CN101690829A - 一种可再细胞化的生物瓣瓣膜材料的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可细胞化生物瓣膜材料的制备方法，其特征在于包括对猪主动脉心脏瓣膜作脱细胞处理，然后用去甲二氢愈创木酸溶液交联，交联后再作后处理。使用交联剂的浓度为0.1-10mg/ml。交联条件是1-40℃下60-360rpm摇动交联2-240小时，取出后浸入D-Hanks液中置于1-6℃条件下后处理3-40天即可获得可细胞化的生物瓣膜材料。通过调节交联剂去甲二氢愈创木酸溶液的浓度、交联的时间和清洗时间等，实现交联的力学强度、抗酶解能力、交联剂释放、促进组织再生能力等方面的可调控。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物瓣瓣膜材料的交联制备方法，更确切地说，本发明涉及一种去甲二氢愈创木酸作为交联剂交联制备可再细胞化生物瓣瓣膜材料的方法，属生物医学工程学领域。
背景技术
心脏瓣膜病变是危及人类健康的一种重要疾病。其主要治疗方法为心瓣膜置换术。自1960年Harken和Starr首先用人工球笼式机械瓣置换主动脉瓣和二尖瓣以来，人工心脏瓣膜获得了医学界极大的关注和重视，因此也取得了显著的进步。
目前，人工心脏瓣膜有机械瓣和生物瓣两大类。机械瓣在使用了各向同性低温热解碳(或氧化钛)为材料(或改性材料)后，一定程度上改善了机械瓣的血液相容性等性能，使得机械瓣得到了广泛使用。但由于机械瓣有难以克服的非生理性、瓣膜在不同程度上阻碍了正常血液流动状态，手术后的血栓率以及因为必须终身服用抗凝药物可能造成的出血并发症，使得人们在使用机械瓣的同时，不得不关注并探索生物瓣的研制。
临床应用的几种生物心脏瓣膜(异种有架生物瓣、无架生物瓣、同种异体主动脉瓣、自体肺动脉瓣等)具有与人体心脏瓣膜相类似的血流动力学性能和优良的生物相容性。心瓣膜置换患者仅需短期或不需抗凝治疗，特别适用于65岁以上的患者和不宜使用抗凝药物或术后难以进行抗凝监测的患者。根据美国胸外科医师学会国家心脏外科数据库8万多例患者的统计，20世纪90年代生物瓣在主动脉瓣置换术中占37.6％，二尖瓣置换术中占23.1％，表明生物瓣具有很大的临床使用价值。生物瓣中使用最多的是经过戊二醛处理固定后的猪主动脉瓣。戊二醛处理脉瓣后，提高了瓣膜的强度和韧性，并在很大程度上掩盖和减少了生物材料的免疫原性。但植入人体后3周即出现生物瓣的致命弱点——钙化，继而引起血栓，并反过来促进钙化的生成，使瓣膜失去功能。一般10年内约有1/3的患者需再次进行心瓣膜置换术。近年来尽管在改善生物瓣设计和防止钙化等方面作了大量研究工作，但目前仍不理想。传统带架的异种生物瓣的设计与天然心脏瓣膜功能相差较大。有架瓣膜存在瓣膜启闭应力集中的缺点，机械应力集中在异种生物瓣的钙化变性过程中起了主导作用；无架生物瓣尽管减少了应力集中，但瓣膜组织内失活的内皮细胞、结缔组织细胞及其碎片留存在瓣膜的内层和表面，形成早期钙化的好发部位，仍无法避免无支架瓣膜植入人体后的钙化变性；低温保存的同种主动脉瓣植入人体后，组织内原有的细胞消失，在其组织纤维上可见宿主细胞和细胞外间质生长，瓣膜组织结构的完整性得以延续，但同种主动脉瓣的来源受限，更由于瓣膜内各种有核细胞膜的表面上分布有组织相容性抗原，供者与受者之间需配型以减少机体免疫反应而使其来源更少，并且植入后仍有一系列排斥问题需处理[Schoen FJ.New frontiers in the pathology and therapy of heart valvedisease：2006 society for cardiovascular pathology，distinguishedachievement award lecture.United States Canadian Academy of Pathology，Atlanta，GA，February 12，2006.Cardiovasc Pathol2006；15：271-279.，Schoen FJ，Levy RJ.Tissue heart valves：Currentchallenges and future research perspectives.J Biomed Mater Res1999；47：439-465.]。同时，同种主动脉瓣组织内凋亡或变性的细胞随低温保存的时间延长而增多，植入人体后这些凋亡或变性的细胞诱发炎性反应，导致瓣膜内皮丢失和细胞外间质毁损。自体肺动脉瓣的解剖学和组织结构形态学与主动脉瓣存在差异，且自体肺动脉瓣移植到主动脉瓣部位后需在肺动脉瓣位植入人工心脏瓣膜，在临床应用中仍有缺憾。
因此，钙化、免疫原性和耐久性差是目前所有生物瓣不能广泛使用的共同缺点，减少钙化、降低免疫原性和提高生物瓣的耐久性是生物瓣研制的主要方向。近几年随着组织工程技术的日益提高，采用组织工程技术研制瓣膜的研究工作已取得了初步成果。理想的组织工程心脏瓣膜是指应用组织工程技术复制出的一种具有细胞活性的新型生物瓣膜。其原理是利用可吸收的聚合物或其他生物材料为支架，将活细胞种植于瓣膜支架上，制造出一种与受体组织相容性好，有活力而无免疫原性，不需抗凝，耐久性强的生物心脏瓣膜。移植后能支持患者心脏功能至终生。这种理想的瓣膜不仅能为正在成长的患者提供增长能力，还能修复累加的创伤。1995年Shinoka应用此技术，将羊成纤维细胞(Fibroblasts，FBCs)及血管内皮细胞依次种植于人工合成的聚乙醇酸/聚乳酸支架上制成瓣膜，植入羊肺动脉瓣区，获得初步成功，表明组织工程生物瓣的研制已有了一个良好的开端。
组织工程瓣膜的研制主要有三方面的工作：(1)支架材料的选择及加工处理；(2)种子细胞的选择及培养；(3)在特定的环境中，将细胞种植到支架材料上，并进行适应体内环境的重构。其中组织工程瓣膜支架的选材及处理尤为重要，好的组织工程瓣膜支架可以方便细胞的种植、构建，甚至可以直接在体内诱导细胞贴附，继而向内长入、分化、细胞外基质代谢等瓣膜重建过程。因此组织工程生物瓣膜支架需要足够的机械强度、抗炎、无毒、好的细胞相容性等性能。
虽然目前可吸收的高分子材料支架，在材料来源方面具有一定的优势，但由于心脏瓣膜是个复杂的三维结构，人工合成支架构建心脏瓣膜还涉及支架结构按照瓣膜血液流变学原理塑形，难度较大，短期内不可能进入临床。同时，组织工程生物瓣膜要想进入临床必须克服稳定性、安全性对病人心理的影响。由于每个人的代谢能力和生理特点各不相同，因而要制备降解速率适合每个病人瓣膜再生速度相匹配的组织工程生物瓣膜，目前还是极大的难题，必须在原有的较为可靠的生物瓣的基础上，向组织工程生物瓣膜过渡。这就需要一种既能在较长时期内起生物瓣功能，又能在一定时期后随着材料的逐渐代谢和细胞的贴附、增殖、长入而细胞化的人工生物瓣膜。
因而应用猪脱细胞主动脉瓣作为新型生物瓣瓣膜材料被国内外学者所重视。脱细胞法处理动物来源的瓣膜材料可防止细胞残片引起免疫反应。通过去垢剂、酶消化和超声清洗等方法彻底抽提细胞，保留由胶原蛋白、弹性蛋白、纤粘连蛋白(fibronectin)和层粘连蛋白(laminin)组成的天然支架结构。这种材料植入犬体内试验结果显示，无炎症反应、不致瘤、不钙化，而且有可能再生内皮。因而脱细胞材料成为人们探索新型可再细胞化生物瓣瓣膜材料的一种重要选择。
2001年以来，Koob TJ等为构建组织工程肌腱修复肌腱损伤而寻找一种用于交联胶原蛋白的交联剂，发现从灌木Larrea divaricata中分离提取出来的一种二元酚——NDGA，是一种优良的胶原蛋白交联剂[Thomas J.Koob，Daniel J.Hernandez.Material properties of polymerized NDGA-collagencomposite fibers：development of biologically based tendon constructsBiomaterials，Volume 23，Issue 1，January 2002，P203-212.，Thomas J.Koob.Biomimetic approaches to tenden repair.Comparative Biochemistryand Physiology-Part A：Molecular & Integrative Physiology，Volume 133，Issue 4，December 2002，P1171-1192.]。他们将此二元酚加入到I型胶原纤维中，得到拉伸强度超过天然肌腱2倍的胶原纤维。其拉伸强度和弹性模量较戊二醛胶联的胶原纤维分别高出约50％和20％，较碳化二亚胺交联的材料分别高出约230％和220％。NDGA交联的胶原纤维表现出优良的生物相容性，可快速长入肌腱成纤维细胞。NDGA是儿茶酚的二聚体，氧化后变成二醌，再经氧化实现分子间缩合。缩合前后的醌基团可与蛋白质中Lys和Arg等碱性氨基酸残基的ε-氨基反应，从而将胶原纤维交联起来，这一交联机理不同于戊二醛等交联剂直接交联赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)等碱性氨基酸残基，也不同于碳化二亚胺等交联剂直接交联碱性氨基酸残基Lys和酸性氨基酸残基天冬氨酸(Asp)或谷氨酸(Glu)等。除了交联特性之外，作为儿茶酚的衍生物，NDGA还是一种抗氧化剂，能清除多种活性氧自由基，保护肌体免受氧化损伤。参与细胞外和细胞内的信号转导而调节肌体的代谢，如通过抑制Smad信号途径抑制转形生长因子β(transforming growth factor-β)的活性[7，8]。研究还发现NDGA还具有较弱的雌激素活性，可以调节肌体的生长发育。NDGA的这些作为交联剂的特点和其优良的生理活性表明，NDGA很适合用于交联动物心脏瓣膜材料，使交联的材料不仅可保持其天然性能，还能满足瓣膜正常的力学性能要求，便于再细胞化。但至今未见采用NDGA交联脱细胞动物心脏瓣膜制备生物瓣瓣膜材料的报道和相关专利。
基于上述分析，本发明拟以脱除细胞的猪心脏主动脉瓣膜为材料，采用NDGA交联处理法对瓣膜进行交联、增强力学性能，制备出性能优良的可再细胞化的生物瓣瓣膜材料。
发明内容
本发明目的在于提供一种可细胞化的生物瓣瓣膜材料的制备方法，它是通过去甲二氢愈创木酸作为交联剂对天然生物瓣瓣膜材料的交联而实现。所述的去甲二氢愈创木酸(nordihydroguaiaretic acid NDGA，又名3，4-二羟基愈创木酸，橙花醇乙酸酯)。本发明制备的生物瓣瓣膜材料不仅能保持瓣膜的天然形态和柔软性，增强材料的力学强度和稳定性，并有很好的细胞相容性，有利于植入人体后的细胞迁移、增殖、生长和组织重建。
具体地说，本发明提供的生物瓣瓣膜材料的制备方法包括(1)猪主动脉天然心脏瓣膜作脱细胞处理和(2)脱细胞后的生物瓣瓣膜材料的交联，现分述如下：
(一)天然瓣膜的脱细胞过程
1.将屠宰场采集的新鲜猪主动脉瓣膜，放入1-6℃、加入双抗的无Ca、Mg的磷酸缓冲液(D-Hanks液)中，2小时内带回，在4℃下、4小时内剪下瓣膜叶片后，用无菌D-Hanks液清洗干净。所述的D-Hanks液配方为无Ca、Mg离子的磷酸缓冲液：将0.4g KCl，0.06g KH2PO4，8.00g NaCl，0.35g NaHCO3和0.09g Na2HPO4·7H2O溶解于1L超纯水中。超纯水的电阻为18.2MΩ
2.将取回的猪主动脉瓣膜放入1-6℃的无菌D-Hanks液作为储存运输液，用1-6℃平衡盐缓冲液D-Hanks液清洗三遍。
3.将剪下的瓣膜叶片放入脱细胞液中，1-40℃下60-360rpm(转/分钟)转速摇动脱除瓣膜细胞8-96小时，清洗干净，使用DNA酶和RNA酶液37℃下60-360rpm转速摇动降解脱除细胞核成分消化12-96小时，脱去细胞核，以完全去除瓣膜材料上的细胞成分，降低材料的免疫原性。所述的脱细胞溶液配方为：将0.1g胰蛋白酶、0.5g非离子去垢剂聚乙二醇辛基苯基醚(4-(1，1，3，3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol，商品名Triton X-100，即曲利通)、0.5g脱氧胆酸钠和0.02g EDTA溶解于100mL超纯水中。所述的DNA酶与RNA酶液配方为：用D-Hanks液在1-4℃下配制的20μg/ml的核酸酶(RNase)和0.2mg/ml的脱氧核酸酶(DNase)按1∶1体积比混合即可。
4.用超纯水配制的无菌D-Hanks液，将脱细胞生物瓣瓣膜材料在1-40℃下、60-360rpm转速摇动清洗瓣膜细胞残留的细胞碎片、游离蛋白质和核酸等大分子5-10次，每次1-2小时，最后再次用超纯水配制的无菌D-Hanks液充分清洗干净，得到脱细胞天然生物瓣瓣膜材料。用D-Hanks液清洗脱细胞生物瓣膜材料的最佳环境条件是：37℃。
(二)脱细胞天然生物瓣瓣膜材料的交联
1.NDGA在碱性条件下的溶解度比在中性条件下大，因此先称取100mgNDGA溶于2mL浓度为1mol/L NaOH中，然后用D-Hanks溶液将其稀释成0.1-10mg/ml的NDGA交联剂溶液中，推荐组分为0.1，0.5，1.5，2.5，5mg/mLNDGA溶液。
2.将完全脱细胞后的瓣膜材料浸入0.1-10mg/ml的NDGA交联剂溶液中，1-40℃恒温60-360rpm/min恒速摇荡交联2-96小时，使交联剂与瓣膜成分接触。同时以6.25mg/ml的戊二醛溶液交联作为对照。
3.取出的瓣膜材料在D-Hanks中1-40℃条件下60-360rpm摇动条件下震荡清洗10遍，每遍持续180min。
4.交联后得到的瓣膜材料浸在D-Hanks液中，可放入1-6℃低温冰箱作后处理3-40天，优先推荐后处理7-10天，每天更换D-Hanks溶液；以60-360rmp摇动清洗5-10次，每次持续3小时，得到本发明交联的可脱细胞化的生物瓣瓣膜材料。
为了验证本发明提供的交联方法制备的生物瓣瓣膜材料的特性，本发明进行形态学观察、力学性能测试、稳定性测试、体外毒性测试及体外细胞种植试验。
(1)形态学观察
脱细胞后的猪心脏瓣膜在扫描电子显微镜(SEM)下观察其微观形貌。瓣膜脱水制样过程如下：
1.将样品浸泡在浓度为2.5％的戊二醛的D-Hanks溶液中4个小时。取出后用D-Hanks缓冲液清洗三遍，每遍持续10分钟。
2.把瓣膜浸泡在浓度梯度依次提高的乙醇溶液中(乙醇的体积份数分别为30％，50％，70％，90％，95％，100％)，每个浓度10分钟，使之脱水。随后将样品浸入体积比为50∶50的乙醇与六甲基二硅胺烷(HMDS)干燥10分钟，然后放入100％的HMDS中干燥10分钟，最后放入通风橱中干燥过夜。
3.在观察之前，将干燥的样品喷金扫描电镜观察其瓣膜材料纤维的形貌。
(2)力学性能的测定(最大抗张强度与弹性模量)
新鲜猪心脏瓣膜、未交联的、NDGA交联的和戊二醛交联的以及2.5mg/mlNDGA交联后在D-Hanks溶液中保存1d、3d、7d及15d的脱细胞天然生物瓣瓣膜材料，作最大抗张强度和弹性模量等力学性能的测定。测试的步骤如下：
1.将要测试的瓣膜沿胶原纤维的方向剪成宽约4mm，长约25mm的长条。每组6个样品，经SHIMADZU材料力学测试仪在2mm/min的拉伸速率下测试最大抗张强度。最大抗张强度的数值可从电脑显示的stress-strain曲线图中直接读出。
2.取stress-strain曲线的最大斜率即为最大弹性模量，最大弹性模量可以说明瓣膜材料本身的柔软度与弹性。
(3)稳定性测试
1.体外酶降解
交联后的瓣膜胶原纤维与弹性纤维力学性能提高，强度增强，纤维更紧密，稳定性增强，抗体外酶降解的能力提高。
样品秤重后，浸在1.8mg/mL II型胶原酶的D-Hanks溶液中(酶活力单位1000U/mL，pH7.4)， 37℃、60rpm降解。分别在1、4和24h后加入50μL 10mmol/L EDTA终止反应，剩余样品干燥至恒重，再次秤重(Wt)。瓣膜酶解后的相对残留量(W％)可以通过下式计算：
W％＝Wt/W0×100
式中W0表示每个样品的初始质量，Wt表示相应的每个样品酶降解后的质量。残留量百分比越高，说明抗酶降解能力越强，交联后的材料越稳定。
2.NDGA体外释放动力学的测定
(1)测定NDGA标准曲线：将NDGA用D-Hanks液配置成200μg/ml的标准溶液，进行全波长扫描，找到最大吸收峰位置437nm。后在437nm处测定不同浓度NDGA的OD值，得到NDGA浓度-OD值标准曲线。(2)NDGA样品浓度的测定：NDGA样品在437nm处测定OD值，以浓度-OD值的标准曲线推算出NDGA样品浓度。(3)NDGA体外释放动力学的测定：NDGA交联的瓣膜材料放置于D-Hanks缓冲液中，定时收集浸泡瓣膜的缓冲液，每天进行换液，测定NDGA释放的浓度。
(4)体外细胞毒性试验
将10mg NDGA溶于1ml的DMSO中，用DMEM培养液稀释成不同浓度(稀释后培养基中DMSO的浓度低于1％)。将牛心脏瓣膜间质细胞、平滑肌细胞或人脐静脉内皮细胞(HUVEC)以1000细胞/孔接种于96孔板，培养24小时后，加入上述不同浓度的NDGA。以系列浓度的戊二醛作毒性对照，同时设空白对照及1％DMSO对照。细胞每2-3天换液，连续培养7天，MTT法测细胞活力。
(5)体外细胞种植试验
将交联和不交联的生物瓣瓣膜材料剪成直径10mm的圆片，放入48孔板内，每片种植104个人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，培养24小时后固定、脱水、喷金，扫描电镜观察细胞种植黏附状态。
综上所述，本发明公开一种可细胞化的生物瓣瓣膜材料的制备方法。首先，本发明以动物心脏瓣膜为原料，经及时处理和脱细胞，得到脱细胞瓣膜的多孔胞外基质材料。该材料即为天然生物瓣瓣膜材料，但其①力学强度低于天然瓣膜，②残留免疫原性易引起宿主炎症反应，③易降解等。所以本发明将此天然材料浸入不同浓度、不同比例的去甲二氢愈创木酸溶液中，在适当温度条件下，摇动交联处理，从而得到无毒性、不皱缩、柔软、多孔、胞外基质纤维自然排列、机械强度高，稳定性好，细胞相容性好、可在1-6℃下长期保存在D-Hanks液中备用，既可当作生物瓣用于临床心脏瓣膜置换、修复，又可作为支架用于体内或体外再细胞化构建成组织工程心脏瓣膜应用于临床。可以通过调节交联剂去甲二氢愈创木酸溶液的浓度、交联的时间和清洗时间等，实现交联的力学强度、抗酶解能力、交联剂释放、促进组织再生能力等方面的可调控(详见实施例)。
附图说明
图1脱细胞天然生物瓣瓣膜材料扫描电镜照片。猪心脏瓣膜作脱细胞处理，并清洗干净之后取样扫描电镜观察。照片显示由细胞外基质组成的多孔结构没有任何残留细胞和细胞碎片。
图2未交联及交联处理的脱细胞生物瓣瓣膜材料。从左至右，1：未交联处理的天然生物瓣瓣膜材料；2：0.625％GA交联处理的生物瓣瓣膜材料；3：0.5mg/ml NDGA交联处理的生物瓣瓣膜材料；4：1.5mg/ml NDGA交联处理的生物瓣瓣膜材料；5：5mg/ml NDGA交联处理的生物瓣瓣膜材料。
图3为本发明用特殊交联剂去甲二氢愈创木酸(浓度为0.5、1.5、2.5和5mg/ml)所交联制备的脱细胞生物瓣瓣膜材料的最大抗拉强度(A)和最大弹性摸量(B)比较。Control：未交联的脱细胞生物瓣瓣膜材料；GA：传统交联剂戊二醛(6.25mg/ml)交联的脱细胞生物瓣瓣膜材料。图NDGA：去甲二氢愈创木酸。“*”表示与未交联的脱细胞生物瓣瓣膜材料相比有显著差异，p＜0.05。
图4为本发明所用特殊天然交联剂去甲二氢愈创木酸以2.5mg/ml浓度交联制备的脱细胞生物瓣瓣膜材料，浸泡于D-Hanks液中保存不同时间后的最大抗拉强度(A)和最大弹性摸量(B)的变化。“*”表示与未交联的脱细胞生物瓣瓣膜材料相比有显著差异，p＜0.05。
图5为本发明所用特殊天然交联剂去甲二氢愈创木酸以不同浓度(0.5、1.5、2.5和5mg/ml)交联制备的脱细胞生物瓣瓣膜材料在抗胶原酶降解后的相对质量比较图。A：不交联的脱细胞组织工程瓣膜；B：传统交联剂戊二醛(6.25mg/ml)交联的脱细胞生物瓣瓣膜材料。
图6为本发明所用特殊天然交联剂去甲二氢愈创木酸(2.5mg/mL)交联的脱细胞瓣膜在D-Hanks液中浸泡15天时，交联剂去甲二氢愈创木酸释放过程。图中右上角是去甲二氢愈创木酸吸光度-浓度标准曲线(线性关系为y＝0.0988x-0.1646，R2＝0.9757)。D-Hanks溶液每天换一次，10天之后去甲二氢愈创木酸浓度超出检测下限之外，所以没有浓度结果。
图7.为本发明所用特殊天然交联剂去甲二氢愈创木酸和传统交联剂戊二醛对瓣膜间质细胞(A)血管平滑肌细胞(B)和内皮细胞(C)的增殖抑制作用。从图中可以看出去甲二氢愈创木酸对三种细胞的增殖抑制毒性均约为戊二醛的1％。“*”表示与空白对照或DMSO相比有显著差异，p＜0.05。
图8.为本发明所用特殊天然交联剂去甲二氢愈创木酸交联制备的脱细胞生物瓣瓣膜材料(A)在种植人脐静脉内皮细胞24后的低倍(B)和高倍(C)扫描电镜观察照片。从图中可以看出去甲二氢愈创木酸交联后对内皮细胞的贴附没有毒性。
图9是以每片瓣膜加10ml的比例，加入0.1mg/ml、0.5mg/ml、1.5mg/ml和5mg/ml去甲二氢愈创木酸的D-Hanks溶液，24℃下、以240rpm的摇动速度，交联2小时(图中的3、4、5和6)、240小时(图中的7、8、9和10)和72小时(图中的11、12、13和14)的脱细胞生物瓣瓣膜材料。图中的1为未交联的脱细胞生物瓣瓣膜材料，2为戊二醛交联的脱细胞生物瓣瓣膜材料。3至14分别代表0.1mg/ml、0.5mg/ml、1.5mg/ml和5mg/ml去甲二氢愈创木酸交联不同时间的脱细胞生物瓣瓣膜材料，交联完成后不皱缩，能保持原有外形，稳定性良好。
具体实施方式
通过下面结合附图，以进一步阐明本发明的实质性特点和显著的进步，但本发明决非仅局限于实施例。
实施例1
用1-6℃的平衡的盐缓冲液D-Hanks液作为储存运输液，2小时内从屠宰场取来新鲜的猪主动脉心脏瓣膜，在4℃下、4小时内剪下瓣膜叶片，使用D-Hanks液清洗干净。所制备好脱细胞猪心脏主动脉瓣膜，脱洗干净，得到如图1结构和外形的脱细胞生物瓣瓣膜材料。扫描电镜下瓣膜材料的胞外基质纤维呈束状疏松排列，无纤维肿胀断裂现象，瓣膜材料多孔、胞外基质纤维自然排列，表面亦无细胞碎片残留。瓣膜材料以每片加2ml的比例加入2.5mg/ml去甲二氢愈创木酸的D-Hanks特制溶液浸泡，37℃下120rpm摇动交联48小时。再以每片材料加2ml的比例加入D-Hanks溶液浸泡瓣膜，在37℃下120rpm摇动清洗10小时以上，重复清洗5次。所得瓣膜材料作上述性能评价。图2中2为6.25mg/ml戊二醛交联的脱细胞瓣膜材料，与未交联脱细胞天然生物瓣瓣膜材料(图中1)一样松弛，无法维持瓣膜外形。而图中3、4、5和6为本发明所用交联剂去甲二氢愈创木酸以1mg/ml、1.5mg/ml、2.5mg/ml和5mg/ml浓度交联的脱细胞生物瓣瓣膜材料，交联后能维持瓣膜原来外形，柔润而不皱缩。图3显示2.5mg/ml去甲二氢愈创木酸交联的脱细胞瓣膜材料最大抗拉强度为16.8MPa，优于戊二醛交联的脱细胞瓣膜材料(10.5MPa)，也优于不交联的脱细胞瓣膜材料(8.7MPa)。图4显示2.5mg/ml去甲二氢愈创木酸交联后的脱细胞瓣膜材料在D-Hanks液中浸泡120天时，其各时间点的最大抗张强度能与刚交联后的基本持平，没有减小。随着浸泡时间的延长，弹性模量也逐渐增长。表明本发明所用交联剂去甲二氢愈创木酸对脱细胞瓣膜材料交联的力学稳定性维持良好。图5显示本发明以0.5mg/ml、1.5mg/ml、2.5mg/ml和5mg/ml浓度的去甲二氢愈创木酸交联的脱细胞瓣膜材料和戊二醛交联的脱细胞瓣膜材料，均有较强的抗酶解能力，其中2.5mg/ml去甲二氢愈创木酸交联的脱细胞瓣膜材料酶解24小时后只降解了9.68％，与戊二醛交联的脱细胞瓣膜降解率(23.01％)接近。相对于不交联的脱细胞瓣膜，两种交联剂交联的脱细胞瓣膜的降解率都很低，表明脱细胞瓣膜的组成分子分别被去甲二氢愈创木酸和戊二醛交联修饰，该结果也同时说明去甲二氢愈创木酸具有良好的交联效果。图6显示去甲二氢愈创木酸交联的脱细胞瓣膜在缓冲溶液中，交联剂去甲二氢愈创木酸释放较快，释放量基本在3μg/ml以下，至第11天，已在0.5μg/ml以下，超出检测范围。释放量极低也可能是交联后力学强度稳定性良好的原因。图7显示本发明所使用的交联剂去甲二氢愈创木酸在浓度为1μg/ml以下时对牛心脏瓣膜间质细胞、牛血管平滑肌细胞和人血管内皮细胞株HUVEC的增殖潜力没有抑制，在浓度大于1μg/ml时细胞OD值小于对照组，表现有毒性；而戊二醛直到浓度为0.001μg/ml时才对瓣膜间质细胞的增殖潜力没有抑制，浓度为0.01μg/ml时已有明显抑制，在浓度大于0.01μg/ml时细胞OD值小于对照组，表现有毒性。该结果显示去甲二氢愈创木酸对瓣膜间质细胞的增殖潜力抑制较戊二醛小100倍(10/0.001)。对照图6，脱细胞瓣膜交联后的残余交联剂去甲二氢愈创木酸在D-Hanks液中浸泡9天后的释放量在去甲二氢愈创木酸对上述细胞的毒性范围以下，无任何毒性。图8为人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在2.5mg/ml去甲二氢愈创木酸交联的脱细胞瓣膜材料上的贴附和伸展，可见去甲二氢愈创木酸交联的脱细胞瓣膜材料具有很好的细胞相容性，适合作为原位组织工程瓣膜用作病损瓣膜的替换，也适合作为组织工程瓣膜的体外构建。
实施例2
按前述方法制备猪脱细胞组织工程瓣膜天然材料并清洗干净后，以每片瓣膜材料加2ml的比例加入1.5mg/ml去甲二氢愈创木酸的D-Hanks特制溶液实施例1方法交联，所得交联后生物瓣瓣膜材料同样能维持瓣膜原来外形、柔润、不皱缩、多孔、胞外基质纤维自然排列。图3显示1.5mg/ml去甲二氢愈创木酸交联的脱细胞瓣膜材料最大抗拉强度为13.18MPa。图5显示1.5mg/ml去甲二氢愈创木酸交联的脱细胞瓣膜瓣膜材料酶解24小时后，只有约10％被降解。表明该浓度去甲二氢愈创木酸同样对脱细胞组织工程瓣膜瓣膜材料具有交联作用，并具有良好的力学性能和抗酶解稳定性。
实施例3
按实施例1方法从屠宰场取来新鲜的猪主动脉心脏瓣膜并清洗干净。用D-Hanks溶液清洗三次之后，用脱细胞溶液4℃下静止脱除瓣膜细胞96小时。用D-Hanks液将脱细胞的心脏瓣膜材料在24℃(常温)下、120rpm转速摇动清洗瓣膜细胞残渣、碎片及游离蛋白质、核酸等大分子等5次，每次10小时以上。以每片瓣膜加10ml的比例加入0.1mg/ml、0.5mg/ml、1.5mg/ml和5mg/ml去甲二氢愈创木酸的D-Hanks溶液，24℃下、以240rpm的摇动速度，交联2小时(图9中的3、4、5和6)、72小时(图9中的11、12、13和14)和240小时(图9中的7、8、9和10)。以每片瓣膜加20ml的比例加入D-Hanks溶液浸泡瓣膜，常温下120rpm清洗。这样所制得的本发明的人工生物瓣膜材料，作前述性能评价。交联2小时的最大抗拉强度分别为9.2MPa、12.1MPa和13.6MPa；交联72小时的最大抗拉强度分别为14.0MPa、14.5MPa、15.9MPa和15.7MPa；交联240小时的最大抗拉强度分别为14.4MPa、14.9MPa、16.9MPa和15.7MPa。以去甲二氢愈创木酸最低浓度0.1mg/ml交联最短时间2小时制备的脱细胞生物瓣瓣膜材料，其酶降解率为28.4％与戊二醛的相当。以去甲二氢愈创木酸最高浓度5mg/ml交联最长时间240小时制备的脱细胞生物瓣瓣膜材料，其残余交联剂在D-Hanks溶液中的约3天时间释放的溶液浓度超出检测限之外，此时释放的去甲二氢愈创木酸对人血管内皮细胞株HUVEC无任何毒性。图9中瓣膜1为未交联的脱细胞组织工程瓣膜天然材料，2为戊二醛交联的脱细胞生物瓣瓣膜材料。3至14分别代表0.1mg/ml、0.5mg/ml、1.5mg/ml和5mg/ml去甲二氢愈创木酸交联不同时间的脱细胞生物瓣瓣膜材料，显示交联完成后材料不皱缩，能保持原有外形，稳定性良好。所有交联的脱细胞生物瓣瓣膜材料均可在4℃下D-Hanks溶液长期保存。
Claims (10)
1.一种可细胞化的生物瓣瓣膜材料的制备方法，其特征在于包括对猪主动脉心脏瓣膜作脱细胞处理，然后用去甲二氢愈创木酸溶液交联，交联后再作后处理，具体步骤为：
a)将屠宰场采集的新鲜猪主动脉瓣膜，放入1-6℃、加入双抗的无Ca、Mg的磷酸缓冲D-Hanks液中，2小时内带回，在4℃下、4小时内剪下瓣膜叶片后，用无菌D-Hanks液清洗干净；
b)将步骤a剪下的瓣膜叶片，放入脱细胞液中，在1-6℃下以60-360rpm转速摇动脱除瓣膜细胞，之后将瓣膜用无菌D-Hanks液清洗干净；
c)将步骤b清洗干净的脱细胞瓣膜用DNA酶与RNA酶液在37℃下60-360rpm摇动降解脱除细胞核成分，再次用无菌D-Hanks液清洗干净；
d)用超纯水配置的无菌D-Hanks液将脱完细胞的瓣膜材料在1-40℃下、以60-360rpm转速摇动清洗瓣膜上残留的细胞碎片、游离蛋白质及核酸成分，再次用超纯水配制的无菌D-Hanks液将脱细胞瓣膜清洗干净，得到完全脱细胞的、天然心脏瓣膜材料；
e)将步骤d得到的完全脱细胞的天然心脏瓣膜材料浸入0.1-10mg/ml的NDGA溶液中，在1-40℃下60-360rpm摇动交联2-240小时，取出交联的心脏瓣膜天然材料，用无菌D-Hanks液清洗干净；
f)将交联后的天然心脏瓣膜材料浸入D-Hanks液中置于1-6℃下作后处理3-40天后可得到可细胞化的生物瓣瓣膜材料；
所述的D-Hanks液配方为无Ca、Mg离子的磷酸缓冲液：将0.4g KCl，0.06g KH2PO4，8.00g NaCl，0.35g NaHCO3和0.09g Na2HPO4·7H2O溶解于1L超纯水中；
所述的脱细胞溶液是由0.1g胰蛋白酶、0.5g非离子去垢剂聚乙二醇辛基苯基醚、0.5g脱氧胆酸钠和0.02g EDTA溶解于100mL超纯水中配制而成的；
所述的DNA酶与RNA酶液配方为：用D-Hanks液在1-4℃下配制的20μg/ml的核酸酶和0.2mg/ml的脱氧核酸酶(DNase)按1∶1体积比混合；
所述的NDGA交联剂溶液配方为：将NDGA用2mL 1mol/L的NaOH溶解溶解后，再用D-Hanks液稀释配制成浓度为0.1-10mg/mL溶液。
2.根据权利要求1所述的可细胞化生物瓣瓣膜材料的制备方法，其特征在于步骤b所述的脱除瓣膜细胞的时间为8-96小时；步骤c所述的用DNA酶与RNA酶脱除细胞核成分的时间为12-96小时。
3.根据权利要求1所述的可细胞化的生物瓣瓣膜材料的制备方法，其特征在于所有清洗步骤所涉及的D-Hanks清洗液是采用18.2MΩ超纯水配制的D-Hanks液。
4.根据权利要求1所述的可细胞化的生物瓣瓣膜材料的制备方法，其特征在于步骤d所述的用超纯水配无菌D-Hanks液清洗脱细胞生物瓣瓣膜材料的细胞残留的细胞碎片、游离蛋白质或核酸大分子的清洗次数为5-10，每次1-2小时。
5.根据权利要求1所述的可细胞化的生物瓣瓣膜材料的制备方法，其特征在于所述的用D-Hanks液清洗脱细胞生物瓣瓣膜材料的环境条件是37℃、60-360rpm转速摇动清洗。
6.根据权利要求1所述的可细胞化的生物瓣瓣膜材料的制备方法，其特征在于所述的脱细胞生物瓣瓣膜材料的交联剂NDGA的浓度分别为0.1、0.5、1.5、2.5和5mg/ml。
7.根据权利要求1所述的可细胞化的生物瓣瓣膜材料的制备方法，其特征在于步骤e所述的脱细胞生物瓣瓣膜材料的交联时间为8-96小时。
8.根据权利要求1所述的可细胞化的生物瓣瓣膜材料的制备方法，其特征在于所述的交联后用D-Hanks液清洗的条件是D-Hanks液在1-40℃下，10-360rpm摇动清洗10次，每次持续3小时。
9.根据权利要求1所述的可细胞化生物瓣瓣膜材料的制备方法，其特征在于所述的交联后处理是将交联后的完全脱细胞的心脏瓣膜材料浸入D-Hanks液中放置在1-6℃环境中，后处理7-10天，每天更换D-Hanks液，之后用D-Hanks液清洗干净。
10.根据权利要求1所述的可细胞化的生物瓣瓣膜材料的制备方法，其特征在于经过后处理的生物瓣瓣膜材料，在1-6℃下长期保存于D-Hanks液中备用，并通过调节NDGA交联剂的力学强度-抗酶解能力、交联剂释成和促进组织再生能力的调控。
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