数并用台盼兰染色测定细胞活率；以每瓶2×106个细胞接种于75cm2培养瓶中，添加20ml完全培养基，晃匀后在5％CO2、37℃培养箱中培养；定期换液；培养10～15天后传代至P1代，继续用完全培养基培养；所述完全培养基包括：DMEM-F12培养基、10％FBS、100μg/mL青霉素、50μg/mL链霉素、0.01～0.05％硝酸硫胺、0.05～0.1％麦芽糖，所述DMEM-F12培养基是DMEM-F12以体积比1：1配制的培养基；
组织块部分：将收集的组织块置于75cm2培养瓶中，使组织块能够覆盖培养瓶中一半的培养面积，添加完全培养基没过组织，晃匀后于5％CO2、37℃培养箱中培养；2d后补液10ml完全培养基，继续培养；较多间充质干细胞爬出后去组织，定期换液；培养10～15天后传代至P1代，继续用完全培养基培养；
(5)P1代细胞收获：用胰酶消化液将上一步骤中的两部分合并后的P1代细胞消化后，收集细胞，计数并测定细胞活率，冻存，即得P1代的羊膜间充质干细胞，完成从P0代至P1代的细胞传代；依次重复上述从P0代到P1代的传代操作以分别进行P1代至P2代、P2代至P3代直至P15代的细胞传代，得到P1代至P15代的羊膜间充质干细胞。
根据本发明第二方面所述的用途，制备所述羊膜间充质干细胞的步骤中，所述基础平衡盐溶液是通过如下方式配制得到的：将0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的链霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液。
根据本发明第二方面所述的用途，制备所述羊膜间充质干细胞的步骤中，所述混合酶消化液中包含：0.1mg/ml的I型胶原酶，0.3mg/ml的II型胶原酶，0.1mg/ml的透明质酸酶和0.05mg/ml的中性蛋白酶。
根据本发明第二方面所述的用途，制备所述羊膜间充质干细胞的步骤中，步骤(5)中，胰酶消化液是包括0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液。
根据本发明第二方面所述的用途，其中所述细胞制剂中所述药用溶媒是水。
根据本发明第二方面所述的用途，其中所述细胞制剂是供注射方式使用的制剂。
根据本发明第二方面所述的用途，其中所述羊膜间充质干细胞是经传代培养至1～20代的细胞，例如是经传代培养至1～15代的细胞，例如是经传代培养至1～12代的细胞。
根据本发明第二方面所述的用途，其中所述细胞制剂中所述羊膜间充质干细胞的浓度为(1～8)×106个/ml。
根据本发明第二方面所述的用途，其中所述细胞制剂中所述羊膜间充质干细胞的浓度为(1.5～6)×106个/ml。
根据本发明第二方面所述的用途，其中所述细胞制剂中所述羊膜间充质干细胞的浓度为(2～4)×106个/ml。
根据本发明第二方面所述的用途，其中所述细胞制剂中还包含氯化钠。
根据本发明第二方面所述的用途，其中所述细胞制剂中还包含氯化钠，其浓度为7～10mg/ml。
根据本发明第二方面所述的用途，其中所述细胞制剂中还包含氯化钠，其浓度为7.5～9.5mg/ml。
根据本发明第二方面所述的用途，其中所述细胞制剂中还包含氯化钠，其浓度为8～9mg/ml。
根据本发明第二方面所述的用途，其中所述细胞制剂中还包含泛酸钙。
根据本发明第二方面所述的用途，其中所述细胞制剂中还包含泛酸钙，其浓度为0.5～5mg/ml。
根据本发明第二方面所述的用途，其中所述细胞制剂中还包含泛酸钙，其浓度为1～4mg/ml。
根据本发明第二方面所述的用途，其中所述细胞制剂中还包含泛酸钙，其浓度为1.5～3.5mg/ml。
根据本发明第二方面所述的用途，其中所述细胞制剂中还包含鸟氨酸。
根据本发明第二方面所述的用途，其中所述细胞制剂中还包含鸟氨酸，其浓度为5～35mg/ml。
根据本发明第二方面所述的用途，其中所述细胞制剂中还包含鸟氨酸，其浓度为10～30mg/ml。
根据本发明第二方面所述的用途，其中所述细胞制剂中还包含鸟氨酸，其浓度为15～25mg/ml。
根据本发明第二方面所述的用途，其中所述细胞制剂具有如本发明实施例任一项所述配方。
根据本发明第二方面所述的用途，其中所述细胞制剂是照包括如下步骤的方法制备得到的：将氯化钠等药用辅料用适量水溶解，得到盐水溶液；将传代培养所得间充质干细胞转移至离心管中离心(例如2000rpm离心5min)，弃上清，加盐水溶液使细胞重悬，制得细胞制剂。
在本发明上述各种操作步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。
本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。下面对本发明作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
间充质干细胞是一类具有自我复制和多向分化潜能的成体干细胞，具有易分离、培养、扩增，免疫原性低，不表达II型主要组织相容性复合物(MHC)的优势，可以异体使用，具有强大的迁移、免疫调节能力，通过旁分泌方式促进组织损伤修复再生，是再生医学理想的种子细胞。
本发明使用本领域经典的动物试验验证本发明细胞制剂在用于宫腔粘连中的生物学效应，并且呈现令人满意的效果，这些结果为临床应用的有效性提供了坚实的依据。
附图说明
图1：给予羊膜间充质干细胞的细胞制剂后HE染色观察子宫内膜形态的结果。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细的描述。
本发明下文试验中所使用的材料例如其中所使用的试剂是本领域已知的，其可以采用公知方法配制或者直接从市场购得。CN 106754674B(中国专利号ZL 2016111295528)记载了详细的羊膜间充质干细胞获取方法，其全部内容通过引用并入本文。
实施例1：从羊膜制备人羊膜间充质干细胞
(1)从胎盘样品采集盒中取出胎盘，置于白瓷盘中，使用基础平衡盐溶液(将0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的链霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液，即得)反复冲洗表面，对胎盘进行消毒处理；
(2)用手术镊慢慢撕取胎膜外层羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基础平衡盐溶液反复清洗表面污血，剪碎成直径为5mm的羊膜组织小块；用300目滤网过滤，生理盐水冲洗残血，组织块转移至50ml离心管；
(3)组织消化：在37度恒温摇床中，将组织块用1倍组织体积的混合酶消化液(内含：0.1mg/ml的I型胶原酶，0.3mg/ml的II型胶原酶，0.1mg/ml的透明质酸酶和0.05mg/ml的中性蛋白酶)以100rpm振荡消化40min；消化结束后，加2ml胎牛血清混匀终止；用200目滤网过滤并用大量生理盐水清洗，收集滤液；
(4)分别对滤液部分和组织块部分进行细胞培养：
滤液部分：收集的滤液以1500rpm离心5min，去上清，用生理盐水重悬清洗细胞沉淀；以1500rpm离心5min，去上清，将细胞沉淀用完全培养基(DMEM-F12(1：1)培养基、10％FBS、100μg/mL青霉素、50μg/mL链霉素、0.02％硝酸硫胺、0.085％麦芽糖)重悬；计数仪计取有核细胞数并用台盼兰染色测定细胞活率(通常可得大于1×107细胞，细胞活率大于95％)；以每瓶2×106个细胞接种于75cm2培养瓶中，添加20ml完全培养基，晃匀后在5％CO2、37℃培养箱中培养；定期换液；培养12天后传代至P1代，继续用完全培养基培养；
组织块部分：将收集的组织块置于75cm2培养瓶中，使组织块能够覆盖培养瓶中一半的培养面积，添加完全培养基没过组织，晃匀后于5％CO2、37℃培养箱中培养；2d后补液10ml完全培养基，继续培养；较多间充质干细胞爬出后去组织，定期换液；培养12天后传代至P1代，继续用完全培养基培养；
(5)P1代细胞收获：用胰酶消化液(包含0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液)将上一步骤中的两部分合并后的P1代细胞消化后，收集细胞，计数并测定细胞活率，冻存，即得P1代的羊膜间充质干细胞，完成从P0代至P1代的细胞传代；依次重复上述从P0代到P1代的传代操作以分别进行P1代至P2代、P2代至P3代直至P15代的细胞传代，得到P1代至P15代的羊膜间充质干细胞。
本实施例所得P1代细胞，人羊膜间充质干细胞细胞显微图(培养3天，100倍放大)、人羊膜间充质干细胞细胞显微图(培养10天，40倍放大)、人羊膜间充质干细胞细胞显微图(培养10天，100倍放大)、人羊膜间充质干细胞细胞诱导分化的成骨测试结果、人羊膜间充质干细胞细胞诱导分化的成软骨测试结果、人羊膜间充质干细胞细胞诱导分化的成脂测试结果，典型的可以分别参见CN 106754674B之图1～图6。
实施例2：从羊膜制备人羊膜间充质干细胞
(1)从胎盘样品采集盒中取出胎盘，置于白瓷盘中，使用基础平衡盐溶液(将0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的链霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液，即得)反复冲洗表面，对胎盘进行消毒处理；
(2)用手术镊慢慢撕取胎膜外层羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基础平衡盐溶液反复清洗表面污血，剪碎成直径为5mm的羊膜组织小块；用300目滤网过滤，生理盐水冲洗残血，组织块转移至50ml离心管；
(3)组织消化：在37度恒温摇床中，将组织块用1倍组织体积的混合酶消化液(内含：0.1mg/ml的I型胶原酶，0.3mg/ml的II型胶原酶，0.1mg/ml的透明质酸酶和0.05mg/ml的中性蛋白酶)以100rpm振荡消化30min；消化结束后，加2ml胎牛血清混匀终止；用200目滤网过滤并用大量生理盐水清洗，收集滤液；
(4)分别对滤液部分和组织块部分进行细胞培养：
滤液部分：收集的滤液以1500rpm离心5min，去上清，用生理盐水重悬清洗细胞沉淀；以1500rpm离心5min，去上清，将细胞沉淀用完全培养基(DMEM-F12(1：1)培养基、10％FBS、100μg/mL青霉素、50μg/mL链霉素、0.01％硝酸硫胺、0.1％麦芽糖)重悬；计数仪计取有核细胞数并用台盼兰染色测定细胞活率(通常可得大于1×107细胞，细胞活率大于95％)；以每瓶2×106个细胞接种于75cm2培养瓶中，添加20ml完全培养基，晃匀后在5％CO2、37℃培养箱中培养；定期换液；培养10天后传代至P1代，继续用完全培养基培养；
组织块部分：将收集的组织块置于75cm2培养瓶中，使组织块能够覆盖培养瓶中一半的培养面积，添加完全培养基没过组织，晃匀后于5％CO2、37℃培养箱中培养；2d后补液10ml完全培养基，继续培养；较多间充质干细胞爬出后去组织，定期换液；培养15天后传代至P1代，继续用完全培养基培养；
(5)P1代细胞收获：用胰酶消化液(包含0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液)将上一步骤中的两部分合并后的P1代细胞消化后，收集细胞，计数并测定细胞活率，冻存，即得P1代的羊膜间充质干细胞，完成从P0代至P1代的细胞传代；依次重复上述从P0代到P1代的传代操作以分别进行P1代至P2代、P2代至P3代直至P15代的细胞传代，得到P1代至P15代的羊膜间充质干细胞。
实施例3：从羊膜制备人羊膜间充质干细胞
(1)从胎盘样品采集盒中取出胎盘，置于白瓷盘中，使用基础平衡盐溶液(将0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的链霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液，即得)反复冲洗表面，对胎盘进行消毒处理；
(2)用手术镊慢慢撕取胎膜外层羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基础平衡盐溶液反复清洗表面污血，剪碎成直径为5mm的羊膜组织小块；用300目滤网过滤，生理盐水冲洗残血，组织块转移至50ml离心管；
(3)组织消化：在37度恒温摇床中，将组织块用1倍组织体积的混合酶消化液(内含：0.1mg/ml的I型胶原酶，0.3mg/ml的II型胶原酶，0.1mg/ml的透明质酸酶和0.05mg/ml的中性蛋白酶)以100rpm振荡消化60min；消化结束后，加2ml胎牛血清混匀终止；用200目滤网过滤并用大量生理盐水清洗，收集滤液；
(4)分别对滤液部分和组织块部分进行细胞培养：
滤液部分：收集的滤液以1500rpm离心5min，去上清，用生理盐水重悬清洗细胞沉淀；以1500rpm离心5min，去上清，将细胞沉淀用完全培养基(DMEM-F12(1：1)培养基、10％FBS、100μg/mL青霉素、50μg/mL链霉素、0.03％硝酸硫胺、0.07％麦芽糖)重悬；计数仪计取有核细胞数并用台盼兰染色测定细胞活率(通常可得大于1×107细胞，细胞活率大于95％)；以每瓶2×106个细胞接种于75cm2培养瓶中，添加20ml完全培养基，晃匀后在5％CO2、37℃培养箱中培养；定期换液；培养15天后传代至P1代，继续用完全培养基培养；
组织块部分：将收集的组织块置于75cm2培养瓶中，使组织块能够覆盖培养瓶中一半的培养面积，添加完全培养基没过组织，晃匀后于5％CO2、37℃培养箱中培养；2d后补液10ml完全培养基，继续培养；较多间充质干细胞爬出后去组织，定期换液；培养10天后传代至P1代，继续用完全培养基培养；
(5)P1代细胞收获：用胰酶消化液(包含0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA的消化液)将上一步骤中的两部分合并后的P1代细胞消化后，收集细胞，计数并测定细胞活率，冻存，即得P1代的羊膜间充质干细胞，完成从P0代至P1代的细胞传代；依次重复上述从P0代到P1代的传代操作以分别进行P1代至P2代、P2代至P3代直至P15代的细胞传代，得到P1代至P15代的羊膜间充质干细胞。
在本发明制备细胞制剂的实例中，如未另外说明，均以每1ml比例的量表示，实际制备时每批次量不少于50ml。本发明制备细胞制剂的实例中，如未另外说明，所用干细胞均是由本文实施例1方法获得的。本发明上下文中，间充质干细胞的制剂(即细胞制剂)的制备过程均在无菌操作条件下进行。
实施例11a、制备间充质干细胞的制剂
间充质干细胞(P8代)：3×106个，
氯化钠：8.5mg，
泛酸钙：2.5mg，
鸟氨酸：20mg，
水，适量至1ml。
制法：将氯化钠、泛酸钙和鸟氨酸用适量水溶解，得到盐水溶液；将实施例2之步骤2细胞传代所得间充质干细胞转移至离心管中，2000rpm离心5min，弃上清，加盐水溶液使细胞重悬，制得细胞制剂。
实施例11a1、制备间充质干细胞的制剂
本实施例11a1的细胞制剂参照实施例11a的配方和制法获得，不同的仅是不添加鸟氨酸。
实施例11a2、制备间充质干细胞的制剂
本实施例11a2的细胞制剂参照实施例11a的配方和制法获得，不同的仅是不添加泛酸钙。
实施例11a3、制备间充质干细胞的制剂
本实施例11a3的细胞制剂参照实施例11a的配方和制法获得，不同的仅是既不添加鸟氨酸也不添加泛酸钙。
实施例11b、制备间充质干细胞的制剂
间充质干细胞(P12代)：2×106个，
氯化钠：9mg，
泛酸钙：1.5mg，
鸟氨酸：15mg，
水，适量至1ml。
制法：将氯化钠、泛酸钙和鸟氨酸用适量水溶解，得到盐水溶液；将实施例2之步骤2细胞传代所得间充质干细胞转移至离心管中，2000rpm离心5min，弃上清，加盐水溶液使细胞重悬，制得细胞制剂。
实施例11c、制备间充质干细胞的制剂
间充质干细胞(P6代)：4×106个，
氯化钠：8.5mg，
泛酸钙：3.5mg，
鸟氨酸：20mg，
水，适量至1ml。
制法：将氯化钠、泛酸钙和鸟氨酸用适量水溶解，得到盐水溶液；将实施例2之步骤2细胞传代所得间充质干细胞转移至离心管中，2000rpm离心5min，弃上清，加盐水溶液使细胞重悬，制得细胞制剂。
实施例11d、制备间充质干细胞的制剂
间充质干细胞(P3代)：2.5×106个，
氯化钠：8mg，
泛酸钙：3mg，
鸟氨酸：25mg，
水，适量至1ml。
制法：将氯化钠、泛酸钙和鸟氨酸用适量水溶解，得到盐水溶液；将实施例2之步骤2细胞传代所得间充质干细胞转移至离心管中，2000rpm离心5min，弃上清，加盐水溶液使细胞重悬，制得细胞制剂。
实施例11e、制备间充质干细胞的制剂
间充质干细胞(P10代)：3.5×106个，
氯化钠：9mg，
泛酸钙：2mg，
鸟氨酸：18mg，
水，适量至1ml。
制法：将氯化钠、泛酸钙和鸟氨酸用适量水溶解，得到盐水溶液；将实施例2之步骤2细胞传代所得间充质干细胞转移至离心管中，2000rpm离心5min，弃上清，加盐水溶液使细胞重悬，制得细胞制剂。
试验例1：间充质干细胞细胞治疗宫腔粘连(IUA)临床前有效性试验
本试验例1使用实施例11a所得细胞制剂进行测试。
1、建立大鼠子宫内膜损伤动物模型
建立一个机械损伤的IUA大鼠模型。选取8周龄的健康雌性Sprague-Dawley大鼠(250-300g)，每天8:00-10:00取阴道涂片；连续4天发情周期。大鼠麻醉后，通过腹部中线下切口暴露子宫角。从子宫角切除一段长1.5cm、宽0.5cm的子宫段，保留子宫中膜完整。用生理盐水冲洗腹腔后，缝合腹直肌筋膜和皮肤。所有动物术后每天肌肉注射青霉素两次，连续3天。
2、MSCs移植修复子宫内膜损伤
(1)实验设计和分组：选取36只8周龄的健康雌性Sprague-Dawley大鼠(250-300g)，随机分为3组，分别为空白对照组(n＝12)、模型组(n＝12)、MSCs治疗组(n＝12)。
(2)实验方法：对照组：不给予任何处理；模型组：大鼠麻醉后，经腹部中线下切口暴露子宫角。从子宫角切除一段长1.5cm、宽0.5cm的子宫段，保留子宫中膜完整，最后逐层缝合腹部；切除后子宫角完全止血，缺损明显，开放自然愈合。MSCs治疗组：在IUA模型基础上，将细胞制剂(5×105细胞)注射到子宫腔内。
治疗后1周、2周、4周、8周，每个时间点，每组各处死3只大鼠，收集子宫组织，对子宫创面的愈合情况进行观察及组织学分析。
3、HE染色观察子宫内膜形态
(1)方法：苏木精-伊红(HE)染色，观察子宫内膜组织结构。组织石蜡包埋，切片5μm厚，标准HE染色。采用TE2000-U倒置相差显微镜(日本东京Nikon)观察大鼠子宫组织形态学变化。H&E切片记录子宫内膜厚度和腺体数目，在每个图像中选择5个视野进行计数。
(2)结果：典型结果参见图1；具体的讲，对照组：子宫内膜结构完整，上皮细胞排列紧密，子宫内膜上皮呈高柱状，子宫内膜腺体丰富；模型组：子宫内膜不全，宫腔明显缩小，子宫内膜上皮呈偏平状或低柱状，内膜间质腺体数量减少，子宫内膜间质纤维化明显；MSCs组：可见子宫恢复良好，子宫内膜上皮呈高柱状，内膜腺体较多。
经观测，子宫内膜厚度、腺体计数、纤维化程度的结果分别如表1所示。
表1：
组别 子宫内膜厚度(μm) 腺体计数(个) 子宫内膜纤维化面积百分比(％)
对照组 754.40±30.29 20.84±3.27 12.6％±2.3％
模型组 350.60±54.39 2.68±0.72 60.7％±4.8％
MSCs组 644.31±48.53 14.46±2.14 22.3％±2.7％
P值 <0.001 <0.001 <0.001
P值：MSCs组与模型组比较
4、MSCs促进子宫功能恢复：生育实验
本试验用于验证受孕胚胎个数验证子宫生育力的恢复。
(1)实验方法：通过检测再生子宫角是否能接受受精卵，并能支持胚胎发育到妊娠晚期来评估其功能。治疗后8周，对照组、模型组、MSCs组、与雄性大鼠交配。阴道堵塞出现的日期被认为是妊娠第0天。大鼠在妊娠第15天进行安乐死，检查子宫角是否有胚胎。
(2)结果：MSCs移植提高IUA大鼠生育能力，与胚胎着床密切相关；子宫内膜损伤可导致胚胎着床失败或降低胚胎着床率。为了检测MSCs对子宫内膜修复的作用，观察不同组大鼠的胚胎着床效率。结果，模型组子宫胚胎个数明显少于对照组和MSCs组(P<0.05)，MSCs组子宫胚胎个数少于正常组(P<0.05)，具体结果如表2所示。
表2：
Figure BDA0002861905410000171
P值：MSCs组与模型组比较
上述结果表明，羊膜间充质干细胞对于损伤的子宫内膜具有再生修复作用，并且改善生育能力。
试验例1a：间充质干细胞细胞治疗宫腔粘连(IUA)临床前有效性试验
本试验例1a使用实施例11a1所得细胞制剂(无鸟氨酸)进行测试。本试验例1a的间充质干细胞细胞治疗宫腔粘连(IUA)临床前有效性试验照试验例1进行，具体是在试验例1中并行设置试验组进行试验。结果：子宫内膜厚度＝427.52±39.73μm(p<0.1)、腺体计数＝7.17±1.82个(p<0.05)、子宫内膜纤维化面积百分比＝47.5％±3.3％(p<0.05)、胚胎个数＝3.73±1.84个(p<0.05)，4个参数的结果与试验例1中的实施例11a细胞制剂结果之间均呈现p<0.05的显著性差异。
试验例1b：间充质干细胞细胞治疗宫腔粘连(IUA)临床前有效性试验
本试验例1b使用实施例11a2所得细胞制剂(无泛酸钙)进行测试。本试验例1b的间充质干细胞细胞治疗宫腔粘连(IUA)临床前有效性试验照试验例1进行，具体是在试验例1中并行设置试验组进行试验。结果：子宫内膜厚度＝396.63±51.34μm(p<0.1)、腺体计数＝6.84±2.53个(p<0.05)、子宫内膜纤维化面积百分比＝51.2％±4.6％(p<0.05)、胚胎个数＝4.31±2.27个(p<0.05)，4个参数的结果与试验例1中的实施例11a细胞制剂结果之间均呈现p<0.05的显著性差异。
试验例1c：间充质干细胞细胞治疗宫腔粘连(IUA)临床前有效性试验
本试验例1c使用实施例11a3所得细胞制剂(无鸟氨酸亦无泛酸钙)进行测试。本试验例1c的间充质干细胞细胞治疗宫腔粘连(IUA)临床前有效性试验照试验例1进行，具体是在试验例1中并行设置试验组进行试验。结果：子宫内膜厚度＝367.24±42.53μm(p<0.1)、腺体计数＝6.28±2.04个(p<0.05)、子宫内膜纤维化面积百分比＝44.6％±5.1％(p<0.05)、胚胎个数＝3.53±2.24个(p<0.05)，4个参数的结果与试验例1中的实施例11a细胞制剂结果之间均呈现p<0.05的显著性差异。
如上述试验例1以及实施例1a、实施例1b、实施例1c所示，出人意料地发现，在细胞制剂中同时添加鸟氨酸和泛酸钙二者可以显著地改善细胞制剂的生物学效果。
试验例2：羊膜间充质干细胞的验证：
使用流式细胞仪检测下列项目
CD73检测：准备两支流式管，编号，其中一支为质控管一支为样品管，将CD73的control试剂摇匀，向质控管中加入20ul，再将CD73试剂摇匀，向样品管中加入20ul CD73试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600ul样品，然后混匀，置于4℃左右避光孵育30分钟，然后向质控管和流式管中分别加入1毫升PBS，混匀后1500转/分钟离心5分钟，后弃去上清，加入240ul的PBS后混匀上机，检测阳性结果≧95％则为合格，出具细胞表面标记物检测合格报告。
CD90检测：准备两支流式管，编号，其中一支为质控管一支为样品管，将CD90的control试剂摇匀，向质控管中加入20ul，再将CD90试剂摇匀，向样品管中加入10ul CD90试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600ul样品，然后混匀，置于4℃左右避光孵育30分钟，然后向质控管和流式管中分别加入1毫升PBS，混匀后1500转/分钟离心5分钟，后弃去上清，加入240ul的PBS后混匀上机，检测阳性结果≧95％则为合格，出具细胞表面标记物检测合格报告。
CD105检测：准备两支流式管，编号，其中一支为质控管一支为样品管，将CD105的control试剂摇匀，向质控管中加入10ul，再将CD105试剂摇匀，向样品管中加入5ulCD105试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600ul样品，然后混匀，置于4℃左右避光孵育30分钟，然后向质控管和流式管中分别加入1毫升PBS，混匀后1500转/分钟离心5分钟，后弃去上清，加入240ul的PBS后混匀上机，检测阳性结果≧95％则为合格，出具细胞表面标记物检测合格报告。
备注：所有细胞表型检测所用试剂的量均为经过实验可行后确定的使用量。
CD45检测：准备两支流式管，编号，其中一支为质控管一支为样品管，将CD45的control试剂摇匀，向质控管中加入20ul，再将CD45试剂摇匀，向样品管中加入20ul CD45试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600ul样品，然后混匀，置于4℃左右避光孵育30分钟，然后向质控管和流式管中分别加入1毫升PBS，混匀后1500转/分钟离心5分钟，后弃去上清，加入240ul的PBS后混匀上机，检测阳性结果≦2％则为合格，出具细胞表面标记物检测合格报告。
HLA-DR检测：准备两支流式管，编号，其中一支为质控管一支为样品管，将HLA-DR的control试剂摇匀，向质控管中加入20ul，再将HLA-DR试剂摇匀，向样品管中加入20ulHLA-DR试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600ul样品，然后混匀，置于4℃左右避光孵育30分钟，然后向质控管和流式管中分别加入1毫升PBS，混匀后1500转/分钟离心5分钟，后弃去上清，加入240ul的PBS后混匀上机，检测阳性结果≦2％则为合格，出具细胞表面标记物检测合格报告。
羊膜间充质干细胞向成骨细胞的诱导分化：1)碱性磷酸酶染色：成骨细胞会产生大量碱性磷酸酶，蓝紫色染色为碱性磷酸酶阳性。2)钙盐沉积染色：成骨细胞会产生钙盐的沉积，橙红色着色为阳性。这样的结果是典型的向成骨细胞的诱导分化的阳性结果。
其它检测项目亦可使用本领域公知的方法进行。
通过本试验例2的测试方法测试本发明实施例1～3所得人羊膜间充质干细胞，经检测，结果显示各参数均与人羊膜间充质干细胞典型特征相符。例如，经流式检测，实施例1～3所得人羊膜间充质干细胞其CD73、CD90、CD105阳性为阳性，CD34、CD45、HLADR、CD11b、CD19阴性；这些羊膜间充质干细胞的诱导分化结果显示其：成软骨、成脂、成骨为阳性。结果显示这些标志物或诱导分化性能均与人羊膜间充质干细胞符合。
以上所述实施例仅是为充分说明本申请而所举的较佳的实施例，本申请的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本申请基础上所作的等同替代或变换，均在本申请的保护范围之内。本申请的保护范围以权利要求书为准。

Claims (12)

1.用于治疗宫腔粘连的供注射方式使用的细胞制剂，其由如下组分组成：羊膜间充质干细胞3×106个/ml、氯化钠8.5mg/ml、泛酸钙2.5mg/ml、鸟氨酸20mg/ml、药用溶媒水；该细胞制剂是按照如下步骤的方法制备得到的：将氯化钠、泛酸钙和鸟氨酸用适量水溶解，得到盐水溶液；将传代培养所得间充质干细胞转移至离心管中2000rpm离心5min，弃上清，加盐水溶液使细胞重悬，制得细胞制剂。
2.根据权利要求1的细胞制剂，其中所述羊膜间充质干细胞是经传代培养至1~15代的细胞。
3.根据权利要求1的细胞制剂，其中所述羊膜间充质干细胞是经传代培养至1~12代的细胞。
4.根据权利要求1的细胞制剂，其中所述羊膜间充质干细胞是通过如下步骤的方法制备得到的：
(1)从胎盘样品采集盒中取出胎盘，置于白瓷盘中，使用基础平衡盐溶液反复冲洗表面，对胎盘进行消毒处理；
(2)用手术镊慢慢撕取胎膜外层羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基础平衡盐溶液反复清洗表面污血，剪碎成直径为5mm的羊膜组织小块；用300目滤网过滤，生理盐水冲洗残血，组织块转移至50ml离心管；
(3)组织消化：在37℃恒温摇床中，将组织块用1倍组织体积的混合酶消化液以100rpm振荡消化30~60min；消化结束后，加2ml胎牛血清混匀终止；用200目滤网过滤并用大量生理盐水清洗，收集滤液；
(4)分别对滤液部分和组织块部分进行细胞培养：
滤液部分：收集的滤液以1500rpm 离心5min，去上清，用生理盐水重悬清洗细胞沉淀；以1500rpm 离心5min，去上清，将细胞沉淀用完全培养基重悬；计数仪计取有核细胞数并用台盼兰染色测定细胞活率；以每瓶2×106个细胞接种于75cm2培养瓶中，添加20ml完全培养基，晃匀后在5%CO2、37℃培养箱中培养；定期换液；培养10~15天后传代至P1代，继续用完全培养基培养；
组织块部分：将收集的组织块置于75cm2培养瓶中，使组织块能够覆盖培养瓶中一半的培养面积，添加完全培养基没过组织，晃匀后于5%CO2、37℃培养箱中培养；2d后补液10ml完全培养基，继续培养；较多间充质干细胞爬出后去组织，定期换液；培养10~15天后传代至P1代，继续用完全培养基培养；
(5)P1代细胞收获：用胰酶消化液将上一步骤中的两部分合并后的P1代细胞消化后，收集细胞，计数并测定细胞活率，冻存，即得P1代的羊膜间充质干细胞，完成从P0代至P1代的细胞传代；依次重复上述从P0代到P1代的传代操作以分别进行P1代至P2代、P2代至P3代直至P15代的细胞传代，得到P1代至P15代的羊膜间充质干细胞。
5.根据权利要求4的细胞制剂，所述基础平衡盐溶液是通过如下方式配制得到的：将0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的链霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液。
6.根据权利要求4的细胞制剂，所述混合酶消化液中包含：0.1mg/ml的I型胶原酶，0.3mg/ml的II型胶原酶，0.1mg/ml的透明质酸酶和0.05mg/ml的中性蛋白酶。
7.根据权利要求4的细胞制剂，所述DMEM-F12培养基是DMEM-F12以体积比1：1配制的培养基。
8.根据权利要求4的细胞制剂，所述完全培养基包括：DMEM-F12培养基、10%FBS、100μg/mL青霉素、50μg/mL链霉素。
9.根据权利要求8的细胞制剂，所述的完全培养基中还添加了0.01~0.05%硝酸硫胺和0.05~0.1%麦芽糖。
10.根据权利要求4的细胞制剂，步骤(5)中，胰酶消化液是包括0.25%的胰蛋白酶和0.02%的EDTA的消化液。
11.根据权利要求1的细胞制剂，其中所述羊膜间充质干细胞是通过如下步骤的方法制备得到的：
(1)从胎盘样品采集盒中取出胎盘，置于白瓷盘中，使用基础平衡盐溶液反复冲洗表面，对胎盘进行消毒处理；
(2)用手术镊慢慢撕取胎膜外层羊膜置于150mm玻璃皿中，使用基础平衡盐溶液反复清洗表面污血，剪碎成直径为5mm的羊膜组织小块；用300目滤网过滤，生理盐水冲洗残血，组织块转移至50ml离心管；
(3)组织消化：在37℃恒温摇床中，将组织块用1倍组织体积的混合酶消化液以100rpm振荡消化30~60min；消化结束后，加2ml胎牛血清混匀终止；用200目滤网过滤并用大量生理盐水清洗，收集滤液；
(4)分别对滤液部分和组织块部分进行细胞培养：
滤液部分：收集的滤液以1500rpm 离心5min，去上清，用生理盐水重悬清洗细胞沉淀；以1500rpm 离心5min，去上清，将细胞沉淀用完全培养基重悬；计数仪计取有核细胞数并用台盼兰染色测定细胞活率；以每瓶2×106个细胞接种于75cm2培养瓶中，添加20ml完全培养基，晃匀后在5%CO2、37℃培养箱中培养；定期换液；培养10~15天后传代至P1代，继续用完全培养基培养；所述完全培养基包括：DMEM-F12培养基、10%FBS、100μg/mL青霉素、50μg/mL链霉素、0.01~0.05%硝酸硫胺、0.05~0.1%麦芽糖，所述DMEM-F12培养基是DMEM-F12以体积比1：1配制的培养基；
组织块部分：将收集的组织块置于75cm2培养瓶中，使组织块能够覆盖培养瓶中一半的培养面积，添加完全培养基没过组织，晃匀后于5%CO2、37℃培养箱中培养；2d后补液10ml完全培养基，继续培养；较多间充质干细胞爬出后去组织，定期换液；培养10~15天后传代至P1代，继续用完全培养基培养；
(5)P1代细胞收获：用胰酶消化液将上一步骤中的两部分合并后的P1代细胞消化后，收集细胞，计数并测定细胞活率，冻存，即得P1代的羊膜间充质干细胞，完成从P0代至P1代的细胞传代；依次重复上述从P0代到P1代的传代操作以分别进行P1代至P2代、P2代至P3代直至P15代的细胞传代，得到P1代至P15代的羊膜间充质干细胞。
12.权利要求1~11任一项所述细胞制剂在制备用于治疗宫腔粘连的药物中的用途。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106754674B (zh) * 2016-12-09 2019-09-20 博雅干细胞科技有限公司 从人胎盘羊膜制备羊膜间充质干细胞的方法及其应用
CN111084905A (zh) * 2019-12-10 2020-05-01 肖雁冰 利用羊膜间充质干细胞制备人工羊膜的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106754674B (zh) * 2016-12-09 2019-09-20 博雅干细胞科技有限公司 从人胎盘羊膜制备羊膜间充质干细胞的方法及其应用
CN111084905A (zh) * 2019-12-10 2020-05-01 肖雁冰 利用羊膜间充质干细胞制备人工羊膜的方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Human amniotic mesenchymal stromal cell transplantation improves endometrial regeneration in rodent models of intrauterine adhesions;Gan等;《Cytotherapy》;20171231;第19卷(第5期);摘要，第604页右栏第2段，605页图1 *
Gan等."Human amniotic mesenchymal stromal cell transplantation improves endometrial regeneration in rodent models of intrauterine adhesions.《Cytotherapy》.2017,第19卷(第5期), *
NF-κB信号通路在人羊膜间充质干细胞治疗宫腔粘连中的作用;勾亚婷等;《第三军医大学学报》;20200608(第11期);全文 *
羊膜干细胞用于修复损伤子宫内膜的临床研究;许慕慧等;《系统医学》;20190320(第06期);全文 *
羊膜干细胞用于修复损伤子宫内膜的动物实验研究;张燕燕等;《现代医院》;20160726(第08期);全文 *

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