KR0181691B1 - 항석회화 생체 조직 이식물 및 그의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

생체 조직에 혈액 적합성, 생체내 안정성 및 항석회화 특성을 지닌 술폰화 폴리에틸렌 옥사이드 유도체를 화학적 개질 방법으로 공유 결합시켜 제조되는 장시간 사용 가능하고 석회화가 월등히 적은 생체 조직 이식물 및 그의 제조 방법이 기재되어 있다.
본 발명의 개질 방법에 따라 술폰화 폴리에틸렌 옥사이드 유도체를 생체 조직에 결합시킬 경우 혈액 적합성, 생체내 안정성 및 항석회화 특성을 가질 뿐만 아니라 콘드로이틴황산염과 같은 음이온 효과, 공간 충진 효과 및 칼슘 침착 유도 인자 중의 하나로 알려진 콜라겐의 카르복시기를 블로킹하는 효과 등의 상승 작용을 기대할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 혈전증과 색전증을 억제하고 그 감염도 줄일 수 있기 때문에 석회화 억제 방법으로 더욱 유리하다. 본 발명에 따라 개질된 생체 조직은 생체내 석회화 동물 시험에서 칼슘 침착량의 분석 결과, 술폰화 폴리에틸렌 옥사이드 미함유 대조군에 비하여 매우 적은 값을 나타내어 월등히 개선된 항석회화 특성을 갖고 있음이 입증되었다. 따라서, 본 발명에 의하여 개질된 생체 조직은 생체 조직 이식물로서 이식 후 장기간 사용될 수 있다.

Description

항석회화 생체 조직 이식물 및 그의 제조 방법
본 발명은 장기간 사용할 수 있는 항석회화 생체 조직 이식물에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 설명하자면, 본 발명은 혈액 적합성, 생체내 안정성, 항석회화 특성을 지닌 술폰화 폴리에틸렌 옥사이드 유도체를 생체 조직에 공유 결합시킴으로써 제조되는 장기간 사용 가능한 항석회화 생체 조직 이식물 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.
생체 조직 이식물이란 동물이나 사람의 생체 조직을 적당히 화학 처리하여 특정의 기능을 부여한 다음, 질병이나 사고로 손상된 사람의 조직이나 장기에 이식할 수 있는 생체 조직을 말한다. 이러한 대표적인 생체 조직 이식물로는 생체 조직 심장 판막 (tissue heart valve), 조직 팻취 (tissue patch), 조직 혈관 (bioprosthetic vascular graft), 인대 및 힘줄 대체 조직 (ligament and tendon substitutes), 연골 재생 조직 (cartilage substitute), 상처 치유 (wound healing), 약물 전달 체계 (drug delivery system)용 조직 및 단백질 등이 있다.
심장 판막의 이상에 의하여 심장 기능이 저하하면 외과적 수술에 의해 인공적으로 제작된 판막을 사용하게 된다. 현재 상품화되어 사용되고 있는 것은 기계식 판막 (mechanical valve)과 생체 조직 판막 (tissue valve)이 있다. 이 중에서, 생체 조직 판막은 1965년 카펜티어 (Carpentier)가 그 개발에 성공한 이래 [A. Carpentier 등, J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 58, 467, 1969], 돼지의 대동맥 판막 (porcine aortic valve)이나 소의 심막 (bovine pericardium)을 약물로 고정 처리하여 만든 생체 조직 판막이 임상적으로 사용되고 있다. 이 판막은 생체와 유사한 형태와 기능을 가지고 있을 뿐만 아니라, 중심 혈류가 보존되고, 용혈이 적고 혈전 형성률이 아주 낮아서 항응고제를 장기 투여할 필요가 없는 등 기계식 판막보다 훌륭한 점이 많다. 그러나, 이 판막은 판막첨판의 비후단축, 조직의 변성 괴사에 의한 판막첨판의 단열, 천공 및 특히 병리적 석회화 (calcification; 石灰化) 등의 이식후 판막 기능이 저하되는 여러 가지 문제점을 갖고 있다.
외과 수술용 조직 팻취는 선천적 이상이나 질병 및 사고로 인하여 손상된 심장, 혈관 부위나 조직의 결함 부위를 보강하거나 대체하기 위하여 사용되고 있으며, 현재 인조 합성 팻취 (synthetic patch) 및 동물의 조직 팻취 (xenograft tissue patch)가 있다. 이 중에서, 조직 팻취는 소나 말의 심막이 사용되고 있으며 우수한 혈액 및 조직 적합성을 가지고 있으나, 생체 내에서 석회화 등에 의해서 내구성이 떨어지는 단점이 있다.
조직 혈관은 고분자 인조 혈관과 더불어 손상된 혈관을 대체하기 위하여 사용되고 있으며, 소의 동맥이나 심막 및 사람의 정맥 등이 이용되고 있다. 이 밖에 동물이나 사람의 생체 조직을 이용하여 인대, 힘줄 및 연골을 대체할 수 있으며 상처 치유 및 약물 전달 체계용으로도 응용할 수 있다.
일반적으로 생체 조직 판막을 포함한 생체 조직을 임상적으로 사용하기 위해서는 면역 반응을 포함한 염증성 반응과 콜라겐 및 엘라스틴의 변성을 막는 처리 방법들이 이용되고 있다 [A. Capentier, Biological Tissue in Heart Valve Replacement, M.I. Ionescu et al. (Eds), Butterworth, London, 1972]. 즉, 이식된 생체 조직에 있어서 숙주에 의한 면역 반응을 일으키지 않고 멸균 상태에서 강도와 유연성의 유지 및 증강, 콜라겐 및 엘라스틴의 변성 예방, 숙주 세포의 침입 방지 등을 목적으로 한다. 이와 같은 방법에서는 먼저 생체 조직을 무균적으로 채취하여 이것을 행크 (Hanks) 용액으로 씻어서 가용성 항원 물질을 제거한다. 다음에, 메타 과요오드산나트륨으로 뮤코 다당류와 당단백을 산화시켜 측쇄상의 알데히드기를 만든다. 이것은 인접해 있는 분자의 아미노기와 결합하여 분자간의 가교를 이룬다. 이어서, 남은 메타 과요오드산나트륨을 에틸렌글리콜로 중화시킨 후 글루타르알데히드 완충액으로 남은 당단백 분자의 아미노기와 가교 결합시킨다. 마지막으로, 수소화붕소나트륨으로 환원시켜 이들 가교 결합을 안정화시킨다. 그러나, 이 처리 방법도 생체 조직을 장기간 사용할 때 석회화에 의해서 내구성이 떨어지는 단점이 있다.
본 명세서에 기재된 0b석회화0c라는 용어는 수산화인회석 (hydroxyapatite) [(Ca10(PO4)6(OH)2]과 같은 인산칼슘 화합물 또는 탄산칼슘 등의 몇 가지 칼슘 화합물의 침착을 의미하며, 이로 인하여 생체 조직 재료는 응력 집중으로 물성 특히 유연성을 상실하여 결국 굴곡 파괴 및 생체내 분해를 일으키게 된다 [F. J. Schoen 등, J. Biomed. Mater. Res.: Appl. Biomat,. 22(A1), 11, 1988].
이러한 생체 조직의 석회화를 방지하기 위하여 생리적인 석회화 억제제인 디포스포네이트 [R. J. Levy 등, Circulation, 71, 349, 1985]와 황산도데실나트륨과 같은 세척제 [R. J. Levy 등, CRC Crit. Rev. Biocompat., 2, 147, 1986] 등이 사용되었다. 석회화를 유발하는 칼슘은 양이온이므로, 생체 조직 재료에 프로타민 [G. Golomb 등, J. Biomed. Mater. Res., 25, 85, 1991]을 결합시키거나, 또는 알루미늄 [C. L. Webb 등, TASAIO, 34, 855, 1988] 또는 철 [M. Bailwin 등, Trans. Soc. Biomat., 14, 61, 1991]로 전처리함으로써 생체 조직 재료에 양이온을 미리 도입하여 전기적 반발력에 의해 칼슘 (Ca++)의 흡착을 억제하는 방법이 연구되었다. 또한, 콘드로이틴황산염 등과 같은 음이온 다당류 (anionic polysaccharides) [G.M. Bernacca 등, Biomaterials, 13, 345, 1992]를 도입하는 방법 및 아세틸살리실산 (Aspirin)으로 처리하거나 (USP 4,838,888), 또는 아미노올레산 (WO 8906945)으로 처리하는 방법 등도 항석회화 특성을 얻을 수 있는 방법인 것으로 알려져 있다. 또한, 생체 조직에 있어서, 석회화의 직접적인 동기가 가교제인 글루타르알데히드 자체의 영향인 것으로 판단하고 글루타르알데히드 대신에 카르보디이미드 또는 폴리에틸렌글리콜 디글리세리딜 에테르 또는 글리세롤 폴리글리시딜 에테르를 사용함으로써 석회화의 발생을 감소시키는 방법이 보고되었다 [T. Okoshi 등, TASAIO, 36, 411, 1990].
이러한 종래의 석회화 억제 방법들은 생체 조직의 칼슘 침착을 어느 정도 줄일 수는 있으나, 제조 공정이 용이하지 않고 생체내 안정성 및 혈액 적합성에 문제가 있으며, 이와 같은 방법들로 처리된 생체 조직은 이식 후 장기간 사용시 기계적 특성 및 내구성이 현저히 저하되는 결점이 있다.
본 발명자들은 상기와 같은 종래 기술의 단점을 개선하기 위해 예의 연구한 결과, 술폰화 폴리에틸렌 옥사이드의 음이온성 친수성 고분자 유도체를 생체 조직에 공유 결합시킴으로써 장기간 사용 가능하고 석회화가 월등히 적은 생체 조직을 얻을 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명은 이러한 발견을 기초로 완성되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 장기간 사용할 수 있는 항석회화 생체 조직 이식물 및 그의 제조 방법을 제공하는 것이다. 더 구체적으로 말하자면, 본 발명은 혈액 적합성, 생체내 안정성 및 항석회화 특성을 지닌 술폰화 폴리에틸렌 옥사이드 의 음이온성 친수성 고분자 유도체를 화학적 개질 방법으로 생체 조직 (bioprosthetic tissue, BT)에 공유 결합시켜 제조된 장기간 사용 가능하고 석회화가 월등히 적은 항석회화 생체 조직 이식물 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 개질 방법에 따라 술폰화 폴리에틸렌 옥사이드 유도체를 생체 조직에 공유 결합시켜 혈액 적합성, 생체내 안정성 및 항석회화 특성을 갖는 생체 조직 이식물을 제조할 수 있다. 더우기, 본 발명의 개질 방법은 콘드로이틴황산염과 같은 음이온 효과, 공간 충전 효과 및 칼슘 침착 유도인자 중의 하나로 알려진 콜라겐의 카르복시기를 블로킹하는 효과 등의 상승 작용을 기대할 수 있다. 특히, 본 발명의 개질 방법은 혈전증과 색전증을 억제하고, 또한 감염을 줄일 수 있기 때문에 석회화 억제 방법으로 더욱 유리하다.
본 발명에 있어서, 생체 조직을 개질하는 데에는 크게 2가지 방법이 사용된다. 하나는 카펜티어의 생체 조직 개질 방법에 있어서, 글루타르알데히드 처리 전 또는 후에 술폰화 폴리에틸렌 옥사이드 유도체를 생체 조직에 공유 결합시키는 것이다. 다른 하나는 생체 조직의 산화 및 중화 과정을 거치지 않고 직접 글루타르알데히드로 처리하는 것이다. 이들 방법에서 글루타르알데히드 처리 전 또는 후에 각각 술폰화 폴리에틸렌 옥사이드 유도체를 결합시켜서 그라프트 효율을 높일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 생체 조직은 동물이나 사람의 생체 조직으로, 이를 술폰화 폴리에틸렌 옥사이드 유도체와 결합시켜서, 장기간 사용 가능하고 항석회화 특성이 우수한 생체 조직을 제조한다. 특히, 본 출원인은 술폰화 폴리에틸렌 옥사이드 유도체를 결합시켜서 제조할 수 있는 항석회화 특성이 우수한 생체 조직 심장 판막에 대해서 특허 출원한 바 있다 (대한민국 특허 공개 제96-3746호, 1996. 2. 23).
본 발명의 생체 조직 이식물인 조직 팻취, 혈관, 힘줄 및 인대는 상기 대한민국 특허 공개 제96-3746호에 기재된 생체 조직 심장 판막과는 달리 다음과 같은 제조상의 차이가 있다. 본 발명의 조직 팻취는 생체 조직의 내구성 및 탄력성도 부여하고 동맥류 등도 방지하기 위하여 개질 후 잔류하는 글루타르알데히드를 PBS로 여러번 세척한다. 조직 혈관은 잔류 글루타르알데히드의 세포 독성을 제거하고 내피 세포화를 향상시키기 위해서 개질 후 아미노산 용액으로 세척한다. 조직 힘줄 및 인대는 신도 등과 같은 기계적 물성을 개선하기 위하여 힘줄의 경우 0.2% 글루타르알데히드를 사용하여 고정화시키고, 인대의 경우는 글루타르알데히드로 고정화시킨 후 메탄올로 처리한다. 이와 같은 본 발명의 생체 조직 이식물의 특성은 각각의 동물 실험을 통하여 항석회화와 관련하여 침착된 칼슘 함량을 분석하여 비교할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 술폰화 폴리에틸렌 옥사이드 유도체는 하기 화학식 1로 나타내어진다.
X-R-SO3Y
식 중,
X는 아미노기 또는 알데히드기이고,
R은 폴리(에틸렌옥시)기 (PEO), 또는 PEO 함유기이고,
Y는 수소 원자 또는 -SO3와 염을 형성하여 얻어진 음이온, 예를 들어 나트륨이다.
즉, 이들 술폰화 폴리에틸렌 옥사이드 유도체에는 H2N-PEO-SO3및 OHC-PEO-SO3등이 포함된다. 이들은 여러 가지 방법에 의해서 제조될 수 있다. 대표적인 제조 방법은 먼저 양쪽 말단이 아미노기인 PEO의 어느 한 쪽 아미노기를 프로판 술톤 (propane sulton)과 같은 알킬 술톤과 반응시켜 아미노기를 말단에 갖고 있는 술폰화 폴리에틸렌 옥사이드 유도체를 제조한다. 이와 같이 X가 아미노기인, 아미노기를 말단에 갖고 있는 술폰화 폴리에틸렌 옥사이드 유도체는 본 발명자들에 의해 1993년 12월 6일자로 출원된 대한민국 특허 출원 제93-26599호에 기재된 것과 같은 화합물이다. 또한, 술폰화 폴리에틸렌 옥사이드 유도체의 나머지 다른 한 쪽 미반응 아미노 잔기에 글루타르알데히드와 같은 디알데히드를 반응시켜 알데히드를 말단에 갖고 있는 술폰화 폴리에틸렌 옥사이드 유도체를 제조할 수 있다. 여기서, R은 수용성의 유동성 고분자 잔기이다. R의 분자량은 항석회화 특성에 중요한 역할을 하며, R의 분자량이 바람직하게는 100∼20,000, 더욱 바람직하게는 200∼10,000일때, 우수한 항석회화 특성이 나타난다. R의 분자량이 100 이하일 경우, 자체 특성인 유동성이 결여되며, 20,000 이상일 때는 사슬이 너무 길어서 겹쳐지기 때문에 오히려 유동성이 현저히 떨어진다.
본 발명의 술폰화 폴리에틸렌 옥사이드 유도체는 생체 조직의 메타 과요오드산나트륨 (NaIO4)에 의한 산화, 에틸렌글리콜에 의한 중화 및 글루타르알데히드에 의한 알데히드 활성화시 첨가하여 결합시킬 수 있으며, 또한, 수용성 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC) 등과 같은 카르보디이미드에 의해서도 결합시킬 수 있다. 특히, EDC 반응시에는 수용액의 pH가 산성이어야 하는데, pH 3.0∼5.0가 더욱 바람직하다.
본 발명에서는, 생체 조직의 고정, 저장 및 알데히드 활성화에 글루타르알데히드를 사용하며, 완충제로서는 안정하고 불활성이며 완충 능력이 뛰어난 인산 완충 식염수 (PBS, pH 7.4) 용액을 사용한다. 또한, EDC 반응 전에 아세트산 무수물과 같은 블로킹제를 사용하여 생체 조직의 아미노기를 블로킹시킬 수 있다. 술폰화 폴리에틸렌 옥사이드 유도체를 생체 조직에 반응시킬 때 생체 조직 내의 아미노기는 자체 내의 카르복시기와 반응해 가교를 형성함으로써 술폰화 폴리에틸렌 옥사이드 유도체와 생체 조직의 카르복시기와의 결합을 방해할 수 있다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 아래 실시예들은 단지 본 발명을 설명하기 위한 것이며, 결코 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다.
[실시예 1]
양말단에 아미노기를 갖는 폴리에틸렌 옥사이드 (H2N-PEO-NH2; 분자량; 400, 1,000, 2,000, 4,000, 8,000; 일본 유지사) 30 g을 테트라히드로푸란 (THF) 300 ㎖에 첨가하여 50℃에서 30분간 용해시켰다. 여기에, THF 15 ㎖ 중에 용해시킨 프로판 술톤 3 g을 적가한 다음 50℃에서 5 시간 동안 반응시켰다. 이 반응물을 냉각 THF로 침전시킨 후 여과하고, 상온에서 24 시간 진공 건조하여 아미노기를 말단에 갖는 폴리에틸렌 옥사이드의 술폰화된 유도체를 제조하였다. 계속해서, 이 유도체 25 g을 증류수 250 ㎖ 중에 용해시킨 후 여기에 글루타르알데히드 3 g을 넣은 다음 50℃에서 5 시간 동안 반응시켜서 알데히드를 말단에 갖는 폴리에틸렌 옥사이드의 술폰화된 유도체를 얻었다.
제조된 술폰화 폴리에틸렌 옥사이드 유도체들의 푸리에 변환 적외선 [Fourier transform infrared (FTIR)] 분석 결과, 각각 1,030 cm-1에서의 -SO3기 및 1,730 cm-1에서의 -CHO기의 특성 피크가 확인되었다.
이하의 실시예 2∼9에서, 예를 들어 H2N-PEO1000-SO3등으로 기재되어 있는 술폰화 폴리에틸렌 옥사이드 유도체는 분자량 약 1,000의 폴리에틸렌 옥사이드를 사용하여 실시예 1의 방법에 따라서 제조한 술폰화 폴리에틸렌 옥사이드 유도체를 의미하고, 또한 예를 들어 BT-PEO1000-SO3등으로 기재되어 있는 조직은 분자량 약 1,000의 폴리에틸렌 옥사이드를 사용하여 실시예 1의 방법에 따라서 제조한 술폰화 폴리에틸렌 옥사이드 유도체가 공유 결합된 생체 조직 (bioprosthetic tissue, BT)을 의미한다.
[실시예 2]
돼지에서 채취한 대동맥 판막의 생체 조직 (BT)을 4℃의 행크 용액에 2 시간 동안 침지시킨 다음 1 : 2 비율의 3% 메타 과요오드산나트륨 (NaIO4) 용액과 행크 용액으로 조성된 1% NaIO4용액 200 ㎖에 넣어 4℃의 암소에서 24 시간 산화시켰다. 이어서, 생체 조직을 PBS 용액으로 세척한 후, 1% 에틸렌글리콜 용액 200 ㎖에 넣어 4℃에서 1 시간 동안 중화시킨 다음, 다시 PBS로 수세하고, 0.65% 글루타르알데히드 용액에서 4℃로 1 주일 이상 고정화하였다. 이것을 PBS로 세척한 후 4℃에서 0.01M 수소화붕소나트륨 (NaBH4)으로 16 시간 동안 환원시킨 다음 pH 8의 4% 아세트산 무수물 수용액으로 상온에서 3 시간 동안 처리하여 미반응 아미노기를 블로킹하였다. 계속해서, PBS로 세척한 후 생체 조직을 6.3 g H2N-PEO1000-SO3가 용해된 0.05M KH2PO4수용액에 넣고 EDC 1 g을 사용하여 pH 4.4로 되게 하고 상온에서 24 시간 동안 반응시킨 다음 PBS로 세척하여 BT-PEO1000-SO3를 제조하였다.
생성된 개질 생체 조직의 항석회화 특성을 하기와 같은 생체내 석회화 동물 실험을 통하여 평가하였다.
체중 약 80 g의 쥐 (4주령)를 케타민으로 마취시킨 후 복부의 털을 깎고 알콜로 소독한 다음 복부 중앙 부분의 피부를 등뼈 방향으로 절개하였다. 이어서, 복부의 피부와 근육 사이의 피하 조직에 낭 (pouch)을 만들어 좌우에 각각 대조군 (PEO-SO3미함유)과 상기에서 얻어진 BT-PEO-SO3의 생체 조직 (1 x 2 cm)을 동시에 이식하고 봉합하였다. 3주 후에 시료를 꺼내어 침착된 칼슘의 양을 유도 공액 플라즈마 [Inductively Coupled Plasma (ICP, Plasmascan 710, Lattam Co.)]로 분석하였다. 칼슘의 양은 건조된 조직 중량 (㎎)당 침착된 칼슘의 양 (㎍)으로 표기하였다.
상기 실험 결과 BT-PEO1000-SO3는 칼슘 침착량에 있어 대조군 (25 ㎍/㎎)에 비해서 아주 적은 값 (5 ㎍/㎎)을 나타내므로, 매우 우수한 항석회화 특성이 입증되었다.
[실시예 3]
소에서 채취한 심막을 H2N-PEO400-SO3를 함유한 행크 용액 200 ㎖ (10%)에 넣고,4℃에서 2 시간 동안 침지시킨 후 세척을 하지 않은 채 EDC를 사용해서 반응시켰다. 계속해서, 1% H2N-PEO400-SO3/NaIO4용액 200 ㎖에 생체 조직을 4℃에서 24 시간 동안 산화 반응시킨 후 4℃에서 10% H2N-PEO400-SO3/에틸렌글리콜 용액 200 ㎖에서 1 시간 동안 중화 반응시켰다. 이러한 생체 조직을 글루타르알데히드에 넣어 1주일 이상 고정한 후 NaBH4로 환원시켜 BT-PEO400-SO3를 제조하였다.
생성된 개질 생체 조직을 실시예 2에서와 같이 생체내 석회화 동물 실험을 통해 칼슘 침착량을 분석한 결과, 대조군 (56 ㎍/㎎)에 비해서 비교적 적은 값 (20 ㎍/㎎)을 나타내므로, 우수한 항석회화 특성이 입증되었다.
[실시예 4]
소 또는 말에서 채취한 심막을 행크 용액에 2 시간 동안 침지시킨 후 0.65% 글루타르알데히드에 넣고 1주일 이상 4℃에서 고정한 다음, 잔류 글루타르알데히드를 제거하기 위하여 PBS로 여러번 세척하였다. 이것을 PBS 중에 용해시킨 pH 11의 5% H2N-PEO8000-SO3용액 200 ㎖에 넣고 상온에서 2일간 반응시키고, 이어서 NaBH4로 환원시켜 BT-PEO8000-SO3를 제조하였다.
잡견 (25∼30 kg)을 케타민과 펜토탈로 마취시킨 다음 좌측 흉부를 면도한 후 5번 늑간을 통하여 흉부를 절개하였다. 심막을 부분 종절개하여 폐동맥을 먼저 노출시키고 또한 후 종격막을 절개하여 하행 흉부 대동맥도 노출시켰다. 각각의 혈관벽을 2 cm 이상 종절개하여 조직 팻취 (2×2.5 cm)를 대고 연속 봉합하였다. 한달 후에 시료를 축출하여 침착된 칼슘의 양을 ICP로 분석하였다.
상기 실험 결과, 칼슘 침착량은 대조군 (70 ㎍/㎎)에 비해서 생성된 개질 생체 조직은 비교적 적은 값 (25 ㎍/㎎)을 나타내므로, 우수한 항석회화 특성이 입증되었다.
[실시예 5]
소에서 채취한 동맥을 행크 용액에 2 시간 동안 침지시킨 후 pH 7.4인 10% H2N-PEO4000-SO3용액 50 ㎖에 넣고 상온에서 8 시간 동안 침지시킨 다음, 여기에 2% 글루타르알데히드 50 ㎖를 적가한 후 24 시간 동안 상온에서 반응시켰다. 이를 PBS와 아미노산으로 차례로 세척한 후 EDC를 사용하여 추가로 H2N-PEO4000-SO3를 반응시켰다.이러한 생체 조직을 글루타르알데히드에 넣어 1주일 이상 고정한 후 NaBH4로 환원시켜 BT-PEO4000-SO3를 제조하였다.
잡견 (50 kg)을 케타민과 펜토탈로 마취시킨 다음 흉부를 면도한 후 흉골의 정중앙을 절개하였다. 노출된 심장의 우심실과 폐동맥 사이를 조직 혈관으로 연결한 다음 봉합하였다. 4주 후에 시료를 축출하여 침착된 칼슘의 양을 ICP로 분석하였다.
상기 실험 결과, 칼슘 침착량은 미처리 (80 ㎍/㎎)에 비해서 생성된 개질 생체 조직이 적은 값 (25 ㎍/㎎)을 나타내므로, 우수한 항석회화 특성을 나타내었다.
[실시예 6]
사람에서 채취한 정맥을 행크 용액에 2 시간 동안 침지시킨 후 pH 7.4인 10% OHC-PEO1000-SO3용액 50 ㎖에 넣고 상온에서 8시간 동안 반응시켰다. 이를 PBS와 아미노산으로 차례로 세척한 후 EDC를 사용하여 추가로 H2N-PEO1000-SO3를 반응시켰다. 이러한 생체 조직을 글루타르알데히드에 넣어 1주일 이상 고정한 후 NaBH4로 환원시켜 BT-PEO1000-SO3를 제조하였다.
생성된 개질 생체 조직을 실시예 5에서와 같이 동물 실험한 결과, 실시예 5와 유사하게 우수한 항석회화 특성을 나타내었다.
[실시예 7]
소에서 채취한 힘줄을 행크 용액에 2 시간 동안 침지한 후 0.2% 글루타르알데히드 50 ㎖에 넣고 4℃에서 24 시간 동안 침지시킨 다음 이것을 PBS로 세척후 pH 11인 5% H2N-PEO2000-SO3용액 50 ㎖에 넣고 상온에서 24 시간 동안 반응시켰다. 이것을 PBS로 세척한 후 생체 조직을 1:2의 비율의 3% NaIO4용액과 행크 용액으로 조성된 1% NaIO4용액 200 ㎖에 넣어 4℃ 암소에서 24 시간 산화시킨 다음, PBS로 세척 후 1% 에틸렌글리콜 용액 200 ㎖에 넣어 4℃에서 1 시간 동안 중화시켰다. 계속해서, PBS로 세척한 후 아세트산 무수물로 미반응 아미노기를 블로킹한 다음, EDC를 사용하여 추가로 H2N-PEO2000-SO3를 반응시켰다. 이러한 생체 조직을 글루타르알데히드에 넣어 1주일 이상 고정한 후 NaBH4로 환원시켜 BT-PEO2000-SO3를 제조하였다.
뉴질랜드 토끼를 마취한 상태에서 아킬레스건을 노출시켰다. 건의 중앙 부분에서 양쪽 방향으로 2 cm를 자른 후 조직 힘줄 (2 cm)를 그 사이에 대고 양 끝을 봉합하였다. 6 주 후에 시료를 축출하여 침착된 칼슘의 양을 ICP로 분석하였다.
상기 실험 결과, 칼슘 침착량은 미처리 (50 ㎍/㎎)에 비해서 아주 적은 값 (7 ㎍/㎎)을 나타내므로, 매우 우수한 항석회화 특성을 나타내었다.
[실시예 8]
소에서 채취한 인대를 행크 용액에 2 시간 동안 침지한 후 2% 글루타르알데히드 50 ㎖에 넣고 4℃에서 24 시간 동안 침지시킨 다음, 이것을 메탄올 및 PBS로 차례로 세척한 후 pH 11인 5% H2N-PEO1000-SO3용액 50 ㎖에 넣고 상온에서 24 시간 동안 반응시켰다. 이를 PBS로 세척한 후 아세트산 무수물로 미반응 아미노기를 블로킹한 다음 EDC를 사용하여 추가로 H2N-PEO1000-SO3를 반응시켰다. 이러한 생체 조직을 글루타르알데히드에 넣어 1주일 이상 고정한 후 NaBH4로 환원시켜 BT-PEO1000-SO3를 제조하였다.
체중 약 250 g의 쥐를 케타민으로 마취시킨 후 양쪽 무릎의 연골을 길이 0.8 cm, 폭 0.3 cm로 노출시킨 다음 좌우에 각각 대조군과 개질된 조직 인대를 동시에 이식하고 봉합하였다. 두달 후에 시료를 축출하여 침착된 칼슘의 양을 ICP로 분석하였다.
상기 실험 결과, 칼슘 침착량은 대조군 (25 ㎍/㎎)에 비하여 아주 적은 값 (3 ㎍/㎎)을 나타내므로, 매우 우수한 항석회화 특성이 입증되었다.
[실시예 9]
1% NaIO4용액 대신에 1% H2N-PEO2000-SO3/NaIO4용액을 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 7에서와 동일한 방법으로 BT-PEO2000-SO3를 제조하였다.
생성된 개질 생체 조직을 실시예 7에서와 같이 동물 실험한 결과, 실시예 7과 유사한 항석회화 특성을 나타내었다.
본 발명에 따라 술폰화 폴리에틸렌 옥사이드 유도체를 생체 조직에 결합시킬 경우 혈액 적합성, 생체내 안정성 및 항석회화 특성을 가질 뿐만 아니라 콘드로이틴황산염과 같은 음이온 효과, 공간 충진 효과 및 칼슘 침착 유도인자 중의 하나로 알려진 콜라겐의 카르복시기를 블로킹하는 효과 등의 상승 작용을 기대할 수 있다. 또한, 본 발명의 개질 방법은 혈전증과 색전증을 억제하고 그 감염도 줄일 수 있기 때문에 석회화 억제 방법으로 더욱 유리하다. 본 발명에 따른 개질 생체 조직 (BT-PEO-SO3)은 생체내 석회화 동물 시험에서 칼슘 침착량의 분석 결과, 술폰화 폴리에틸렌 옥사이드 미함유 대조군에 비하여 매우 적은 값을 나타내어 월등히 개선된 항석회화 특성을 갖고 있음이 입증되었다. 따라서, 본 발명의 개질 생체 조직은 생체 조직 이식물로서 이식 후 장기간 사용될 수 있다.

Claims (11)

  1. 하기 화학식 1로 나타내는 음이온성 친수성 고분자 유도체가 화학식 1의 X를 통해서, 심막, 혈관, 힘줄, 인대로 이루어진 군으로부터 선택된 생체 조직에 공유 결합되는 것이 특징인 항석회화 생체 조직 이식물.
    [화학식 1]
    X-R-SO3Y
    식 중,
    X는 아미노기 또는 알데히드기이고,
    R는 폴리(에틸렌옥시)기 (PEO), 또는 PEO 함유기이고,
    Y는 수소 원자 또는 나트륨 등의 금속 이온이다.
  2. 제1항에 있어서, R의 분자량이 100∼20,000인 것인 항석회화 생체 조직 이식물.
  3. 제1항에 있어서, R의 분자량이 200∼10,000인 것인 항석회화 생체 조직 이식물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 조직 팻취, 조직 혈관, 힘줄 대체 조직 또는 인대 대체 조직인 것인 생체 조직 이식물.
  5. 메타 과요오드산나트륨에 의한 산화, 에틸렌 글리콜에 의한 중화, 또는 글루타르알데히드에 의한 알데히드 활성화시에, 음이온성 친수성 고분자 유도체를, 심막, 혈관, 인대, 힘줄, 연골로 이루어진 군으로부터 선택된 생체 조직에 공유 결합시키거나, 또는 카르보디이미드를 사용하여 음이온성 친수성 고분자 유도체를 상기 생체 조직에 결합시키는 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 따른 항석회화 생체 조직 이식물의 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서, 음이온성 친수성 고분자 유도체는 글루타르알데히드의 전처리 또는 후처리에 의해서 생체 조직에 결합되는 것인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 카르보디이미드는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이드 (EDC)인 것인 방법.
  8. 제5항 또는 제7항에 있어서, EDC 수용액의 pH가 3.0∼5.0인 방법.
  9. 제5항에 있어서, 글루타르알데히드는 조직의 고정, 저장 및 알데히드 활성화에 사용되는 것인 방법.
  10. 제5항에 있어서, 조직을 안정화하기 위한 완충제로서 인산 완충 식염수 (PBS)를 사용하는 방법.
  11. 제5항에 있어서, 블록화제로서 무수 아세트산을 사용하여 조직의 아미노기를 블록킹시키는 방법.
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