CN101366979A - 一种组织补片及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种组织补片及其制备方法，本发明是以脱细胞小肠粘膜下层为内层，其两面包裹覆有脱细胞羊膜所构成；所制备的组织补片以脱细胞羊膜隔绝了脱细胞小肠粘膜下层的免疫毒性；而脱细胞小肠粘膜下层补偿了脱细胞羊膜机械强度的不足，与现有产品相比，具有较高的生物活性和生物相容性，无明显免疫排斥反应，对细胞无毒性；同时制备方法具有原料来源不受限制，无细胞残留，能有效灭活病毒，不产生伦理道德问题的优点。所制备的产品适用于充当组织加强物，修复机体软组织强度不足或缺损；作为组织充填材料，用于颜面部凹陷畸形的修复。

Description

一种组织补片及其制备方法

技术领域

本发明属于组织工程的生物材料技术领域，具体涉及一种组织补片及其制备方法。

背景技术

覆盖创面理想的方法是移植自体皮，但由于自体皮源常常不充足，这样就需要皮肤替代物。而由细胞外基质构成组织补片具有其他类材料所难以比拟的生物相容性，是当前最有应用前景的创面覆盖物，主要包括异体和异种皮、羊膜类、动物腹膜、胶原膜等材料。

细胞外基质(extracellular matrix，ECM)为细胞的生存及活动提供适宜的场所，不仅是细胞的机械支撑组织，而且是营养供给和免疫应答的场所，参与调节胚胎发育进程，决定细胞的粘附与迁移，在创伤修复和纤维化、细胞的生长、分化、代谢和肿瘤发生及转移中起重要作用，并作为组织替代材料用于临床，在多种组织器官的修复中发挥着重要作用。其主要成分包括胶原蛋白、非胶原糖蛋白、弹力纤维、糖胺多糖、蛋白聚糖、与基质代谢相关的酶及细胞因子。

组织补片的促愈合作用表现在：具有一定的止血促凝作用，还可诱导多种细胞增殖分化；胶原蛋白不但可作为伤口凝血块的基底，而且是粒细胞、巨噬细胞、纤维母细胞的趋化性物质，为各种细胞的游走、附着、增殖提供支架。组织补片在创面最终降解为机体修复细胞所必需的氨基酸，为创面修复提供营养物质。

小肠粘膜下层(Small intestinal submucosa，SIS)来源于小肠，是一种天然的细胞外基质生物材料，主要由I、III型胶原蛋白构成，含有少量的IV、V型胶原蛋白，还包含有氨基葡聚糖和糖蛋白等，所含的氨基葡聚糖主要包括透明质酸、肝素、硫酸乙酸肝素、硫酸软骨素A和硫酸皮肤素。SIS在体内能引导和支持宿主细胞生长，逐渐完全降解，具有较强的机械强度，适用于组织工程的支架材料。然而SIS来源于动物，目前的产品在植入人体后不可避免地会产生免疫排斥反应，影响其临床应用的效果。

羊膜是人体最厚的基膜，来源广泛，其基底膜中含有纤维粘连素、层粘连素和I型胶原等成分。羊膜是由羊膜上皮和含有大量胶原纤维和成纤维细胞的基质层构成，其厚度为0.02～0.5mm，薄而透明，无血管。羊膜具有以下特征：(1)易于获得，制备简单，容易满足临床需求；(2)为半透膜，可允许小分子物质通过；(3)含一定量的胶原纤维，具有一定的弹性和韧性以及抗拉力，易于铺展；(4)几乎没有免疫排斥反应。研究表明，羊膜的抗体形成及其细胞免疫反应在各种条件下都是很低的，尚无发生严重排斥反应的报道。羊膜的缺点是厚度和强度不足，用于创面后容易降解，是制约其临床应用的瓶颈。

因此将SIS与羊膜结合可以克服两者的缺点，形成全新的、利于临床使用的组织补片。经检索，未见有此类产品的应用和文献报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提出一种组织补片及其制备方法，所制备的组织补片具有良好的机械强度、较高的生物活性和生物相容性，无明显免疫排斥反应，对细胞无毒性，同时制备方法具有原料来源不受限制，脱细胞效果好，无细胞残留，去除抗原成分的优点。

本发明所提出的组织补片，其特征在于：是以脱细胞小肠粘膜下层为内层，其两面裹覆有脱细胞羊膜层所构成，各膜层分别为1～4层结构。所述的脱细胞羊膜为人羊膜经脱细胞处理后所形成的膜状材料；所述的脱细胞小肠粘膜下层为哺乳动物小肠粘膜下层经脱细胞处理后所形成的膜状材料。

本发明所述组织补片的制备方法，包括有脱细胞羊膜和脱细胞小肠粘膜下层的制备，以及组织补片的构建，具体步骤如下：

步骤一，脱细胞羊膜的制备：取健康产妇胎盘，在无菌操作下剥离羊膜，用生理盐水冲洗干净，分离羊膜和绒毛膜获取羊膜，将其浸泡于含有1～4g/L胰蛋白酶和0.1～0.4g/L乙二胺四乙酸二钠的混合消化液中，消化不少于1小时，用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗后，再置入含有30～50U/ml的DNA酶溶液中浸泡25分钟以上，去除残留的DNA成分，降低免疫原性，用PBS漂洗后备用；

步骤二，脱细胞小肠粘膜下层的制备：将哺乳动物的空肠用水冲洗干净，切成片段，置于含有过氧乙酸和乙醇的水溶液中浸泡消毒不少于1小时，用磷酸盐缓冲液漂洗；刮除小肠粘膜、肌层和浆膜，用PBS漂洗干净；再将其置入0.1～1M的NaOH溶液中，于2～8℃条件下浸泡8分钟以上，达到溶解细胞、灭活病毒的目的，用PBS漂洗至中性；再置入含有DNA酶和α-半乳糖苷酶的混合溶液中浸泡25分钟以上，去除残留的DNA和α-gal天然抗原成分，降低免疫原性，最后用PBS漂洗干净备用；其中，所述过氧乙酸的终浓度(V/V)为0.1～0.5％，乙醇的终浓度(V/V)为2％～10％；所述DNA酶的终浓度为30～50U/ml，α-半乳糖苷酶的终浓度为10～25U/ml；

步骤三，组织补片的构建：将制备的脱细胞羊膜铺开展平，把制备的脱细胞小肠粘膜下层铺展于其上，再于其上覆盖所制备的脱细胞羊膜铺展，压紧使其紧密结合，干燥后灭菌，形成多层组织补片。所述的脱细胞小肠粘膜下层可以是1～4层叠加；任一面的脱细胞羊膜也可以是1～4层叠加；各层之间可以使用生物胶(包括胶原蛋白、纤维蛋白胶、透明质酸、硫酸软骨素、水凝胶、骨胶、明胶、果胶的任一种或是几种的混合)涂刷粘结，再用机械压紧的方法使各层间紧密黏附。

本发明所制备组织补片的主要用途有：(1)充当组织加强物，修复机体软组织的强度不足或缺损(疝、瘘等)；(2)修复皮肤缺损创面(烧烫伤、溃疡、供皮区、营养不良和感染创面等)；(3)用于颜面部凹陷畸形的修复，如颞部、颊部凹陷；(4)做为生物支架材料用于其他组织工程器官的制备，如组织工程化角膜、组织工程化耳鼓膜、组织工程化肌腱、组织工程化牙周膜、组织工程化周围神经等。

本发明制备的组织补片，以脱细胞羊膜包裹脱细胞小肠粘膜下层可以隔离脱细胞小肠粘膜下层的免疫毒性；而脱细胞小肠粘膜下层在内层起支撑作用，能补偿脱细胞羊膜机械强度的不足。本发明的制备方法简单、原料来源不受限制，不产生伦理道德问题，无细胞残留，使用强碱环境可有效地去除病毒，无化学物质残留，提高了产品的生物相容性。本发明的组织补片，具有较高的生物活性和生物相容性、无明显免疫排斥反应、对细胞无毒性的优点；具有一定的机械强度和韧性，其形状大小及厚度易于改变，便于临床缝合固定，可覆盖创面、充填软组织缺损、促进创周细胞的生长和增殖，满足创面修复的需要；也可做为生物支架材料用于其他组织修补材料的制备。

具体实施方式

以下结合实例详细说明本发明技术方案的具体实施方式。

实例一：

1、脱细胞羊膜制备：羊膜取自剖宫产健康产妇胎盘，在无菌操作下剥离羊膜，用生理盐水冲洗干净后，分离羊膜和绒毛膜获取羊膜，将其浸泡于含有1.25g/L胰蛋白酶和0.2g/L乙二胺四乙酸二钠的混合消化液中，37℃条件下振摇消化1小时，用PBS漂洗后，再将其置入含有30U/ml的DNA酶溶液中，于37℃条件下浸泡30分钟，用PBS漂洗后备用；

2、脱细胞小肠粘膜下层的制备：将猪小肠用水冲洗干净，切成片段，置于含有0.2％过氧乙酸和10％乙醇的水溶液中浸泡消毒2小时，用PBS漂洗；刮除小肠粘膜层、肌层和浆膜，用PBS漂洗干净；将其置入1M的NaOH溶液中，于4℃条件下浸泡10分钟，用PBS漂洗至中性；再将其置入含有40U/ml的DNA酶和10U/ml的α-半乳糖苷酶的混合溶液中，于37℃条件下浸泡30分钟，用PBS漂洗干净备用；

3、组织补片的构建：将制备的脱细胞羊膜和脱细胞小肠粘膜下层修剪成同样大小，把双层脱细胞羊膜铺开展平，将单层脱细胞小肠粘膜下层铺展于其上，再于其上覆盖双层脱细胞羊膜铺展，通过机械压紧使其紧密结合，将其伸展自然干燥后环氧乙烷消毒灭菌，形成多层组织补片。

本实例制备的组织补片具有厚度相对较薄，降解相对较快，可用于修复表浅的皮肤缺损创面；也可作为生物支架材料，开发其他组织工程产品。

实例二：

1、脱细胞羊膜制备：羊膜取自健康产妇胎盘，无菌操作下剥离羊膜，用生理盐水冲洗干净后，分离羊膜和绒毛膜获取羊膜，将其浸泡于含有2.5g/L胰蛋白酶和0.4g/L乙二胺四乙酸二钠的混合消化液中，37℃振摇消化1.5小时，用PBS漂洗后，再将其置入含有40U/ml的DNA酶溶液中，于37℃条件下浸泡30分钟，用PBS漂洗干净备用；

2、脱细胞小肠粘膜下层的制备：将牛小肠用水冲洗干净，切成片段，置于含有0.4％过氧乙酸和5％乙醇的水溶液中浸泡消毒4小时，用PBS漂洗；刮除小肠粘膜层、肌层和浆膜，用PBS漂洗干净，获得小肠粘膜下层；将小肠粘膜下层置入0.5M的NaOH溶液中，于4℃条件下浸泡30分钟，用PBS漂洗至中性；再将其置入含有50U/ml的DNA酶和20U/ml的α-半乳糖苷酶的溶液中，于37℃条件下浸泡30分钟，用PBS漂洗后备用；

3、组织补片的构建：将制备的脱细胞羊膜和脱细胞小肠粘膜下层修剪成同样大小，把三层脱细胞羊膜铺开叠加展平，将二层脱细胞小肠粘膜下层叠加铺展于其上，再于其上覆盖三层脱细胞羊膜叠加铺展，各层之间使用胶原蛋白进行涂刷粘结，再通过机械压紧使其紧密结合，最后将其冷冻干燥后钴60灭菌消毒，形成多层组织补片。

本实例制备的组织补片具有厚度相对较厚，机械强度较高，降解相对较慢，可用于充当组织加强物，修复机体软组织强度不足或缺损；修复皮肤缺损较深的创面。

Claims (4)

1.一种组织补片，其特征在于：是以脱细胞小肠粘膜下层为内层，其两面裹覆有脱细胞羊膜层所构成，各膜层分别为1～4层结构；所述的脱细胞羊膜为人羊膜经脱细胞后所形成的膜状材料；所述的脱细胞小肠粘膜下层为哺乳动物小肠粘膜下层经脱细胞后所形成的膜状材料。

2.制备权利要求1所述组织补片的方法，包括有脱细胞羊膜和脱细胞小肠粘膜下层的制备，其特征在于，具体步骤如下：

步骤一，脱细胞羊膜制备：将获取的羊膜浸泡于含有1～4g/L胰蛋白酶和0.1～0.4g/L乙二胺四乙酸二钠的混合消化液中，消化不少于1小时，用磷酸盐缓冲液漂洗后，再置入含有30～50U/ml的DNA酶溶液中浸泡25分钟以上，用磷酸盐缓冲液漂洗后备用；

步骤二，脱细胞小肠粘膜下层的制备：将哺乳动物的空肠用水冲洗干净，切成片段，置于含有过氧乙酸和乙醇的水溶液中浸泡消毒不少于1小时，用磷酸盐缓冲液漂洗；刮除小肠粘膜、肌层和浆膜，用磷酸盐缓冲液漂洗干净；再将其置入0.1～1M的NaOH溶液中，于2～8℃条件下浸泡8分钟以上，用磷酸盐缓冲液漂洗至中性；再置入含有DNA酶和α-半乳糖苷酶的混合溶液中浸泡25分钟以上，最后用磷酸盐缓冲液漂洗干净备用；

步骤三，组织补片的构建：把制备的脱细胞羊膜铺开展平，将制备的脱细胞小肠粘膜下层铺展于其上，再于其上覆盖所制备的脱细胞羊膜铺展，压紧使其紧密结合，干燥后灭菌，形成多层组织补片。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：在步骤二中，所述过氧乙酸和乙醇的最终体积浓度分别为0.1～0.5％和2％～10％；所述DNA酶和α-半乳糖苷酶的终浓度分别为30～50U/ml和10～25U/ml。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：在所述步骤三中的各膜层间使用生物胶涂刷粘结，再用机械压紧的方法使各层间紧密黏附。