KR102430470B1 - 3d 프린팅 기술을 이용하여 정렬된 콜라겐 섬유를 포함하는 투명한 각막 조직의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명의 각막 조직 제조방법은 각막 조직 유래 하이드로겔을 원료로 사용하고 압출 기반의 3D 프린팅 노즐을 통해 원료를 압출하면서 특정 범위의 전단응력(Shear stress)을 가하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 압출 기반 3D 프린팅 방법을 사용하는 경우 각막 세포에 손상을 주지 않고 동시에 투명하면서도 정렬된 형태의 콜라겐 섬유를 갖는 각막 조직을 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법으로 제조된 각막 조직은 콜라겐 배열능, 콜라겐 분비 등과 같은 각막 세포의 효능 활성도가 피펫팅으로 제조한 각막 조직에 비해 2배 이상 증가할 뿐만 아니라 투명도 역시 실제 각막의 투명도 이상으로 향상된 물리적 특성을 보인다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 각막 조직을 토끼에 이식하는 경우 이식된 각막이 주변 각막 조직과 잘 융합되어 염증 반응을 일으키지 않으면서 실제 각막과 유사한 투명도를 보인다.

Description

3D 프린팅 기술을 이용하여 정렬된 콜라겐 섬유를 포함하는 투명한 각막 조직의 제조방법{Manufacturing method of transparent corneal tissue containing aligned collagen fibrils using three dimensional printing}

본 발명은 각막 조직의 제조방법 등에 관한 것으로서, 더 상세하게는 3D 프린팅 기술을 이용하여 각막 세포에 손상을 주지 않고 투명하면서도 정렬된 형태의 콜라겐 섬유를 갖는 인공 각막 조직을 제조하는 방법 등에 관한 것이다.

인체 내 조직 및/또는 장기는 주로 세포 및 세포외기질(Extracellular matrix, ECM)로 구성되며, 상기 세포외기질은 콜라겐(Collagen), 글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycan, GAG) 등을 포함하는 다양한 형태의 단백질로 이루어져 있다. 그 중 콜라겐은 세포외기질의 구조를 담당하는 섬유 단백질로서, 조직 및/또는 장기의 물리적/기계적 특성과 직접적인 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 콜라겐 섬유의 공간적 조직화는 섬유성 매트릭스에 조직 특이적인 기계적 특성을 부여하고, 세포의 부착, 증식, 분화 및 이동을 매개한다. 예를 들어, 심장 판막 조직 내의 굽어지는 방향에 있는 면은 접선 방향의 콜라겐 섬유 패턴을 가지는 반면, 굽어지지 않는 방향에 있는 면은 방사 방향의 콜라겐 섬유 패턴을 가진다. 또한, 근육 조직은 섬유 다발이 뻗어 나가는 방향으로 수축하는 기능을 수행하는 콜라겐 기반 근섬유로 구성되어 있다. 또한, 각막 조직은 콜라겐 섬유의 격자 무늬 패턴으로 인해 안구 내부 압력을 견딜수 있으며 투명한 특성을 보인다.

각막은 시력에 요구되는 고도의 조직화된 콜라겐 구조를 가지며, 이를 통해 눈에 투명한 광학적 창과 가장 높은 굴절력을 제공한다. 각막 기질(Corneal stroma)의 내부 콜라겐 패턴은 각막의 투명도에 영향을 미친다. 최근의 연구는 콜라겐 섬유 구조를 제어하고 합성 및 천연 생체 재료를 사용하여 투명한 각막 구조를 복제하기 위한 다양한 방법을 제안하고 있다.

예를 들어, 대한민국 등록특허공보 제10-0970193호에는 1) 인간으로부터 분리·배출된 조직을 콜라게나아제(collagenase), 프로테아제(protease) 또는 이들의 혼합물로 처리하는 단계; 2) 상기 단계 1에서 효소처리된 조직을 염기 존재 하에 과산화수소(H2O2)와 반응시켜 당단백질을 제거하는 단계; 3) 상기 단계 2에서 얻어진 조직을 공기 중에 건조시켜 투명 콜라겐 기질을 수득하는 단계; 및 4) 상기 단계 3에서 얻어진 투명 콜라겐 기질을 가교결합시키는 단계를 포함하는, 각막 제조용 투명 콜라겐 기질의 제조방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-1717234호에는 각막을 숯(charcoal)이 포함된 정제수에 넣고 탈세포 처리하는 단계; 및 상기 처리된 각막의 세포외 기질을 저장액(hypotonic solution)내에서 교반하여 후처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 각막 생성방법과 함께 숯(charcoal)에서 방출되는 음이온을 통해 각막의 세포외 기질을 구성하는 콜라겐(collagen) 또는 객(glycosaminoglycans) 표면의 음전하를 안정화시키는 내용이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-1859654호에는 동물 각막조직의 세포외 부분인 탈세포화 세포외 기질과 콜라겐 용액을 준비하고, 상기 탈세포화 세포외 기질 용액과 콜라겐 용액의 혼합액을 몰드에 주입하여 탈세포화 세포외 기질과 콜라겐 겔을 함유하는 성형체를 제조하고, 압축기를 사용하여 상기 성형체에 30 gf 내지 2,000 gf의 압력으로 가압하여 압축 및 탈수공정을 수행하는 단계를 포함하는 인공 각막시트의 제조방법이 개시되어 있다.

본 발명은 종래의 기술적 배경하에서 도출된 것으로서, 본 발명의 목적은 각막 세포에 손상을 주지 않고 동시에 투명하면서도 정렬된 형태의 콜라겐 섬유를 갖는 각막 조직을 제조하는 방법을 제공하는 데에 있다. 또한, 본 발명의 목적은 각막이 손상된 환자에 필요한 각막 이식체로서 유용한 인공 각막 소재를 제공하는데에 있다.

본 발명의 발명자들은 각막 조직 유래 하이드로겔을 원료로 사용하고 압출 기반의 3D 프린팅 기술을 통해 각막 조직을 제조하는 과정에서 특정 범위의 전단응력(Shear stress)을 가하면 각막 세포에 손상을 주지 않으면서도 각막 조직 내 콜라겐 섬유의 미세구조를 모사하여 투명한 각막 조직의 제조가 가능하다는 점을 확인하고 본 발명을 완성하였다. 구체적으로, 본 발명의 발명자들은 압출 기반 3D 세포 프린팅 시 발생하는 전단응력(shear stress)을 이용하여 각막 조직 내 콜라젠 섬유의 미세구조 패턴을 모사하였다. 프린팅 노즐 직경을 변경시키며 전단응력(shear stress)을 조절하였으며, 전단응력(shear stress)이 증가할수록 콜라겐 섬유 배열 정도가 더 높아지는 것을 확인할 수 있었다. 하지만, 전단응력(shear stress)이 높아질수록 세포에 가해지는 손상이 높아져 세포의 형태 및/ 또는 기능 변형이 일어나는 현상이 발생하였다. 이를 바탕으로 실제 각막 내 콜라겐 섬유 배열을 유지시키되 세포의 변형이 일어나지 않는 범위의, 각막 조직 프린팅을 위해 적합한 전단응력(shear stress)를 선정하였다. 해당 결과를 이용하여 각막 조직에 적용했을 때, 각막 세포에 손상을 주지 않고 실제 각막의 투명도를 확보할 수 있는 제작 공정을 확립하였다.

상기 목적을 해결하기 위하여 본 발명의 일 예는 바이오잉크를 3D 프린팅하여 각막 조직을 제조하는 방법으로서, 상기 바이오잉크를 프린팅 노즐을 통해 압출하여 25~100 ㎪의 전단응력을 인가하는 것을 특징으로 하는 3D 프린팅을 이용한 각막 조직의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 일 예에 따른 각막 조직의 제조방법에서 상기 바이오잉크는 프린팅 노즐을 통해 압출된 후 소정의 형상으로 적층가공 된다.

본 발명의 일 예에 따른 각막 조직의 제조방법에서 상기 바이오잉크는 하이드로겔 형태의 각막 유래 탈세포화 세포외기질을 포함하고, 바람직하게는 각막 유래 탈세포화 세포외기질에 캡슐화된 각막 유래 세포를 더 포함한다. 본 발명에서 사용되는 용어인 '세포외기질(ECM)'은 동물세포에 구조적인 지지를 통상 제공함과 동시에, 다른 다양한 중요한 기능을 수행하는 동물 조직의 세포외 부분이다. 세포외기질은 동물에 있어서 결합 조직을 규정하는 특징이다. 본 발명에 적용 가능한 세포외기질은 각막 유래 세포외기질로서, 세포 주변을 둘러싸는 물리적인 구조 이외에 세포의 부착을 돕는 단백질이나 세포의 생장 및 기능의 발현에 도움이 되는 단백질들을 포함하고 있다. 이러한 세포외기질은 돼지, 소와 같은 동물의 조직일 수 있고 다양한 기관으로부터 추출이 가능하다. 상기 각막 유래 세포외기질은 바람직하게는 각막 기질 조직에서 유래한다. 상기 세포외기질은 탈세포화 처리된 것이 바람직하다. 이에 따라 면역반응을 유도하는 항원으로서 작용할 수 있는 세포를 제거함으로써 동종이식 (allograft) 또는 이종이식 (xenograft)시 면역반응을 최소화화는 효과가 있다. 조직에 따라 세포의 종류와 수, 조직 자체의 물리적 특성이 다르기 때문에 산, 염기, 저장액, 고장액, 세제 등 다양한 화학물질을 이용하여 탈세포화가 이루어진다. 또한 탈세포화 과정만을 거쳐 조직 자체의 구조를 유지한 채로 사용하기도 하지만, 동결건조와 분쇄과정을 거쳐 산성 용액에 녹여 액상으로 사용하거나 이를 다시 중화과정을 거쳐 겔 형태로 만들어 사용하기도 한다. 상기 바이오잉크를 구성하는 각막 유래 세포는 바람직하게는 1×10⁶ cells/㎖ 내지 1×10⁷ cells/㎖의 농도로, 더 바람직하게는 3×10⁶ cells/㎖ 내지 8×10⁶ cells/㎖의 농도로 각막 유래 탈세포화 세포외기질에 캡슐화된다. 상기 각막 유래 세포는 각막내피세포, 각막상피세포 및 각막기질세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고,이중 각막기질세포인 것이 바람직하다. 또한, 상기 바이오잉크를 구성하는 각막 유래 탈세포화 세포외기질은 바람직하게는 텔로펩티드가 제거된 콜라겐 섬유를 포함한다. 상기 각막 유래 탈세포화 세포외기질을 구성하는 콜라겐 섬유는 압출 기반의 3D 프린팅시 정렬 수준을 고려할 때 50 ㎚ 이상(예를 들어 50~100 ㎚)의 직경 및 2000 ㎚ 이상(예를 들어 2000~4000 ㎚)의 길이를 가지는 것이 바람직하고, 40 이상(예를 들어 40~50)의 종횡비(aspect ratio)를 가지는 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 하이드로겔 형태의 각막 유래 탈세포화 세포외기질은 바람직하게는 비뉴턴 점성(non-Newtonian viscosity)을 가지며 전단박하(shear thinning)의 흐름 특성을 가진다.

본 발명의 일 예에 따른 각막 조직의 제조방법에서 3D 프린팅시 바이오잉크에 인가되는 전단응력은 콜라겐 섬유의 정렬 수준, 세포 손상의 최소화, 각막 조직의 투명도 등을 고려할 때 30~95 ㎪인 것이 바람직하고, 40~90 ㎪인 것이 더 바람직하다. 본 발명의 일 예에 따른 각막 조직의 제조방법에서 바이오잉크에 인가되는 전단응력은 바이오잉크의 점도, 유속 및 프린팅 노즐의 내부 직경 등고 같은 다양한 인자에 의해 영향을 받으며, 주로 프린팅 노즐의 내경에 크게 지배된다. 본 발명의 일 예에 따른 각막 조직의 제조방법에서 바이오잉크를 압출하는 프린팅 노즐의 내경은 콜라겐 섬유의 정렬 수준, 세포 손상의 최소화, 각막 조직의 투명도 등을 고려할 때 0.2~0.45 ㎜인 것이 바람직하고, 0.25~0.4 ㎜인 것이 더 바람직하다.

상기 목적을 해결하기 위하여 본 발명의 일 예는 전술한 제조방법으로 제조되고, 각막 유래 세포(예를 들어 각막기질세포) 배지에서 배양된 후 격자 패턴의 정렬된 콜라겐 섬유를 포함하는 각막 조직을 제공한다. 본 발명의 일 예에 따른 각막 조직에서 상기 격자 패턴의 정렬된 콜라겐 섬유는 다양한 파장대의 가시광선 투과율을 고려할 때 40 ㎚ 이하(예를 들어, 20~40 ㎚)의 직경을 가지는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 일 예에 따른 각막 조직은 두께가 크게 제한되지 않으며, 예를 들어 배양 용이성 및 이식 용이성 등을 고려할 때 두께가 100~200 ㎛인 것이 바람직하고, 120~180 ㎛인 것이 더 바람직하다. 또한, 본 발명의 일 예에 따른 각막 조직은 다양한 파장대의 가시광선 투과율이 우수하며, 예를 들어 75% 이상(예를 들어 75~99%)의 가시광선 투과율을 가지며, 바람직하게는 80% 이상의 가시광선 투과율을 가진다.

본 발명의 압출 기반 3D 프린팅 방법을 사용하는 경우 각막 세포에 손상을 주지 않고 동시에 투명하면서도 정렬된 형태의 콜라겐 섬유를 갖는 각막 조직을 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법으로 제조된 각막 조직은 콜라겐 배열능, 콜라겐 분비 등과 같은 각막 세포의 효능 활성도가 피펫팅으로 제조한 각막 조직에 비해 2배 이상 증가할 뿐만 아니라 투명도 역시 실제 각막의 투명도 이상으로 향상된 물리적 특성을 보인다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 각막 조직을 토끼에 이식하는 경우 이식된 각막이 주변 각막 조직과 잘 융합되어 염증 반응을 일으키지 않으면서 실제 각막과 유사한 투명도를 보인다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 제조된 각막 조직은 각막이 손상된 환자에 필요한 각막 이식체로서의 가능성을 가지며 유용한 인공 각막 소재로 사용될 수 있다.

도 1은 전단 유도된 콜라겐 섬유의 정렬을 전반적으로 나타낸 것이다.
도 2는 세포 배양 28일째에 바이오잉크 내에 캡슐화된 분화된 각막기질세포(differentiated keratocytes)의 세포 거동을 나타낸 것이다.
도 3은 배양 시간의 경과에 따른 25G 그룹 및 NP 그룹 샘플의 세포 형태 및 활성의 변화를 나타낸 것이다.
도 4는 실험 그룹의 각막 특이적 특징을 조사한 결과이다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 보호범위를 한정하는 것은 아니다.

1. 재료 및 방법

1.1. 바이오잉크(Bioink)의 제조

바이오잉크는 분화된 각막기질세포(Keratocyte) 및 이를 캡슐화하는 각막 탈세포화 세포외기질(Co-dECM)으로 구성된다.

분화된 각막기질세포를 다음과 같이 준비하였다[Park MN, Kim B, Kim H, Park SH, Lim MH, Choi YJ, Yi HG, Jang J, Kim SW and Cho DW 2017 Human turbinate-derived mesenchymal stem cells differentiated into keratocyte progenitor cells J. Clin. Exp. Ophthalmol. 8 627 참조]. 인간 비갑개 유래 중간엽 줄기세포(Human turbinate derived mesenchymal stem cells, hTMSCs; Catholic University of Korea, St.Mary's Hospital에서 입수함)를 10%(v/v) 소태아혈청 및 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 정상 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에 넣고 가습된 5% 이산화탄소 분위기 및 37℃의 온도 조건에서 배양하였다. 이후 2번째 계대에서 정상 배지를 10 ng/㎖ KGF/EGF를 포함하는 분화배지로 교체하고 1일 동안 배양하여 분화된 각막기질세포(differentiated keratocytes)를 수득하였다.

또한, 각막 탈세포화 세포외기질(Co-dECM)을 다음과 같이 준비하였다[Kim H, Park MN, Kim J, Jang J, Kim HK and Cho DW 2019 Characterization of cornea-specific bioink: high transparency, improved in vivo safety J. Tissue Eng. 10 참조]. 먼저, 송아지눈에서 절개한 전체 각막을 100 units/㎖ 페니실린 및 0.1 ㎎/㎖ 스트렙토마이신을 포함하는 PBS 완충용액으로 세척하였다. 이후, 각막 조직에서 상피와 내피를 제거하고 순수한 각막 기질층(Stromal layer)을 얻었다. 이후, 기질 조직을 0.5% Triton X-100을 포함하는 20mM 수산화암모늄 용액(NH₄OH; 4.98 N 수용액)에 넣고 약 4 hr 동안 교반하였다. 이후, 기질 조직을 증류수로 세척하고, Tris-HCl(hypotonic Tris hydrochloride; pH 7.4) 완충용액으로 약 24 hr 동안 처리하였다. 이후, 기질 조직을 1% (v/v) Triton X-100을 포함하는 10mM Tris-HCl 용액에 넣고 37℃에서 약 24 hr 동안 교반하여 각막 탈세포화 세포외기질(Co-dECM) 조직을 수득하였다. 이후, 각막 탈세포화 세포외기질(Co-dECM) 조직을 50% 에탄올 내의 1% 과산화아세트산 용액으로 약 10 hr 동안 처리하여 살균하였다. 탈세포화 과정을 완료한 후, 각막 탈세포화 세포외기질(Co-dECM)을 하룻밤동안 동결건조하고 액상 질소 및 분쇄 장치를 이용하여 미세한 분말로 분쇄하였다. 0.2g Co-dECM 분말을 0.02g 펩신이 보충된 10㎖ 아세트산 용액(0.5M)으로 약 3일 동안 처리하여 콜라겐 분자 내의 텔로펩타이드(telopeptides)를 제거하고 완전히 용해시켰다. 이후, 2% Co-dECM 용액을 10 ㎛ 메쉬를 통해 여과하고 10M 수산화나트늄 용액으로 pH를 7.0~7.4로 조정하여 각막 탈세포화 세포외기질(Co-dECM) 하이드로겔을 제조하였다.

각막 탈세포화 세포외기질(Co-dECM) 하이드로겔에 2번째 또는 3번째 계대로부터 얻은 각막기질세포를 5×10⁶ cells/㎖의 농도로 캡슐화하여 세포가 캡슐화된 각막 탈세포화 세포외기질(Co-dECM) 하이드로겔 형태의 바이오잉크를 제조하였다. 상기 세포 캡슐화 과정은 얼음상에서 수행되었다.

1.2. 3D 프린팅 과정에서의 전단응력(Shear stress) 계산

전단응력은 프린터 노즐의 직경을 변화시킴으로써 조절된다. 유체 흐름이 비뉴턴 점성(non-Newtonian viscosity)을 가진 Hagen-Poiseulle 흐름이라고 가정한다면, 속도 v(r)에 대한 해석적 해(analytic solution)은 하기의 식 (1)과 같다.

부피 유량 Q는 속도를 평균화하고 여기에 노즐 면적 A를 곱함으로써 하기의 식 (2)와 같이 계산될 수 있다.

식 (2)로부터 압력강하 ΔP는 하기의 식 (3)과 같이 게산될 수 있다.

상기 압력강하 ΔP를 벽 전단응력(wall shear stress)의 해석적 표현에 삽입하면 하기의 식 (4)와 같다.

non-printed(NP) 샘플을 생성하기 위해 사용된 1㎖ 피펫 팁의 내경 d(= 2R)은 1.5㎜이고, 3D- printed 샘플을 생성하기 위해 사용된 20G 노즐, 25G 노즐 및 30G 노즐의 내경 d(= 2R)은 각각 0.66㎜, 0.29㎜ 및 0.15㎜ 이다. 길이 L은 피펫 팁의 경우 150㎜이고 프린터 노즐의 경우 22.62㎜ 이다. 시린지(syringe)로부터의 부피 유량 Q_syringe는 0.0024 ㎜/s 이다. 후술하는 식 (5) 및 도 1의 (b)에 의할 때, 전단응력은 고정된 부피 유량에서 노즐의 중심선으로부터의 거리에 선형적으로 비례한다. 따라서, 벽 전단응력(wall shear stress)을 모든 샘플군의 전단응력 수준을 나타내는 대표 지수로 선택하였다.

1.3. 전단 유도된 콜라겐 섬유의 관찰 및 정성화

바이오잉크는 다양한 프린터 노즐(20G, 25G, 30G)을 사용하여 3D 세포 프린팅 되었고, 피펫팅(NP) 되었다. 가정용으로 개발된 3D 프린터가 사용되었다. 사용한 3D 프린터의 위치 오차 정확도는 x축 및 y축 이동 방향에서 각각 ±5㎛ 및 ±1㎛이고 z축 이동 방향에서 ±5㎛ 이다. 프린팅 시스템은 2개의 압출 기반 디스펜싱 모듈과 1개의 잉크젯 기반 디스펜싱 모듈을 가지고 있다. 각막 기질을 세포-프린트 하기 위해 압출 모듈(Nano master SMP-III, Musashi Engineering, Tokyo, Japan)이 사용되었다. 직경을 제외하고, 전단과 관련된 파라미터들은 모두 다음과 같이 고정되었다.

* 공급 속도 : 130 ㎜/min; 방출 속도 : 0.0024 ㎜/s; 온도 4℃

3D 세포 프린팅 또는 피펫팅을 통해 제조한 직경 5㎜ 및 두께 150㎛의 시트(Sheet)를 배양기에서 약 30분 동안 가교결합시킨 후 각막기질세포 배지에서 약 4주 동안 배양하였다. 이후, 400 ㎚ 밴드 패스 필터(HQ 400/20M-2P, Chroma, USA)를 통해 필터링된 790 ㎚ 원형 편광(Circular Polarized Light) 조건하에서 통상적인 SHG(Second Harmonic Generation) 현미경(을 사용하여 콜라겐 섬유를 관찰하였다. x-y 평면에서 뷰 이미징 필드는 300㎛×300㎛(512 픽셀×512 픽셀)이었고, 대물렌즈 후방 조리개에서의 전력은 약 25㎽로 조정되었다. 이미지 획득 속도는 프레임 당 약 15초 이었다. 각 그룹당 5개의 샘플들이 제조되었고, 각각의 샘플은 다른 위치에서 5번 이미지화되었다. 콜라겐 섬유 방향의 이방성을 특징짓기 위해 Orientation J 소프트웨어를 사용하여 샘플들의 SHG 이미지들을 분석하였다. 방향 값들은 각도(°)의 함수로서 얻어졌다. 통계적 목적을 위해 각 그룹의 3개 샘플들의 데이터로부터 상관 분석을 수행하였다.

1.4. 유전자 발현 분석

배양 7일 및 14일에 Trizol(Invitrogen Life Technologies, USA)을 사용하여 각 샘플로부터 mRNA을 추출하고 RNA 정제 키트가 구비된 Nanodrop(Thermo-Fisher Scientific, USA)을 사용하여 정량화하였다. Maxima First Strand cDNA kit(Thermo-Fisher Scientific, USA)를 사용하여 1㎍의 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. SYBR Green PCR Master Mix assay(Applied Biosystems, USA)를 사용하여 샘플들을 준비한 후, ABI 7500 Realtime PCR system(Applied Biosystems, USA)을 사용하여 real-time PCR을 수행하였다. 프라이머들은 이전 연구[Park MN, Kim B, Kim H, Park SH, Lim MH, Choi Y J, Yi HG, Jang J, Kim SW and Cho DW 2017 Human turbinate-derived mesenchymal stem cells differentiated into keratocyte progenitor cells J. Clin. Exp. Ophthalmol. 8 627 ]에 기초하여 설계되었다. 95℃에서 10분 동안 변성시킨 후, 95℃에서 15초 동안 어닐링하고 60℃에서 1분 동안 신장 및 검출하는 40번의 사이클을 통해 증폭 반응을 수행하였다. 사용된 프라이머들은 KERA, ALDH, ACTA2, Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) 유전자에 대한 프라이머이었고, 구체적인 염기서열은 하기의 표 1과 같다.

유전자	방향	염기서열(5'→3')
KERA	Forward	GCCTCCAAGATTACCAGCCAA
	Reverse	ACGGAGGTAGCGAAGATGAGGT
ALDH	Forward	CGCTCCTGATGCAAGCATGGAAGC
	Reverse	CTCCCAACAACCTCCTCTATGGCT
ACTA2	Forward	TCGGGACCTCACTGACTACC
	Reverse	AATCCAGGGCGACATAACAC
GAPDH	Forward	CCAGGTGGTCTCCTCTGACTTC
	Reverse	GTGGTCGTTGAGGGCAATG

측정된 유전자 발현 수준을 GAPDH에 대해서 정규화하였고, 2^_ΔΔCT 방법을 사용하여 분석하였다. 각 샘플을 3회씩 평가하였다.

1.5. 세포 정렬 및 활성

샘플들을 PBS 용액 내의 파라포름알데하이드(4% w/v)로 처리하여 고정하고; Triton X-100(0.1%)로 처리하여 투과성으로 만들고; 비특이적 결합을 방지하기 위해 PBS 용액 내의 소혈청알부민으로 처리하고; PBS로 15분 동안 3번 세척하고; Anti-Collagen I antibody(Abcam, UK), Anti-Human Keratocan antibody(LSBio, UK) 및 anti-alpha smooth muscle actin(α-SMA) antibody(Abcam, UK)와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 배양하고; PBS로 세척하고; Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody(Invitrogen Life Technologies, USA) 또는 Alexa Fluor 594 goat anti-mouse antibody(Invitrogen Life Technologies, USA )에 37℃에서 1 hr 동안 노출시키고; DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole) 및 Phalloidin으로 대조염색하였다. FV1000 Olympus 공초첨 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 염색된 샘플의 이미지를 획득하였다.

분비된 콜라겐 양을 정량화하기 위해, 배양 4일, 14일 및 28일째의 샘플(NP, 25G)을 사용하여 hydroxyproline assay를 수행하였다. 샘플들과 Co-dECM 하이드로겔을 -80℃에서 냉동하고 동결건조기를 사용하여 동결건조하였다.각각의 건조된 샘플 10㎎을 파파인 용액 1㎖에 넣고 60℃에서 16 hr 동안 소화시켰다. 상기 파파인 용액은 5 mM Na₂-ethylenediaminetetraacetic acid 및 5 mM cysteine-HCl을 포함하는 pH 6.5의 0.1M sodium phosphate 용액에 125 ㎎/㎖ 농도로 파파인을 포함하는 용액이다. 또한, Blank로 사용하기 위해 샘플이 첨가되지 않은 파파인 용액만를 배양하였다. 소화된 용액 내 총 콜라겐 양은 chloramine T 및 para-dimethylaminobenzaldehyde 용액을 사용하는 통상적인 hydroxyproline assay[Sorkio A, Koch L, Koivusalo L, Deiwick A, Miettinen S, Chichkov B and Skottman H 2018 Human stem cell based corneal tissue mimicking structures using laser-assisted 3D bioprinting and functional bioinks Biomaterials 171 57-71]에 기초하여 정량화되었다. 샘플의 흡광도를 microplate reader(Epoch2; BioTek Instrument Inc., USA)를 이용하여 540 ㎚의 파장에서 측정하였다. 콜라겐 함량은 hydroxyproline 표준 곡선으로부터 내삽되었다.

1.6. 광학 투과도

각막 투과도는 microplate reader를 사용한 광 투과율의 측정을 통해 검사되었다. 모든 샘플들을 48-웰 플레이트의 웰에 놓고 샘플들 표면을 덮는 과량의 액체를 흡묵지를 사용하여 제거하였다. 비교군으로, 인간 각막을 글리세롤 내에서 탈수하였다. 모든 샘플들은 200 ㎛의 두께로 준비되었다. microplate reader 내의 48-웰 플레트를 셋팅한 후, 300~700 ㎚의 파장 범위에서 광 흡수값을 결정하였다. 각각의 샘플들을 3회씩 평가하였고, 모든 투과율 결과를 기준인 Blank 웰의 흡광도를 측정함으로써 수정하였다.

2.7. 생체내(In-vivo) 평가

생체내에서 투과도을 관찰하기 위해 Ophthalmic and Vision Research의 동물 사용에 대한 ARVO 성명서에 의거하여 Daegu-Gyeongbuk Advanced Medical Industry Promotion Foundation(DGMIF, the approval number of protocol: DGMIF-17080801-00)에서 동물 실험을 수행하였다. 10마리의 건강한 뉴질랜드 토끼(수컷, 8주령, 평균 몸무게는 약 2㎏)를 15 ㎎/㎖ 케타민(ketamine) 및 5 ㎎/㎖ 럼펀(rumpun)을 사용하여 마취시키고, 크레센트 나이프를 사용하여 6㎜ 직경의 3-쿼터 환상 절개를 제작하였다. 5개의 인쇄된 샘플과 5개의 비인쇄된 NP 샘플을 동물 각각의 각막 기질에 이식하였다. 절개 부위를 10-0 ethilon nylond으로 봉합하고 수술을 받은 눈을 olymyxin B, neomycin 및 dexamethasone을 포함하는 점안액(Forus, Samil Pharm. Co., Ltd, Korea)으로 2주일 동안 하루에 2번 처리하였다.

이후, 토기에 15 ㎎/㎖ 케타민(ketamine) 및 5 ㎎/㎖ 럼펀(rumpun)을 근육주사 하고, 메디컬 키드의 샘플 스테이지에 조심스럽게 놓은 후 실험 전에 10분 동안 유지하였다. 미세먼지 입자가 없은 OCT 이미지를 얻기위해 눈을 생리식염수로 세척하여 외부 물질, 먼지 입자 및 눈썹을 제거하였다. 토기의 건강 및 DGMIF 프로토콜을 고려하여 실험을 2주 간격으로 수행하였다. 토끼를 외과 수술 후 4주 뒤에 안락사시켰다.

2. 결과 및 논의

도 1은 전단 유도된 콜라겐 섬유의 정렬을 전반적으로 나타낸 것이다. 도 1의 a는 바이오잉크 압출 동안의 노즐 내 콜라겐 섬유의 정렬을 개략적으로 도시한 것이다. 도 1의 b는 세포를 포함하는 2% Co-dECM 바이오잉크의 점도 파일이다. 도 1의 c는 3D 프린팅할 때 서로 다른 크기의 노즐에 대한 벽 전단응력의 방사 반향 분포이다. 도 1의 d는 전단에 의해 정렬된 콜라겐의 SHG(Second Harmonic Generation) 이미지(scale bar = 20㎛)이다. 도 1의 e는 서로 다른 방위각에서 수집된 SHG(Second Harmonic Generation) 이미지를 Orientation J로 분석하여 얻은 방향 분포이다.

3D 프린팅할 때 전단응력은 바이오잉크의 점도, 유속 및 노즐의 내부 직경에 의해 지배된다. 본 실험에서 사용한 Co-dECM 바이오잉크는 전단박하(shear thinning) 특성을 가진다. 0.1 s^-1 내지 1000 s^-1의 전단속력 범위에서 바이오잉크의 점도는 하기 식 (5)와 같이 모델링될 수 있다.

상기 식 (5)에서 η는 동적 점도를 나타내고, γ는 유체의 전단변형률을 나타내고, K 및 n은 모델의 상수들을 나타낸다. 여기서, K=40.878, n=0.203이고, 상기 상수값들은 바이오잉크의 유변학적 분석으로부터 회귀식을 통해 얻어진다(도 1의 b 참조). 인쇄될수 있은 샘플들의 전단박하(shear thinning) 프로파일은 잉크의 성공적인 압출을 위해 요구되는 점성 조건을 충족한다. 이러한 점성 특성에 기초하여, 3D 프린팅에 사용된 노즐의 반경에 관한 전단응력은 유체 흐름이 비뉴턴 점성(non-Newtonian viscosity)을 가진 Hagen-Poiseulle 흐름이라고 가정하여 추정될 수 있고, 하기 식 (6)에 의해 특성지울 수 있다.

프린팅 노즐 반경 R이 감소할수록 콜라겐 섬유에 적용되는 전단응력 τ_wall은 증가하고(도 1의 c 참조), 그 결과 콜라겐 섬유의 더 많은 정렬을 야기한다. 콜라겐 섬유 및 각막 특이적 생화학적인 실마리를 포함하는 다양한 거대분자들로 이루어진 2% Co-dECM 하이드로겔을 인쇄하였다. 초기에 바이오잉크 내의 분열된 거대분자들은 무작위도 분포된다. 그러나, 바이오잉크가 분배되기 시작할 때 전단응력이 내부의 거대분자에 인가되고 거대분자들이 유체 흐름 방향을 따라 지향된다(shear thinning 거동). 이러한 과정을 통해 결과적으로 콜라겐 섬유들이 정렬된다. 콜라겐 섬유들은 SHG 현미경에 의해 관찰되었다. SHG 이미지를 32 비트 이미지로 변환시킨 후, Orientation-J plug-in(EPFL) 내지 the Image J software(NIH)를 사용하여 모든 각도에서의 콜라겐 섬유들의 분포를 정량화 하였다. 주어진 프린팅 조건 하에서, 가장 좁은 노즐을 통해 인쇄된 샘플은 가강 큰 전단응력을 받았고 다른 실험 그룹에 비해 더 균일하게 정렬된 콜라겐 섬유들을 가진 반면, NP 그룹은 무작위로 지향된 콜라겐 섬유들을 보였다(도 1의 c 내지 e 참조).

전단응력은 프린팅 과정 동안 세포 운명에도 영향을 준다. 세포사멸(apoptosis), 세포주기 억류(cell-cycle arrest) 및 세포골격 리모델링(cytoskeletal remodeling)과 같은 세포 거동은 전단응력의 수준에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있다(Shyy JY and Chien S 1997 Role of integrins in cellular responses to mechanical stress and adhesion Curr. Opin. Cell Biol. 9 707-13). 본 실험에서, 4개의 다른 실험 조건하에서 5×10⁶ cells/㎖의 농도의 분화된 각막기질세포(differentiated keratocytes)를 사용하였을 때 서로 다른 세포 거동이 관찰되었다. 상기 4개의 서로 다른 실험 조건은 3개의 서로 다른 직경인 20 게이지(20G), 25 게이지(25G) 및 30 게이지(30G) 노즐로 인쇄된 그룹과 대조군인 NP 그룹을 나타낸다. 도 2는 세포 배양 28일째에 바이오잉크 내에 캡슐화된 분화된 각막기질세포(differentiated keratocytes)의 세포 거동을 나타낸 것이다. 도 2의 a는 DAPI, α-SMA 및 F-actin의 면역형광 염색 후에 얻은 공초점 형광 현미경 이미지(scale bar = 50㎛)이다. 도 2의 b는 GAPDH 수준에 의해 정규화된 각막기질세포 특이적 유전자인 KERA, ALD 및 근육섬유아세포(myofibroblast) 특성화 유전자인 ACTA2의 RNA 발현 수준을 나타낸 것이다. 각각의 실험 그룹은 인쇄 후 28일째에 서로 다른 세포 형태를 보였다(도 2의 a 참조). 이것은 벽 전단응력의 크기가 프린팅 노즐 직경에 의존하여 변화하기 때문이다. 하기 표 2에 3D 프린팅 과정 동안 노즐 직경에 따라 Co-dECM 바이오잉크에 인가되는 벽 전단응력을 나타내었다.

노즐 게이지	벽 전단응력(㎪)
20G	12.620
21G	16.055
22G	22.038
23G	28.719
24G	43.646
25G	47.418
26G	62.137
27G	89.635
28G	101.877
29G	119.348
30G	136.960

20G 노즐의 사용은 NP 그룹과 유사한 세포 형태 및 분포를 유도하였다. 게다가, 양쪽 그룹에서 콜라겐 섬유의 방향성은 무작위적이므로 12.62 ㎪보다 낮은 벽 전단응력은 바이오잉크에 무시할만한 영향을 가지는 것으로 결론내릴 수 있다. 12.62 ㎪보다 더 큰 전단응력이 가해진 25G 및 30G 그룹의 경우, 정렬된 세포들이 인쇄 경로 방향을 따라 관찰되었고 다른 그룹보다 더 높은 각막기질세포 특이적 유전자(keratocan, KERA; Aldehyde dehydrogenase, ALDH) 발현 수준을 보였다(도 2의 b 참조). 이러한 결과는 전단 유도된 콜라겐 섬유의 배열이 각막기질세포 마커의 상승된 발현 수준에 도움을 준다는 것을 입증한다. 그러나, 가장 높은 136.96 ㎪의 전단응력을 받는 30G 그룹의 경우 세포내 α-SMA의 심각한 발현이 관찰되었다. α-SMA 발현은 각막 상처에 대응하여 각막기질세포로부터 분화되는 근육섬유아세포(myofibroblast)의 표현형 특성을 대표한다. 특히, 근육섬유아세포(myofibroblast)는 각막 투명도의 상실에 기여한다[Torricelli AA and Wilson SE 2014 Cellular and extracellular matrix modulation of corneal stromal opacity Exp. Eye Res. 129 151-160]. 따라서, 근육섬유아세포(myofibroblast)의 존재는 30G 노즐의 사용에 기인하는 각막 특성의 심각한 부작용을 나타낸다. 결론적으로, 25G 노즐이 조직공학적으로 각막을 제작하는데 있어서 최적의 각막 특성을 얻기 위해 선택되었다.

25G 노즐로부터 인쇄된 각막 특성은 NP 그룹과 비교되었다. 도 3은 배양 시간의 경과에 따른 25G 그룹 및 NP 그룹 샘플의 세포 형태 및 활성의 변화를 나타낸 것이다. 도 3의 a는 분화된 각막기질세포의 공초점 이미지이고, 도 3의 b는 세포 배양 3일, 14일 및 28일째의 세포 방향성 분포이고(scale bar = 100㎛), 도 3의 c는 분비된 COL의 공초점 이미지이고, 도 3의 d는 25G 그룹 및 NP 그룹 샘플 내 하이드록시프롤린(hydroxyproline) 함량을 나타낸 것이다. 25G 그룹 및 NP 그룹의 샘플들은 생체외(in vitro) 및 생체내(in vivo)에서 효능의 평가를 위해 28일 동안 배양되었다. 인쇄된 세포는 3일째에 방위각들에 대하여 균일하게 신장하였다. 바이오잉크 내의 거대분자로부터 반응함으로써 세포들은 시간의 경과함에 따라 어떠한 스트레스 파이버(stress fiber) 없이 이미지 방향성에 대하여 120°에서 정렬되었다(도 3의 a 및 b 참조). 25G 그룹 샘플 내에서 세포들은 일정하게 배열된 반면, NP 그룹 샘플 내에서 세포들은 무작위로 배열되었다. 또한, 세포기질세포의 세포 거동이 활성화되었다. 분비된 타입-Ⅰ 콜라겐(COL)의 양은 25G 그룹 및 NP 그룹 샘플 양쪽에서 14일 및 28일째에 점진적으로 증가하였다. 25G 그룹 샘플의 28일째에 이미지화된 COL 강도가 NP 그룹 샘플보다 2.49배 정도 훨씬 높은 점은 주목할만 하다(도 3의 c 및 d 참조). 이러한 교원질성 세포외기질(ECM) 생산은 콜라겐 섬유의 전단 유도된 정렬이 각막기질 유사 환경을 제공하고 세포들이 교원질성 매트릭스를 리모델링하도록 조장하는 것을 나타낸다. 이러한 결과들은 각막기질세포가 물이 풍부한 세포외기질(ECM)을 조밀하게 채워진 콜라겐 섬유 타입 세포외기질로 대체하는 출생후 발육 스테이지(post-natal developmental stage)와 유사하다[Hassell JR and Birk DE 2010 The molecular basis of corneal transparency Exp. Eye Res. 91 326-35]. 도 4는 실험 그룹의 각막 특이적 특징을 조사한 결과이다. 도 4의 a는 세포 배양 28일째에 25G 그룹 샘플 내 비특이적 콜라겐의 SHG 이미지이고(scale bar = 100㎛), 도 4의 b는 25G 그룹 샘플 내 콜라겐 섬유의 방향성 분포이고, 도 4의 c는 세포 배양 28일째에 NP 그룹 샘플 내 비특이적 콜라겐의 SHG 이미지이고(scale bar = 100㎛), 도 4의 d는 NP 그룹 샘플 내 콜라겐 섬유의 방향성 분포이고, 도 4의 e는 틈새등(slit lamp) 검사로부터 얻은 NP 그룹 샘플의 광학 이미지이고, 도 4의 f는 NP 그룹 샘플의 2D 횡단면 OCT 이미지이고, 도 4의 g는 틈새등(slit lamp) 검사로부터 얻은 25G 그룹 샘플의 광학 이미지이고, 도 4의 h는 25G 그룹 샘플의 2D 횡단면 OCT 이미지이고, 도 4의 i는 가시광선 투과율 측정 결과이고, 도 4의 j는 이식된 샘플들의 조직학적 이미지이다(scale bar = 100㎛). SHG 이미지에서 보이는 바와 같이 COL을 포함하는 비특이적 콜라겐 섬유는 25G 그룹 샘플 내에서 십자형 패턴으로 존재하는 것이 밝혀졌다(도 4의 a 및 b 참조). 이러한 격자 유사 미세구조는 특히 인간 각막 조직에서 관찰될 수 있으며, 이는 각막의 투명도와 직접적으로 관련되어 있다[Torricelli AA and Wilson SE 2014 Cellular and extracellular matrix modulation of corneal stromal opacity Exp. Eye Res. 129 151-60]. 25G 그룹 샘플의 공학적 매트릭스는 배양 28일째에 인간 각막 및 Co-dECM 하이드로겔에 비해 개선된 가시광선 투과율을 발휘한다(도 4의 i 참조). 인간 각막 및 Co-dECM 하이드로겔은 주로 가시광선의 투과를 허용하는 직경을 가진 콜라겐 섬유로 구성된다. 그러나, 300~450 ㎚ 파장 근방 가시광산의 산란은 콜라겐 섬유의 직경이 파장과 유사하기 때문에 증가된다. 25G 그룹 샘플의 경우, 세포가 성장함에 따라 본래의 콜라겐 섬유들이 새롭게 합성되고 직경이 40 ㎚ 보다 작으며 수직으로 쌓인 세포외기질(ECM)로 대체된다. 이는 모든 파장대에 걸쳐 더 많은 가시광선을 동일하게 투과시키는데에 도움을 준다. 한편, NP 그룹의 경우 콜라겐 섬유의 패턴은 세포 배양 28일 이후에도 거의 관찰되지 않았고(도 4의 c 및 d 참조), 이러한 경향은 설치류 눈에 대해 보고된 바와 유사하다[Bueno JM, Palacios R, Chessey MK and Ginis H 2013 Analysis of spatial lamellar distribution from adaptive-optics second harmonic generation corneal images Biomed. Opt. Express 4 1006-13]. NP 그룹 샘플의 투명도는 45%보다 작고, 이러한 결과는 NP 그룹 샘플을 임상적으로 인공 각막으로 이용할 수 없게 만든다[Ventura L, de Jesus GT, de Oliveira GCD and Sousa SJ 2005 Portable light transmission measuring system for preserved corneas Biomed. Eng. Online 4 70]. 이러한 결과는 본래의 비방향성 콜라겐 섬유상에서 배양된 세포는 비정렬된 교원질성 세포외기질(ECM)을 재구성한다는 것을 나타낸다. 이러한 생체외(in vitro) 평가의 경향은 생체내(in vivo) 평가에서도 유지되었다. 샘플들은 28일 동안 배양된 후 토끼 각막에 이식되었다. 25G 그룹 샘플이 주입된 각막은 NP 그룹 샘플이 주입된 각막에 비해 광학적으로 더 투명하였다(도 4의 e 및 g 참조). 모든 이식된 샘플들은 내부에 위치되었고 28일 동안 주변 각막 조직과 융합되었다(도 4의 f, h 및 j 참조). 생체내 이식 후에 콜라겐의 어떠한 효소적 분해도 관찰되지 않은 반면, 몇몇 다른 연구에서는 생체내 이식 후 효소적 분해가 발생한다는 점을 보고한 바 있다[Liu W et al 2009 Collagen-phosphorylcholine interpenetrating network hydrogels as corneal substitutes Biomaterials 30 1551-9]. 따라서, 각막 내 수직 격자 섬유 다발들이 3D 프린팅시 가해진 전단응력에 의해 재생산될 수 있고, 개발된 조직공학적 각막은 천연의 투명한 각막 조직으로서 효과적이다는 점이 증명되었다고 결론지을 수 있다.

3. 결론

본 발명자는 이식될 수 있는 투명한 각막을 얻기 위해 정렬된 콜라겐 구조를 개발하였다. 상기 정렬된 콜라겐 구조는 각막 기질로부터 유래한 탈세포화 세포외기질(ECM) 바이오잉크를 3D 세포 프린팅 기술을 사용하면서 전단응력을 유도함으로써 얻어졌다. 콜라겐 섬유의 정렬은 압출하는 동안 전단응력 방향을 따라 발생하기 때문에, 전단 관련 3D 프린팅 파라미터들이 제작물 내의 콜라겐 섬유의 방향성을 공간적으로 제어하기 위해 사용될 수 있다. 다양한 노즐 직경과 관련된 전단응력은 콜라겐 섬유 방향성의 다양한 분포를 이르게 한다. 프린팅 경로를 따라 리모델링된 콜라겐 섬유는 생체내 4주 배양 후에 본래의 인간 각막 구조와 유사한 격자 패턴을 생성시켰다.

이상에서와 같이 본 발명을 상기의 실시예를 통해 설명하였지만 본 발명의 보호범위가 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 최상의 양식으로서 개시된 특정 실시 형태로 국한되는 것이 아니며, 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (15)

1. 하이드로겔 형태의 바이오잉크를 내경이 0.25~0.4 ㎜인 3D 프린팅 노즐을 통해 40~90 ㎪의 전단응력이 인가되는 조건으로 압출하여 시트를 수득하는 단계; 및
   상기 시트를 각막기질세포용 배지에서 배양하여 각막 조직을 수득하는 단계를 포함하는 방법으로서,
   상기 바이오잉크는 각막기질조직 유래 탈세포화 세포외기질 및 상기 각막기질조직 유래 탈세포화 세포외기질에 캡슐화된 각막기질세포를 포함하고,
   상기 각막 조직은 격자 패턴의 정렬된 콜라겐 섬유를 포함하고, 두께가 100~200 ㎛이며, 가시광선 투과율이 75~99%이고,
   상기 격자 패턴의 정렬된 콜라겐 섬유는 20~40 ㎚의 직경을 가지는 것을 특징으로 하는 3D 프린팅을 이용한 각막 조직의 제조방법.
   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 각막기질세포는 1×10⁶ cells/㎖ 내지 1×10⁷ cells/㎖의 농도로 캡슐화된 것을 특징으로 하는 3D 프린팅을 이용한 각막 조직의 제조방법.
   
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 상기 각막기질조직 유래 탈세포화 세포외기질은 텔로펩티드가 제거된 콜라겐 섬유를 포함하는 것을 특징으로 하는 3D 프린팅을 이용한 각막 조직의 제조방법.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 콜라겐 섬유는 50~100 ㎚의 직경 및 2000~4000 ㎚의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 3D 프린팅을 이용한 각막 조직의 제조방법.
   
7. 제5항에 있어서, 상기 콜라겐 섬유는 40~50의 종횡비(aspect ratio)를 가지는 것을 특징으로 하는 3D 프린팅을 이용한 각막 조직의 제조방법.
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제

Images