CN1160480A - 制备用作细胞种植框架和植入体的生物细胞外基质的方法 - Google Patents

Abstract

由人类或动物供体得到的组织。该组织可通过固定方法来固定。可引起排斥的细胞成分可通过化学处理从组织中除去，从而使细胞外基质(ECM)保留了它们原有的形状，生物结构，超微结构，定位和耐久性。将活细胞种植在作为细胞框架的所得ECM上，形成用于移植或同种异体移植的有生命的移植物。

Description

制备用作细胞种植框架和植入体的 生物细胞外基质的方法

本发明涉及从人或动物组织所得到的组织制备生物细胞外基质的方法。

器官或组织的损伤或缺失是人类健康中最经常发生、最具灾难性且花费最昂贵的问题之一。因此，组织工程学作为一个新的领域便应运而生，其是利用生物学和工程学原理来开发损伤组织的功能替代物。

组织工程是一个应用工程和生命科学原理研究正常和病理状态哺乳组织间结构-功能关系并进而研制能恢复，保持或改善组织功能的领域。它包括将活细胞与天然或人工的细胞外基质一起用于研制用于恢复或替代组织功能的移植体。

对于制备新的组织替代物所采取的三种基本构思之一是将细胞置于基质上或之中。该基质来自天然材料或合成的生物降解的聚合物纤维框架，其被作为ECM。

尽管已开发出许多人工或合成的移植物，但这些组织替代物仍不能恰当地取代天然高度复杂的结构。今天在组织移植中所面临的挑战是克服机体的免疫系统并尽力改善移植物的功能。尽管在本领域已取得了很大进展，但目前的组织移植仍存有许多问题，这包括炎症，降解，瘢痕，感染，钙化，咬合和排斥。因此，目前广泛深入的医学生物材料研究是面向改善移植组织移植物的工程，但理想的人工移植物还未研制出来。

美国专利4,801,299记载了一种通过用洗涤剂除去组织中细胞成份从而得到供移植用的细胞外基质的方法。但如该组织预先用固定剂固定的话，则该洗涤剂不能用于该组织的制备。

本发明人在研究中出人意料地发现通过将来自人或动物供体的组织先用固定液固定，然后用作为消化液的碱性溶液除去固定组织中细胞得到细胞外基质，该细胞外基质具有优良的组织完整性和作为移植物所需具备的其它性质，并使供体的来源更广，从而为供体提供了广泛来源。本发明基于上述发现得以完成。

本发明的目的是提供一种加工来自人或动物的生物组织的方法，其是通过化学处理来制备脱细胞化的以胶原蛋白为主的ECM，所得到的生物组织用于人类或动物的移植。本发明提供了制备改进的ECM的有效方法，该ECM一般具有该组织的原有形状且同时保留了所需要的生物结构。该组织可由已知方法得到，该组织可是宿主的或从尸体或供体得到的。该组织在固定后进行脱细胞。

得到该组织后，对其进行固定，然后进行脱细胞，其中脱细胞用的消化液选自碱金属氢氧化物或其碳酸盐或碳酸氢盐，氢氧化铵，碱金属醇化物，有机胺或它们的混合物。可采用氧氢氧化钠或氢氧化钾溶液。然后将所得到的ECM洗涤，孵育并保存。

在移植前，作为细胞框架的ECM可用来自宿主(自身细胞)或其它人的细胞种植。该机体组织的ECM也可作为基质材料用于组织替代。

本发明包括通过固定处理，除去细胞，灭菌和细胞重建步骤获得生物组织，从而提供用于移植的生物替代组织。

在优选实施方案中，所获得的组织优选是与随后进行植入的移植物相同的组织。例如皮肤用于代替皮肤，血管用于代替血管，软骨用于代替软骨等。

用人的尸体或动物供体得到的生物组织具有1cm³体积或更大，其获取后马上置于带有固定剂的固定液中，如戊二醛或甲醛。该固定液可包含于缓冲液如磷酸钠缓冲液中(PBS)的2％甲醛和1.5％戊二醛。该组织在固定液中最少保留时间约2小时，或直到该组织完全被固定。组织固定后，用适宜材料对其洗涤几次，如用蒸馏水。

在优选实施方案中，该组织然后被放在NaOH或KOH溶液或任何其它碱性溶液中以进行该组织的孵育，从而除去固定组织中细胞。该组织于室温在该溶液中的保留时间为约12小时-5天。溶液优选含1.5-2.0N NaOH或KOH的碱性溶液。浓度范围为0.1N-5N，温度范围为约4℃-60℃，这取决于所加工供体组织的类型和获得该脱细胞化ECM所需的时间长度。更高浓度，更高的温度或更长的消化将损害该结果。实践中，在室温用NaOH或KOH处理更长时间会导致弹性纤维的消化。所得ECM可通过显微镜和扫描电子显微镜观察到。

组织脱细胞化后，进行组织的洗涤。洗涤组织的溶液可以是蒸馏水和缓冲液，如磷酸钠。

在该步中，可变化洗涤溶液，优选为约每30分钟，且持续洗涤直到ECM呈半透明状。洗涤ECM后，将ECM于氨基酸如天门冬氨酸，谷氨酸或甘氨酸溶液中孵育以消除残余的游离固定剂并降低pH。具体的氨基酸可是0.5％天门冬氨酸或0.1M甘氨酸溶液。缓冲液中ECM孵育最好将洗涤液pH带到约7.4。加工后，可以在移植前不损害ECM结构的任何方式放置并贮存该脱细胞的ECM。

该ECM结构提供了用于细胞粘着，生长和分化的适宜有效的生物底物。该ECM可在移植前通过细胞培养技术在其上种植活细胞作为细胞框架而成为替代组织，或通过各种医学步骤直接作为体内或体外植入的模板。

本发明提供了一种组织产品，其包括良好防腐的ECM。该ECM调节与其接触的细胞行为上起着活性的并且综合的作用。

本发明就是制备一个完好保留的细胞外基质，目前大量的研究已经证明了细胞外基质对与其相接触的细胞的各种行为起着非常重要的调节作用，围绕在细胞外的基质是一种相对很稳定的结构物质，但是只认为围绕在细胞外的基质对于细胞仅仅起着惰性的支持和框架的作用，这种看法已成为了过去，构成细胞外基质的每一种成份对于与它相接触的细胞的生长，分化都有着特殊的功能，由它们结合而构成的具有三维立体空间的细胞外基质，对于细胞的生长、分化、代谢、调节都起着不可替代的作用，反过来由于这些细胞外基质是由细胞所产生，所以细胞对于围绕在其周围的细胞外基质的形成起着这样或那样的作用和影响，在细胞的表面有着与ECM相连结的特殊的受体，这样细胞基质的组成成份和空间结构对于细胞的代谢、形态生长分化有着密切相关的作用。

因此，对于通过该技术特殊处理过的组织，由于所有能够被宿主识别出对宿主表达组织免疫抗原性的细胞物质被去除，而完整保留下来的ECM其形态，组织结构，超微结构，定位和耐受性等都与原有组织的基质一样。

当与目前市场的移植物比较时，本发明所制备的ECM具有难以模仿的天然生物构造并在应用中具有优越性能。该ECM与由ECM成份如胶原或纤维蛋白涂覆的化学聚合物底物组成的移植体比较，其绝对无毒，不会引起不良过敏活性且可促进细胞繁殖。当本发明与美国专利4,801,299的ECM和方法比较时，本发明通过更简易，低花费的方法在更短的时间内制备ECM，同时保留了所需的天然结构，且供体的来源更广泛，方便。

Claims (21)

1.一种通过去除了细胞成份，保留细胞外基质而制备生物移植体的方法，其包括以下步骤：

a.获得组织

b.将所得的组织用固定剂固定，

c.将选自碱金属氢氧化物或其碳酸盐或碳酸氢盐，氢氧化铵，碱金属醇化物，有机胺或它们的混合物的碱性溶液用于所述组织。

2.权利要求1所述的一种通过去除细胞成份，保留细胞外基质，制备生物移植体的方法，其还包括用缓冲液对组织进行洗涤的步骤。

3.权利要求2所述的一种制备生物移植体的方法，其进一步包含了将所获得的细胞外基质在孵育溶液中进行孵育的步骤以便消除残留的固定液成份并降低细胞外基质的pH值。

4.权利要求3所述的方法，其中的孵育液是天门冬氨酸。

5.权利要求3所述的方法，其中的孵育液是谷氨酸。

6.权利要求3所述的方法，其中孵育液是甘氨酸。

7.权利要求1所述的方法，其中的碱性溶液是氢氧化钠溶液。

8.权利要求2所述的方法，其中碱性溶液是氢氧化钠溶液。

9.权利要求3所述的方法，其中碱性溶液是氢氧化钠溶液。

10.权利要求4所述的方法，其中碱性溶液是氢氧化钠溶液。

11.权利要求5所述的方法，其中碱性溶液是氢氧化钠溶液。

12.权利要求6所述的方法，其中碱性溶液是氢氧化钠溶液。

13.权利要求1所述的方法，其中的碱性溶液是氢氧化钾溶液。

14.权利要求2所述的方法，其中碱性溶液是氢氧化钾溶液。

15.权利要求3所述的方法，其中碱性溶液是氢氧化钾溶液。

16.权利要求4所述的方法，其中碱性溶液是氢氧化钾溶液。

17.权利要求5所述的方法，其中碱性溶液是氢氧化钾溶液。

18.权利要求6所述的方法，其中碱性溶液是氢氧化钾溶液。

19.权利要求1-6任一所要求的方法，其中所制备的ECM可作为移植用的模板直接用于人或动物的移植。

20.权利要求1-6任一所要求的方法，其中所制备的ECM可被种植上来自宿主或其它人或动物的活细胞而用作人或动物移植的移植体。

21.权利要求1所要求的方法，其中所述的动物可以是猪、牛、羊。