KR101717234B1

KR101717234B1 - 생체적합성 각막 생성방법 및 생체적합성 조직 탈세포 처리 조성물

Info

Publication number: KR101717234B1
Application number: KR1020150054725A
Authority: KR
Inventors: 박문녀; 조동우; 문영미; 장진아; 김현지
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2015-04-17
Filing date: 2015-04-17
Publication date: 2017-03-27
Also published as: US20160303288A1; KR20160123901A

Abstract

본 발명에 따른 생체적합성 각막 생성방법은 조직원으로부터 각막을 절개하여 제공하는 단계; 상기 제공된 각막의 세포외 기질을 숯(charcoal)이 포함된 정제수에 넣고 소정의 시간 동안 탈세포 처리하는 단계; 및 상기 처리된 각막의 세포외 기질을 저장액(hypotonic solution)내에서 교반하여 후처리하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 생체적합성 각막 생성방법은 각막의 탈세포화 처리제로 숯(charcoal)을 사용하여, 원형 각막의 세포외 기질과 동일한 조직 재생을 가능하게 하는 효과가 있다.
또한, 면역 거부 반응이 없는 각막 생성 및 상기 각막의 이식을 통한 환자의 빠른 재생 효과를 기대할 수 있는 효과가 있다.

Description

생체적합성 각막 생성방법 및 생체적합성 조직 탈세포 처리 조성물{BIOCOMPATIBILITY CORNEA GENERATION METHOD AND BIOCOMPATIBILITY TISSUE DECELLULARIZED COMPOSITION}

본 발명은 생체적합성 각막 생성방법 및 생체적합성 조직 탈세포 처리 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 생체 조직의 탈세포를 처리하는 과정에서 생체적합성 숯(charcoal)을 이용하여 각막의 세포외 기질이 원형 보존에 최적합하도록 재생되는 생체적합성 각막 생성방법 및 생체적합성 각막 탈세포 처리 조성물에 관한 것이다.

각막은 눈의 검은 동자의 표면을 덮고 있는 투명한 막을 말한다. 이것은 외부로부터 눈을 보호하는 일차적인 역할을 할 뿐만 아니라, 빛을 눈 안으로 받아들여 사물을 볼 수 있게 해주는 창문과 같은 역할을 한다.

각막에 기능적이거나 구조적으로 회복 불가능한 손상이 생기게 되면, 각막이 붓거나 혼탁해져 시력에 타격을 받는다. 각막 혼탁이 생기면 각막이 하얗게 변하고, 심해지면 미용상의 문제를 초래할 수 있다. 이와 같이 손상된 각막을 다른 사람에게서 기증받은 깨끗한 각막으로 바꾸어 주는 수술이 각막 이식이다. 이러한 각막 이식은 시력을 개선하기 위해서일 뿐만 아니라 눈의 구조를 유지하거나, 각막 질환 자체를 치료하기 위해서 그리고 미용적인 목적으로 시술하기도 한다.

한편, 각막 이식에 있어서, 각막 이식의 기증자는 현재 현저하게 부족한 실정이며, 각막 이식 후에도, 감염 및 면역 반응과 같은 합병증이 일어나는 문제점이 있다. 따라서 최근 3D 프린터를 이용한 각막재생을 이용하여 환자의 환부와 정확히 일치하는 다수의 임플란트를 제작하는 방법을 수행하고 있다.

그러나 이 역시, 임플란트 제작에 사용되는 생분해성 고분자의 경우 주변 각막조직 유래 세포와의 융합이 잘 이루어지지 않는 문제점이 있다. 이는 생분해성 고분자의 경우 세포 부착성이 낮고 줄기세포의 각막조직에 중요한 기능하는 keratocyte로의 분화가 잘 이루어지지 않기 때문이다.

한국공개특허 제10-2014-0007913호

조직공학에서 탈세포화 세포외 기질의 이용은 다양하며, 가장 적합한 생체 유래 재료로 사용될 수 있다. 본 발명의 목적은 효과적인 탈세포화 세포외 기질의 이용을 위해서 화학적 처리보다는 자연친화적인 재료인 숯을 탈세포 처리제로 이용함에 있다.

본 발명은 각막 조직의 세포외 기질(ECM)을 구성하고 있는 콜라겐(collagen)과 객(glycosaminoglycans)의 규칙적인 배열이 손상되지 않도록 탈세포화 처리하여 각막 조직 재생의 증진을 유도하는데 있다.

본 발명에 따른 생체적합성 각막 생성방법은 조직원으로부터 각막을 절개하여 제공하는 단계; 상기 제공된 각막을 숯(charcoal)이 포함된 정제수에 넣고 소정의 시간 동안 탈세포 처리하는 단계; 및 상기 처리된 각막의 세포외 기질을 저장액(hypotonic solution)내에서 교반하여 후처리하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 상기 탈세포 처리하는 단계에서, 상기 정제수에 포함된 상기 숯(charcoal)에서 방출되는 음이온은 상기 제공된 각막의 세포외 기질을 구성하는 콜라겐(collagen) 또는 객(glycosaminoglycans) 표면의 음전하를 안정화시킬 수 있다.

또한, 상기 탈세포 처리하는 단계에서, 상기 정제수에 포함된 상기 숯(charcoal)은 다공질로서, 상기 다공을 통해 상기 제공된 각막 조직 주변의 불순물을 흡착 또는 제거할 수 있다.

또한, 상기 탈세포 처리하는 단계는, 분쇄된 숯(charcoal)과 염이 포함된 정제된 증류수에 상기 제공된 각막을 넣고 150~210rpm에서 18~20시간 동안 교반할 수 있다.

그리고 상기 정제수에 포함된 숯(charcoal)에 의해 탈세포 처리된 상기 각막의 세포외 기질 내에 함유된 DNA는 질량 퍼센트로 3%미만일 수 있다.

또한, 상기 후처리하는 단계는, 상기 저장액으로 Tris-HCl(pH8)을 사용하며 상기 저장액 내 상기 처리된 각막의 세포외 기질을 넣고 150-210rpm에서 18~30시간 동안 교반할 수 있다.

또한, 상기 후처리단계 이후에, 상기 후처리된 상기 각막의 세포외 기질을 완충용액과 정제된 증류수로 세척하고 소정의 시간동안 동결 건조하는 단계; 상기 동결 건조된 상기 각막의 세포외 기질을 절개하고 가용화하는 단계; 및 상기 가용화된 기질을 인체에 적합한 pH로 조절한 후 겔화를 유도하는 단계;를 포함할 수 있다.

또한, 상기 가용화하는 단계는, 상기 각막의 세포외 기질을, 상기 각막의 세포외 기질의 0.01~0.05 질량비에 해당하는 단백질가수분해 효소군 중 선택된 하나에 의해 처리한 후, 산처리 물질을 넣어 500~700rpm에서 44~52시간 동안 교반할 수 있다.

또한, 상기 겔화를 유도하는 단계 이후에, 상기 겔화 처리된 바이오 잉크를 3D프린터에 주입하고, 상기 3D프린터를 사용하여 스캐닝된 이식 대상자의 환부 사이즈와 일치하는 각막을 생성하는 단계;상기 생성된 각막을 상기 이식 대상자에 이식하는 단계; 및 상기 이식된 각막이 상기 이식 대상자의 상기 각막 주변 세포에 접촉하여 성장하는 단계;를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 생체적합성 조직 탈세포 처리 조성물은 조직원으로부터 제공된 각막의 탈세포화를 위한 혼합물에 정제수 및 숯(charcoal)을 유효 성분으로 함유할 수 있다.

또한, 상기 숯(charcoal)에서 방출되는 음이온은 상기 제공된 각막의 세포외 기질을 구성하는 콜라겐(collagen) 또는 객(glycosaminoglycans)을 표면의 음전하를 안정화시킬 수 있다.

또한, 상기 숯(charcoal)은 다공질로서, 상기 다공을 통해 상기 제공된 각막 조직 주변의 불순물을 흡착 또는 제거할 수 있다.

또한, 상기 혼합물은 상기 정제수에 분쇄된 숯(charcoal)과 염을 포함하여 구성될 수 있다.

기타 실시 예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.

본 발명에 따른 생체적합성 각막 생성방법 및 생체적합성 조직 탈세포 처리 조성물은 각막의 탈세포화 처리제로 숯(charcoal)을 사용하여, 원형의 각막 세포외 기질과 동일한 조직 재생을 가능하게 하는 효과가 있다.

또한, 본 발명에 따른 생체적합성 각막 생성방법 및 생체적합성 조직 탈세포 처리 조성물은 각막의 탈세포화 처리제로 숯(charcoal)을 사용하여, 면역 거부 반응이 없는 각막 생성 및 상기 각막의 이식을 통한 환자의 빠른 재생효과를 기대할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체적합성 각막 생성방법을 나타낸 순서도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 숯(charcoal)을 이용한 탈세포 처리된 각막의 세포외 기질이 생체 재료로서 적합한지 실험을 통해 분석한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 숯(charcoal)을 이용한 탈세포 처리된 연골의 세포외 기질이 생체 재료로서 적합한지 실험을 통해 분석한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 CCK-8을 처리하여 세포 활성도를 비교한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 숯(charcoal)으로 탈세포 처리한 기질에 세포 활성을 나타낸 이미지이다.

이하, 본 발명의 실시 예에 따른 생체적합성 각막 생성방법에 대해 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 그러나 본 실시예의 이하에서 개시되는 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 한다.

따라서 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원 시점에 있어서 이를 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

또한, 본 발명에 따른 생체적합성 각막 생성방법 및 생체적합성 각막의 탈세포 처리 조성물은 각막을 한정하여 설명하고 있으나, 이에 한정된 것은 아니며, 각막 이외에 다양한 신체 조직에 적용할 수 있음을 이해하여야 한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체적합성 각막 생성방법을 나타낸 순서도이다.

우선, 조직원으로부터 각막을 절개하여 제공하는 단계가 진행될 수 있다(S10).

조직원은 돼지, 소, 토끼 등의 각종 동물 군 중에서 선택할 수 있다. 본 발명에서는 상기 조직원으로 소의 각막을 이용하였다. 따라서 소의 각막을 5~13mm 동공 모양으로 절개해 낼 수 있다. 그리고 상피 부분을 제거하고, 내피를 벗겨내는 단계가 진행된다.

이후, 상피와 내피가 제거된 450~550um 두께의 스트로마(stroma)층을 완충용액에 넣고 140~210rpm으로 30분~1시간 교반시켜 세척할 수 있다. 여기서 완충용액은 PBS(Phosphate buffer saline)를 사용할 수 있다. 이후, 세척이 완료된 각막의 세포외 기질을 12~20시간 동안 냉동 보관한다. 상기 냉동 보관을 통하여 스트로마(stroma)의 층간의 간격이 벌어지도록 할 수 있다.

그리고 상기 제공된 각막을 숯(charcoal)이 포함된 정제수에 넣고 소정의 시간동안 탈세포 처리하는 단계를 진행할 수 있다(S20).

탈세포 처리 단계를 구체적으로 살펴보면, 우선 상기 냉동 보관을 통하여 부풀어 오른 스트로마(stroma)의 층을 2~4개로 결대로 벗기는 과정을 거칠 수 있다. 다만, 상기 스트로마(stroma)층은 조직원의 종류 및 생장에 따라 두께를 달리하므로, 벗기는 스트로마 층의 수를 2~4층으로 한정하지 않고 선택적으로 달리할 수 있다.

이후, 미리 준비해둔 정제된 DI water에 숯(charcoal) 및 염을 넣어 푼 용액에 상기 냉동되어 있던 각막을 넣고 150~210rpm에서 20~28시간 동안 교반시킬 수 있다. 여기서 숯(charcoal)은 얇게 분쇄하여 티백 주머니에 넣어 용액 속에 함유되도록 하는 방식으로 탈세포 처리제 역할을 수행할 수 있으며, 본 발명에서 염은 Nacl을 사용할 수 있다.

숯(charcoal)은 정화, 청정, 탈취, 제독, 제련, 전자파 제거 등 많은 효능을 지니고 있다. 그 중 특히 원적외선 방출과 음이온 방출은 숯(charcoal)이 우리건강에 직접적으로 영향을 미치는 가장 강력한 기능 중 하나이다. 여기서 숯(charcoal)의 음이온 방출은 세포외 기질(ECM)을 구성하고 있는 콜라겐(collagen)과 객(glycosaminoglycans) 표면의 음전하들의 구조를 안정화시킬 수 있다.

콜라겐(collagen) 및 객(glycosaminoglycans)을 살펴보면, 우선, 콜라겐(collagen)은 피부, 혈관, 뼈, 치아, 근육 등 모든 결합조직의 주된 단백질로서 또 다른 장기에도 세포 간 메트릭스로서 존재한다. 구성은 세 개의 폴리펩티드 사슬이 꼬여 있는 삼중나선형 구조로 특히 하이드로프롤린의 함량이 많은 단백질이며, 특히 포유동물의 살과 결합조직을 구성하고 늘어난 섬유 형태의 콜라겐(collagen)은 주로 힘줄, 인대, 각막, 연골조직 등에 주요한 구성성분으로 작용할 수 있다.

글라이코사미노글라이칸(Glycosaminoglycans)은 세포외 기질(ECM)에 있는 프로테오글리칸(proteoglycan) 주변과 세포 표면에 존재하며, 여러 개의 이당류(disaccharide)를 가지고 있는 긴 다당류(polysaccharide)이다. 객(glycosaminoglycans)과 가까이 있는 프로테오글리칸(proteoglycan)은 세포 외 기질(ECM)에 있는 증식 인자(growth factor) 및 사이토카인(cytokine)들과 결합하므로 직접적으로 세포에게 분화하거나 증식 등의 환경을 제공하게 되는 역할을 할 수 있다.

각막 조직은 다른 조직에 비하여 세포외 기질(ECM)을 구성하고 있는 콜라겐(collagen)과 객(glycosaminoglycans)의 규칙적인 배열에 의하여 시각이 유지된다. 즉, 각막 조직은 다른 조직에 비하여 콜라겐(collagen)과 객(glycosaminoglycans)의 비율이 대부분 차지하고 있으며, 각막의 원형을 보존시키기 위하여 콜라겐(collagen)과 객(glycosaminoglycans)의 비율 및 배열이 매우 높은 영향을 미칠 수 있다. 따라서 탈세포화 과정에서 상기 숯(charcoal)을 탈세포 처리제로 이용하는 경우, 숯(charcoal)의 음이온 방출이 각막의 세포외 기질(ECM)을 구성하고 있는 콜라겐(collagen)과 객(glycosaminoglycans)이 띄고 있는 표면 음전화들의 구조를 안정화시켜 상기 규칙적인 배열이 유지되는 이점을 보여준다.

기존의 탈세포 처리제로 이용되는 CHAPS와 같은, 세척제(detergent)들은 대부분 콜라겐(collagen)과 객(glycosaminoglycans)의 표면전하를 변형시키고, 이는 조직의 구조 변형을 유발하여, 조직 손상 및 조직 재생에 이롭지 못하였다. 그러나 본 발명에 따른 탈세포 처리제인 숯(charcoal)의 음이온 방출은 콜라겐(collagen)과 객(glycosaminoglycans)의 배열을 유지시켜주는 기능을 통해 세포외 기질(ECM)의 구조를 보존하는데 유리하게 작용하며 특히, 각막 조직에 생체적합적인 효과를 보여준다.

또한, 숯(charcoal)은 다공질로서, 상기 숯(charcoal)에 함유된 다공은 미생물, 중금속 및 오염 물질에 해당하는 불순물을 흡착할 수 있는 구조이다. 이런 다공을 포함하는 숯(charcoal)은 제공된 각막의 세포외 기질(ECM) 주변의 불순물을 흡착 또는 제거하여 효과적인 조직 재생을 가능하게 하는 효과도 가질 수 있다.

상기 숯(charcoal)을 이용하여, 탈세포화 단계를 거치고 나면, 상기 처리된 각막의 세포외 기질(ECM)을 저장액(hypotonic solution)내에서 교반하여 후처리하는 단계가 진행될 수 있다(S30).

구체적으로 후처리 단계에서 저장액(hypotonic solution)으로 Tris-HCl(pH8)을 사용하며, 상기 저장액(hypotonic solution) 내 처리된 각막을 넣고 150-210rpm에서 18~30시간 동안 교반할 수 있다. 상기와 같은 후처리 단계에 의하여, 세포가 용해(lysis)된 후에 남아있게 되는 DNA 또는 증식인자(growth factor)들을 제거할 수 있다.

탈세포화된 세포외 기질(ECM) 내에 DNA 또는 증식인자(growth factor)의 함유량이 높게 측정될 경우, 자가 세포 인식에 따른 면역반응을 일으키게 된다. 이는 상기 세포외 기질(ECM)과 서로 다른 DNA를 보유하고 있는 대상자에게 적합한 이식이 수행될 수 없다. 따라서 후처리 단계를 통해 DNA 또는 증식인자(growth factor)를 상당 부분 제거할 필요가 있으며, 특히 후술하겠지만, 본 발명은 숯(charcoal)을 이용한 탈세포 처리단계를 거치면서 더 낮은 DNA 함유량을 포함하는 세포외 기질을 획득할 수 있는 이점을 가진다.

이후, 상기 후처리된 상기 각막의 세포외 기질을 완충용액과 정제된 증류수로 세척하고 소정의 시간동안 동결 건조하는 단계가 진행될 수 있다(S40).

세척하는 단계는 여러 단계를 거쳐 진행되며, 상기 세척을 통하여 분순물이 충분히 제거되고 새로운 조직 내부에 이식되었을 때 면역반응을 최소한으로 억제할 수 있다.

세척하는 단계는 우선 완충용액으로 filered PBS를 사용하며, 상기 filered PBS와 정제된 DI water로 150-210rpm에서 24~48시간 동안 교반하면서 세척할 수 있다. 이후에 추가적인 완충용액으로 8~12mM Tris buffer(pH8)를 사용하여 20~28h동안 교반할 수 있다. 그리고 1% triton과 10mM Tris buffer를 넣고 20~40분 동안 교반할 수 있다. 이후, 0.1% 과초산(peracetic acid), 5% 에탄올(ethanol), 94.9% DI water에서 약 1시간 동안 150~210rpm으로 교반할 수 있다. 그리도 마지막으로 DI water로 12~20시간 교반하며, PBS를 사용하여 24~48시간 교반하면서 세척이 완료될 수 있다. 세척이 완료된 탈세포화된 각막의 세포외 기질(ECM)은 이후, 냉동 보관한 후 동결 건조(lyophilization)하는 단계를 진행할 수 있다.

이후, 상기 동결 건조(lyophilization)된 상기 각막의 세포외 기질(ECM)을 절개하고 가용화(solubilization)하는 단계가 진행될 수 있다(S50).

충분히 동결 건조(lyophilization)된 상기 각막은 겔화(gelation) 단계의 진행에 적합하도록 잘게 분쇄할 필요가 있다. 따라서 상기 동결 건조(lyophilization)된 각막 탈세포화 세포외 기질은 잘게 가위로 자르거나 믹서기로 가는 방법을 통해서 미세한 입자로 만들 수 있다. 이후, 미세화된 세포외 기질의 입자들은 가용화(solubilization)과정을 거치게 된다. 구체적으로 각막 세포외 기질의 0.01~0.05 질량비에 해당하는 단백질 가수분해 효소군 중 선택된 하나에 의해 처리한 후, 산처리 물질을 넣어 500~700rpm에서 44~52시간 동안 교반할 수 있다. 본 발명에서 단백질가수분해 효소로는 펩신(pepsin)을 사용하였으며, 산처리 물질로 약 0.5M 아세트산(acetic acid)를 사용하였다.

가용화(solubilization)처리가 완료되면, 입자화된 각막 세포외 기질(ECM)을 인체에 적합한 pH로 조절한 후 겔화(gelation)를 유도하는 단계가 진행될 수 있다(S60).

구체적으로, pH를 조절하기 위하여 약 10M NaOH를 약 10ul씩 넣으면서 pH7.2~7.6으로 맞춘다. pH를 적절하게 조절한 이후에는 세포외 기질(ECM)을 인큐베이터에 넣은 후 겔화(gelation)를 유도한다. 따라서 상기 겔화(gelation) 과정을 거친 용액은 3D프린터를 이용한 각막 재생재의 원료로 사용될 수 있다.

상기 겔화(gelation) 처리된 세포외 기질은 바이오 잉크로 3D프린터에 주입되어 환자의 환부와 정확히 일치하는 임틀란트, 즉 각막을 제작할 수 있다.

3D프린터는 우선 이식 대상자의 환부 사이즈를 스캐닝하여 이식 대상자의 환부 사이즈와 일치하는 각막에 대한 데이터를 확보한다. 이후, 겔화(gelation) 처리된 탈세포외 기질로 구성된 점성을 가진 용액, 즉 바이오 잉크를 3D프린터에 주입하고, 상기 3D프린터를 사용하여 스캐닝된 이식 대상자의 환부 사이즈와 일치하는 각막을 제작하는 단계가 진행될 수 있다.

이후, 생성된 각막을 상기 이식 대상자에 이식하는 단계와 상기 이식된 각막이 상기 이식 대상자의 상기 각막 주변 세포에 접촉하여 성장하는 단계를 거쳐 이식이 완료된다.

상기 숯(charcoal)으로 탈세포화 처리된 세포외 기질은 전술한 숯(charcoal)의 효능에 따라 불순물을 효과적으로 제거하고, 뛰어난 생체 적합성에 의하여 이식 대상자의 이식 주변 세포와의 융합이 잘 이루어진다. 또한, 줄기세포의 분화가 잘 이루어지기 때문에 매우 빠르고 효과적인 각막 이식이 가능하여 각막을 제공받은 환자의 빠른 재생 효과를 기대할 수 있다.

더욱이, 본 발명은 탈세포화 세포외 기질의 활용도를 효과적으로 적용하기 위해서 화학적 처리가 아닌 자연친화적인 재료인 숯(charcoal)을 탈세포 처리제로 이용하였다. 이러한 탈세포화 기질에 사용된 숯(charcoal)은 한국에서 전통적으로 사용하는 재료의 우수함을 세계에 알릴 수 있다는 점과 더불어 글로벌을 타켓으로 하는 조직공학에서 좋은 재료로 활용될 수 있는 효과가 있다.

이하, 숯(charcoal)으로 탈세포 처리된 각막의 세포외 기질(ECM)이 생체재료로서 적합한 지 알아보기 위한 각막을 구성하는 유리한 성분의 비율 변화 및 유전자 제거 효과를 실험을 통하여 분석하였다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 숯(charcoal)을 이용한 탈세포 처리된 각막의 세포외 기질이 생체 재료로서 적합한지 실험을 통해 분석한 그래프이다. 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 숯(charcoal)을 이용한 탈세포 처리된 연골의 세포외 기질이 생체 재료로서 적합한지 실험을 통해 분석한 그래프이다.

도 2 및 도 3을 참조하면, 생체 재료의 탈세포분석을 위하여 콜라겐 내용물의 정량 하이드록시프롤린 분석(hydroxyproline assay for quantification of total collagen content)을 실시하였다.

여기서 하이드록시프롤린(hydroxyproline)은 콜라겐(collagen)을 합성하는 효소이다. 우선, 표준 용액(standard solution)을 30ug/ml부터 0,1,2,3,4,5,6,8,10,15,20,30ug/ml로 희석해서 준비한다. 그리고 샘플을 3개로 각각 나누어서 96 well에 넣어 준비한다. 그리고 클로라민 T용액(chloramine T solution)를 넣고 20분 동안 실온(RT)에 놓아둔다. 그리고 추가적으로 DAB (3,3'-diaminobenzidine)넣은 후 60도의 온도를 가지는 워터 배쓰(water bath)에서 30분 동안 둔다. 이후, 실온(RT)에서 식히고 540nm파장에서 흡광도를 재서 콜라겐(collagen)의 양을 분석하였다.

또한, 호크스트 33258을 사용한 DNA정량법(Quantifiaction of DNA using Hoechst 33258)을 실시하였다. 상기 호크스트 33258을 사용한 DNA정량법(Quantifiaction of DNA using Hoechst 33258)은 흉선(thymus)에서 분리된 DNA 중합효소(DNA polymerase)에 의해 합성된 주형 DNA(template DNA)를 정량화하는 분석방법이다.

우선 Calf thymus DNA standard stock solution(1mg/ml)을 TE buffer에서 1000ng/ml, 500, 250, 100, 50, 20, 10, 0으로 희석해서 준비한다. 샘플은 10/1로 희석해서 3개씩 준비한다. 여기서, 각 샘플에서 3%이상의 DNA가 측정되면 자가 세포 인식에 따라 외부 조직에 대하여 면역 반응을 일으키기 때문에 탈세포화 세포외 기질(ECM)을 사용하는데 적합하지 않다. 하지만 숯(charcoal)을 사용하여 탈세포 처리된 각막 또는 연골의 세포의 기질의 경우에는 기존에 탈세포 처리제로 사용하던 CHAPS보다 더 좋은 효능을 보여주고 있음이 확인되었다.

또한, 상기 실험에서 사용된 DMMB 분석(dimethylmethylene blue assay)을 추가로 실시하였다. 상기 DMMB(dimethylmethylene blue)는 양이온 염료이며, 황산화 글리코아미노글리칸(sulfated glycoaminoglycan)하고만 결합하는 성질을 가지고 있다. 즉 chondroitin sulfate, keratin sulfate, heparan sulfate에만 결합하기 때문에 GAG을 정량하는 데 사용된다.

CSA a 20ug/ml, CSA b 40ug/ml, CSA c 60ug/ml을 준비하고 샘플을 각 세 개씩 준비한다. DMMA 염료(DMMA dye)를 각각 well에 넣고 535nm파장에서 흡광도 값을 읽는다. 표준값(standard)과 샘플의 값을 비교해서 양을 측정한다.

표 1은 상기 실험을 통하여 CHAPS 또는 숯(charcoal)으로 탈세포 처리된 각막의 기질 내의 DNA, GAG, 콜라겐(collagen)을 함유량을 비교한 표이다.

각막		DNA	GAG	Collagen
	Native	100	100	100
	Original	2.34	67.00	85.15
	CHAPS	8.26	29.37	125.82
	Charcoal	2.89	107.18	148.09

Native는 원 각막조직, Original은 탈세포화된 각막 조직, CHAPS는 CHAPS로 처리된 세포외 조직, Charcoal은 숯(charcoal)으로 처리된 세포외 조직을 나타낸다.

상기 도 2 및 표 1을 살펴보면, 숯(charcoal)을 사용하여 처리된 각막 세포의 기질의 경우에는 기존에 탈세포 처리제로 사용하던 CHAPS를 사용한 세포외 기질보다 DNA함량은 낮게, 객(glycosaminoglycans) 및 콜라겐(collagen)의 함량은 높은 것으로 알 수 있다. 전술한 것처럼 면역 반응을 억제하기 위하여 DNA함량은 낮을수록 안정적이며, 3%미만일 경우 적합하다. 또한, 세포외 기질(ECM)에 함유된 객(glycosaminoglycans)및 콜라겐(collagen)의 배열에 따라 시각이 유지되기 때문에 객(glycosaminoglycans) 및 콜라겐(collagen)의 함유량은 높을수록 유리하다는 것을 알 수 있다.

따라서 숯(charcoal)으로 처리된 각막 세포외 기질(ECM)의 경우를 살펴보면, 전체 질량 대비 DNA함량은 3%미만으로 안정적이며, 객(glycosaminoglycans) 및 콜라겐(collagen)의 함유량은 CHAPS을 사용한 세포외 기질(ECM)보다 매우 높게 유지되어 각막 형성 및 생체적합성에 있어 보다 더 좋은 효능을 보여주고 있음이 확인되었다.

추가적으로, 숯(charcoal)은 CHAPS에 비하여 경제적으로 유리한 물질에 해당한다. 예를 들면, 현재 CHAPS 120ml에 17만원 정도의 가격대를 형성함에 비추어, 숯(charcoal)은 5kg에 3만원 정도의 가격대를 형성하고 있다. 따라서 숯(charcoal)은 상기 각막의 탈세포 처리제로서의 직접적인 효능 외에도 경제적인 점에서 매우 유리한 장점을 가지고 있다.

표 2는 상기 실험을 통하여 CHAPS 또는 숯(charcoal)으로 탈세포 처리된 연골조직의 기질 내의 DNA, GAG, 콜라겐(collagen)을 함유량을 비교한 표이다.

연골		DNA	GAG	Collagen
	Native	100	100	100
	CHAPS	4.67	279.80	122.94
	Charcoal	4.70	240.30	141.52

Native는 원 연골조직, CHAPS는 CHAPS로 처리된 연골 세포외 조직, Charcoal은 숯(charcoal)으로 처리된 연골 세포외 조직을 나타낸다.

상기 도 3 및 표 2를 살펴보면, 숯(charcoal)을 사용하여 탈세포 처리된 연골 기질의 경우에는 기존에 탈세포 처리제로 사용하던 CHAPS을 사용한 세포외 기질보다 DNA함량은 유사하게, 콜라겐(collagen)의 함량은 높은 것으로 알 수 있다(객의 함량은 Native 대비 크게 증가하나 CHAPS 사용 대비 다소 낮음). 전술한 것처럼 면역 반응을 억제하기 위하여 DNA함량은 낮을수록 안정적이며, 연골의 대부분을 구성하는 성분은 콜라겐(collagen)과 객(glycosaminoglycans) 으로 연골을 재생하기 위하여 콜라겐(collagen)과 객(glycosaminoglycans)의 함유량은 높을수록 유리하다는 것을 알 수 있다. 다만, 연골의 경우, 일반적으로 세포외 기질(ECM)의 DNA함량은 5% 이내면 안정적임이 알려져 있다.

따라서 숯(charcoal)을 사용하여 탈세포 처리된 연골의 세포외 기질(ECM)의 경우를 살펴보면, 전체 질량 대비 DNA함량은 CHAPS을 사용한 세포외 기질과 큰 차이가 없으나 안정적인 수치이며, 콜라겐(collagen)의 함유량은 CHAPS을 사용한 세포외 기질보다 높게 유지되는 것이 확인되었다. 이를 통하여 각막 조직은 물론 다른 조직에도 숯(charcoal)을 사용하여 탈세포 처리된 기질이 조직 재생에 필요한 구성들을 높게 함유할 수 있음을 다시 한번 확인할 수 있었다.

결론적으로 본 발명은 숯(charcoal)으로 탈세포 처리된 각막 세포외 기질(ECM)은 면역 반응을 일으키는 DNA는 낮게 함유하며, 조직 재생에서 가장 중요한 성분인 콜라겐(collagen)과 객(glycosaminoglycans)은 높게 함유하여, 이식 재료에 뛰어난 효과를 가질 수 있고, 경제적임을 알 수 있다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라, CCK-8을 처리하여 세포 활성도를 비교한 그래프이다. 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라, 숯(charcoal)으로 탈세포 처리한 기질에 세포 활성을 나타낸 이미지이다.

도 4를 살펴보면, 세포 활성도를 확인하기 위하여 일반적으로 사용하는 CCK-8을 약품으로 처리하였다. 그래프 상, 숯(charcoal)을 표시한 막대는 숯(charcoal)을 이용하여 탈세포화된 세포외 기질에 세포를 넣은 후 시간에 따른 세포의 활성도를 나타낸다. 콜라겐(collagen)를 표시한 막대는 콜라겐(collagen)에 세포를 넣은 후 시간에 따른 세포의 활성도를 나타낸다. 시간은 3일, 7일, 14일까지 비교하였다.

시간이 지남에 따라, 탈세포화된 세포와 기질에 세포를 넣은 군은 콜라겐(collagen)에 세포를 넣은 군과 비교하여 세포 활성도가 지속적으로 증가하고 있음을 확인할 수 있다.

도 5를 살펴보면, 이미지를 통하여 숯(charcoal)을 이용하여 탈세포 처리 공정을 거친 각막 내의 살아있는 세포의 분포를 죽은 세포와 비교하였으며, 세포의 활성도가 활발함을 확인할 수 있었다.

따라서 도 4 및 5를 통하여, 숯(charcoal)을 탈세포 처리제로 사용한 경우 조직의 빠른 재생 효과 및 각막 형성과 생체적합성에 있어 보다 더 좋은 효능을 보여주고 있음을 다시 한번 알 수 있었다.

본 발명에 따른 생체적합성 조직의 탈세포 처리 조성물은 조직원으로부터 제공된 조직의 탈세포화를 위한 혼합물에 정제수 및 숯(charcoal)을 함유하여 구성될 수 있다. 상기 조직에는 각막이 포함될 수 있으며, 이하 각막을 예로 설명한다. 또한, 상기 혼합물은 상기 정제수에 분쇄된 숯(charcoal)과 염을 포함하며 구성될 수 있다. 여기서 숯(charcoal)은 얇게 분쇄하여 티백 주머니에 넣어 용액 속에 함유되도록 하는 방식으로 탈세포 처리제 역할을 수행할 수 있으며, 본 발명에서 염은 Nacl을 사용할 수 있다.

따라서 상기 성분으로 구성된 탈세포 처리 조성물 내에 냉동되어 있던 각막을 넣고, 150~210rpm에서 20~28시간 동안 교반시켜 탈세포를 처리할 수 있다.

전술한대로 상기 탈세포 처리 조성물에 함유된 숯(charcoal)은 음이온을 방출할 수 있다. 즉, 숯(charcoal)에서 방출되는 음이온은 상기 제공된 각막의 세포외 기질을 구성하는 콜라겐(collagen) 또는 객(glycosaminoglycans) 표면의 음전하를 안정화시킬 수 있다. 그 이외에도 상기 숯(charcoal)은 다공질로서, 상기 다공을 통해 상기 제공된 각막 조직 주변의 불순물을 흡착 또는 제거하는 효과가 있다. 이하 탈세포 처리제로 사용된 숯(charcoal)의 효능 및 방법의 구체적인 내용은 전술한 바 생략한다.

이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시 예들을 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적인 특징들이 변경되지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것으로 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

제공된 각막을 숯(charcoal)이 포함된 정제수에 넣고 탈세포 처리하는 단계; 및
상기 처리된 각막의 세포외 기질을 저장액(hypotonic solution)내에서 교반하여 후처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 각막 생성방법.
제 1항에 있어서,
상기 탈세포 처리하는 단계에서, 상기 정제수에 포함된 상기 숯(charcoal)에서 방출되는 음이온은 상기 제공된 각막의 세포외 기질을 구성하는 콜라겐(collagen) 또는 객(glycosaminoglycans) 표면의 음전하를 안정화시키는 것을 특징으로 하는 생체적합성 각막 생성방법.
제 1항에 있어서,
상기 탈세포 처리하는 단계에서, 상기 정제수에 포함된 상기 숯(charcoal)은 다공질로서, 상기 다공을 통해 상기 제공된 각막 조직 주변의 불순물을 흡착 또는 제거하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 각막 생성방법.
제 1항에 있어서,
상기 탈세포 처리하는 단계는, 정제된 증류수에 분쇄된 숯(charcoal)과 염을 넣은 후, 상기 제공된 각막을 넣고 150~210rpm에서 18~20시간 동안 교반하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 각막 생성방법.
제 1항에 있어서,
상기 정제수에 포함된 숯(charcoal)에 의해 탈세포 처리된 상기 각막의 세포외 기질 내에 함유된 DNA는 질량 퍼센트로 3%미만인 것을 특징으로 하는 생체적합성 각막 생성방법.
제 1항에 있어서,
상기 후처리하는 단계는, 상기 저장액으로 Tris-HCl(pH8)을 사용하며 상기 저장액 내 상기 처리된 각막의 세포외 기질을 넣고 150-210rpm에서 18~30시간 동안 교반하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 각막 생성방법.
제 1항에 있어서, 상기 후처리단계 이후에,
상기 후처리된 상기 각막의 세포외 기질을 완충용액과 정제된 증류수로 세척하고 동결 건조하는 단계;
상기 동결 건조된 상기 각막의 세포외 기질을 절개하고 가용화하는 단계; 및
상기 가용화된 기질을 pH 7.2 내지 7.6으로 조절한 후 겔화를 유도하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 각막 생성방법.
제 7항에 있어서, 상기 가용화하는 단계는,
상기 각막의 세포외 기질을, 상기 각막의 세포외 기질의 0.01~0.05 질량비에 해당하는 단백질가수분해 효소군 중 선택된 하나에 의해 처리한 후, 산처리 하기 위한 산(acid) 물질을 넣어 500~700rpm에서 44~52시간 동안 교반하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 각막 생성방법.
제 7항에 있어서, 상기 겔화를 유도하는 단계 이후에,
상기 겔화 처리된 바이오 잉크를 3D프린터에 주입하고, 상기 3D프린터를 사용하여 스캐닝된 이식 대상자의 환부 사이즈와 일치하는 각막을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 각막 생성방법.
조직원으로부터 제공된 각막 조직 또는 연골조직의 탈세포화를 위한 혼합물로서, 정제수 및 숯(charcoal)을 포함하여 구성되는 생체적합성 조직 탈세포 처리 조성물.
제 10항에 있어서,
상기 숯(charcoal)에서 방출되는 음이온은 상기 제공된 각막 조직 또는 연골 조직의 세포외 기질을 구성하는 콜라겐(collagen) 또는 객(glycosaminoglycans) 표면의 음전하를 안정화시키는 것을 특징으로 하는 생체적합성 조직 탈세포 처리 조성물.
제 10항에 있어서,
상기 숯(charcoal)은 다공질로서, 상기 다공을 통해 상기 제공된 각막 조직 또는 연골 조직 주변의 불순물을 흡착 또는 제거하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 조직 탈세포 처리 조성물.
제 10항에 있어서,
상기 혼합물은 상기 정제수에 분쇄된 숯(charcoal)과 염을 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 생체적합성 조직 탈세포 처리 조성물.