CN106039405A - 一种细胞外基质复合生物补片的制备方法 - Google Patents

一种细胞外基质复合生物补片的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种细胞外基质复合生物补片的制备方法。具体而言，包括将多个细胞外基质单元沿一个方向X依次部分重叠放置形成一个铺设层A，在铺设层A上方沿与X垂直的方向Y重复前述步骤得到铺设层B，根据需要重复前述步骤铺至需要的层数，然后将铺设好的材料加压成型；其中，在铺设层A和B之间加入ECM胶，所述ECM胶通过将ECM单元冻干、粉碎、经蛋白酶处理制得。该方法制备的复合生物补片拉伸强度得到提高，且减少了对ECM的损耗。

Description

一种细胞外基质复合生物补片的制备方法
技术领域
本发明涉及一种细胞外基质复合生物补片的制备方法。
背景技术
细胞外基质(extracellular matrix，ECM)是种复杂的动态系统，其不仅是维持组织和器官所必需的生物支架、避免组织和器官溶解成一团糊状，此外还能释放重要的信号分子、调控机体进行自我修复。目前市场上应用的ECM生物材料主要包括小肠黏膜下层(small intestinal submucosa,SIS)、膀胱黏膜层基底膜(urinarybladder membrane,UBM)、羊膜、真皮、心包、腹膜等，用其制成的生物补片具有与人体生物相容性好、无异物反应等优点。
由于疝重建及硬脑膜修复等疾病对修复材料均有一定的位伸强度和尺寸的要求，而单片ECM(如SIS和UBM)生物材料其抗拉强度及大小远满足不了需求，这就需要用若干片ECM材料复合成型来达到一定的尺寸和强度，以满足临床需求。
已报道一些ECM生物材料复合重叠方法(如CN 103877619A)，但其材料重叠过多(大于1cm)易造成产品局部不均匀明显、复合成型的工艺对产品拉伸强度的增加也有限、且对生物材料的损耗也较严重，日后规模化生产，对经济效益有一定影响。
发明内容
本发明提供了一种细胞外基质复合生物补片的制备方法，所述方法包括如下步骤：
1)将多个细胞外基质单元沿一个方向X依次部分重叠放置形成一个铺设层A，根据需要可沿与其垂直的Y方向依次部分重叠铺设多列铺设层A；
2)在铺设层A上方沿与X垂直的方向Y重复步骤1)的步骤得到铺设层B，根据需要可沿X方向依次部分重叠铺设多列铺设层B；
3)根据需要重复前述步骤铺至需要的层数；
4)将铺设好的材料加压成型：
其中，在细胞外基质单元之间或铺设层A和B之间加入ECM胶，所述ECM胶通过将ECM单元冻干、粉碎、经蛋白酶处理制得。
所述步骤1)的铺设可以在平板上进行，步骤3)完成后在铺设材料的上方铺一块平板；优选两个步骤中的平板选自酚醛塑料、聚乙烯、环氧树脂、聚甲基丙烯酸甲酯中的一种或两种。
在本发明优选的实施方案中，所述平板带有多个贯穿孔，优选孔的形状为正方形、菱形或圆形。
在本发明优选的实施方案中，所述的平板和细胞外基质之间可以铺设医用纱布。
根据临床实践，步骤3)中的层数优选为2至20层。
处理ECM的蛋白酶来源没有特别限制，在本发明优选的实施方案中其选自胃蛋白酶或胰蛋白酶，优选其浓度为0.05％－3％。
ECM(浓度为0.1－100mg/ml，溶于水中)经蛋白酶处理的时间可根据实际情况选择，本发明优选的实施方案中处理时间为6－24个小时。
为使用方便，ECM经蛋白酶处理后还可通过加热使蛋白酶灭活，优选加热温度为70－90℃。
在本发明优选的实施方案中，铺设层A和铺设层B可分别单独铺设，铺设完成时分别单独加压，然后再垂直放置后铺设至需要的层数并再次加压成型。
本发明中的加压方法可以采用机械加压或者抽真空加压的方法，在本发明优选的实施方案中，步骤4)中加压方法为抽真空加压。在本发明特别优选的实施方案中，所述抽真空加压包括将铺设好的两面带有酚醛塑料板的细胞外基质材料置于一个一侧带孔的自封袋中，然后抽真空的步骤；优选所述自封袋为加厚自封袋；优选所述孔在自封袋一侧中央。抽真空的时间可根据材料的性质选择，优选为2－12分钟。
为了增强生物补片的强度，在步骤4)加压后得到细胞外基质复合生物补片可以经冻干后用可吸收线缝合。
为了节省ECM材料的用量，步骤1)、2)中重叠部分的宽度为0.1-1cm之间。
ECM的来源不受特别限制，考虑到原材料的可得性，本发明中所使用的细胞外基质材料优选选自SIS或UBM。
本发明还提供了一种通过上述方法制备得到的复合生物补片。
本发明中所述的X和Y方向的垂直关系指的是二者大致成90度，但不意味着其必须是精确垂直的，只要能够起到降低产品的各向异性，提高ECM的拉伸强度的作用，即满足本发明中所述的“垂直关系”。
在本发明的制备方法中，“任选”一词意指可以做也可以不做，例如步骤2中将所得铺设层A经加压成型的步骤，就是可以有也可以没有的步骤。
使用本发明的方法制备成的生物补片具有的优点是：(1)每个ECM单元间复合紧密，且产品拉伸强度高(大于85N/cm)；(2)复合重叠部位短，节省材料，规模化生产可产生较大经济效益；(3)复合后的材料整体均匀性好；(4)复合所用胶水完全可吸收，无异物反应。
附图说明
图1为本发明实施例1中小肠组织纵向、横向；
图2为本发明实施例1中每个铺设层内SIS铺设模式；
图3为本发明实施例1中多列SIS层A的铺设模式(图中为3列)；
图4为本发明实施例1中相邻铺设层间铺设模式。
具体实施方式
以下结合实施例用于进一步描述本发明，但这些实施例并非限制本发明的范围。
实施例1：
(1)SIS或UBM的制备：猪小肠或膀胱经机械处理后得SIS或UBM材料，经过氧乙酸+乙醇消毒并清洗后，得SIS或UBM。
A、将SIS沿肠管纵向剖开，并沿横向将SIS裁剪成5－30cm纵向长度的SIS单元；
B、UBM不需裁剪，直接到下一步(其余方法同SIS)。
(2)ECM胶水的制备：如将SIS或UBM单元置于冻干机冻干，得固体SIS或UBM，并用粉碎机粉碎得SIS粉末。取一定量SIS或UBM粉末(浓度为0.1－100mg/ml)置于一定浓度(浓度0.05％－3％)的胃蛋白酶或胰蛋白酶消化6－24h，制得SIS或UBM胶水，最后加热至70－90℃，保温10-50min，使蛋白酶灭活，贴签保存备用。前述浓度指的是这些物质溶于水的浓度。
(3)取一A4纸大小(30*21cm)酚醛塑料材质平板[均匀分布有许多贯穿孔(图案有正方形、菱形、圆形等)]平铺在台面上，并在平板上铺一层医用沙布或不铺，将由(1)中所得第一块SIS单元平铺在医用沙布的左上端，将第二个SIS单元与第一个SIS单元部分重叠放置，并沿纵向方向错开一定距离，保证两个SIS单元的横向平行，两个SIS单元的重叠部分宽度在0.1-1cm之间，第三个SIS单元沿之前纵向方向与第二个SIS单元部分重叠放置，同样使两个SIS单元的横向平行，两个SIS单元的重叠部分宽度0.1-1cm，依次重复，从左上端往左下端方面直至SIS铺满整张不锈钢板(若需铺第二列时，两SIS单元除需纵向重叠0.1-1cm外,横向也需重叠0.1-1cm)，得SIS层A。在铺设得到的SIS层A上涂一层步骤按步骤(2)方式制得的SIS胶水。
(4)将铺好的SIS层A在台面上旋转90°角，方法同步骤(4)，另取SIS单元沿旋转90°后的SIS层A左上端边缘开始重叠铺设，直至铺满整张酚醛塑料板，得SIS层B；如果需要继续往SIS层B上铺设SIS层A，则在该SIS层B上涂一层步骤按步骤(2)方式制得的SIS胶水。
(5)根据需要重复上述步骤(4)和(5)铺设至所需层数(2－12层)；
(6)再用一块医用沙布铺在设定好的层数上，再在其上面压上另一块带贯穿孔的酚醛塑料板，并在沙布上铺层吸水滤纸或脱脂棉。
(7)将上述两块酚醛塑料板及其之间铺设的材料夹紧，并加压，即可得到所需的复合生物补片。
实施例2
(1)真空层压装置的制作：将一台真空泵用橡胶管连接一双嘴抽滤瓶一端，并将抽滤瓶置于装有干冰的泡沫箱内，待用。
(2)层压袋的制作方法：取一只10号(24*34cm)加厚自封袋，在其一侧中央钻一中心孔，并将一小型漏斗(如：测肺活量吹嘴)小的一端从自封袋内往外穿过中心孔。加厚自封袋的大小可根据不锈钢板的尺寸来定，从1号(6*8.5cm)到12号(45*34cm)。
(3)将实施例1步骤(6)中铺好的酚醛塑料板放入(2)中的层压袋，并将(2)中小型漏斗倒扣在最上一层酚醛塑料板上。
(4)将(3)中露出的漏斗嘴通过橡胶管连接到(1)中抽滤瓶的另一端。启动真空泵，开始层压工艺，持续时间2min-12h。
实施例3
按照实施例类似方法制备复合生物补片，不同之处在于步骤(3)中铺设得到SIS层A后即按照步骤(6)、(7)的方法将该层A夹紧，然后涂胶；铺设层B也采用前述类似步骤单独夹紧后再铺至已夹紧过的层A之上。
实施例4
按照实施例1中SIS胶水制备工艺制好2mg/ml SIS胶水，备用。取一A4纸大小酚醛塑料板，按“复合成型前技术方案中步骤(3)、(4)”方法(重叠部分长度为0.5cm)，涂胶并复合6层，按实施例2启动层压工艺，得一复合成型6层SIS生物补片，置于冻干机(-50℃，真空50μbar条件下，冻干16小时)，得SIS生物补片成品。(用拉力测试仪测得拉伸强度为121N)。
实施例5
按照实施例1中UBM胶水制备工艺制好3mg/ml UBM胶水，备用。取一B5纸大小聚乙烯板，按“复合成型前技术方案中步骤(3)、(4)”方法(重叠部分长度为0.8cm)，涂胶并复合4层，启动层压工艺，得一复合成型4层UBM生物补片，置于冻干机(-45℃，真空20μbar条件下，冻干12小时)，得UBM生物补片成品。(用拉力测试仪测得拉伸强度为103N)。

Claims (17)

1.一种细胞外基质复合生物补片的制备方法，所述方法包括如下步骤：
1)将多个细胞外基质单元沿一个方向X依次部分重叠放置形成一个铺设层A，根据需要可沿与其垂直的Y方向依次部分重叠铺设多列铺设层A；
2)在铺设层A上方沿与X垂直的方向Y重复步骤1)的步骤得到铺设层B，根据需要可沿X方向依次部分重叠铺设多列铺设层B；
3)根据需要重复前述步骤铺至需要的层数；
4)将铺设好的材料加压成型：
其中，在细胞外基质单元之间或铺设层A和B之间加入ECM胶，所述ECM胶通过将ECM单元冻干、粉碎、经蛋白酶处理制得。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述步骤1)的铺设在平板上进行，步骤3)完成后在铺设材料的上方铺一块平板；优选两个步骤中的平板选自酚醛塑料、聚乙烯、环氧树脂、聚甲基丙烯酸甲酯中的一种或两种。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其中所述平板带有多个贯穿孔，优选孔的形状为正方形、菱形或圆形。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其中所述的平板和细胞外基质之间铺有医用纱布。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤4)中的层数为2至20层。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述ECM胶的浓度范围为0.1－100mg/ml。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述蛋白酶为胃蛋白酶或胰蛋白酶，优选其浓度为0.05％－3％。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其中ECM经蛋白酶处理的时间为6－24个小时。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其中ECM经蛋白酶处理后还包括加热使蛋白酶灭活的步骤，优选加热温度为70－90℃。
10.根据权利要求2或3所述的制备方法，其中步骤4)中加压方法为抽真空加压。
11.根据权利要求9所述的制备方法，其中所述抽真空加压包括将铺设好的两面带有酚醛塑料板的细胞外基质材料置于一个一侧带孔的自封袋中，然后抽真空的步骤；优选所述自封袋为加厚自封袋；优选所述孔在自封袋一侧中央。
12.根据权利要求9所述的制备方法，其中所述抽真空持续2－180分钟。
13.根据权利要求1所述的制备方法，还包括加压后得到细胞外基质复合生物补片经冻干后用可吸收线缝合的步骤。
14.根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤1)、2)中重叠部分的宽度为0.1-1cm之间。
15.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于还包括将铺设层A或铺设层B单独加压的步骤。
16.根据权利要求1所述的制备方法，所述的细胞外基质选自SIS或UBM。
17.一种通过如权利要求1－14任意一项所述的制备方法制备得到的生物补片。
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