ES2228647T3 - Tratamientos anti-calcificacion para biomateriales fijos. - Google Patents
Tratamientos anti-calcificacion para biomateriales fijos.Info
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Abstract
Un método para la anticalcificación de un biomaterial reticulado con aldehídos, que comprende poner en contacto el biomaterial con una solución de tratamiento de anticalcificación que comprende de 1% en volumen a 50% en volumen de uno o más alcoholes y/o polioles de C4 o superiores.
Description
Tratamientos anti-calcificación
para biomateriales fijos.
La presente invención se refiere en general al
campo de dispositivos médicos para ser implantados en seres
humanos. Más particularmente, la presente invención se refiere a
métodos para tratar materiales biológicos para ser usados como
dispositivos implantables bioprostéticos.
Las bioprótesis son dispositivos derivados de
tejidos biológicos tratados para ser usados en la implantación en
seres humanos. El desarrollo de estos dispositivos se originó como
un intento de obviar algunas de las complicaciones clínicas
asociadas con el desarrollo temprano de la válvula cardiaca mecánica
y ha dado lugar desde entonces a una rápida proliferación de
dispositivos bioprostéticos para una diversidad de aplicaciones.
Ejemplos de algunas de las bioprotésis actualmente usadas o bajo
desarrollo incluyen válvulas cardiacas, injertos vasculares,
injertos vasculares biohíbridos, sustitutos de ligamentos, parches
pericardiales y otros.
El componente principal de los tejidos biológicos
usado para fabricar bioprótesis es el colágeno, un término genérico
para una familia de proteínas extracelulares relacionadas. Las
moléculas de colágeno consisten en tres cadenas de poliaminoácidos
dispuestas en una configuración trihelicoidal que termina con un
grupo carboxilo no helicoidal y una terminación en amino. Estas
moléculas de colágeno se ensamblan para formar microfibrillas, que
a su vez se ensamblan en forma de fibrillas, dando lugar a fibras
de colágeno. Los aminoácidos que constituyen las moléculas de
colágeno contienen grupos laterales, que incluyen grupos amino
(NH_{2}), ácido carboxílico (COOH) e hidroxilo (OH), además de
los enlaces de amidas de la cadena principal del polímero, todos
los cuales representan sitios para una reacción química potencial
sobre estas moléculas.
Como los tejidos de colágeno se degradan
rápidamente tras la implantación en el recipiente hospedante, es
necesario estabilizar el tejido si va a ser usado para aplicaciones
químicas. La estabilización química mediante la reticulación de
tejidos, también conocida como fijación de tejidos, ha sido
conseguida usando una diversidad de compuestos. Lo más típicamente,
la fijación química ha empleado moléculas polifuncionales que
tienen dos o más grupos reactivos capaces de formar enlaces químicos
estables intramoleculares e intermoleculares con los grupos
laterales de aminoácidos reactivos presentes en las moléculas de
colágeno. La más ampliamente usada de estas moléculas
polifuncionales es la molécula de cinco átomos de carbono,
glutaraldehído, que tiene un aldehído en cada extremo de una cadena
alifática lineal. Los grupos aldehído del glutaraldehído y otras
moléculas similares reaccionan bajo condiciones fisiológicas con
los grupos amino primarios de las moléculas de colágeno para
reticular el material. El tejido reticulado de glutaraldehído
producido de esta forma exhibe una resistencia aumentada a la
degradación enzimática, una inmunogenicidad reducida y una
estabilidad aumentada.
A pesar de su uso ampliamente extendido, hay
ciertas desventajas asociadas con la reticulación de tejidos con
aldehídos polifuncionales y otros agentes reticulantes químicos.
Por ejemplo, tras la implantación, el tejido fijado con aldehído es
susceptible de formar depósitos calcáreos degenerativos. La
calcificación patológica, por ejemplo, el depósito no deseado de
sales minerales de fosfato de calcio en un tejido implantado, puede
representar la causa predominante de fallo de los dispositivos
bioprostéticos fijados con glutaraldehído (Golomb et al.,
1987; Levy et al., 1986; Thubrikar et al., 1983;
Girardot et al., 1995). El mecanismo para la calcificación
patológica de un tejido implantado no está completamente
comprendido, pero puede ser debido a factores del hospedante,
factores del implante y/o factores extraños, como una tensión
mecánica. Adicionalmente, hay alguna evidencia que sugiere que los
depósitos de calcio pueden estar relacionados con células
desvitalizadas y, en particular, con membranas celulares en las que
las bombas de calcio (Ca + 2-Mg + 2 ATPasa)
responsable del mantenimiento de los bajos niveles de calcio
intracelulares ya no funcionan o funcionan incorrectamente.
Un pretratamiento detergente con detergentes
unidos por enlaces no covalentes, como
dodecil-sulfato de sodio (SDS) o detergentes unidos
con enlaces covalentes, como ácido amino-oleico, se
ha descrito que reduce la calcificación de los materiales expuestos
a la sangre en circulación (Gott et al., 1992). Sin embargo,
los detergentes puede afectar adversamente a la estructura y/o
propiedades de los tejidos, dando lugar a una disminución de la
temperatura de desnaturalización del colágeno, o temperatura de
contracción, que es una medida importante de la resistencia,
durabilidad e integridad del material. Además de ello, el uso de
detergentes puede dar lugar a una toxicidad
local.
local.
En otra aproximación, la patente de EE.UU. nº
5.746.775 describe el tratamiento de tejido tratado con
glutaraldehído con alcoholes inferiores (es decir, alcoholes
C_{1}-C_{3}), en el que el alcohol inferior está
presente a más de 50% en volumen en una solución de tratamiento de
alcohol. El método se describe que es útil para preparar un tejido
para una implantación en un ser vivo.
A pesar de los intentos previos para proporcionar
biomateriales que tengan una resistencia a la calcificación,
continua habiendo una necesidad de aproximaciones
anti-calcificación alternativas con una eficacia
mejorada y facilidad de uso. Por tanto, hay una necesidad de un
método eficaz para conferir propiedades
anti-calcificación a largo plazo a materiales
bioprostéticos, por ejemplo, tejidos, que no esté acompañado de
efectos perjudiciales y que incorporen agentes
anti-calcificación y/o tratamientos en los
protocolos existentes para la preparación de biomateriales de
calidad química. La presente invención se dirige a superar o al
menos reducir los efectos de uno o más de los problemas
anteriormente expuestos.
Según un aspecto de la presente invención, se
proporciona un método para tratar un biomaterial que comprende
poner en contacto un biomaterial, como un tejido de animal
reticulado, con una solución de tratamiento
anti-calcificación. Las soluciones de tratamiento
anti-calcificación de este aspecto de la invención
incluyen soluciones comprendidas por alcoholes o polioles superiores
y disolventes orgánicos apróticos polares. Las soluciones de
tratamiento anti-calcificación se ponen en contacto
con el biomaterial bajo condiciones eficaces para reducir la
calcificación patológica del biomaterial a continuación de la
implantación en un hospedante mamífero. Como es ilustra en la
presente memoria descriptiva, esta reducción de la calcificación
puede ser verificada, por ejemplo, evaluando el contenido de calcio
de un biomaterial implantado tratado con una solución de
tratamiento anti-calcificación de la invención
comparado con un biomaterial implantado pero no tratado de esta
forma. Preferentemente, esta reducción de la calcificación será
mayor que 50%, más preferentemente mayor que 75% y lo más
preferentemente mayor que 90%, comparada con un biomaterial
implantado sin tratar.
El alcohol o poliol superior usado en la
formulación de una solución de tratamiento
anti-calcificación puede ser un alcohol o poliol
C_{4}-C_{36} lineal o ramificado. En ciertas
realizaciones preferidas de la invención, el alcohol o poliol
superior se seleccionará entre un alcohol o poliol
C_{6}-C_{18}, preferentemente entre un alcohol o
poliol C_{7}-C_{9}. Normalmente, el alcohol o
poliol superior comprende menos de aproximadamente 50% en volumen
de dicha solución de tratamiento anti-calcificación.
En algunos casos, sin embargo, se deseará usar una solución de
tratamiento anti-calcificación en la que el alcohol
o poliol superior comprenda menos de aproximadamente 25% en volumen
de dicha solución de tratamiento
anti-calcificación, o incluso menos de
aproximadamente 10% en volumen de dicha solución de tratamiento
anti-calcificación. La solución de tratamiento
anti-calcificación de la presente invención puede
comprender adicionalmente al menos un disolvente orgánico
seleccionado, por ejemplo, entre alcoholes
C_{1}-C_{3}. Además de ello, la solución de
tratamiento anti-calcificación puede comprender
también agua o un disolvente acuoso.
Los disolventes orgánicos apróticos polares
útiles para la formulación de las soluciones de tratamiento
anti-calcificación de la presente invención tendrán
preferentemente constantes dieléctricas mayores que aproximadamente
20, más preferentemente mayores que aproximadamente 30 y poseerán
algún grado de solubilidad en agua. Los disolventes orgánicos
apróticos polares útiles en este aspecto de la invención incluyen,
por ejemplo, N-alguil-pirrolidinonas
y N-alquil-amidas, en las que el
grupo o grupos alquilo comprenden cadenas alquílicas lineales o
ramificadas que tienen de aproximadamente 1 a 10 átomos de carbono.
Los disolventes ilustrativos de esta clase incluyen
N-metil-pirrolidinona,
N,N-dimetilacetamida,
N,N-dimetilformamida,
N,N-dimetilpropionamida y similares.
En un aspecto adicional de la presente invención,
se proporciona un método para tratar un tejido de animal reticulado
con aldehído formando una solución de tratamiento
anti-calcificación comprendida por al menos un
disolvente orgánico y de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 25%
en volumen de un alcohol o poliol C_{6}-C_{18},
y poner en contacto la solución de tratamiento
anti-calcificación con el biomaterial reticulado con
aldehído bajo condiciones eficaces para reducir la calcificación
patológica del biomaterial a continuación de la implantación en un
hospedante mamífero. Como se describió anteriormente, una solución
de tratamiento anti-calcificación de la invención
puede contener uno o más disolventes orgánicos y puede comprender
adicionalmente agua o un sistema disolvente acuoso compatible. En
una realización ilustrativa de este aspecto de la invención, un
disolvente orgánico está presente de aproximadamente 35% a
aproximadamente 49% en volumen de dicha solución de tratamiento
anti-calcificación, y el resto está comprendido por
dicha agua y disolvente acuoso. En esta realización, es preferido
que el agua o disolvente acuoso esté presente a más de
aproximadamente 50% en volumen de dicha solución de tratamiento
anti-calcificación.
Todavía, en un aspecto adicional de la presente
invención, se proporciona un método para tratar un tejido de
mamífero reticulado con aldehído proporcionando una solución de
tratamiento anti-calcificación comprendida por
aproximadamente 0,1% a aproximadamente 25% en volumen de un alcohol
o poliol C_{6}-C_{18}, aproximadamente 25% a
aproximadamente 99% en volumen de un disolvente orgánico
seleccionado entre un alcohol C_{1}-C_{3}, y el
volumen restante, si lo hay, está comprendido por agua o un
disolvente acuoso; y poner en contacto la solución de tratamiento
anti-calcificación con un biomaterial reticulado
con aldehído durante un período eficaz para reducir la
calcificación patológica del biomaterial a continuación de la
implantación en un hospedante mamífero. Una realización ilustrativa
de este aspecto de la invención emplea un disolvente orgánico que
está presente de aproximadamente 35% a aproximadamente 45% en
volumen de la solución de tratamiento
anti-calcificación y un alcohol o poliol superior
que está presente de aproximadamente 1% a aproximadamente 10% en
volumen de la solución de tratamiento
anti-calcificación.
En otro aspecto de esta invención, se proporciona
un método para tratar un biomaterial, que comprende poner en
contacto un biomaterial reticulado con aldehído con una solución de
tratamiento anti-calcificación comprendida por
N-metil-pirrolidinona,
N,N-dimetilacetamida,
N,N-dimetilformamida y/o
N,N-dimetilpropionamida bajo condiciones eficaces
para reducir la calcificación patológica del biomaterial a
continuación de la implantación en un hospedante mamífero.
En otro aspecto de esta invención, se proporciona
un método para tratar un biomaterial, preferentemente un tejido de
animal reticulado, poniendo en contacto un biomaterial con una
solución de tratamiento anti-calcificación a una
temperatura entre aproximadamente 30º y 60ºC durante un período y
bajo unas condiciones eficaces para reducir la calcificación
patológica del biomaterial a continuación de la implantación en un
hospedante mamífero. Las soluciones de tratamiento
anti-calcificación comprenden entre aproximadamente
10% y aproximadamente 50% en volumen, preferentemente entre
aproximadamente 25% y 50% en volumen de un alcohol
C_{1}-C_{3}, como metanol, etanol, propanol o
isopropanol y el volumen restante está comprendido por agua o un
tampón acuoso, como HEPES.
Se describen a continuación realizaciones
ilustrativas de la invención. Para una mayor claridad, no todas las
características de una materialización real son descritas en esta
memoria descriptiva. Naturalmente, se apreciará que en el
desarrollo de cualquier realización real, se deben hacer numerosas
decisiones específicas para la materialización para conseguir los
objetivos específicos en desarrollo, como el cumplimiento de las
restricciones relacionadas con el sistema y relacionadas con el
negocio, que variarán de una materialización a otra. Además de ello,
se apreciará que este esfuerzo de desarrollo puede ser complejo y
puede requerir tiempo, pero no obstante sería una rutina a entender
para los expertos ordinarios en la técnica que aprovechan las
ventajas de esta descripción.
El término "biomaterial" se usa en la
presente memoria descriptiva para hacer referencia generalmente a
materiales biológicamente derivados que contienen colágeno. Por
ejemplo, pueden ser usados diversos tipos de tejidos biológicos
implantables derivados de numerosas fuentes animales y partes de la
anatomía como biomateriales de acuerdo con esta invención. El tejido
puede derivar, por ejemplo, de fuentes animales como seres humanos,
bovino, porcino, equino, ovino, canguros, conejos y otros. Ejemplos
ilustrativos de tejidos de animales usados de acuerdo con la
presente invención incluyen, pero sin limitación, válvulas
cardiacas, particularmente válvulas cardiacas porcinas o bovinas;
orígenes, paredes y/o terminaciones aórticas; pericardio,
materiales derivados de tejidos conectivos como duramadres; tejidos
de homoinjertos como homoinjertos aórticos e injertos de
desviaciones de arterias safenas; tendones, ligamentos, parches
para la piel; arterias; venas y similares. Naturalmente, otros
materiales biológicamente derivados que se conoce que son adecuados
para usos de alojamiento interior en el cuerpo de un ser vivo están
también contemplados dentro de la invención. Para algunas
aplicaciones, puede ser deseado manipular el biomaterial de alguna
manera con el fin de proporcionarlo en una forma o conformación
particular, por ejemplo, usando pinzas metálicas antes de los
tratamientos descritos en la presente memoria descriptiva. De esta
forma, el biomaterial puede ser reticulado y/o tratado con alcoholes
en la configuración geométrica tridimensional particular de las
bioprótesis que van a ser implantadas.
Normalmente, el biomaterial tratado según esta
invención está comprendido por un biomaterial que ha sido
fijado/reticulado mediante un tratamiento con uno o más agentes
reticulantes químicos u otros tratamientos que efectúan la
reticulación. Estos pueden incluir, por ejemplo, tratamientos con
aldehídos polifuncionales, epóxidos polifuncionales,
foto-oxidación y/o cualesquiera otros agentes
reticulantes o tratamientos que favorezcan las reacciones entre
grupos de ácido carboxílico y amina, como hidrocloruro de
N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida
(EDC). Naturalmente, los tratamientos de
anti-calcificación de esta invención son usados
preferentemente de forma conjunta con agentes reticulantes o
tratamientos que aumenten la propensión de un biomaterial a
calcificar a continuación de una implantación en un hospedante
vivo.
En una realización de la invención, el
biomaterial es uno que ha sido reticulado mediante tratamiento con
un aldehído monofuncional, un aldehído polifuncional o alguna
combinación de los mismos. Un "aldehído monofuncional" se
refiere a una molécula que contiene una única funcionalidad de
aldehído, como formaldehído, mientras que "aldehído
polifuncional" se refiere a una molécula que contiene dos o más
funcionalidades de aldehído. Los demás constituyentes presentes en
el aldehído monofuncional o polifuncional no son críticos con la
condición de que no afecten adversamente a la capacidad de los
grupos aldehído para ser reactivos con colágeno, y ser así capaces
de producir tejidos biológicos reticulados. Ejemplos de aldehídos
monofuncionales y polifuncionales comúnmente usados en los métodos
de fijación de biomateriales para producir biomateriales reticulados
incluyen compuestos de aldehídos que contienen un componente
alifático que comprende una cadena alifática saturada o insaturada,
lineal o ramificada, que tiene de aproximadamente 2 a
aproximadamente 36 átomos de carbono. Lo más preferentemente, los
procedimientos de reticulación emplean el uso de un aldehído
polifuncional que tiene de 2 a aproximadamente 10 átomos de
carbono, como el (alquil lineal de 5 átomos de
carbono)-dialdehído, glutaraldehído.
Como se usan en la presente memoria descriptiva,
las expresiones "biomaterial fijado con aldehído" o
"biomaterial reticulado con aldehído" se refiere a un
biomaterial que ha sido tratado con uno o más compuestos de
aldehídos monofuncionales y/o polifuncionales. Las técnicas y
condiciones para tratar biomateriales con agentes reticulantes que
contienen aldehídos son bien conocidas y están fácilmente
disponibles para los expertos en la técnica (por ejemplo, véase
Zilla et al.). En estos procedimientos, un biomaterial es
puesto en contacto normalmente con una solución de aldehído durante
un período y bajo condiciones eficaces para dar lugar al grado
deseado de reticulación del colágeno y otras proteínas celulares en
el tejido. Los procedimientos para verificar el progreso y/o la
compleción de la reacción de reticulación son también bien
conocidos. Por ejemplo, el grado de reticulación de un tejido
tratado puede ser verificado evaluando su temperatura de
contracción y/o la cantidad de proteínas extraíbles presentes en el
material.
El experto en esta técnica reconocerá que el
período de la reacción de reticulación según esta invención no es
crítico en la medida en que el biomaterial y el agente reticulante
permanezcan en contacto durante un período de tiempo suficiente
para permitir que se produzca la reticulación. El tiempo de
tratamiento variará naturalmente dependiendo del tipo de biomaterial
que esté siendo tratado, el aldehído particular usado y/o la
concentración del aldehído en la solución reticulante. Normalmente,
la duración de la reacción será de aproximadamente un minuto a
varios días. Sin embargo, el tiempo de tratamiento no debe ser tan
largo que afecte adversamente al biomaterial reticulado. Tiempos de
reticulación de varios días o más no son inusuales. Sin embargo, el
biomaterial puede ser tratado también durante períodos más cortos,
por ejemplo, desde aproximadamente 1 minuto hasta aproximadamente
doce horas, o durante aproximadamente una hora a aproximadamente
seis horas, con la condición de que se consiga el grado deseado de
reticulación.
Las temperaturas y/o presiones de reacción
empleadas en una reacción de reticulación normal no son críticas y
pueden incluir esencialmente cualesquiera condiciones que sean
eficaces para permitir que se produzca la reacción de reticulación
mientras no comprometan adversamente al progreso de la reacción o a
la integridad del biomaterial que esté siendo tratado. La
identificación de las condiciones óptimas de temperatura y presión
para una materialización particular de la presente invención pueden
ser fácilmente determinadas por el individuo experto en esta
técnica. Generalmente, la reacción de reticulación puede ser
llevada a cabo a temperatura ambiente, o a cualquier otra
temperatura conveniente que no sobrepase sustancialmente la
temperatura de desnaturalización del tejido de aproximadamente
62ºC. Por tanto, las temperaturas de la reacción pueden ser
seleccionadas desde un intervalo de temperaturas de aproximadamente
0ºC hasta aproximadamente 60ºC, preferentemente desde
aproximadamente 20ºC hasta aproximadamente 50ºC. Aunque la presión
para una reacción normal varía generalmente en el intervalo de
aproximadamente 2 mm de Hg hasta aproximadamente 6 mm de Hg, las
presiones adecuadas pueden ser tan elevadas como 100 mm de Hg, o
más si se desea.
Después de que el biomaterial es reticulado de
esta manera, el tejido es opcionalmente lavado/aclarado, y puesto en
contacto con una solución de tratamiento de anticalcificación. Las
soluciones de tratamiento de anticalcificación de la presente
invención incluyen soluciones comprendidas por alcoholes o polioles
superiores, (es decir, moléculas orgánicas que contienen dos
funcionalidades de alcohol), disolventes apróticos polares como
N-metil-pirrolidinona y soluciones
comprendidas por menos de aproximadamente 50% en volumen de uno o
más alcoholes inferiores (C_{1}-C_{3}).
Por lo tanto, según una realización de la
presente invención, las soluciones de tratamiento de
anticalcificación están comprendidas por uno o más alcoholes o
polioles superiores es (por ejemplo, un alcohol o poliol de C_{4}
a C_{36}). El alcohol o poliol superior será normalmente un
alcohol o poliol alifático lineal o ramificado, y puede contener
restos o sustituyentes químicos adicionales con la condición de que
no interfieran inaceptablemente con os efectos de anticalcificación
descritos en la presente memoria descriptiva. En una realización
ilustrativa de la invención, los alcoholes superiores usados para
formular una solución de tratamiento de anticalcificación son
alcoholes primarios, secundarios o terciarios seleccionados entre
alcoholes alifáticos C_{6}-C_{18} lineales o
ramificados como hexanol, heptanol, octanol, nonanol, etc., o
polioles C_{6}-C_{18} lineales o ramificados
seleccionados entre 1,2-octanodiol (también
denominado a veces 1,2-dihidroxioctano),
1,8-octanodiol, 1,10-decanol,
1,10-dodecanol, 1,2-dihidroxidecano
y 1,2-dihidroxidodecano. En ciertas realizaciones
ilustrativas de la invención, los alcoholes o polioles superiores
están presentes a menos de aproximadamente 50%, menos de
aproximadamente 25% o menos de aproximadamente 10% en volumen de la
solución de tratamiento de anticalcificación, y el resto está
comprendido por un disolvente orgánico. Por tanto, además de los
alcoholes o polioles superiores anteriormente descritos, la
solución de tratamiento de anticalcificación de la presente
invención puede comprender adicionalmente uno o más disolventes
orgánicos. Los disolventes orgánicos usados según la presente
invención son preferentemente seleccionados entre los que no tienen
efectos perjudiciales sobre el tejido que está siendo tratado o
sobre los efectos de anticalcificación conseguidos mediante el uso
de la solución de tratamiento de anticalcificación. Los disolventes
orgánicos deben ser capaces de disolver adecuadamente el alcohol o
poliol superior para formar una solución de tratamiento de
anticalcificación homogénea. Los disolventes orgánicos que pueden
mejorar, aumentar o facilitar de algún otro modo los efectos de
anticalcificación de los alcoholes o polioles superiores de esta
invención, naturalmente son particularmente preferidos. Los
disolventes orgánicos útiles según esta realización incluyen
alcoholes inferiores (por ejemplo, alcoholes
C_{1}-C_{3}), acetona, acetato de etilo, lactato
de etilo, polietilenglicol y similares.
Las soluciones de tratamiento de
anticalcificación según ciertas realizaciones de la invención
comprenden uno o más alcoholes y/o polioles en una mezcla
preferentemente homogénea con uno o más disolventes orgánicos. Por
ejemplo, las soluciones de tratamiento de alcoholes particularmente
ilustrativas comprenden de aproximadamente 0,1% a aproximadamente
25% en volumen de uno o más alcoholes o polioles superiores, y
sustancialmente la totalidad del resto de dicha solución está
comprendida por el disolvente orgánico. Las soluciones de
tratamiento de anticalcificación ilustrativas adicionales comprenden
de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10% en volumen de uno o
más alcoholes o polioles superiores, y sustancialmente la totalidad
del resto de la solución está comprendida por un disolvente
orgánico.
Alternativamente, el o los alcoholes o polioles
superiores de la solución de tratamiento de anticalcificación
pueden ser formulados en un sistema disolvente acuoso, por ejemplo,
con agua o con cualquiera de una diversidad de sistemas tamponantes
acuosos, o pueden ser formulados en una mezcla de un sistema
disolvente acuoso y uno o más disolventes orgánicos. Algunos
alcoholes o polioles superiores pueden exhibir una escasa
solubilidad en sistemas de base acuosa, pero tener una mayor
solubilidad en muchos disolventes orgánicos. Por tanto, en las
realizaciones que emplean un sistema disolvente de base acuosa, en
algunos casos será preferido que uno o más disolventes orgánicos
sean también empleados en una cantidad al menos suficiente para
disolver el alcohol o poliol superior para proporcionar una solución
de tratamiento de anticalcificación homogénea, es decir,
sustancialmente de fase única.
Por lo tanto, en realizaciones adicionales de la
invención, las soluciones de tratamiento de anticalcificación están
comprendidas por aproximadamente 0,1 a aproximadamente 25% en
volumen de uno o más alcoholes o polioles superiores,
aproximadamente 25% a aproximadamente 49% en volumen de uno o más
disolventes orgánicos, y sustancialmente la totalidad del resto de
dicha solución es agua o una solución de base acuosa. Otras
realizaciones de la invención proporcionan una solución de
tratamiento de anticalcificación comprendida por aproximadamente
0,1% a aproximadamente 10% en volumen de uno o más alcoholes o
polioles superiores, aproximadamente 35 a aproximadamente 45% en
volumen de uno o más disolventes orgánicos, y sustancialmente la
totalidad del resto de dicha solución es agua o una solución de
base acuosa.
En otra realización de esta invención, la
solución de tratamiento de anticalcificación está comprendida por
uno o más disolventes apróticos polares. Estos disolventes pueden
incluir, por ejemplo,
N-alquil-pirrolidinonas y
N-alquil-amidas, en las que el grupo
o grupos alquilo comprenden cadenas alquílicas lineales o
ramificadas que tienen de aproximadamente 1 a 10 átomos de carbono.
Los disolventes ilustrativos de este tipo incluyen
N-metil-pirrolidinona,
N,N-dimetilacetamida,
N,N-dimetilformamida,
N,N-dimetilpropionamida y similares. Los disolventes
apróticos polares particularmente preferidos incluyen los que
tienen algún grado de solubilidad en agua y/o los que tienen
constantes dieléctricas elevadas, por ejemplo, los que tienen
constantes dieléctricas mayores que aproximadamente 20,
preferentemente mayores que aproximadamente 30.
Todavía, en otra realización de la invención, las
soluciones de tratamiento de alcoholes inferiores
(C_{1}-C_{3}), que comprenden menos de 50% en
volumen del alcohol inferior, preferentemente entre aproximadamente
25% y 50%, son también adecuadas como soluciones de tratamiento de
anticalcificación. Aunque los intentos de tratamiento de
anticalcificación anteriores que usa las soluciones de alcoholes
inferiores como estos han sido insatisfactorios, se ha encontrado
ahora que se pueden conseguir de hecho efectos de anticalcificación
significativos poniendo en contacto un biomaterial con una solución
de tratamiento de alcohol inferior a una temperatura en el intervalo
de aproximadamente 30ºC a aproximadamente 60ºC, preferentemente
entre aproximadamente 35ºC y 45ºC. Estas temperaturas de
tratamiento mejoran la eficacia de las soluciones de tratamiento de
anticalcificación de esta realización, facilitando posiblemente la
difusión y penetración de los alcoholes inferiores en el
biomaterial. Preferentemente, el tratamiento según esta realización
es realizado mediante la agitación de la solución de tratamiento de
anticalcificación mientras está en contacto con el biomaterial.
El biomaterial reticulado es puesto en contacto o
expuesto de alguna otra forma con una solución de tratamiento de
anticalcificación de la presente invención durante un período de
tiempo suficiente para hacer que el biomaterial sea más resistente
a la calcificación patológica in vivo que un biomaterial que
no haya sido tratado con la solución de tratamiento de
anticalcificación. La duración de la exposición en las
realizaciones descritas en la presente memoria descriptiva es
solamente ilustrativa y se puede variar por los expertos en la
técnica mientras se consiga un resultado deseado. Para las
realizaciones de la invención en las que el biomaterial es sumergido
o mojado en una solución de tratamiento de anticalcificación
líquida, el tiempo de exposición estará normalmente en el intervalo
de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 96 horas. Para algunos
biomateriales, la exposición excesiva a la solución de tratamiento
de anticalcificación puede dar lugar a una disminución de los
efectos de anticalcificación, o puede necesitar la rehidratación del
tejido.
El procedimiento de tratamiento puede ser llevado
a cabo a temperatura ambiente o sus proximidades (por ejemplo,
aproximadamente 25ºC) si se desea. Sin embargo, puede ser usada
también cualquier temperatura de conveniencia que no sea
perjudicial para el biomaterial, por ejemplo de aproximadamente 4ºC
a aproximadamente 60ºC. Como se expuso anteriormente, puede ser
deseado y/o necesario de hecho en algunas realizaciones usar una
temperatura de incubación mayor que la temperatura ambiente con el
fin de mejorar la eficacia del procedimiento de tratamiento, por
ejemplo, aumentando la velocidad y/o el grado de difusión y
penetración de las soluciones de anticalcificación en el
biomaterial.
El biomaterial será tratado normalmente mediante
un contacto con una solución de tratamiento de anticalcificación
líquida. Sin embargo, se podría adoptar también otras
aproximaciones, como la aplicación de vapor, plasma y/o materiales
criogénicos. Independientemente del método de exposición, el período
de tiempo debe ser suficiente para inhibir la calcificación, pero
no tan largo que provoque una deshidratación irreparable del tejido
por cualquiera de los constituyentes de la solución de tratamiento
de anticalcificación. En ciertas realizaciones, el biomaterial es
removido o agitado de algún otro modo durante la exposición a la
solución de tratamiento de anticalcificación con el fin de
facilitar una mayor penetración de los constituyentes de la
solución en el biomaterial. La agitación se puede realizar de
cualquier manera conveniente, como mediante el uso de un vibrador
orbital o eje vibrador, o por agitación manual.
En algunos casos, será preferido formular una
solución de tratamiento de anticalcificación que esté tamponada en
un sistema disolvente acuoso, por ejemplo a un pH entre
aproximadamente 6,0 y 8,0, preferentemente a un pH entre
aproximadamente 7,0 y 7,6. Los tampones adecuados para ser usados a
este respecto incluyen tampones que tienen una capacidad tamponante
suficiente para mantener un pH fisiológicamente aceptable y que no
provoquen efectos perjudiciales sobre el biomaterial o interfieran
con el procedimiento de tratamiento que esté siendo realizado. Los
tampones ilustrativos incluyen solución salina tamponada con
fosfato (PBS), tampones orgánicos como ácido
N,N-2-hidroxietilpiperazino-N'-2-etanosulfónico
(HEPES) y ácido morfolino-propanosulfónico (MOPS) y
tampones que incluyen borato, bicarbonato, carbonato, cocadilato y
similares. Muchos sistemas tamponantes acuosos adicionales y otros
adecuados para ser usados en la presente invención serán evidentes
para el experto en la técnica.
El biomaterial que ha sido tratado con una
solución de tratamiento de anticalcificación puede ser aclarado
antes de la implantación o almacenamiento para separar cualesquiera
componentes no deseados y/o perjudiciales producidos o usados en el
protocolo de tratamiento del biomaterial, como debris celular o
fragmentos de aldehídos de un pretratamiento con aldehídos. Como se
usa en la presente memoria descriptiva, el término "aclarado"
incluye someter el biomaterial a una solución de aclarado, que
incluye un tratamiento continuo o discontinuo, en el que el
biomaterial es colocado en una solución de aclarado que puede ser
periódicamente retirada y sustituida con solución de nueva
aportación a intervalos predeterminados. Durante el aclarado, el
tejido es preferentemente sometido a vibraciones, o
intermitentemente agitado, para asegurar una distribución uniforme
de la solución de aclarado. Ilustrativamente, un aclarado puede
comprender mojar el biomaterial en solución de aclarado de nueva
aportación que es sustituida varias veces durante un período de
aproximadamente una hora o menos. Alternativamente, la solución de
aclarado puede ser sustituida a intervalos de varias horas o más
durante un período de aclarado más largo, como aproximadamente 24
horas. Ejemplos de soluciones de aclarado incluyen soluciones
fisiológicamente adecuadas como agua, solución salina, PBS,
solución salina tamponada con HEPES, lactato de Ringers (pH 7,4),
bicarbonato de sodio (pH 7,4), Tris (pH 7,4), imidazol (pH 7,4) y
similares.
Posteriormente al aclarado, el biomaterial
tratado está preparado para una implantación o puede ser
esterilizado y almacenado hasta ser usado. El almacenamiento en
soluciones de glutaraldehído estándar del tipo normalmente usado
para un almacenamiento a largo plazo de bioprótesis de calidad
clínica puede invertir parcialmente los efectos ventajosos
conseguidos mediante el método de tratamiento de la presente
invención. Por tanto, puede ser ventajoso almacenar el biomaterial
tratado en una solución que contenga un alcohol o poliol, como una
solución de alcohol-glutaraldehído, preferentemente
bajo condiciones que mantengan las propiedades de inhibición de la
calcificación del material tratado.
En otras realizaciones de la invención, los
biomateriales que hayan sido tratados de acuerdo con el método de
la invención son almacenados en un entorno exento de aldehídos. Por
ejemplo, el tejido tratado puede ser colocado en bolsas
esterilizadas y sometido a una radiación esterilizante, como una
radiación gamma. Naturalmente, el método de tratamiento de la
presente invención será compatible con muchos otros conservantes
esterilizantes conocidos y/o técnicas que son conocidas por los
expertos en la técnica.
En realizaciones adicionales, la solución de
tratamiento de anticalcificación de la presente invención puede
comprender adicionalmente uno o más agentes de anticalcificación
adicionales, que incluyen, pero sin limitación, una sal soluble de
un catión metálico, como Al+3 ó Fe+3, preferentemente en un
intervalo de concentraciones de 0,001 M a 0,1 M. Las sales de
aluminio solubles en agua, por ejemplo, que son agentes de
anticalcificación adicionales adecuados para ser usados en la
práctica de la presente invención, incluyen, sin limitación,
clorato de aluminio, lactato de aluminio, sulfato de
aluminio-potasio, sulfato de
aluminio-sodio, sulfato de aluminio, nitrato de
aluminio y cloruro de aluminio. También, las sales férricas solubles
en agua, como cloruro férrico, nitrato férrico, bromuro férrico,
edentato de sodio-férrico, sulfato férrico y
formiato férrico, están también dentro de lo contemplado por la
invención. Naturalmente, cualquier sal de sodio o hierro que sea
soluble en el sistema disolvente de la solución de tratamiento,
puede ser usada en la práctica de la invención.
Aunque no se desean vinculaciones de carácter
teórico, lo que sigue puede explicar, al menos en parte, ciertas
ventajas realizadas mediante el empleo de soluciones de tratamiento
de anticalcificación según la presente invención. En tejidos y
células vivos, la concentración de calcio extracelular normal es
aproximadamente 1 mM y la concentración de calcio intracelular es
aproximadamente 0,1 \muM. Este gradiente de concentración elevado
de calcio entre las zonas extracelulares e intracelulares es
mantenido mediante bombas dependientes de energía metabólica
bioquímica a través de las membranas de plasma de las células. Tras
la fijación, estas fuerzas bioquímicas no son activas, y esto da
lugar a una concentración elevada de calcio por toda la matriz de
tejido fijado. Las membranas de plasma y los organelos unidos a
membranas tienen un elevado contenido de fosfolípidos, que
proporciona fósforo para la formación de fosfato de calcio. En el
entorno in vivo, la concentración elevada de calcio en el
tejido fijado acoplado a la fuente de fósforo de los lípidos puede
favorecer condiciones para la cristalización de fosfato de calcio.
Sin embargo, los constituyentes de las soluciones de tratamiento de
anticalcificación usadas según esta invención pueden ser altamente
eficaces para penetrar la matriz de tejidos, interaccionando y
posiblemente facilitando la separación de fosfolípidos y otro debris
celular del biomaterial reticulado, interfiriendo así con la
capacidad de estos componentes para contribuir al procedimiento de
cristalización.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para
demostrar ciertas realizaciones ilustrativas de esta invención.
Debe apreciarse por los expertos en la técnica que las técnicas
descritas en los ejemplos que siguen representan las encontradas
por los inventores para actuar en la práctica de la invención y,
por lo tanto, se puede considerar que constituyen ejemplos de modos
ilustrativos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la
técnica, teniendo en cuenta la presente descripción, deben apreciar
que se pueden hacer muchos cambios en las realizaciones específicas
que se describen y obtener todavía un resultado análogo o similar
sin apartarse de las características generales y el alcance de la
invención.
Se obtuvo pericardio bovino de reciente
aportación del matadero, se recortó para suprimir el exceso de
grasa y se almacenó en una solución de osmolaridad elevada hasta
ser usado. Antes de la fijación, el tejido se aclaró a fondo en
solución salina tamponada con fosfato (PBS) que tenía un pH de
7,3-7,4. Se preparó una solución al 0,25% de
glutaraldehído añadiendo 2,5 ml de una solución de glutaraldehído
al 50% (Aldrich Chemical) a 500 ml usando PBS. Se añadieron 50
muestras de 1 cm x 1 cm de tejido de pericardio bovino a la
solución de glutaraldehído y el tubo se almacenó a temperatura
ambiente durante 7 días.
En una campana esterilizada, se lavaron trozos de
pericardio bovino fijado con glutaraldehído con PBS esterilizada (3
lavados, 10 minutos cada uno). Las muestras se sumergieron
seguidamente en una solución filtrada y esterilizada de 40% de
etanol, 5% de octanol, 55% de agua y se trataron durante 24 horas a
temperatura ambiente. El tejido se lavó seguidamente con PBS
esterilizada (3 lavados, 10 minutos cada uno) y en etanol al 40%
filtrado y esterilizado en PBS durante aproximadamente 30 minutos.
Las muestras se almacenaron en 40 ml de PBS durante aproximadamente
1 día antes de usarlas para estudios de implantación en ratas.
En una instalación separada, se trataron cinco
muestras de 1 cm x 1 cm de tejido de pericardio bovino fijado con
glutaraldehído (glutaraldehído al 0,25%, 16 h) con una solución
comprendida por 40% de etanol, 5% de octanol y 55% de agua durante
30 minutos. Se trataron 5 muestras adicionales en la solución
durante 24 h. Después del tratamiento, las muestras se lavaron con
PBS 30 ml x 3) y se almacenaron en etanol al 45%. Las muestras se
analizaron seguidamente para evaluar la presencia de proteínas
extraíbles y para determinar las temperaturas de contracción.
La reticulación del tejido biológico da lugar a
menos proteína extraíble en el material. Los ensayos de extracción
de proteínas se realizaron extrayendo 10-20 mg de
tejido con 10-20 \mul de una solución de
extracción que contenía Tris-HCl 50 mM, 10% de
glicerol, 4% de mercaptoetanol, 1% de
dodecil-sulfato de sodio, NaCl 0,5 M y 0,01% de
azul de bromofenol. La solución extraída se analizó seguidamente en
un gel preparado de 4-20% de
acrilamida:bisacrilamida (37,5:1) Mini-PROTEAN II
(Biorad Inc.).
Las temperaturas de contracción de los tejidos
tratados se determinaron también usando análisis calorimétrico de
exploración diferencial estándar. Normalmente, se calentaron
2-10 mg de tejido a la velocidad de 10ºC por minuto
bajo una atmósfera de nitrógeno. El comienzo de la endotermia
observado a aproximadamente 60-90ºC es
convencionalmente atribuido a una transición de la contracción, y
se usó como la temperatura de contracción. Un aumento en la
temperatura de contracción es una indicación de que se ha producido
la reticulación.
Los resultados de las determinaciones de
proteína extraíble y la temperatura de contracción se resumen en la
Tabla 1 siguiente:
A partir de estos resultados, está claro que el
tratamiento no provocó ninguna degradación del tejido fijado con
glutaraldehído, según se pone de manifiesto por la ausencia de
proteínas extraíbles. Además de ello, ni los tratamientos de 1 hora
ni los de 24 horas alteraron sustancialmente los valores de las
temperaturas de contracción, indicando que el tratamiento no alteró
las propiedades físicas del tejido fijado con glutaraldehído.
Antes de la implantación, las muestras fueron
aclaradas 3 veces durante 3 minutos cada una en recipientes de 500
ml de PBS esterilizado, acompañado de agitación suave. Las muestras
tratadas y no tratadas fueron implantadas por vía subcutánea usando
procedimientos quirúrgicos estándar aproximadamente a 1 cm desde la
línea media abdominal en ratas Sprague-Dawley de 3
semanas de edad. El tejido implantado se recuperó después de 60
días.
Tras la retirada, las muestras de tejidos fueron
tratadas usando métodos histológicos estándar y teñidas con
H&E, tricromo de von Kossa y Masson. La tinción de von Kossa
identifica la calcificación del tejido. El alcance de la
calcificación mediante la tinción de von Kossa se graduá de 0 (nada)
a 5 (grave).
El contenido de calcio de las muestras
recuperadas se determinó hidrolizando las muestras bajo condiciones
ácidas y analizando las muestras digeridas usando espectroscopía de
emisión de plasma inductivamente acoplado (ICP) estándar.
Normalmente, aproximadamente 0,5 g del tejido explantado se secan,
se pesan y se hidrolizan bajo condiciones ácidas. La muestra
digerida resultante se diluyó con agua y se analizó usando un
espectrofotómetro ICP (Varian Inc.; Liberty100/200
ICP-OCS).
Los resultados de estos experimentos se resumen
en la Tabla 2 siguiente:
La tendencia del tejido fijado con glutaraldehído
a calcificar en el modelo de rata está bien documentada en la
bibliografía, y esto fue confirmado por los experimentos del
solicitante. Sin embargo, las muestras fijadas con glutaraldehído y
tratadas con una solución de tratamiento de anticalcificación que
contenía un alcohol superior (por ejemplo, octanol) exhibieron una
reducción significativa de la calcificación en comparación con las
no tratadas. Las muestras tratadas con una solución de etanol al
45% durante 24 horas a temperatura ambiente mostraron valores
similares a los valores de los testigos.
En una campana esterilizada, trozos de tejido de
pericardio bovino fijado con grutaraldehído (Mitroflow Inc.;
Richmond, British Columbia, Canadá) tejido cuspidal porcino
(Labcor; Belo Horizonte, Brasil) y tejido de pared porcina (Labcor
Inc.) fueron transferidos a tubos esterilizados que contenían
soluciones de 1,2-octanodiol (5% de
1,2-octanodiol (Aldrich Chemical), 40% de etanol y
55% de tampón HEPES 10 mM). Los tubos fueron transferidos a un
incubador a 37ºC y mantenidos a 37ºC con agitación suave durante
aproximadamente 16 horas. Después del tratamiento, las muestras
fueron transferidas a soluciones que contenían 22% de etanol en
HEOES 10 mM y almacenadas durante 14 días a 4ºC. La relación final
de tejido a volumen para todos los tratamientos fue de
aproximadamente 27 ml/g.
Para los tratamientos con
N-metil-pirrolidinona (NMP), trozos
de tejido de pericardio bovino fijado con glutaraldehído (Microflow
Inc.), tejido de valva porcina (Labcor Inc.) y tejido de pared
porcina (Labcor Inc.) fueron transferidos a tubos esterilizados que
contenían NMP. Los tubos fueron incubados a temperatura ambiente
durante aproximadamente 16 horas con agitación manual ocasiona.
Después del tratamiento, las muestras de tejidos fueron transferidas
a soluciones de etanol tamponadas con 22% de HEPES y almacenadas
durante 14 días a 4ºC.
Las muestras tratadas con las soluciones de
1,2-octanodiol y con NMP, así como las muestras sin
tratar de cada tipo de tejido, fueron proporcionadas a los
laboratorios Charles Rivers (Wilmington, MA) para su implantación en
ratas. Fueron analizadas siete ratas por grupo de tratamiento.
Antes de la implantación, las muestras de tejidos fueron aclaradas
durante 3 minutos 3 veces en PBS esterilizada, acompañado de
agitación suave. Las muestras fueron implantadas por vía subcutánea
aproximadamente a 1 cm desde la línea media abdominal en ratas
Sprague-Dawley de 3 semanas de edad y recuperadas
después de 60 días de implantación. Las muestras no implantadas (una
por tipo de tejido por tratamiento) fueron usadas como testigos no
implantados. Después de la recuperación, las muestras fueron
analizadas en cuanto a los contenidos de calcio y fósforo usando
una metodología ICP estándar.
Los resultados de estos experimentos se resumen a
continuación en la Tabla 3.
Los testigos no implantados tenían niveles muy
bajos de calcio y fósforo (no mostrados). A partir de la Tabla
anterior, sin embargo, se puede observar que las muestras de
tejidos explantados que no habían sido tratadas con una solución de
tratamiento de anticalcificación tenían niveles muy elevados de
calcio y fósforo. Estos se observó independientemente del tipo de
tejido. Por otra parte, los tejidos explantados que habían sido
tratados con solución de 1,2-octanodiol o bien con
NMP tenían niveles de calcio y fósforo significativamente reducidos.
De forma interesante, aunque los niveles fueron reducidos para
todos los tipos de tejidos, el efecto fue lo más pronunciado con
pericardio bovino.
Las muestras de tejidos explantadas fueron
también seccionadas, teñidas con H&E y evaluadas
histológicamente en cuanto a la inflamación, vascularización y
organización de colágeno. Las muestras tratadas con
1,2-octanodiol, las muestras tratadas con NMP y las
muestras testigos tenían una graduación histológica similar,
indicando que los tratamientos de anticalcificación no alteraron la
respuesta biológica por el animal hospedante.
Para estos experimentos, se colocaron muestras de
pericardio bovino en soluciones al 0,25% de glutaraldehído en PBS,
en la que permanecieron a temperatura ambiente durante
aproximadamente 7 días. Los tejidos reticulados fueron seguidamente
sometidos a tratamientos con 1,2-octanodiol o NMP,
como se describió anteriormente. Las muestras tratadas fueron
seguidamente analizadas en cuanto a proteínas extraíbles y para
determinar las temperaturas de contracción.
Además, se realizaron ensayos de digestión
enzimática como sigue. Las muestras de tejidos fueron digeridas
después de una desnaturalización térmica durante 10 minutos a 80ºC
en 4 mg/ml de pepsina (Sigma chemical, St. Louis, MO) en HCl 10 mM
durante 4 horas a 37ºC. Las relaciones de enzima:tejido (peso:peso
húmedo) fueron 1:2500. A continuación de una centrifugación a 4ºC
durante 5 minutos a 13.000 rpm (30.000 x g), se usaron las materias
sobrenadantes de la reacción para una electroforesis sobre gel.
Los resultados de estos experimentos se resumen
seguidamente en la Tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados demuestran que para los dos
tratamientos de anticalcificación (1,2-octanodiol y
NMP), no hubo ningún efecto significativo sobre la temperatura de
contracción en comparación con un tejido sin tratar, sugiriendo que
no se había producido ningún cambio significativo en el estado de
reticulación del tejido como consecuencia de los tratamientos de
anticalcificación. Además de ello, tanto las muestras tratadas como
las no tratadas no consiguieron mostrar proteínas extraíbles a
continuación de la extracción de proteínas y los ensayos de
digestión de pepsina, indicando que los tratamientos de
anticalcificación no afectaron adversamente a la bioestabilidad
del
tejido.
tejido.
En una campana esterilizada, se transfirieron
trozos de tejido de pericardio bovino fijado con glutaraldehído
(Mitroflow Inc.) a tubos esterilizados que contenían una solución
al 45% de HEPES-etanol tamponado (45% de etanol,
55% de tampón HEPES 10 mM). Los tubos fueron transferidos a un
incubador a 37ºC y se mantuvieron a 37ºC con agitación suave durante
aproximadamente 16 horas. Después del tratamiento, las muestras
fueron transferidas a una solución de reciente aportación de etanol
tamponado con HEPES al 45% y se almacenaron durante 14 días a
temperatura ambiente (\sim 25ºC). La relación final de tejido a
volumen para todos los tratamientos fue de aproximadamente
27 ml/g.
27 ml/g.
Se proporcionaron muestras tratadas con solución
de etanol al 45%, así como muestras sin tratar de cada tipo de
tejido a los laboratorios Charles Rivers (Wilmington, MA) para su
implantación en ratas. Se analizaron siete ratas por grupo de
tratamiento. Antes de la implantación, las muestras de tejido
fueron aclaradas durante 3 minutos 3 veces en PBS esterilizada,
acompañado de agitación suave. Las muestras fueron implantadas por
vía subcutánea aproximadamente a 1 cm desde la línea media
abdominal en ratas Sprague-Dawley de 3 semanas de
edad y se recuperaron después de 60 días de implantación. Las
muestras no implantadas (una por tipo de tejido por tratamiento)
fueron usadas como testigos no implantados. Después de la
recuperación, las muestras fueron analizadas en cuando a sus
contenidos de calcio y fósforo mediante ICP.
Los resultados de estos experimentos se resumen a
continuación en la Tabla 5.
Estos datos demuestran que las muestras de
tejidos implantados que no recibieron ningún tratamiento de
anticalcificación mostraron niveles elevados de calcio y fósforo.
Sin embargo, las muestras de tejidos tratadas con solución de etanol
mostraron una reducción significativa en ambos niveles. Después del
período de implantación de 60 días, las muestras de testigos no
implantados tenían niveles muy bajos de calcio y fósforo (no
mostrados).
Por tanto, las soluciones de alcoholes inferiores
que tienen por debajo de 50% en volumen de alcohol pueden reducir
la calcificación bajo condiciones apropiadas de tratamiento, por
ejemplo, usando una temperatura elevada para mejorar la eficacia
del tratamiento. Podrían ser usadas también otras soluciones que
contengan menos de 50% en volumen de un alcohol inferior, por
ejemplo, metanol o isopropanol.
Las realizaciones particulares descritas con
anterioridad son solamente ilustrativas, ya que la invención puede
ser modificada y puesta en práctica de maneras diferentes pero
equivalentes, evidentes para os expertos en la técnica que puedan
aprovechar las explicaciones de la presente memoria descriptiva. Más
específicamente, será evidente que ciertos agentes que están
química y/o fisiológicamente relacionados pueden sustituir a los
agentes descritos en la presente memoria descriptiva, mientras se
consiguen resultados iguales o análogos. Además de ello, no están
previstas limitaciones para los detalles de construcción o diseño
mostrados en la presente memoria descriptiva, distinto de los
descritos en las reivindicaciones posteriores. Por lo tanto, es
evidente que las realizaciones particulares anteriormente descritas
pueden ser alteradas o modificadas y que todas estas variaciones
están consideradas dentro del alcance y las características
generales de la invención. Consecuentemente, la protección buscada
en la presente memoria descriptiva es como se expone en las
reivindicaciones siguientes.
Las siguientes referencias, hasta el alcance en
que proporcionan ejemplos de detalles del procedimiento u otros
complementarios a los expuestos en la presente memoria descriptiva,
están incorporadas específicamente como referencia a la presente
memoria descriptiva.
Patente de EE.UU. nº 5.746.775
Girardot et al., J. Biomed Mater
Res (1995) 29:793-801
Golomb et al., Am J Pathol
(1987) 127:122-130
Gott, J.P. et al.; Ann. Thorac.
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Levy et al, Inc: Williams DF, ed.
CRC Critical Rev. in Biocompatibility, vol. 2 (1986):
147-187
Thubrikar et al., J Thorac
Cardiovasc Surg (1983) 86:115-125
Zilla et al., J Heart Valve
Dis (1997) 6: 492-501.
Claims (27)
1. Un método para la anticalcificación de un
biomaterial reticulado con aldehídos, que comprende poner en
contacto el biomaterial con una solución de tratamiento de
anticalcificación que comprende de 1% en volumen a 50% en volumen
de uno o más alcoholes y/o polioles de C_{4} o superiores.
2. El método según la reivindicación 1, en el que
el biomaterial reticulado con aldehídos es un tejido de animal.
3. El método según la reivindicación 1 ó 2, en el
que los alcoholes o polioles de C_{4} o superiores son alcoholes
o polioles de C_{4}-C_{36} lineales o
ramificados.
4. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que los alcoholes o polioles de
C_{4} o superiores son alcoholes o polioles de
C_{6}-C_{18} lineales o ramificados.
5. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que los alcoholes o polioles de
C_{4} o superiores son alcoholes o polioles de
C_{7}-C_{9} lineales o ramificados.
6. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el alcohol de C_{4} o superior
es heptanol, octanol o nonanol.
7. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 ó 6, en el que el poliol de C_{4} o
superior es 1,2-octanodiol,
1,8-octanodiol, 1,10-decanol,
1,10-dodecanol, 1,2-dihidroxidecano
o 1,2-dihidroxidodecano.
8. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que el alcohol y/o poliol de C_{4}
o superior comprende de 1% en volumen a 25% en volumen de la
solución de tratamiento de anticalcificación.
9. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que el alcohol y/o poliol de C_{4}
o superior comprende de 1% en volumen a 10% en volumen de la
solución de tratamiento de anticalcificación.
10. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que la solución de tratamiento de
anticalcificación comprende adicionalmente al menos un disolvente
orgánico distinto de un alcohol y/o poliol de C_{4} o
superior.
11. El método según la reivindicación 10, en el
que el disolvente orgánico se selecciona entre un alcohol de
C_{1}-C_{3}, acetona, acetato de etilo, lactato
de etilo o polietilenglicol.
12. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que el tratamiento de
anticalcificación comprende adicionalmente agua o un disolvente
acuoso.
13. El método según la reivindicación 1, en el
que la solución de tratamiento de anticalcificación comprende al
menos un disolvente orgánico distinto de un alcohol o poliol de
C_{4} y/o superior y de 1% en volumen a 25% en volumen de un
alcohol o poliol de C_{6}-C_{18}.
14. El método según la reivindicación 13, en el
que el alcohol de C_{6}-C_{18}es un alcohol de
C_{7}-C_{9}.
15. El método según la reivindicación 13 ó 14, en
el que el alcohol de C_{6}-C_{18} es heptanol,
octanol o nonanol.
16. El método según la reivindicación 13, en el
que el poliol de C_{6}-C_{18} es
1,2-octanodiol, 1,8-octanodiol,
1,10-decanol, 1,10-dodecanol,
1,2-dihidroxidecano o
1,2-dihidroxidodecano.
17. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 16, en el que el disolvente orgánico se
selecciona entre un alcohol de C_{1}-C_{3},
acetona, acetato de etilo, lactato de etilo o polietilenglicol.
18. El método según la reivindicación 17, en el
que el disolvente orgánico es etanol.
19. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 18, en el que el tratamiento de
anticalcificación comprende adicionalmente agua o un tampón
acuoso.
20. El método según la reivindicación 13 ó 17, en
el que el disolvente orgánico está presente de 35% a 49% en volumen
de dicha solución de tratamiento de anticalcificación, y el resto
está comprendido por agua o un sistema disolvente acuoso.
21. El método según la reivindicación 20, en el
que el agua o sistema disolvente acuoso está presente a más de 50%
en volumen de la solución de tratamiento de anticalcificación.
22. El método según la reivindicación 2, en el
que el tejido de animal es un tejido de mamífero y la solución de
tratamiento de anticalcificación comprende 1% en volumen a 25% en
volumen de un alcohol o poliol de C_{7}-C_{9},
25% a 99% en volumen de un alcohol de
C_{1}-C_{3}, y el volumen restante, si lo hay,
está comprendido por agua o un disolvente acuoso; bajo condiciones
eficaces para reducir la calcificación patológica del tejido a
continuación de una implantación en un hospedante mamífero.
23. El método según la reivindicación 22, en el
que el alcohol de C_{1}-C_{3} está presente de
35% a 45% en volumen de la solución de tratamiento de
anticalcificación.
24. El método según la reivindicación 22, en el
que el alcohol de C_{7}-C_{9} está presente de
1% a 10% en volumen de la solución de tratamiento de
anticalcificación.
25. El método según la reivindicación 22, en el
que el alcohol de C_{7}-C_{9} es octanol.
26. El método según la reivindicación 22, en el
que el poliol de C_{7}-C_{9} es
1,2-octanodiol o 1,8-octanodiol.
27. El método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la solución de tratamiento de
anticalcificación comprende adicionalmente un tampón acuoso
seleccionado entre solución salina tamponada con fosfato, ácido
N,N-2-hidroxietilpiperazino-N'-2-etanosulfónico,
ácido morfolino-propano-sulfónico y
tampones que incluyen borato, bicarbonato, carbonato o
cacodilato.
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