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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufbereitung von Corneagewebe für Anwendungen vornehmlich in der Transplantation sowie die Verwendung einer Lösung zur Dezellularisierung von Corneagewebe. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung transparentes Corneagewebe.
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Dezellularisierung von Gewebe dient der Vermeidung von Immunreaktionen, die auftreten können, wenn körperfremdes Gewebe vom Immunsystem detektiert wird. Um solche Reaktionen zu lindern oder zu vermeiden werden bei einer Dezellularisierung Zellmembranen, intrazelluläre Proteine, Zellkerne und andere Zellbestandteile möglichst vollständig aus dem Gewebe entfernt, um eine praktisch reine extrazelluläre Matrix zu erhalten. Im Gewebe verbleibende Zellen und Zellbestandteile wären insbesondere potente Ausgangspunkte für eine unerwünschte Immunreaktion, die in anderen Geweben z.B. zur Kalzifizierung des biologischen Implantatmaterials führen kann.
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Bei der Dezellularisierung von Corneagewebe sind darüber hinaus besondere Anforderungen gestellt. Da die Cornea im äußeren Bereich des Lichtdurchtritts des Augapfels angesiedelt ist und für das Sehen vom Licht durchschienen wird, ist es für den Empfänger des Implantats und für dessen Sehen essentiell, dass das Implantat nicht nur keine Immunreaktionen hervorruft, sondern auch gleichzeitig transparent und klar ist.
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Es ist bei der Dezellularisierung von Corneagewebe ferner wichtig, dass der Dezellularisierungsschritt so schonend durchgeführt wird, dass die Struktur in der extrazellulären Matrix möglichst unbeeinflusst bleibt, während andererseits möglichst alle darin enthaltenen Zellen und Zellbestandteile aus dem Gewebe entfernt werden. Dadurch kann der chemische und verändernde Eingriff in das Gewebe möglichst gering gehalten werden, während Immunreaktionen verhindert werden.
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Es ist daher wünschenswert Corneagewebe sehr schonend so zu dezellularisieren, dass die Gewebestruktur wenig verändert wird und Transparenz erhalten bleibt.
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Vor diesem Hintergrund wird ein Verfahren zur Aufbereitung von Corneagewebe vorgeschlagen mit dem es gelingt, transparentes Corneagewebe zur Verfügung zu stellen, das bestenfalls keine Immunreaktionen hervorruft.
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Insbesondere wird nach Bereitstellung des Corneagewebes ein Verfahren zur Aufbereitung von Corneagewebe vorgeschlagen umfassend die folgenden Schritte:
Dezellularisierung des Gewebes mittels eines gewebeschonenden Detergens in Gegenwart eines Polyalkohols.
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Xenogene Gewebe und unter bestimmten Umständen auch menschliches Spendergewebe müssen vor einer Implantation gründlich gereinigt und aufbereitet werden. Dabei wird das Gewebe möglichst so modifiziert, dass es vom Körper nicht als Fremdgewebe erkannt wird und eine möglichst lange Lebensdauer hat. Wie bereits angemerkt, ist es im Falle von Corneagewebe zudem notwendig, dass das Gewebe optische Transparenz aufweist, damit der Patient nach der Implantation hinreichend sehen kann. Ein solches Corneagewebe kann durch das hierin vorgeschlagene Verfahren zur Verfügung gestellt werden
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Als gewebeschonendes Detergens werden hierin Dezellularisierungsmittel verstanden, die die Aufgabe erfüllen Zellmembranen, intrazelluläre Proteine, Zellkerne und andere Zellbestandteile möglichst vollständig aus dem Gewebe zu entfernen, dabei allerdings die weitere Gewebestruktur nicht oder nur kaum verändern; sprich, dass die Struktur in der extrazellulären Matrix möglichst unbeeinflusst bleibt. Beispielsweise bleibt auch die Shrinkage Temperatur nahezu unverändert bei Dezellularisierung mit einem schonenden Dezellularisierungsmittel im Vergleich zu nativem Gewebe. Starke, bisweilen hoch konzentrierte Dezellularisierungsmittel wie z.B. Natriumdodecylsulfat (SDS) hingegen nehmen erheblichen Einfluss auf die extrazelluläre Struktur und verändern diese signifikant. Eine solche Veränderung ist gerade bei Cornea unerwünscht, denn - ohne an diese Theorie gebunden zu sein - wird von Erfinderseite angenommen, dass Trübungen des Corneagewebes, die ein Sehen durch das Gewebe unmöglich machen, durch Veränderungen in der Kollagenfibrillenstruktur hervorgerufen werden.
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Wie allerdings überraschenderweise gefunden wurde, ist es nicht ausreichend lediglich ein gewebeschonendes Detergens, wie hierin beschrieben, für die Dezellularisierung von Corneagewebe zu verwenden. Gewebe, die unter üblichen Bedingungen mit einem gewebeschonenden Dezellularisierungsmittel dezellularisiert werden, weisen starke Trübung auf. Es wurde erfindungsgemäß gefunden, dass die Dezellularisierung von Corneagewebe ferner in Gegenwart eines Polyalkohols durchgeführt werden muss, um transparentes Gewebe zu erhalten.
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Geeignete Polyalkohole sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend oder bestehend aus umfassend oder bestehend aus Glycerin, 1,2-Propandiol, 1,3-Propandiol, Polyethylenglykol, Polypropylenglykol, Ethylenglykol, 1,2-Butandiol, 1,3-Butandiol, 1,4-Butandiol, 2,3-Butandiol, 1,2,3-Butantriol, 1,2,4-Butantriol, 1,2-Pentandiol, 1,3-Pentandiol, 1,4-Pentandiol, 1,5-Pentandiol, 2,3-Pentandiol, 2,4-Pentandiol, 1,2,5-Pentantriol, 1,3,4-Pentantriol, 1,3,5-Pentantriol, 1,2,3,4-Butantetrol, bevorzugt meso-1,2,3,4-Butantetrol, und weitere Alditole mit einer linearen C5 bis C8 Kohlenstoffkette. Polyethylenglykole weisen bevorzugt ein mittleres Molekulargewicht zwischen 100 g/mol und 4000 g/mol, insbesondere 400 g/mol auf. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Polyalkohol ausgewählt aus der Gruppe umfassend oder bestehend aus umfassend oder bestehend aus Glycerin, Polyethylenglykol und Ethylenglykol. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist der Polyalkohol Glycerin.
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Die hierin vorgeschlagenen Polyalkohole werden bevorzugt als wässrige Lösungen eingebracht. Im Rahmen dieser Anmeldung bezieht sich die Angabe %v/v oder Vol.% auf einen Volumenprozentanteil. Wird bezüglich einer Lösung nichts anderes angegeben, so wird für die Lösungen hierin Wasser als Lösungsmittel verwendet. 100 ml Lösung mit 5 %v/v Glutaraldehyd enthält entsprechend 5 ml Glutaraldehyd. Die Angaben %w/v oder Gew.% beziehen sich im Rahmen dieser Anmeldung auf einen Gewichtsanteil. 100 ml Lösung mit 0,9 %w/v Natriumchlorid enthält entsprechend 0,9 g Natriumchlorid.
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In einer Ausführungsform des hierin vorgeschlagenen Verfahrens wird die Dezellularisierung in Gegenwart eines Polyalkohols, der in Form einer 10 bis 70 % Lösung, bevorzugt in einer 30 bis 50% Lösung vorliegt, durchgeführt. Ohne an diese Theorie gebunden zu sein, nehmen die Erfinder an, dass die Einbringung des Polyalkohols, bevorzugt in der oben angegebenen Konzentration, aufgrund des Unterschieds der Konzentration des Polyalkohols im Gewebe und in der umgebenen Lösung zu osmotischen Druck führt, der die Einbringung des Polyalkohols in das Corneagewebe nach sich zieht unter Abgabe von Wasser. Es wird ferner angenommen, dass sich dies günstig auf die Erhaltung der extrazellulären Matrix während der Dezellularisierung auswirkt. Im Gegensatz dazu wird angenommen, dass eine hohe Konzentration von Wasser im Corneagewebe während der Dezellularisierung zu einer Veränderung der Kollagenfibrillen führt und eine Trübung des Gewebes bewirkt.
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Erfindungsgemäß kann ein gewebeschonendes Detergens als Dezellularisierungsmittel durch den Einsatz von Lipopeptiden, insbesondere zyklischen und/oder amphiphilen Lipopeptiden bereitgestellt werden. Hier kommen insbesondere β-Hydroxy-Fettsäure- oder β-Amino-Fettsäure-haltige Peptide in Frage. Es hat sich gezeigt, dass die Lipopeptide wie hierin beschrieben hervorragende Ergebnisse bei der Dezellularisierung von Corneagewebe zeigen. Das Gewebe kann mit dieser Stoffklasse sehr schonend von Zellbestandteilen befreit werden. Die Struktur der extrazellulären Matrix bleibt bei der Verwendung eines Lipopeptids sehr gut erhalten. So zeigen beispielsweise Messungen der Shrinkage Temperatur, dass diese auch nach der Behandlung mit einem Lipopeptid im Bereich von nativem Gewebe bleibt.
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Besonders bevorzugt enthält das Detergens zur Dezellularisierung ein zyklisches Lipoheptapeptid, insbesondere Surfactin. In dieser bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung wird ein zyklisches Lipoheptapeptid, insbesondere Surfactin enthaltendes Detergens zur Dezellularisierung verwendet. Insbesondere enthält das Detergens ein zyklisches Lipoheptapeptid mit einer zyklischen Struktur wie nachfolgend wiedergegeben:
(CH3)2-CE-(CH2)n → CH-CH2-CO → L-Glu → L-Leu → D-Leu → L-Val → L-Asp → D-Leu → L-Leu → O
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Dabei kann für Anwendungen für die vorliegende Erfindung n=8-12 und Glu, Leu, Val, Asp sein, wobei Glu, Leu, Val, Asp für die Aminosäuren Glutaminsäure, Leucin, Valin und Asparaginsäure stehen.
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Ebenso vorteilhaft können Lipopeptide wie Daptomycin, Caspofungin, Arthrofactin, Echinocandine, Iturine, Syringomycine, Syringopeptide und/oder Polymyxine verwendet werden. Zweckmäßigerweise enthält das Detergens mindestens ein Lipopeptid ausgewählt aus der Liste: Surfactin, Daptomycin, Caspofungin, Arthrofactin oder der Gruppe der Echinocandine, Iturine, Syringomycine, Syringopeptide, Polymyxine.
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In einer weiteren Ausführungsform des hierin vorgeschlagenen Verfahrens wird die Dezellularisierung zusätzlich in Gegenwart eines zweiten Dezellularisierungsmittels, vorzugsweise von Desoxycholsäure, durchgeführt wird. Desoxycholsäure fungiert als zweites, gering konzentriertes Dezellularisierungsmittel und führt in Kombination mit dem hierin beschriebenen Detergens zur einer umfassenderen Dezellularisierung, wohingegen auch hier die Gewebestruktur aufgrund der Gegenwart eines Polyalkohols nicht so stark verändert wird, dass eine Trübung des Corneagewebes auftritt. Als besonders vorteilhaft konnte gefunden werden, dass die Verwendung eines zweiten Dezellularisierungsmittels führt in Kombination mit dem hierin beschriebenen Detergens auch zu einer Auflösung der Kernmembranen führt, wodurch der Zellaufschluss wesentlich besser gelingt. Alternativ zu Desoxycholsäure können z.B. auch Triton-X 100 oder Tween 20 verwendet werden. Bevorzugt wird das zweite Dezellularisierungsmittel in einer sehr geringen Konzentration hinzugegeben, vorzugsweise in einer Konzentration von 0.1 bis 1 Gew.%.
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In einer weiteren Ausführungsform umfasst das hierin vorgeschlagene Verfahren einen Schritt des Behandelns des dezellularisierten Gewebes mit mindestens einer α-Galactosidase in Gegenwart eines Polyalkohols. Vorzugsweise ist der Polyalkohol derselbe wie der des Dezellularisierungsschrittes.
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α-Galaktosidasen, auch α-D-Galactosidgalactohydrolase, E.C. 3.2.1.22, sind Enzyme, die in der Lage sind, die Hydrolyse von Galactosylresten der nichtreduzierenden Enden einer Vielzahl von Oligisacchariden und Polysacchariden, sowie von Galactolipiden und Glycoproteinen zu katalysieren.
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Die zusätzliche Verwendung einer α-Galactosidase hat den Vorteil, dass natürlich vorkommende xenogene Galaktose-α-1,3-galaktose-β-1,4-N-acetylglucosamin-Epitope (α-1,3-Galaktosylreste, α-Gal-Epitope) des Corneagewebes effektiv entfernt werden können. Die Entfernung der α-Gal-Epitope ist gewünscht, da diese zu starken Immunreaktionen unter Bildung von Antikörpern führen können. Die Konzentration von α-Gal-Epitopen auf der Oberfläche des Gewebes kann grundsätzlich durch Dezellularisierung verringert werden, allerdings eher unter harschen Dezellularisierungsbedingungen, die häufig auch zu einer Veränderung der extrazellulären Matrix führen.
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In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Corneagewebe mit einem Typ einer α-Galaktosidase behandelt. Es ist aber ebenfalls möglich eine Kombination von α-Galaktosidasen zu verwenden. Dies bedeutet, dass die in Kombination verwendeten α-Galaktosidasen eine unterschiedliche Struktur und/oder Herkunft aufweisen; das heißt dass die α-Galaktosidasen in einem unterschiedlichen Lebewesen produziert wurden und/oder eine unterschiedliche Struktur aufweisen. α-Galaktosidasen können je nach Herkunft in ihrer Aufgabe, strukturell und in Ihrer Wirkung signifikant divergieren. Dies ist stark damit verbunden, dass eine Vielzahl von Organismen α-Galaktosidasen produziert, wie zum Beispiel Archaeen, Bakterien, Pilze, Pflanzen oder Tiere. Eine mögliche Ursache für die Diversität von α-Galaktosidasen kann in der Aufgabe im jeweiligen Organismus liegen. Dabei kann zum Beispiel eine Gruppierung durch die pH-Abhängigkeit der Enzymaktivität gegeben sein.
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In einer weiteren Ausführungsform wird für das hierin vorgeschlagene Verfahren die Verwendung von alkalischen α-Galaktosidasen vorgeschlagen. Alkalische α-Galaktosidasen zeichnen sich dadurch aus, dass diese im alkalischen Medium (bisweilen auch im schwach Sauren) eine hohe oder ihre höchste enzymatische Aktivität aufweisen und dabei ferner eine hohe Substratspezifität aufweisen. Die Verwendung von alkalischen α-Galaktosidasen ist vorteilhaft, da es dadurch ermöglicht wird, parallel zu den alkalischen α-Galaktosidasen auch DNasen und RNasen effizient zu verwenden. DNasen und RNasen dienen der Entfernung von restlichen Ribonukleinsäuren aus dem Gewebe. Durch Kombination von α-Galaktosidasen mit DNasen und/oder RNasen kann somit ein noch verbesserter Schutz gegenüber Immunreaktionen und Kalzifizierung erreicht werden. Insbesondere sind α-Galaktosidasen bevorzugt, die im leicht alkalischen oder zumindest nicht stark sauren, insbesondere in einem pH-Bereich von 5.5 bis 8.0, weiter bevorzugt in einem pH-Bereich von 6.0 bis 7.8 und am meisten bevorzugt, die in einem pH-Bereich von 7.0 bis 7.6 die höchste spezifische Enzymaktivität zeigen, da in diesem pH-Bereich eine Kombination mit DNasen und RNasen in der Weise möglich ist, dass die verwendeten Enzyme effizient arbeiten können . Bevorzugte alkalische α-Galaktosidasen stammen von Arabidopsis thaliana, Cucumis melo, Cucumis sativus, Oryza sativa, beispielsweise der Japonica-Gruppe, Pisum sativum, Solanum Lycopersicum, Tetragonia tetragonioides und Zea mays.
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In einer bevorzugten Ausführungsform wird das hierin vorgeschlagene Verfahren in Gegenwart von mindestens einer α-Galaktosidase, die von Arabidopsis thaliana, Cucumis melo, Cucumis sativus, Oryza sativa, beispielsweise der Japonica-Gruppe, Pisum sativum, Solanum Lycopersicum, Tetragonia tetragonioides, Zea mays oder der grünen Kaffeebohne stammt. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform stammt die α-Galactosidase von der grünen Kaffeebohne oder von Cucumis melo.
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In einer weiteren Ausführungsform umfasst das hierin vorgeschlagenen Verfahrens einen Schritt des Behandelns des dezellularisierten Corneagewebes mit einer DNAse in Gegenwart eines Polyalkohols. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das hierin vorgeschlagene Verfahren einen Schritt des Behandelns des dezellularisierten Gewebes mit einer DNAse und einer α-Galaktosidase in Gegenwart eines Polyalkohols wie hierin beschrieben. Bevorzugt wird der Schritt des Behandelns des dezellularisierten Gewebes mit einer DNAse und/oder einer α-Galaktosidase in Gegenwart eines Polyalkohols in einer Pufferlösung, zweckmäßigerweise bei einem pH von 5,5 bis 8,0, durchgeführt. Dabei eignen sich Dulbecco's Phosphat gepufferte Salzlösung (DPBS) ohne Kalzium und Magnesium sowie Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS)- oder 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure (HEPES) als Puffer.
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Vorteilhafterweise wird das Corneagewebe vor und besonders bevorzugt nach der Dezellularisierung zumindest einmal, bevorzugt mehrmals, mit einem geeigneten Lösungsmittel, insbesondere einer Salzlösung und/oder einer Alkohollösung, gespült, wobei diese Spüllösungen einen hierin vorgeschlagenen Polyalkohol enthalten. Hierbei können diese Lösungen auch einen geeigneten Puffer enthalten wie DPBS. Insbesondere enthalten diese Lösungen Glycerin. Besonders vorteilhaft sind dabei physiologische Natriumchloridlösungen (entspricht einer 0,9 %w/v NaCl-Lösung. 100 ml Lösung mit 0,9 %w/v Natriumchlorid enthält entsprechend 0,9 g Natriumchlorid) enthaltend einen hierin vorgeschlagenen Polyalkohol.
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In einer bevorzugten Ausführungsform wird nach Bereitstellen von Corneagewebe ein Verfahren zur Aufbereitung von Corneagewebe vorgeschlagen umfassend die folgenden Schritte:
- • Dezellularisierung des Gewebes mittels eines gewebeschonenden Detergens in Gegenwart eines hierin vorgeschlagenen Polyalkohols, wobei die Dezellularisierung in Gegenwart von einem zweiten Dezellularisierungsmittel durchgeführt wird,
- • Behandeln des dezellularisierten Gewebes mit einer DNAse in Gegenwart eines Polyalkohols und
- • Behandeln des dezellularisierten Gewebes mit α-Galactosidase in Gegenwart eines Polyalkohols.
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Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung einer Lösung vorgeschlagen, die mindestens ein schonendes Dezellularisierungsmittel, bevorzugt ein zyklisches Lipopeptid, weiter bevorzugt ein Lipopeptid mit amphiphilen Eigenschaften, bestehend aus einer hydrophilen Grundstruktur und einer hydrophoben Seitenkette, und am meisten bevorzugt Surfactin, und einen Polyalkohol enthält, bevorzugt Glycerin, als Detergens zur Dezellularisierung von Corneagewebe.
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Die zuvor genannte Verwendung wird ferner vorgeschlagen mit einer Lösung die mindestens Surfactin, Daptomycin, Caspofungin, Arthrofactin, ein Echinocandin, ein Iturin, ein Syringomycin, ein Syringopeptid und/oder ein Polymyxin enthält sowie einen Polyalkohol wie hierin beschrieben.
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Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird Corneagewebe vorgeschlagen, das nach einem hierin beschriebenen Verfahren behandelt wurde und somit erhältlich ist.
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In einer besonderen Ausführungsform wird ferner transparentes dezellularisiertes Corneagewebe vorgeschlagen, das einen Polyalkohol enthält, insbesondere Glycerin. Des Weiteren wird transparentes, dezellularisiertes Corneagewebe, das einen Polyalkohol enthält, insbesondere Glycerin, und ferner das auf der Oberfläche frei oder annähernd frei von α-Gal-Epitopen und/oder DNA ist.
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Corneagewebe kann für die hierin vorgestellte Erfindung unterschiedlichen Ursprungs sein, sowohl menschlichen als auch tierischen Ursprungs. Im Falle von tierischem Gewebe kann die Cornea beispielsweise vom Schwein, Schaf, Ziege, Pferd, Krokodil, Känguru, Strauß, Affen, bevorzugt Primaten, Oktopus, Kaninchen und vom Rind stammen.
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Im Folgenden soll die Erfindung anhand von erfindungsgemäßen Ausführungsbeispielen und mittels Abbildungen näher erläutert und mit Proben, die nicht erfindungsgemäß behandelt wurden, verglichen werden.
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zeigt den Vergleich des DNA-Gehaltes von nativem Corneagewebe im Vergleich zu Corneagewebe, das einer hierin vorgestellten Gewebeaufarbeitung unterzogen wurde.
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Auf der Ordinate des Diagramms in ist der Rest-DNA-Gehalt des Corneagewebes in (µg/Cornea) nach Gewebeaufarbeitung aufgetragen. Verglichen werden die Proben des ursprünglichen DNA-Gehaltes vor der Gewebeaufarbeitung sowie nach der Gewebeaufarbeitung gemäß einem hierin vorgeschlagenen Verfahren. Der DNA-Gehalt bildet ein direktes Maß für die Entfernung zellulärer Bestandteile aus dem biologischen Gewebe. Wie aus ersehen werden kann, führt eine Gewebeaufarbeitung gemäß dem hierin vorgeschlagenen Verfahren, hier beispielhaft mit Surfactin, Desoxycholsäure und einer DNAse durchgeführt, zu einer Entfernung von DNA aus dem Corneagewebe.
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zeigt Corneagewebe (a), das durch ein erfindungsgemäßes Verfahren in Anwesenheit von einem hierin vorgeschlagenen Polyalkohol dezellularisiert wurde. Die Corneaproben weisen einen äußerst hohen Grad an Transparenz auf, der es ermöglicht Gedrucktes auf der Unterlage unter der Corneaprobe problemlos zu erkennen und zu lesen.
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zeigt Corneagewebe (b), das durch ein nicht erfindungsgemäßes Verfahren in Abwesenheit von einem hierin vorgeschlagenen Polyalkohol dezellularisiert wurde. Das Gewebe ist stark eingetrübt und so undurchsichtig, dass Gedrucktes auf der Unterlage unter der Corneaprobe nicht einmal schemenhaft erkannt werden kann.
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zeigt Belegung mit α-Gal-Epitopen von nativem, dezellularisiertem sowie dezellularisiertem und mit Galactosidase behandelten Gewebe. Dabei dient die Angabe von „Native“ für die Konzentration von α-Gal-Epitopen auf unbehandeltem Gewebe, während die Angabe von „M86 initial“ den Grenzwert für das Vorhandensein von keinen α-Gal-Epitopen darstellt. Somit wird ein Messsystem vorgegeben, dass durch die Absorptionswerte von minimaler/nicht vorhandener Menge α-Gal-Epitopen (M86 initial) und maximaler Menge von α-Gal-Epitopen (native) eingegrenzt wird. Es wird ersichtlich, dass durch die hierin vorgeschlagene Dezellularisierung nicht nur transparentes Gewebe hergestellt werden kann, sondern darüber hinaus eine signifikante Reduzierung beziehungsweise nahezu vollständige Entfernung von α-Gal-Epitopen erreicht werden kann, wodurch die Wahrscheinlichkeit für eine Immunreaktion auf transplantierte Cornea minimiert wird.
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Beispiel 1
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Lentikel (also Stücke von Corneagewebe) werden in Zellkulturmedium zum Beispiel enthaltend oder bestehend aus DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) oder ähnlich wirkenden Lösungen gelagert.
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Anschließend wird das Zellkulturmedium abgezogen und die Lentikel werden 3 x mit 5 ml phys. NaCl Lösung mit 40 Gew.% Glycerin bei Raumtemperatur und unter leichter Bewegung gespült.
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Im Anschluss werden die Proben durch Behandeln mit folgender Lösung ca. 20 h bei 37 °C lang dezellularisiert: 0.06 Gew.% Surfactin, 0.5 Gew.% Natriumdesoxycholat und 40 Gew.% Glycerin in phys. NaCl.
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Die Proben werden 5 x mit 5 ml NaCl plus 40 Gew.% Glycerin bei Raumtemperatur und unter leichter Bewegung gespült und anschießend im Kühlschrank gelagert.
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Beispiel 2
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In einer Weiterführung der vorliegenden Erfindung werden Proben des Beispiels 1 in einem weiteren Behandlungsschritt enzymatisch weiter gereinigt. Dazu werden die Lentikel für 16 h bei 37 °C mit 40 U/ml DNAse I sowie 0.1 U/ml Green Coffee Bean (GCB) α-Galactosidase in 50 mM HEPES (pH 6.0), 2 mM CaCl, 5 mM MgCl mit 40 Gew.% Glycerin behandelt.
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Die Proben werden anschließend 5 Mal mit 5 ml NaCl mit 40 Gew.% Glycerin je 5 min bei Raumtemperatur und unter leichter Bewegung gespült.
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Für die Bestimmung des DNA-Gehalts auf den Proben, werden diese enzymatisch mit 15 U Proteinase K in DPBS behandelt und schließlich vermessen.
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Für die Bestimmung der verbliebenen α-Gal-Epitope auf der Oberfläche der Proben wurden diese mit Hilfe eines M86 Antikörper basierten Immuno-Assay bestimmt.
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Vergleichsbeispiel
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Lentikel werden in einem Zellkulturmedium gelagert. Die Proben werden aufgeteilt. Einzelne Proben werden zu analytischen Zwecken mit 15 U/ml Proteinase K in DPBS behandelt und anschließend einer DNA-Bestimmung unterzogen.
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Anschließend wird bei weiteren Proben die Aufbewahrungslösung abgezogen und die Proben werden 3x mit 5 ml phys. NaCl Lsg. gespült. Im Anschluss daran werden die Proben mit 5 ml 0.06 Gew.% Surfactin und 0.5 Gew.% Desoxycholsäure ca. 20 h dezellularisiert. Das Vergleichsbeispiel wurde demnach in Abwesenheit eines Polyalkohols, wie hierin beschrieben, durchgeführt.
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Für die weitere Analytik werden die Proben mit 15 U/ml Proteinase K in PBS behandelt, mit 5 x 8 ml NaCl gespült und ferner für 16 h mit 40 U/ ml DNAse I behandelt.
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Der DNS-Gehalt in den unbehandelten Lentikeln wurde mit 2.42 +/- 0.38 µg/Cornea bestimmt. Behandelte Lentikel dagegen enthielten keine messbare DNS mehr.
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Die hier geschilderten Ausführungsbeispiele dienen der Verdeutlichung der Erfindung. Zahl und/oder Ausgestaltung der Spülschritte (insbesondere Konzentrationen und Zusammensetzung der Lösung zum Spülen oder der Pufferlösung) können vom Fachmann im Rahmen seiner Kenntnisse variiert werden.
