DE60014966T2

DE60014966T2 - Behandlung zur vermeidung von kalzifizierung für fixierte biomaterialien

Info

Publication number: DE60014966T2
Application number: DE60014966T
Authority: DE
Inventors: P. Chandrashenkhar PATHAK; A. Mark MOORE; E. Richard PHILLIPS
Original assignee: Carbomedics Inc
Current assignee: Carbomedics Inc
Priority date: 1999-12-13
Filing date: 2000-12-13
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2020-12-14
Also published as: EP1239896A1; CA2393438C; WO2001041828A1; DE60014966D1; US6479079B1; ES2228647T3; WO2001041828B1; EP1239896B1; CA2393438A1; JP2003516191A

Description

Stand der Technik
Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf das Gebiet medizinischer Vorrichtungen zur Implantation bei Menschen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zum Verarbeiten biologischer Materialien zur Verwendung als bioprothetische implantierbare Vorrichtungen.
Bioprothesen sind Vorrichtungen, die aus verarbeiteten biologischen Geweben gewonnen werden, die zur Implantation bei Menschen verwendet werden sollen. Die Entwicklung derartiger Vorrichtungen entstand als Versuch, einige der klinischen Komplikationen, die mit der frühen Entwicklung der mechanischen Herzklappe verbunden waren, zu umgehen, und führt seither zu einer raschen Ausbreitung bioprothetischer Vorrichtungen für eine Vielzahl von Anwendungen. Beispiele mancher der Bioprothesen, die derzeit verwendet oder entwickelt werden, umfassen Herzklappen, Gefäßtransplantatate, biohybride Gefäßtransplantate, Sehnenersätze, Perikard-Patches und andere.
Die Hauptkomponente der biologischen Gewebe, die zum Herstellen von Bioprothesen verwendet werden, ist Kollagen, ein generischer Begriff für eine Familie verwandter extrazellulärer Proteine. Kollagenmoleküle bestehen aus drei Ketten von Poly(aminosäuren), die in einer dreisträngigen Konfiguration angeordnet sind, die in nichthelikalen Carboxyl- und Aminoendungen endet. Diese Kollagenmoleküle vereinigen sich, um Mikrofibrillen zu bilden, die sich wiederum zu Fibrillen vereinigen, was zu Kollagenfasern führt. Die Aminosäuren, die die Kollagenmoleküle bilden, enthalten zusätzlich zu den Amidbindungen der Polymerhauptkette Seitengruppen, einschließlich Amin(NH₂)-, Carbonsäure(COOH)- und Hydroxyl(OH)-Gruppen, die allesamt Stellen für eine potenzielle chemische Reaktion an diesen Molekülen darstellen.
Da sich Kollagengewebe auf eine Implantation in einen Empfänger hin rasch zersetzen, ist es notwendig, das Gewebe zu stabilisieren, wenn es für klinische Anwendungen eingesetzt werden soll. Eine chemische Stabilisierung durch eine Gewebevernetzung, auch als Gewebefixierung bekannt, wurde bereits unter Verwendung einer Vielzahl von Verbindungen erzielt. Am üblichsten ist es, dass eine chemische Fixierung polyfunktionelle Moleküle verwendet, die zwei oder mehr reaktive Gruppen aufweisen, die in der Lage sind, irreversible und stabile intramolekulare und intermolekulare chemische Bindungen mit den reaktiven Aminosäure-Seitengruppen zu bilden, die an den Kollagenmolekülen vorliegen. Das am häufigsten verwendete dieser polyfunktionellen Moleküle ist das C₅-Molekül Glutaraldehyd, der an jedem Ende einer linearen aliphatischen Kette einen Aldehyd aufweist. Die Aldehydgruppen von Glutaraldehyd und anderen, ähnlichen Molekülen reagieren unter physiologischen Bedingungen mit den primären Amingruppen von Kollagenmolekülen, um das Material zu vernetzen. Ein auf diese Weise erzeugtes, mit Glutaraldehyd vernetztes Gewebe weist eine erhöhte Beständigkeit gegenüber einer enzymatischen Zersetzung, eine verringerte Immunisierungsstärke und eine erhöhte Stabilität auf.
Trotz seiner weit verbreiteten Nutzung weist das Vernetzen von Gewebe mit polyfunktionellen Aldehyden und anderen chemischen Vernetzungsmitteln gewisse Nachteile auf. Beispielsweise ist ein mit Aldehyd fixiertes Gewebe nach einer Implantation anfällig für die Entstehung degenerativer Kalkablagerungen. Eine pathologische Verkalkung, z.B. die unerwünschte Ablagerung von Kalziumphosphat-Mineralsalzen in einem implantierten Gewebe, kann die überwiegende Ursache des Versagens von mit Glutaraldehyd fixierten bioprothetischen Vorrichtungen darstellen (Golomb et al., 1987; Levy et al., 1986; Thubrikar et al., 1983; Girardot et al., 1995). Der Mechanismus einer pathologischen Verkalkung ei nes implantierten Gewebes ist nicht vollständig erforscht, kann jedoch auf Faktoren, die auf den Empfänger bezogen sind, Faktoren, die auf das Implantat bezogen sind, und/oder auf äußere Faktoren wie z.B. mechanische Beanspruchungen, zurückzuführen sein. Überdies liegen Hinweise darauf vor, dass Kalziumablagerungen mit devitalisierten Zellen in Verbindung stehen können, und insbesondere mit Zellmembranen, bei denen die Kalziumpumpen (Ca+2–Mg+2 ATPase), die dafür verantwortlich sind, die niedrigen intrazellulären Kalziumpegel aufrechtzuerhalten, gar nicht mehr funktionieren oder eine Fehlfunktion aufweisen.
Eine Reinigungsmittel-Vorbehandlung mit nichtkovalent verbundenen Reinigungsmitteln, z.B. Natriumdodecylsulfat (SDS), oder kovalent gebundenen Reinigungsmitteln, z.B. Aminooleinsäure, sollen Berichten zufolge die Verkalkung von Materialien, die zirkulierendem Blut ausgesetzt sind, verringern (Gott et al., 1992). Jedoch können sich Reinigungsmittel auch negativ auf die Gewebestruktur bzw. -eigenschaften auswirken, was zu einer Abnahme der Kollagendenaturierungstemperatur bzw. Schrumpftemperatur führt, die ein wichtiges Maß der Festigkeit, Haltbarkeit und Integrität eines Materials ist. Überdies kann die Verwendung von Reinigungsmitteln zu einer lokalen Toxizität führen.
Bei einem weiteren Lösungsansatz beschreibt die US-Patentschrift Nr. 5,746,775 die Behandlung eines mit Glutaraldehyd vorbehandelten Gewebes mit niederen Alkoholen (d.h. C₁-C₃-Alkoholen), wobei der niedere Alkohol in einer Menge von mehr als 50 Volumenprozent in einer Alkoholbehandlungslösung vorliegt. Es wird berichtet, dass das Verfahren beim Präparieren eines Gewebes zur Implantation in ein Lebewesen nützlich ist.
Trotz früherer Versuche, Biomaterialien bereitzustellen, die eine Beständigkeit gegenüber Verkalkung aufweisen, besteht weiterhin ein Bedarf an alternativen Lösungsansätzen von Verkalkungsgegenmaßnahmen mit einer verbesserten Wirk samkeit und Nutzungsfreundlichkeit. Somit besteht ein Bedarf an einem effektiven Verfahren, um bioprothetischen Materialien, z.B. Geweben, langfristige Antiverkalkungseigenschaften zu verleihen, das keine schädlichen Begleiterscheinungen aufweist und das Antiverkalkungsmittel bzw. -behandlungen in existierende Protokolle für die Herstellung von Biomaterialien einer klinischen Qualität beinhaltet. Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, die Auswirkungen eines oder mehrerer der oben dargelegten Probleme zu überwinden oder zumindest abzumildern.
Offenbarung der Erfindung
Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Behandeln eines Biomaterials vorgesehen, das ein Inberührungbringen eines Biomaterials, z.B. eines vernetzten Tiergewebes, mit einer Antikalkbehandlungslösung umfasst. Die Antikalkbehandlungslösungen dieses Aspekts der Erfindung umfassen Lösungen, die aus höheren Alkoholen oder Polyolen und polaren aprotischen organischen Lösungsmitteln bestehen. Die Antikalkbehandlungslösungen werden unter Bedingungen, die wirksam sind, um eine pathologische Verkalkung des Biomaterials im Anschluss an eine Implantation in ein Empfänger-Säugetier zu verringern, mit dem Biomaterial in Berührung gebracht. Wie hierin veranschaulicht ist, kann diese Verringerung der Verkalkung beispielsweise dadurch überwacht werden, dass der Kalziumgehalt eines mit einer Antikalkbehandlungslösung der Erfindung behandelten implantierten Biomaterials im Vergleich zu einem nicht derart behandelten implantierten Biomaterial ausgewertet wird. Vorzugsweise beträgt diese Verringerung der Verkalkung im Vergleich zu einem unbehandelten implantierten Biomaterial mehr als 50 %, stärker bevorzugt mehr als 75 % und am stärksten bevorzugt mehr als 90 %.
Der bzw. das beim Formulieren der Antikalkbehandlungslösung verwendete höhere Alkohol oder Polyol kann ein linearer bzw. lineares oder verzweigter bzw. verzweigtes C₄-C₃₆-Alkohol oder -Polyol sein. Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsbeispielen der Erfindung ist der bzw. das höhere Alkohol oder Polyol aus einem C₆-C₁₈-Alkohol oder -Polyol, vorzugsweise aus einem C₇-C₉-Alkohol oder -Polyol ausgewählt. Üblicherweise umfasst der bzw. das höhere Alkohol oder Polyol weniger als etwa 50 Volumenprozent der Antikalkbehandlungslösung. In manchen Fällen ist es jedoch erwünscht, eine Antikalkbehandlungslösung zu verwenden, bei der der bzw. das höhere Alkohol oder Polyol weniger als etwa 25 Volumenprozent der Antikalkbehandlungslösung, oder sogar weniger als etwa 10 Volumenprozent der Antikalkbehandlungslösung, umfasst. Die Antikalkbehandlungslösung der vorliegenden Erfindung kann ferner zumindest ein organisches Lösungsmittel aufweisen, das z.B. aus C₁-C₃-Alkoholen ausgewählt ist. Überdies kann die Antikalkbehandlungslösung auch Wasser oder ein wässriges Lösungsmittel aufweisen.
Polare aprotische organische Lösungsmittel, die beim Formulieren der Antikalkbehandlungslösungen der vorliegenden Erfindung nützlich sind, weisen vorzugsweise Dielektrizitätskonstanten von mehr als etwa 20, stärker bevorzugt mehr als etwa 30 auf, und sie besitzen ein gewisses Maß an Wasserlöslichkeit. Polare aprotische organische Lösungsmittel, die bei diesem Aspekt der Erfindung nützlich sind, umfassen z.B. N-Alkylpyrolidinone und N-Alkylamide, bei denen die Alkylgruppe oder -gruppen verzweigte oder lineare Alkylketten aufweisen, die von etwa 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweisen. Veranschaulichende Lösungsmittel dieser Klasse umfassen N-Methylpyrolidinon, N,N-Dimethylacetamid, N,N-Dimethylformamid, N,N-Dimethylpropionamid und dergleichen.
Bei einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Behandeln eines mit Aldehyd vernetzten Tiergewebes vorgesehen, bei dem eine Antikalkbehandlungslösung gebildet wird, die aus zumindest einem organischen Lösungsmittel und aus von etwa 0,1 bis etwa 25 Volumenprozent eines C₆-C₁₈-Alkohols oder -Polyols besteht, und bei dem die Antikalkbehandlungslösung unter Bedingungen, die wirksam sind, um die pathologische Verkalkung des Biomaterials im Anschluss an eine Implantation in ein Empfänger-Säugetier zu verringern, mit dem mit Aldehyd vernetzten Biomaterial in Berührung gebracht wird. Wie oben beschrieben wurde, kann eine Antikalkbehandlungslösung der Erfindung ein oder mehrere organische Lösungsmittel enthalten und kann ferner Wasser oder ein kompatibles wässriges Lösungsmittelsystem aufweisen. Bei einem veranschaulichenden Ausführungsbeispiel dieses Aspekts der Erfindung liegt ein organisches Lösungsmittel in einer Menge von etwa 35 bis etwa 49 Volumenprozent der Antikalkbehandlungslösung vor, wobei der Rest Wasser oder ein wässriges Lösungsmittel umfasst. Bei diesem Ausführungsbeispiel ist bevorzugt, dass das Wasser oder das wässrige Lösungsmittel in einer Menge von mehr als etwa 50 Volumenprozent der Antikalkbehandlungslösung vorliegt.
Bei einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Behandeln eines mit Aldehyd vernetzten Säugetiergewebes vorgesehen, bei dem eine Antikalkbehandlungslösung bereitgestellt wird, die etwa 0,1 bis etwa 25 Volumenprozent eines C₆-C₁₈-Alkohols oder -Polyols, etwa 25 bis etwa 99 Volumenprozent eines organischen Lösungsmittels, das aus einem C₁-C₃-Alkohol ausgewählt ist, umfasst, wobei das eventuell verbleibende Volumen aus Wasser oder einem wässrigen Lösungsmittel besteht; und bei dem die Antikalkbehandlungslösung über eine Zeitdauer, die effektiv ist, um eine pathologische Verkalkung des Biomaterials im Anschluss an eine Implantation in ein Empfänger-Säugetier zu verringern, mit einem mit Aldehyd vernetzten Biomaterial in Berührung gebracht wird. Ein veranschaulichendes Ausführungsbeispiel dieses Aspekts der Erfindung verwendet ein organisches Lösungsmittel, das in einer Menge von etwa 35 bis etwa 45 Volumenprozent der Antikalkbehandlungslösung vorliegt, und einen höheren Alkohol oder ein höheres Polyol, der bzw. das in einer Menge von etwa 1 bis etwa 10 Volumenprozent der Antikalkbehandlungslösung vorliegt.
Bei einem weiteren Aspekt dieser Erfindung ist ein Verfahren zum Behandeln eines Biomaterials vorgesehen, das ein Inberührungbringen eines mit Aldehyd vernetzten Biomaterials mit einer Antikalkbehandlungslösung umfasst, die aus N-Methylpyrolidinon, N,N-Dimethylacetamid, N,N-Dimethylformamid und/oder N,N-Dimethylpropionamid besteht, unter Bedingungen, die wirksam sind, um eine pathologische Verkalkung des Biomaterials im Anschluss an eine Implantation in ein Empfänger-Säugetier zu verringern.
Bei einem weiteren Aspekt dieser Erfindung ist ein Verfahren zum Behandeln eines Biomaterials, vorzugsweise eines vernetzten Tiergewebes, vorgesehen, bei dem ein Biomaterial bei einer Temperatur zwischen 30° und 60°C über eine Zeitdauer und unter Bedingungen, die wirksam sind, um eine pathologische Verkalkung des Biomaterials im Anschluss an eine Implantation in ein Empfänger-Säugetier zu verringern, mit einer Antikalkbehandlungslösung in Berührung gebracht wird. Die Antikalkbehandlungslösungen umfassen zwischen etwa 10 und etwa 50 Volumenprozent, vorzugsweise zwischen etwa 25 und 50 Volumenprozent, eines C₁-C₃-Alkohols, z.B. Methanol, Ethanol, Propanol oder Isopropanol, wobei das verbleibende Volumen aus Wasser oder einem wässrigen Puffer, z.B. HEPES, besteht.
Beschreibung veranschaulichender Ausführungsbeispiele
Nachfolgend werden veranschaulichende Ausführungsbeispiele der Erfindung beschrieben. Der Übersichtlichkeit halber sind in dieser Spezifikation nicht alle Merkmale einer tatsächlichen Implementierung beschrieben. Man wird selbstverständlich erkennen, dass bei der Entwicklung eines derartigen tatsächlichen Ausführungsbeispiels zahlreiche implementierungsspezifische Entscheidungen getroffen werden müssen, um die spezifischen Ziele der Entwickler zu erreichen, z.B. Vereinbarkeit mit systembezogenen und unternehmensbezogenen Einschränkungen, die von einer Implementierung zur anderen variieren. Überdies wird man einsehen, dass eine derartige Entwicklungsbemühung komplex und zeitaufwändig sein kann, für Fachleute, die den Vorteil dieser Offenbarung haben, jedoch ein routinemäßiges Unterfangen wäre.
Der Begriff „Biomaterial" wird hierin verwendet, um allgemein auf kollagenhaltige, biologisch gewonnene Materialien zu verweisen. Beispielsweise können verschiedene Typen von implantierbaren biologischen Geweben, die von zahlreichen Tierquellen und Teilen der Anatomie gewonnen werden, als Biomaterialien gemäß dieser Erfindung verwendet werden. Das Gewebe kann z.B. von tierischen Quellen wie z.B. dem Menschen, von Rindern, Schweinen, Pferden, Schafen, Känguruhs, Kaninchen und anderen gewonnen werden. Veranschaulichende Beispiele von Tiergeweben, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, umfassen folgende, sind aber nicht auf diese beschränkt: Herzklappen, insbesondere Herzklappen vom Schwein oder Rind; Aortenwurzeln, -wände und/oder -segel; Perikard; aus Bindegewebe gewonnene Materialien wie z.B. Dura Mater; Homotransplantatgewebe wie z.B. Aortenhomotransplantate und Saphena-Bypass-Transplantate; Sehnen; Bänder, Hautpatches; Arterien; Venen und dergleichen. Selbstverständlich fallen auch andere biologisch gewonnene Materialien, von denen man weiß, dass sie sich für Verweilanwendungen im Körper eines Lebewesens eignen, in die Betrachtung der Erfindung. Bei manchen Anwendungen kann es erwünscht sein, das Biomaterial auf bestimmte Weise zu manipulieren, um es in einer bestimmten Form oder Gestalt bereitzustellen, wobei vor den hierin beschriebenen Behandlungen beispielsweise Metall-Stents verwendet werden. Auf diese Weise kann das Biomaterial bei der bestimmten dreidimensionalen geometrischen Konfiguration der zu implantierenden Bioprothese vernetzt und/oder mit Alkohol behandelt werden.
Üblicherweise umfasst das gemäß dieser Erfindung behandelte Biomaterial ein Biomaterial, das anhand einer Behandlung mit einem oder mehreren chemischen Vernetzungsmitteln oder anhand anderer Behandlungen, die eine Vernetzung bewirken, fixiert/vernetzt wurde. Diese Behandlungen können z.B. Behandlungen mit polyfunktionellen Aldehyden, polyfunktionellen Epoxiden, eine Photooxidation und/andere Vernetzungsmittel oder Behandlungen umfassen, die Reaktionen zwischen Carbonsäure- und Amingruppen, z.B. N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDC), fördern. Selbstverständlich werden die Antikalkbehandlungen dieser Erfindung vorzugsweise in Verbindung mit Vernetzungsmitteln oder Behandlungen eingesetzt, die die Anfälligkeit eines Biomaterials, im Anschluss an eine Implantation in einen lebenden Empfänger zu verkalken, erhöhen.
Bei einem Ausführungsbeispiel der Erfindung ist das Biomaterial eines, das durch eine Behandlung mit einem monofunktionellen Aldehyd, einem polyfunktionellen Aldehyd oder einer Kombination aus denselben vernetzt wurde. „Monofunktioneller Aldehyd" bezieht sich auf ein Molekül, das eine einzige Aldehydfunktionalität enthält, z.B. Formaldehyd, wohingegen sich „polyfunktioneller Aldehyd" auf ein Molekül bezieht, das zwei oder mehrere Aldehydfunktionalitäten enthält. Die anderen an dem monofunktionellen oder polyfunktionellen Aldehyd vorhandenen Komponenten sind nicht kritisch, vorausgesetzt, dass sie die Fähigkeit der Aldehydgruppen, kollagenreaktiv und dadurch in der Lage zu sein, vernetzte biologische Gewebe zu erzeugen, nicht nachteilig beeinflussen. Beispiele von monofunktionellen und polyfunktionellen Aldehyden, die üblicherweise bei Biomaterialfixierungsverfahren zum Erzeugen vernetzter Biomaterialien verwendet werden, umfassen Aldehydverbindungen, die eine aliphatische Komponente enthalten, die eine lineare oder verzweigte, gesättigte oder ungesättigte aliphatische Kette mit von etwa 2 bis etwa 36 Kohlenstoffatomen aufweist. Am stärksten bevorzugt verwenden Vernetzungsprozesse einen polyfunktionellen Aldehyd, der von 2 bis etwa 10 Kohlenstoffatome aufweist, z.B. den linearen C₅-Alkyldialdehyd, Glutaraldehyd.
Gemäß seiner Verwendung hierin bezieht sich der Begriff „mit Aldehyd fixiertes Biomaterial" oder „mit Aldehyd vernetztes Biomaterial" auf ein Biomaterial, das mit einer oder mehreren monofunktionellen und/oder polyfunktionellen Aldehydverbindungen behandelt wurde. Die Techniken und Bedingungen zum Behandeln von Biomaterialien mit aldehydhaltigen Vernetzungsmitteln sind Fachleuten hinreichend bekannt und für diese ohne weiteres erhältlich (siehe z.B. Zilla et al.). Bei diesen Prozessen wird ein Biomaterial üblicherweise über einen Zeitraum und unter Bedingungen, die wirksam sind, um zu dem gewünschten Vernetzungsgrad von Kollagen und anderen zellulären Proteinen in dem Gewebe zu führen, mit einer Aldehydlösung in Berührung gebracht. Prozeduren zum Überwachen des Fortschritts und/oder des Abschlusses der Vernetzungsreaktion sind ebenfalls hinreichend bekannt. Beispielsweise kann der Vernetzungsgrad eines behandelten Gewebes überwacht werden, indem seine Schrumpfungstemperatur und/oder die Menge an in dem Material vorliegendem extrahierbaren Protein bewertet wird.
Fachleute werden erkennen, dass die Dauer der Vernetzungsreaktion gemäß dieser Erfindung nicht kritisch ist, solange das Biomaterial und das Vernetzungsmittel über eine Zeitdauer, die ausreichend ist, dass eine Vernetzung erfolgt, in Berührung bleiben. Die Behandlungszeit variiert selbstverständlich je nach der Art des behandelten Biomaterials, dem jeweiligen verwendeten Aldehyd und/oder der Konzentration des Aldehyds in der Vernetzungslösung. Üblicherweise beträgt die Dauer der Reaktion zwischen einer Minute und mehreren Tagen. Jedoch sollte die Behandlungszeit nicht so lange sein, dass sie das vernetzte Biomaterial beeinträchtigt. Vernetzungszeiten von mehreren Tagen oder mehr sind nicht unüblich. Jedoch kann das Biomaterial auch über kürzere Zeiträume behandelt werden, z.B. zwischen etwa einer Minute und etwa 12 Stunden, oder zwischen etwa einer Stunde und etwa sechs Stunden, vorausgesetzt, dass der gewünschte Vernetzungsgrad erzielt wird.
Die bei einer typischen Vernetzungsreaktion verwendeten Reaktionstemperaturen und/oder -drücke sind nicht kritisch und können im Wesentlichen jegliche Bedingungen umfassen, die wirksam sind, um zu ermöglichen, dass die Vernetzungsreaktion stattfindet, und die den Fortschritt der Reaktion oder die Integrität des behandelnden Biomaterials nicht nachteilig beeinflussen. Eine Identifizierung der optimalen Temperatur- und Druckbedingungen für eine bestimmte Implementierung der vorliegenden Erfindung kann durch Fachleute ohne weiteres bestimmt werden. Allgemein kann die Vernetzungsreaktion bei einer Umgebungstemperatur oder bei jeglicher anderen zweckmäßigen Temperatur durchgeführt werden, die die Gewebedenaturierungstemperatur von etwa 62°C nicht wesentlich übersteigt. Somit können Reaktionstemperaturen aus einem Temperaturbereich von etwa 0°C bis etwa 60°C, vorzugsweise von etwa 20°C bis etwa 50°C ausgewählt werden. Obwohl der Druck für eine typische Reaktion allgemein zwischen etwa 2 mm Hg und etwa 6 mm Hg liegt, können geeignete Drücke sogar auch 100 mm Hg oder mehr betragen, falls gewünscht.
Nachdem das Biomaterial auf diese Weise vernetzt wurde, wird das Gewebe optional gewaschen/gespült und mit einer Antikalkbehandlungslösung in Berührung gebracht. Die Antikalkbehandlungslösungen der vorliegenden Erfindung umfassen Lösungen, die aus höheren Alkoholen, Polyolen (d.h. organischen Molekülen, die zwei oder mehrere Alkoholfunktionalitäten enthalten), polaren aprotischen Lösungsmitteln, z.B. N-Methylpyrolidinon, und Lösungen bestehen, die weniger als etwa 50 Volumenprozent eines oder mehrerer niederer (C₁-C₃)Alkohole umfassen.
Somit bestehen die Antikalkbehandlungslösungen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung aus einem oder mehreren höheren Alkoholen oder Polyolen (z.B. einem C₄-C₃₆-Alkohol oder -Polyol). Der bzw. das höhere Alkohol oder Polyol ist üblicherweise ein aliphatischer linearer bzw. aliphatisches lineares oder verzweigter bzw. verzweigtes Alkohol oder Polyol und kann zusätzliche chemische Anteile oder Substituenten enthalten, vorausgesetzt, dass sie die hierin beschriebenen Antikalkwirkungen nicht auf unannehmbare Weise beeinträchtigen. Bei einem veranschaulichenden Ausführungsbeispiel der Erfindung sind die höheren Alkohole, die verwendet werden, um die Antikalkbehandlungslösung zu formulieren, primäre, sekundäre oder tertiäre Alkohole, die aus linearen oder verzweigten aliphatischen C₆-C₁₈-Alkoholen, z.B. Hexanol, Heptanol, Octanol, Nonanol usw., oder linearen oder verzweigten C₆-C₁₈-Polyolen ausgewählt sind, die aus 1,2-Octandiol (manchmal auch als 1,2-Dihydroxyoctan bezeichnet), 1,8-Octandiol, 1,10-Decanol, 1,10-Dodecanol, 1,2-Dihydroxydecan und 1,2-Dihydroxydodecan ausgewählt sind. Bei bestimmten veranschaulichenden Ausführungsbeispielen der Erfindung liegen die höheren Alkohole oder Polyole in einer Menge von weniger als etwa 50, weniger als etwa 25 oder weniger als etwa 10 Volumenprozent der Antikalkbehandlungslösung vor, wobei der Rest ein organisches Lösungsmittel umfasst. Somit kann die Antikalkbehandlungslösung der vorliegenden Erfindung zusätzlich zu den oben beschriebenen höheren Alkoholen und Polyolen des weiteren ein oder mehrere organische Lösungsmittel enthalten. Die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten organischen Lösungsmittel sind vorzugsweise aus denen ausgewählt, die keine schädliche Wirkung auf das behandelte Gewebe oder auf die durch die Verwendung der Antikalkbehandlungslösung erzielten Antikalkeffekte haben. Die organischen Lösungsmittel sollten in der Lage sein, den höheren Alkohol bzw. das höhere Polyol auf angemessene Weise aufzulösen, um eine homogene Antikalkbehandlungslösung zu bilden. Organische Lösungsmittel, die die Antikalkeffekte der höheren Alkohole oder Polyole dieser Erfindung verbessern, verstärken oder auf andere Weise begünstigen können, sind selbstverständlich besonders bevorzugt. Organische Lösungsmittel, die gemäß diesem Ausführungsbeispiel nützlich sind, umfassen niedere Alkohole (z.B. C₁-C₃-Alkohole), Aceton, Ethylacetat, Ethyllactat, Polyethylenglycol und dergleichen.
Antikalkbehandlungslösungen gemäß bestimmten Ausführungsbeispielen der Erfindung umfassen ein(en) oder mehrere höhere Alkohole und/oder Polyole in einem vorzugsweise homogenen Gemisch mit einem oder mehreren organischen Lösungsmitteln. Beispielsweise umfassen besonders veranschaulichende Alkoholbehandlungslösungen zwischen etwa 0,1 und etwa 25 Volumenprozent eines oder mehrerer höherer Alkohole oder Polyole, wobei im Wesentlichen der gesamte Rest der Lösung aus einem organischen Lösungsmittel besteht. Zusätzliche veranschaulichende Antikalkbehandlungslösungen umfassen zwischen etwa 0,1 und etwa 10 Volumenprozent eines oder mehrerer höherer Alkohole oder Polyole, wobei im Wesentlichen der gesamte Rest der Lösung aus einem organischen Lösungsmittel besteht.
Alternativ dazu können der eine oder die mehreren höheren Alkohole bzw. das eine oder die mehreren Polyole der Antikalkbehandlungslösung in einem wässrigen Lösungsmittelsystem formuliert sein, z.B. mit Wasser oder mit einem beliebigen einer Vielzahl von wässrigen Puffersystemen, oder sie können in einem Gemisch aus einem wässrigen Lösungsmittelsystem und einem oder mehreren organischen Lösungsmitteln formuliert sein. Manche höhere Alkohole und Polyole können in auf Wasser basierenden Systemen eine geringe Löslichkeit aufweisen, jedoch in vielen organischen Lösungsmitteln eine höhere Löslichkeit aufweisen. Somit ist es bei Ausführungsbeispielen, die auf Wasser basierende Lösungsmittelsysteme verwenden, in manchen Fällen bevorzugt, dass ferner ein oder mehrere organische Lösungsmittel in einer Menge verwendet werden, die zumindest ausreichend ist, um den höheren Alkohol bzw. das höhere Polyol aufzulösen, um eine homogene, z.B. im Wesentlichen in einer einzigen Phase vorliegende Antikalkbehandlungslösung bereitzustellen.
Somit umfassen Antikalkbehandlungslösungen bei zusätzlichen Ausführungsbeispielen der Erfindung etwa 0,1 bis etwa 25 Volumenprozent eines oder mehrerer höherer Alkohole oder Polyole, etwa 25 bis etwa 49 Volumenprozent eines oder mehrerer organischer Lösungsmittel, wobei im Wesentlichen der gesamte Rest der Lösung Wasser oder eine auf Wasser basierte Lösung ist. Weitere Ausführungsbeispiele der Erfindung liefern eine Antikalkbehandlungslösung, die etwa 0,1 bis etwa 10 Volumenprozent eines oder mehrerer höherer Alkohole oder Polyole, etwa 35 bis etwa 45 Volumenprozent eines oder mehrerer organischer Lösungsmittel umfasst, wobei im Wesentlichen der gesamte Rest der Lösung Wasser oder eine auf Wasser basierende Lösung ist.
Bei einem weiteren Ausführungsbeispiel dieser Erfindung umfasst die Antikalkbehandlungslösung ein oder mehrere polare aprotische Lösungsmittel. Derartige Lösungsmittel können beispielsweise N-Alkylpyrolidinone und N-Alkylamide umfassen, bei denen die Alkylgruppe oder -gruppen lineare oder verzweigte Alkylketten mit von etwa 1 bis 10 Kohlenstoffatomen umfassen. Veranschaulichende Lösungsmittel dieses Typs umfassen N-Methylpyrolidinon, N,N-Dimethylacetamid, N,N-Dimethylformamid, N,N-Dimethylpropionamid und dergleichen. Besonders bevorzugte polare aprotische Lösungsmittel umfassen diejenigen, die einen gewissen Grad an Wasserlöslichkeit aufweisen, und/oder diejenigen mit hohen Dielektrizitätskonstanten, die beispielsweise Dielektrizitätskonstanten von mehr als etwa 20, vorzugsweise mehr als etwa 30 aufweisen.
Bei einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung sind Behandlungslösungen mit niederem (C₁-C₃-)Alkohol, die weniger als 50 Volumenprozent des niederen Alkohols, vorzugsweise zwischen etwa 25 und 50 Volumenprozent, umfassen, ebenfalls als Antikalkbehandlungslösungen geeignet. Während bisherige Antikalkbehandlungsversuche, die Lösungen mit niederem Alkoholen wie z.B. diesen verwenden, bisher nicht erfolgreich sind, stellte man nun fest, dass eine bedeutende Antikalkwirkung in der Tat dadurch erzielt werden kann, dass man ein Biomaterial mit einer Behandlungslösung mit einem niederen Alkohol bei einer Temperatur im Bereich von etwa 30°C bis etwa 60°C, vorzugsweise zwischen etwa 35°C und 45°C, in Berührung bringt. Diese Behandlungstemperaturen verbessern die Wirksamkeit der Antikalkbehandlungslösungen dieses Ausführungsbeispiels, möglicherweise durch Erleichtern der Diffusion und des Eindringens der niederen Alkohole in das Biomaterial. Vorzugsweise wird die Behandlung gemäß diesem Ausführungsbeispiel durch ein Rühren der Antikalkbehandlungslösung, während sie mit dem Biomaterial in Berührung ist, begleitet.
Vernetztes Biomaterial wird mit einer Antikalkbehandlungslösung der vorliegenden Erfindung in Berührung gebracht oder auf andere Weise derselben ausgesetzt, und zwar über eine Zeitdauer, die ausreichend ist, um das Biomaterial gegenüber einer pathologischen in-vivo-Verkalkung widerständsfähiger als ein Biomaterial zu machen, das nicht mit der Antikalkbehandlungslösung behandelt ist. Die Expositionsdauer ist bei den hierin beschriebenen Ausführungsbeispielen lediglich veranschaulichend und kann von Fachleuten variiert werden, während sie ein gewünschtes Ergebnis erzielen. Für Ausführungsbeispiele der Erfindung, bei denen das Biomaterial in eine flüssige Antikalkbehandlungslösung eingetaucht oder in einer solchen eingeweicht wird, liegt die Expositionszeit üblicherweise im Bereich von etwa einer Stunde bis etwa 96 Stunden. Bei manchen Biomaterialien kann ein exzessives Inberührungbringen mit der Antikalkbehandlungslösung zu einer Verringerung der Antikalkeffekte führen oder kann eine Rehydratation des Gewebes erforderlich machen.
Die Behandlungsprozedur kann bei oder nahe der Raumtemperatur (z.B. etwa 25°C) durchgeführt werden, falls gewünscht. Jedoch kann jegliche zweckmäßige Temperatur, die für das Biomaterial nicht schädlich ist, z.B. etwa 4°C bis etwa 60°C, verwendet werden. Wie oben erörtert wurde, kann es bei manchen Ausführungsbeispielen in der Tat wünschenswert und/oder notwendig sein, eine über der Raumtemperatur liegende Inkubationstemperatur zu verwenden, um die Wirksam keit des Behandlungsprozesses zu verbessern, z.B. indem die Rate bzw. der Grad der Diffusion und des Eindringens der Antikalklösungen in das Biomaterial erhöht wird.
Das Biomaterial wird üblicherweise durch Kontakt mit einer flüssigen Antikalkbehandlungslösung behandelt. Jedoch sind auch andere Lösungsansätze möglich, z.B. eine Dampf-, Plasma- und/oder Tiefkühlanwendung. Ungeachtet des Expositionsverfahrens sollte die Zeitdauer ausreichend sein, um eine Verkalkung zu hemmen, sollte jedoch nicht so lange sein, dass eine irreparable Dehydrierung des Gewebes durch jegliche der Komponenten der Antikalkbehandlungslösung bewirkt wird. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen wird das Biomaterial geschüttelt oder auf andere Weise gerührt, während es der Antikalkbehandlungslösung ausgesetzt wird, um ein stärkeres Eindringen der Komponenten der Lösung in das Biomaterial zu ermöglichen. Ein Schütteln kann auf jegliche zweckmäßige Weise bewerkstelligt werden, z.B. durch Verwendung einer Orbital-Schüttelmaschine oder eines Schüttelgestells oder durch manuelles Rühren.
In manchen Fällen ist es bevorzugt, eine Antikalkbehandlungslösung zu formulieren, die in einem wässrigen Lösungsmittelsystem gepuffert ist, beispielsweise auf einen pH-Wert zwischen etwa 6,0 und 8,0, vorzugsweise auf einen pH-Wert zwischen etwa 7,0 und 7,6. Puffer, die sich zur diesbezüglichen Verwendung eignen, umfassen Puffer, die eine Pufferkapazität aufweisen, die ausreichend ist, um einen physiologisch akzeptablen pH-Wert aufrechtzuerhalten und die keinerlei schädliche Wirkung auf das Biomaterial haben oder den durchgeführten Behandlungsvorgang stören. Veranschaulichende Puffer umfassen phosphatgepufferte Sole (PBS), organische Puffer, z.B. N-N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES) und Morpholinpropansulfonsäure (MOPS) sowie Puffer, die Borat, Bicarbonat, Carbonat, Kakodylat und dergleichen umfassen. Fachleuten werden viele zusätzliche wässrige und/oder andere Puffersysteme einfal len, die sich zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung eignen.
Das Biomaterial, das mit einer Antikalkbehandlungslösung behandelt wurde, kann vor einer Implantation oder Aufbewahrung gespült werden, um jegliche unerwünschten und/oder schädlichen Komponenten, die bei dem Biomaterialbehandlungsprotokoll erzeugt oder verwendet wurden, z.B. zellulären Debris oder Aldehydfragmente aus einer Aldehyd-Vorbehandlung, zu beseitigen. Gemäß seiner Verwendung hierin umfasst der Begriff „Spülen", dass das Biomaterial einer Spüllösung ausgesetzt wird, einschließlich einer kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Verarbeitung, wobei das Biomaterial in eine Spüllösung platziert wird, die periodisch beseitigt und in vorbestimmten Abständen durch eine frische Lösung ersetzt wird. Während des Spülens wird das Gewebe vorzugsweise geschüttelt oder von Zeit zu Zeit gerührt, um eine gleichmäßige Verteilung der Spüllösung zu gewährleisten. Zur Veranschaulichung kann ein Spülvorgang ein Einweichen des Biomaterials in einer frischen Spüllösung umfassen, die über einen Zeitraum von etwa einer Stunde oder weniger mehrere Male ausgetauscht wird. Alternativ dazu kann die Spüllösung in Abständen von mehreren Stunden oder mehr über eine längere Spüldauer, z.B. etwa 24 Stunden, ausgetauscht werden. Beispielhafte Spüllösungen umfassen physiologisch geeignete Lösungen, z.B. Wasser, Sole, PBS, mit HEPES gepufferte Sole, Ringer-Lactat (pH-Wert 7,4), Natriumbicarbonat (pH-Wert 7,4), Tris (pH-Wert 7,4), Imidazol (pH-Wert 7,4) und dergleichen.
Nach dem Spülen ist das behandelte Biomaterial bereit zur Implantation, oder es kann sterilisiert und bis zur Verwendung aufbewahrt werden. Eine Aufbewahrung in standardmäßigen Glutaraldehyd-Lösungen des Typs, der üblicherweise für eine langfristige Aufbewahrung von Bioprothesen für klinische Zwecke verwendet wird, kann die vorteilhaften Effekte, die durch das Behandlungsverfahren der vorliegenden Erfindung erreicht werden, teilweise rückgängig machen. Somit kann es vorteilhaft sein, das behandelte Biomaterial in einer alkohol- oder polyolhaltigen Lösung, z.B. einer Alkohol-Glutaraldehyd-Lösung, aufzubewahren, vorzugsweise unter Bedingungen, die die Verkalkungshemmungseigenschaften des behandelten Materials aufrechterhalten.
Bei anderen Ausführungsbeispielen der Erfindung werden Biomaterialien, die gemäß dem Verfahren der Erfindung behandelt wurden, in einer aldehydfreien Umgebung aufbewahrt. Beispielsweise kann ein behandeltes Gewebe in sterile Beutel platziert und einer Sterilisierungsstrahlung, z.B. Gamma-Strahlung, ausgesetzt werden. Selbstverständlich ist das Behandlungsverfahren der vorliegenden Erfindung mit vielen anderen bekannten sterilisierenden Konservierungsstoffen und/oder Techniken, die Fachleuten bekannt sind, vereinbar.
Bei weiteren Ausführungsbeispielen kann die Antikalkbehandlungslösung der vorliegenden Erfindung ferner ein oder mehrere zusätzliche Antikalkmittel umfassen, einschließlich, aber nicht ausschließlich, eines löslichen Salzes eines metallischen Kations, z.B. Al+3 oder Fe+3, vorzugsweise in einem Konzentrationsbereich von 0,001M bis 0,1M. Beispielsweise umfassen wasserlösliche Aluminiumsalze, die zur Verwendung bei der Praxis der vorliegenden Erfindung geeignete weitere Antikalkmittel sind, ohne Einschränkung Aluminiumchlorat, Aluminiumlactat, Aluminiumkaliumsulfat, Aluminiumnatriumsulfat, Aluminiumsulfat, Aluminiumnitrat und Aluminiumchlorid. Auch wasserlösliche Eisen(III)-Salze, z.B. Eisentrichlorid, Eisentrinitrat, Eisentribromid, Natriumtriedentatferrat (III), Eisentrisulfat und Eisen(III)-Formiat, werden bei der Erfindung in Betracht gezogen. Selbstverständlich kann jegliches Salz von Aluminium oder Eisen, das in dem Lösungsmittelsystem der Behandlungslösung löslich ist, bei der Praxis der Erfindung verwendet werden.
Folgendes kann zumindest teilweise bestimmte Vorteile erklären, die durch eine Verwendung von Antikalkbehandlungslösungen gemäß der vorliegenden Erfindung erzielt werden, obwohl keine Einschränkung durch diese Theorie beabsichtigt ist. Bei lebendem Gewebe und lebenden Zellen beträgt die typische extrazelluläre Kalziumkonzentration etwa 1 mM, und die intrazelluläre Kalziumkonzentration beträgt etwa 0,1 μM. Dieser große Kalziumkonzentrationsgradient zwischen der extrazellulären und der intrazellulären Region wird über die Plasmamembranen der Zellen hinweg durch biochemische metabolische energieabhängige Pumpen aufrechterhalten. Auf eine Fixierung hin sind diese biochemischen Kräfte nicht aktiv, und dies führt zu einer hohen Kalziumkonzentration in der gesamten fixierten Gewebematrix. Plasmamembranen und membrangebundene Organellen sind reich an Phospholipiden, die Phosphor für die Bildung von Kalziumphosphat bereitstellen. In der in-vivo-Umgebung kann die hohe Kalziumkonzentration in dem fixierten Gewebe in Verbindung mit einer Phosphorquelle aus Lipiden Bedingungen für eine Kalziumphosphatkristallisation begünstigen. Jedoch können die Bestandteile der gemäß dieser Erfindung verwendeten Antikalkbehandlungslösungen beim Eindringen in die Gewebematrix, Interagieren mit Phospholipiden und anderem zellulären Debris aus dem vernetzten Biomaterial und möglicherweise beim Ermöglichen von deren bzw. dessen Beseitigung, und beim Beeinträchtigen der Fähigkeit derartiger Komponenten, zu dem Kristallisationsprozess beizutragen, äußerst effektiv sein.
Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um bestimmte veranschaulichende Ausführungsbeispiele dieser Erfindung zu demonstrieren. Fachleuten sollte einleuchten, dass die in den folgenden Beispielen offenbarten Techniken diejenigen darstellen, bei denen die Erfinder feststellten, dass sie bei der Praxis der Erfindung funktionieren, und die somit als Beispiele veranschaulichender Modi für deren Praktizierung angesehen werden können. Jedoch sollten Fachleute angesichts der vorliegenden Offenbarung erkennen, dass an den spezifischen offenbarten Ausführungsbeispielen viele Änderungen vorgenommen werden können und trotzdem ein gleiches oder ähnliches Ergebnis erzielt werden kann, ohne von der Wesensart und dem Schutzumfang der Erfindung abzuweichen.
Beispiele
Beispiel 1 – Behandlung eines mit Aldehyd fixierten Gewebes mit höheren Alkoholen
Rinder-Perikard wurde frisch vom Schlachthof erhalten, von überschüssigem Fett befreit und bis zur Verwendung in einer Lösung mit hoher Osmolarität aufbewahrt. Vor der Fixierung wurde das Gewebe gründlich in phosphatgepufferter Sole (PBS) mit einem pH-Wert von 7,3 bis 7,4 gespült. Eine 0,25%ige Glutaraldehyd-Lösung wurde hergestellt, indem 2,5 ml einer 50%igen Glutaraldehyd-Lösung (Aldrich Chemical) zu 500 ml PBS gegeben wurden. Fünfzehn 1 cm × 1 cm große Proben des Rinder-Perikard-Gewebes wurden zu der Glutaraldehyd-Lösung hinzugegeben, und die Röhre wurde sieben Tage lang bei Raumtemperatur aufbewahrt.
In einem sterilen Abzugsschrank wurden mit Glutaraldehyd fixierte Stücke des Rinder-Perikards mit sterilem PBS gewaschen (drei Wäschen, jeweils zehn Minuten). Die Proben wurden dann in eine sterile gefilterte Lösung aus 40 % Ethanol, 5 % Octanol, 55 % Wasser eingetaucht und bei Raumtemperatur 24 Stunden lang behandelt. Das Gewebe wurde dann mit sterilem PBS (drei Wäschen, jeweils zehn Minuten) und in sterilem gefiltertem 45%igem Ethanol in PBS etwa 30 Minuten lang gewaschen. Die Proben wurden etwa einen Tag lang in 40 ml PBS aufbewahrt, bevor sie für Rattenimplantationsstudien verwendet wurden.
In einem getrennten Experiment wurden fünf 1 cm × 1 cm große Proben eines mit Glutaraldehyd fixierten Rinder-Perikard-Gewebes (0,25 % Glutaraldehyd, 16 Stunden) 30 Minuten lang mit einer Lösung behandelt, die aus 40 % Ethanol, 5 % Octanol und 55 % Wasser bestand. Fünf weitere Pro ben wurden 24 Stunden lang in der Lösung behandelt. Nach der Behandlung wurden die Proben mit PBS gewaschen (30 ml × 3) und in 45 %igem Ethanol aufbewahrt. Die Proben wurden anschließend analysiert, um das Vorliegen extrahierbarer Proteine auszuwerten und um die Schrumpfungstemperaturen zu ermitteln.
Auswertung von extrahierbaren Proteinen und Schrumpfungstemperaturen
Ein Vernetzen von biologischem Gewebe führt zu weniger extrahierbarem Protein in dem Material. Proteinextraktionsversuche wurden durchgeführt, indem 10 bis 20 mg eines Gewebes mit 10 bis 20 μl einer Extraktionslösung extrahiert wurden, die 50 mM Tris-HCl, 10 % Glycerol, 4 % Mercaptoethanol, 1 % Natriumdodecylsulfat, 0,5M NaCl und 0,01 Bromphenolblau enthielt. Die extrahierte Lösung wurde anschließend auf einem fertigen Gel aus 4–20%-Acrylamid:Bisacrylamid (37,5:1) Mini-PROTEAN-II (Biorad Inc) analysiert.
Die Schrumpfungstemperaturen der behandelten Gewebe wurden ebenfalls unter Verwendung einer standardmäßigen Differenzialscanningkaloriemetrieanalyse ermittelt. Üblicherweise wurden 2 bis 10 mg Gewebe mit der Rate von 10°C pro Minute in einer Stickstoffatmosphäre erhitzt. Der bei etwa 60 bis 90°C beobachtete Beginn des Endotherms wird herkömmlicherweise auf einen Schrumpfungsübergang zurückgeführt und wurde als Schrumpfungstemperatur verwendet. Eine Zunahme der Schrumpfungstemperatur ist ein Hinweis darauf, dass eine Vernetzung stattgefunden hat.
Die Ergebnisse der Bestimmung des extrahierbaren Proteins und der Schrumpfungstemperatur sind in der nachfolgenden Tabelle 1 zusammengefasst:
TABELLE 1
Aus diesen Ergebnissen geht klar hervor, dass die Behandlung keine Verschlechterung des mit Glutaraldehyd fixierten Gewebes bewirkte, wie durch das Nichtvorliegen extrahierbarer Proteine belegt wird. Überdies beeinträchtigten weder die über eine Stunde noch die über 24 Stunden erfolgenden Behandlungen die Schrumpfungstemperaturwerte beträchtlich, was darauf hinweist, dass die Behandlung die physischen Eigenschaften des mit Glutaraldehyd fixierten Gewebes nicht veränderte.
Auswertung der Verkalkung im Anschluss an eine in-vivo-Implantation Vor der Implantation wurden die Proben jeweils drei Mal drei Minuten lang in 500ml-Behältern mit sterilem PBS gespült und dabei leicht gerührt. Behandelte und unbehandelte Exemplare wurden unter Verwendung standardmäßiger chirurgischer Prozeduren drei Wochen alten Sprague-Dawley-Ratten etwa 1 cm von der Abdominalmittellinie subkutan implan tiert. Das implantierte Gewebe wurde nach 60 Tagen wieder entnommen.
Nach ihrer Entnahme wurden die Gewebeproben unter Verwendung standardmäßiger histologischer Verfahren verarbeitet und mit H&E, einem Trichrom von von Kossa und Masson, gefärbt. Die Von-Kossa-Färbung identifiziert die Verkalkung des Gewebes. Das Ausmaß der Verkalkung wurde anhand der Von-Kossa-Färbung zwischen 0 (keine) und 5 (stark) eingestuft.
Der Kalziumgehalt der wiedergewonnenen Proben wurde bestimmt, indem die Proben unter sauren Bedingungen hydrolysiert wurden und indem die digerierten Proben unter Verwendung einer standardmäßigen ICP-Emissionsspektrophotometrie (ICP = inductively coupled plasma, induktiv gekoppeltes Plasma) analysiert wurden. Üblicherweise wurden etwa 0,5 g des explantierten Gewebes getrocknet, gewogen und unter sauren Bedingungen hydrolysiert. Die resultierende digerierte Probe wurde mit Wasser verdünnt und unter Verwendung eines ICP-Spektrophotometers analysiert (Varian Inc.; Liberty 100/200 ICP-OCS).
Die Ergebnisse dieser Experimente sind in der nachfolgenden Tabelle 2 zusammengefasst:
TABELLE 2
Die Tendenz eines mit Glutaraldehyd fixierten Gewebes, in dem Rattenmodell zu verkalken, ist in der Literatur hinreichend dokumentiert und wurde durch unsere Experimente bestätigt. Jedoch wiesen diejenigen mit Glutaraldehyd fixierten Proben, die mit einer Antikalkbehandlungslösung behandelt wurden, die einen höheren Alkohol (z.B. Octanol) enthielt, im Vergleich zu den nicht behandelten eine beträchtliche Verringerung der Verkalkung auf. Proben, die 24 Stunden lang bei Raumtemperatur mit einer 45%igen Ethanollösung behandelt wurden, zeigten ähnliche Werte wie die Kontrollproben.
Beispiel 2 – Behandlung von mit Aldehyd fixiertem Gewebe mit 1,2-Octandiol und N-Methylpyrolidinon
In einem sterilen Abzugsschrank wurden Stücke eines mit Glutaraldehyd fixierten Rinder-Perikard-Gewebes (Mitroflow Inc.; Richmond, British Columbia, Canada), eines Schweine-Cuspis-Gewebes (Labcor; Belo Horizonte, Brazil) und eines Wandgewebes vom Schwein (Labcor Inc.) in sterile Röhren transferiert, die 1,2-Octandiol-Lösungen enthielten (5 1,2-Octandiol (Aldrich Chemical), 40 % Ethanol und 55 10mM HEPES-Puffer). Die Röhren wurden in einen 37°C aufweisenden Inkubator transferiert und 16 Stunden lang unter leichtem Rühren auf 37°C gehalten. Nach der Behandlung wurden die Proben in Lösungen transferiert, die 22 % Ethanol in 10mM HEPES aufwiesen, und 14 Tage lang bei 4°C aufbewahrt. Das endgültige Verhältnis des Gewebes zum Volumen betrug für alle Behandlungen etwa 27 ml/g.
Für Behandlungen mit N-Methylpyrolidinon (NMP) wurden Stücke eines mit Glutaraldehyd fixierten Rinder-Perikard-Gewebes (Mitroflow Inc.), Schwein-Cuspis-Gewebes (Labcor Inc.) und Wandgewebes vom Schwein (Labcor Inc.) in sterile Röhren transferiert, die NMP enthielten. Die Röhren wurden etwa 16 Stunden lang unter gelegentlichem manuellem Rühren bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Behandlung wurden die Gewebeproben in 22%ige, mit HEPES gepufferte Ethanollösungen transferiert und 14 Tage lang bei 4°C aufbewahrt.
Auswertung der Verkalkung im Anschluss an eine in-vivo-Implantation
Den Charles Rivers Laboratories (Wilmington, MA) wurden zur Implantation in Ratten Proben, die mit den 1,2-Octandiol-Lösungen und mit NMP behandelt worden waren, sowie unbehandelte Proben jedes Gewebetyps bereitgestellt. Pro Behandlungsgruppe wurden sieben Ratten analysiert. Vor der Implantation wurden die Gewebeproben 3 Mal 3 Minuten in sterilem PBS gespült und dabei leicht gerührt. Die Proben wurden drei Wochen alten Sprague-Dawley-Ratten etwa 1 cm von der Abdominalmittellinie subkutan implantiert und 60 Tage nach der Implantation wiedergewonnen. Nicht implantierte Proben (eine pro Gewebetyp pro Behandlung) wurden als nicht implantierte Kontrollen verwendet. Nach der Wiedergewinnung wurden die Proben unter Verwendung einer standardmäßigen ICP-Methodologie auf ihren Kalzium- und Phosphorgehalt hin analysiert.
Die Ergebnisse dieser Experimente sind in der Tabelle 3 unten zusammengefasst.
TABELLE 3
Nicht implantierte Kontrollen wiesen einen sehr niedrigen Kalzium- und Phosphorgehalt auf (nicht gezeigt). Aus der obigen Tabelle kann man jedoch ersehen, dass explantierte Gewebeproben, die nicht mit einer Antikalkbehandlungslösung behandelt worden waren, einen sehr hohen Kalzium- und Phos phorgehalt aufwiesen. Dies wurde unabhängig von dem Gewebetyp beobachtet. Dagegen wiesen explantierte Gewebe, die entweder mit einer 1,2-Octandiol-Lösung oder mit NMP behandelt worden waren, beträchtlich verringerte Kalzium- und Phosphorpegel auf. Obwohl die Pegel bei allen Gewebetypen verringert waren, war der Effekt interessanterweise bei Rinder-Perikard am ausgeprägtesten.
Explantierte Gewebeproben wurden ebenfalls seziert, mit H&E gefärbt und histologisch in Bezug auf eine Entzündung, Vaskularisierung und Kollagen-Organisation ausgewertet. Die mit 1,2-Octandiol behandelten Proben, die mit NMP behandelten Proben und die Kontrollproben wiesen eine ähnliche histologische Einstufung auf, was darauf hindeutete, dass die Antikalkbehandlungen die biologische Reaktion des Empfängertiers nicht veränderten.
Analyse von extrahierbaren Proteinen und Schrumpfungstemperaturen
Bei diesen Experimenten wurden Proben von Rinder-Perikard in 0,25%ige Lösungen von Glutaraldehyd in PBS platziert, wo sie etwa sieben Tage lang bei Raumtemperatur verblieben. Die vernetzten Gewebe wurden dann einer Behandlung entweder mit 1,2-Octanol oder mit NMP, oben beschrieben, unterzogen. Die behandelten Proben wurden anschließend auf extrahierbare Proteine hin und zur Bestimmung von Schrumpfungstemperaturen analysiert.
Ferner wurden Versuche einer enzymatischen Digestion durchgeführt. Nach einer zehnminütigen thermischen Denaturierung bei 80°C in 4 mg/ml Pepsin (Sigma Chemical, St. Louis, MO) wurden Gewebeproben vier Stunden lang bei 37°C in 10 mM HCl digeriert. Das Verhältnis Enzym:Gewebe (Gewicht:Nassgewicht) betrug 1:2500. Im Anschluss an eine fünfminütige, bei 4°C und 13.000 UpM (30.000 × g) erfolgen de Zentrifugation wurden Reaktionsüberstände zur Gelelektrophorese verwendet.
Die Ergebnisse dieser Experimente sind nachstehend in der Tabelle 4 zusammengefasst.
TABELLE 4
Diese Ergebnisse demonstrieren, dass bei beiden Antikalkbehandlungen (1,2-Octandiol und NMB) im Vergleich zu unbehandeltem Gewebe keine beträchtliche Auswirkung auf die Schrumpfungstemperatur vorlag, was nahe legte, dass infolge der Antikalkbehandlungen keine beträchtliche Änderung des Vernetzungsstatus des Gewebes stattgefunden hatte. Überdies wiesen sowohl die behandelten als auch die unbehandelten Proben im Anschluss an die Proteinextraktions- und Pepsindigestionsversuche keine extrahierbaren Proteine auf, was darauf hindeutete, dass die Antikalkbehandlungen die Biostabilität des Gewebes nicht beeinträchtigten.
Beispiel 3 – Behandlung eines mit Aldehyd fixierten Gewebes mit Lösungen niederer Alkohole
In einem sterilen Abzugsschrank wurden Stücke eines mit Glutaraldehyd fixierten Rinder-Perikard-Gewebes (Mitroflow Inc.) in sterile Röhren transferiert, die eine 45%ige Lösung von mit HEPES-gepuffertem Ethanol (45 % Ethanol, 55 10mM HEPES-Puffer) enthielten. Die Röhren wurden in einen 37°C aufweisenden Inkubator transferiert und 16 Stunden lang bei leichtem Rühren auf 37°C gehalten. Nach der Behandlung wurden die Proben in eine frische Lösung von 45 mit HEPES gepuffertem Ethanol transferiert und 14 Tage lang bei Raumtemperatur (25°C) aufbewahrt. Das abschließende Verhältnis zwischen Gewebe und Volumen betrug bei allen Behandlungen etwa 27 ml/g.
Auswertung der Verkalkung im Anschluss an eine in-vivo-Implantation
Den Charles Rivers Laboratories (Wilmington, MA) wurden zur Implantation in Ratten Proben bereitgestellt, die mit der 45%igen Ethanollösung und mit NMP behandelt wurden, sowie unbehandelte Proben jedes Gewebetyps. Pro Behandlungsgruppe wurden sieben Ratten analysiert. Vor der Implantation wurden die Gewebeproben 3 Mal 3 Minuten in sterilem PBS gespült und dabei leicht gerührt. Die Proben wurden etwa 1 cm von der Abdominalmittellinie subkutan in drei Wochen alte Sprague-Dawley-Ratten implantiert und 60 Tage nach der Implantation wiedergewonnen. Nicht implantierte Proben (eine pro Gewebetyp pro Behandlung) wurden als nicht implantierte Kontrollen verwendet. Nach der Wiedergewinnung wurden die Proben unter Verwendung von ICP auf ihren Kalzium- und Phosphorgehalt hin analysiert.
Die Ergebnisse dieser Experimente sind in der Tabelle 5 unten zusammengefasst.
TABELLE 5
Diese Daten zeigen, dass die implantierten Gewebeproben, die keine Antikalkbehandlung erhielten, einen hohen Gehalt an Kalzium und Phosphor aufwiesen. Jedoch wiesen Gewebeproben, die mit der Ethanollösung behandelt worden waren, eine beträchtliche Reduktion des Gehalts beider Substanzen auf. Nach dem 60-tägigen Implantationszeitraum wiesen nicht implantierte Kontrollproben einen sehr niedrigen Gehalt an Kalzium und Phosphor auf (nicht gezeigt).
Somit können Lösungen mit niederen Alkoholen, die unter 50 Volumenprozent Alkohol aufweisen, eine Verkalkung unter geeigneten Behandlungsbedingungen verringern, z.B. indem eine erhöhte Temperatur verwendet wird, um die Wirksamkeit der Behandlung zu verbessern. Andere Lösungen, die weniger als 50 Volumenprozent eines niederen Alkohols, z.B. Methanol oder Isopropanol, enthalten, könnten ebenfalls verwendet werden.
Die oben offenbarten bestimmten Ausführungsbeispiele sind lediglich veranschaulichend, da die Erfindung auf unterschiedliche, jedoch äquivalente Weise, die Fachleuten, die von den Lehren hierin profitiert haben, einleuchten dürfte, modifiziert und praktiziert werden kann. Im Einzelnen wird einleuchten, dass bestimmte Mittel, die chemisch und/oder physiologisch verwandt sind, die hierin beschriebenen Mittel ersetzen können, wobei dieselben oder ähnliche Ergebnisse erzielt werden. Überdies sollen die hierin gezeigten Konstruktions- oder Entwurfseinzelheiten lediglich durch die in den nachfolgenden Patentansprüchen beschriebenen Einschränkungen beschränkt werden. Somit ist es offensichtlich, dass die oben offenbarten bestimmten Ausführungsbeispiele abgeändert oder modifiziert werden können und dass alle derartigen Variationen als in den Schutzumfang und die Wesensart der Erfindung fallend betrachtet werden. Dementsprechend wird der hierin gesuchte Schutz in den nachfolgenden Patentansprüchen dargelegt.
Referenzdokumente
Die folgenden Referenzdokumente sind in dem Umfang, in dem sie beispielhafte verfahrensbezogene oder andere Einzelheiten liefern, die die hierin Dargelegten ergänzen, durch Bezugnahme spezifisch in das vorliegende Dokument aufgenommen.
US-Patentschrift Nr. 5,746,775
Girardot et al., J Biomed Mater Res (1995) 29: 793–801
Golomb et al., Am J Pathol (1987) 127: 122–130
Gott, J. P. et al.; Ann.Thorac.Surg.(1992) 53, 207 – 215
Levy et al., In: Williams DF, ed. CRC Critical Rev. in Biocompatibility, Vol. 2 (1986): 147–187
Thubrikar et al., J Thorac Cardiovasc Surg (1983) 86: 115-125 Zilla et al., J Heart Valve Dis (1997) 6: 492–501

Claims

Ein Verfahren zur Verkalkungsgegenmaßnahme bezüglich eines Aldehyd-vernetzten Biomaterials, das ein Inberührungbringen des Biomaterials mit einer Antikalkbehandlungslösung umfasst, die von 1 Volumenprozent bis 50 Volumenprozent eines oder mehrerer C₄- oder höherer Alkohole und/oder Polyole aufweist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem das Aldehydvernetzte Biomaterial ein Tiergewebe ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem die C₄- oder höheren Alkohole oder Polyole lineare oder verzweigte C₄-C₃₆-Alkohole oder -Polyole sind.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die C₄- oder höheren Alkohole oder -Polyole lineare oder verzweigte C₆-C₁₈-Alkohole oder -Polyole sind.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die C₄- oder höheren Alkohole oder Polyole lineare oder verzweigte C₇-C₉-Alkohole oder -Polyole sind.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem der C₄- oder höhere Alkohol Heptanol, Octanol oder Nonanol ist.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 6, bei dem das C₄- oder höhere Polyol 1,2-Octandiol, 1,8-Octandiol, 1,10-Decanol, 1,10-Dodecanol, 1,2-Dihydroxydecan oder 1,2-Dihydroxydodecan ist.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem der bzw. das C₄- oder höhere Alkohol und/oder Po lyol von 1 Volumenprozent bis 25 Volumenprozent der Antikalkbehandlungslösung umfasst.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem der bzw. das C₄- oder höhere Alkohol und/oder Polyol von 1 Volumenprozent bis 10 Volumenprozent der Antikalkbehandlungslösung umfasst.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem die Antikalkbehandlungslösung ferner zumindest ein organisches Lösungsmittel aufweist, das kein C₄- oder höherer bzw. höheres Alkohol-/oder Polyol ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 10, bei dem das organische Lösungsmittel aus C₁-C₃-Alkohol, Aceton, Ethylacetat, Ethyllactat oder Polyethylenglykol ausgewählt ist.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, bei dem die Antikalkbehandlung ferner Wasser oder ein wässriges Lösungsmittel umfasst.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die Antikalkbehandlungslösung zumindest ein organisches Lösungsmittel, das kein C₄- oder höherer bzw. höheres Alkohol und/oder -Polyol ist, und von 1 Volumenprozent bis 25 Volumenprozent eines C₆-C₁₈-Alkohols oder -Polyols umfasst.
Das Verfahren gemäß Anspruch 13, bei dem der C₆-C₁₈-Alkohol ein C₇-C₉-Alkohol ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 13 oder 14, bei dem der C₆-C₁₈-Alkohol Heptanol, Optanol oder Nonanol ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 13, bei dem das C₆-C₁₈-Polyol 1,2-Octandiol, 1,8-Octandiol, 1,10-Decanol, 1,10-Dodecanol, 1,2-Dihydroxydecan oder 1,2-Dihydroxydodecan ist.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 16, bei dem das organische Lösungsmittel aus C₁-C₃-Alkohol, Aceton, Ethylacetat, Ethyllactat oder Polyethylenglykol ausgewählt ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 17, bei dem das organische Lösungsmittel Ethanol ist.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 18, bei dem die Antikalkbehandlung ferner Wasser oder einen wässrigen Puffer umfasst.
Das Verfahren gemäß Anspruch 13 oder 17, bei dem das organische Lösungsmittel in einer Menge von 35 bis 49 Volumenprozent der Antikalkbehandlungslösung vorliegt, wobei der Rest Wasser oder ein wässriges Lösungsmittelsystem umfasst.
Das Verfahren gemäß Anspruch 20, bei dem Wasser oder ein wässriges Lösungsmittelsystem in einer Menge von mehr als 50 Volumenprozent der Antikalkbehandlungslösung vorliegt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 2, bei dem das Tiergewebe ein Säugetiergewebe ist und die Antikalkbehandlungslösung 1 Volumenprozent bis 25 Volumenprozent eines C₇-C₉-Alkohols oder -Polyols, 25 bis 99 Volumenprozent eines C₁-C₃-Alkohols umfasst, wobei das eventuell verbleibende Volumen aus Wasser oder einem wässrigen Lösungsmittel besteht; unter Bedingungen, die wirksam sind, um eine pathologische Verkalkung des Gewebes im Anschluss an eine Implantation in ein Empfänger-Säugetier zu verringern.
Das Verfahren gemäß Anspruch 22, bei dem der C₁-C₃-Alkohol in einer Menge von 35 bis 45 Volumenprozent der Antikalkbehandlungslösung vorliegt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 22, bei dem der C₇-C₉-Alkohol in einer Menge von 1 bis 10 Volumenprozent der Antikalkbehandlungslösung vorliegt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 22, bei dem der C₇-C₉-Alkohol Octanol ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 22, bei dem das C₇-C₉-Polyol 1,2-Octandiol oder 1,8-Octandiol ist.
Das Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Antikalkbehandlungslösung ferner einen wässrigen Puffer, der aus Phosphat-gepufferter Sole, N,N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure, Morpholinpropansulfonsäure ausgewählt ist, und Puffer, die Borat, Bicarbonat, Carbonat oder Kakodylat umfassen, aufweist.