CN104971384A - 一种组织工程角膜的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于组织工程技术领域，提供了一种组织工程角膜的制备方法，采用人角膜缘细胞复合动物源性角膜制备的支架材料的方式，将前弹力层、基质层和后弹力层分离，涂布人角膜缘细胞制备的细胞混悬液，后通过交联，粘合等方式完成含细胞的组织工程角膜构建，此方法制备的组织工程角膜在使用方面具有组织相容性高，可以产业化制备等优点。同时所采用细胞未经过体外扩增培养，细胞性状稳定，不易分化，保证了组织工程角膜的安全性。
Description
技术领域
本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种组织工程角膜的构建方法。
背景技术
角膜是维持人体正常视力的组织之一，角膜的急性损伤、穿孔、溃疡、病变等造成的视力下降或失明，甚至眼球摘除，给患者的正常生活和心理造成极大的影响。
现今，角膜盲已成为全球第二大致盲性疾病，治疗角膜盲最为有效的方法是角膜移植，然而角膜来源缺乏，导致患者不能及时治疗而终生失明。根据统计而知，我国大约有400万角膜盲患者需要角膜移植，然而仅有不到万例的患者有供体角膜进行移植。角膜供体来源的匮乏，制约了角膜盲患者的治疗。
人体正常角膜为椭圆形，横径为11.5--12cm ，垂直径约为10.5--11mm。周边厚度约为1mm，中央稍薄约为0.6mm。其前表面的曲率半径为7.8mm，后表面为6.8mm。角膜由外向内共有5层结构，分别为上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮细胞层。角膜缘为环状区域，在角膜与巩膜交界处，是角膜的干细胞富集区域，含有大量角膜干细胞，可用于组织工程角膜的体外构建。
目前组织工程技术的发展和近年来的研究表明，在组织工程技术思想的支撑下，采用种子细胞和支架材料的方式，可以体外制备组织工程角膜，进行角膜损伤患者的治疗，甚至角膜替代移植。
目前现有技术表明（如中国专利201410264542.X和201410230365.3），其制备的人工角膜仅提供支架材料，缺乏具有活性功能的种子细胞，在植入体内进行修复时，仅依靠患者患处细胞修复能力进行损伤修复，延长了治疗过程的同时，也增加了修复失败的概率，同时，其制备的支架材料为外源性材料，植入后与患者组织相容性差，有排异的风险。
中国专利03140113.9公开了一种人工组织工程化生物角膜，采用了上皮和内皮细胞作为种子细胞，但所用载体为动物组织或异体的角膜成分，其保留了外援细胞或细胞残余组分，并且未对残余组分进行控制描述，其会引起人体的免疫排斥和病毒交叉感染，导致植入修复后患者对植入物的排异反应，造成治疗失败，同时所用种子细胞不具有分化的多潜能性，造成治疗效果的局限性，同时，此类方法，都需要采用体外培养的方式扩增细胞，改变了细胞的生存环境，加大了细胞变异的可能性，同时细胞培养过程漫长，延缓了治疗过程，而且可能面临二次手术的，给患者健康带来潜在的危害。
因此，本发明以解决上述现有技术的问题为目的，即本发明的目的在于提供模拟人体正常角膜的结构和功能，实现角膜移植治疗的替代物的功能。
发明内容
本发明的目的是提供一种生物相容性高、透明度好、力学性能强，可应用于人体角膜移植手术的全层修复的组织工程角膜的制备方法。
该组织工程角膜的制备，包括以下步骤，
步骤一、动物源性角膜的选取和前处理：
选取包含有前弹力层的动物源性角膜，将其置于添加抗生素的、温度在2～30℃的去离子水中浸泡8～24h，待所述动物源性角膜厚度溶胀到2～5倍厚度后，该动物源性角膜的上皮细胞层会由于后弹力层胀起而脱落，同时抗生素的使用，可以有效去除该动物源性角膜组织的细菌，获得无菌的、去除了上皮细胞层的动物源性角膜组织材料；
步骤二、角膜各层的分离：
将步骤一制备所得的动物源性角膜组织材料置于角膜切削设备中，切削获得前弹力层组织片、基质层组织片和后弹力层组织片，实现角膜各层的分离；
步骤三、将步骤二制备所获得的前弹力层组织片、基质层组织片和后弹力层组织片去抗原、病毒灭活处理后，采用质量百分比浓度为60%～95%的甘油对去抗原、病毒灭活处理后的前弹力层组织片、基质层组织片和后弹力层组织片进行脱水处理，然后在2～30℃的温度条件下，使前弹力层组织片、基质层组织片和后弹力层组织片恢复至溶胀前的生理状态，同时置于所述甘油中保持待用；
步骤四、制备细胞混悬液：
将人角膜缘组织置于25～37℃预热的胰酶溶液中消化细胞，胰酶浓度为0.1%～0.25%，消化时间为1～10min，后采用人血清终止消化，800～1200rpm离心收集细胞，随后采用溶液A将收集的细胞制备成细胞混悬液，待用。
所述溶液A是体积百分数为10%～30%的人血清、胶原溶液和透明质酸溶液中的任一种或两种的混合或三种的混合溶液；
所述细胞混悬液的细胞浓度为1×104至2×105个细胞每毫升；
步骤五、组织工程角膜的构建：
将步骤四制备的细胞混悬液涂布于步骤三制备的前弹力层组织片、基质层组织片和后弹力层组织片上，在25～37℃下静置至少30min后，让细胞有效附着于弹力层组织片、基质层组织片和后弹力层组织片的表面；
再将表面上附着了细胞的前弹力层组织片、基质层组织片和后弹力层组织片，以后弹力层组织片在下、基质层组织片居中和前弹力层组织片在上的顺序堆叠，同时对其进行交联和加固以固定各层，制得所述组织工程角膜。
上述抗生素为青霉素类、头孢菌素类、链霉素、庆大霉素、红霉素和白霉素的一种或两种或多种混合。
上述前弹力层组织片和后弹力层组织片的切削厚度为所述动物源性角膜组织材料的厚度的5%～10%。
上述去抗原后的前弹力层组织片、基质层组织片和后弹力层组织片的DNA残留量在1～100mg/ml之间，其脂性物质含量应在1%以下。
上述细胞混悬液的pH值在5～9之间，细胞混悬液300nm至800nm的透光率在80%以上，细胞混悬液的渗透压在200～380 mOsmol/L之间。
上述人血清是接收角膜移植或修复的患者自身制备的血清或正常健康的人通过采血而制备的，并进行补体灭活操作后的人血清。
上述交联是指采用核黄素光催化的交联操作，在后弹力层组织片与基质层组织片之间、基质层组织片和前弹力层组织片之间滴加核黄素溶液，并充分去除层间气泡，使后弹力层组织片、基质层组织片和前弹力层组织片中的核黄素溶液达到15～50μg/g的浓度，再通过波长在350～390nm范围内的光照射，进行光催化的交联。
上述加固是采用生物蛋白胶在所构建的后弹力层组织片与基质层组织片的层间边缘处、基质层组织片和前弹力层组织片的层间边缘处进行黏连，所述的生物蛋白胶是纤维蛋白原浓缩液和凝血酶的混合液。
上述动物源性角膜为猿、猴子、猩猩、猪、牛和鸡的角膜中的任一种
上述的组织工程角膜，其特征在于300nm～800nm范围内光通过率在50%～90%之间，其缝线撕裂力在0.3～5N之间。
与现有产品及技术相比，本发明具有以下优点：
本方法制备的组织工程角膜，采用人角膜缘细胞复合生物支架材料的方式获得最终的组织工程角膜，此方法制备的组织工程角膜在使用方面具有组织相容性高，可以产业化制备等优点。同时所采用细胞未经过体外扩增培养，细胞性状稳定，不易分化，保证了组织工程角膜的安全性。
附图说明：
图1 制备的猪角膜复合人角膜缘细胞的组织工程角膜实物图。
图2 采用组织工程角膜修复兔眼角膜损伤14天修复效果实物图。
图3 兔眼角膜修复后HE染色实物图。
具体实施方式
本实施例的目的是通过提供一种高仿生的组织工程角膜的制备方法，获取具有天然角的前弹力层、基质层、后弹力层、以及与内皮细胞层阻水功能相似的阻水层，且生物相容性高、透明度好、力学性能强的特点，可应用于人体角膜移植手术的全层修复的组织工程角膜。
该组织工程角膜的制备方法，主要包括动物源性角膜前处理，角膜各层的分离，脱细胞、病毒灭活处理，细胞混悬液制备和组织工程角膜的构建，具体制备过程如下：
步骤一，动物源性角膜前处理：
将动物源性角膜取材后，置于添加抗生素的、2~30℃的去离子水浸泡8~24h，天然的角膜会由于吸水而溶胀，其厚度可溶胀到2~5倍厚度后，角膜上皮细胞层会由于后弹力层胀起而脱落，同时抗生素的使用，可以有效去除角膜组织的细菌，获得无菌材料。
本步骤所述的抗生素为青霉素类、头孢菌素类、链霉素、庆大霉素、红霉素和白霉素的一种或两种或多种的混合。
本步骤所述的动物源性角膜，为包含有前弹力层的角膜，由于动物种属差异，有些动物的角膜缺失前弹力层，故本发明所述动物优先选用灵长类动物如猿、猴子和猩猩，同时也可以采用猪、牛和鸡的角膜.
通过本步骤处理，获得的材料包括天然角膜的前弹力层组织、基质层组织和后弹力层组织，去除了角膜的上皮细胞层组织。而角膜的内皮细胞层组织，其生理机构为单层的细胞组织，在实际操作中，目前现有技术难于获得单细胞层组织，而且后续步骤中有脱细胞处理，会完全破坏其结构，故不进行过多说明。
步骤二，角膜各层的分离：
将上述步骤的组织置于角膜切削设备中，切削获得前弹力层组织片、基质层组织片和后弹力层组织片，实现角膜各层的分离。
正常角膜90%的厚度均为基质层，而剩余的厚度主要为上皮细胞层、前弹力层和后弹力层，而本步骤中所用角膜为去除了上皮细胞层的角膜，其层间顺序为前弹力层、基质层和后弹力层，前弹力层和后弹力层的切削厚度，为步骤一处理后材料厚度的5%～10%，可以有效保证所获得完整的前弹力层和后弹力层组织片。
本步骤所述的角膜切削设备，优先采用飞秒激光，可以精准切削角膜组织片，同时还可以是采用显微角膜切削刀或类似的手术器械进行角膜的切削。
步骤三， 去抗原、病毒灭活处理
将上步骤所获得的组织片采用，但不限于中国专利201310003274.1中所述的脱细胞和病毒灭活的方法进行处理，获得低免疫原性的脱毒组织。在此基础上，本步骤还需要采用60%～95%的甘油对上述处理的组织片进行脱水处理，处理温度在2～30℃，使角膜组织恢复溶胀前的生理状态，同时置于上述甘油中保持待用。
本步骤所述的组织片，其特征在于通过处理后，其DNA残留量应在1～100mg/ml之间，其脂性物质含量应在1%以下。
步骤四，细胞混悬液制备：
将人角膜缘组织置于25～37℃预热的胰酶溶液中消化细胞，胰酶浓度为0.1%～0.25%，消化时间为1～10min，后采用人血清终止消化，800～1200rpm离心收集细胞，随后采用溶液A将收集的细胞制备成混悬液，待用。
本步骤中所述的细胞混悬液，其特征在于细胞浓度为1×104至2×105个细胞每毫升。
本步骤中所述的溶液A，其特征在于为10%～30%的人血清、胶原溶液和透明质酸溶液一种或多种的混合液。
本步骤所述的混悬液，其特征在于溶液的pH值在5～9之间，溶液300nm至800nm的透光率在80%以上，溶液的渗透压在200～380 mOsmol/L之间。
本步骤所用的人血清，其特征在于优先的选择是接收角膜移植或修复的患者自身制备的血清，还可以的选择是正常健康的人通过采血而制备的，并进行补体灭活操作后的血清。
步骤五，组织工程角膜的构建：
将步骤四制备的细胞混悬液涂布与步骤三制备的脱细胞、灭病毒后的组织片上，25～37℃下静置至少30min后，让细胞可以有效附着于材料表面。再将不同组织片以后弹力层组织片、基质层组织片和前弹力层组织片的顺序堆叠，同时采用交联技术和加固技术固定各层。
本步骤中所述的交联技术，其特征是可以采用核黄素光催化的交联操作，以强化角膜组织的强度，其技术特征在于不同组织片层间滴加核黄素溶液，并充分去除层间气泡，使角膜组织中的核黄素溶液达到15～50μg/g的浓度，再通过波长在350～390nm范围内的光照射，让构建的组织工程角膜进行光催化的交联。
本步骤中所述的加固技术，其特征是采用生物蛋白胶在所构建组织工程角膜层间边缘处进行黏连，所述的生物蛋白胶是纤维蛋白原浓缩液和凝血酶的混合液。
本步骤中所述的组织工程角膜，其特征在于300nm～800nm范围内光通过率在50%~90%之间，其缝线撕裂力在0.3～5N之间。
通过以上步骤，即可制备前述的组织工程角膜。
现通过以下具体的实施实例，对上述组织工程角膜的制备做进一步的详细说明：
实施例1、制备猪眼角膜支架复合细胞的组织工程角膜。
采集猪眼角膜，置于添加了庆大霉素，链霉素混合的无菌去离子水中浸泡8h，猪角膜厚度由于吸水溶胀至初始厚度的2倍，同时上皮细胞层脱落。再将上述角膜置于显微台面上，采用角膜切削刀将角膜切成三层，前弹力层、基质层和后弹力层的切取厚度分别占总厚度的比例为5%、90%和5%。再将上述组织片置于3M氯化钠高盐溶液和去离子水中反复浸泡，15个循环，脱除细胞，同时采用15kGy辐照进行病毒灭活处理。再将组织片置于85%的甘油中，在25℃中脱水，待用。
同时，取人角膜缘组织，在37℃预热的0.1%胰酶溶液中消化细胞1min，患者自体血清终止消化，800rpm离心收集细胞，计数，采用添加了10%的患者自体血清的透明质酸溶液与角膜缘细胞混合，配置细胞混悬液，细胞混悬液细胞终浓度为1×104个/mL。
所配置的细胞混悬液pH值为5.3，300nm至800nm的透光率为89%，溶液渗透压为300 mOsmol/L。随后将细胞混悬液涂抹于各组织片（即后弹力层组织片、基质层组织片和前弹力层组织片）上，25℃下静置30min，确保细胞完全贴附于支架材料（即后弹力层组织片、基质层组织片和前弹力层组织片）表面，在将各组织片以后弹力层组织片在下、基质层组织片居中和前弹力层组织片在上的顺序堆叠，同时在堆叠的各组织片层间滴加核黄素溶液，保持角膜组织（即后弹力层组织片、基质层组织片和前弹力层组织片）中的核黄素溶液达到15μg/g的浓度，350nm光波照射，进行光催化的交联反应，随后，采用纤维蛋白原浓缩液和凝血酶制备的生物蛋白胶滴加在各层间边缘处，固定各层。检测所制备的组织工程角膜，其光通过率在300nm～800nm范围内光通过率为80%，缝线撕裂力为4.3N。
实施例2、制备牛眼角膜支架复合细胞的组织工程角膜。
采集牛眼角膜，置于添加了青霉素的无菌去离子水中浸泡24h，牛角膜厚度由于吸水溶胀至初始厚度的5倍，同时上皮细胞层脱落。再将上述角膜采用飞秒激光分层，将其分为前弹力层组织片、基质层组织片和后弹力层组织片，其厚度占总厚度的比例为10%、80%和10%。在将上述组织置于1M氢氧化钠溶液中浸泡1h，去离子水清洗清洗，去除氢氧化钠残留，脱除细胞结构，控制材料的免疫原性，采用1%次氯酸钠病毒灭活处理，25kGy辐照灭菌，最后置于，95%甘油中30℃保存脱水待用。
同时，取人角膜缘组织，在25℃预热的0.25%胰酶溶液中消化细胞1min，患者自体血清终止消化，1200rpm离心收集细胞，计数，采用添加了30%的患者自体血清的胶原溶液与角膜缘细胞混合，配置细胞混悬液，细胞混悬液细胞终浓度为2×105个/mL。
所配置的细胞混悬液pH值为5.1，300nm至800nm的透光率为82%，溶液渗透压为350 mOsmol/L。随后将细胞混悬液涂抹于各组织片（即后弹力层组织片、基质层组织片和前弹力层组织片）上，37℃下静置1小时，确保细胞完全贴附于支架材料（即后弹力层组织片、基质层组织片和前弹力层组织片）表面，在将各组织片以后弹力层组织片在下、基质层组织片居中和前弹力层组织片在上的顺序堆叠，同时在堆叠的各组织片层间滴加核黄素溶液，保持角膜组织（即后弹力层组织片、基质层组织片和前弹力层组织片）中的核黄素溶液达到50μg/g的浓度，390nm光波照射，进行光催化的交联反应，随后，采用纤维蛋白原浓缩液和凝血酶制备的生物蛋白胶滴加在各层间边缘处，固定各层。检测所制备的组织工程角膜，其光通过率在300nm～800nm范围内光通过率为60%，缝线撕裂力为4.9N。
Claims (10)
1.一种组织工程角膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，
步骤一、动物源性角膜的选取和前处理：
选取包含有前弹力层的动物源性角膜，将其置于添加抗生素的、温度在2～30℃的去离子水中浸泡8～24h，待所述动物源性角膜厚度溶胀到2～5倍厚度后，该动物源性角膜的上皮细胞层会由于后弹力层胀起而脱落，同时抗生素的使用，可以有效去除该动物源性角膜组织的细菌，获得无菌的、去除了上皮细胞层的动物源性角膜组织材料；
步骤二、角膜各层的分离：
将步骤一制备所得的动物源性角膜组织材料置于角膜切削设备中，切削获得前弹力层组织片、基质层组织片和后弹力层组织片，实现角膜各层的分离；
步骤三、将步骤二制备所获得的前弹力层组织片、基质层组织片和后弹力层组织片去抗原、病毒灭活处理后，采用质量百分比浓度为60%～95%的甘油对去抗原、病毒灭活处理后的前弹力层组织片、基质层组织片和后弹力层组织片进行脱水处理，然后在2～30℃的温度条件下，使前弹力层组织片、基质层组织片和后弹力层组织片恢复至溶胀前的生理状态，同时置于所述甘油中保持待用；
步骤四、制备细胞混悬液：
将人角膜缘组织置于25～37℃预热的胰酶溶液中消化细胞，胰酶浓度为0.1%～0.25%，消化时间为1～10min，后采用人血清终止消化，800～1200rpm离心收集细胞，随后采用溶液A将收集的细胞制备成细胞混悬液，待用。
2.所述溶液A是体积百分数为10%～30%的人血清、胶原溶液和透明质酸溶液中的任一种或两种的混合或三种的混合溶液；
所述细胞混悬液的细胞浓度为1×104至2×105个细胞每毫升；
步骤五、组织工程角膜的构建：
将步骤四制备的细胞混悬液涂布于步骤三制备的前弹力层组织片、基质层组织片和后弹力层组织片上，在25～37℃下静置至少30min后，让细胞有效附着于弹力层组织片、基质层组织片和后弹力层组织片的表面；
再将表面上附着了细胞的前弹力层组织片、基质层组织片和后弹力层组织片，以后弹力层组织片在下、基质层组织片居中和前弹力层组织片在上的顺序堆叠，同时对其进行交联和加固以固定各层，制得所述组织工程角膜。
3.如权利要求1所述的组织工程角膜的制备方法，其特征在于：所述抗生素为青霉素类、头孢菌素类、链霉素、庆大霉素、红霉素和白霉素的一种或两种或多种混合。
4.如权利要求1所述的组织工程角膜的制备方法，其特征在于：所述前弹力层组织片和后弹力层组织片的切削厚度为所述动物源性角膜组织材料的厚度的5%～10%。
5.如权利要求1所述的组织工程角膜的制备方法，其特征在于：所述去抗原后的前弹力层组织片、基质层组织片和后弹力层组织片的DNA残留量在1～100mg/ml之间，其脂性物质含量应在1%以下。
6.如权利要求1所述的组织工程角膜的制备方法，其特征在于：所述细胞混悬液的pH值在5～9之间，细胞混悬液300nm至800nm的透光率在80%以上，细胞混悬液的渗透压在200～380 mOsmol/L之间。
7.如权利要求1所述的组织工程角膜的制备方法，其特征在于：所述人血清是接收角膜移植或修复的患者自身制备的血清或正常健康的人通过采血而制备的，并进行补体灭活操作后的人血清。
8.如权利要求1所述的组织工程角膜的制备方法，其特征在于：所述交联是指采用核黄素光催化的交联操作，在后弹力层组织片与基质层组织片之间、基质层组织片和前弹力层组织片之间滴加核黄素溶液，并充分去除层间气泡，使后弹力层组织片、基质层组织片和前弹力层组织片中的核黄素溶液达到15～50μg/g的浓度，再通过波长在350～390nm范围内的光照射，进行光催化的交联。
9.如权利要求1所述的组织工程角膜的制备方法，其特征在于：所述加固是采用生物蛋白胶在所构建的后弹力层组织片与基质层组织片的层间边缘处、基质层组织片和前弹力层组织片的层间边缘处进行黏连，所述的生物蛋白胶是纤维蛋白原浓缩液和凝血酶的混合液。
10.如权利要求1所述的组织工程角膜的制备方法，其特征在于：所述动物源性角膜为猿、猴子、猩猩、猪、牛和鸡的角膜中的任一种。
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Address after: Taiwan high tech park of Songshan Lake high tech Industrial Development Zone of Dongguan City, Guangdong province 523808 Taoyuan Road No. 1, Dongguan Taiwan Biological Technology Cooperation Center 1 Building 1 room 05 Patentee after: GUANGDONG BO YU REGENERATIVE MEDICINE CO.,LTD. Address before: Taiwan high tech park of Songshan Lake high tech Industrial Development Zone of Dongguan City, Guangdong province 523808 Taoyuan Road No. 1, Dongguan Taiwan Biological Technology Cooperation Center 1 Building 1 room 05 Patentee before: Dongguan Bo and Regenerative Medicine Co.,Ltd. |
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| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20171208 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |