KR20040070988A - 아르기닌이 결합된 항석회화성 생체조직 이식물 및 그제조 방법 - Google Patents

아르기닌이 결합된 항석회화성 생체조직 이식물 및 그제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명에서는 생체조직(Bioprosthetic tissue) 아미노산의 하나인 아르기닌(L-아르기닌)을 화학적으로 결합하여 혈액 응고 방지, 상처치유 및 면역 기능 및 석회화(Calcification)를 크게 감소된 생체조직 이식물에 대하여 개시하고 있다.
본 발명의 생체조직 이식물은 항석회화 기능으로 인하여 항석회화 기능 향상 및 생체 내 내구성 향상, 혈액친화성(blood compatibility)의 향상 및 혈관생성 촉진 기능이 향상되어 인공심장판막 및 순환계 수술용 패치(Patch), 조직혈관 및 피부재생 등을 위한 생체조직 이식물 소재로 사용될 수 있다.

Description

아르기닌이 결합된 항석회화성 생체조직 이식물 및 그 제조 방법{Calcification-resistant Bioprosthetic Tissue Implants Coupled Arginine and Method the Same}
본 발명은 생체조직 이식물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 생체조직에 아르기닌을 화학적으로 결합시켜 항석회화성 및 혈액/ 세포친화성이 향상된 생체조직 이식물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
생체조직 이식물 (bioprosthetic tissue implants)이란 사람 또는 동물의 생체조직을 화학적으로 처리하여 면역특성을 제거하고 특정 기능을 부여한 것을 질병 등으로 손상된 사람의 조직이나 장기에 이식할 수 있는 생체조직을 말한다. 상기 생체조직 이식물의 제조를 위한 동물의 생체조직으로는 돼지의 대동맥 판막(porcine aortic valve)이나 심막(porcine pericardium), 소의 심막(bovine pericardium) 및 소 또는 돼지의 경막(dura mater)들이 일반적으로 사용되고 있다.
상기 동물의 생체조직을 임상적으로 사용하기 위해서 이식된 생체 조직이 숙주에 의한 면역 거부 반응을 유도하지 않는 상태에서 강도와 유연성을 유지할 수있는 방법이 필요하다. 현재, 통상적으로 먼저 생체조직을 채취하여 행크 용액(Hanks Solution)으로 씻어 가용성 항원물질을 제거한 뒤에, 글루타르알데히드 완충용액으로 화학처리(개질)하여 생체 조직중에 포함된 당단백질의 아미노기들과 글루타르알데히드를 가교결합(corsslinking)시킨다. 마지막으로 수산화붕소나트륨(NaBH4)으로 환원시켜 생체 조직물을 안정화시킨다(A. 카펜티어, Biological Tissue in Heart Replacement, M.I. Ionescu et all. (Eds), Butterworth, London, 1972).
상기와 같이 제조되는 생체조직 이식물로는 대표적으로 생체조직 심장판막(tissue heart valve), 수술용 조직 패치, 조직혈관(bioprosthetic vascular graft) 및 인대 및 힘줄 대체조직(ligament and tendon substitute) 등이 있다. 이들을 간단하게 기술하면 다음과 같다.
현재 상업적으로 사용되는 인공심장판막은 크게 기계식 판막과 생체조직 판막으로 나눌 수 있다. 기계식 판막은 내구성이 뛰어나지만, 혈전형성(thrombogenesis)이 수반되므로 항응혈제(anticoagulants)를 복용해야 한다. 반면, 생체조직 판막은 기능 및 형태가 생체와 유사하여 혈전 형성율이 아주 낮아서 항응혈제를 복용할 필요가 없는 등 기계식 판막에 비하여 우수하나, 체내내구성이 취약하고, 판막첨판의 비후단축, 특히 병리적 석회화로 인하여 이식 후 판막의 유연성이 떨어지는 결함이 있다.
수술용 조직 패치는 선천적 이상이나 질병 또는 사고로 손상된 심장, 혈관,조직의 결함부위를 보강, 대체하기 위하여 사용되고 있는데, 현재 인조 합성 패치(Synthetic patch) 및 동물의 조직 패치(xenograft tissue patch)가 있다. 이 중에서 조직 패치는 우수한 혈액적합성(blood compatibility) 및 조직적합성을 가지고 있으나, 상기 생체조직 판막과 같이 생체 내에서 석회화에 의하여 내구성이 떨어지는 단점이 있다.
조직혈관은 고분자 인조혈관과 함께 손상된 혈관을 대체하기 위하여 사용되고 있다. 이 외에 동물이나 사람의 생체조직을 이용하여 인대, 힘줄 등을 대체할 수 있으며 상처 치유 및 약물 전달 체계용으로 응용할 수 있다.
상기에서 설명한 바와 같이 카펜티어가 제안한 생체조직 이식물은 숙주에 의한 면역반응을 피하고 유연성 및 강도를 유지할 수 있으나, 장기간 사용할 경우 석회화에 의하여 내구성이 떨어지는 단점이 있다.
본 발명과 관련하여 석회화(Calcification, 石灰化)란 체내에 이식된 재료 내부에 수산화인회석(hydroxyapatite, Ca10(PO4)6(OH)2)과 같은 인산칼슘 또는 탄산칼슘과 같은 칼슘화합물이 침착되는 것을 말하며, 이로 인하여 생체 조직 재료의 물성, 특히 유연성이 떨어지고 결국 파괴 및 생체 내 분해를 일으킨다.
현재까지 석회화의 발생기전(mechanism)은 명확히 밝혀지지 않고 있으나, 다음과 같은 복합적인 원인에 의하여 일어나는 것으로 연구되었다. ⅰ)생체조직 처리과정 및 그에 사용된 화합물, 특히 글루타르알데히드의 부작용 및 미반응 잔여 글루타르알데히드, ⅱ)조직의 화학적 구조의 변경 및 인체(숙주)의 면역 반응, ⅲ)단백질 및 순환하고 있는 세포의 흡착 등이 석회화의 원인으로 생각되고 있다.
특히, 화학적으로 처리하지 않은 생체조직이 체내 분해도는 크지만, 석회화가 크게 감소한다는 사실로부터 글루타르알데히드 처리법 자체가 석회화의 일차원인으로 지적되어, 글루타르알데히드 대신에 카보디이미드 도는 폴리에틸렌글리콜 디글리세리딜 에테르와 같은 디에폭시 화합물로 가교처리하는 방법이 연구되었으나(T. Okoshi 등, TASAIO, 35, 411, 1990), 생체내 안정성 및 혈액적합성에 있어 추가 연구가 필요한 실정이다.
석회화를 일으키는 칼슘이온이 양이온이므로, 프로타민을 결합하거나(G.Golomb 등, J.Biomed. Mater. Res., 25, 85, 1991) 또는 알루미늄(C.L. Webb등, TASAIO, 34, 855, 1988), 철화합물(M. Bailwin 등, Trans. Soc. Biomat., 14, 61, 1991)과 같은 양이온을 생체조직에 미리 도입하여 전기적 반발력으로 칼슘의 흡착을 억제하려는 방법도 연구되었다.
또한, 콘드로이틴황산염과 같은 음이온 다당류(G.M. Bernacca 등, Biomaterials, 13, 345, 1992)나 키토산(J.Chanda 등, Biomaterials, 15, 465, 1994), 아세틸살리실산(미국특허 4,838,888), 아크릴산 또는 아크릴에스테르(미국특허 4,770,665), 아미노올레산(WO 8906945) 생리적 석회화 억제제인 디포스포네이트(R.J. Levy 등, Circulation, 81, 349, 1985), 황산도데실나트륨과 같은 세척제(R.J. Levy 등, CRC Crit. Rev. Biocompat., 2, 147, 1986), 술폰산화폴리에틸렌옥시드(한국특허공보 제 1996-3746호 및 1998-66242)를 도입하는 방법이 제안된 바 있다.
그러나, 상기 방법들은 제조 공정이 용이하지 않을 뿐 아니라, 제안된 화합물들은 생체내 안정성 및 혈액적합성이 검증되지 못하여 임상적으로 사용하기에는 추가 연구가 필요한 실정이다.
또한, 글루타르알데히드로 개질된 생체조직에 생리 항혈전성 물질인 헤파린을 결합시킨 생체조직 이식물(대한민국 특허공개공보 제 2001-38908호)이 제안된 바 있으나, 헤파린은 고가이고, 장기간 사용할 경우에는 생체내에서 헤파린 분해효소의 작용에 의하여 분해되는 문제점이 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 생체 적합성 및 항혈전성, 특히 항석회화성이 대폭 개선된 생체조직 이식물을 제공하고자 하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 종래 사용되고 있는 생체조직 처리기술 공정을 변경하지 않음으로써 제조공정이 간이하고 경제적으로 유용가능한 생체조직 이식물의 제조방법을 제공하고자 하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 생체조직의 세포를 제거한 무세포성(acellular) 패치를 제조하여 상기 장점을 유지함과 동시에 조직재생을 촉진시킬 수 있는 다공성 지지체(scaffold)로서 사용가능한 조직 패치의 제조방법을 제공하고자 하는 것이다.
상기한 목적을 위하여, 본 발명은 글루타르알데히드 용액에 의하여 처리된 인간 또는 동물의 생체조직에 아르기닌을 화학적으로 결합하는 단계를 포함하는 생체조직 이식물의 제조방법을 제공한다.
상기 인간 또는 동물의 생체조직은 심장판막, 심막 또는 경막 중에서 선택되고, 상기 글루타르알데히드 용액은 0.05 ~ 1.5% 농도의 글루타르알데히드 용액을 사용하며, 상기 아르기닌은 0.05 ~ 50% 농도의 아르기닌 용액을 사용하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 생체조직에 아르기닌을 결합시킨 이후에, 수산화붕소나트륨에 의하여 생체조직을 환원하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
한편, 본 발명은 상기 방법에 의하여 제조되는 생체조직 이식물을 제공하는 데, 이와 같은 생체조직 이식물은 심장판막, 수술용 조직 패치, 조직 혈관에 이용될 수 있으며 무세포성 생체조직 이식물의 경우, 조직재생용 다공성 지지체(scaffold)로서도 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 생체조직 이식물 및 그 제조 방법을 상세하게 설명한다. 본 발명에서는 소, 말, 돼지 또는 사람의 사체로부터 추출된 생체조직을 이용하였다. 상기 생체조직은 바람직하게는 심장판막(cardiac valve), 심막(pericardium) 및 경막(dura mater)이다.
상기 추출된 생체조직은 조직을 훼손하지 않는 안정적인 pH 조건에서 보존되어 처리되어야 할 필요가 있다. 본 발명에서는 종래 사용되고 있는 방법(카펜티어등)에 따라 상기 생체조직의 기계적 물성 개선, 체내분해 감소, 면역반응에 의한 부작용 제거 및 살균을 위하여 글루타르알데히드 수용액으로 처리하였다. 글루타르알데히드는 상기 생체조직의 단백질과 가교반응을 통하여 상기와 같은 작용을 한다. 생체조직을 처리하기 위하여 사용된 글루타르알데히드 수용액은 바람직하게는 0.05~1.5%, 더욱 바람직하게는 0.1~1.0%이다. 만약 글루타르알데히드 수용액의 농도가 0.05%미만이면 상기한 글루타르알데히드의 효과를 기대하기 힘들고, 1.5%를 넘게 되면 가교반응이 급속하게 진행되어 글루타르알데히드가 생체조직과 균일하게 반응하지 못하기 때문이다.
한편, 상기한 바와 같이 동물 또는 사람의 사체로부터 추출한 생체조직은 적절한 pH 조건에서 글루타르알데히드로 처리될 필요가 있다. 글루타르알데히드 수용액으로 생체조직을 처리하는 경우의 pH는 바람직하게는 7.0~7.6이고 보다 바람직하게는 7.1~7.5이다. 이를 위해서 글루타르알데히드 수용액을 적절한 완충용액(buffer solution)과 함께 처리하는 것이 바람직하다.
본 발명에서는 상기 생체조직의 글루타르알데히드 처리 또는 보관을 위하여 안정성이 뛰어나고, 글루타르알데히드에 의한 가교반응에 간섭하지 않는 불활성이며 완충능력이 뛰어난 인산염 완충식염수(phosphate buffered saline, PBS, pH 7.4, 0.01~0.02M)를 사용하였다.
한편, 본 발명에서 사용된 무세포성 생체조직 이식물의 경우에는 생체조직을 글루타르알데히드로 고정 처리하기 전에, 생체조직에 포함된 세포를 용혈(lysis) 시키고 화학적, 효소적 처리를 통하여 세포내 구성성분을 제거한다.
세포 용혈과정에서 사용되는 용액으로는 저장 트리스 버퍼(Hypotonic tris buffer, pH 8.0)를 이용하며, 단백질 분해효소 억제제로는 페닐메틸설포닐플루오라이드(Phenylmethyl-sulfonyl fluoride)가 바람직하다. 상기 단백질 분해효소 억제제를 포함하는 저장 트리스 버퍼 용액을 이용하여 생체조직을 처리하고, 1% 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(octylphenoxypolyethoxyethanol, Triton X-100)을 함유한 단백질분해효소 억제제를 포함하는 저장 트리스 버퍼 용액에 처리한 후 행크 용액으로 세척한다. 본 단계는 사용되는 생체조직에 따라 수회 반복될 수 있다.
생체 조직 중에 잔존하는 핵산은 1% Triton X-100이 함유된 단백질분해효소 억제제를 포함하는 저장 트리스 버퍼 용액으로 처리함과 동시에 리보뉴클리아제(ribonuclease) 및 디옥시리보뉴클리아제(deoxyribonuclease)와 같은 효소로 처리함으로써 분해(degradation)시킨다. 이 후, 행크 용액으로 세척하고 1% SDS 용액으로 처리하여 생체조직 내부에 잔존하는 구성성분을 제거한다.
글루타르알데히드에 의하여 처리된 생체조직은 물성 및 면역적 특성이 개선되었으나, 처리 및 보존 공정에서 미반응 글루타르알데히드가 잔류하게 되고 석회화를 일으키게 된다. 따라서, 본 발명에서는 이런 문제점을 위해서 상기 글루타르알데히드로 처리된 생체조직에 아르기닌을 결합시켜 항혈전성 및 항석회화성이 뛰어난 생체조직 이식물을 제조하였다.
아르기닌(Arginine, NH=C(NH2)NH-CH2CH2CH2CH(NH2)-COOH)은 아미노산이 공통적으로 가지고 있는 아미노기, 카르복실기 외에 작용기로서 구아니딜기를 가지고 있는 강한 염기성 아미노산이다. 아르기닌은 인체에 유해한 암모니아를 요소로 전환시키는 오르니틴 회로에 관여하는 외에, 혈관 내피 세포 및 대식세포(macrophage)에 존재하는 산화질소 합성효소에 의하여 시트룰린 및 산화질소(NO)로 분해되어 혈관 확장 및 면역 기능에 관여하는 것으로 밝혀졌다.
상기 아르기닌으로부터 전환된 산화질소는 혈관확장, 혈소판의 응집 및 활성화 억제, 혈관 평활근 세포의 증식 억제 과정에 주요 인자로 기능하여 혈관 주위의 상피세포의 변환에 의하여 야기되는 심근경색 및 혈전증, 동맥경화증을 방지한다.
또한, 상기한 바와 같이 아르기닌에는 아미노기 및 카르복실기를 포함하고 있어 물성 개선을 위하여 생체조직과 가교 결합된 글루타르알데히드의 알데히드기와 반응하여 각각 쉬프(Schiff) 염기 및 아세탈 화합물로 전환된다. 상기 쉬프 염기는 후술하는 바와 같이 수소화붕소나트륨에 의하여 환원되어 안정될 수 있다.
한편, 아르기닌은 상기한 바와 같이 염기성의 구아니딜기를 포함하고 있는데, 생체 내와 같은 중성 pH 조건에서 상기 구아니딜기는 양이온성을 띠게 된다. 따라서, 양이온성의 구아니딜기는 석회화의 원인 인자인 칼슘 양이온과 전기적으로 반발하게 되어 생체조직에 칼슘이 흡착되는 것을 방지할 수 있다. 따라서, 본 발명에 사용되는 아르기닌은 부분적으로 수화(hydration)되어 이온성을 띠도록 하는 것이 바람직하다.
또한, 아르기닌으로부터 생성되는 산화질소(NO)는 생체 내의 혈관 세포벽에 혈소판과 같은 혈전 형성의 원인이 되는 물질이 점착되는 것을 방지함으로써, 항혈전 및 항석회화를 크게 개선시킬 수 있다. 특히, 아르기닌은 생체조직에 가교되지않은 글루타르알데히드의 미반응 잔류기와 공유 결합하여 제거함으로써, 잔류하는 글루타르알데히드에 의하여 일어나는 항석회화를 더욱 감소시키게 된다.
본 발명에 사용되는 아르기닌 수용액은 생체조직과 가교 결합된 글루타르알데히드 및 미반응 글루타르알데히드의 알데히드기와 반응하기에 충분한 양으로 공급한다. 본 발명에서 사용되는 아르기닌은 0.05~50% 농도가 바람직하며, 더욱 바람직하게는 0.1~10.0%의 농도이다. 아르기닌의 농도가 0.05% 미만이면, 아르기닌의 공급에 따른 효과를 기대하기 힘들고, 50%를 넘게되면 아르기닌 공급량에 비례하는 항석회화 효과가 나오지 않기 때문이다.
본 발명에 따르는 생체조직 이식물 중에는 글루타르알데히드-아르기닌의 반응에 의하여 상기한 바와 같이 쉬프 염기가 생성되는 데, 이는 적절한 환원제를 사용하여 환원시킬 수 있다. 본 발명에서는 수소화붕소나트륨(NaBH4)을 사용하여 상기 쉬프 염기를 환원시켰다. 수소화붕소나트륨 0.01~1 N의 농도로 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명에 의하여 제조되는 생체조직 이식물은 필요에 의하여 적당한 처리(PBS 세척, 아미노산 용액 세척, 메탄올 처리)를 하여 심장판막, 외과/순환계/치과 분야의 수술용 조직 패치, 조직 혈관, 조직 힘줄 및 인대 등으로 사용될 수 있으며, 무세포성 생체조직 패치의 경우 조직공학용 다공성 지지체로도 사용될 수 있다.
본 발명의 실시예에서 사용된 용어 및 장치를 간략하게 기술하면 다음과 같다.
본 발명의 생체조직 이식물의 물리적, 화학적 특성은 수축온도(shrinkage temperature), 기계적 인장강도와 연신도, 콜라젠 분해효소(Collagenase)를 이용한 분해성, 동물 피하근육 이식 실험에 의한 석회화 특성을 통하여 측정하였다.
수축온도는 시차주사식열량분석기(Differential Scanning Calorimeter, DSC, TA 인스트루먼트사, DSC 2010)로 2 ℃/분 승온시키며 측정하였는데, 수축온도가 높을수록 생체조직의 안정성이 큰 것을 의미한다.
인장강도는 인장시험기(인스트론사, 모델 8511), 로드 셀(load cell) 50㎏으로 측정하였다. 또한 분해성은 조직 약 1㎎을 콜라젠분해효소(Clostridium histolyticumType II, 활성도 357 unit/㎎, 미국 시그마사) 용액을 이용하여 37??에서 36시간 분해시킨 후 잔량을 건조 정량하였다 (박기동 등, Biomaterials, 18, 47, 1997).
동물 피하근육 이식 실험은 처리된 생체조직 패치 (크기 1㎝ × 1.5㎝)를 쥐(Sprague-Dawley rat, 수놈 생후 5주, 체중 150~180g)의 등 부위 피부와 근육사이의 피하근육에 이식하고, 8주 후에 꺼내서 6N 염산 용액으로 가수분해한 시료를 유도 결합 플라즈마(Inductively coupled plasma, ICP, Jovin Yvon사, 138 Ultrace)를 이용한 칼슘 정량에 의하여 수행되었다. 침착된 칼슘의 양은 건조된 조직 중량(㎎)당 칼슘의 양(㎍)으로 표시하였다. 순환계 이식 석회화 실험은 개(한국산 잡견, 25~30㎏)를 이용하여 방추형으로 제작한 조직 패치를 대동맥 내부에 이식 8주 후에 꺼내어 침착된 칼슘의 양을 동일한 방법으로 측정하였다 (박기동 등,Biomaterilas, 18, 47, 1997).
이하, 본 발명의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 본 발명이 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
비교예 1
소에서 추출한 심막을 행크 용액에 보존하고 멸균실에서 심막에 부착된 두터운 지방층을 제거한 다음 4 ℃ 암소에서 24시간 동안 유지하여 가용성 단백질을 제거하였다. 처리된 심막 생체조직을 PBS로 여러번 세척한 후 0.4% 글루타르알데히드 용액 내에 10시간동안 처리하였다. 이를 PBS로 여러 번 수세한 다음 0.01N 수소화붕소나트륨 용액에 4 ℃에서 16시간 넣어 환원시켰다. 이렇게 처리된 조직(이하 '기본처리 조직'이라 한다.)의 수축온도는 85 ℃, 콜라젠분해 효소로 분해 후 잔량(이하 '콜라젠분해 잔량'이라 한다.)은 88%, 최대인장강도 1.11 ㎏/㎟, 최대연신율 32%의 물성을 나타내었다.
이에 비하여 글루타르알데히드로 처리하지 않은 조직(이하 '미처리 조직'이라 한다.)의 수축온도는 68 ℃, 콜라젠분해 잔량은 83%, 최대인장강도 0.45 ㎏/㎟, 최대연신율 39%로서 기본처리조직이 글루타르알데히드의 가교로 인하여 안정화되고 강도가 증가된 것을 확인하였다.
그러나, 쥐 피하이식(8주) 시험결과, 미처리 조직에 침착된 칼슘이 0.45 ㎍/㎎인데 반하여 기본처리 조직은 141.8 ㎍/㎎로서 석회화가 많이 진행되었다.
비교예 2
돼지의 대동맥심장판막을 추출하여 상기 비교예 1과 동일한 방벙으로 처리하였다. 기본처리 조직의 수축온도는 86 ℃, 콜라젠분해 잔량은 82%, 최대인장강도 0.88 , 최대연신율 40%이었고, 미처리 조직의 수축온도는 65 ℃, 콜라젠분해 잔량은 71%, 최대인장강도 0.33 ㎏/㎟, 최대연신율 62%이었다.
쥐 피하이식(8주)후 미처리 조직에 침착된 칼슘의 양은 0.55 ㎍/㎎인데 비하여 기본처리 조직은 141.7 ㎍/㎎이었다.
실시예 1
소에서 심막을 추출하여 비교예 1과 동일한 방법으로 행크용액내에 보존 및 글루타르알데히드로 가교처리한 후, 2%의 아르기닌 용액(pH 11.0)에서 4 ℃, 2일동안 반응시켰다. 아르기닌이 고정 처리된 심막 생체조직을 다시 비교예 1과 동일한 방법으로 수소화붕소나트륨 용액으로 환원시켰다.
아르기닌이 고정화된 생체조직(이하 '아르기닌 처리 조직'이라 한다.)의 수축온도는 86 ℃, 콜라젠분해 잔량은 91%, 최대인장강도 1.52 ㎏/㎟, 최대연신율 34%로서 비교예 1의 기본처리 조직보다 안정성이 향상되었다.
또한 쥐 피하이식(8주) 결과, 침착된 칼슘의 양은 10.6 ㎍/㎎로서 기본처리 조직보다 월등히 감소하여 우수한 항석회성을 확인하였다.
실시예 2
소의 심막 대신에 돼지의 대동맥심장판막을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 아르기닌 처리조직 패치를 제조하였다.
아르기닌 처리 조직의 수축온도는 85 ℃, 콜라젠분해 잔량 89%, 최대인장강도 1.22 ㎏/㎟, 최대연신율 42%로서 상기 비교예 2의 기본처리조직보다 안정성이 향상되었다.
또한 쥐 피하이식(8주) 결과, 침착된 칼슘의 양은 10.6 ㎍/㎎로서 기본처리 조직보다 월등히 감소하여 우수한 항석회화성을 확인하였다.
실시예 3
소의 심막 대신에 인간 사체의 심막을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 아르기닌처리 조직 패치를 제조하였다.
아르기닌처리 조직 패치의 항석회화 특성을 개의 대동맥 내부에 이식실험한 결과, 침착된 칼슘의 양이 6.7 ㎍/㎎으로서 기본처리조직의 120 ㎍/㎎보다 훨씬 개선된 항성회화 특성을 나타내었다.
실시예 4
소의 심막 대신에 돼지의 경막을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 아르기닌 처리조직 패치를 제조하였다.
상기 실시예 3과 동일한 방법으로 개 동맥 이식시험을 수행하여 침착된 칼슘량을 분석한 결과, 아르기닌 처리 조직 패치의 칼슘 침착량은 1.6 ㎍/㎎으로 역시 기본처리 조직의 141.7 ㎍/㎎보다 개선된 항석회화 특성을 보였다.
실시예 5
본 실시예에서는 무세포성 생체조직을 이용한 생체조직 이식물을 제조하였다. 우선, 소에서 추출한 심막을 행크용액에 보존하고 심막에 부착된 두터운 지방층을 제거한 다음 페닐메틸설포닐플루오라이드(Phenylmethyl-sulfonyl fluoride)를 포함한 저장 트리스 버퍼 (Hypotonic tris buffer, pH 8.0) 용액에 24시간 동안 4℃에서 처리하여 세포를 용혈(lysis)시켰다. 다음 단계로 1% 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올 (octylphenoxypolyethoxyethanol, Triton X-100)을 함유한 단백질분해효소 억제제 포함하는 저장 용액에 4℃에서 24시간 처리하고 행크용액으로 세척하였다. 세 번째 단계로 리보뉴클리아제(ribonuclease) 용액 및 디옥시리보뉴클리아제(deoxyribonuclease) 혼합용액으로 시료를 37℃에서 3시간 처리하고, 1% 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(octylphenoxypolyethoxyethanol, Triton X-100)을 함유한 단백질분해효소 억제제를 포함하는 저장 tris buffer 용액에 4℃에서 24시간 처리하였다. 마지막으로 행크용액에 세척하고 1% SDS 용액으로 처리한 후 행크용액에 보관하였다.
이와 같이 제조된 무세포성 생체조직을 상기 실시에 1과 동일한 조건에서 처리하여 아르기닌 처리조직 패치를 제조하였다.
실시예 6
소의 심막대신 돼지의 대동맥심장판막을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 아르기닌 처리 조직 패치를 제조하였다.
실시예 7
소의 심막대신에 인간 사체의 심막을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 아르기닌 처리 조직 패치를 제조하였다.
하기 표 1은 상기 실시예 및 비교예의 결과를 정리하여 표시한 것이다.
표 1
수축온도(℃) 콜라젠분해잔량(%) 최대인장강도(㎏/㎣) 최대연신율(%) 침착 칼슘의 양 (㎍/㎎)
비교예 1 미처리 68 83 0.45 39 0.45
기본처리 85 88 1.11 32 141.8
비교예 2 미처리 65 71 0.33 62 0.55
기본처리 86 82 0.88 40 141.7
실시예 1(아르기닌 처리) 86 91 1.52 34 10.6
실시예 2(아르기닌 처리) 85 89 1.22 42 10.6
실시예 3 기본처리 120
아르기닌 처리 6.7
실시예 4 기본처리 141.7
아르기닌 처리 1.6
본 발명에 의하여 제조된 생체조직 이식물의 미반응 글루타르알데히드는 첨가된 아르기닌과 결합하여 제거될 뿐 아니라, 생체조직 이식물은 아르기닌이 가지고 있는 항혈전성을 획득할 수 있으며, 아르기닌으로부터 형성되는 산화질소로 인하여 혈소판, 단백질 등의 세포 점착이 감소되어 혈전 형성 및 석회화를 크게 감소시킬 수 있다.
상기 혈전형성 및 항석회화의 감소로 인하여 내구성이 크게 개선된 심장판막, 수술용 조직 팻취, 조직 혈관, 조직 힘줄 및 인대 등에 이용될 수 있으며, 특히 본 발명에 의하여 무세포성으로 처리된 생체조직 이식물은 조직공학용 다공성 지지체로서도 활용가능하다.

Claims (10)

  1. 글루타르알데히드 용액에 의하여 처리된 인간 또는 동물의 생체조직에 아르기닌을 화학적으로 결합하는 단계를 포함하는 생체조직 이식물의 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 생체조직을 글루타르알데히드 용액으로 처리하기 전에 상기 생체조직을 무세포성 생체조직으로 처리하는 단계를 더욱 포함하는 생체조직 이식물의 제조방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 인간 또는 동물의 생체조직은 심장판막, 심막 또는 경막 중에서 선택되는 생체조직 이식물의 제조방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 글루타르알데히드 용액은 0.05 ~ 1.5% 농도의 글루타르알데히드 용액인 것을 특징으로 하는 생체조직 이식물의 제조방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 아르기닌은 부분적으로 수화된 것을 사용하는 생체조직 이식물의 제조방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 아르기닌은 0.05 ~ 50% 농도의 아르기닌 용액을 사용하는 생체조직 이식물의 제조방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 생체조직에 아르기닌을 결합시킨 이후에, 수산화붕소나트륨에 의하여 생체조직을 환원하는 단계를 더욱 포함하는 생체조직 이식물의 제조방법.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 하나의 항에 의하여 제조되는 생체조직 이식물.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 생체조직은 무세포성 생체조직인 것을 특징으로 하는 생체조직 이식물.
  10. 제 8항 또는 9항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 생체조직 이식물은 심장판막, 수술용 조직 패치, 조직 혈관, 인대, 힘줄 및 조직공학용 다공성 지지체에 사용되는 생체조직 이식물.
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