CN103251987A - 一种脱细胞生物补片及其制备方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种脱细胞生物补片及其制备方法和装置。以猪小肠为原材料，经过酸、双氧水、高盐与碱的混合液等一系列脱细胞处理后，制得脱细胞生物补片。该制备方法经过双氧水处理后高盐与碱混合液循环处理两次便可达到彻底脱细胞去抗原的效果；采用横纵向交替铺叠的方式保持了补片机械性能的均一性，拉伸强度、缝线撕裂力、撕裂强度等力学指标能较好地满足临床需求，有利于手术缝合操作；采用的干燥方式无需使用任何胶黏剂和缝线固定，保持了产品天然的三维立体支架结构，植入人体后不会发生较强的炎症反应和免疫排斥反应；对细胞无毒性，在修复过程中不会发生感染和粘连。本发明适用于修复机体组织缺损、软组织损伤，还可用于生物工程领域，充当组织加强修复膜性缺损和感染创面、作为生物支架材料等。

Description

一种脱细胞生物补片及其制备方法和装置

技术领域

本发明属于组织工程学之医用生物材料技术，具体地说是一种天然脱细胞生物补片及其制备方法和制备装置。 

背景技术

细胞外基质(extracellular matrixc，ECM)是由动物细胞合成并分泌到胞外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子,主要是一些多糖和蛋白或蛋白聚糖，这些物质构成复杂的网架结构，支持并连接组织结构、调节组织的发生和细胞的生理活动。细胞外基质是各种组织器官的主要组织成份，为细胞的生存及活动提供适宜的场所，参与调节胚胎发育进程，决定细胞的粘附与迁移，在创伤修复和纤维化、细胞的生长、分化、代谢和肿瘤发生及转移中起重要作用。 

猪小肠粘膜下层（small intestinal submucosa，SIS）是一种天然的细胞外基质生物材料，主要由I、III型纤维胶原蛋白构成，含有少量的IV、V型胶原蛋白，还包含有氨基葡萄糖和糖蛋白等。由于SIS为天然结缔组织，作为异体移植物植入体内，不会引起明显的免疫排斥反应，是一种理想的生物材料。脱细胞后的猪小肠粘膜下层主要为三维胶原支架，植入体内后可诱导细胞的长入，通过细胞的增殖及细胞外基质的分泌，最终实现组织重建。 

猪小肠粘膜下层SIS作为支架材料，已有较为广泛的研究，其在体内能支持宿主细胞生长，逐渐完全降解，适合作为组织工程的支架材料；SIS已用作外科植入物在外科手术中广泛应用，包括腹壁的修复、膀胱的重建、硬脑膜的重建和疝修补等手术中，并表现出独特的优势。 

目前国内外用于制造外科补片的材料绝大部分是合成材料，如聚丙烯补片（PP），膨化聚四氟乙烯补片（PTFE），聚酯补片（PE）。美国专利US4902508报道—PTFE在血管移植中的成功率很低；另一合成材料Dacron（PE），在解剖过程中，为了避免手术中大量出血，在血管移植之前要进行血液预凝，而预凝处理增加了手术操作难度，降低成功率。合成材料最大的缺陷是抗感染率低，据报道合成材料引起感染的致死率在66%左右，合成补片属于部分甚至全部永久性异物存在于被修补组织内，术后患者有异物感，存在物理刺激引起的无菌炎症及慢性排异引起的后遗症，且容易发生感染和腹腔内粘连。 

复合材料是外科补片的另一主要材料，主要有半吸收复合材料与防粘连复合材料。半吸收复合材料，如聚羟基乙酸（PGA）、聚乳酸（PLA）及其共聚物PGA-PLA等，但很难控制其降解速度与组织的修复速度同步，常因降解过快会导致失去治疗作用，且降解产物造成局部强酸性，抑制被修补组织的正常生长。防粘连复合材料是用聚丙烯与膨化聚四氟乙烯复合而成，可隔离细胞不增殖进补片里，从而达到防止粘连的效果。 

据报道，使用合成材料和复合材料可能导致以下临床并发症：浆液肿、感染、组织顺应性降低、置入补片位置不适、慢性疼痛、补片收缩可能导致的复发和粘连等，这与组织对异物长期的慢性异物反应有关。随着生物材料的出现——具有良好组织屏障作用和抗感染能力的低细胞毒性、低抗原性的生物材料更有利于临床应用，合成补片和复合补片在临床上的弊端更加突出。 

生物材料对组织缺损区的修复愈合是通过内源性组织再生的过程来完成的，因此不会产生过量的瘢痕组织，也没有聚合体异物存留在体内而引发长期慢性炎症的风险。 

国外已有生物材料来源的生物补片，如来源于SIS的Surgisis和Restore，采用国际通用的脱细胞方法，如美国专利US6,206,931中介绍的处理方法；当混合液中过氧乙酸浓度为0.2%～1.0%，乙醇浓度为5.0%～25%，混合液与小肠质量比10:1～5:1，溶液pH2.0～2.6，混合充分后处理1～2小时后，DNA含量＜5μg/mg；溶液中加入10%过氧化氢，DNA含量＜2μg/mg。但是这样DNA残留含量仍然达不到彻底去除细胞的目的。 

现有技术多采用物理和化学联合使用的方法处理猪小肠，以达到脱细胞去抗原的目的。文献报道，物理和化学联合方法处理小肠，能够完全去除SIS中的细胞成分，但同时也存在不少缺点，如：物理方法包括超声波破裂，机械刮除和反复冻融等，能有效破坏细胞膜，释放细胞内物质，现有技术中机械刮除方法多采用直接刮除法，例如同类专利CN200780046919.2和美国专利6,206,931中提及清洗完小肠之后采用直接刮除方法去除粘膜层、肌层和浆膜层。然而直接刮除法所用力度较大，很容易造成材料撕裂或破损，甚至导致材料断裂，影响后续工艺进行，降低效率。反复冻融法，可能引起蛋白质的再折叠和冷变性，从而导致蛋白质的二硫键断裂、蛋白质失活。化学方法包括有机溶剂、酶消化处理和去垢剂，有机溶剂（如实验中常用到的有机溶剂氯仿/甲醇）可有效去除组织的脂肪成分，破坏细胞膜，具有去除细胞的作用。使用有机试剂虽然有较好的脱细胞效果，但存在有机试剂残留的缺点，产生较高的细胞毒性。酶消化技术脱细胞常用蛋白酶、钙螯合剂、核酸酶等，该处理可能损伤组织和器官的细胞外成分，酶作用时间过长及酶作用浓度过高都会破坏细胞外基质的正常结构。去垢剂处理一般比较常用的是0.5% 十二烷基硫酸钠（SDS），SDS常用作蛋白质的变性剂和助溶剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子折叠，破坏蛋白质的二、三级结构。几乎所有的蛋白质均可溶解于SDS，包括疏水和变性的蛋白质，因此SDS能较好地完全去除残留细胞核及胞质蛋白。实验研究表明，SDS会使正常的蛋白组织结构发生断裂，破坏胶原。 

目前多采用冷冻干燥作为小肠粘膜下层的干燥方法。例如中国专利200810150792.5、200680023043.5、200980125052.9中公开的冷冻干燥方法，但是冻干过程中，冷冻速率、冷冻时间、温度、真空度等诸多因素均可能导致多种诱导蛋白质变性。因而冻干过程不易控制，且耗时长成本高，很容易造成小肠粘膜下层中所包含的生长因子失活，而且材料韧性变差，易撕裂，影响临床使用效果。为此，有研究通过增加生物补片的厚度以改善生物补片的机械强度。例如，Cook Medical公司生产的Surgisis产品，是将多层脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料同方向叠加平铺或用缝线编织固定而成，但同一方向叠加平铺的方式未考虑脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料横向与纵向机械强度的差别，由于小肠粘膜下层基质的横向（垂直小肠肠道方向）和纵向（平行小肠肠道方向）的机械强度不同，因此会造成单一方向叠加平铺的多层材料存在横纵机械强度不均的问题，随着补片层数的增加，机械强度不均的问题会更加严重，从而影响手术操作及治疗效果；而缝线编织的方法存在缝线断裂，补片松散，在体内发生位移的风险，造成手术失败；另外，补片表面的缝线与组织直接接触，给患者造成异物感。中国专利200880127971.5公开了一种多层医疗移植产品，是采用粘合剂、胶、粘合聚合物或其他粘合剂的方法，增强多层材料粘合效果，提高力学性能，但同时会使材料密度变大，孔隙率变小，可能导致积液无法排出，引起感染等并发症，不利于植入后的血管及细胞迁入，材料与机体整合。 

综上所述，目前采用SIS制备生物支架材料尚存在的技术问题有：脱细胞去抗原不够彻底，会导致术后发生炎性反应、疼痛等，植入体内后存在病毒感染的潜在危险；冷冻干燥方式影响产品蛋白活性，从而影响材料组织结构的连接和细胞的生理活动；多层生物材料机械强度不均一，易造成补片撕裂，移位，缝线固定多层材料容易产生异物反应、免疫排斥等。 

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种脱细胞生物补片及其制备方法及其装置。本发明所制备的脱细胞生物补片，各方向机械强度均一；植入体内后无异物感， 免疫排斥小。 

本发明是这样实现的： 

本发明所制备的脱细胞生物补片，将脱细胞猪小肠粘膜下层铺展后，按照横向和纵向交替的方式叠加成膜状生物补片；生物补片上均匀分布有诸多贯穿孔，贯穿形孔的直径为1.5～3mm，孔间距为1.5～4cm； 

所述横向，是与猪小肠肠道垂直的方向，纵向是与猪小肠肠道平行的方向；横向、纵向交替叠加的脱细胞猪小肠粘膜下层生物材料为2～10层。 

本发明之脱细胞猪小肠粘膜下层生物补片的制备方法，具体步骤如下： 

步骤一、前处理：将已除去粘膜层，淋巴结、剖开的猪小肠用纯化水清洗至肠内无污物后，置于酸溶液中浸泡0.5～2.5小时，然后用纯化水清洗至pH6.0～8.0。所述的酸溶液可以为盐酸水溶液或乳酸水溶液或过氧乙酸水溶液中的一种，体积浓度为0.5～5.0%。 

酸有凝固蛋白的作用，步骤一采用酸溶液浸泡小肠，可以杀灭细菌繁殖体及芽胞，避免人畜共患疾病的传染。实验研究证实用酸溶液处理猪小肠，并测定荚膜病毒、无荚膜病毒，包括猪细小病毒、猪呼吸道肠道病毒、鼠白血病逆转录酶病毒和猪伪狂犬病毒的灭活效果，结果发现用酸溶液浸泡处理30分钟后，上述所有病毒均被灭活。 

步骤二、消毒处理：将步骤一处理后的猪小肠置于体积浓度为1～15%双氧水溶液中，浸泡0.5～2.5小时，纯化水清洗2～3次后用机械刮除肌层和浆膜层，保留粘膜下层；将小肠粘膜下层置于醇溶液中浸泡1～3小时后用纯化水漂洗至无味；所述醇溶液为70～90%盐酸乙醇溶液、或异丙醇溶液。所述的机械刮除方法有刀片刮除法或竹片刮除法、钢板刮除法、塑料卡片刮除法。 

此步骤采用双氧水溶液处理猪小肠，能有效破坏细胞膜，释放细胞内物质，便于从细胞外基质中清除残留物及剩余细胞内容物，避免破坏细胞外基质三维结构。醇类可迅速杀灭细菌，对真菌孢子也有一定杀灭作用，能够保证微生物限度降低为1cfu/cm2以下，另外醇类特别是乙醇对病毒也有良好的灭活作用。 

双氧水具有氧化作用，与细菌接触时，能破坏细菌菌体，杀死细菌。使用双氧水消毒时会有白色的小气泡产生，这是因为双氧水遇见灰尘、脏物也会分解，生成水和氧气。杀灭细菌后剩余的物质是无任何毒害、无任何刺激作用的水，不会形成二次污染。经过双氧水浸泡过的小肠其组织结构变得疏松，在刮除粘膜层、肌层和浆膜层时所使用的机械力相应减少，另外，机械刮除方法适用于解剖特点为自然平面的分层组织，天然猪小 肠组织外表面结构光滑致密，内层结构经双氧水浸泡之后充分发泡溶胀，组织结构变得较为柔软、蓬松，采用同方向机械刮除方法能够简便有效去除粘膜层、肌层和浆膜层，得到小肠粘膜下层。 

步骤三、脱细胞去抗原：采用高渗盐水与碱溶液的混合溶液联合脱细胞处理，将步骤二得到的小肠粘膜下层置于pH≥11的混合溶液中浸泡15～60分钟，处理温度2～25℃，优化温度15～25℃，混合液处理完之后更换为等量纯化水震摇1～3小时，如此盐碱混合液与纯化水交替循环1～3次，最后再用纯化水清洗至pH值6.0～8.0；所述高渗盐水为氯化钠水溶液、或氯化钾水溶液、或氯化钙水溶液，终浓度为1.0～5.0M，所述的碱溶液为氢氧化钠水溶液、或氢氧化钾水溶液、或氢氧化锂水溶液、或氢氧化钙水溶液、或是氨水溶液，终浓度为0.01～0.1M。 

小肠经过步骤二的双氧水浸泡后，组织结构疏松、发胀，本步骤采用碱盐混合溶液处理，容易进入组织内部，脱细胞效果显著。碱盐混合液循环处理两次就可以达到DNA残留量小于50ng/mg，相比美国专利US6,206,931中介绍的方法，DNA残留量＜2μg/mg，此方法具有脱细胞彻底、去抗原完全和灭活病毒的优点(附图4)。 

步骤四、脱细胞生物补片的制备：将步骤三得到的脱细胞猪小肠粘膜下层铺展后按照横向和纵向交替的方式叠加2～10层，经干燥制备成膜状生物补片，可按需求裁剪成所需尺寸和厚度，包装后灭菌，即得到可临床应用的脱细胞生物补片。干燥方式是常温风干2～12小时或真空干燥的方式，真空干燥温度为20～50℃，时间为5～12小时，空载真空度-0.09～0.096MPa。 

研究发现，由于脱细胞小肠粘膜基质材料纵向机械强度大于横向机械强度，本发明在铺叠时，采用横向与纵向交替铺叠的方法，克服材料自身机械强度不均的不足，提高材料力学均一性。检测结果证明，采用交替铺叠方法制备得到的脱细胞小肠粘膜基质多层补片，各方向拉伸强度几乎完全一致。而采用传统的技术——单一方向铺叠的多层补片，纵向方向拉伸强度较高，而横向方向拉伸强度则只有纵向的50～70%，这样就不利于手术过程中对补片进行多个方向的缝合操作，易发生纵向方向材料撕裂的现象。 

另外，本步骤采用自然晾干和真空干燥的方式，可以更加有效地保护产品中蛋白质的活性、SIS天然结构的完整性和各种天然成分及因子的活性。 

本发明在步骤三脱细胞去抗原以及清洗等步骤时，采用脱细胞反应装置。该装置主要由反应器顶盖和反应器腔体组成，腔体侧面和底端分别设有固定夹和进出液导管口。与反应器腔体相匹配的顶盖将容器密封，密封方式可以为插槽或螺栓或卡扣或螺旋—— 当反应器内注入液体时液体不会渗漏；在腔体两侧分别设有两个进液导管，一侧为盐与碱的混合液，一侧直接与纯化水管相连接；腔体底部设有出液导管，用以排出废液。使用时，打开反应器上端顶盖，在反应器中放入小肠粘膜下层片段，将其一端固定在反应器腔体侧面的固定夹上，固定之后的小肠粘膜下层在溶液中震荡时不会缠绕、打结而影响脱细胞效果。反应器可以选择长方体、立方体、圆柱体等形状的耐酸、耐碱、耐盐、耐腐蚀材料制作，材料种类可为有机玻璃、聚丙烯、聚四氟乙烯、碳钢等。并可辅以超声或震荡方式，超声频率为20～100KHz，间隔0.5～2.5h处理一次，每次10～15min；震荡可以采用水浴或气浴摇床，转速80～200rpm，或间隔震荡、或连续震荡。 

本装置特征还在于，在反应器腔体两侧和底部设置的进液导管和出液导管分别通过管路连接于循环泵，使容器内液体可以循环流动，流速控制在20～100mL/min。 

可有效灭菌灭病毒，保证脱细胞生物补片安全性，相比同类专利及国际通用方法，能够保留SIS中多种天然胶原及因子成分，可彻底去除异种细胞及抗原，避免植入人体内后免疫排斥反应发生；其特征还在于在脱细胞、清洗等处理过程中，采用特制的脱细胞反应器实现，可有效提高脱细胞、清洗效率，避免小肠粘膜下层发生缠绕打结，有利于产业化生产。 

本方法制备的生物补片用于腹壁修复以及疝修复手术，有生物相容性好，无过量瘢痕组织，无长期慢性炎症，组织粘连程度轻等优点。补片植入后，随着宿主组织的长入，生物补片逐步降解，最终生物补片完全被宿主组织代替。 

与现有产品相比，本发明制备的脱细胞生物补片具体优点体现在： 

本发明制备的脱细胞生物补片克服了传统机械强度不均的缺点，横纵向交替铺叠的方式保持了补片机械性能的均一性，在拉伸强度、缝线撕裂力、撕裂强度等力学指标中显示出明显的优势，满足临床需求，有利于手术缝合操作；采用的干燥方式无需使用任何胶黏剂和缝线固定，植入体内后免疫排斥小，无异物反应。 

与现有技术相比，本发明制备的脱细胞生物补片具体优点体现在： 

1）本发明采用酸和醇对小肠进行处理，酸溶液浸泡处理30分钟后，几乎可以杀灭小肠内所有病毒、细菌和真菌孢子。酸和醇的使用与现有技术中单纯使用低浓度的过氧乙酸相比，更加有效地保证了产品病毒灭活。 

2）双氧水浸泡小肠后结合机械刮除粘膜、肌层和浆膜层时，由于经过双氧水浸泡过的小肠其组织结构变得疏松，在刮除过程中所使用的机械力将相应减少；内层结构经双氧水浸泡之后充分发泡溶胀，组织结构变得较为柔软、蓬松，能够简便有效去除粘膜层、 肌层和浆膜层，得到小肠粘膜下层。同时避免了直接刮除法易造成材料撕裂或破损，甚至导致材料断裂的缺点。 

3）本发明脱细胞处理过程采用盐和碱联合使用的方法，循环处理1～3次就可以达到彻底的脱细胞效果（附图3，附图4）。由于在消毒步骤中使用双氧水浸泡过的小肠充分发泡溶胀，组织结构变得较为柔软、蓬松，采用碱盐混合溶液处理，容易进入组织内部，脱细胞效果显著；同时又避免了传统方法中化学试剂、去垢剂和酶难以去除彻底以及对材料结构破坏较为严重的缺点（附图2）。 

4）本发明制备的生物补片，根据材料自身机械强度特点从而确定生物补片不同方向的铺叠方法，相比单一方向简单铺叠的方式，能显著增强多层生物补片结构力学性能的均一性，避免了多层补片由于层数增多各个方向力学性能差异过大的缺点。 

5）干燥方式采取自然晾干或真空干燥方式，两种干燥方式温度均在20～50℃，可以保护产品中的蛋白质活性及多种天然胶原成分及因子（附图5）。 

6）脱细胞过程中脱细胞反应装置的应用，防止小肠相互之间的缠绕、打结，确保样品脱细胞均匀、彻底；处理相同数量小肠，使用脱细胞反应装置比之前使用人工换液及松解缠绕、打结后小肠的时间缩短了2.5小时。进出液导管的设计，不但避免了人工换液，节省人力、物力，而且操作简单方便，缩短了处理时间（附图1）。 

7）本发明制备的脱细胞生物补片，工艺操作简便，脱细胞过程中避免了各种有机试剂的使用，产品脱细胞彻底，无有机试剂残留，无DNA残留，细胞毒性低，在体内无明显免疫排斥反应，组织生物相容性良好（附图6）。 

8）本发明制备的脱细胞生物补片有良好的抗感染效果，补片植入后，不与腹腔内组织发生粘连，随着宿主组织的长入，补片逐步降解（附图7，附图8）。 

经动物实验表明，本发明制备的脱细胞生物补片用在腹壁缺损1～2周后炎症反应逐渐降低，补片与组织之间的生物相容性良好，不与腹腔内组织发生粘连；组织学结果显示，4～8周已经有大量的成纤维细胞迁入组织内，材料与组织已经开始慢慢整合。本发明制备的脱细胞生物补片用在犬的腹股沟疝修复中，4个月后腹腔内无粘连，伤口愈合良好，腹股沟区未见包块。腹腔内无粘连，手术区域无粘连，可见精索外口，材料与组织整合良好。 

附图说明

图1为本发明实施例之脱细胞反应器装置的结构示意图 

图中：1为反应器顶盖，2为混合液进液导管，3为纯化水进液导管，4为固定夹，5为出液导管。 

图2为制备的脱细胞生物补片在显微镜下所观察到的微观结构图片； 

图3为低浓度酸处理小肠粘膜下层的脱细胞方法与本发明所用的脱细胞方法 

制备的产品的电泳检测结果； 

图4为本实施例采用双氧水处理后碱盐混合液循环处理两次的组织学结果图片； 

图5为本发明制备的脱细胞生物补片经过干燥之后与新鲜小肠中所含胶原及各生长因子成分进行了结果对比； 

图6为本实施例制备的脱细胞生物补片在体内一、二、四、八周时实验照片； 

图7为本实施例制备的生物补片与合成补片分别应用于大鼠腹壁缺损的照片； 

图8为本实施例制备的生物补片用于腹壁缺损修复12w时取材的HE切片图片； 

图9为本实施例制备的生物补片用于腹股沟疝修复2个月时取材结果的图片。 

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明技术作进一步的说明。 

实施例1、脱细胞生物补片制备方法和装置之一 

本实施例的制备方法、步骤如下： 

步骤一、前处理：将已除去粘膜层、淋巴结而剖开的猪小肠，用纯化水清洗至肠内无污物后，置于体积浓度为2.0%的盐酸水溶液中浸泡2.5小时，然后用纯化水清洗至pH值6.0～8.0。 

步骤二、消毒处理：将步骤一处理后的猪小肠，置于体积浓度为15%双氧水溶液中，浸泡0.5小时，纯化水清洗3次后，用刀片刮除肌层和浆膜层，保留粘膜下层；将小肠粘膜下层置于70%乙醇溶液中浸泡1小时后，用纯化水漂洗至无味。 

步骤三、脱细胞去抗原：采用高渗盐水与碱溶液的混合溶液联合脱细胞处理，将步骤二得到的小肠粘膜下层置于pH≥11的盐碱混合溶液中浸泡60分钟，其优化处理温度为25℃，之后更换等量纯化水震摇1小时，如此盐碱混合液与纯化水交替循环处理3次，最后用纯化水清洗至pH值6.0～8.0。所述盐碱混合液为浓度为2.0M氯化钾和浓度为0.1M的氨水混合液。 

该脱细胞去抗原以及清洗时，采用脱细胞反应装置。该装置主要由反应器顶盖1和 反应器腔体组成，腔体两侧及底端设有固定夹4和混合液进液导管2出口、混合液出液导管5出口；与反应器腔体相匹配的反应器顶盖1将容器密封，密封方式可以为插槽或螺栓或卡扣或螺旋；在反应器腔体两侧分别设有两个进液导管，一侧为盐与碱的混合液进液导管2，一侧直接与纯化水进液导管3相连接；腔体底部设有出液导管5，用以排出废液；在腔体两侧和底部设置的进液导管和出液导管分别通过管路连接于循环泵，使反应器腔体内液体可以循环流动，流速控制在35mL/min； 

反应器腔体为有机玻璃制成的长方体。 

反应器可辅以超声，超声频率为20KHz，间隔0.5h处理一次，每次10min。 

步骤四、脱细胞生物补片的制备：将步骤三得到的脱细胞猪小肠粘膜下层铺展后按照横向和纵向交替的方式叠加2层，经干燥制备成膜状生物补片；按需求裁剪成所需尺寸和厚度，包装后灭菌，即得到可临床应用的脱细胞生物补片。干燥方式是常温风干2小时，风速3级。 

本实例制备的脱细胞生物补片产品处理强度高，2层产品叠加而成，力学强度较小，韧性强，脱细胞彻底，在体内无明显免疫排斥反应，可用于整形科或者耳鼻喉科修复等。 

实施例2、脱细胞生物补片制备方法和装置之二 

本实施例的制备方法、步骤如下： 

步骤一、前处理：将已除去粘膜层、淋巴结而剖开的猪小肠，用纯化水清洗至肠内无污物后，置于体积浓度为3.0%的乳酸水溶液中浸泡1.5小时，然后用纯化水清洗至pH值6.0～8.0。 

步骤二、消毒处理：将步骤一处理后的猪小肠，置于体积浓度为1%双氧水溶液中，浸泡2.5小时，纯化水清洗2次后，用竹片刮除肌层和浆膜层，保留粘膜下层；将小肠粘膜下层置于异丙醇溶液中浸泡3小时后，用纯化水漂洗至无味。 

步骤三、脱细胞去抗原：采用高渗盐水与碱溶液的混合溶液联合脱细胞处理，将步骤二得到的小肠粘膜下层置于pH≥11的碱盐混合溶液中浸泡15分钟，处理温度25℃，最后等量纯化水震摇3小时，如此盐碱混合液与纯化水交替循环1次，至pH值6.0～8.0。所述盐碱混合液为浓度为5.0M氯化钙和浓度为0.05M的氢氧化钾混合液。 

该脱细胞去抗原以及清洗时，采用实施例1的脱细胞反应装置。容器为聚丙烯制成的立方体。容器可辅以摇床震荡，采用气浴摇床，转速200rpm，连续震荡。 

步骤四、脱细胞生物补片的制备：将步骤三得到的脱细胞猪小肠粘膜下层铺展后按 照横向和纵向交替的方式叠加8层，经干燥制备成膜状生物补片；按需求裁剪成所需尺寸和厚度，包装后灭菌，即得到可临床应用的脱细胞生物补片。干燥方式采用真空干燥的方式——真空干燥温度为20℃，时间为12小时，空载真空度0.096MPa。 

本实例制备的脱细胞生物补片产品处理强度高，8层产品叠加而成，机械强度高、韧性强，脱细胞彻底，在体内无明显免疫排斥反应，生物相容性良好，具有一定的抗感染效果，不与腹腔内组织发生粘连，可用于肿瘤切除后的大面积缺损修复、腹壁全层修复和硬脑膜修复等（附图7，附图8）。 

实施例3、脱细胞生物补片制备方法和装置之三 

本实施例的制备方法、步骤如下： 

步骤一、前处理：将已除去粘膜层、淋巴结而剖开的猪小肠，用纯化水清洗至肠内无污物后，置于体积浓度为1.5%的过氧乙酸溶液中浸泡1.0小时，然后用纯化水清洗至pH值6.0～8.0。 

步骤二、消毒处理：将步骤一处理后的猪小肠，置于体积浓度为3%双氧水溶液中，浸泡1.5小时，纯化水清洗3次后，用不锈钢板刮除肌层和浆膜层，保留粘膜下层；将小肠粘膜下层置于80%乙醇溶液中浸泡2小时后，用纯化水漂洗至无味。 

步骤三、脱细胞去抗原：采用高渗盐水与碱溶液的混合溶液联合脱细胞处理，将步骤二得到的小肠粘膜下层置于pH≥11的碱盐混合溶液中浸泡40分钟，处理温度为20℃，之后更换等量纯化水震摇2小时，如此盐碱混合液与纯化水交替循环2次，最后用纯化水清洗至pH值6.0～8.0。所述盐碱混合液为浓度为3.0M氯化钠和浓度为0.05M的氢氧化钠混合液。 

该脱细胞去抗原以及清洗时，与实施例1的脱细胞反应装置相同。容器为聚四氟乙烯制成的圆柱体。容器可辅以摇床震荡，采用水浴摇床，转速90rpm，连续震荡。 

步骤四、脱细胞生物补片的制备：将步骤三得到的脱细胞猪小肠粘膜下层铺展后按照横向和纵向交替的方式叠加4层，经干燥制备成膜状生物补片；按需求裁剪成所需尺寸和厚度，包装后灭菌，即得到可临床应用的脱细胞生物补片。干燥方式，是常温风干10小时，风速4级。 

本实例制备的脱细胞生物补片产品处理强度相对较低，4层产品叠加而成，产品机械强度较高，柔韧性良好，脱细胞彻底，无细胞残留，无明显免疫排斥反应，在体内可迅速降解，可用于腹股沟疝修复、股疝修复等（附图9）。 

实验报告： 

本发明制备的脱细胞生物补片经过一系列体外检测实验，其检测结果如下： 

1.脱细胞生物补片HE、VG、Masson三色染色： 

脱细胞生物补片分别经HE、VG、Masson三色染色，染色结果如图2所示： 

图2为本实施例制备的脱细胞生物补片在显微镜下所观察到的微观结构图片。本发明的脱细胞处理工艺，可有效去除猪小肠粘膜下层的细胞，仅保留细胞外基质，其主要成分经HE、VG、Masson三色染色，HE染色高倍镜下（400倍）可见无完整细胞结构，VG、Masson染色表明剩余材料为胶原成分。 

2.琼脂糖凝胶电泳检测实验： 

本发明制备脱细胞生物补片的脱细胞方法与低浓度酸处理小肠粘膜下层的脱细胞方法通过电泳检测，其结果如图3所示： 

图3为低浓度酸处理小肠粘膜下层的脱细胞方法（方法一）与本发明所用的脱细胞方法（方法二）制备的产品的电泳检测结果。通过电泳检测，经本发明所用的方法二处理的SIS无明显的DNA残留，而方法一处理的SIS有大片段DNA残留。1为方法一处理的SIS；2和3为方法二处理的SIS；4为Marker。 

3.脱细胞生物补片HE组织学切片实验： 

本发明制备脱细胞生物补片所用的脱细胞处理方法经过HE染色后的实验结果如图4所示： 

附图4为本发明采用双氧水处理后碱盐混合液循环处理两次的组织学结果图片。A为过双氧水后刮除粘膜层、肌层和浆膜层后的组织学结果，B为碱盐混合液循环处理一次后的组织学结果，C碱盐混合液循环处理两次后的组织学结果。碱盐混合液循环处理两次之后，材料在高倍镜下检测无完整细胞结构，达到了彻底脱细胞的目的。 

4.成分测定实验： 

本发明制备的脱细胞生物补片经过干燥之后检测其中所含胶原及各生长因子成分，并与新鲜小肠结果进行了对比，检测结果如下述图表所示： 

上述图表为本发明制备的脱细胞生物补片经过干燥之后与新鲜小肠中所含胶原及各生长因子成分进行了结果对比，结果显示两组数据无明显差异。图表中，A为胶原含量对比结果，B为各生长因子含量对比结果。由两组检测结果可以看出，本发明所用的干燥方法有效地保护了产品中蛋白质的活性和各种生长因子的活性。 

根据一系列体外实验检测结果显示，本发明制备的脱细胞生物补片脱细胞彻底，保持了原材料中的蛋白活性及各种生长因子活性，将本发明制备的脱细胞生物补片应用于动物体内实验，有效性实验结果如下： 

1.脱细胞生物补片大鼠皮下植入实验 

本动物实验报告采用对8只SD大鼠进行皮下植入实验，动物性别不限，动物年龄均为成年，雌鼠无孕。分别在一、二、四、八周时对实验大鼠进行处死解剖取材，每个时间点取材2只大鼠，大体观察脱细胞生物补片在大鼠皮下残留情况，并进行组织学切片检测材料植入部位的组织相容性、炎症反应。 

组织学切片结果如上图5所示，图5为本发明制备的脱细胞生物补片在体内一、二、四、八周时实验照片。A为在体内一周照片，B为在体内二周照片，C为在体内四周照片，D为在体内八周照片。由图可见材料在体内一、四、八周炎症反应逐渐降低，表明该产品具有良好的生物相容性。 

2.脱细胞生物补片大鼠腹壁缺损实验 

2.1动物实验过程 

本动物实验报告分别采用本发明制备的对8只SD大鼠进行腹壁缺损动物实验有效性验证，动物性别不限，动物年龄均为成年，雌鼠无孕。分别在4、8、12、16周时对实验大鼠进行处死解剖取材，每个时间点脱细胞生物补片和合成补片修复大鼠各取材1 例，大体观察脱细胞生物补片对大鼠腹壁缺损的修复情况，并进行组织学切片检测材料的组织相容性、炎症反应以及降解情况等。 

2.2动物实验结果 

大体取材外观结果 

4w取材时修复部位大体情况如上图6所示，附图6为本发明制备的生物补片与合成补片分别应用于大鼠腹壁缺损的照片。A为本发明制备的脱细胞生物补片4w时的照片，B为合成补片4w取材时照片。生物补片在腹壁缺损修复中与腹腔内不发生粘连而合成补片有较为明显的粘连。 

组织学检测结果 

本发明制备的脱细胞生物补片取材后的材料形态，组织学切片结果如下图8所示，各时间点材料均保持良好的修复效果，没有发生腹腔内粘连、补片移位、肠瘘等并发症。大鼠腹壁缺损修复12周后仍能从组织学切片看到有较多材料剩余，材料内部炎症细胞已几乎没有，大量成纤维细胞逐渐迁入材料内部，脱细胞生物补片生物相容性良好。 

图7为本发明制备的生物补片用于腹壁缺损修复12w时取材的HE切片图片。12w时在组织周围还可以清晰地看见材料，在材料中间已经有大量的成纤维细胞浸润，而且有纤维结蹄组织形成，材料与组织已经开始整合。 

3.脱细胞生物补片犬的腹股沟疝修复实验 

3.1动物实验过程 

本动物实验采用对4只犬进行腹股沟疝实验有效性验证，犬性别不限，年龄均为成年，雌犬无孕。分别在2、4个月时对实验犬进行处死解剖取材，每个时间点取材2只犬，大体观察脱细胞生物补片对犬腹股沟疝的修复情况，并进行组织学切片检测材料的组织相容性、炎症反应以及降解情况等。 

3.2动物实验结果 

于术后2、4个月时对4只实验犬进行处死解剖取材，每个时间点取材2只犬，大体观察脱细胞生物补片对犬的腹股沟疝修复情况，并进行组织学切片检测材料在犬腹股沟区的组织相容性、炎症反应以及降解情况等。实验结果如下图8所示： 

在2、4个月取材时大体情况如上图8中，A、B所示，各时间点观察犬腹股沟区的修复情况，伤口愈合良好，腹股沟区未见包块，未见手术区域粘连，能够清楚分离精 索，显露精索内外口，材料较完整，略显淡黄色，未见材料与组织粘连，可吸收缝线完好。 

图8为本发明制备的生物补片用于腹股沟疝修复2个月时取材结果。2个月后腹腔内无粘连，材料与组织无明显炎症反应，材料间已有大量细胞迁入。A为修复2个月后外观大体照，B为修复区材料外观大体照，C为2个月取材组织学结果。 

图9为本发明制备的生物补片用于腹股沟疝修复2个月时取材结果。2个月后腹腔内无粘连，材料与组织无明显炎症反应，材料间已有大量细胞迁入。A为修复2个月后外观大体照，B为修复区材料外观大体照，C为2个月取材组织学结果。 

Claims (10)

1.一种脱细胞生物补片，采用已经脱细胞的猪小肠粘膜下层，其特征在于：将脱细胞猪小肠粘膜下层铺展后，按照横向和纵向交替的方式叠加成膜状生物补片；生物补片上均匀分布有诸多贯穿孔，贯穿形孔的直径为1.5～3mm，孔间距为1.5～4cm； 

所述横向，是与猪小肠肠道垂直的方向，纵向，是与猪小肠肠道平行的方向； 

横向、纵向交替叠加的脱细胞猪小肠粘膜下层生物材料为2～10层。 

2.一种脱细胞生物补片的制备方法，其特征在于，具体步骤如下： 

步骤一、前处理：将已除去粘膜层、淋巴结而剖开的猪小肠，用纯化水清洗至肠内无污物后，置于酸溶液中浸泡0.5～2.5小时，然后用纯化水清洗至pH6.0～8.0； 

所述的酸溶液可以为盐酸水溶液或乳酸水溶液或过氧乙酸水溶液中的一种，体积浓度为0.5～5.0%。 

步骤二、消毒处理：将步骤一处理后的猪小肠，置于体积浓度为1～15%双氧水溶液中，浸泡0.5～2.5小时，纯化水清洗2～3次后，用机械刮除肌层和浆膜层，保留粘膜下层；将小肠粘膜下层置于醇溶液中浸泡1～3小时后，用纯化水漂洗至无味； 

步骤三、脱细胞去抗原：采用高渗盐水与碱溶液的混合溶液联合脱细胞处理，将步骤二得到的小肠粘膜下层置于pH≥11的碱盐混合溶液中浸泡15～60分钟，处理温度2～25℃，最后用纯化水清洗至pH值6.0～8.0； 

步骤四、脱细胞生物补片的制备：将步骤三得到的脱细胞猪小肠粘膜下层铺展后按照横向和纵向交替的方式叠加2～10层，经干燥制备成膜状生物补片；按需求裁剪成所需尺寸和厚度，包装后灭菌，即得到可临床应用的脱细胞生物补片。 

3.根据权利要求2所述脱细胞生物补片的制备方法,其特征在于：所述步骤一中的酸溶液为盐酸水溶液或乳酸水溶液或过氧乙酸水溶液中的一种，体积浓度为0.5～5.0%。 

4.根据权利要求2所述脱细胞生物补片的制备方法,其特征在于：所述所述步骤二中的醇溶液，为70～90%乙醇溶液、或异丙醇溶液。 

5.根据权利要求2所述脱细胞生物补片的制备方法,其特征在于：所述所述步骤二中的机械刮除方法，系指刀片刮除法、或竹片刮除法、或钢板刮除法、或塑料卡片刮除法。 

6.根据权利要求2所述脱细胞生物补片的制备方法,其特征在于：所述步骤三中小肠粘膜下层置于pH≥11的碱盐混合溶液中浸泡15～60分钟，其优化处理温度为15～25℃，之后换等量纯化水在摇床中震摇1～3小时，如此盐碱混合液与纯化水相互交替循环1～3次。 

7.根据权利要求2所述脱细胞生物补片的制备方法,其特征在于：所述步骤四中的干燥方式，是常温风干2～12小时，或真空干燥的方式——真空干燥温度为20～50℃，时间为5～12小时，空载真空度-0.09～0.096MPa。 

8.一种脱细胞生物补片的制备装置，其特征在于：采用脱细胞反应装置。该装置主要由反应器顶盖（1）和反应器腔体组成，腔体两侧设有固定夹（4）和混合液进液导管（2）出口、混合液出液导管（5）出口；与反应器腔体相匹配的反应器顶盖（1）将反应器密封，密封方式可以为插槽或螺栓或卡扣或螺旋；在腔体两侧分别设有两个进液导管，一侧为盐与碱的混合液进液导管（2），一侧直接与纯化水进液导管（3）相连接；腔体底部设有出液导管（5），用以排出废液；在腔体两侧和底部设置的进液导管和出液导管分别通过管路连接于循环泵，使反应器内液体可以循环流动，流速控制在20～100mL/min。 

9.根据权利要求8所述脱细胞生物补片的制备装置，其特征在于：所述脱细胞反应装置可以选择长方体、立方体、圆柱体等形状的耐酸、耐碱、耐盐、耐腐蚀材料制作，材料种类可为有机玻璃、聚丙烯、聚四氟乙烯、碳钢等。 

10.根据权利要求8所述脱细胞生物补片的制备装置，其特征在于：所述脱细胞反应器可辅以超声或震荡装置，超声频率为20～100KHz，间隔0.5～2.5h处理一次，每次10～15min；震荡可以采用水浴或气浴摇床，转速80～200rpm，或间隔震荡、或连续震荡。 

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