CN111686302B - 一种脱细胞角膜及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脱细胞角膜的制备方法，包括：一、对摘取的动物眼球进行清洗和消毒处理；二、剪取角膜，用生理盐水清洗干净；三、将角膜置于去离子水中，震荡破碎角膜中的细胞；四、将角膜置于高渗溶液中震荡处理，然后置于低渗溶液中震荡处理；五、角膜重复处理2~4次；六、脱水处理；七、削切，灭菌后保存。采用本发明的方法制备脱细胞角膜，能耗小，周期短，能在短时间内彻底脱除细胞的同时保护角膜的胶原的组成、机械完整性和生物活性，同时没有任何有毒有害的试剂残留，使角膜能更好的发挥其功能以及移植的有效性，制备的脱细胞角膜透明度好，免疫原性低，能够直接用于角膜移植。

Description

一种脱细胞角膜及其制备方法

技术领域

本发明属于医疗器械技术领域，具体涉及一种脱细胞角膜及其制备方法。

背景技术

角膜(Cornea)是眼睛最前面的透明部分，覆盖虹膜、瞳孔及前房，因复杂交错的胶原结构，使其能够保持良好的透明度和屈光度，同时丰富密集的神经分布，也使人们能够更好的感知周围的世界。然而角膜的病变会对其透明度等产生一定的影响，据统计，全球因角膜疾病致盲的眼病位列第二盲眼病，而且还在不断增加。面对庞大的患者群体，尤其是亚洲国家，捐献角膜的人数相对较少，所以仅靠角膜捐献来进行移植的希望非常小。

在寻找角膜移植替代品的过程中，由于某些动物角膜的结构、理化特性和光学特性非常相似，所以异体移植成为人们关注的焦点。但是异体移植存在排斥反应，主要是由于异体角膜细胞以及抗原成分会成为受体强大的免疫原，引起机体的免疫反应，因此，脱细胞角膜便应运而生，其目的是清除角膜中的细胞和抗原成分，仅剩下可供受体细胞等长入的三维立体支架类胶原成分。由于动物角膜细胞外基质的成分主要为胶原，所以可以很好的避免排斥反应，为角膜移植提供良好的基质材料。2015年，“艾欣瞳”的成功注册以及临床应用的成功，以及2016年广州优得清生物科技有限公司生产的脱细胞角膜植片也成功注册，为异体角膜移植带来了希望。

近些年人们都致力于研究脱细胞角膜的制备，其中有很多方法可以彻底脱细胞，现有的角膜去细胞方法包括洗涤剂、高低渗、酶和非酶试剂、高压、氮气和人类血清的一种或几种，主要目的是最小程度影响角膜胶原的结构、机械完整性和生物活性的基础上去除所有的细胞成分；因为细胞成分残留可能导致新注入的角膜细胞凋亡以及引起血管化等炎症反应。但是去细胞试剂是否破坏了细胞外基质的关键结构尚不清楚，并且脱细胞试剂的残留也降低了组织相容性，大大提高了异体移植的风险。例如脱细胞试剂中的酸会损伤胶原蛋白，同时减小角膜的机械性能；酶类脱细胞有较强的特异性，需要联合其它方法一同脱细胞，但是酶类的残留不仅会影响细胞再生，还会引起机体免疫反应；非离子洗涤剂TritonX-100虽然优于酶类，但是毒性较强，也会减少角膜的机械性能；离子洗涤剂SDS或SD有较大的毒性，单独使用也不能完全去除角膜中的可溶性蛋白抗原，还会损害细胞外基质成分；醇类的使用会使胶原蛋白发生沉淀，影响亚显微结构；而螯合剂如EDTA单独使用效果不佳，且会使基质丢失较多的金属离子成分。

因此急需一种角膜透明度高，结构和胶原蛋白完整的脱细胞角膜。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种脱细胞角膜的制备方法。该方法简单可靠，原料来源广泛，成本低，使用方便，易于工业化推广应用，能耗小，周期短，能在短时间内彻脱除细胞的同时保护角膜的胶原的组成、机械完整性和生物活性，同时没有任何有毒有害的试剂残留，使角膜能更好的发挥其功能以及移植的有效性，采用该方法制备的脱细胞角膜透明度好，免疫原性低，能够直接用于角膜移植。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种脱细胞角膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、对摘取的动物眼球进行清洗和消毒处理；

步骤二、从步骤一中经清洗和消毒处理后的动物眼球上剪取角膜，角膜上保留有2mm~4mm宽的巩膜，然后将剪取的角膜用生理盐水清洗干净；

步骤三、将步骤二中清洗干净的角膜置于去离子水中，于摇床中震荡破碎角膜中的细胞；

步骤四、将步骤三中震荡后的角膜置于高渗溶液中，于摇床中震荡处理3h~6h，然后置于低渗溶液中，于摇床中震荡处理3h~6h；所述高渗溶液为浓度为1M~3M的氯化钠溶液，所述低渗溶液为去离子水；

步骤五、按照步骤四的方法对角膜重复处理2~4次；

步骤六、将滤纸放置于干燥的氯化钠上，然后将微孔滤膜放置于滤纸上，形成脱水元件，将步骤五中重复处理后的角膜置于两个所述脱水元件之间进行脱水处理，所述角膜的上下表面均与微孔滤膜接触；所述微孔滤膜的层数为1~4层，滤纸的层数为3~10层；

步骤七、对步骤六中脱水处理后的角膜进行削切，然后将削切后的角膜灭菌后保存。

上述的一种脱细胞角膜的制备方法，其特征在于，步骤一中所述消毒处理采用次氯酸钠溶液浸泡消毒，处理时间为30min~60min。

上述的一种脱细胞角膜的制备方法，其特征在于，所述次氯酸钠溶液的质量浓度为0.09%~0.2%。

上述的一种脱细胞角膜的制备方法，其特征在于，步骤一中所述清洗和消毒处理的具体过程为：将摘取的动物眼球用生理盐水清洗，然后用次氯酸钠溶液浸泡消毒，最后用生理盐水清洗去除次氯酸钠。

上述的一种脱细胞角膜的制备方法，其特征在于，步骤三中所述震荡的时间为5h~10h，摇床的转速为100rpm~200rpm，所用去离子水的温度为18℃~30℃。

上述的一种脱细胞角膜的制备方法，其特征在于，步骤四中所述高渗溶液的温度为18℃~30℃，低渗溶液的温度为18℃~30℃，摇床的转速均为100rpm~200rpm；步骤四中在低渗溶液中震荡处理的过程中，每隔0.5h~1h换液一次。

上述的一种脱细胞角膜的制备方法，其特征在于，步骤六中脱水处理的时间为0.5h~3h。

上述的一种脱细胞角膜的制备方法，其特征在于，步骤七中削切后的角膜厚度为0.15mm~0.55mm。

上述的一种脱细胞角膜的制备方法，其特征在于，步骤七中采用钴-60γ射线进行辐照灭菌，辐照剂量为5kGy ~10kGy。

另外，本发明还提供了一种利用上述的方法制备得到的脱细胞角膜。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明前处理过程中全眼球和剪取角膜的清洗均采用生理盐水，一方面可以达到一定的抑菌作用，另一方面还可以有效的维持角膜的原始厚度。

2、本发明采用全眼球病毒灭活，最大程度地减少了对角膜基质胶原结构的破坏，同时保持了角膜的固有形态，使角膜胶原纤维的排列与新鲜角膜最为接近，最大程度的保证了角膜植入后的透明度；其次，在工艺最开始进行全眼球病毒灭活最大程度的降低了病毒风险，保证了生产加工人员的安全。

3、本发明采用高渗溶液和低渗溶液循环进行脱细胞，采用氯化钠溶液为高渗溶液，去离子水为低渗溶液，避免了使用去垢剂进行脱细胞造成的有机溶剂残留所导致的潜在毒性，提高了产品的安全性，同时氯化钠的使用对于维持角膜的透明度有很好的效果，优选低渗溶液震荡处理的过程中换液，有利于角膜细胞的进一步破碎。

4、本发明采用氯化钠溶液作为高渗溶液，避免了使用EDTA二钠溶液所引起的角膜金属离子丢失，透明度低的问题，提高了产品透明度。

5、本发明采用微孔滤膜、滤纸和盐相结合的脱水元件，最快能在半小时左右将角膜脱水至原始厚度，避免了甘油脱水引起的角膜变形及甘油残留引起的角膜变黄而使透明度降低。

6、本发明方法简单可靠，原料来源广泛，成本低，使用方便，易于工业化推广应用。

7、采用本发明的方法制备脱细胞角膜，能耗小，周期短，能在短时间内彻脱除细胞的同时保护角膜的胶原的组成、机械完整性和生物活性，同时没有任何有毒有害的试剂残留，使角膜能更好的发挥其功能以及移植的有效性。

8、本发明制备的脱细胞角膜透明度好，免疫原性低，能够直接用于角膜移植。

下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

说明书附图

图1为本发明实施例1制备的脱细胞角膜整体的苏木精-伊红（HE）染色结构图。

图2为本发明实施例1制备的脱细胞角膜局部的苏木精-伊红（HE）染色结构图。

图3为本发明脱水处理时角膜与脱水元件的结构示意图。

附图标记说明：

1—角膜；	2—微孔滤膜；	3—滤纸；
			4—氯化钠。

具体实施方式

实施例1

本实施例的脱细胞角膜的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、取处死后4小时内的新鲜健康成年猪眼球，将摘取的眼球用生理盐水清洗去除血渍，然后用质量浓度为0.09%的次氯酸钠溶液浸泡消毒60min，最后用生理盐水清洗3次去除次氯酸钠；

步骤二、从步骤一中经清洗和消毒处理后的眼球上剪取角膜，角膜上保留有2mm宽的巩膜，并去掉巩膜上的结膜，然后将剪取的角膜用生理盐水清洗5次；

步骤三、将步骤二中清洗后的角膜置于18℃去离子水中，放入摇床震荡破碎角膜中的细胞，震荡的时间为10h，每2小时换液一次，震荡的转速为200rpm；

步骤四、将步骤三中震荡后的角膜置于温度为18℃的高渗溶液中，于摇床中震荡处理3h，摇床的转速为200rpm，然后置于温度为18℃的低渗溶液，于摇床中震荡处理3h，摇床的转速为200rpm；所述高渗溶液为浓度为3M的氯化钠溶液，所述低渗溶液为去离子水；在低渗溶液中震荡处理的过程中，每隔1h换液一次；

步骤五、按照步骤四的方法对角膜重复处理4次；

步骤六、将滤纸放置于干燥的氯化钠4上，然后将微孔滤膜2（市售微孔滤膜均可）放置于滤纸3上，形成脱水元件，如图3所示，将步骤五中重复处理后的角膜1置于两个所述脱水元件之间脱水处理0.5h，所述角膜的上下表面均与微孔滤膜接触；所述微孔滤膜的层数为1层，滤纸的层数为10层；

步骤七、对步骤六中脱水处理后的角膜进行削切，削切后的角膜只包含前弹力层和部分基质层，厚度为0.55mm；然后将削切后的角膜平铺到直径为3cm的一次性培养皿中，基质层贴壁，培养皿用封口膜封口，采用钴-60γ射线进行辐照灭菌后保存，得到脱细胞角膜，辐照剂量为5kGy。

本实施例制备得到的脱细胞角膜脱细胞彻底，无可见细胞碎片，透明度好，免疫原性低，能够直接用于角膜移植。

图1为本实施例制备的脱细胞角膜整体的苏木精-伊红（HE）染色结构图，图2为本实施例制备的脱细胞角膜局部的苏木精-伊红（HE）染色结构图。从图中可以看出，本实施例制备的脱细胞角膜脱细胞彻底，无可见细胞碎片。

实施例2

本实施例的脱细胞角膜的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、取处死后4小时内的新鲜健康成年猪眼球，将摘取的眼球用生理盐水清洗，然后用质量浓度为0.15%次氯酸钠溶液浸泡消毒60min，最后用生理盐水清洗3次去除次氯酸钠；

步骤二、从步骤一中经清洗和消毒处理后的眼球上剪取角膜，角膜上保留有3mm宽的巩膜，并去掉巩膜上的结膜，然后将剪取的角膜用生理盐水清洗5次；

步骤三、将步骤二中清洗后的角膜置于20℃的去离子水中，放入摇床震荡破碎角膜中的细胞，震荡的时间为7h，每1小时换液一次，震荡的转速为160rpm；

步骤四、将步骤三中震荡后的角膜置于温度为20℃的高渗溶液中，于摇床中震荡处理4h，摇床的转速为160rpm，然后置于温度为20℃的低渗溶液中，于摇床中震荡处理3h，摇床的转速为160rpm；所述高渗溶液为浓度为2M的氯化钠溶液，所述低渗溶液为去离子水；在低渗溶液中震荡处理的过程中，每隔0.5h换液一次；

步骤五、按照步骤四的方法对角膜重复处理3次；

步骤六、将滤纸放置于干燥的氯化钠4上，然后将微孔滤膜2（市售微孔滤膜均可）放置于滤纸3上，形成脱水元件，如图3所示，将步骤五中重复处理后的角膜1置于两个所述脱水元件之间脱水处理0.5h，所述角膜的上下表面均与微孔滤膜接触；所述微孔滤膜的层数为2层，滤纸的层数为4层；

步骤七、对步骤六中脱水处理后的角膜进行削切，削切后的角膜只包含前弹力层和部分基质层，厚度为0.45mm；然后将削切后的角膜平铺到直径为3cm的一次性培养皿中，基质层贴壁，培养皿用封口膜封口，采用钴-60γ射线进行辐照灭菌后保存，得到脱细胞角膜，辐照剂量为7kGy。

本实施例制备得到的脱细胞角膜脱细胞彻底，无可见细胞碎片，透明度好，免疫原性低，能够直接用于角膜移植。

实施例3

本实施例的脱细胞角膜的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、取处死后4小时内的新鲜健康成年猪眼球，将摘取的眼球用生理盐水清洗，然后用质量浓度为0.2%次氯酸钠溶液浸泡消毒30min，最后用生理盐水清洗3次去除次氯酸钠；

步骤二、从步骤一中经清洗和消毒处理后的动物眼球上剪取角膜，角膜上保留有3.5mm宽的巩膜，并去掉巩膜上的结膜，然后将剪取的角膜用生理盐水清洗5次；

步骤三、将步骤二中清洗后的角膜置于25℃的去离子水中，放入摇床震荡破碎角膜中的细胞，震荡的时间为6h，每1小时换液一次，震荡的转速为140rpm；

步骤四、将步骤三中震荡后的角膜置于温度为25℃的高渗溶液中，于摇床中震荡处理3h，摇床的转速为140rpm，然后置于温度为25℃的低渗溶液中，于摇床中震荡处理3h，摇床的转速为140rpm；所述高渗溶液为浓度为2M的氯化钠溶液，所述低渗溶液为去离子水；在低渗溶液中震荡处理的过程中，每隔1h换液一次；

步骤五、按照步骤四的方法对角膜重复处理3次；

步骤六、将滤纸放置于干燥的氯化钠4上，然后将微孔滤膜2（市售微孔滤膜均可）放置于滤纸3上，形成脱水元件，如图3所示，将步骤五中重复处理后的角膜1置于两个所述脱水元件之间脱水处理1h，所述角膜的上下表面均与微孔滤膜接触；所述微孔滤膜的层数为2层，滤纸的层数为5层；

步骤七、对步骤六中脱水处理后的角膜进行削切，削切后的角膜只包含前弹力层和部分基质层，厚度为0.25mm；然后将削切后的角膜平铺到直径为3cm的一次性培养皿中，基质层贴壁，培养皿用封口膜封口，采用钴-60γ射线进行辐照灭菌后保存，得到脱细胞角膜，辐照剂量为10kGy。

本实施例制备得到的脱细胞角膜脱细胞彻底，无可见细胞碎片，透明度好，免疫原性低，能够直接用于角膜移植。

实施例4

本实施例的脱细胞角膜的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、取处死后4小时内的新鲜健康成年猪眼球，将摘取的眼球用生理盐水清洗去除血渍，然后用质量浓度为0.15%的次氯酸钠溶液浸泡消毒40min，最后用生理盐水清洗3次去除次氯酸钠；

步骤二、从步骤一中经清洗和消毒处理后的眼球上剪取角膜，角膜上保留有3mm宽的巩膜，并去掉巩膜上的结膜，然后将剪取的角膜用生理盐水清洗5次；

步骤三、将步骤二中清洗后的角膜置于28℃去离子水中，放入摇床震荡破碎角膜中的细胞，震荡的时间为5h，每1小时换液一次，震荡的转速为120rpm；

步骤四、将步骤三中震荡后的角膜置于温度为28℃的高渗溶液中，于摇床中震荡处理4h，摇床的转速为120rpm，然后置于温度为28℃的低渗溶液中，于摇床中震荡处理4h，摇床的转速为120rpm；所述高渗溶液为浓度为2M的氯化钠溶液，所述低渗溶液为去离子水；在低渗溶液中震荡处理的过程中，每隔0.8h换液一次；

步骤五、按照步骤四的方法对角膜重复处理3次；

步骤六、将滤纸放置于干燥的氯化钠4上，然后将微孔滤膜2（市售微孔滤膜均可）放置于滤纸3上，形成脱水元件，如图3所示，将步骤五中重复处理后的角膜1置于两个所述脱水元件之间脱水处理2h，所述角膜的上下表面均与微孔滤膜接触；所述微孔滤膜的层数为2层，滤纸的层数为6层；

步骤七、对步骤六中脱水处理后的角膜进行削切，削切后的角膜只包含前弹力层和部分基质层，厚度为0.15mm；然后将削切后的角膜平铺到直径为3cm的一次性培养皿中，基质层贴壁，培养皿用封口膜封口，采用钴-60γ射线进行辐照灭菌后保存，得到脱细胞角膜，辐照剂量为5kGy。

本实施例制备得到的脱细胞角膜脱细胞彻底，无可见细胞碎片，透明度好，免疫原性低，能够直接用于角膜移植。

实施例5

本实施例的脱细胞角膜的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、取处死后4小时内的新鲜健康成年猪眼球，将摘取的眼球用生理盐水清洗去除血渍，然后用质量浓度为0.2%的次氯酸钠溶液浸泡消毒30min，最后用生理盐水清洗3次去除次氯酸钠；

步骤二、从步骤一中经清洗和消毒处理后的眼球上剪取角膜，角膜上保留有4mm宽的巩膜，并去掉巩膜上的结膜，然后将剪取的角膜用生理盐水清洗5次；

步骤三、将步骤二中清洗后的角膜置于30℃去离子水中，放入摇床震荡破碎角膜中的细胞，震荡的时间为5h，每0.5h换液一次，震荡的转速为100rpm；

步骤四、将步骤三中震荡后的角膜置于温度为30℃的高渗溶液中震荡处理6h，摇床的转速为100rpm，然后置于温度为30℃的低渗溶液中震荡处理6h，摇床的转速为100rpm；所述高渗溶液为浓度为1M的氯化钠溶液，所述低渗溶液为去离子水；在低渗溶液中震荡处理的过程中，每隔0.5h换液一次；

步骤五、按照步骤四的方法对角膜重复处理2次；

步骤六、将滤纸放置于干燥的氯化钠4上，然后将微孔滤膜2（市售微孔滤膜均可）放置于滤纸3上，形成脱水元件，如图3所示，将步骤五中重复处理后的角膜1置于两个所述脱水元件之间脱水处理3h，所述角膜的上下表面均与微孔滤膜接触；所述微孔滤膜的层数为4层，滤纸的层数为3层；

步骤七、对步骤六中脱水处理后的角膜进行削切，削切后的角膜只包含前弹力层和部分基质层，厚度为0.15mm；然后将削切后的角膜平铺到直径为3cm的一次性培养皿中，基质层贴壁，培养皿用封口膜封口，采用钴-60γ射线进行辐照灭菌后保存，得到脱细胞角膜，辐照剂量为10kGy。

本实施例制备得到的脱细胞角膜脱细胞彻底，无可见细胞碎片，透明度好，免疫原性低，能够直接用于角膜移植。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

Claims (8)

1.一种脱细胞角膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、对摘取的动物眼球进行清洗和消毒处理；

步骤二、从步骤一中经清洗和消毒处理后的动物眼球上剪取角膜，角膜上保留有2mm～4mm宽的巩膜，然后将剪取的角膜用生理盐水清洗干净；

步骤三、将步骤二中清洗干净的角膜置于去离子水中，于摇床中震荡破碎角膜中的细胞；

步骤四、将步骤三中震荡后的角膜置于高渗溶液中，于摇床中震荡处理3h～6h，然后置于低渗溶液中，于摇床中震荡处理3h～6h；所述高渗溶液为浓度为1M～3M的氯化钠溶液，所述低渗溶液为去离子水；

步骤五、按照步骤四的方法对角膜重复处理2～4次；

步骤六、将滤纸放置于干燥的氯化钠上，然后将微孔滤膜放置于滤纸上，形成脱水元件，将步骤五中重复处理后的角膜置于两个所述脱水元件之间进行脱水处理，所述角膜的上下表面均与微孔滤膜接触；所述微孔滤膜的层数为1～4层，滤纸的层数为3～10层；

步骤七、对步骤六中脱水处理后的角膜进行削切，然后将削切后的角膜灭菌后保存；

步骤一中所述消毒处理采用次氯酸钠溶液浸泡消毒，处理时间为30min～60min；

所述次氯酸钠溶液的质量浓度为0.09％～0.2％。

2.根据权利要求1所述的一种脱细胞角膜的制备方法，其特征在于，步骤一中所述清洗和消毒处理的具体过程为：将摘取的动物眼球用生理盐水清洗，然后用次氯酸钠溶液浸泡消毒，最后用生理盐水清洗去除次氯酸钠。

3.根据权利要求1所述的一种脱细胞角膜的制备方法，其特征在于，步骤三中所述震荡的时间为5h～10h，摇床的转速为100rpm～200rpm，所用去离子水的温度为18℃～30℃。

4.根据权利要求1所述的一种脱细胞角膜的制备方法，其特征在于，步骤四中所述高渗溶液的温度为18℃～30℃，低渗溶液的温度为18℃～30℃，摇床的转速均为100rpm～200rpm；步骤四中在低渗溶液中震荡处理的过程中，每隔0.5h～1h换液一次。

5.根据权利要求1所述的一种脱细胞角膜的制备方法，其特征在于，步骤六中脱水处理的时间为0.5h～3h。

6.根据权利要求1所述的一种脱细胞角膜的制备方法，其特征在于，步骤七中削切后的角膜厚度为0.15mm～0.55mm。

7.根据权利要求1所述的一种脱细胞角膜的制备方法，其特征在于，步骤七中采用钴-60γ射线进行辐照灭菌，辐照剂量为5kGy～10kGy。

8.一种利用如权利要求1至7中任一权利要求所述的方法制备得到的脱细胞角膜。

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