CN103908700B - 一种脱细胞角膜的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种脱细胞角膜的制备方法，本发明采用脱角膜上皮层、紫外交联、病毒灭活、脱细胞处理、梯度脱水、辐照保护和灭菌的步骤。所制备的脱细胞角膜抗原去除彻底，不会激起宿主获得性免疫反应，生物相容性好，对天然角膜基质的损伤小，保留了天然角膜的结构特性，也保留了天然角膜的有效成分，因此有着与天然角膜相似的物理化学特性；所制备的脱细胞角膜移植后，经动物实验显示，移植角膜透明、无瘢痕形成，不发生融解、无新生血管；移植后1个月即与植床完全融合，3个月角膜已经完全上皮化，并有角膜基质细胞向脱细胞角膜植片迁移，证明组织正在发生缓慢的改建，6个月后移植的角膜与天然角膜在组织学和外观检测中无明显差异。
Description
技术领域
本发明属于组织工程学生物医用材料技术领域，具体涉及一种脱细胞角膜的制备方法。
背景技术
角膜是维持人体正常视力最重要的组织之一。角膜会由于发生圆锥角膜、大泡性角膜、真菌感染、外伤瘢痕等疾病造成视力下降或失明，现今角膜盲已成为全球第二大致盲性疾病。目前治疗角膜盲最为有效的方式是异体角膜移植，然而异体角膜来源的缺乏造成大量患者得不到及时治疗而最终失明。据统计全球有超过1000万的人口遭受角膜盲疾病，然而仅有不到12万的患者能够接受异体角膜的移植治疗。
为解决临床角膜供体不足的问题，人们试图用高分子合成材料或天然衍生材料构建人工角膜。高分子合成材料通常包括聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）等，由于这类材料生物相容性差，不能实现与宿主植床的融合，不是理想的人工角膜材料。如最具代表性的波士顿人工角膜，该角膜只能应用于异体角膜移植反复失败、高危植床等有限的适应症上，由于该角膜产品属于一种特殊屈光装置，不具生物活性，在移植后的外观和受体的舒适感与自然角膜差异很大。理想的人工角膜应有好的生物相容性、透明度、低免疫原性。天然衍生材料由于具有良好的生物相容性，被广泛用于人工角膜的制备，如胶原、胶原与糖胺聚糖混合体、胶原与壳聚糖混合体等。天然衍生材料制备的人工角膜最具代表性的是AlphaCorTM，该角膜是由经过交联的胶原制备而成，与人天然角膜有类似的外形和机械性能，该角膜产品已应用于临床。经长期观察发现，AlphaCorTM在移植后会出现缓慢的角膜基质降解，并出现难以上皮化的现象，主要原因是其无法模拟天然角膜的超微结构。天然角膜从外至内是由上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层、内皮细胞层组成，其中基质层是由有序的胶原束与蛋白聚糖排列组成的透明组织，胶原束直径为22～32nm，间距约30nm，该空间距离是由胶原与蛋白聚糖分子中的氢键所维持，这种结构能阻止散光发生，并为角膜提供特殊生物力学性能以抵御眼内压力。迄今为止，还无法利用生物材料在体外模拟角膜如此精密复杂的结构。
随着脱细胞技术的快速发展，通过对天然组织的处理，去除天然组织中的细胞及其他抗原成分，并保留天然组织中细胞外基质成分以及空间结构。脱细胞技术已广泛应用于血管、皮肤、心脏瓣膜、神经等组织，脱细胞的天然组织也被用于组织损伤修复。目前已有脱细胞天然组织广泛应用于临床，并取得了良好的组织修复效果。
天然猪角膜与人角膜有着高度相似的组织生理结构，因此猪角膜已被研究作为原料制备脱细胞角膜，并作为异体角膜替代物用于角膜板层移植。最初脱细胞的方式是采用TritonX100联合胰酶进行处理，该方法虽然能够完全去除组织中的细胞，但对天然角膜的胶原微结构和糖胺聚糖成分破坏严重，致使处理后的角膜丧失了天然角膜大部分的组织特性，移植后与组织融合效果较差，无法达到治疗目的。为了避免角膜基质结构的严重破坏，又有仅采用去污剂（例如TritonX100、十二烷基磺酸钠、脱氧胆酸钠等）进行脱细胞处理，但十二烷基磺酸钠等离子型去垢剂仍对组织有很大程度破坏，且去垢剂的残留难以洗脱，容易造成脱细胞角膜的细胞毒性。此外有采用特异性破坏细胞膜的磷脂酶代替广谱性酶进行脱细胞处理，仍难以达到完全去除细胞抗原的目的，移植后会诱发较强的免疫宿主反应；因此采用与去垢剂（例如脱氧胆酸钠）联合使用，仍无法避免对天然角膜基质的影响，且磷脂酶非常昂贵，难以实现脱细胞角膜的产品化。日本学者采用低温高压法对猪角膜进行处理，达到了脱细胞效果，但是高压法对设备要求非常严苛，且高压条件下角膜的胶原也会产生变性，影响脱细胞角膜的治疗效果。
为避免化学去垢剂与生物酶对脱细胞角膜微结构的损害，有学者采用交联方法加强角膜结构，传统的交联剂（如戊二醛、EDC等）会使角膜基质整体结构全部交联，导致角膜基质失去天然角膜的弹性和韧性，更严重的是导致角膜基质的生物相容性下降，移植后不与植床融合，最终被宿主排斥。
因此要保留天然角膜的透明性与机械性能达到更好的角膜修复效果，需要摆脱现有的角膜脱细胞技术，建立全新的角膜脱细胞工艺。
发明内容
针对现有技术的存在问题，本发明的目的是提供一种脱细胞角膜的制备方法，所制备的脱细胞角膜具有天然角膜的基质层和前弹力层，保留了天然角膜的物理化学性能，生物相容性好、透明度好，可替代异体角膜进行板层角膜修复。
本发明提出的脱细胞角膜制备方法，包括脱角膜上皮层、紫外交联、病毒灭活、脱细胞处理、梯度脱水、辐照保护与灭菌的步骤，具体如下：
步骤一、脱角膜上皮层：将哺乳动物角膜置入0.05～0.2M的乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中，浸泡12h，再用去离子水以振荡法溶胀角膜，使角膜达到0.2～1.5cm厚度，然后搓去角膜上皮细胞层，暴露出角膜前弹力层; 所述哺乳动物角膜的结构完整、无损伤，保留有0.1～0.5 cm宽的巩膜；
所处理的角膜需保留一定宽度的巩膜，为后续步骤中多次采用振荡处理，需借助巩膜保护角膜结构，防止角膜基质断裂。组织学结果显示含巩膜的角膜在脱细胞处理后角膜基质排列有序，而不含巩膜的则基质结构散乱。
角膜上皮层与角膜基质结合紧密，金属离子在角膜上皮层与基质层的连接中发挥重要作用，本步骤采用EDTA金属螯合剂处理角膜，减弱角膜上皮层与基质层的贴附强度，结合角膜溶胀，使角膜上皮层能轻易去除。
步骤二、紫外交联：采用370nm波长的紫外光，照射步骤一得到的角膜的前弹力层面20～60分钟，完成交联处理;
角膜前弹力层在角膜损伤后的上皮再生中发挥着关键作用，为了避免振荡洗涤等处理对角膜前弹力层的结构造成损坏，影响角膜上皮化，并平衡脱细胞工艺强度，所以采用紫外交联的方法强化角膜前弹力层的稳定性。
步骤三、病毒灭活：用刀具在角膜的后弹力层面划2～10根划痕，划痕深度＜1mm; 将角膜放入浓度为5～80mg/ml的海藻糖溶液中浸泡0.5～3h，转入海藻糖浓度为5～80mg/ml、乙醇浓度为70ml/100ml的混合溶液中浸泡2h，再转入浓度为2～10mg/ml的海藻糖溶液中振荡清洗，直至无乙醇残留，最后用生理盐水洗净角膜基质中的海藻糖残留;
角膜后弹力层与前弹力层结构致密，要彻底去除细胞需要长时间接触脱细胞处理液，但同时会对角膜基质造成损伤。由于最终制备的脱细胞角膜不含角膜后弹力层，因此本步骤利用后弹力层保护角膜基质不受到机械损伤，对后弹力层进行划痕破损，使脱细胞处理液更容易渗入角膜基质。
70ml/100ml的乙醇溶液能够去除动物角膜中的病毒成分，但会使角膜脱水，导致蛋白间的氢键相互连接、发生变性，影响脱细胞角膜与受体植床的融合性；而海藻糖富含醛基，能够替代水分子与蛋白质形成氢键，从而避免蛋白质由于脱水而发生变性。因此采用海藻糖对角膜基质蛋白进行保护。
步骤四、脱细胞处理：将步骤三得到的角膜置入1～5M的NaCl溶液中振荡处理0.25～4h，再转入去离子水中振荡清洗0.25～4h；然后转入20～60mM的NaOH溶液中振荡处理0.25～4h，最后用去离子水冲洗，直至洗出液pH达到4～8;
所采用高、低渗溶液处理角膜，使角膜基质细胞在强烈的脱水、溶胀过程中破裂，再利用NaOH溶液除去破碎细胞的残留成分。
步骤五、梯度脱水：将步骤四得到的脱细胞角膜置入0.05～0.2M的MgCl2水溶液中浸泡10～60分钟; 采用在50ml/100ml～90ml/100ml范围内浓度梯度的甘油，从低浓度到高浓度对角膜进行2～3次的脱水处理，使脱细胞角膜厚度回复到天然角膜的厚度;
由于步骤四中使用大量去离子水和盐水冲洗角膜，会使角膜中的金属离子丢失，导致角膜基质蛋白发生一定程度的变性，主要表现为角膜外观变为瓷白色，影响角膜的透明度。发明人通过实验发现，采用适当浓度的MgCl2溶液对脱细胞角膜处理，可以恢复变性角膜基质蛋白的活性，角膜外观由瓷白色转变为正常色泽，恢复透明度。
天然角膜内皮细胞对维持角膜的含水率具有重要的调控作用，经过脱细胞处理的角膜由于不含细胞，因此在溶液中发生溶胀，从而影响脱细胞角膜的厚度和透明度。本步骤采用角膜保存剂（甘油）对角膜进行脱水处理，采用梯度浓度的甘油可以减缓角膜基质的脱水速率，避免角膜快速脱水导致皱缩，对角膜基质造成损伤。
步骤六、辐照保护与灭菌：将步骤五得到的角膜放入5～30mg/ml浓度的甘露醇溶液中5～15分钟; 按照需要厚度，采用物理方法对角膜进行削切，去除后弹力层和部分基质层，保留前弹力层和部分基质层；真空包装后，采用15～25 kGy的钴60辐照灭菌。
经过甘油脱水处理的角膜中残留的甘油浓度太高，会造成角膜基质变粘、变硬，不利于快速平整削切，对临床应用的影响较大。本步骤采用甘露醇溶液对角膜进行复水，能使角膜物理性能回复，同时甘露醇是良好的辐射保护剂，可避免在辐照灭菌时角膜基质胶原发生断裂。通过实验检验甘露醇的保护效果，结果显示含甘露醇的脱细胞角膜在辐射后降解速度明显慢于不含甘露醇的脱细胞角膜（图3）。
可以看出，本发明制备的脱细胞角膜抗原去除彻底，不会激起宿主获得性免疫反应。由于是采用无机试剂进行脱细胞处理，不使用生物酶和去垢剂，生物相容性好，对天然角膜基质的损伤小，保留了天然角膜的结构特性，也保留了天然角膜的有效成分（胶原、糖胺聚糖等），因此有着与天然角膜相似的物理化学特性。所制备的角膜在板层移植后，能够快速上皮化，维持角膜的透明，并能与植床融合，不产生血管化、瘢痕化、融解等现象；可替代异体角膜进行板层角膜移植。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
①采用EDTA与适度溶胀相结合的方法去除角膜上皮细胞层，EDTA能够螯合角膜上皮细胞层与基质层连接的金属离子，使二者的贴附放松；角膜再经过适度溶胀，可以轻柔的物理搓揉方式完全去除上皮细胞层；既能完整地去除角膜上皮结构，又不会使角膜基质蛋白发生严重损伤变性，保证了角膜的透明性。发明人分别采用“胰酶法”、“SDS法”和“刮除法”对角膜进行去上皮化处理，与本发明方法比较结果显示，采用胰酶法和SDS法处理的角膜虽然去除了上皮层，但是角膜降解时间明显加快（图4）；而刮除法不仅没能完全去除上皮层，还对前弹力层基质结构造成了损伤；本发明方法处理的角膜不仅上皮层完全去除（图5），并且降解时间与天然角膜相近（图4）。
②由于哺乳动物源性的角膜存在病毒传播的危害，发明人通过对比不同病毒灭活试剂，发现乙醇对角膜基质的破坏相对较小。本发明采用海藻糖对角膜基质蛋白进行脱水保护，因为海藻糖富含醛基，能够替代水分子与蛋白质形成氢键，从而避免蛋白质由于脱水而发生变性。通过对海藻糖结合乙醇处理的角膜进行机械性能的测定，结果显示经海藻糖处理角膜的拉伸强度与天然角膜接近，但是仅用乙醇处理角膜的机械硬度变大，角膜弹性明显下降，证明天然角膜基质的活性已经发生了变化。病毒灭活验证结果显示，70%的乙醇可以灭活有包膜的DNA病毒和RNA病毒及无包膜的RNA病毒等三类病毒，再结合钴60处理即可把无包膜的DNA病毒完全灭活（产品病毒灭活的合格标准是能够去除这四类病毒）。
③角膜透明性的维持主要依赖高度有序的胶原纤维排列，传统的脱细胞方法（如去垢剂、胰酶）会使角膜基质中胶原纤维结构严重破坏，造成脱细胞角膜透明度的下降，并发生脱细胞角膜的快速溶解。本发明采用无机盐溶液的高、低渗处理方式是以物理溶胀方式来实现细胞的破裂，试剂本身对胶原结构不会造成任何破坏。在角膜细胞破裂后，虽然进行清洗，但角膜基质中仍存在细胞裂解物残留，此时采用低浓度碱溶液在不破坏角膜胶原蛋白结构的前提下，可以完全去除角膜基质中的蛋白质残留。实验证明，本发明方法能彻底去除角膜抗原，角膜基质损伤小（图6），而且无机试剂容易洗脱、残留少；细胞毒性与皮下组织学染色切片结果显示其生物相容性非常好（图7和图8）。动物有效性实验证明，本发明方法处理的脱细胞角膜，移植后角膜上皮化速度明显快于不交联的脱细胞角膜（图9）。
将本发明制备得到的脱细胞角膜用于兔角膜板层移植，动物实验有效性结果显示，脱细胞角膜移植后角膜透明、无瘢痕形成，不发生融解、无新生血管；移植后1个月，角膜即与植床完全融合，3个月的组织学结果显示，移植的角膜已经完全上皮化，并有角膜基质细胞向脱细胞角膜植片迁移，证明组织正在发生缓慢的改建，6月后移植的角膜与天然角膜在组织学和外观检测中无明显差异（图10）。
附图说明
附图1为去除巩膜的角膜和保留巩膜的角膜经脱细胞处理后的组织学切片对比照片；其中 A是去除巩膜的角膜经脱细胞处理后的组织学切片照片，可见胶原基质排列散乱，说明角膜基质受到损伤；B是保留巩膜的角膜经脱细胞后的组织学切片照片，可见胶原基质结构非常有序，说明在角膜脱细胞处理中，保留巩膜对角膜基质蛋白具有保护作用，避免胶原结构受到损伤。
附图2为未用MgCl2处理的脱细胞角膜与采用MgCl2处理的外观比较照片；A是未用MgCl2处理的脱细胞角膜外观照片，可见角膜色泽瓷白，完全丧失了天然角膜基质的折光性；B是经MgCl2处理的脱细胞角膜外观照片，可见保留了天然角膜的色泽；以上结果说明，适当的MgCl2处理可防止角膜基质蛋白变性，保持角膜天然的折光性。
附图3为用胶原酶检测含甘露醇的脱细胞角膜与不含甘露醇的降解率对比曲线；A线是含甘露醇脱细胞角膜的降解率，B线是不含甘露醇脱细胞角膜的降解率；横坐标是降解时间，单位是小时；纵坐标是脱细胞角膜的质量，单位是毫克。可以看出含甘露醇角膜的降解率显著慢于不含甘露醇的角膜，说明采用甘露醇处理脱细胞角膜在辐照灭菌时可以保护角膜，而未采用甘露醇保护的角膜，辐照后其结构会受到严重破坏。
附图4为采用胶原酶检测分别经胰酶处理、SDS处理、本发明方法处理的脱细胞角膜和未经处理新鲜角膜的降解率对比曲线；A线是经胰酶处理的脱细胞角膜的降解率；B线是经SDS处理的脱细胞角膜的降解率；C线是本发明方法处理的脱细胞角膜的降解率；D线是新鲜角膜的降解率；横坐标是降解时间，单位是小时；纵坐标是脱细胞角膜的质量，单位是毫克。可以看出，经胰酶处理的降解率最高，SDS的降解率次之，本发明方法与新鲜角膜的降解率相当；说明在上述三种脱细胞方法中，胰酶和SDS处理对角膜基质蛋白的破坏严重，而本发明方法的破坏最小。
附图5为采用刮除法去表皮处理后的角膜组织学切片照片，※标注的是角膜上皮结构，结果显示上皮层不能完全去除，可见仅采用物理刮除难以达到去角膜上皮的效果。
附图6为本发明方法处理脱细胞角膜的组织学切片照片，从图中可见角膜基质细胞已经完全去除，基质结构有序；说明本发明方法能够实现去除细胞抗原的目的，同时对角膜基质蛋白的破坏程度小。
附图7为采用浸提方法对本发明制备的脱细胞角膜进行细胞毒性检测结果图片；横坐标1是空白对照组，2是脱细胞角膜检测组；纵坐标是吸光值。从图中可见本发明制备的脱细胞角膜没有细胞毒性。
附图8是采用本发明制备的脱细胞角膜进行大鼠皮下包埋的组织学切片照片；A和B分别是包埋2周和4周后的照片，从图中可见脱细胞角膜在大鼠皮下激发的炎症反应非常微弱，证明本发明的脱细胞角膜免疫原性低。
附图9是经紫外交联的脱细胞角膜与未经紫外交联的在移植14天后采用荧光素钠检测角膜上皮化结果的对比照片；其中A是经紫外交联的角膜的检测结果照片；B是未经紫外交联的角膜的检测结果照片，箭头指向未上皮化部分。从图中可知，经紫外交联的脱细胞角膜上皮的再生速度明显快于未交联的，说明紫外交联对角膜的前弹力层具有保护作用。
附图10为采用本发明制备的脱细胞角膜进行兔板层角膜移植的有效性验证结果照片；A是术后1天的外观结果照片，B是术后1月的外观结果照片，C是术后3月的外观结果照片，D是术后6月的外观结果照片。可以看出，随着移植时间的延长，本发明角膜的融合性良好、植片透明，生物相容性好，可以实现板层角膜移植的目的。
具体实施方式
实施例1、制备脱细胞（猪）角膜
步骤一、脱角膜上皮层：将结构完整、无损伤、带有0.3 cm宽巩膜的猪角膜置入0.2M的EDTA溶液中，浸泡12h，再用去离子水采用振荡法溶胀角膜，使角膜达到1cm厚，然后搓去角膜上皮细胞层，暴露出角膜前弹力层;
步骤二、紫外交联：将步骤一得到的角膜，使其前弹力层面朝上放置，室温下采用370 nm波长的紫外光照射1h，完成交联处理;
步骤三、病毒灭活：用刀具在角膜的后弹力层表面划10根划痕，划痕深度＜1mm; 将角膜放入50mg/ml的海藻糖溶液中浸泡3h，转入含有海藻糖浓度为5mg/ml、乙醇浓度为70ml/100ml的混合溶液中浸泡2h，再转入浓度为5mg/ml的海藻糖溶液中振荡清洗，直至无乙醇残留，最后用生理盐水洗净角膜基质中的海藻糖残留;
步骤四、脱细胞处理：将步骤三得到的角膜置入3M的NaCl溶液中振荡处理1h，再转入去离子水中振荡清洗4h，然后转入60mM的NaOH 溶液中振荡处理2h，最后用去离子水冲洗，直至洗出液pH在4～8之间;
步骤五、梯度脱水：将步骤四得到的脱细胞角膜置入0.1M 的MgCl2水溶液中浸泡20分钟; 分别采用50ml/100ml、70ml/100ml、90ml/100ml浓度的甘油，按浓度梯度依次对角膜进行3次脱水处理，使脱细胞角膜厚度回复到天然角膜的厚度;
步骤六、辐照保护和灭菌：将步骤五得到的角膜放入5mg/ml浓度的甘露醇溶液中15分钟; 按照需厚度，采用角膜削切设备进行物理削切，去除后弹力层和部分基质层，保留前弹力层和部分基质层；真空包装后，采用25 kGy的钴60辐照灭菌。
由于不同来源的角膜原料本身存在差异，本实例以猪角膜为原料，相对于人角膜而言更厚更致密，因此要完全除去猪角膜的细胞抗原，选择处理试剂的浓度较高、处理时间较长，保证试剂充分渗透，完全除去细胞抗原。猪角膜的刚性差，弧度不明显，因此选择较长时间的紫外交联处理，增加脱细胞角膜的机械强度。将本实例制备的角膜应用于兔板层角膜移植，术后15天移植角膜实现上皮化，1月后角膜透明，3月后角膜与植床完全融合，6个月后移植角膜与天然角膜在组织学和外观检测中无明显差异（参见图10）。
实施例2、制备脱细胞（兔）角膜
步骤一、脱角膜上皮层：将结构完整、无损伤、并保留有1 mm宽巩膜的兔角膜置入0.1M的EDTA溶液中，浸泡12h；再用去离子水采用振荡法溶胀角膜，使角膜达到0.5cm厚，然后搓去角膜上皮细胞层，暴露出角膜前弹力层;
步骤二、紫外交联：将步骤一得到的角膜，使其前弹力层面朝上放置，室温下用370 nm波长的紫外光照射20分钟，完成交联处理;
步骤三、病毒灭活：用刀具在角膜的后弹力层表面划4根划痕，划痕深度＜1mm; 将角膜放入浓度为20mg/ml的海藻糖溶液中浸泡0.5h; 转入含有海藻糖浓度为5mg/ml、乙醇浓度为70ml/100ml的混合溶液中浸泡2h，再转入浓度为2mg/ml的海藻糖溶液中振荡清洗，直至无乙醇残留，最后用生理盐水洗净角膜基质中的海藻糖残留;
步骤四、脱细胞处理：将步骤三得到的角膜置入3M的NaCl溶液中振荡处理0.5h，再转入去离子水中振荡清洗0.5h；然后转入20mM的NaOH 溶液中振荡处理15分钟，最后用去离子水冲洗，直至洗出液pH在4～8之间;
步骤五、梯度脱水：将步骤四得到的脱细胞角膜置入0.05M的MgCl2水溶液中浸泡20分钟; 分别采用50ml/100ml、70ml/100ml浓度的甘油，按浓度梯度依次对角膜进行2次脱水处理，使脱细胞角膜厚度回复到天然角膜的厚度;
步骤六、辐射保护：将步骤五得到的角膜放入5mg/ml浓度的甘露醇溶液中5分钟; 按照需厚度，采用角膜削切设备进行物理削切，去除后弹力层和部分基质层，保留前弹力层和部分基质层；真空包装后，采用25 kGy的钴60辐照灭菌。
本实例采用兔角膜为原料，比猪角膜薄，致密程度也较小，因此选用浓度较低的处理试剂，处理时间较短，在保证完全去除抗原的前提下尽量减小对角膜基质蛋白的损伤。兔角膜的刚性较强，角膜弧度明显，因此进行紫外交联的时间较短，就能达到保护角膜前弹力层的目的。将本实例制备的角膜应用于猪板层角膜移植，移植角膜10天后完成上皮化，3个月后植片透明并且完全融合。说明所制备的角膜用于异体移植，生物相容性好，融合性良好，可以实现板层角膜移植的目的。
Claims (1)
1.一种脱细胞角膜的制备方法，包括脱角膜上皮层、紫外交联、病毒灭活、脱细胞处理、梯度脱水、辐照保护和灭菌的步骤，具体如下：
步骤一、脱角膜上皮层：将哺乳动物角膜置入0.05～0.2M的乙二胺四乙酸溶液中浸泡12h，再用去离子水以振荡法溶胀角膜，使角膜达到0.2～1.5cm厚度，然后搓去角膜上皮细胞层，暴露出角膜前弹力层; 所述哺乳动物角膜的结构完整、无损伤，保留有0.1～0.5 cm宽的巩膜；
步骤二、紫外交联：采用370 nm波长的紫外光，照射步骤一得到的角膜的前弹力层面20～60分钟，完成交联处理;
步骤三、病毒灭活：用刀具在角膜的后弹力层面划2～10根划痕，划痕深度＜1mm; 将角膜放入浓度为5～80mg/ml的海藻糖溶液中浸泡0.5～3h，转入含有5～80mg/ml浓度海藻糖和含70ml/100ml浓度乙醇的混合溶液中浸泡2h，再转入浓度为2～10mg/ml的海藻糖溶液中振荡清洗，直至无乙醇残留，最后用生理盐水洗净角膜基质中的海藻糖残留;
步骤四、脱细胞处理：将步骤三得到的角膜置入1～5M的NaCl溶液中振荡处理0.25～4h，再转入去离子水中振荡清洗0.25～4h；然后转入20～60mM的NaOH溶液中振荡处理0.25～4h，最后用去离子水冲洗，直至洗出液pH达到4～8;
步骤五、梯度脱水：将步骤四得到的脱细胞角膜置入0.05～0.2M的MgCl2水溶液中浸泡10～60分钟; 采用在50ml/100ml～90ml/100ml范围内浓度梯度的甘油，从低浓度到高浓度对角膜进行2～3次的脱水处理，使脱细胞角膜厚度回复到天然角膜厚度;
步骤六、辐照保护和灭菌：将步骤五得到的角膜放入5～30 mg/ml浓度的甘露醇溶液中5～15分钟; 按照需要厚度，采用物理方法对角膜进行削切，去除后弹力层和部分基质层，保留前弹力层和部分基质层；真空包装后，采用15～25 kGy的钴60辐照灭菌。
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