CN111888529B - 基于人羊膜及羊膜间充质干细胞的仿生羊膜及方法和应用 - Google Patents

基于人羊膜及羊膜间充质干细胞的仿生羊膜及方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于人羊膜及羊膜间充质干细胞的仿生羊膜及其制备方法和应用，该仿生羊膜具有hAAM‑AAM‑hAAM的夹心结构，hAAM为人脱细胞羊膜，AAM为通过hAMSCs与BD基质胶制备的人工羊膜，两个hAAM的网状纤维面均处于内侧，AAM处于两个hAAM之间，且AAM中的hAMSCs通过细胞‑基质连接结构定植于两层hAAM的网状纤维面的网孔中。本发明的仿生羊膜能够形成与新鲜羊膜力学特性较为接近的充分的生物力学强度，具有很好的弹性、抗拉力和延展性。

Description

基于人羊膜及羊膜间充质干细胞的仿生羊膜及方法和应用
技术领域
本发明涉及一种仿生羊膜，具体涉及一种基于人羊膜及羊膜间充质干细胞的仿生羊膜及方法和应用。
背景技术
宫腔粘连(Intrauterine Adhesions,IUA)是指由于损伤或感染等原因引起子宫内膜基底层损伤并发生瘢痕愈合，导致子宫腔、子宫峡部和宫颈管腔的宫壁发生部分或全部的粘连，引起宫腔缩小、有效内膜免疫减少、经量减少甚至闭经等症状的临床疾病。随着无痛人流、无痛清宫手术的增加，IUA发病呈逐年上升趋势，且粘连程度逐渐加重，严重影响女性身心健康和生育能力。近年来，IUA已成为导致女性不孕症的重要原因之一，约占不孕症发病因素的8％，同时还与复发性流产、胎儿生长受限、反复胚胎着床失败、胎盘植入部位异常等密切相关。因此，无论是宫腔初次手术后的IUA预防，还是针对IUA的粘连分离术后再次粘连的预防，都成为妇科学和生殖医学领域研究的一个热点，且目前尚无特效的治疗方法。
以提高生育能力为最终目标的IUA预防和再次粘连预防存在两个关键技术，一个是术后早期阻隔宫腔前后壁，另一个是及时促进子宫内膜生长。既往已经有大量的研究在这些方面进行了有益的尝试，常用的方法包括：在宫内放置球囊或节育器、向宫腔内注射透明质酸钠等生物胶、干细胞或人羊膜的宫内移植等，还会辅以雌激素类药物。
然而，现有的研究显示，常规节育环屏障面积有限且存在嵌顿风险，预防效果不佳。球囊虽然屏障作用明显，但可能压迫宫腔，影响内膜血供和修复过程，且可能对宫颈机能存在一定影响。而向宫腔内注射透明质酸钠等生物胶虽可能有利于内膜抗菌、抗氧化和抗纤维化，降低宫腔再次粘连的程度和比例，但单独使用并不能显著改善患者的妊娠结局。雌激素类药物可以促进子宫内膜的快速生长，有效覆盖基底膜的纤维化区域，但由于无法物理阻隔宫腔前后壁，且使用存在一定的禁忌症和血栓形成风险，只能作为辅助用药。因此，IUA的预防和术后再粘连问题仍未得到根本改善，尤其是中、重度和复发性的IUA患者。
干细胞移植和羊膜及其制品宫腔内移植是预防IUA及术后再粘连的新兴研究领域，且已经取得了一些可喜进展。由于损伤的子宫内膜中内源性干细胞遭到破坏或含量减少，抑或出现增殖分化异常，导致自我修复能力不足，因此补充外源性的干细胞有助于加速子宫内膜，减少粘连机率。
目前，处于研究阶段的主要干细胞来源有胚胎干细胞和成体干细胞，尤以成体干细胞研究较多，包括羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)、骨髓间充质干细胞和经血干细胞等，其中羊膜间充质干细胞因其来源丰富、取材无创、具有极低的免疫原性、较强的增殖能力和多向分化潜能，且无致瘤性，已被证明具有良好的促进子宫内膜修复的作用。但是，hAMSCs脱离原本羊膜环境，再经体外大规模培养后的分化能力、遗传特征和稳定性都可能发生一定变化，使用的安全性可能存在隐患。而且，hAMSCs用于IUA治疗的途径也存在一定争议：hAMSCs经血循环注入后表现出对创伤组织的“归巢现象”，但归巢率往往较低，未“归巢”的干细胞在人体内代谢的形式和归宿尚不清楚；宫腔局部输注的hAMSCs因缺乏一定的载体，因此输注部位、作用方式、所需剂量等也难以规范。因此，hAMSCs用于IUA的临床治疗尚存在一个较为漫长的探索过程。
人羊膜及其制品的宫腔移植已较广泛用于IUA的临床治疗，但最新的荟萃分析显示，在宫腔镜下粘连松解术后单纯使用人羊膜及其制品，仅能增加患者的月经血容量，并不能改善粘连的复发率、再次妊娠率和自然流产率。
我们在中国专利CN201911255423.7公开了“利用羊膜间充质干细胞制备人工羊膜的方法”，将BD-基质胶(BD-Matrigel，BDM)与含有DMEM/F12培养基的hAMSCs悬液按一定比例混合，置于Transwell培养板孔中，在37℃条件下成胶并制得直径2cm、厚约3mm的圆形果冻状膜(hAMSCs浓度为3×105/cm3)，即“人工羊膜(artificial amniotic membrane，AAM)”，加入适量DMEM/F12和10％胎牛血清后置于37℃条件下培养，结果显示：AAM中hAMSCs分布均匀，呈不规则球形生长，接近间充质干细胞原有特征，存活率达95.09％，VEGF高表达(579.91±38.94pg/mL)，表明hAMSCs在以BDM为支架的AAM中能够存活，且能保持良好的增殖活性。
上述专利中制备的AAM中的hAMSCs虽然能保持较好活性，但是AAM的质地呈近似“果冻”状，几乎没有抗拉性，难以进行生物力学性能的检测并完成下一步的转化实验，尤其是无法满足后续动物在体实验的需求。导致这种现象的主要原因可能是：(1)DMEM/F12对BDM的稀释作用；(2)hAMSCs减弱了BDM内部的有机分子间的作用力。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于人羊膜及羊膜间充质干细胞的仿生羊膜及方法和应用，解决了现有AAM的力学性能差几乎没有抗拉性的问题，能够形成与新鲜羊膜力学特性较为接近的充分的生物力学强度，具有很好的弹性、抗拉力和延展性。
为了达到上述目的，本发明提供了一种基于人羊膜及羊膜间充质干细胞的仿生羊膜，该仿生羊膜具有hAAM-AAM-hAAM的夹心结构，hAAM为人脱细胞羊膜，AAM为通过hAMSCs与BD基质胶制备的人工羊膜，两个hAAM的网状纤维面均处于内侧，AAM处于两个hAAM之间，且AAM中的hAMSCs通过细胞-基质连接结构定植于两层hAAM的网状纤维面的网孔中。
优选地，所述AAM的厚度为2～4mm。
优选地，所述AAM中，hAMSCs的细胞浓度为3～5×105/mL。
优选地，所述hAAM为通过将人新鲜羊膜组织依次经过戊二醛的交联和胰蛋白酶的消化，使人新鲜羊膜组织的上皮层细胞松解、脱落率达80％以上而获得的，其厚度为0.02～0.5mm。
本发明的另一目的是提供一种所述的基于人羊膜及羊膜间充质干细胞的仿生羊膜的制备方法，该方法包含：
将一片hAAM置于Transwell小室内底部，hAAM的网状纤维面向上，在其上放置AAM，再将另一片hAAM覆盖于在AAM上，且hAAM的网状纤维面向下与AAM接触，将Transwell小室置于加有相同培养基的24孔板中，保证两层hAAM和中间AAM在培养期间的营养条件，从而使AAM中的hAMSCs通过细胞-基质连接结构定植于两层hAAM的网状纤维面的网孔中，形成具有hAAM-AAM-hAAM夹心结构的膜，获得基于人羊膜及羊膜间充质干细胞的仿生羊膜。
优选地，所述AAM的制备为，用无血清的DMEM/F12培养基按1:3稀释BD基质胶，在冰浴中融化稀释的BD基质胶，于冰浴中将hAMSCs与BD基质胶按1:1混合注入孔板中，制成细胞浓度为3×105/mL的薄膜，在37℃培养使其成胶，加入适量DMEM/F12完全培养基，获得AAM。
优选地，稀释后的BD基质胶的浓度为50μL/cm2生长面积。
优选地，所述hAMSCs的提取为，将新鲜羊膜剪碎，加入0.25％胰蛋白酶消化，加入Ⅱ型胶原酶消化，收集细胞滤液并离心，重悬于含10％胎牛血清和100U/mL青链霉素的DMEM/F12培养基中，在37℃孵育；当细胞融合达到80％时，用0.25％胰蛋白酶消化，1:3传代培养，获得3～5代生长状态好的hAMSCs。
优选地，所述hAAM的制备为，将除杂后的人新鲜羊膜组织与戊二醛交联，使用0.25％胰蛋白酶消化至上皮层细胞松解、脱落率达80％以上，去除多余的胰蛋白酶，获得hAAM。
本发明的另一目的是提供基于人羊膜及羊膜间充质干细胞的仿生羊膜的应用，该仿生羊膜用于作为宫腔内移植产品。
本发明的基于人羊膜及羊膜间充质干细胞的仿生羊膜及方法和应用，解决了现有AAM的力学性能差几乎没有抗拉性的问题，具有以下优点：
(1)本发明的仿生羊膜，将AAM与两层人脱细胞羊膜以hAAM-AAM-hAAM夹心结构设计，通过hAMSCs与人脱细胞羊膜良好的生物相容性，hAAM能够增强hAMSCs粘附、融合，借助细胞-基质连接结构将AAM定植于人脱细胞羊膜表面，实现了hAMSCs的“同源”定植、良好的力学性能和稳定的增殖活性，为研究BAM向子宫内膜定向转化形成“人工子宫内膜”并实现人工子宫内膜的研发、动物实验、生产和临床应用奠定了技术基础；
(2)本发明的仿生羊膜，以来源广泛、低免疫原性、无致瘤风险的hAMSCs作为干细胞成份，以低免疫原性、富含纤维组织、结缔组织和胶原蛋白的人脱细胞羊膜为双层结构支架，以无免疫活性、已商品化的生物材料BD基质胶作为hAMSCs的三维细胞支架，极大地方便未来的产品转化、进行规模化生产和后续的临床使用。
附图说明
图1为基于人羊膜及羊膜间充质干细胞的仿生羊膜的构造示意图。
图2为AAM的整体外观。
图3为打孔后的人新鲜羊膜和未打孔的人新鲜羊膜分别与hAMSCs共培养结果。
图4为hAMSCs在BAM和AAM中的细胞增殖结果。
图5为BAM中所含hAMSCs的干细胞表型鉴定实验结果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种基于人羊膜及羊膜间充质干细胞的仿生羊膜的制备方法，该方法包含：
(1)制备人脱细胞羊膜(hAAM,human acellular amniotic membrane)
将人新鲜羊膜组织经生理盐水充分漂洗，除去血迹和表面可能粘附的其他杂质，然后与戊二醛交联过夜，使用0.25％胰蛋白酶充分消化2次，每次30～40min，将新鲜羊膜表皮细胞消化至松解状态，具体需在倒置显微镜下观察，上皮层细胞松解、脱落率达80％以上时停止消化，再用生理盐水轻柔漂洗三次，去除多余的胰蛋白酶，然后将制成的hAAM冷冻干燥、分装，将其用环氧乙烷灭菌后置于-20℃条件下冷冻备用，其厚度为0.02～0.5mm。
经过戊二醛的交联和胰蛋白酶的消化，可以将新鲜羊膜表层的上皮细胞松解，容易与下面的基底层分离，在生理盐水漂洗后很容易脱落，制成hAAM。
(2)制备人工羊膜(AAM,artificial amniotic membrane)
(2.1)提取hAMSCs
将新鲜羊膜剪碎至1mm大小碎片后，加入0.25％胰蛋白酶消化2次，每次30min。加入Ⅱ型胶原酶消化1h，收集细胞滤液并离心，重悬于含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基(含100U/mL青链霉素)中，在37℃孵箱中恒温孵育。培养液每2天更换1次，当细胞融合达到80％时，用0.25％胰蛋白酶消化，1:3传代培养，获得3～5代生长状态好的hAMSCs。
经过胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶的消化，可以成功分离新鲜羊膜中的间充质干细胞，在加有抗生素的培养基中进行培养可以促进细胞分裂和增值，同时有效抗菌减少细胞被污染的概率，经细胞传代培养可以获得更多的细胞数量。
(2.2)制备AAM
用无血清的DMEM/F12培养基按1:3稀释BD基质胶，然后分装入冻存管中保存。在冰浴中融化预先分装的BD基质胶，于冰上将步骤(2.1)培养的hAMSCs与基质胶(浓度为50μL/cm2生长面积的基质胶)按1:1混合注入24孔板中，制成底面积为2cm2、厚度约3～5mm、细胞浓度为3×105/mL的圆形薄膜，即AAM，参见图2。37℃培养箱放置30min使其成胶后，加入适量DMEM/F12完全培养基，隔天换液。
BD基质胶在零度以下呈液体状态，可以与hAMSCs相互混合且细胞密度均匀，当温度升高至37℃以后，BD基质胶呈现固态，成为hAMSCs生长的三维基质框架，hAMSCs与BD基质胶在常温条件下静置后最终形成“果冻状”AAM。
(3)制备仿生羊膜
先将一片步骤(1)制备的hAAM置于Transwell小室(底部带有微孔的细胞培养装置)内底部，hAAM的网孔面向上，在其上加厚度为2～4mm的AAM，再将另一片hAAM覆盖于前述AAM上，且hAAM的网孔面向下，与AAM相对，形成“hAAM-AAM-hAAM”的“夹心三明治结构”膜，即BAM，将Transwell小室置于加有适于hAMSCs生长的培养基的24孔板中，底部的微孔不影响细胞培养液的透过，能够保证BAM上下两面均接受相同的营养物质，保证两层hAAM和中间AAM在培养期间有充分的营养条件，从而使hAMSCs通过细胞-基质连接结构定植于上下两层hAAM的网孔中，置于37℃恒温培养箱中培养，培养箱中二氧化碳浓度为5％，氧气浓度为20％，其余为氮气。其中，培养基为在含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基中加入青链霉素并配制成终浓度为100U/mL的细胞培养基。
中间AAM的厚度会影响间充质细胞含量的差别，即将来移植进入宫腔后发挥生物学转化和保护子宫内膜作用的差别。为了保证合成后的仿生羊膜厚度合适和便于植入患者子宫内，因此设计AAM厚度为2～4mm，平均3mm，这样制成的BAM总厚度在4～5mm左右，女性宫颈口直径约5～6mm，保证BAM厚度在宫颈口直径以下便于BAM置入宫腔内。
在hAMSCs的细胞浓度相同的情况下，含4mm AAM的仿生羊膜较含2mm AAM的仿生羊膜中hAMSCs的细胞总量高一倍，因此在植入宫腔应用过程中能够提供更多的hAMSCs来源，为宫腔内膜修复提供更充分的物质基础，但制造成本相应升高一倍。
本发明的仿生羊膜中，hAAM是由新鲜羊膜经一系列的物理、化学方法处理后得到的不含羊膜上皮细胞(上皮层)的生物膜，其一面保留了新鲜羊膜的呈纤维组织网状交错分布的三维结构(上皮细胞下方的网状纤维)，作为移植的基底和细胞支架，另一面保留了新鲜羊膜原有的基底膜(含有丰富的纤维组织)和基质层(即致密层、纤维母细胞层和海绵层，主要成分为胶原蛋白)，也保留了新鲜羊膜原来的生物力学特征。但是，hAAM的上皮层(网孔面)菲薄，单位体积中可载荷的细胞数量少，单纯作为细胞支架用于修复子宫内膜的作用有限，故迄今尚未见人脱细胞羊膜联合干细胞或其它生物学方法用于子宫内膜修复或IUA相关研究的报道。
本发明设计将人工羊膜中的hAMSCs定植于脱细胞羊膜上，形成“人脱细胞羊膜-人工羊膜”复合膜，一方面希望显著增加膜的干细胞数量，另一方面希望解决hAAM的上皮层菲薄导致可载荷的细胞数量少的问题，同时，还需要解决既往研究和发明技术中羊膜抗拉强度不足、延展性差和弹性不足的缺陷。
本发明通过大量研究，采用“夹心三明治结构”，采用两层hAAM，两层hAAM中具备双层的基底膜，且具备完整的基质层，不仅含有丰富的天然纤维组织，还含有大量的胶原蛋白，能够形成与新鲜羊膜力学特性较为接近的充分的生物力学强度，还保证了制备的BAM的弹性和抗拉力，解决既往研究和发明技术中羊膜抗拉强度不足、延展性差和弹性不足的缺陷。同时，中间层AAM中含有大量的具有生物活性的hAMSCs，可以充分发挥其生物学功能，达到真正的“仿生羊膜”效果，而且将AAM置于两层镜面对称的hAAM之间，在双层hAAM夹持和hAMSCs定植融合的固定作用下，使得制备的BAM具有除上皮层外其他所有羊膜结构的生物学和细胞学特点，较本发明最为接近的“果冻状”的单纯AAM具有更好的抗拉强度和应力特性。
本发明制备的仿生羊膜中，hAMSCs在细胞因子(TGF-β1+EGF+PDGF-BB)或子宫内膜间质细胞(endometrial stromal cells，ESC)提供的微环境中，能够向子宫内膜上皮细胞分化。而且，在AAM中，hAMSCs能保持良好的增殖能力，且呈现不规则球形生长的现象更加接近间充质干细胞原有特征，这种干细胞的特征有利于hAMSCs经体外培养后维持其分化能力，有利于将BAM植入宫腔后其中所含的hAMSCs向子宫内膜的特性发生转化。
实验例1hAMSCs与人新鲜羊膜共培养
将打孔后的(50孔/低倍视野)人新鲜羊膜和未打孔的人新鲜羊膜分别与hAMSCs共培养。培养基配置方法：向含10％胎牛血清(美国GIBCO公司)的DMEM/F12培养基(美国GIBCO公司)中加入100U/mL的青链霉素(美国GIBCO公司)。
结果如图1所示(A为未打孔人新鲜羊膜；B为打孔后人新鲜羊膜，可见羊膜上皮层缺损，呈凹陷状；C为打孔后人新鲜羊膜+hAMSCs；D为打孔后人新鲜羊膜+hAMSCs经PBS洗涤后)，发现未打孔组的新鲜羊膜与hAMSCs之间未形成粘附、融合的现象；打孔组的新鲜羊膜表面可见羊膜凹陷处(打孔处)hAMSCs呈簇生长，且具有hAMSCs在二维培养条件下的典型梭形结构特征，但与羊膜凹陷处的组织之间存在明显的间隙，经PBS浸泡洗涤后凹陷处呈簇生长的hAMSCs消失，表明两者间并未实现细胞-组织间的真正交互融合，只是羊膜打孔的凹陷部位为hAMSCs的生长提供了驻足的场所，该实验结果表明并不能通过打孔的方式将hAMSCs与人新鲜羊膜融合以达到增强人工羊膜力学性能的可能。
实验例3生物膜抗拉实验
剪取大小为1.5×1.5cm的本发明的BAM和单纯新鲜羊膜各5片，在其上方和下方距离边缘0.5cm处分别使用铁夹固定，上方铁夹固定于支架上，下方铁夹依次悬挂不同重量的微量砝码，重量逐渐递增，直至膜中间发生断裂，记录导致膜断裂时的砝码重量，此重量值为该膜的最大抗拉负荷。
实验结果：两组膜的抗拉负荷平均值分别为84.2g±11.5g和89.1g±13.7g，经独立样本t检验，两组间无显著差异(P＞0.05)，表明两种膜的抗拉强度并无明显差距，也即本发明的BAM与新鲜羊膜的抗拉强度相似，达到了良好的“仿生效果”。
实验例3细胞增殖实验
收集原代的hAMSCs，AAM中的hAMSCs和BAM中的hAMSCs，通过经典的胰酶消化—电动移液器轻轻反复吹打—4℃低温离心机高速离心—DMEM培养基重悬等多个步骤，分别得到3组hAMSCs的重悬液。
将细胞重悬液稀释调整至3×105cell/mL的浓度，使用市售CCK-8试剂盒，按照操作说明书进行细胞增殖率的检测。
经检测，BAM中hAMSCs的增殖活性(CCK-8OD值)显著高于AAM中hAMSCs和原代hAMSCs的增殖活性(经单因素方差分析检验P＜0.05，参见图4)。
实验例4BAM中所含hAMSCs的干细胞表型鉴定实验
分离本发明的BAM的“夹心结构膜”，提取BAM中的hAMSCs并用胰酶进行消化和培养基重悬，使用特异性细胞表面抗体，在流式细胞仪上进行细胞表面蛋白测定。
研究结果显示，hAMSCs细胞表面CD44、CD73、CD90以及CD105呈高表达，而CD45、34、11b、9和HLA-DR呈低表达(如图5所示)，符合间充质干细胞表型标志，表明本发明的BAM中的hAMSCs具有良好的间充质干细胞特性，可以分化成不同类型的细胞。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (10)

1.一种基于人羊膜及羊膜间充质干细胞的仿生羊膜，其特征在于，该仿生羊膜具有hAAM-AAM-hAAM的夹心结构，hAAM为人脱细胞羊膜，不含羊膜上皮细胞，hAAM的一面保留新鲜羊膜的呈纤维组织网状交错分布的三维结构，即上皮细胞下方的网状纤维，另一面保留了新鲜羊膜原有的基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层；AAM为通过羊膜间充质干细胞hAMSCs与BD基质胶制备的人工羊膜，两个hAAM的网状纤维面均处于内侧，AAM处于两个hAAM之间，且AAM中的hAMSCs通过细胞-基质连接结构定植于两层hAAM的网状纤维面的网孔中。
2.根据权利要求1所述的基于人羊膜及羊膜间充质干细胞的仿生羊膜，其特征在于，所述AAM的厚度为2~4mm。
3.根据权利要求1所述的基于人羊膜及羊膜间充质干细胞的仿生羊膜，其特征在于，所述AAM中，hAMSCs的细胞浓度为3~5×105/mL。
4.根据权利要求1所述的基于人羊膜及羊膜间充质干细胞的仿生羊膜，其特征在于，所述hAAM为通过将人新鲜羊膜组织依次经过戊二醛的交联和胰蛋白酶的消化，使人新鲜羊膜组织的上皮层细胞松解、脱落率达80%以上而获得的，其厚度为0.02~0.5mm。
5.一种如权利要求1-4中任意一项所述的基于人羊膜及羊膜间充质干细胞的仿生羊膜的制备方法，其特征在于，该方法包含：
将一片hAAM置于Transwell小室内底部，hAAM的网状纤维面向上，在其上放置AAM，再将另一片hAAM覆盖于在AAM上，且hAAM的网状纤维面向下与AAM接触，将Transwell小室置于加有相同培养基的孔板中，保证两层hAAM和中间AAM在培养期间的营养条件，从而使AAM中的hAMSCs通过细胞-基质连接结构定植于两层hAAM的网状纤维面的网孔中，形成具有hAAM-AAM-hAAM夹心结构的膜，获得基于人羊膜及羊膜间充质干细胞的仿生羊膜。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述AAM的制备为，用无血清的DMEM/F12培养基按1: 3稀释BD基质胶，在冰浴中融化稀释的BD基质胶，于冰浴中将hAMSCs与BD基质胶按1: 1混合注入孔板中，制成细胞浓度为3×105/mL的薄膜，在37℃培养使其成胶，加入适量DMEM/F12完全培养基，获得AAM。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，稀释后的BD基质胶的浓度为50μL/cm2生长面积。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述hAMSCs的提取为，将新鲜羊膜剪碎，加入0.25%胰蛋白酶消化，加入Ⅱ型胶原酶消化，收集细胞滤液并离心，重悬于含10%胎牛血清和100U/mL青链霉素的DMEM/F12培养基中，在37℃孵育；当细胞融合达到80%时，用0.25%胰蛋白酶消化，1: 3传代培养，获得3~5代生长状态好的hAMSCs。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述hAAM的制备为，将除杂后的人新鲜羊膜组织与戊二醛交联，使用0.25%胰蛋白酶消化至上皮层细胞松解、脱落率达80%以上，去除多余的胰蛋白酶，获得hAAM。
10.如权利要求1-4中任意一项所述的基于人羊膜及羊膜间充质干细胞的仿生羊膜的应用，其特征在于，该仿生羊膜用于制备宫腔内移植产品。
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